TW202015652A - 皮膚光老化預防劑、以及、含有該類物質的功能性化妝品 - Google Patents

皮膚光老化預防劑、以及、含有該類物質的功能性化妝品 Download PDF

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Abstract

課題 提供皮膚的光老化預防劑。塗覆紫外線散亂劑或紫外線吸收劑等，不僅在皮膚表面使紫外線直接散射或吸收，在皮膚內部使皮膚細胞的防禦功能正常作用，提供能從根本上預防紫外線引起的皮膚光老化之皮膚光老化預防劑。 解決方法 光老化預防劑，含有存在於紫蘇油（perilla oil）、亞麻仁油（flaxseed Oil、linseed oil）、紫蘇籽油（perilla seed oil）、奇亞籽油（chia seed oil）、印加果油（Sacha Inchi oil）或綠核果油（green nuts oil）中的α-次亞麻油酸衍生物作為有效成分；此光老化預防劑，抑制人類真皮纖維母細胞（human dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）生成量降低，可以應用作為功能性化妝品。

Description

皮膚光老化預防劑、以及、含有該類物質的功能性化妝品
本發明係有關於皮膚的光老化預防劑，特別是有關於一種含有α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）衍生物的皮膚光老化預防劑。
人的皮膚從外層《皮膚側（skin side）》分為『表皮（epidermis）』、『真皮（dermis）』"和『皮下組織（hypodermis）』三層。表皮的厚度為0.2毫米（mm）〜0.7毫米，從外側由角質層（stratum corneum）、顆粒層（stratum granulosum）、棘狀層(stratum spinosum )和底層(stratum basale)所組成；表皮的最頂層的角質層，係在皮膚的最外層，厚度約0.02毫米，由複數個薄薄的角質細胞以層狀相互重疊而形成，正常的角質層具有防止異物入侵等屏障功能，在維持皮膚健康上是非常重要的層。
表皮下層的真皮，保持水分來支撐皮膚的功能，藉由存在於真皮的纖維母細胞（fibroblast）所生成的膠原蛋白（collagen）和彈性蛋白（elastin）的纖維（fiber）成分和透明質酸（hyaluronic acid）等的保濕成分，可以保持皮膚的彈性，因此，人體皮膚，在各個層中，保護皮膚而保持健康、具有通過免疫資訊來保護生體的功能。
另一方面，紫外線是波長為10〜400奈米（nm）的電磁波，從對人類健康和環境的影響的觀點來看，再進一步分為紫外線A波《UVA；400〜315奈米》、紫外線B波《UVB；315〜280奈米》、紫外線C波《UVC；小於280奈米》。
紫外線A波《UVA》約占到達地球表面的所有紫外線總量的95%，其本身能量弱、但輻照量大，由於穿透力高，對人的皮膚影響較大，它作用於皮膚的真皮層，使蛋白質變性，使皮膚的彈性失去而加速老化。
紫外線B波《UVB》約占紫外線總量的5%。雖然大部分的紫外線B波被臭氧層（ozone layer）吸收，但近年臭氧層受到破壞，地球表面也因而帶來了更多紫外線B波。這些紫外線B波因為主要在皮膚表面被吸收，所以幾乎沒有達到皮膚真皮層；然而，它的能量比紫外線A波強，據說是紫外線A波的100〜1000倍，不僅產生黑斑（stains）、皺紋（wrinkles）、皮膚乾燥等的美容方面的不良影響，還有過量生產黑色素（melanin）以外，又與免疫力下降、皮膚癌、白內障等疾病有很深的關係。
紫外線C波《UVC》具有很強的殺菌作用，對生體的破壞力也最強，但通常不會到達受臭氧層保護的地球表面。
因此，防止紫外線《UVA和UVB》造成的皮膚損害，係預防黑斑、皺紋、下垂、乾燥等而導向預防皮膚老化的同時，也導向維持免疫力和預防皮膚癌等。
一般來說，為了防止紫外線對皮膚造成損害，有人使用含有紫外線散亂劑（ultraviolet scattering agent）或紫外線吸收劑（ultraviolet absorber）等的塗覆劑《即防曬劑》；紫外線散亂劑旨在藉由覆蓋皮膚、反射紫外線來防止滲透到皮膚中，此處，係使用如氧化鈦（titanium oxide）或氧化鋅（zinc oxide）等白色無機粉末。
另一方面，紫外線吸收劑，係在皮膚表面吸收紫外線轉變成熱能釋放出去，而防止滲透到皮膚。此處，係使用如二苯甲酮衍生物（benzophenone derivatives,）或苯並三唑衍生物（benzotriazole derivatives）等的合成化合物。又，近年來,作為對皮膚友善的紫外線吸收劑，係使用天然素材，例如，於下述專利文獻1中，已建議使用金銀花（Lonicera japonica）、杜仲（Eucommia ulmoides）、歐芹葉（parsley leaf）、番石榴葉（guava leaf）和馬黛茶（mate tea）等的抽提物作為天然類的紫外線吸收劑。
專利文獻1特開平8-120255號公報 發明所欲解決之問題
附帶說明，關於紫外線散亂劑和紫外線吸收劑，存在有限的效果持續性和皮膚負擔很大的問題。此外，在前述專利文獻1中提出的天然類的紫外線吸收劑，即使是對皮膚溫和之物，也存在效果持久性的問題，這不能作為預期具有防止皮膚光老化的效果之物。
於此，本發明處理前述各種問題，不只是塗覆紫外線散亂劑或紫外線吸收劑等在皮膚表面使紫外線直接散射或吸收，也希望在皮膚內部皮膚細胞的防禦功能發揮正常作用，以提供能夠從根本上預防紫外線造成的皮膚光老化的皮膚光老化預防劑做為目標。 解決問題的方法
在前述問題的解決上，本發明的發明團隊，藉由聚焦於人類皮膚的表皮細胞和真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）之間的串擾（crosstalk）《在細胞間，一面接受傳遞信號，而同時其他路徑也受到影響》，確認紫蘇油（perilla oil）對皮膚的光老化的預防效果，至此完成本發明。
亦即，本發明有關之皮膚的光老化預防劑，依據申請專利範圍第1項之記載， 係用於預防因紫外線照射而生之皮膚光老化的預防劑，含有以α-次亞麻油酸（alpha-linolenic acid）衍生物為有效成分，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第2項之記載，係申請專利範圍第1項所述之皮膚的光老化預防劑， 前述α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）衍生物，係至少1個分子的α-次亞麻油酸是與酯類結合的三酸甘油酯（triglyceride），以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第3項之記載，係申請專利範圍第1項或第2項所述之皮膚的光老化預防劑， 前述α-次亞麻油酸衍生物，係含在於紫蘇油（perilla oil）、亞麻仁油（flaxseed Oil、linseed oil）、紫蘇籽油（perilla seed oil）、奇亞籽油（chia seed oil）、印加果油（Sacha Inchi oil）或綠核果油（green nuts oil）中者，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第4項之記載，係申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑， 藉由抑制人類真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）生成量降低而預防前述的光老化，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第5項之記載，係申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑， 將紫外線照射所致之人類表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）的細胞毒性（cytotoxicity）的減弱效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第6項之記載，係申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑， 將紫外線照射所致之細胞內活性氧類（reactive oxygen species）濃度增加的抑制效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第7項之記載，係申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑， 將紫外線照射所致之人類表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）的細胞毒性（cytotoxicity）的作為主因的人類真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）合成量降低的抑制效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第8項之記載，係申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑， 將紫外線照射所致之白血球介素-8（Interleukin-8, IL-8）合成量增加的抑制效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵。
又，本發明，依據申請專利範圍第9項之記載，係申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑， 將紫外線照射所致之人類真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）合成量的增加效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵。
又，本發明相關之功能性化妝品，依據申請專利範圍第10項之記載， 係含有申請專利範圍第1項至第9項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，以此為特徵。 發明之成果 発明の効果
依據前述結構組成，本發明相關之皮膚的光老化預防劑，含有α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）衍生物作為有效成分；又，此α-次亞麻油酸衍生物也可以是至少1分子的α-次亞麻油酸與酯類結合的三酸甘油酯（triglyceride）。又，這些有效成分也可以是紫蘇油（perilla oil）、亞麻仁油（flaxseed Oil、linseed oil）、紫蘇籽油（perilla seed oil）、奇亞籽油（chia seed oil）、印加果油（Sacha Inchi oil）或綠核果油（green nuts oil）之物。此皮膚的光老化預防劑，藉由抑制人類真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）產生量降低而預防光老化《詳細內容於後述明》。
又，依據前述結構組成，本發明相關之皮膚的光老化預防劑，因紫外線照射所致之人類表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）的細胞毒性（cytotoxicity）的減弱效果的顯現、細胞內活性氧類（reactive oxygen species）濃度增加的抑制效果的顯現、人類表皮角質細胞的細胞毒性為要因之真皮纖維母細胞的膠原蛋白生成量降低的抑制作用的顯現、白血球介素-8（Interleukin-8, IL-8）合成量增加的抑制效果的顯現、以及、人類真皮纖維母細胞的膠原蛋白生成量的增加作用的顯現等之中，至少有一者作為主要因素，藉由抑制人類真皮纖維母細胞的膠原蛋白產生量降低而預防光老化。
因此，依據前述結構組成，在皮膚表面塗覆紫外線散亂劑或紫外線吸收劑等，不只是使紫外線直接散射或吸收，在皮膚的內部，使皮膚細胞的防禦功能正常作用，可以從根本預防因紫外線造成的皮膚的光老化，可以提供皮膚的光老化預防劑。
以下，將詳細說明本發明。首先，說明關於皮膚老化，皮膚老化有生理老化和光老化，因慢性地暴露於太陽光而進行的光老化，由於真皮基質（dermal matrix）的質有量的改變，在其表面生出皺紋（wrinkles）和鬆弛（slack）。
圖1係顯示皮膚的光老化中的表皮細胞和真皮纖維母細胞的串擾（crosstalk）的概念示意圖（conceptual diagram）。在圖1中，暴露在紫外線《以下也稱為『UV』》的皮膚內部，生成活性氧類（reactive oxygen species）《以下也稱為『ROS』》，活性氧類對纖維母細胞作用，使膠原蛋白分解酵素的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase-1）《以下也稱為『MMP1』》的合成被促進；又，作用於表皮細胞的情形時，產生促炎性細胞因子（proinflammatory cytokine）的白血球介素-1α（interleukin-1α）《以下也稱為『IL-1α』》、白血球介素-6（interleukin-6）《以下也稱為『IL-6』》和白血球介素-8（interleukin-8）《以下也稱為『IL-8』》。
這些促炎性細胞因子，不僅會引起發炎，還自分泌性地（autocrine）、旁分泌性地（paracrine）作用於膠原蛋白合成抑制因子（collagen synthesis inhibitor）《以下也稱為『CCN1』》，對真皮基質的代謝系統有很大的影響，被認為因為此基質成分的合成和分解的平衡變調，而形成光老化皮膚。
另一方面，α-次亞麻油酸，係與二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid；DHA）或二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid；EPA）等相同的奥米茄-3脂肪酸《又稱n−3脂肪酸》（omega-3 fatty acid；ω−3 fatty acid）的一種，係無法在人體內合成的必需脂肪酸；又，α-次亞麻油酸等的n−3類脂肪酸《分子中的雙鍵有3個》，已知以中性脂肪值的降低、防止心律不齊（arrhythmia）發生、改善血管內皮細胞（vascular endothelial cell）的功能、防止血栓生成等的生理作用為媒介，可以對文明病（lifestyle disease）的預防效果發生有效作用。再者，近年來含有多量α-次亞麻油酸的紫蘇油《含有做為三酸甘油酯的α-次亞麻油酸》等的美肌效果也受到矚目。
關於本發明，除了藉著前述的各生理作用所得之效果或美肌效果之外，也確認具有使皮膚細胞對紫外線的防禦功能正常作用的機能；特別是，於本發明中，係使用α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）衍生物；作為α-次亞麻油酸衍生物，例如，可列舉使用的有至少1分子的α-次亞麻油酸與酯類結合的三酸甘油酯。
α-次亞麻油酸與酯類結合的三酸甘油酯，有：α-次亞麻油酸三酸甘油酯（α-linolenic acid triglyceride）、α-次亞麻油酸二酸甘油酯（α-linolenic acid diglyceride）、和α-次亞麻油酸單酸甘油酯（α-linolenic acid monoglyceride），也可以是它們的混合物。又，甘油（glycerol）的3個羥基（hydroxyl group）之中，α-次亞麻油酸和酯結合以外的羥基，也可以是其他有機酸例如亞麻油酸（linoleic acid）等和酯結合。
大量含有α-次亞麻油酸和酯結合的三酸甘油酯的植物油《主要從種子詐取》，可列舉使用的有紫蘇油（perilla oil）、亞麻仁油（flaxseed Oil、linseed oil）、紫蘇籽油（perilla seed oil）、奇亞籽油（chia seed oil）、印加果油（Sacha Inchi oil）、和綠核果油（green nuts oil）等；這些油類之中，據說紫蘇油含有的α-次亞麻油酸多達總脂肪的50～65%的量。
其次，有關本發明使皮膚細胞的防禦功能正常作用加以說明；關於本發明的實施型態，將利用含有多量α-次亞麻油酸與酯類結合的三酸甘油酯的紫蘇油加以說明。再者，本發明相關之α-次亞麻油酸衍生物的作用效果，並不僅限於紫蘇油，也可以是其他含有α-次亞麻油酸衍生物的植物油。
本發明的發明團隊，為了確認對於光老化皮膚的進行有預防效果， 第1階段：被紫外線B波照射的人類真皮角質細胞（human dermal keratinocytes）《以下也稱為HaCaT細胞》的細胞毒性的減弱效果； 第2階段：對細胞內活性氧類（reactive oxygen species）《以下也稱為『ROS』》的濃度增加的抑制效果； 第3階段：對於因紫外線B波照射導致膠原蛋白合成量減低的抑制效果； 第4階段：對於因紫外線B波照射導致白血球介素-8（interleukin-8, IL-8）合成量增加的紫蘇油抑制效果、 第5階段：對於人類真皮纖維母細胞（Normal Human Dermal Fibroblast）《以下也稱為『NHDF』》的膠原蛋白合成量的紫蘇油促進效果； 確認此5階段。
以下，針對各階段加以說明。又，前述5階段之中，第1階段～第3階段中，使用紫蘇油《α-次亞麻油酸含量55%》作為α-次亞麻油酸衍生物，其比較對象則使用α-次亞麻油酸《100%游離酸試劑》。
＜第1階段＞ 於本第1階段，確認相關的紫外線B波照射過的人類真皮角質細胞（human dermal keratinocytes）《HaCaT細胞》的細胞毒性的減弱效果。首先，確認對於紫蘇油和α-次亞麻油酸的HaCaT細胞的毒性作為初步確認（Preliminary confirmation）；在培養基中植入HaCaT細胞《3.5Í104 細胞／井（cells／well）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時。其次，改換為已添加預定濃度的紫蘇油或α-次亞麻油酸的培養基，再於37℃、5%二氧化碳（CO2）環境下，培養24小時。然後，細胞存活率（cell viability）用細胞存活率分析法（MTT assay；3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay；yellow tetrazol assay）作比色測定（colorimetric determination），加以評價。
圖2係表示紫蘇油（perilla oil）對人類角質細胞（human keratinocyte）HaCaT細胞的毒性的圖表。圖3係表示α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）對人類角質細胞的毒性的圖表。在任一者的圖表中，縱軸係細胞存活率《%》、橫軸係表示紫蘇油或α-次亞麻油酸的細胞處理濃度《微克／毫升（μg／ml）》。從圖2的結果來看，紫蘇油的細胞處理可能濃度為300微克／毫升；又，從圖3的結果來看，α-次亞麻油酸的細胞處理可能濃度為75微克／毫升。
其次，實施紫蘇油或α-次亞麻油酸的紫外線B波耐量試驗（tolerance test）。首先，培養基中植入HaCaT細胞《3.5Í104 細胞／井（cells／well）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時。接著，對這些細胞進行照射強度0～80毫焦耳／平方厘米（mJ／cm2 ）的紫外線B波照射；再來，改換為已添加預定濃度的紫蘇油或α-次亞麻油酸的培養基，再於37℃、5%二氧化碳（CO2）環境下，培養24小時。然後，細胞存活率（cell viability）用細胞存活率分析法（MTT assay；yellow tetrazol assay）作比色測定（colorimetric determination），加以評價。
圖4係表示紫蘇油對紫外線B波照射過《20毫焦耳／平方厘米》的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(1)；圖5係表示α-次亞麻油酸對紫外線B波照射過《20毫焦耳／平方厘米》的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(1)。在任一者的圖表中，縱軸係細胞存活率《%》、橫軸係表示紫蘇油或α-次亞麻油酸的細胞處理濃度《微克／毫升（μg／ml）》。從圖4的結果來看，紫蘇油150微克／毫升以上處理的細胞，無論有無紫外線B波照射，細胞存活率都增加；另一方面，從圖5的結果來看，α-次亞麻油酸37.5微克／毫升以上處理的細胞，會由於紫外線B波照射的有無而導致細胞死亡。
另一方面，圖6係表示紫蘇油對紫外線B波照射過《0～80毫焦耳／平方厘米》的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(2)；圖7係表示α-次亞麻油酸對紫外線B波照射過《0～80毫焦耳／平方厘米》的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(2)。在任一者的圖表中，縱軸係細胞存活率《%》、橫軸係表示紫外線B波照射強度《毫焦耳／平方厘米（mJ／cm2 ）》。從圖6的結果來看，雖然依據紫外線B波照射強度而導致細胞死亡，但是紫蘇油的處理抑制了細胞死亡（cell death）；另一方面，從圖7的結果來看，雖然依據紫外線B波照射強度而導致細胞死亡，但是α-次亞麻油酸的處理卻促進細胞死亡。
從這些結果來看，可以了解紫蘇油有意義地抑制因紫外線B波照射所致之HaCaT細胞的細胞損傷（cell damage）；與此相比，α-次亞麻油酸沒有抑制細胞損傷，反而促進細胞損傷。因此，紫蘇油《α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》被認為藉由某些作用對皮膚老化是有效的。
＜第2階段＞ 於此第2階段，確認對於細胞內活性氧類《細胞內ROS》濃度增加的抑制作用。首先，首先，培養基中植入HaCaT細胞《3.5Í104 細胞／井（cells／well）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時。接著，對這些細胞進行照射強度20毫焦耳／平方厘米（mJ／cm2 ）的紫外線B波照射；再來，改換為已添加預定濃度的紫蘇油或α-次亞麻油酸的培養基《0.5%胎牛血清（Fetal Bovine Serum；FBS）／杜氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM）》，再於37℃、5%二氧化碳（CO2）環境下，培養24小時。
接下來，藉由細胞內活性氧類反應螢光探針（reactive fluorescent probe）《H2 DCFDA（2',7'-二氯二氫螢光素二乙酸酯；2',7'-dichloro dihydro fluorescein diacetate）》進行細胞內活性氧類濃度的測定。測定係用聚氰基丙烯酸正丁酯套組《BCA kit（Bicinchoninic Acid kit）》定量細胞蛋白質，對細胞蛋白質的螢光強度《螢光強度（fluorescence intensity；F.I.）／微克蛋白質（μg protein）》加以評價。
圖8係表示紫蘇油對紫外線B波照射後《20毫焦耳／平方厘米》的細胞內活性氧類（ROS）增加的影響的圖表；圖9係表示α-次亞麻油酸對紫外線B波照射後《20毫焦耳／平方厘米》的細胞內活性氧類增加的影響的圖表。在任一者的圖表中，縱軸係細胞內活性氧類濃度《螢光強度／微克蛋白質》、橫軸係表示紫蘇油或α-次亞麻油酸的細胞處理濃度《微克／毫升（μg／ml）》。從圖8的結果來看，紫蘇油18.8微克／毫升以上處理的細胞，因紫外線B波照射而誘導的細胞內活性氧類濃度增加，受到抑制；另一方面，從圖9的結果來看，因紫外線B波照射而誘導的細胞內活性氧類濃度並沒有被抑制，在75微克／毫升的濃度時，確認細胞內活性氧類濃度反而增加。
從以上結果來看，紫蘇油抑制因紫外線B波照射而致的細胞內活性氧類濃度上升；與此比較，α-次亞麻油酸卻未抑制因紫外線B波照射而致的細胞內活性氧類濃度上升，反而隨著濃度而使之增加。因此，紫蘇油《α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》被認為係藉由抑制因紫外線B波照射表皮細胞使細胞內活性氧類濃度增加，而具有減緩細胞損傷的作用。
＜第3階段＞ 於第3階段，確認對於因紫外線B波照射所致之膠原蛋白合成量減低的抑制效果。首先，培養基中植入HaCaT細胞《3.5Í104 細胞／井（cells／well）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時，接著，對這些細胞進行照射強度20毫焦耳／平方厘米（mJ／cm2 ）的紫外線B波照射；再來，改換為已添加預定濃度的紫蘇油或α-次亞麻油酸的培養基《0.5%胎牛血清（Fetal Bovine Serum；FBS）／杜氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM）》，再於37℃、5%二氧化碳（CO2）環境下，培養24小時。又，從收回的培養基上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯套組《BCA kit（Bicinchoninic Acid kit）》定量細胞蛋白質。
另一方面，在植入正常人類真皮纖維母細胞《NHDF》《2Í104 細胞／井（cells／well）》的培養基中添加收回的培養基上清液，於37℃、5%二氧化碳（CO2）環境下，培養24小時；然後，用酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay）《ELISA法》定量I型膠原蛋白《COL I（Type I collagen）》，接著，從已定量的I型膠原蛋白合成量和培養基上清液的蛋白質數量，算出每個細胞蛋白質的膠原蛋白量。
圖10係表示紫蘇油對經由紫外線B波照射後《20毫焦耳／平方厘米》的人類角質細胞HaCaT細胞的培養上清液處理之人類真皮纖維母細胞《NHDF》的膠原蛋白產生量的影響的圖表；圖11係表示α-次亞麻油酸對經由紫外線B波照射後《20毫焦耳／平方厘米》的人類角質細胞HaCaT細胞的培養上清液處理之人類真皮纖維母細胞的膠原蛋白產生量的影響的圖表。在任一者的圖表中，縱軸係無紫外線B波照射為基準的I型膠原蛋白合成量《%》、橫軸係表示紫蘇油或α-次亞麻油酸的細胞處理濃度《微克／毫升（μg／ml）》。從圖10的結果來看，因紫外線B波照射使I型膠原蛋白合成量顯著減少，而紫蘇油係濃度依賴性地抑制該減少；另一方面，從圖11的結果來看，α-次亞麻油酸無法抑制因紫外線B波照射所致之I型膠原蛋白合成量減少。
＜第4階段＞ 於本第4階段，確認紫蘇油對因紫外線B波照射所致之白血球介素-8《IL-8》合成量增加的抑制效果。首先，培養基中植入HaCaT細胞《4.0Í104 細胞／井（cells／well）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時，接著，對這些細胞進行照射強度30毫焦耳／平方厘米（mJ／cm2 ）的紫外線B波照射；再來，改換為已添加0～300微克／毫升的紫蘇油的培養基《0.5%胎牛血清（FBS）／杜氏改良伊格爾培養基（DMEM）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時，收回該培養基上清液。然後，從收回的培養基上清液，用酵素連結免疫吸附分析法《ELISA法》定量白血球介素-8的合成量。
圖12係表示紫蘇油對經由紫外線B波照射而增強的白血球介素-8（Interleukin-8, IL-8）產生的影響的圖表。於圖12中，縱軸係蛋白質中白血球介素-8的合成量《微微克（pg）／微克蛋白質（μg protein）》，橫軸係表示紫蘇油的細胞處理濃度《微克／毫升（μg／ml）》。從圖12的結果來看，因紫外線B波照射使白血球介素-8合成量顯著增加，而紫蘇油係濃度依賴性地抑制該增加。
＜第5階段＞ 於本第5階段，確認紫蘇油對人類真皮纖維母細胞《NHDF》的膠原蛋白合成量的促進作用。首先，在培養基中植入正常人類真皮纖維母細胞《NHDF》《2Í104 細胞／井（cells／well）》，於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時；其次，改換為添加預定濃度的紫蘇油的培養基《0.5%胎牛血清（FBS）／杜氏改良伊格爾培養基（DMEM）》，再於37℃、5%二氧化碳（CO2 ）環境下，培養24小時，收回此培養基上清液。
接下來，用酵素連結免疫吸附分析法《ELISA法》定量I型膠原蛋白《COL I》合成量的同時，也從培養基上清液藉由聚氰基丙烯酸正丁酯套組《BCA kit（Bicinchoninic acid kit）》定量細胞蛋白質。其次，從已定量完成的I型膠原蛋白合成量和培養基上清液的蛋白質數量算出相當每個細胞蛋白質的膠原蛋白數量。
圖13係表示紫蘇油對人類真皮纖維母細胞（Normal Human Dermal Fibroblast；NHDF）的膠原蛋白產生量的影響的圖表。於圖13中，縱軸係每個蛋白質中I型膠原蛋白的合成量《毫微克（ng）／微克蛋白質（μg protein）》，橫軸係表示紫蘇油的細胞處理濃度《微克／毫升（μg／ml）》。從圖13的結果來看，紫蘇油使纖維母細胞每個蛋白質的I型膠原蛋白合成量上升係濃度依賴性。
因此，從地4階段和第5階段的結果來看，應可瞭解紫蘇油《α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》抑制因紫外線B波照射表皮細胞而誘導的白血球介素-8的分泌增加、也抑制真皮纖維母細胞的膠原蛋白合成量的減少。
綜合整理以上結果，顯示在圖14。圖14係表示表皮細胞和真皮纖維母細胞的串擾（crosstalk）中，抑制光老化皮膚的進行的紫蘇油的作用之概念示意圖。於圖14中，紫蘇油《α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》使因紫外線B波照射而上升的細胞內活性氧類減低，具有減輕HaCaT細胞的細胞損傷的作用。
再者，紫蘇油《α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》由於抑制了因紫外線照射所致皮膚細胞過度分泌的膠原蛋白合成能力減低的相關的某些體液因素（humoral factor）的分泌，具有抑制因紫外線照射所致膠原蛋白合成能力減低的作用。
因此，紫蘇油《α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》藉由減輕因紫外線所致之皮膚細胞的細胞損傷，被認為具有抑制皮膚光老化的進行的作用。
其次，作為皮膚的光老化預防劑的α-次亞麻油酸衍生物《主要是α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯》置入皮膚內的方法，將加以說明。最直接的方法，可以從皮膚進入皮膚的內部，具體來說，可以認為是作為各種化妝品進入皮膚中。以下，藉由實施例，關於功能性化妝品加以說明；還有，本發明相關之功能性化妝品並未侷限於以下的實施例。 【實施例】
於本實施例中，含有多量α-次亞麻油酸和酯類結合的三酸甘油酯的紫蘇油做為皮膚的光老化預防劑，列舉含有此功能性化妝品的配方例（formulation example）。
＜配方例1：化妝霜劑（cosmetic cream）＞ 紫蘇油                                                                   5.0%重量比 角鯊烷（squalane）                                            20.0%重量比 蜂蠟（beeswax）                                         5.0%重量比 甘油（glycerin）                                         5.0%重量比 單硬脂酸甘油酯（glycerin mono-stearate）     2.0%重量比 防腐劑（preservative）                                       適量 香料                                                                       適量 純淨水（purified water）                                    殘差《其餘的部分》 ＜配方例2：化妝水（cosmetic lotion）＞ 紫蘇油                                                                  5.0%重量比 乙醇（ethanol）                                                   5.0%重量比 甘油（glycerin）                                         2.0%重量比 1,3-丁二醇（1,3-butylene glycol）                     2.0%重量比 聚乙烯油烯基醚（polyethylene oleyl ether）   0.5%重量比 檸檬酸鈉（sodium citrate）                               0.1%重量比 檸檬酸（citric acid）                                          0.1%重量比 純淨水（purified water）                                    殘差《其餘的部分》 ＜配方例3：乳液（milky lotion）＞ 紫蘇油                                                                  5.0%重量比 角鯊烷（squalane）                                            4.0%重量比 凡士林（vaseline）                                             2.5%重量比 鯨蠟醇（cetanol）                                               2.0%重量比 甘油（glycerin）                                         2.0%重量比 親脂性單硬脂酸甘油酯（lipophilic glycerin mono-stearate） 1.0%重量比 硬脂酸（stearic acid）                                        1.0%重量比 L-精胺酸（L‐arginine）                                      1.0%重量比 氫氧化鉀（potassium hydroxide）                     0.1%重量比 香料                                                                       微量 純淨水（purified water）                                    殘差《其餘的部分》 如同前述說明，依據本發明，塗覆紫外線散亂劑或紫外線吸收劑等在皮膚表面，不僅使紫外線直接散射或吸收，在皮膚內部，皮膚細胞的防禦功能可以正常作用，可以提供能從根本上預防因紫外線引起的皮膚光老化之皮膚光老化預防劑。再者，本發明相關之光老化預防劑，雖然被應用在前述功能性化妝品上，但也被認為可應用作為功能性食品的其他方面的用途。
【圖1】係顯示皮膚的光老化中的表皮細胞和真皮纖維母細胞的串擾（crosstalk）的概念示意圖（conceptual diagram）。 【圖2】係表示紫蘇油（perilla oil）對人類角質細胞（human keratinocyte）HaCaT細胞的毒性的圖表。 【圖3】係表示α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）對人類角質細胞（human keratinocyte）的毒性的圖表。 【圖4】係表示紫蘇油對紫外線B波照射過的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(1)。 【圖5】係表示α-次亞麻油酸對紫外線B波照射過的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(1)。 【圖6】係表示紫蘇油對紫外線B波照射過的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(2)。 【圖7】係表示α-次亞麻油酸對紫外線B波照射過的人類角質細胞HaCaT細胞的細胞毒性試驗的影響的圖表(2)。 【圖8】係表示紫蘇油對紫外線B波照射後的細胞內活性氧類（reactive oxygen species；ROS）增加的影響的圖表。 【圖9】係表示α-次亞麻油酸對紫外線B波照射後的細胞內活性氧類（reactive oxygen species；ROS）增加的影響的圖表。 【圖10】係表示紫蘇油對經由紫外線B波照射後的人類角質細胞HaCaT細胞的培養上清液處理之人類真皮纖維母細胞（Normal Human Dermal Fibroblast；NHDF）的膠原蛋白產生量的影響的圖表。 【圖11】係表示α-次亞麻油酸對經由紫外線B波照射後的人類角質細胞HaCaT細胞的培養上清液處理之人類真皮纖維母細胞（Normal Human Dermal Fibroblast；NHDF）的膠原蛋白產生量的影響的圖表。 【圖12】係表示紫蘇油對經由紫外線B波照射而增強的白血球介素-8（Interleukin-8, IL-8）產生的影響的圖表。 【圖13】係表示紫蘇油對人類真皮纖維母細胞（Normal Human Dermal Fibroblast；NHDF）的膠原蛋白產生量的影響的圖表。 【圖14】係表示表皮細胞和真皮纖維母細胞的串擾（crosstalk）中，抑制光老化皮膚的進行的紫蘇油的作用之概念示意圖。

Claims (10)

  1. 一種皮膚的光老化預防劑，係為了預防因紫外線照射而誘發之皮膚的光老化，含有以α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）衍生物為有效成分，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之皮膚的光老化預防劑，其中前述α-次亞麻油酸（Alpha-linolenic acid）衍生物，係至少有1分子的α-次亞麻油酸是與酯類結合的三酸甘油酯（triglyceride），以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之皮膚的光老化預防劑，其中前述α-次亞麻油酸衍生物，係含在於紫蘇油（perilla oil）、亞麻仁油（flaxseed Oil、linseed oil）、紫蘇籽油（perilla seed oil）、奇亞籽油（chia seed oil）、印加果油（Sacha Inchi oil）或綠核果油（green nuts oil）中者，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，藉由抑制人類真皮纖維母細胞（human dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）生成量降低而預防前述的光老化，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，將紫外線照射所致之人類表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）的細胞毒性（cytotoxicity）的減弱效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  6. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，將紫外線照射所致之細胞內活性氧類（reactive oxygen species）濃度增加的抑制效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  7. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，將紫外線照射所致之人類表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）的細胞毒性（cytotoxicity）的作為主因的人類真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）合成量降低的抑制效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  8. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，將紫外線照射所致之白血球介素-8（Interleukin-8, IL-8）合成量增加的抑制效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  9. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，將紫外線照射所致之人類真皮纖維母細胞（dermal fibroblasts）的膠原蛋白（collagen）合成量的增加效果的顯現作為一個主要因素，以此為特徵之皮膚的光老化預防劑。
  10. 一種功能性化妝品，係含有申請專利範圍第1項至第9項之任一項所述之皮膚的光老化預防劑，以此為特徵之功能性化妝品。
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