TW202011997A - 抗體藥物綴合物及其治療癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種抗體-藥物綴合物，其中所述抗體特異性鍵結至TfR、轉鐵蛋白受體，且其中所述藥物較佳選自細胞毒性藥物。所述抗體-藥物綴合物特別可用於治療包括癌症的增殖性疾病，諸如淋巴瘤或白血病。

Description

抗體藥物綴合物及其治療癌症的用途
以下揭露一種抗體-藥物綴合物，其中該抗體特異性鍵結至TfR、轉鐵蛋白受體，且其中該藥物較佳選自細胞毒性藥物。所述抗體-藥物綴合物特別可用於治療包括癌症的增殖性疾病，諸如淋巴瘤或白血病。
抗體-藥物綴合物(antibody-drug conjugates；下文稱為“ADC”)是一類新的治療劑，特別是癌症治療劑。此類ADC至少包含抗體和有效負載(例如，細胞毒性藥物)，二者均藉由連接子鍵結。因此，ADC被設計成將抗體標靶的特異性與有效負載的效率(例如，化學治療劑的細胞毒性)相鍵結。有效的ADC應呈現高特異性和低毒性。
在毒性的背景下，ADC的抗體需要準確地且效率鍵結至其抗原，這意味著合適的標靶抗原優先或僅在標靶細胞上表現。
一些專利或專利申請案，諸如US6214345、WO 03/026577、WO 03/043583、WO 2004/010957、WO 2005/082023和WO 2015/001117揭露可用於製造ADC的連接子。已被用於將細胞毒素或藥物綴合至抗體的連接子類型的實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽連接子。連接子例如選自易受溶酶體區室內的低pH裂解或易受蛋白酶切割之彼等者，該蛋白酶諸如優先在腫瘤組織中表現的蛋白酶，例如組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶D)。有效的連接子可確保準確且及時地釋放有效負載。在毒性的背景下，似乎連接子的穩定性可影響有效負載所施加的毒性，即使連接子本身似乎不會驅動毒性。實際上，穩定的連接子可以標靶特異性的方式釋放有效負載，而不穩定的連接子更可能經歷有效負載的非準確釋放(例如，由於非特異性切割)，導致非-特異性毒性。
ADC中使用的有效負載是非常有效的，通常是皮莫耳範圍內的細胞毒性藥物。常見有效負載例如微管抑制劑(諸如美登素(maytansine)衍生物(DM1/DM4)或奧瑞他汀(auristatins) (MMAE/MMAF))、DNA合成抑制劑(諸如卡奇黴素(calicheamicin)，阿黴素(doxorubicin)、吡咯并苯并二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepine)、吲哚并苯并二氮雜卓(indolinobenzodiazepine)或倍癌黴素(duocarmycin)衍生物)或拓撲-異構酶抑制劑(諸如SN-38)。
儘管ADC似乎是有前景的治療方法，但是一些ADC可能毒性太大，此限制這些化合物的治療範圍或阻止進一步的臨床開發。
因此，呈現高特異性、最高效率和低毒性之有效的ADC需要適當組合其每種組分。
轉鐵蛋白受體(CD71) (下文稱為“TfR”)是一種二硫鍵聯的同型二聚體跨膜醣蛋白，其由兩個各自約90kDa的760個胺基酸單體組成。TfR在鐵攝取和細胞生長的調節中起關鍵作用(Gillet al ., N Engl J Med., 332,1744-1748, 1995 - Hermineet al ., N Engl J Med., 332, 1749-1751, 1995)。當二鐵轉鐵蛋白鍵結至其細胞表面受體時，它經由網格蛋白包被的凹坑內化到酸性囊泡中，其中鐵-轉鐵蛋白複合物經解離。釋放之後，受體和原-轉鐵蛋白再循環回到細胞表面。
TfR在不斷更新的組織的細胞質膜上持續表現，諸如骨髓中的血液細胞的前體、肝臟中的肝細胞、表皮中的角質細胞和腸上皮的隱窩中的腸細胞。
一些研究顯示了，TfR在惡性組織中比在其健康對應物中表現更多(Gatteret al. , J Clin Pathol., 36,539-545, 1983 - Faulket al. , Lancet., 2,390-392, 1980 - Shindelmanet al. , Int J Cancer, 27,329-334, 1981)。一些作者報導了基於這種想法的治療方法途徑，使用抗-TfR抗體或轉鐵蛋白本身綴合至藥物以殺死惡性細胞。其亦提出使用抗-TfR抗體來阻斷轉鐵蛋白與TfR之間的相互作用，並因此阻止鐵攝取，導致鐵剝奪和細胞生長的負調節。然而，儘管許多出版物描述了抗-TfR抗體的製備，但是卻很少有關於具有抗增殖性活性的抗-TfR單株抗體(mAb)的報導。
在先前的出版物(Mouraet al., J Exp Med, 194, 417-425, 2001)中，作者報導了一種小鼠單株IgG(IgG2kappa)，命名為A24，其鍵結至人類TfR。
WO 2005/111082揭露該A24抗體，能夠阻斷T細胞增殖的鼠類抗體，並且其似乎比前述mAb 42/6在抑制T細胞的增殖方面更有效。A24亦降低細胞表面的TfR表現並減損TfR的再循環。A24還能夠阻斷急性和慢性兩種ATL形式的惡性T細胞的離體增殖(Mouraet al., Blood , 103,5, 1838-45,1 March 2004, Callenset al. , 2010; J. Exp. Med. , Vol 207 No 4, pp731-750)。此抗體還被描述為能夠在體外和體內防止套膜細胞淋巴瘤腫瘤發展(Lepelletieret al. Cancer Res 2007; 67:1145-1154; Callenset al. 2008, Leukemia, 22, 42-48)。
WO 2017/013230進一步揭露A24抗體的人源化形式，以及它們在治療增殖性疾病中的用途。其亦揭露與治療部分綴合的抗-TfR抗體，諸如細胞毒素或藥物。然而，在WO 2017/013230中沒有揭露特異性的ADC。
因此，需要一種包含有效的抗-TfR抗體的ADC，其具有高特異性和低毒性。
因此，本案發明人開發了前述ADC。本發明確實依賴於它們無法預期的效果，顯示出本發明的ADC(亦即，包含特異性抗-TfR抗體與特異性連接子和藥物組合)具有以下優點： - A24和ADC對表現TfR的細胞具有相似的鍵結功效； - ADC僅誘導CD71陽性細胞的細胞凋亡； - ADC在多細胞株中有效； - ADC在體外和體內均有效； - ADC既不會引起脫靶效應(例如，不釋放促發炎細胞激素)也不會引起體內毒性作用。
因此，本發明關於一種式(I)：Ab-L-Z-X-D的ADC，其中： - Ab係抗-TfR抗體， - L係鍵結至所述抗體的連接子分子，所述連接子分子係式(II)：
Figure 02_image001
式(II) 其中，n係2和20之間的整數， - Z係鍵結至L的纈胺酸-瓜胺酸二肽， - X係鍵結至Z的胺基苯甲基酯自消耗性基(self-immolative group)， - D係鍵結至X的藥物。
在可與其他實施例組合的具體實施例中，D係細胞毒性藥物。較佳地，所述D係藥物單甲基奧瑞他汀E(以下稱為“MMAE”)。
在可與其他實施例組合的具體實施例中，X係共價鍵結至Z的對-胺基苯甲基酯基，所述X係下式(III)：
Figure 02_image003
式(III) J係選自F、Cl、Br、NO2 、NHCOCH3 、N(CH3 )2 、NHCOCF3 、烷基、和鹵烷基中的任選取代基，且m係0、1、2、3和4的整數，較佳地，X係對-胺基苯甲基酯，其中m係0。
在可與其他實施例組合的具體實施例中，L係共價鍵結至所述抗體中之一個或多個硫醇殘基。較佳地，L對應於下式(IV)的連接子分子：
Figure 02_image005
式(IV) 。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體包括全長抗體或含有抗原鍵結部分的抗體片段。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體特異性鍵結至SEQ ID NO：16之轉鐵蛋白受體。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體與轉鐵蛋白受體鍵結的KD為10nM或更低，較佳KD為1nM或更低。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體誘導HL-60細胞株的細胞凋亡至與用相對嵌合抗體測量的誘導水平相等或更高的水平，所述嵌合抗體具有SEQ ID NO：9之VH和SEQ ID NO：10之VL的親代鼠類可變區。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體係單株抗體。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體係人源化抗體。
在可與其他實施例組合的另一具體實施例中，所述抗體包含人類IgG4同型恆定區，或突變或化學修飾的恆定區，其中，在與具有野生型IgG1同型恆定區的相應抗體相比時，所述突變或化學修飾的恆定區對所述抗體不賦予ADCC活性或降低ADCC活性。可供選擇地，所述抗體包含人類IgG1同型恆定區，或突變或化學修飾的恆定區，其中，在與具有野生型IgG1同型恆定區的相應抗體相比時，所述突變或化學修飾的恆定區賦予所述抗體增加的ADCC活性。
在可與其他實施例組合的另一具體和較佳的實施例中，所述抗-TfR抗體係IgG4同型的單株和人源化抗體。
在可與其他實施例組合的另一具體和較佳的實施例中，所述抗-TfR抗體包含： (a) 包含SEQ ID NO：1之HCDR1、SEQ ID NO：2之HCDR2、SEQ ID NO：3之HCDR3的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：4之LCDR1、SEQ ID NO：5之LCDR2和SEQ ID NO：6之LCDR3的可變輕鏈多肽； (b) 包含SEQ ID NO：1之HCDR1、SEQ ID NO：2之HCDR2、SEQ ID NO：3之HCDR3的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：4之LCDR1、SEQ ID NO：8之LCDR2和SEQ ID NO：6之LCDR3的可變輕鏈多肽； (c) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：13之VL的可變輕鏈多肽； (d) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：14之VL的可變輕鏈多肽； (e) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：15之VL的可變輕鏈多肽； (f) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：13之VL的可變輕鏈多肽； (g) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：14之VL的可變輕鏈多肽；或 (h) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：15之VL的可變輕鏈多肽。
可用於本發明之ADC的抗體的實例包括人源化抗-TfR抗體mAb1至mAb16，如下所述，特別是表1中。較佳地，所述抗體係包含SEQ ID NO：18之重鏈和SEQ ID NO：17之輕鏈的mAb1。
本發明亦揭露如上所定義的ADC，其用作為藥劑，特別是用於治療癌症。所述癌症較佳係血液腫瘤，且更具體係淋巴瘤或白血病。可供選擇地，所述ADC亦可用於治療實體腫瘤。
本發明進一步關於一種醫藥組合物，包含如上所定義的ADC，與一種或多種醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合，任選地包含其他活性成分。
本發明進一步關於一種組合物，包含如上所定義的ADC，進一步包含組胺酸，且具有6.5的pH。所述組合物亦可包含蔗糖和聚山梨醇酯80。
在一具體實施例中，所述組合物係凍乾調配物，或所述ADC以治療可接受的量包含在預填充注射器或預填充小瓶中。
本發明進一步關於一種獲得如上所定義的ADC的方法，其中該方法包括： - 在適合於表現編碼如上所定義的抗體的核酸的條件下培養宿主細胞； - 分離所述抗體； - 使單甲基奧瑞他汀E鍵結至下式(V)的連接子L-Z-X的合成；
Figure 02_image007
式(V) - 使所述抗體綴合至經鍵結至式(V)的連接子L-Z-X的單甲基奧瑞他汀E。
[定義]
為了更容易理解本發明，首先定義某些術語。在全文詳細說明中闡述了另外的定義。
除非另有說明，術語“CD71”或“轉鐵蛋白受體”或“TfR”是指如SEQ ID NO：16中所定義的人類TfR。此序列對應於轉鐵蛋白受體蛋白1同型1(智人) (NCBI參考序列NP_003225.2)。
本文提及的術語“抗體”包括完整抗體和任何抗原鍵結片段(亦即，“抗原鍵結部分”)或其單鏈。天然存在的“抗體”係包含至少兩條藉由二硫鍵相互連接的重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的醣蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可進一步細分為高度變異區，稱為互補性決定區(CDR)，散布有更保守的區域，稱為構架區(FR)。每個VH和VL由以下列順序從胺基末端到羧基末端排列的三個CDR和四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的鍵結結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的鍵結，該宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。如本文所用，術語抗體的“抗原鍵結部分”(或簡稱“抗原部分”)是指抗體的全長或一個或多個片段，其保留特異性鍵結至抗原 (例如，TfR的一部分)的能力。已經顯示，抗體的抗原鍵結功能可以藉由全長抗體的片段來進行。含括在該術語抗體的“抗原鍵結部分”內的鍵結片段的實例包括：Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；F(ab)2片段；包含兩個Fab片段的二價片段，該Fab片段在鉸鏈區處藉由雙硫鍵連接；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體之單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；UniBody，由在鉸鏈區處具有修飾的IgG重鏈(例如，IgG4)的單臂、結構域抗體片段(Wardet al. , 1989 Nature 341:544-546)組成，或由VH結構域組成的奈米抗體片段組成；以及孤立的互補決定區(CDR)；或包含所述抗原鍵結部分的任何融合蛋白。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼，但它們可以使用重組方法藉由合成連接子來連接，使得它們能夠製成單鏈蛋白，其中VL和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Birdet al. , 1988 Science 242:423-426; and Hustonet al. , 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)。此類單鏈抗體也旨在包括在術語抗體的“抗原鍵結部分”內。使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的常規技術獲得這些抗體片段，並以與完整抗體相同的方式篩選該等片段的效用。如本文所用，“分離的抗體”是指實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性鍵結至TfR的分離的抗體實質上不含特異性鍵結至除TfR之外的其他抗原的抗體)。然而，特異性鍵結至TfR的分離的抗體可能與其他抗原(諸如來自其他物種的TfR分子)具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。片語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本文中可與術語“與抗原特異性鍵結的抗體”互換使用。
如本文所用的術語“單株抗體”或“單株抗體組合物”是指單分子組合物的抗體分子的調配物。單株抗體組合物顯示對特定表位的單一鍵結特異性和親和力。
如本文所用，“同型”是指由重鏈恆定區基因提供的抗體類別(例如，IgM、IgE、IgG，諸如IgG1或IgG4)。
如本文所用，“特異性鍵結至抗原”的抗體或蛋白，例如，“特異性鍵結至TfR”意指鍵結至所述抗原的抗體或蛋白(例如，SEQ ID NO：16的人類TfR)，具有KD為100nM或更低，10nM或更低，1nM或更低。
如本文所用，術語“KD”意指解離常數，其由Kd對Ka的比率(亦即，Kd/ Ka)獲得，並表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域中充分建立的方法測定抗體的KD值。用於確定抗體的KD的方法是經由使用表面電漿共振，或使用生物感測器系統，諸如Biacore® 系統。
如本文所用，術語“Kassoc”或“Ka”意指特定抗體-抗原相互作用的鍵結率，而本文所用的術語“Kdis”或“Kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。
如本文所用，術語“親和力”是指抗原與抗原在單個抗原位點處的相互作用的強度。在每個抗原位點內，抗體“臂”的可變區在許多位點處通過弱抗非-共價力與抗原相互作用；相互作用越多，親和力越強。
如本文所用，術語“HL-60細胞株”是指Collins等人衍生出的前骨髓細胞(PNAS 1978,75：2458-1462)，且也在Gallagher等人(Blood, 1979,54：713-733)中描述過，例如，可在ATCC® 收集中心以目錄號CCL-240TM 獲得。
如本文所用，術語“宿主細胞”是指原核細胞或真核細胞。真核細胞，例如哺乳動物宿主細胞、酵母或絲狀真菌是較佳的，且特別是哺乳動物細胞，因為它們比原核細胞更可能組裝和分泌正確折疊和免疫活性的抗體。
如本文所用，抗體“A24”是指在WO 2005/111082中揭露的抗體。
如本文所用，術語“ADCC”或“抗體依賴性細胞毒性”活性是指細胞消耗活性。ADCC活性可以藉由市售可得的ADCC測定來測量，例如，由Promega在Ref#G7015下商業化的ADCC Reporter Bioassay。
如本文所用，術語“細胞凋亡”是指程序性細胞死亡。關於細胞凋亡的更多資訊可以在“Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Susan Elmore,Toxicol Pathol . 2007; 35(4): 495–516＂找到。
如本文所用，術語“EC50 ”是指在指定的暴露時間之後，在基線和最大值之間的中途誘導反應的抗體濃度。例如，這種濃度可以經由GraphPad軟體確定。
如本文所用，術語“受試者”包括任何人類或非人類動物。術語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。術語“受試者”也包括術語“患者”。
如本文所用，術語“藥物”亦指“有效負載”，即與抗體(或片段)綴合的部分。藥物不應解釋為限於典型的化學治療劑。例如，藥物可包括具有所需生物活性的蛋白質、肽或多肽。較佳地，藥物是指治療性部分，諸如細胞毒素。 “細胞毒素”或“細胞毒性劑”包括對細胞(例如殺手細胞)有害的任何試劑。
如本文所用，術語“連接子分子”是指式(II)或式(IV)的化合物。所述連接子分子適合與包含硫醇部分的化合物(諸如抗體)連接。
如本文所用，術語“纈胺酸-瓜胺酸二肽”(下文稱為“二肽VC”)表示由兩個胺基酸纈胺酸和瓜胺酸組成的連接子。此二肽特別是式(VI)：
Figure 02_image009
式(VI)。
如本文所用，術語“胺基苯甲基酯自消耗性基”是指起到自消耗性基作用的胺基苯甲基酯基團。所述基團由式(III)化合物表示。“自消耗性基”可以定義為雙功能性化學部分，其(i)能夠將至少兩個其他化學部分共價連接在一起形成穩定的分子，(ii)可藉助於酶切割的方式從分子中一個間隔的化學部分釋放，和(iii)酶切割後，可以從分子的其餘部分自發切割以釋放另一個間隔的化學部分。
如本文所用，術語“烷基”是指單價飽和烴鏈(具有直鏈或分支鏈)。例如，烷基是指C1 -C20 烷基。較佳地，烷基是“低級烷基”，亦即具有1、2、3、4、5或6個碳的烷基(直鏈或分支鏈C1 -C6 烷基)。例如，此包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、正己基等。
如本文所用，術語“鹵烷基”是指具有一個或多個氫原子經一個或多個鹵素原子取代的烷基。較佳地，鹵烷基是“低級鹵烷基”，亦即具有1、2、3、4、5或6個碳的鹵烷基(直鏈或分支鏈C1 -C6 鹵烷基)。例如，此包括CF3 、CF2 Br、CH2 F、CHFCH3 、CF3 CH2 、CF3 CF2 、CHF2 CF2 、CH2 Cl或CH2 CH2 C1。
如本文所用，術語“鍵結”是指鍵聯。此鍵聯也由式(I)中的短劃線“-”表示。鍵聯可以是共價鍵，或非共價相互作用，諸如透過靜電力。較佳地，鍵結是共價鍵結。如本文所用，式上的“波浪線”表示本發明的ADC的每個部分(Ab、L、Z、X和D)之間的接附位點。
如本文所用，“治療上可接受的量”是指足以實現所需結果的量(例如，腫瘤尺寸的減小、腫瘤生長的抑制、轉移的預防、細胞凋亡的誘導......)。
[重組抗體]
本發明的抗體是抗-TfR抗體。較佳地，所述抗體包括人源化重組抗體mAb1-mAb16，其分離和結構特徵在於其可變重鏈和輕鏈胺基酸序列和人類恆定同型，如下表1中所述： 表1：mAb1-mAb16的可變重鏈和輕鏈胺基酸序列
Figure 108112406-A0304-0001
用於產生mAb1至mAb16的IgG4、IgG1及其突變體形式IgG1 AA和IgG1 N297A的恆定同型區的對應胺基酸和核苷酸編碼序列是本領域所熟知的。全長輕鏈和重鏈以及mAb1的對應編碼序列係顯示在下表2中。 表2：全長重鏈和輕鏈DNA編碼序列
Figure 108112406-A0304-0002
根據本發明之一些抗體VH CDR1(也稱為HCDR1)、VH CDR2(也稱為HCDR2)、VH CDR3(也稱為HCDR1)、VL CDR1(也稱為LCDR1)、VL CDR2(也稱為LCDR2)、VL CDR3(也稱為HCDR3)之胺基酸序列的實例係顯示在表3中。
在表3中，使用Chothia系統(Chothia C, Lesk AM. 1987, J Mol Biol 196, 901-917)描繪了本發明的一些抗體的CDR區。為了便於閱讀，CDR區分別稱為HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3。
表3：根據Chothia的mAb1至mAb16和參考A24抗體的CDR區
Figure 108112406-A0304-0003
表4、表5和表6描述了相對於ADC抗體的有用胺基酸和核苷酸序列。
表4：用於實施本發明的有用胺基酸和核苷酸序列的簡要描述
Figure 108112406-A0304-0004
表5：用於實施本發明的有用胺基酸和核苷酸序列的簡要描述
Figure AA1
Figure AA2
Figure AA3
表6：mAb1-mAb16的可變區和IgG Fc區的描述
Figure 108112406-A0304-0006
在一個實施例中，分離的重組抗體具有：重鏈可變區，包含SEQ ID NO：1之HCDR1；SEQ ID NO：2之HCDR2；SEQ ID NO：3之HCDR3；輕鏈可變區，包含SEQ ID NO：4之LCDR1；SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8之LCDR2；和SEQ ID NO：6之LCDR3；其中所述抗體特異性鍵結至SEQ ID NO：16的轉鐵蛋白受體。
在具體的實施例中，根據本發明的分離的重組抗體包含： (a) 包含SEQ ID NO：1之HCDR1、SEQ ID NO：2之HCDR2、SEQ ID NO：3之HCDR3的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：4之LCDR1、SEQ ID NO：5之LCDR2和SEQ ID NO：6之LCDR3的可變輕鏈多肽； (b) 包含SEQ ID NO：1之HCDR1、SEQ ID NO：2之HCDR2、SEQ ID NO：3之HCDR3的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：4之LCDR1、SEQ ID NO：8之LCDR2和SEQ ID NO：6之LCDR3的可變輕鏈多肽； (c) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及SEQ ID NO：13之VL的可變輕鏈多肽； (d) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及SEQ ID NO：14之VL的可變輕鏈多肽； (e) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及SEQ ID NO：15之VL的可變輕鏈多肽； (f) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及SEQ ID NO：13之VL的可變輕鏈多肽； (g) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及SEQ ID NO：14之VL的可變輕鏈多肽；或 (h) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及SEQ ID NO：15之VL的可變輕鏈多肽。
在具體實施例中，如上定義的所述重組抗-TfR抗體具有一種或多種以下特性： (i) 其鍵結至具有KD為10nM或更低，較佳KD為1nM或更低的轉鐵蛋白受體，如藉由SPR測量； (ii) 其鍵結至具有EC50 為0.1μg/ml或更低，較佳為0.05μg/ml或更低的轉鐵蛋白受體，如在ELISA測定法中測量(參見PCT/EP2016/067465以獲得更多資訊)； (iii) 其誘導HL-60細胞株的細胞凋亡至與用相對的參考嵌合抗體測量的誘導水平相等或更高的水平，所述參考嵌合抗體具有SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：10的VL的親代鼠類可變區，例如，如使用HL-60細胞凋亡誘導測定法測量的。典型地，與具有包含SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：10的VL的A24的親代鼠類可變區的相同量的參考嵌合抗體相比，可以測定10μg/ml的本發明的重組抗體的量用於誘導HL-60細胞株的細胞凋亡。如果用測試抗體測量的陽性細胞百分比沒有顯著低於用參考抗體測量的陽性細胞百分比，則測試抗體的HL-60細胞凋亡誘導測定中細胞凋亡的誘導等於參考抗體。
如本文所用，“相應”參考嵌合抗體是指具有同型恆定區的參考抗體，所述同型恆定區100%相同於待測特定性質的抗體的同型恆定區，例如，細胞凋亡的誘導。
在可與先前實施例組合的某些實施例中，本文提供的抗體是上文定義的抗體的抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、UniBody和scFv片段、雙鏈抗體、單結構域或奈米抗體和其他片段。術語“雙鏈抗體”是指具有兩個抗原-鍵結位點的小抗體片段，該片段包含與相同多肽鏈(VH-VL)中的輕鏈可變結構域(VL)連接的重鏈可變結構域(VH)。藉由使用太短而允許相同鏈上的兩個結構域之間配對的連接子，該結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原-鍵結位點。單結構域抗體是包含抗體的全部或部分重鏈可變結構域或全部或部分輕鏈可變結構域的抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體是人類單結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham，MA；參見例如美國專利號6,248,516 B1)。抗體片段可以藉由各種技術而製備，包括(但不限於)完整抗體的蛋白水解消化以及如本文所述的重組宿主細胞的產生。
在某些實施例中，本發明的抗體是人源化抗體。典型地，人源化非人類抗體以降低對人類的免疫原性，同時具有親代非人類抗體的至少相同親和力(或更高親和力)。在較佳的實施例中，本發明的抗體是親代抗體A24的人源化抗體。通常，人源化抗體包含一個或多個可變結構域，其中CDR(或其部分)衍生自非人類抗體，例如，鼠類A24抗體，和FR(或其部分)衍生自人類抗體序列。人源化抗體視需要還包含至少一部分人類恆定區。在一些實施例中，人源化抗體中的一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，衍生CDR殘基的A24抗體)的相對殘基取代，例如，以恢復或改善抗體特異性或親和力。在一些具體的實施例中，人源化抗體中的一些CDR殘基亦經取代，例如，以恢復或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體及其製備方法，例如，見於前述的Almagro和Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)，且進一步描述於例如，Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)；US Patent Nos. 5, 821,337，7,527,791，6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (describing specificity determining region (SDR) grafting)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (describing "resurfacing")；Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (describing "FR shuffling")；和Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (describing the "guided selection" approach to FR shuffling)。較佳地，根據本發明的重組抗體是人源化沉默抗體，較佳為人源化沉默IgG1或IgG4抗體。
如本文所用，術語“沉默”抗體是指在ADCC活性測定中測量的呈現出無ADCC活性或低ADCC活性的抗體。
在一個實施例中，術語“無ADCC活性或低ADCC活性”是指沉默抗體呈現ADCC活性為至少低於10%，例如低於用野生型人類IgG1同型的相應抗體觀察到的ADCC活性低於50%。
沉默的效應子功能可以藉由抗體的Fc恆定部分中的突變來獲得，並且已經在Art：Strohl 2009(AA＆N297A)；Baudino 2008, D265A(Baudinoet al. , J.Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91)中描述。沉默IgG1抗體的實例包括所謂的AA突變體，其包含IgG1 Fc胺基酸序列中的L234A和L235A突變。另一種沉默IgG1抗體包含N297A突變，其產生去糖基化或非糖基化抗體。
具有突變胺基酸序列的抗體可以藉由編碼核酸分子的誘變(例如，定點或PCR介導的誘變)獲得，然後使用本文所述的功能測定法測試編碼的改變的抗體的保留功能(亦即，上述功能)。
[具有保守修飾的抗體]
在某些實施例中，本發明的抗體(或包含其抗原鍵結部分的鍵結蛋白)具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區和包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區，其中這些CDR序列中的一個或多個具有基於本文所述的mAb1至mAb16抗體或其保守修飾的特定胺基酸序列，並且其中所述抗體或蛋白保留本發明的抗-TfR抗體的所欲功能特性。
抗-TfR抗體的所欲功能特性包括(但不限於)： (i) 其鍵結至具有KD為10nM或更低，較佳KD為1nM或更低的轉鐵蛋白受體，例如藉由SPR測定法測量，例如使用Biacore； (ii) 其鍵結至具有EC50 為0.1μg/ml或更低，較佳為0.05μg/ml或更低的轉鐵蛋白受體，如在ELISA測定法中測量(參見PCT/EP2016/067465以獲得更多資訊)； (iii) 其誘導HL-60細胞株的細胞凋亡至與用相對的參考嵌合抗體測量的誘導水平相等或更高的水平，所述參考嵌合抗體具有SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：10的VL的親代鼠類可變區，例如，如使用HL-60細胞凋亡誘導測定法測量的。典型地，與具有包含SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：10的VL的A24的親代鼠類可變區的相同量的參考嵌合抗體相比，可以測定10μg/ml的本發明的重組抗體的量用於HL-60細胞株的細胞凋亡的誘導。如果用測試抗體測量的陽性細胞百分比沒有顯著低於用參考抗體測量的陽性細胞百分比，則測試抗體的HL-60細胞凋亡誘導測定中細胞凋亡的誘導等於參考抗體。
如本文所用，術語“保守序列修飾”意指胺基酸取代，其中胺基酸殘基經具有相似側鏈的胺基酸殘基取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)和芳香側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸) 。因此，本發明的抗體的CDR區內的一個或多個胺基酸殘基可以經來自相同側鏈家族的其他胺基酸殘基替換，並且可以使用本文所述的功能測定法測試改變的抗體的保留功能。
可以藉由本領域已知的標準技術將修飾引入本發明的抗體中，例如定點誘變和PCR介導的誘變。
[框架或Fc工程]
本發明的工程化抗體包括其中對VH及/或VL內的框架殘基進行修飾的彼等抗體，例如，改善抗體的性質。典型進行這樣的框架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個框架殘基“回復突變”到相對的生殖系序列。更具體地，已經歷體細胞突變的抗體可含有與衍生抗體的生殖系序列不同的框架殘基。可以藉由將抗體框架序列與衍生抗體的生殖系序列進行比較來鑑定這些殘基。為了使框架區序列恢復其生殖系構型，可以藉由例如定點誘變或PCR介導的誘變將體細胞突變“回復突變”至生殖系序列。這種“回復突變”抗體亦包括在本發明中。
另一種類型的框架修飾涉及突變框架區內或甚至一個或多個CDR區內的一個或多個殘基，以去除T細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。
特別是，Antitope公司(Cambridge UK)開發了一系列用於評估和脫去免疫原性的專有技術，這些技術基於鑑定治療性抗體和蛋白中T細胞表位的位置。這些技術總結如下： - iTopeTM ：用於預測肽鍵結至人類MHC第二型對偶基因的電腦模擬技術(Perryet al. 2008Drugs in R&D ,9 (6):385-396)。 -TCEDTM ：使用EpiScreenTM T細胞表位作圖測定法特別是抗體V區域的研究中鑑定的已知T細胞表位的資料庫(Brysonet al. 2010Biodrugs 24(1):1-8)。可藉由BLAST搜索來詢問資料庫以鑑定共同的基序(Altschulet al. 1997Nucleic Acids Res . (1997) 25:3389-3402)。
除了在框架或CDR區內進行的修飾之外或作為替代，可以設計本發明的抗體以包括Fc區內的修飾，典型改變抗體的一種或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體鍵結、Fc受體鍵結及/或抗原依賴性細胞毒性。
此外，本發明的抗體可以是經化學修飾的(例如，一個或多個化學部分可經附接至抗體)或者可以經修飾以改變其糖基化，再次改變抗體的一個或多個功能特性。以下進一步詳細描述這些實施例中的每一個。
如本文所用，術語“同型恆定區”或“Fc區”可互換使用以定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區，包括天然序列Fc區和變體Fc區。人類IgG重鏈Fc區通常定義為包含來自位置C226或來自P230至IgG抗體的羧基-末端的胺基酸殘基。Fc區中殘基的編號是Kabat的EU索引的編號。可以例如在抗體的生產或純化期間中除去Fc區的C-末端離胺酸(殘基K447)。因此，本發明的抗體的組合物可包含去除了所有K447殘基的抗體群、去除了沒有K447殘基的抗體群、以及具有和不具有K447殘基的抗體的混合物的抗體群。
在一個具體實施例中，修飾CH1的鉸鏈區，使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目被改變，例如，增加或減少。在Bodmer等人的美國專利第5,677,425號中進一步描述了這種方法。改變CH1的鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目，以便例如促進輕鏈和重鏈的組配或增加或減少抗體的穩定性。
在另一個實施例中，突變抗體的Fc鉸鏈區以降低抗體的生物半衰期。更具體地，將一個或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區，使得抗體相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA鍵結具有受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)鍵結。在Ward等人的美國專利第6,165,745號中進一步詳細描述了前述方法。
在另一個實施例中，修飾抗體以增加其生物半衰期。各種方法都是可能的。例如，可以引入一個或多個下列突變：T252L、T254S、T256F，如Ward的美國專利第6,277,375號中所述者。或者，為了增加生物半衰期，可以在CH1區或CL區內改變抗體以包含取自IgG的Fc區的CH2結構域的兩個環的補救受體鍵結表位，如Presta等人的美國專利第5,869,046號和第6,121,022號中所述者。
在再一其他實施例中，藉由經不同的胺基酸殘基取代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應子功能。例如，可以經不同的胺基酸殘基替換一個或多個胺基酸，使得抗體對效應子配體具有改變的親和力，但保留親代抗體的抗原鍵結能力。改變親和力的效應子配體可以是，例如，Fc受體或補體的C1組分。在Winter等人的美國專利第5,624,821號和第5,648,260號兩者中進一步詳細描述了前述方法。
在另一個實施例中，選自胺基酸殘基的一個或多個胺基酸可以經不同的胺基酸殘基替換，使得抗體具有改變的C1q鍵結及/或減少或脫去補體依賴性細胞毒性(CDC)。在Idusogie等人的美國專利第6,194,551號中進一步詳細描述了前述方法。
在另一個實施例中，改變一個或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。此方法在Bodmer等人的PCT公開案WO 94/29351中進一步描述。
在又另一個實施例中，修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力及/或藉由修飾一個或多個胺基酸來增加抗體對Fcγ受體的親和力。此方法在Presta的PCT公開案WO 00/42072中進一步描述。 此外，已經繪製了人類IgG1上FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的鍵結位點，並且已經描述了具有改善的鍵結的變體(參見Shields, R.L.et al. , 2001 J. Biol. Chem 276:6591-6604)。
在其他實施例中，修飾Fc區以降低抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力及/或藉由修飾一個或多個胺基酸降低抗體對Fcγ受體的親和力。具有降低的效應子功能，且特別是降低的ADCC的此類抗體包括沉默抗體。
在某些實施例中，使用IgG1同型的Fc結構域。在一些具體的實施例中，使用IgG1 Fc片段的突變體變體，例如，沉默IgG1 Fc，其降低或脫去融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或鍵結Fcγ受體的能力。IgG1同型沉默突變體的實例是IgG1，其中白胺酸經胺基酸位置234和235處的丙胺酸取代，如Hezareh等人的J.Virol 2001 Dec; 75(24)：12161-8中所述者。
在某些實施例中，Fc結構域是沉默Fc突變體，其阻止Fc結構域位置297處的糖基化。例如，Fc結構域在位置297處含有天冬醯胺的胺基酸取代。這種胺基酸取代的實例是經甘胺酸或丙胺酸的N297的取代。
在又另一個實施例中，修飾抗體的糖基化。例如，可以製備去糖基化的抗體(亦即抗體缺乏糖基化)。可以改變糖基化以(例如)增加抗體對抗原的親和力。這種碳水化合物修飾可以藉由(例如)改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，其導致脫去一個或多個可變區框架糖基化位點，從而脫去該位點處的糖基化。這種糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。在Co等人的美國專利第5,714,350號和第6,350,861號中進一步詳細描述了這種方法。
另外或可替代地，可以製備具有改變糖基化類型的抗體，諸如具有減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加的對分GlcNac結構的抗體。已經證明這種改變糖基化模式增加抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以藉由(例如)在具有改變糖基化機制的宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變糖基化機制的細胞在本領域中已被描述，並且可用作表現本發明的重組抗體從而產生具有改變糖基化的抗體的宿主細胞。例如，Hang等人的EP 1 176 195描述一種具有功能性受損的FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻糖基轉移酶，致使在這種細胞株中表現的抗體呈現出低岩藻糖基化。因此，在一個實施例中，本發明的抗體藉由在呈現出低岩藻糖基化模式的細胞株(例如，缺陷表現編碼岩藻糖基轉移酶的FUT8基因的哺乳動物細胞株)中重組表現而產生。Presta的PCT公開案WO 03/035835描述一種變體CHO細胞株、Lecl3細胞，其具有降低岩藻糖連接於Asn(297)鍵聯的碳水化合物的能力，還導致在該宿主細胞中表現的抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields, R.L.et al. , 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人的PCT公開案WO 99/54342描述一種工程化以表現修飾醣蛋白之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)的細胞株，使得在工程化細胞株中表現的抗體呈現出增加的對分GlcNac結構，這導致抗體的ADCC活性增加(亦參見Umanaet al ., 1999Nat. Biotech . 17:176-180)。
本發明考慮的本文抗體的另一種修飾是聚乙二醇化或羥乙基澱粉化(hesylation)或相關技術。抗體可經聚乙二醇化以(例如)增加該抗體的生物(例如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，典型使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反應性酯或醛衍生物在一個或多個PEG基團連接於該抗體或抗體片段上的條件下反應。聚乙二醇化可以藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)的醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用，術語“聚乙二醇”意欲涵蓋已用於使其他蛋白衍生之任何形式的PEG，諸如單(C1 -C10 )烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，欲聚乙二醇化的抗體是去糖基化的抗體。用於聚乙二醇化蛋白的方法在本領域中是已知的，並且可以應用於本發明的抗體。參見例如Nishimura等人的EP 0 154 316或Ishikawa等人的EP 0 401 384。
本發明考慮的抗體的另一種修飾是至少本發明抗體的抗原鍵結區與血清蛋白(諸如人類血清白蛋白或其片段)的綴合物或蛋白融合物，以增加所得分子的半衰期。這種方法例如描述在Ballance等人的EP 0 322 094中。
另一種可能性是至少本發明抗體的抗原鍵結區與能夠鍵結至血清蛋白的蛋白(諸如人類血清白蛋白)的融合物，以增加所得分子的半衰期。這種方法例如描述在Nygren等人的EP 0 486 525中。
在一個具體實施例中，相對於相同同型的野生型抗體，已經減少或脫去了根據本發明的抗體的效應子功能或補體活化功能。在一個態樣，藉由選自抗體的糖基化的減少、抗體同型的修飾至天然具有減少或脫去的效應子功能的同型和Fc區的修飾的方法來減少或脫去效應子功能。在具體相關的實施例中，具有降低或脫去的效應子功能的所述同型是IgG4同型。
[本發明的抗體的產生]
可以使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的常規技術來獲得本發明的抗體。關於編碼本發明的抗體的核酸以及產生這些抗體的轉染瘤(transfectomas)的產生的更多資訊，所屬技術領域中具有通常知識者還可以參考國際申請號PCT/EP2016/067465。
[連接子]
本發明的ADC含有三種不同的連接子：L、Z和X。鍵聯在一起的這些三種連接子的通式由式(V)表示。連接子允許抗體與藥物之間的鍵聯。較佳地，鍵聯是共價的。因此，在本發明的實施例中，D係共價鍵結至X及/或X係共價鍵結至Z及/或Z係共價鍵結至L及/或L係共價鍵結至Ab。更佳地，D係共價鍵結至X，且X係共價鍵結至Z，且Z係共價鍵結至L，且L係共價鍵結至Ab。
L是式(II)或式(IV)的連接子分子，其中n是2至20之間組成的整數。L是PEG-芳基丙腈，也稱為“APN”。如本文所揭露的，n包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。L在各種條件下賦予ADC穩定性。關於L的更多資訊在PCT/EP2014/064387中揭露。
在可與其他實施例組合的實施例中，L透過至少一個硫醇部分(來自抗體的半胱胺酸)鏈結至抗體。在一實施例中，L與抗體之間的鏈結位於式(II)或式(IV)中的雙鍵C=C側上。
Z是鍵結至L的纈胺酸-瓜胺酸的二肽。Z在L的羰基側(亦即羰基官能基)上與L鏈結。在一實施例中，L與Z之間的鏈結發生在L的羰基與Z的胺基官能基(例如纈胺酸的胺基官能基)之間。二肽VC是可切割的連接子。可切割的連接子利用血流中的條件與靶細胞(特別是癌細胞)內的細胞質條件之間的差異。二肽VC在溶酶體內的酸性環境中藉由溶酶體蛋白酶(諸如組織蛋白酶B)裂解。ADC在靶細胞中內化之後，組織蛋白酶B在Z與X之間存在細胞內裂解機制(例如瓜胺酸與胺基苯甲酯自消耗性基之間在胺基官能基側上的裂解) (參見式(VII)中的箭頭 )。
Figure 02_image011
式(VII)
生成物X-藥物不是穩定的中間體，並且會自發地進行脫去反應，留下藥物作為產物(亦即1,6-脫去反應(自我犧牲))。關於纈胺酸-瓜胺酸二肽作為經由組織蛋白酶B的細胞內裂解機制的更多資訊，參見例如Dubowchik GM, Firestone RA, Padilla L, Willner D, Hofstead SJ, Mosure K, et al., Bioconjug Chem. 2002; 13：855-69。
X是鍵結至式(III)的Z的胺基苯甲基酯自消耗性基。X鍵聯至Z的羧基(亦即羰基官能基)側上的Z。在一實施例中，Z與X之間的鍵聯發生在Z的羰基與X的胺基官能基之間。關於胺基苯甲基酯自消耗性基的更多資訊，參見WO 03/026577或WO 2004/010957。如本文所揭露，X因此是雙官能化學部分間隔基，其(i)能夠將至少兩個其他化學部分共價鍵聯在一起成為穩定的分子(特別是D和Z)，(ii)可以藉助於酶促切割的方式從分子中的一個間隔的化學部分釋放(在藉由組織蛋白酶B切割之後，釋放X-D)；(iii)在酶促切割後，可以從分子的其餘部分自發地切割以釋放另一個間隔的化學部分(最後釋放D)。
[有效負載]
在一個實施例中，本發明的D是在X的羰基官能基側上鍵聯至X的有效負載。在一實施例中，X與D之間的鍵聯發生在X的羰基官能基與D的胺基之間。
在一具體實施例中，在本發明的ADC中，D是細胞毒性藥物。
在一實施例中，細胞毒性藥物選自由：分類素(taxon)、細胞鬆弛素B、奧瑞他汀(auristatin)、短桿菌素D、溴化乙錠、依米嗪(emetine)、絲裂黴素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、道諾黴素、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-脫氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌黴素及其類似物或同系物。此包括抗代謝物(例如，甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶氮烯唑胺(decarbazine))、燒蝕劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chloraxnbucil)、左旋苯丙酸氨芥(meiphalan)、卡氮芥(carmustine) (BSNU)和環已亞硝脲(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺、硫酸布他卡因、二溴甘露糖醇、鏈脲菌素、絲裂黴素C和順-二氯乙二胺鉑(II) (DDP) 順氯氨鉑、蒽環黴素(例如，道諾黴素(daunorubicin，之前為daunomycin)和阿黴素、抗生素(例如，放線菌素(dactinomycin，之前為actinomycin)、博來黴素、光神黴素和氨茴黴素(AMC))及抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼和長春鹼)。較佳地，該藥物是單甲基奧瑞他汀E。
[本發明的ADC]
在一實施例中，本發明提供一種ADC，其中抗-TfR抗體鍵聯至藥物(特別是MMAE)。連接子是如上所定義的分子L、Z和X。較佳地，所述ADC可選擇性地將有效劑量的MMAE遞送至表現TfR的腫瘤組織。
在一實施例中，本發明提供一種如上所定義的式(I)的ADC。
在更佳的實施例中，本發明的ADC如下： - Ab是抗-TfR抗體，特別是如上所定義的mAb1， - L是鍵結至所述抗體的連接子分子，所述連接子分子係式(IV)， - Z是鍵結至L的纈胺酸-瓜胺酸二肽， - X鍵結至Z，且是式(III)的對-胺基苯甲基酯自消耗性基，其中m為0， - D是鍵結至X的藥物，特別是MMAE。
在另一個更佳的實施例中，本發明稱為“INA01-SDV1”的ADC如下： - Ab是抗-TfR抗體mAb1，其特徵在於是由SEQ ID NO：18表示的重鏈和由SEQ ID NO：17表示的輕鏈， - L是鍵結至所述抗體的連接子分子，所述連接子分子係式(IV)， - Z是鍵結至L的纈胺酸-瓜胺酸二肽， - X鍵結至Z，且是式(III)的對-胺基苯甲基酯自消耗性基，其中m為0， - D是MMAE。
圖1表示本發明(稱為“INA01-SDV1”或“INA01-SDV#1)的較佳ADC之一者的示意圖示。人源化抗體INA01(Ab)已通過半胱胺酸殘基連接子APN(L)、經酶組織蛋白酶B可切割的二肽序列纈胺酸-瓜胺酸(Z)、其中m為0之式(III)的對-胺基苯甲基酯(X)、和細胞毒性單甲基奧瑞他汀E“MMAE”(D)附接。
儘管藥物與抗體的比率具有特定ADC的精確值，但應理解，當用於描述含有許多ADC的樣品時，該值通常是平均值，這是由於某種程度的不均勻性，典型與綴合步驟相關。ADC的樣品的平均負載在本文中稱為藥物對抗體的比率，或“DAR”。在一些實施例中，DAR介於約1和約8之間(亦即1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5和8)，較佳平均值 大約4。
[醫藥組合物-調配物]
在另一態樣，本發明提供一種組合物，例如，醫藥組合物，含有本文揭露的ADC中的一種或組合(例如，選自由mAb1-mAb16所組成群組之一種ADC，特別是mAb1，鍵結至式(IV)的連接子分子，其本身鍵結至Z，其本身鍵結至X，其是其中m為0之式(III)的對-胺基苯甲基酯自消耗性基，其本身鍵結至藥物諸如MMAE)、與醫藥上可接受的載體一起配製。
在一較佳的實施例中，本發明的組合物(例如調配物)含有(i)本文所揭露的ADC中的一種或組合(例如，選自由mAb1-mAb16所組成群組之一種ADC，特別是mAb1，鍵結至式(IV)的連接子分子，其本身鍵結至Z，其本身鍵結至X，其是其中m為0之式(III)的對-胺基苯甲基酯自消耗性基，其本身鍵結至藥物諸如MMAE)，(ii)組胺酸，(iii)和視需要的醫藥上可接受的載體，並且所述組合物的pH為6.5。在另一個實施例中，本發明的組合物(例如調配物)含有(i)本文所揭露的ADC中的一種或組合，(ii)組胺酸，(iii)蔗糖，(iv)聚山梨醇酯80，並且所述組合物的pH為6.5。較佳地，組胺酸的莫耳濃度為20mM。在另一個實施例中，本發明的組合物(例如調配物)含有(i)本文所揭露的ADC中的一種或組合，(ii)20mM組胺酸，(iii)6%蔗糖(6g溶於100mL緩衝液)，(iv)0.02%聚山梨醇酯80，並且所述組合物的pH為6.5。較佳地，所述組合物在40℃下是穩定的，這意味著ADC的平均DAR保持在4和4.5之間。pH可以藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何技術來確定。
本文所揭露的醫藥組合物亦可組合治療來給藥，亦即與其他藥劑組合給藥。例如，該組合治療可包括本發明的ADC，與至少一種抗病毒劑、抗發炎劑或另一種抗增殖劑組合。可在組合治療中使用的治療劑的實例會在以下關於本發明的ADC的使用的部分中更詳細地描述。
如本文所用，“醫藥上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、披覆、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。載體應適合於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮給藥(例如經由注射或輸注)。在一個實施例中，載體應適合於皮下途徑。取決於給藥途徑，活性化合物(亦即ADC)可經披覆在材料中以保護化合物免受酸和其它可能使化合物失活的天然條件的作用。無菌磷酸鹽緩衝鹽水是醫藥上可接受的載體的一個實例。其他合適的載體是所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。(參見例如Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995))調配物可進一步包括一種或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、白蛋白以防止小瓶表面上的蛋白損失等 。
醫藥組合物的形式、給藥的途徑、劑量和方案自然取決於欲治療的病症、疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重和性別等。
本發明的醫藥組合物可經配製用於局部、口服、腸胃外、腹膜內、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下或眼內給藥等，較佳為腹膜內或靜脈內。
較佳地，醫藥組合物含有賦形劑，其對於能夠注射的調配物是醫藥上可接受的。這些特別可以是等滲的、無菌的、鹽溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或這些鹽類的混合物)，或是乾燥的，特別是冷凍乾燥的組合物，其在添加時取決於在無菌水或生理鹽水的情況下，允許構成可注射的溶液。
用於給藥的劑量可以根據各種參數進行調整，特別是根據所用的給藥方式，相關病理學或所欲治療的持續時間的函數進行調整。
為了製備醫藥組合物，可以將有效量的ADC溶解或分散在醫藥上可接受的載體或水性介質中。
適用於注射使用的醫藥形式包括無菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的調配物；和無菌粉末或凍乾物，用於臨時製備無菌可注射的溶液或分散液。在所有情況下，該形式必須是無菌的並且必須是流動的，以便存在易於注射的程度。它必須在製造和儲存的條件下穩定，並且必須防止微生物諸如細菌和真菌的污染作用。
作為游離鹼或藥理學上可接受的鹽類的活性化合物的溶液可以在適當地與界面活性劑諸如羥丙基纖維素混合的水中製備。分散液也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和在油中製備。在常規的儲存和使用的條件下，這些調配物含有防腐劑以防止微生物的生長。
可以將本發明的ADC配製成為呈中性或鹽形式的組合物。醫藥上可接受的鹽包括酸加成鹽(用蛋白的游離胺基形成)並且其用無機酸諸如例如鹽酸或磷酸，或有機酸諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等來形成。用游離羧基形成的鹽類也可以衍生自無機鹼，諸如例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；和有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因等。
載體也可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。適當的流動性例如可藉由使用諸如卵磷脂的披覆、藉由在分散的情況下保持所需的粒度和藉由使用界面活性劑來保持。微生物之作用的防止可以藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙汞硫柳酸鈉等來防止。在許多情況下，較佳包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射的組合物的延長吸收可以藉由在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。
無菌可注射的溶液可藉由將所需量的活性化合物併入具有上述列舉的各種其它成分(如果需要)的適當溶劑，然後藉由過濾滅菌來製備。通常，分散液可藉由將各種滅菌的活性成分引入無菌載體中來製備，該無菌載體含有基礎分散介質和來自上述列舉彼等者所需的其他成分。在用於製備無菌可注射的溶液的無菌粉末的情況下，較佳的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其產生活性成分的粉末加上來自其先前無菌過濾的溶液的任何其他所欲成分。
還考慮製備更多或更高濃度的直接注射用溶液，其中設想使用DMSO作為溶劑以使得極快的滲透，將高濃度的活性劑遞送至小腫瘤區域。
在配製時，溶液將以與劑量調配物相容的方式給藥，並以治療有效的量給藥。調配物易於以多種劑型給藥，例如上述可注射的溶液的類型，但也可以利用藥物釋放膠囊等。
對於在水溶液中的腸胃外給藥，例如，如果需要，溶液應該適當地緩衝，並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適用於靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內給藥。就此而言，根據本發明，可以利用的無菌含水介質對於所屬技術領域中具有通常知識者而言是已知的。例如，可以將一個劑量溶解在1ml的等滲NaCl溶液中，並且將其添加到1000ml的皮下注射液中或者在建議的輸注部位處注射(參見例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580)。取決於所要治療的受試者的狀況，必然發生劑量的一些變化。在任何情況下，負責給藥的人員將確定個體受試者的適當劑量。
本發明的ADC可以在治療混合物內配製成每劑量包含約0.0001至1.0毫克，或約0.001至0.1毫克，或約0.1至1.0毫克，或甚至1.0至約10毫克。也可以多劑量來給藥。
除了配製用於腸胃外給藥的化合物，諸如靜脈內或肌內注射，其他醫藥上可接受的形式包括(例如)用於口服給藥的片劑或其他固體；時間釋放膠囊；以及目前使用的任何其他形式。
在某些實施例中，可以考慮使用脂質體及/或奈米顆粒。脂質體及/或奈米顆粒的形成和使用是所屬技術領域中具有通常知識者已知的。
奈米膠囊通常可以穩定的且可重複的方式包封化合物。為了避免由於細胞內聚合物過載引起的副作用，通常使用能夠在體內降解的聚合物來設計這種超細顆粒(尺寸約0.1μm)。滿足這些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯奈米顆粒預期能用於本發明，並且這些顆粒可以容易地製備。
脂質體由磷脂形成，該磷脂分散在水性介質中並自發形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡(MLV))。MLV通常具有從25nm至4μm的直徑。MLV的音波振動處理使得形成具直徑在200至500Å範圍的小單層囊泡(SUV)，在核芯中含有水溶液。脂質體的物理特性取決於pH、離子強度和二價陽離子的存在。
[本發明之ADC的用途和方法]
本發明的ADC具有體外和體內診斷和治療效用。例如，這些分子可經給藥於培養中的細胞(例如，在體外或體內，或在受試者中，例如體內)來治療、預防或診斷各種疾病。
本發明的ADC不僅可抑制細胞增殖，亦可誘導高增殖性細胞(諸如活化T細胞)的細胞凋亡。
本文考慮使用本發明的ADC作為藥劑，特別是用於治療、預防或診斷細胞增殖性疾病，例如表達高水平TfR的腫瘤，更具體地，血液腫瘤，諸如淋巴瘤，且特別是ATL、MCL、霍奇金氏病、大型B細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、急性白血病(骨髓樣和淋巴樣)以及實體瘤，諸如腎癌、肺癌(小細胞)、乳癌等。
進一步揭露本發明的ADC用於治療實體瘤。
如上所揭露使用的ADC可以作為唯一的活性成分來給藥，或與例如作為佐劑來組合給藥，或與其他藥物(例如抗病毒劑、抗發炎劑或細胞毒性劑、抗增殖劑、化療劑或抗腫瘤劑來組合給藥，例如用於治療或預防上述疾病。例如，如上所揭露使用的ADC可與AZT、IFN-α、抗-CD20 mAb、抗-CD25 mAb、抗-PD1 mAb、抗-PDL-1 mAb、化學治療劑來組合使用。適合的抗腫瘤劑可包括(但不限於)烷化劑(諸如環磷醯胺、甲氮芥(mechloretamine)、苯芥苯丁酸、黴美蘭、亞硝基脲、莫唑胺)，蒽環黴素(諸如道諾黴素、阿黴素、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌、戊柔比星(valrubicin))，紫杉烷類(諸如紫杉醇、多西紫杉醇)，埃坡黴素、拓撲異構酶I之抑制劑(諸如伊立替康或拓撲替康)，拓撲異構酶II之抑制劑(諸如依托泊苷、替尼泊苷或特福泊苷(Tafluposide))，核苷酸類似物和前體類似物(諸如阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟脲嘧啶、吉西他濱、羥基脲、巰基嘌呤、甲胺蝶呤或硫代鳥嘌呤(Tioguanine))，肽抗生素(諸如卡鉑、順鉑和奧沙利鉑)，維生素A酸類(諸如維甲酸、阿利維A酸(alitretinoin)、貝沙羅汀)，長春花生物鹼和衍生物(諸如長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱)，靶向治療劑，諸如激酶抑制劑(諸如依魯替尼、艾代拉里斯(Idelalisib)、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、威羅菲尼(Vemurafenib)、維莫德吉(Vismodegib))，蛋白酶體抑制劑(諸如硼替佐米、卡非佐米(carfilzomib))，組蛋白去乙醯酶抑制劑(諸如伏立諾他(Vorinostat)或羅米地辛(Romidepsin))。
根據前述內容，本發明在又一態樣提供一種方法，包括投予治療有效量的本發明的ADC。
根據前述內容，本發明在又一態樣提供一種方法，包括共投予(例如，同時或依次)治療有效量之本發明的ADC和至少一種第二藥物物質，所述第二藥物物質是抗病毒劑或抗增殖劑，例如，如上所述者。
由本文揭露的組合物(例如包含ADC)和使用說明書所組成的套組也在本發明的範圍內。該套組可進一步含有至少一種另外的試劑，或一種或多種另外的抗體或蛋白(例如，具有鍵結至靶抗原上不同於第一抗體的表位的互補活性的抗體)。該等套組典型包括指示套組內容物的預期用途的標籤。術語標籤包括在套組上或與套組一起提供或伴隨套組的任何書寫或記錄材料。該套組可進一步包括用於診斷患者是否屬於將反應ADC治療的群組的工具，如上所述者。
[製造本發明的ADC的方法]
本發明的抗體可藉由連接子L-Z-X經由本領域已知的任何技術與至少一種藥物綴合。這些技術例如描述於US 7,811,572；US 7,368,565；US 2011/0003969；US 2011/0166319；US 2012/0253021和US 2012/0259100中。關於用於將治療劑綴合至抗體的方法的更多資訊，也可參見Panowksi Set al . 2014 Jan 1; 6(1): 34-45關於抗體藥物綴合物的綜述。
在一實施例中，用於獲得本發明的ADC的方法包括以下步驟： - 在適用於表現編碼如上定義的抗體的核酸的條件下培養宿主細胞， - 分離該抗體， - 合成鍵結至式(V)的連接子L-Z-X的單甲基奧瑞他汀E， - 綴合所述抗體至該鍵結至式(V)的連接子L-Z-X的單甲基奧瑞他汀E。
可如上述來獲得抗體。抗體含有四個鏈間二硫鍵，可用作潛在的綴合位點。該四個鏈間二硫鍵可被還原，例如藉由参(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)，這使得八個硫醇基團可用於綴合。
可如PCT/EP2014/064387中所揭露者來獲得連接子L。可如WO 03/026577或WO 2004/010957中所揭露者來獲得連接子X。連接子Z也是知道如何獲得它的所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。
已充分描述的本發明現將藉由以下實例進一步說明，這些實例僅是說明性的，且不意欲進一步限制。
[實例]
實例1：比較在造血細胞株上A24與INA01-SDV1之間的鍵結
進行兩種生物素化抗體(抗體A24和ADC INA01-SDV1的抗體)的系列稀釋(5至0.05ug/mL)，並在THP-1和MEC-1細胞株上培養。使用鏈黴親合素(streptavidin)Alexa F488(可從ThermoFisher scientific獲得)藉由流式細胞儀檢測該經稀釋的抗體的鍵結。
A24和INA01-SDV1兩者均顯示出與CD71+ 細胞株相同的親和力(圖2A和圖2B)。
實例2：細胞凋亡
用人類CD71轉染CHO細胞，藉由FACS選擇殖株。將天然CHO細胞(人類CD71陰性細胞)和hCD71陽性細胞用幾種濃度的INA01-SDV#1在37℃的完全培養基中培養96小時。在第4天時，將細胞與Annexin V和Topro 3一起培養。藉由FACS測定細胞凋亡細胞作為雙陽性Annexin V/Topro 3細胞。
結果顯示在圖3A和圖3B中。條形表示細胞凋亡細胞的百分比。
實例3：INA01-SDV#1對多發性細胞株的體外功效
藉由Promega根據製造商的操作手冊使用細胞存活力測定CellTiter-Glo® 測量細胞增殖的抑制。簡言之，將細胞接種在48孔板中，並在存在或不存在濃度增加的INA01-SDV1(從0至20μg/ml)的情況下培養96小時。
結果呈現在圖4A和圖4B中。在Ramos和THP-1細胞株兩者中的細胞存活力均受損。
實例4：INA01-SDV1的體內功效
為了評估INA01-SDV#1的體內功效，裸鼠經皮下注射5x106 個THP-1細胞。當腫瘤達到100mm3 時，以5mg/kg、0.5mg/kg或PBS-腹膜內的治療模式注射小鼠。每天監測腫瘤生長，當腫瘤達到1000mm3 時犧牲小鼠。
圖5的資料表示在單次注射INA01-SDV#1之後數天內小鼠的存活率。
實例5：毒理學分析
在野生型B6(WT)小鼠和CD71/轉鐵蛋白雙剔除小鼠(TfR/Tf 2Ki)中評估INA01-SDV#1的毒理學分析。每4天以3mg/kg經IP注射INA01-SDV#15次，並在最後一次注射之後兩天犧牲。
圖6表示WT(圖6A)和TfR/Tf 2Ki小鼠(圖6B)中肉眼可見的器官分析。下表7表示圖6A和圖6B中描述的每個器官的獨立病理學分析。
表7：圖6A和圖6B中描述的每個器官的獨立病理學分析
Figure 108112406-A0304-0007
實例6：調配物
已比較4種不同的調配物。調配物1和調配物2以及調配物3和調配物4僅因它們的pH而不同。調配物含有ADC、20mM組胺酸或20mM檸檬酸鹽、6%蔗糖(6g溶於100mL的緩衝液)和0.02%聚山梨醇酯80。
調配物1含有根據本發明的ADC，特別是INA01，和組胺酸，此調配物的pH為5.5。調配物2含有根據本發明的ADC，特別是INA01，和組胺酸，此調配物的pH為6.5。調配物3含有根據本發明的ADC，特別是INA01，和檸檬酸鹽，此調配物的pH為5.5。調配物4含有根據本發明的ADC，特別是INA01，和檸檬酸鹽，此調配物的pH為6.5。
結果如下表8所示。它們表明調配物1至調配物4的DAR(藥物抗體比)值在T=0和T=2週儲存在5℃/40℃和T=4週儲存在5℃/25℃。在40℃下，除了調配物2之外，測量DAR值的整體降低。這些結果表明，與調配物1、調配物3和調配物4相比，調配物2是穩定的。
表8：4種調配物的比較
Figure 108112406-A0304-0008
實例7：IC50 的測定
將HL-60急性骨髓性白血病細胞株(亦即，表現CD71的細胞)在37℃下與10個濃度範圍為從0.02至10ug/mL的INA01-SDV#1一起培養。ADC對細胞增殖的影響如圖7所示。擬合曲線用於計算IC50 。因此，計算出的INA01-SDV#1的IC50 為0.08μg/mL。
實例8：TNF-α的分泌
為了評估INA01-SDV#1是否可以在患者中誘導細胞激素釋放綜合症(CRS)，測試周邊血液單核細胞(PBMC)的TNF-α分泌。在PBMC與INA01-SDV#1在三種不同條件下培養之後測試TNF-α的產生，該條件表示ADC的不同濃度：高披覆(空氣乾燥)、低披覆(濕式塗布)或在溶液中(水性)。
材料及方法
藉由Ficoll分離PBMC並將其懸浮於如前述報導的幾種活化程序之0.1、1或10μg/ml的含有INA01-SDV#1空氣乾燥、濕式塗布或含水性的培養基中(Findlay L et al. J. Immunol. Meth 2008; Stebbings R et al. J. Immunol. 2007)。在37℃培養24小時之後，藉由酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)評估TNF-α。使用DuoSet ELISA開發套組，其包含用於開發三明治式ELISA以測量天然和重組人類TNF-α所需的基本組分。
INA01-SDV#1披覆
INA01-SDV#1以三種不同的方案呈現給PBMC：空氣乾燥、濕式披覆或含水性。
- 空氣乾燥：INA01-SDV#1以50μl的5X 工作濃度加入(最終濃度為0.1、1和10μg/ml)。將板保持在通風櫥下過夜，然後洗滌兩次。
- 濕式披覆：INA01-SDV#1以200ul的5X 工作濃度加入(最終濃度為0.1、1和10μg/ml)。黏貼孔以避免乾燥，然後洗滌兩次。
- 含水性：PBMC和INA01-SDV#1在培養基中一起培養。
結果
結果如圖8所示，顯示在PBMC的所有INA01-SDV#1培養條件下均沒有釋放TNF-α。然而，用1ng/ml的LPS培養24小時產生強的TNF-α釋放。
實例9：在IP給藥之後INA01-SDV#1的體內功效
為了評估INA01-SDV#1的體內功效，裸鼠經皮下注射5x106 個THP-1細胞。當腫瘤達到100mm3 時，每4天注射4次，以1mg/kg、0.5mg/kg或PBS-腹膜內的治療模式注射小鼠。每天監測腫瘤生長，且當腫瘤達到1000mm3 時犧牲小鼠。
圖9的資料表示在INA01-SDV#1腹膜內注射4次之後數天內小鼠的存活率。
實例10：在IV給藥之後INA01-SDV#1的體內功效
為了評估INA01-SDV#1的體內功效，裸鼠經皮下注射5x106 個THP-1細胞。當腫瘤達到100mm3 時，每4天注射4次，以3mg/kg、0.5mg/kg或PBS-靜脈內的治療模式注射小鼠。每天監測腫瘤生長，且當腫瘤達到1000mm3 時犧牲小鼠。
圖10的資料表示在INA01-SDV#1靜脈注射4次之後數天內小鼠的存活率。
無。
圖1表示稱為“INA01-SDV1”或“INA01-SDV#1”的ADC的示意圖示。INA01對應至Ab，APN對應至L，VC-PAB各自對應至Z-X，且MMAE對應至D。
圖2表示INA01-SDV1和A24在造血細胞株上的比較鍵結，圖2A表示用THP-1細胞株的結果，圖2B表示用MEC-1細胞株的結果。
圖3表示用人類CD71轉染或不轉染的CHO細胞上計畫性細胞死亡(細胞凋亡)的誘導，圖3A表示用CD71陰性細胞的結果，且圖3B表示用CD71陽性細胞的結果。
圖4表示藉由減少INA01-SDV#1在多細胞株上的增殖的體外功效，圖4A表示用Ramos細胞株的結果，且圖4B表示用THP-1細胞株的結果。
圖5表示INA01-SDV#1的體內功效。圖5表示在處理之後用THP-1細胞株異種移植的無腫瘤小鼠的百分比的Kaplan-Meier圖。治療僅由投予一次稱為INA01-SDV#1的ADC組成。當腫瘤尺寸為約100mm3 時，經腹膜內(IP)注射來治療。測試了兩種劑量(5mg/kg和0.5mg/kg)。n是小鼠數目。
圖6表示在野生型B6(WT)小鼠中的INA01-SDV#1和以3mg/kg經腹膜內投予的CD71/轉鐵蛋白雙剔除小鼠(TfR/Tf 2Ki)的毒理學分析。每4天進行5次注射(q4dx5)。圖6A表示在WT中的肉眼可見的器官分析，且圖6B表示在TfR/Tf 2Ki小鼠中的肉眼可見的器官分析。圖6A和圖6B中描述的每個器官的組織學檢查係在表7中述及。
圖7表示HL-60急性骨髓性白血病細胞株的細胞增殖，該細胞株在37℃下與10個濃度的稱為INA01-SDV#1的ADC一起培養72小時，範圍從0.02至10ug/mL。配適的曲線用於計算IC50 (0.08ug/mL)。
圖8表示在三種不同條件下將PBMC(周邊血液單核細胞)與稱為INA01-SDV#1的ADC培養之後的TNF-α產生(以pg/mL計)，前述三種不同條件為：高披覆(風乾)、低披覆(濕法披覆)或在溶液(水溶液)中。測試了三種不同濃度的ADC：0.1、1和10ug/mL。
圖9表示INA01-SDV#1的體內功效。圖9表示在處理之後用THP-1細胞株異種移植的無腫瘤小鼠的百分比的Kaplan-Meier圖。治療由稱為INA01-SDV#1的ADC，每4天4次投予組成。當腫瘤尺寸為約100mm3 時，經腹膜內(IP)注射來治療。測試了兩種劑量(1mg/kg和0.5mg/kg)。n是小鼠數目。使用對數等級檢定確定p值。* P=0.025。
圖10表示INA01-SDV#1的體內功效。圖10表示在處理之後用THP-1細胞株異種移植的無腫瘤小鼠的百分比的Kaplan-Meier圖。治療由稱為INA01-SDV#1的ADC，每4天4次投予組成。當腫瘤尺寸為約100mm3 時，經靜脈注射(IV)來治療。測試了兩種劑量(3mg/kg和0.5mg/kg)。n是小鼠數目。使用對數等級檢定確定p值。** P=0.0015。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 108112406-A0101-11-0002-1

Claims (15)

  1. 一種抗體-藥物綴合物，其具有式(I)：Ab-L-Z-X-D， 其中，Ab係抗-TfR抗體， L係鍵結至所述抗體的連接子分子，所述連接子分子係式(II)：
    Figure 03_image001
    式(II) 其中，n係2和20之間的整數， Z係鍵結至L的纈胺酸-瓜胺酸二肽， X係鍵結至Z的胺基苯甲基酯自消耗性基， D係鍵結至X的藥物。
  2. 如請求項1所述之抗體-藥物綴合物，其中，所述藥物係細胞毒性藥物，特別是單甲基奧瑞他汀E。
  3. 如請求項1至2中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，X係共價鍵結至Z的對-胺基苯甲基酯基，所述X係下式(III)：
    Figure 03_image003
    式(III) J係選自F、Cl、Br、NO2 、NHCOCH3 、N(CH3 )2 、NHCOCF3 、烷基及鹵烷基中的任選取代基，且m係0、1、2、3和4的整數， 所述X較佳係對-胺基苯甲基酯，其中m係0。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，L係共價鍵結至所述抗體中之一個或多個硫醇殘基， 較佳所述L對應於式(IV)的連接子分子：
    Figure 03_image005
    式(IV) 。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，所述抗體包括全長抗體或含有抗原鍵結部分的抗體片段。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，所述抗體特異性鍵結至SEQ ID NO：16之轉鐵蛋白受體。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，所述抗體與所述轉鐵蛋白受體鍵結的KD為10nM或更低，較佳KD為1nM或更低。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，所述抗體係單株抗體及/或人源化抗體。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中， 所述抗體包含人類IgG4同型恆定區，或突變或化學修飾的恆定區，其中，在與具有野生型IgG1同型恆定區的相應抗體相比時，所述突變或化學修飾的恆定區對所述抗體不賦予或降低ADCC活性，或 所述抗體包含人類IgG1同型恆定區，或突變或化學修飾的恆定區，其中，在與具有野生型IgG1同型恆定區的相應抗體相比時，所述突變或化學修飾的恆定區賦予所述抗體增加的ADCC活性。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其中，所述抗-TfR抗體包含： (a) 包含SEQ ID NO：1之HCDR1、SEQ ID NO：2之HCDR2、SEQ ID NO：3之HCDR3的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：4之LCDR1、SEQ ID NO：5之LCDR2和SEQ ID NO：6之LCDR3的可變輕鏈多肽； (b) 包含SEQ ID NO：1之HCDR1、SEQ ID NO：2之HCDR2、SEQ ID NO：3之HCDR3的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：4之LCDR1、SEQ ID NO：8之LCDR2和SEQ ID NO：6之LCDR3的可變輕鏈多肽； (c) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：13之VL的可變輕鏈多肽； (d) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：14之VL的可變輕鏈多肽； (e) 包含SEQ ID NO：11之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：15之VL的可變輕鏈多肽； (f) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：13之VL的可變輕鏈多肽； (g) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：14之VL的可變輕鏈多肽；或 (h) 包含SEQ ID NO：12之VH的可變重鏈多肽以及包含SEQ ID NO：15之VL的可變輕鏈多肽； 較佳所述抗體係包含SEQ ID NO：18之重鏈以及SEQ ID NO：17之輕鏈的mAb1。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之抗體-藥物綴合物，其係用作為藥劑，且較佳係用於治療腫瘤，例如實體腫瘤或血液腫瘤，且更具體係淋巴瘤或白血病。
  12. 一種醫藥組合物，包含如請求項1至10中任一項所述之抗體-藥物綴合物；與一種或多種醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合，任選地包含其他活性成分。
  13. 一種組合物，包含如請求項1至10中任一項所述之抗體-藥物綴合物，所述組合物具有6.5的pH，且進一步包含組胺酸，和任選的蔗糖和聚山梨醇酯80。
  14. 一種凍乾調配物、預填充注射器或小瓶，包含如請求項1至10中任一項所述之抗體-藥物綴合物。
  15. 一種用於獲得如請求項1至10中任一項所述之抗體-藥物綴合物的方法，包含以下步驟： 在適合於表現編碼如請求項1至10中所定義的抗體的核酸的條件下培養宿主細胞； 分離所述抗體； 使單甲基奧瑞他汀E鍵結至式(V)的連接子L-Z-X的合成；以及
    Figure 03_image007
    式(V) 使所述抗體綴合至經鍵結至式(V)的連接子L-Z-X的單甲基奧瑞他汀E。
TW108112406A 2018-04-10 2019-04-10 抗體藥物綴合物、包含其的醫藥組合物、組合物和凍乾調配物、預填充注射器或小瓶及獲得其的方法 TWI829683B (zh)

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