ES2936527T3 - Conjugados de anticuerpo-fármaco y sus usos para el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a conjugados de anticuerpo-fármaco, en los que el anticuerpo se une específicamente a TfR, el receptor de transferrina, y en los que el fármaco se elige preferentemente entre un fármaco citotóxico. Dichos conjugados de anticuerpo-fármaco son útiles en particular en el tratamiento de enfermedades proliferativas que incluyen cánceres, tales como linfoma o leucemia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo-fármaco y sus usos para el tratamiento del cáncer
Sector de la técnica
A continuación se divulgan conjugados de anticuerpo-fármaco, en donde el anticuerpo se une específicamente a TfR, el receptor de la transferrina, y en donde el fármaco se elige preferentemente entre un fármaco citotóxico. Dichos conjugados de anticuerpo-fármaco son útiles en particular en el tratamiento de enfermedades proliferativas, incluidos los cánceres, tales como el linfoma o la leucemia.
Estado de la técnica
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (en lo sucesivo denominados "ADC") son una nueva clase de productos terapéuticos, en particular terapéuticos contra el cáncer. Dichos ADC comprenden al menos un anticuerpo y una carga útil (por ejemplo, un fármaco citotóxico), ambos unidos por un enlazador. Por lo tanto, los ADC están diseñados para combinar la especificidad de la diana del anticuerpo con la eficiencia de la carga útil (por ejemplo, la citotoxicidad de un agente quimioterapéutico). Un ADC eficaz debe presentar alta especificidad y baja toxicidad.
En el contexto de la toxicidad, el anticuerpo del ADC necesita unirse con precisión y eficiencia a su antígeno, lo que significa que el antígeno diana adecuado se expresa preferencial o exclusivamente en las células diana.
Varias patentes o solicitudes de patente, tal como en los documentos US 6214345, WO 03/026577, WO 03/043583, WO 2004/010957, WO 2005/082023 y WO 2015/001117 divulgan enlazadores que se pueden usar para producir ADC. Los ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina o un fármaco con un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptido. Los enlazadores se eligen, por ejemplo, entre aquellos susceptibles de escisión por pH bajo dentro del compartimento lisosomal o susceptibles de escisión por proteasas, como las proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral, por ejemplo, las catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D). Un enlazador eficaz puede garantizar una liberación precisa y oportuna de la carga útil. En el contexto de la toxicidad, también parece que la estabilidad del enlazador puede afectar la toxicidad ejercida por la carga útil, incluso si el propio enlazador no parece provocar toxicidad. De hecho, un enlazador estable puede liberar la carga útil de una manera específica de la diana, mientras que es más probable que un enlazador no estable experimente una liberación imprecisa de la carga útil (por ejemplo, debido a una escisión no específica), dando lugar a una toxicidad inespecífica.
Las cargas útiles utilizadas en los ADC son muy potentes, a menudo fármacos citotóxicos en el intervalo picomolar. Las cargas útiles comunes son, por ejemplo, inhibidores de microtúbulos (como derivados de maitansina (DM1/DM4) o auristatinas (MMAE/MMAF)), Inhibidores de la síntesis de ADN (como caliqueamicina, doxorrubicina, pirrolobenzodiacepinas, indolinobenzodiacepinas o derivados de la duocarmicina) o inhibidores de la topoisomerasa (como SN-38).
Aunque los ADC parecen ser tratamientos prometedores, algunos ADC pueden ser demasiado tóxicos, lo que limita la ventana terapéutica de estos compuestos o impide un mayor desarrollo clínico.
Los ADC eficaces que presentan alta especificidad, máxima eficiencia y baja toxicidad requieren por tanto de una adecuada combinación de cada uno de sus componentes.
El receptor de la transferrina (CD71) (en lo sucesivo denominado "TfR") es una glicoproteína transmembrana homodimérica unida por enlaces disulfuro que consiste en dos monómeros de 760 aminoácidos de aproximadamente 90 kDa cada uno. TfR juega un papel crucial en la regulación de la absorción de hierro y el crecimiento celular (Gill et al., N Engl J Med., 332,1744-1748, 1995 - Hermine et al., N Engl J Med., 332, 1749-1751, 1995). Cuando la transferrina diférrica se une a su receptor de la superficie celular, se internaliza a través de cavidades recubiertas de clatrina a vesículas ácidas donde se disocia el complejo de hierro-transferrina. Después de la liberación, el receptor y la apotransferrina se reciclan de nuevo a la superficie celular.
TfR se expresa constitutivamente en la membrana plasmática celular de tejidos que se renuevan constantemente, tales como los precursores de las células sanguíneas en la médula ósea, los hepatocitos en el hígado, los queratinocitos en la epidermis y los enterocitos en las criptas del epitelio intestinal.
Varios estudios han demostrado que TfR se expresa más abundantemente en tejidos malignos que en sus homólogos sanos (Gatter et al., J Clin Pathol., 36, 539-545, 1983 - Faulk et al., Lancet., 2, 390-392, 1980 - Shindelman et al., Int J Cancer, 27, 329-334, 1981). Varios autores han descrito enfoques terapéuticos basados en esta idea utilizando anticuerpos anti-TfR o la propia transferrina conjugada con fármacos para destruir células malignas. También se ha propuesto utilizar anticuerpos anti-TfR para bloquear la interacción entre transferrina y TfR y, en consecuencia, prevenir la absorción de hierro, lo que conduce a la privación de hierro y la regulación negativa del crecimiento celular. Sin embargo, aunque muchas publicaciones describen la preparación de anticuerpos anti-TfR, existen muy pocas referencias de anticuerpos monoclonales (mAb) anti-TfR que tengan actividad antiproliferativa.
En una publicación anterior (Moura et al., J. Exp. Med., 194, 417-425, 2001), los autores han descrito una IgG monoclonal de ratón (IgG2kappa), denominada A24, que se une al TfR humano.
El documento WO 2005/111082 divulga el anticuerpo A24, un anticuerpo murino capaz de bloquear la proliferación de linfocitos T, y que parecía ser más eficaz que el mAb 42/6 descrito anteriormente para inhibir la proliferación de linfocitos T. A24 también redujo la expresión de TfR en la superficie celular y alteró el reciclado de TfR. A24 también puede bloquear la proliferación ex vivo de linfocitos T malignos de las formas agudas y crónicas de la ATL (Moura et al., Blood, 103,5, 1838-45,1 March 2004, Callens et al., 2010; J. Exp. Med., Vol 207 No 4, págs. 731-750). Este anticuerpo también se ha descrito como capaz de prevenir el desarrollo de tumores de linfoma de células del manto tanto in vitro como in vivo (Lepelletier et al. Cancer Res 2007; 67:1145-1154; Callens et al. 2008, Leukemia, 22, 42­ 48).
El documento WO 2017/013230 divulga además versiones humanizadas de anticuerpos A24 y su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos. También divulga un anticuerpo anti-TfR conjugado con un resto terapéutico, tal como una citotoxina o un fármaco. Sin embargo, no se divulga ningún ADC específico en el documento WO 2017/013230.
Por tanto, existe la necesidad de un ADC que comprenda un anticuerpo anti-TfR que sea eficaz, que posea alta especificidad y baja toxicidad.
Los inventores han desarrollado así tal ADC. La presente invención se basa, de hecho, en sus resultados inesperados que muestran que el ADC de la invención (es decir, que comprende anticuerpos anti-TfR específicos combinados con enlazadores y fármacos específicos) posee las siguientes ventajas:
- A24 y el ADC tienen una eficacia de unión similar en células que expresan TfR;
- El ADC induce solo la apoptosis de células CD71 positivo;
- El ADC es eficaz en múltiples líneas celulares;
- El ADC es eficaz in vitro, y también in vivo;
- El ADC no provoca efectos fuera de la diana (por ejemplo, no libera citocinas proinflamatorias) ni efectos tóxicos in vivo.
Objeto de la técnica
Por tanto, la divulgación se refiere al ADC de fórmula (I): Ab-L-Z-X-D, en donde:
- Ab es un anticuerpo anti-TfR,
- L es una molécula enlazadora unida a dicho anticuerpo, siendo dicha molécula enlazadora de fórmula (II):
Figure imgf000003_0001
en donde n es un número entero comprendido entre 2 y 20,
- Z es un dipéptido de valina-citrulina unido a L,
- X es un grupo autoinmolante de éster de aminobencilo unido a Z,
- D es un fármaco unido a X.
En una realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, D es un fármaco citotóxico. Preferentemente, tal D es el fármaco monometil auristatina E (en lo sucesivo denominado "MMAE").
En una realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, X es un grupo éster de paraaminobencilo unido covalentemente a Z, siendo dicho grupo X de la siguiente fórmula (III):
Figure imgf000003_0002
siendo J un sustituyente opcional elegido entre F, Cl, Br, NO2 , NHCOCH3 , N(CH3)2, NHCOCF3 , alquilo y haloalquilo, y siendo m un número entero de 0, 1, 2, 3 y 4. Preferentemente, X es un éster de para-aminobencilo en donde m es 0.
En una realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, L está unido covalentemente a uno o más residuos tiol de dicho anticuerpo. Preferentemente, L corresponde a una molécula enlazadora de fórmula (IV):
Figure imgf000004_0001
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo incluye anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos que contienen porciones de unión a antígeno.
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo se une específicamente al receptor de la transferrina de la SEQ ID NO:16.
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo se une al receptor de la transferrina con una KD de 10 nM o menos, preferentemente con una KD de 1 nM o menos.
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo induce la apoptosis de la línea celular HL-60 a un nivel igual o superior al nivel de inducción medido con el correspondiente anticuerpo quimérico con regiones variables murinas parentales que tienen VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10.
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
En otra realización específica, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo comprende una región constante de isotipo IgG4 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente no confiere o confiere una actividad reducida de ADCC a dicho anticuerpo cuando se compara con un anticuerpo correspondiente con la región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre. Como alternativa, dicho anticuerpo comprende una región constante de isotipo IgG1 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente confiere una mayor actividad de ADCC a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo correspondiente con región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre.
En otra realización específica y preferida, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo anti-TfR es un anticuerpo monoclonal y humanizado de isotipo IgG4.
En otra realización específica y preferida, que se puede combinar con otras realizaciones, dicho anticuerpo anti-TfR comprende o:
(a) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:5 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;
(b) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:8 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;
(c) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13;
(d) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;
(e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:15;
(f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13;
(g) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;
(h) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:15.
Los ejemplos de anticuerpos que se pueden usar en ADC de la invención incluyen los anticuerpos anti-TfR humanizados mAb1 a mAb16 como se describe a continuación, en particular en la Tabla 1. Preferentemente, dicho anticuerpo es mAb1 que comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO:18 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:17.
También se divulgan en este documento ADC como se ha definido anteriormente, para su uso como medicamento, particularmente para su uso en el tratamiento del cáncer. Dicho cáncer es preferentemente un tumor hematológico, y más concretamente un linfoma o leucemia. Como alternativa, dicho ADC también puede usarse en el tratamiento de un tumor sólido.
La divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un ADC como se ha definido anteriormente, en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables, que comprende opcionalmente otros principios activos.
La divulgación se refiere además a una composición que comprende un ADC como se ha definido anteriormente, que comprende además histidina, y que tiene un pH de 6,5. Dicha composición también puede comprender sacarosa y polisorbato 80.
En una realización específica, dicha composición es una formulación liofilizada, o dicho ADC está contenido en una jeringa precargada o un vial precargado en una cantidad terapéuticamente aceptable.
La divulgación se refiere además a un proceso para obtener un ADC como se ha definido anteriormente, en donde el método comprende:
- cultivar una célula hospedadora en condiciones adecuadas para la expresión de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se ha definido anteriormente,
- aislar el anticuerpo,
- síntesis de la monometil auristatina E unida al enlazador L-Z-X de fórmula (V):
Figure imgf000005_0001
- conjugar dicho anticuerpo con monometil auristatina E unida al enlazador L-Z-X de fórmula (V).
Descripción de las figuras
La Figura 1 representa una representación esquemática del ADC denominado "INA01-SDV1" o "INA01-SDV n.° 1". INA01 corresponde a Ab, APN corresponde a L, VC-PAB corresponde a Z-X respectivamente y MMAE corresponde a D.
La Figura 2 representa uniones comparativas de INA01-SDV1 y A24 en líneas de células hematopoyéticas, La Figura 2A representa los resultados con la línea celular THP-1 y la Figura 2B representa los resultados con la línea celular Me C-1.
La Figura 3 representa la inducción de la muerte celular programada (apoptosis) en células CHO transfectadas o no con CD71 humano, La Figura 3A representa los resultados con células negativas para CD71 y la Figura 3B representa los resultados con células positivas para CD71.
La Figura 4 representa la eficacia in vitro por reducción de la proliferación de INA01-SDV n.° 1 en múltiples líneas celulares, La Figura 4A representa los resultados con la línea celular Ramos y la Figura 4B representa los resultados con la línea celular THP-1.
La Figura 5 representa la eficacia in vivo de INA01-SDV n.° 1. La Figura 5 representa el diagrama de Kaplan-Meier del porcentaje de ratones sin tumor xenoinjertados con la línea celular THP-1, después del tratamiento. El tratamiento consiste en una sola administración del ADC denominado INA01-SDV n.° 1. El tratamiento se inyecta por vía intraperitoneal (IP) cuando el tamaño del tumor era de aproximadamente 100 mm3. Se probaron dos dosis (5 mg/kg y 0,5 mg/kg). n es el número de ratones.
La Figura 6 representa el análisis toxicológico de INA01-SDV n.° 1 en ratones B6 de tipo silvestre (WT) y ratones con doble inactivación para CD71/transferrina (TfR/Tf 2Ki) administrado por vía intraperitoneal a 3 mg/kg. Cinco inyecciones cada 4 días (c4dx5). La Figura 6A representa el análisis macroscópico de órganos en WT y Figura 6B representa el análisis macroscópico de órganos en ratones TfR/Tf 2Ki. El examen histológico de cada órgano representado en las Figuras 6A y 6B se menciona en Tabla 7.
La Figura 7 representa la proliferación celular de la línea celular de leucemia mieloide aguda HL-60, incubada durante 72 horas a 37 °C con 10 concentraciones del ADC denominado INA01-SDV n.° 1, que varía de 0,02 a 10 |jg/ml. La curva ajustada se utilizó para calcular la CI50 (0,08 jg/ml).
La Figura 8 representa la producción de TNF-a (en pg/ml) después de la incubación de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) con el ADC denominado INA01-SDV n.° 1 en tres condiciones diferentes: alto recubrimiento (secado al aire), bajo recubrimiento (recubrimiento húmedo) o en solución (acuoso). Se ensayaron tres concentraciones diferentes de ADC: 0,1, 1 y 10 jg/ml.
La Figura 9 representa la eficacia in vivo de INA01-SDV n.° 1. La Figura 9 representa el diagrama de Kaplan-Meier del porcentaje de ratones sin tumor xenoinjertados con la línea celular t HP-1, después del tratamiento. El tratamiento consiste en 4 administraciones, cada 4 días, del ADC denominado INA01-SDV n.° 1. El tratamiento se inyecta por vía intraperitoneal (IP) cuando el tamaño del tumor era de aproximadamente 100 mm3. Se probaron dos dosis (1 mg/kg y 0,5 mg/kg). n es el número de ratones. El valor de p se determinó utilizando la prueba de rangos logarítmicos. *P = 0,025.
La Figura 10 representa la eficacia in vivo de INA01-SDV n.° 1. La Figura 10 representa el diagrama de Kaplan-Meier del porcentaje de ratones sin tumor xenoinjertados con la línea celular THP-1, después del tratamiento. El tratamiento consiste en 4 administraciones, cada 4 días, del ADC denominado INA01-SDV n.° 1. El tratamiento se inyecta por vía intravenosa (IV) cuando el tamaño del tumor era de aproximadamente 100 mm3. Se probaron dos dosis (3 mg/kg y 0,5 mg/kg). n es el número de ratones. El valor de p se determinó utilizando la prueba de rangos logarítmicos. **P = 0,0015.
Descripción detallada
Definiciones
Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, se definen en primer lugar determinados términos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
El término "CD71" o "receptor de la transferrina" o "TfR" se refiere al TfR humano como se define en la SEQ ID NO:16, a menos que se describa lo contrario. Esta secuencia corresponde a la isoforma 1 de la proteína receptor de la transferrina 1 (homo sapiens) (Secuencia de referencia NCBI NP_003225.2).
El término "anticuerpo" al que se hace referencia en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, la "porción de unión a antígeno") o cadenas simples de los mismos. Un "anticuerpo" natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina con los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico (C1q). La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente la "porción de antígeno"), como se usa en el presente documento, se refiere a la longitud completa o uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una parte de TfR). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2; un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un UniBody que consiste en un solo brazo con una cadena pesada de IgG modificada, por ejemplo IgG4, en la región bisagra, un fragmento de anticuerpo de dominio (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), o un fragmento de nanoanticuerpo que consiste en un dominio VH; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; o cualquier proteína de fusión que comprenda tal porción de unión a antígeno. Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes distintos, estos pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una proteína de cadena sencilla en donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, p. ej., Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se exploran para determinar su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a TfR está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de TfR). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a TfR puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de TfR de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única por un epítopo particular.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo o una proteína que "se une específicamente a un antígeno", por ejemplo, que "se une específicamente a TfR" pretende hacer referencia a un anticuerpo o proteína que se une a dicho antígeno (por ejemplo, el TfR humano de la SEQ ID NO:16) con una KD de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos.
El término "KD", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de Kd a Ka (es decir Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para anticuerpos se pueden determinar usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la KD de un anticuerpo es usar resonancia de plasmón superficial, o usar un sistema de biosensor, tal como el sistema Biacore®.
El término "Kasoc" o " Ka", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la velocidad de asociación de una interacción particular antígeno-anticuerpo, mientras que el término "Kdis" o "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la velocidad de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno.
Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos únicos. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interacciona a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad.
Como se usa en el presente documento, la expresión "línea celular HL-60" se refiere a la promielocítica obtenida por Collins et al. (PNAS 1978, 75:2458-1462) y descrita también en Gallagher et al. (Blood, 1979, 54:713-733), por ejemplo disponible en la colección ATCC® con el número de catálogo CCL-240™.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a células procariotas o eucariotas. Las células eucariotas, por ejemplo, las células hospedadoras de mamíferos, levaduras u hongos filamentosos, se prefieren, y en particular las células de mamíferos, porque son más propensas que las células procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunitariamente activo.
Como se usa en el presente documento, el anticuerpo "A24" se refiere al anticuerpo como se divulga en el documento WO 2005/111082.
Como se usa en el presente documento, el término "ADCC" o actividad de "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" se refiere a la actividad de depleción celular. La actividad de ADCC se puede medir mediante ensayos de ADCC comercializados, por ejemplo, ADCC Reporter Bioassay comercializado por Promega con el N.° Ref. G7015.
Como se usa en el presente documento, el término "apoptosis" se refiere a la muerte celular programada. Puede encontrar más información sobre la apoptosis en "Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Susan Elmore, Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516.
Como se usa en el presente documento, el término "CE50" se refiere a la concentración de un anticuerpo para inducir una respuesta, a mitad de camino entre la línea base y el máximo después de un tiempo de exposición especificado. Por ejemplo, dicha concentración se puede determinar mediante el software GraphPad.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, ... El término "sujetos" también abarca el término "paciente".
Como se usa en el presente documento, el término "fármaco" también se refiere a "una carga útil", es decir, un resto que se conjuga con un anticuerpo (o un fragmento). D no ha de interpretarse como que el agente terapéutico está limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, D puede abarcar una proteína, un péptido o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Preferentemente, se refiere a un resto terapéutico, tal como una citotoxina. Una "citotoxina" o "agente citotóxico" incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, las destruye).
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula enlazadora" se refiere a compuestos de fórmulas (II) o (IV). Tales moléculas enlazadoras son apropiadas para unirse a un compuesto que comprende un resto tiol, tal como un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "dipéptido de valina-citrulina" (en lo sucesivo denominado "dipéptido VC") representa un enlazador que consiste en dos aminoácidos valina y citrulina. Este dipéptido es en particular de fórmula (VI):
Figure imgf000008_0001
Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo autoinmolante de éster de aminobencilo" se refiere a un grupo éster de aminobencilo que funciona como un grupo autoinmolante. Dicho grupo está representado por un compuesto de fórmula (III). Un "grupo autoinmolante" puede definirse como un resto químico bifuncional que (i) es capaz de unir covalentemente al menos otros dos restos químicos en una molécula estable, (ii) puede liberarse de uno de los restos químicos espaciados de la molécula por medio de escisión enzimática, y (iii) después de la escisión enzimática, puede escindirse espontáneamente del resto de la molécula para liberar el otro de los restos químicos espaciados.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada saturada monovalente (que tiene una cadena lineal o ramificada). Por ejemplo, "alquilo" se refiere a alquilo C1-C20. Preferentemente, el alquilo es un "alquilo inferior", es decir, un grupo alquilo que tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos (grupo alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada). Por ejemplo, esto incluye metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, sec-butilo, tere-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "haloalquilo" se refiere a un alquilo que tiene uno o más átomos de hidrógeno reemplazados por uno más átomos de halógeno. Preferentemente, el haloalquilo es un "haloalquilo inferior", es decir, un grupo haloalquilo que tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 carbonos (grupo haloalquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada). Por ejemplo, esto incluye FC3 , CF2Br, CH2F, CHFCH3 , CF3CH2 , CF3CF2 , CHF2CF2 , CH2Cl, o CH2CH2CL
Como se usa en el presente documento, el término "unido" se refiere a un enlace. Este enlace también está representado por el guión "-" en la fórmula (I). El enlace puede ser un enlace covalente o una interacción no covalente, como a través de fuerzas electrostáticas. Preferentemente, los enlaces son enlaces covalentes. Como se usa en el presente documento, las "líneas onduladas" en las fórmulas representan los sitios de unión entre cada parte (Ab, L, Z, X y D) del ADC de la divulgación.
Como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente aceptable" se refiere a una cantidad suficiente para lograr los resultados deseados (por ejemplo, una reducción en el tamaño del tumor, inhibición del crecimiento tumoral, prevención de metástasis, inducción de la apoptosis, ...).
Anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos de la divulgación son anticuerpos anti-TfR. Preferentemente, tales anticuerpos incluyen los anticuerpos recombinantes humanizados mAb1-mAb16, aislados y caracterizados estructuralmente por sus secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera variables e isotipo constante humano como se describe en la Tabla 1 a continuación:
- 6
Figure imgf000009_0002
La correspondiente secuencia codificante de aminoácidos y nucleótidos de las regiones de isotipo constante de IgG4, IgG1 y sus versiones mutantes IgG1 AA e IgG1 N297A utilizadas para generar mAb1 a mAb16 son bien conocidas en la técnica. Las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa y las correspondientes secuencias codificantes de mAb1 se muestran en la Tabla 2 a continuación.
T l 2: n i ifi n l ADN l n li r l n i m l
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Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH (también denominadas HCDR1), CDR2 de VH (también denominadas HCDR2), CDR3 de VH (también denominadas HCDR1), CDR1 de VL (también denominadas LCDR1), CDR2 de VL (también denominadas LCDR2), CDR3 de VL (también denominadas HCDR3), de algunos anticuerpos de acuerdo con la divulgación se muestran en la Tabla 3.
En la Tabla 3, las regiones CDR de algunos anticuerpos de la presente divulgación se delinean usando el sistema Chothia (Clothia C, Lesk AM. 1987, J Mol Biol 196, 901-917). Para facilitar la lectura, las regiones CDR se denominan en lo sucesivo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente.
T l : R i n DR mA 1 mA 1 n i r r f r n i A24 r n h hi
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continuación
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Las Tablas 4, 5 y 6 describen secuencias útiles de aminoácidos y nucleótidos relativas a anticuerpos de ADC. T l 4: Br v ri i n n i min i n l i il r n r n r i l inv ni n
Figure imgf000010_0002
T l : Br v ri i n n i min i n l i il r n r n r i l inv ni n
Figure imgf000010_0003
continuación
Figure imgf000011_0001
continuación
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Tabla 6: Descripción de las regiones variables y de la región Fc de IgG de mAb1-mAb16
Figure imgf000013_0001
En una realización, un anticuerpo recombinante aislado tiene: una región variable de la cadena pesada que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1; HCDR2 de la SEQ ID NO:2; HCDR3 de la SEQ ID NO:3; una región variable de la cadena ligera que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4; LCDR2 de las SEQ ID NOs: 5 u 8; y LCDR3 de las SEQ ID NOs: 6; en donde dicho anticuerpo se une específicamente al receptor de la transferrina de la SEQ ID NO:16.
En realizaciones específicas, el anticuerpo recombinante aislado de acuerdo con la divulgación comprende o:
(a) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:5 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;
(b) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:8 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;
(c) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:13;
(d) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:14;
(e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:15;
(f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:13;
(g) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:14; o
(h) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:15.
En una realización específica, dicho anticuerpo anti-TfR recombinante como se ha definido anteriormente tiene una o más de las siguientes propiedades:
(i) se une al receptor de la transferrina con una KD de 10 nM o menos, preferentemente con una KD de 1 nM o menos, medida por SPR;
(ii) se une al receptor de la transferrina con una CE50 de 0,1 pg/ml o menos, preferentemente de 0,05 pg/ml o menos, medido en un ensayo ELISA (véase el documento PCT/EP2016/067465 para obtener más información); (iii) induce la apoptosis de la línea celular HL-60 a un nivel igual o superior al nivel de inducción medido con el correspondiente anticuerpo quimérico de referencia que tiene las regiones variables murinas parentales con VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10, por ejemplo, medido usando un ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60. Normalmente, se puede analizar una cantidad de 10 pg/ml de un anticuerpo recombinante de la presente divulgación para la inducción de la apoptosis de la línea celular HL-60 en comparación con la misma cantidad del anticuerpo quimérico de referencia con las regiones variables murinas parentales de A24 que comprenden VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10. La inducción de la apoptosis en el ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60 de un anticuerpo probado es igual a un anticuerpo de referencia si el porcentaje de células positivas medido con el anticuerpo probado no es significativamente menor que el porcentaje de células positivas medido con el anticuerpo de referencia.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo quimérico de referencia "correspondiente" se refiere al anticuerpo de referencia con una región constante de isotipo 100 % idéntica a la región constante de isotipo del anticuerpo que se va a probar para una propiedad particular, por ejemplo, la inducción de la apoptosis.
En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones anteriores, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo de los anticuerpos definidos anteriormente. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, UniBody y fragmentos scFv, diacuerpos, dominio único o nanoanticuerpos y otros fragmentos. El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véanse, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 6.248.516 B1). Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células hospedadoras recombinantes como se describen en el presente documento.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo de la presente divulgación es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, a la vez que tiene al menos la misma afinidad (o afinidad superior) del anticuerpo no humano parental. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos humanizados del anticuerpo parental A24. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que, las c Dr , (o porciones de las mismas) proceden de un anticuerpo no humano, por ejemplo, el anticuerpo A24 murino y las FR (o porciones de las mismas) proceden de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, se sustituyen algunos restos de FR en un anticuerpo humanizado por los restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo A24 del que proceden los restos de la CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo. En algunas realizaciones específicas, también se sustituyen algunos restos de la CDR en un anticuerpo humanizado, p. ej., para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, p. ej., en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen etal., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); patentes de EE.UU. N.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de regiones determinantes de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "modificación de la superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR). Preferentemente, el anticuerpo recombinante de acuerdo con la divulgación es un anticuerpo silencioso humanizado, preferentemente un anticuerpo IgG1 o IgG4 silencioso humanizado.
Como se usa en el presente documento, el término anticuerpo "silencioso" se refiere a un anticuerpo que presenta una actividad de ADCC baja o nula medida en un ensayo de actividad de ADCC.
En una realización, la expresión "actividad de ADCC baja o nula" significa que el anticuerpo silencioso presenta una actividad de ADCC que está al menos por debajo del 10 %, por ejemplo por debajo del 50 % de la actividad de ADCC que se observa con el correspondiente anticuerpo con isotipo IgG1 humano de tipo silvestre.
Las funciones efectoras silenciadas se pueden obtener mediante mutación en la parte constante Fc de los anticuerpos y se han descrito en la técnica: Strohl 2009 (AA y N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J. Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91). Los ejemplos de anticuerpos IgG1 silenciosos comprenden el denominado mutante AA que comprende la mutación L234A y L235A en la secuencia de aminoácidos de Fc de IgG1. Otro anticuerpo IgG1 silencioso comprende la mutación N297A, que da como resultado anticuerpos aglucosilados o no glucosilados.
Los anticuerpos con secuencias de aminoácidos mutantes se pueden obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de las moléculas de ácido nucleico codificantes, seguido de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función retenida (es decir, las funciones descritas anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
Anticuerpos con modificaciones conservadoras
En determinadas realizaciones, un anticuerpo (o una proteína de unión que comprende una porción de unión al antígeno del mismo) de la divulgación tiene una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde una o más de estas secuencias CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos mAb1 a mAb16 descritos en el presente documento o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde el anticuerpo o proteína retiene las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-TfR de la divulgación.
Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-TfR incluyen sin limitación:
(i) se une al receptor de la transferrina con una KD de 10 nM o menos, preferentemente con una Kd de 1 nM o menos, por ejemplo, medido mediante el ensayo de SPR, por ejemplo usando Biacore® ;
(ii) se une al receptor de la transferrina con una CE50 de 0,1 pg/ml o menos, preferentemente de 0,05 pg/ml o menos, medido en un ensayo ELISA (véase el documento PCT/EP2016/067465 para obtener más información); (iii) induce la apoptosis de la línea celular HL-60 a un nivel igual o superior al nivel de inducción medido con el correspondiente anticuerpo quimérico de referencia que tiene las regiones variables murinas parentales con VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10, por ejemplo, medido usando un ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60. Normalmente, se puede analizar una cantidad de 10pg/ml de un anticuerpo recombinante de la presente divulgación para la inducción de la apoptosis de la línea celular HL-60 en comparación con la misma cantidad del anticuerpo quimérico de referencia con las regiones variables murinas parentales de A24 que comprenden VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10. La inducción de la apoptosis en el ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60 de un anticuerpo probado es igual a un anticuerpo de referencia si el porcentaje de células positivas medido con el anticuerpo probado no es significativamente menor que el porcentaje de células positivas medido con el anticuerpo de referencia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "modificaciones de secuencia conservadoras" pretende hacer referencia a sustituciones de aminoácidos en las que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la divulgación se pueden reemplazar por otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado se puede ensayar para determinar la función retenida usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la divulgación mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por la PCR.
Manipulación genética en la región marco o Fc
Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética de la divulgación incluyen aquellos en los que se han efectuado modificaciones en los restos de la región marco en VH y/o VL, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Generalmente, tales modificaciones en la región marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo. Dichos restos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que proviene el anticuerpo. Para reestablecer las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" estén abarcados por la invención.
Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T para reducir de ese modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo.
En particular, la empresa Antitope (Cambridge, Reino Unido) ha desarrollado una gama de tecnologías patentadas para evaluar y eliminar la inmunogenicidad, que se basan en la identificación de la ubicación de los epítopos de linfocitos T en proteínas y anticuerpos terapéuticos. Estas tecnologías se resumen a continuación:
- iTope™ - una tecnología informática para la predicción de la unión de péptidos a alelos de las moléculas del CMH de clase II humano (Perry et al. 2008 Drugs en R&D, 9(6):385-396).
- TCED™ - una base de datos de epítopos de linfocitos T conocidos identificados en estudios que utilizan ensayos de mapeo de epítopos de linfocitos T EpiScreen™ especialmente de regiones V de anticuerpos (Bryson et al. 2010 Biodrugs 24(1): 1-8). La base de datos puede ser consultada por BLAST haciendo una búsqueda para identificar motivos comunes (Altschul et al. 1997 Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402).
Además o como alternativa a las modificaciones efectuadas en la región marco o en las regiones CDR, los anticuerpos de la divulgación se pueden modificar por ingeniería genética para que incluyan modificaciones en la región Fc, generalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno.
Asimismo, un anticuerpo de la divulgación se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) o modificar para alterar su glucosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "región constante de isotipo" o "región Fc" se usa indistintamente para definir la región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la región Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. La región Fc de la cadena pesada de la IgG humana generalmente se define como que comprende el resto de aminoácido desde la posición C226 o desde P230 hasta el extremo carboxilo terminal del anticuerpo IgG. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice EU de Kabat. La lisina del extremo C (K447) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos de la divulgación puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin restos K447 eliminados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447.
En una realización específica, se modifica la región bisagra de CH1 de tal manera que se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra, p. ej., aumenta o disminuye. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.677.425, concedida a Bodmer et al. Se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra-Fc de manera que el anticuerpo tiene una unión a la proteína A estafilocócica (SpA) deteriorada en relación con la unión a SpA de Fc-bisagra natural. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.165.745, concedida a Ward et al.
En otra realización, el anticuerpo se modifica para incrementar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.277.375 concedida a Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo en la región CH1 o CL para que contenga un receptor de rescate de unión al epítopo tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022 concedidas a Presta et al.
Incluso en otras realizaciones, se altera la región Fc sustituyendo al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sustituir uno o más aminoácidos por un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero mantenga la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo original. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc del componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas concedidas a Winter et al.
En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos se pueden sustituir por un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una unión a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551 concedida a Idusogie et al.
En otra realización, se alteran uno o más restos de aminoácidos para alterar de este modo la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 94/29351, concedida a Bodmer et al.
En aún otra realización, se modifica la región Fc para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 00/42072 concedida a Presta. Por otra parte, los sitios de unión en la IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem 276:6591-6604).
En otras realizaciones, se modifica la región Fc para disminuir la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para disminuir la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. Dichos anticuerpos con funciones efectoras disminuidas, y en particular ADCC disminuida, incluyen anticuerpos silenciosos.
En determinadas realizaciones, se usa el dominio Fc de isotipo IgG1. En algunas realizaciones específicas, se usa una variante mutante del fragmento Fc de la IgG1, por ejemplo un Fc de IgG1 silencioso que reduce o elimina la capacidad del polipéptido de fusión para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/ o unirse a un receptor Fcy. Un ejemplo de un mutante silencioso de isotipo IgG1 es una IgG1 en donde la leucina se reemplaza por alanina en las posiciones de aminoácidos 234 y 235 como se describe en J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 por Hezareh et al.
En determinadas realizaciones, el dominio Fc es un mutante Fc silencioso que evita la glucosilación en la posición 297 del dominio Fc. Por ejemplo, el dominio Fc contiene una sustitución del aminoácido asparagina en la posición 297. Un ejemplo de dicha sustitución de aminoácidos es la sustitución de N297 por una glicina o una alanina.
En otra realización más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, que el anticuerpo carece de glucosilación). Se puede alterar la glucosilación para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la alteración de uno o más sitios de glucosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región marco variable para eliminar de este modo la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicho enfoque se describe con más detalle en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.714.350 y 6.350.861 concedidas a Co et al.
Adicionalmente, o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNAc bisectadas aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glucosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar los anticuerpos recombinantes de la divulgación para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1 176 195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación. Por tanto, en una realización, los anticuerpos de la divulgación se producen mediante expresión recombinante en una línea celular que presenta un patrón de hipofucosilación, por ejemplo, una línea celular de mamífero con expresión deficiente del gen FUT8 que codifica la fucosiltransferasa. La Publicación PCT WO 03/035835 concedida a Presta describe una variante de la línea celular CHO, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a los hidratos de carbono unidos a Asn(297), que también da como resultado una hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 concedida a Umana et al. describe líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que dichos anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas por ingeniería genética presentan estructuras GlcNac bisectadas aumentadas que dan como resultado una actividad de ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).
Otra modificación de los anticuerpos en el presente documento que se contempla en la presente divulgación es la pegilación o hesilación o tecnologías relacionadas. Se puede someter a pegilación un anticuerpo para, por ejemplo, incrementar la semivida biológica (por ejemplo, en el suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster o derivado aldehído reactivo de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos de PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende incluir cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la divulgación. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 concedido a Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 concedido a Ishikawa et al.
Otra modificación de los anticuerpos que se contempla en la presente divulgación es un conjugado o una fusión de proteína de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la divulgación con una proteína sérica, tal como la seroalbúmina humana o un fragmento de la misma para aumentar la semivida de la molécula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Ballance et al., documento EP 0322094.
Otra posibilidad es una fusión de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la divulgación con proteínas capaces de unirse a proteínas séricas, tales como la seroalbúmina humana para aumentar la semivida de la molécula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Nygren et al., documento EP 0486525.
En una realización específica, la función efectora o la función de activación del complemento de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación se ha reducido o eliminado respecto a un anticuerpo de tipo silvestre del mismo isotipo. En un aspecto, la función efectora se reduce o se elimina mediante un método seleccionado entre reducción de la glucosilación del anticuerpo, modificación de isotipo del anticuerpo a un isotipo que naturalmente tiene una función efectora reducida o eliminada y modificación de la región Fc. En una realización relacionada específica, dicho isotipo con función efectora reducida o eliminada es el isotipo IgG4.
Producción de anticuerpos de la divulgación
Los anticuerpos de la divulgación se pueden obtener utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Para obtener más información sobre los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la divulgación, así como la generación de transfectomas que producen estos anticuerpos, los expertos en la materia también pueden consultar la solicitud internacional número PCT/EP2016/067465.
Enlazadores
El ADC de la divulgación contiene tres enlazadores diferentes: L, Z y X. La fórmula general de estos tres enlazadores unidos entre sí está representada por la fórmula (V). Los enlazadores permiten el enlace entre el anticuerpo y el fármaco. Preferentemente, el enlace es covalente. Por tanto, en una realización de la invención, D está unido covalentemente a X y/o X está unido covalentemente a Z y/o Z está unido covalentemente a L y/o L está unido covalentemente a Ab. Más preferentemente, D está unido covalentemente a X y X está unido covalentemente a Z y Z está unido covalentemente a L y L está unido covalentemente a Ab.
L es una molécula enlazadora de fórmula (II) o (IV), en donde n es un número entero comprendido entre 2 y 20. L es un PEG-arilpropiolonitrilo, también denominado "APN". Como se divulga en el presente documento, n abarca entonces 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20. L confiere estabilidad de ADC en una amplia gama de condiciones. Se divulga más información sobre L en el documento PCT/EP2014/064387.
En una realización, que se puede combinar con otras realizaciones, L está ligado al anticuerpo a través de al menos un resto tiol (de la cisteína de un anticuerpo). En una realización, el enlace entre L y el anticuerpo está del lado del doble enlace C=C en la fórmula (II) o (IV).
Z es un dipéptido de valina-citrulina unido a L. Z está unido a L en el lado del grupo carbonilo (es decir, función carbonilo) en L. En una realización, el enlace entre L y Z ocurre entre el grupo carbonilo de L y la función amino de Z (por ejemplo, función amino de valina). El dipéptido VC es un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles aprovechan las diferencias entre las condiciones en el torrente sanguíneo y las condiciones citoplásmicas dentro de las células diana (en particular, las células cancerosas). El dipéptido VC se escinde en el ambiente ácido dentro de los lisosomas por las proteasas lisosomales, como la catepsina B. Después de la internalización de ADC en las células diana, hay un mecanismo de escisión intracelular por la catepsina B, entre Z y X (por ejemplo, escisión entre la citrulina y el grupo autoinmolante de éster de aminobencilo del lado de la función amina (véase en la fórmula (VII):
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El fármaco X resultante no es un intermedio estable y se elimina espontáneamente dejando el fármaco como producto (es decir, una eliminación 1,6 (autoinmolación)). Para obtener más información sobre el dipéptido valina-citrulina como mecanismo de escisión intracelular por la catepsina B, véase por ejemplo Dubowchik Gm , Firestone RA, Padilla L, Willner D, Hofstead SJ, Mosure K, et al. Bioconjug Chem. 2002; 13:855-69.
X es un grupo autoinmolante de éster de aminobencilo unido a Z de fórmula (III). X está unido a Z en el lado del grupo carboxílico (es decir, función carbonilo) de Z. En una realización, el enlace entre Z y X se produce entre el grupo carbonilo de Z y la función amino de X. Para obtener más información sobre el grupo autoinmolante del éster de aminobencilo, véase los documentos WO 03/026577 o WO 2004/010957. Como se divulga en el presente documento, X es, por lo tanto, un espaciador de resto químico bifuncional, que (i) es capaz de unir covalentemente al menos otros dos restos químicos en una molécula estable (en particular, D y Z), (ii) puede liberarse de uno de los restos químicos espaciados de la molécula por medio de la escisión enzimática (después de la escisión por la catepsina B, se libera X-D); y (iii) después de la escisión enzimática, puede escindirse espontáneamente del resto de la molécula para liberar el otro de los restos químicos espaciados (finalmente se libera D).
Cargas útiles
En una realización, D de la divulgación es una carga útil que está unida a X en el lado de la función carbonilo de X. En una realización, el enlace entre X y D ocurre entre la función carbonilo de X y el grupo amino de D.
En una realización específica, en el ADC de la divulgación, D es un fármaco citotóxico.
En una realización, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que consiste en: taxol, citocalasina B, auristatina, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Esto incluye también antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes ablativos (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina-platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Preferentemente, el fármaco es monometil auristatina E.
ADC de la divulgación
En una realización, la presente divulgación proporciona ADC donde un anticuerpo anti-TfR se une a un fármaco (en particular, MMAE). Los enlazadores son moléculas L, Z y X como se ha definido anteriormente. Preferentemente, dicho ADC puede administrar selectivamente una dosis eficaz de una MMAE a los tejidos tumorales que expresan TfR.
En una realización, la presente divulgación proporciona ADC de fórmula (I) como se ha definido anteriormente.
En una realización más preferida, el ADC de la divulgación es el siguiente:
- Ab es un anticuerpo anti-TfR, en particular mAb1 como se ha definido anteriormente,
- L es una molécula enlazadora unida a dicho anticuerpo, siendo dicha molécula enlazadora de fórmula (IV), - Z es un dipéptido de valina-citrulina unido a L,
- X está unido a Z y es un grupo autoinmolante de éster de para-aminobencilo de fórmula (III) en donde m es 0, - D es un fármaco unido a X, en particular MMAE.
En otra realización más preferida, el ADC de la divulgación denominado "INA01-SDV1" es el siguiente:
- Ab es el anticuerpo mAb1 anti-TfR caracterizado por una cadena pesada representada por la SEQ ID NO:18 y una cadena ligera representada por la SEQ ID NO:17,
- L es una molécula enlazadora unida a dicho anticuerpo, siendo dicha molécula enlazadora de fórmula (IV), - Z es un dipéptido de valina-citrulina unido a L,
- X está unido a Z y es un grupo autoinmolante de éster de para-aminobencilo de fórmula (III) en donde m es 0, - D es MMAE.
La Figura 1 representa una representación esquemática de uno de los ADC preferidos de la divulgación, denominado "INA01-SDV1" o "INA01-SDV n.° 1". Al anticuerpo humanizado INA01 (Ab) se le ha unido a través de los restos de cisteína el enlazador APN (L), una secuencia dipeptídica valina-citrulina escindible por la enzima catepsina B (Z), un éster de para-aminobencilo de fórmula (III) en donde m es 0 (X), y la monometil auristatina E citotóxica 'MMAE' (D).
Si bien la proporción entre fármaco y anticuerpo tiene un valor exacto para un ADC específico, se entiende que el valor a menudo será un valor promedio cuando se usa para describir una muestra que contiene muchos ADC, debido a cierto grado de falta de homogeneidad, normalmente asociado con la etapa de conjugación. La carga promedio para una muestra de un ADC se denomina en el presente documento proporción entre fármaco y anticuerpo, o "DAR". En algunas realizaciones, la DAR está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 (es decir, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 y 8), preferentemente en un promedio de alrededor de 4.
Composiciones farmacéuticas - Formulaciones
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de ADC divulgados en el presente documento, (por ejemplo, un ADC seleccionado del grupo que consiste en mAb1-mAb16, en particular mAb1, unido a una molécula enlazadora de fórmula (IV), unida a su vez a Z, unido a su vez a X, que es un grupo autoinmolante de éster de para-aminobencilo de fórmula (III) en donde m es 0, unido a su vez a un fármaco como MMAE), formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida, la composición de la divulgación (por ejemplo, una formulación) contiene (i) uno o una combinación de ADC divulgados en el presente documento, (por ejemplo, un ADC seleccionado del grupo que consiste en mAb1-mAb16, en particular mAb1, unido a una molécula enlazadora de fórmula (IV), unida a su vez a Z, unido a su vez a X, que es un grupo autoinmolante de éster de para-aminobencilo de fórmula (III) en donde m es 0, unido a su vez a un fármaco como MMAE), (ii) histidina, (iii) y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, y el pH de dicha composición es 6,5. En otra realización, la composición de la divulgación (por ejemplo, una formulación) contiene (i) uno o una combinación de ADC divulgados en el presente documento, (ii) histidina (iii) sacarosa, (iv) polisorbato 80, y el pH de dicha composición es 6,5. Preferentemente, la concentración molar de histidina es 20 mM. En otra realización, la composición de la divulgación (por ejemplo, una formulación) contiene (i) uno o una combinación de ADC divulgados en el presente documento, (ii) histidina 20 mM, (iii) sacarosa al 6 % (6 g por 100 ml de tampón), (iv) polisorbato 80 al 0,02 %, y el pH de dicha composición es de 6,5. Preferentemente, dichas composiciones son estables a 40 °C, es decir, la DAR media del ADC se mantiene entre 4 y 4,5. El pH puede determinarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir ADC de la presente divulgación, combinado con al menos un agente antivírico, antiinflamatorio u otro agente antiproliferativo. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en la terapia de combinación se describen en mayor detalle a continuación en la sección sobre usos del ADC de la divulgación.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, intradural o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). En una realización, el vehículo debe ser adecuado para la vía subcutánea. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, ADC, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia. (Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995)). Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en superficies de viales, ...
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen naturalmente dependerán de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, ...
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden formularse para administración tópica, oral, parenteral, intraperitoneal, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares, preferentemente intraperitoneal o intravenosa.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos, que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles, (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de las soluciones inyectables.
Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse como una función de diversos parámetros y en particular como una función del modo de administración usado, de la patología pertinente o como alternativa, de la duración deseada del tratamiento.
Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz del ADC en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; incluyendo las formulaciones aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles o liofilizados para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tales como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Un ADC de la divulgación puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede llevarse a cabo con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros principios necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de la solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.
También se contempla la preparación de soluciones más, o fuertemente, concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los principios activos en un área tumoral pequeña.
Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármaco y similares.
Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences" 15.a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración, en todo caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual.
El ADC de la divulgación puede formularse en una mezcla terapéutica de forma que comprenda de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso 1,0 a aproximadamente 10 miligramos por dosis. También pueden administrarse múltiples dosis.
Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad.
En determinadas realizaciones, se puede contemplar el uso de liposomas y/o nanopartículas. La formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos por los expertos en la materia.
Las nanocápsulas pueden en general inmovilizar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 pm) se diseñan en general usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan para el uso en la presente divulgación nanopartículas biodegradables de polialquil-cianoacrilato que cumplen con estos requisitos, y tales partículas pueden fabricarse fácilmente.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilaminares (denominadas también vesículas multilaminares (MLV)). Las MLV tienen en general diámetros desde 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.
Usos y métodos del ADC de la divulgación
El ADC de la presente divulgación tiene utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o in vivo o a un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos.
El ADC de la divulgación no solo puede inhibir la proliferación celular, sino también inducir apoptosis de células muy proliferativas, tales como linfocitos T activados.
Se contempla en el presente documento usar el ADC de la presente divulgación como un medicamento, en particular para su uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de trastornos proliferativos celulares, tales como tumores que expresan un elevado nivel de TfR, más específicamente, tumores hematológicos, tales como linfoma, y en particular, ATL, MCL, enfermedad de Hodgkin, linfoma de linfocitos B grandes, linfoma periférico de linfocitos T, leucemia aguda (mieloide y linfoide), así como tumores sólidos, tales como carcinoma renal, cáncer de pulmón (microcítico), cáncer de mama...
Se divulga además el ADC de la presente divulgación para su uso en el tratamiento de un tumor sólido.
El ADC para su uso como se ha divulgado anteriormente puede administrarse como el único principio activo o junto con, por ejemplo, como adyuvante de, o en combinación con, otros fármacos, por ejemplo, agentes antivíricos, antiinflamatorios o citotóxicos, antiproliferativos, quimioterapia o agentes antitumorales, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de las enfermedades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, el ADC para su uso como se ha divulgado anteriormente se puede usar en combinación con AZT, IFN-alfa, mAb anti-CD20, mAb anti-CD25, mAb anti-PD1, mAb anti-PDL-1, agentes quimioterapéuticos. Agentes antineoplásicos adecuados pueden incluir sin limitación, agentes alquilantes (tales como ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucilo, melfalán, nitrosureas, temozolomida), antraciclinas (tales como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, valrrubicina), taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel), epotilonas, inhibidores de la topoisomerasa I (tales como irinotecán o topotecán), inhibidores de la topoisomerasa II (tales como etopósido, tenipósido o taflupósido), análogos de nucleótidos y análogos de precursores (tales como azacitidina, azatioprina, capecitabina, citarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, o tioguanina), antibióticos peptídicos (tales como carboplatino, cisplatino y oxaliplatino), retinoides (tales como tretinoína, alitretinoína, bexaroteno), alcaloides de la vinca y derivados (tales como vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), terapias dirigidas tales como inhibidores de quinasa (tales como ibrutinib, idelalisib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, vismodegib), inhibidores del proteasoma (tales como bortezomib, carfilzomib), inhibidores de la histona desacetilasa (tales como vorinostat o romidepsina).
De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación proporciona en otro aspecto más un método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ADC de la divulgación.
De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación proporciona en un aspecto adicional un método que comprende la coadministración, por ejemplo, concomitantemente o por orden, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ADC de la divulgación, y al menos un segundo fármaco, siendo dicho segundo fármaco un agente antivírico o antiproliferativo, por ejemplo, como se ha indicado anteriormente.
También dentro del alcance de la presente divulgación están kits que consisten en las composiciones (por ejemplo, que comprenden ADC) divulgados en el presente documento y las instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos adicionales o proteínas (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno diana distinto del primer anticuerpo). Los kits incluyen normalmente un texto informativo que indica el uso pretendido de los contenidos del kit. La expresión texto informativo incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit. El kit puede comprender además herramientas para diagnosticar si un paciente pertenece a un grupo que responderá a un tratamiento con ADC, tal como se ha definido anteriormente.
Proceso de elaboración del ADC de la divulgación
Los anticuerpos de la divulgación pueden conjugarse con al menos un fármaco mediante enlazadores L-Z-X mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en los documentos US 7.811.572; US 7.368.565; US 2011/0003969; US 2011/0166319; US 2012/0253021 y US 2012/0259100. Para obtener más información relativa a los métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véase también Panowksi S et al. 2014 Jan 1; 6(1): 34-45 para una revisión sobre conjugados de anticuerpos y fármacos.
En una realización, un proceso para obtener el ADC de la divulgación comprende las siguientes etapas:
- cultivar una célula hospedadora en condiciones adecuadas para la expresión de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se ha definido anteriormente,
- aislar el anticuerpo,
- síntesis de la monometil auristatina E unida al enlazador L-Z-X de fórmula (V),
- conjugar dicho anticuerpo con monometil auristatina E unida al enlazador L-Z-X de fórmula (V).
Los anticuerpos se pueden obtener como se explicó anteriormente. Los anticuerpos contienen cuatro enlaces disulfuro intercatenarios que se pueden utilizar como posibles sitios de conjugación. Los cuatro enlaces disulfuro entre cadenas se pueden reducir, por ejemplo, por tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) o ditiotreitol (DTT), lo que da como resultado ocho grupos tiol que están disponibles para la conjugación.
El enlazador L se puede obtener como se divulga en el documento PCT/EP2014/064387. El enlazador X se puede obtener como se divulga en los documentos WO 03/026577 o WO 2004/010957. El enlazador Z también es bien conocido por los expertos en la materia que saben cómo obtenerlo.
Habiéndose descrito completamente la invención, ahora se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Comparación de la unión entre A24 e INA01-SDV1 en líneas celulares hematopoyéticas
Se realizaron diluciones en serie (5 a 0,05 pg/ml) de ambos anticuerpos biotinilados (anticuerpo A24 y anticuerpo contra ADC INA01-SDV1) y se incubaron en líneas celulares THP-1 y MEC-1. La unión de los anticuerpos diluidos se detectó mediante citometría de flujo utilizando estreptavidina Alexa F488 (disponible en ThermoFisher Scientific). Tanto A24 como INA01-SDV1 muestran una afinidad idéntica a las líneas celulares CD71 (Figuras 2A y 2B). Ejemplo 2: Apoptosis
Las células CHO se transfectaron con CD71 humano y los clones se seleccionaron mediante FACS. Se incubaron células CHO nativas (negativas para CD71 humano) y células hCD71 positivas con varias concentraciones de INA01-SDV n.° 1 durante 96 horas en medio completo a 37 °C. En el día 4, las células se incubaron con anexina V y Topro 3. Las células apoptóticas se determinaron mediante FACS como células anexina V/Topro 3 doblemente positivas. Los resultados se presentan en las Figuras 3A y 3B. Las barras representan el porcentaje de células apoptóticas.
Ejemplo 3: Eficacia in vitro de INA01-SDV n.° 1 en múltiples líneas celulares
La inhibición de la proliferación celular se midió utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo® de Promega según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en placas de 48 pocillos y se incubaron durante 96 horas en presencia o no de una concentración creciente de INA01-SDV1 (de 0 a 20 pg/ml).
Los resultados se presentan en las Figuras 4A y 4B. La viabilidad celular se vio afectada en las líneas celulares Ramos y THP-1.
Ejemplo 4: Eficacia in vivo de INA01-SDV1
Para evaluar la eficacia in vivo del INA01-SDV n.° 1, se inyectó por vía subcutánea a ratones desnudos 5 * 106 células THP-1. Cuando los tumores alcanzaron los 100 mm3, los ratones se inyectaron en un modo curativo con o 5 mg/kg, 0,5 mg/kg o PBS intraperitoneal. Los crecimientos tumorales se controlaron todos los días y los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 1000 mm.3.
Los datos de la Figura 5 representan la supervivencia de los ratones en días después de la inyección única de INA01-SDV n.° 1.
Ejemplo 5: Análisis toxicológico
El análisis toxicológico de INA01-SDV n.° 1 se evaluó en ratones B6 de tipo silvestre (WT) y ratones con doble inactivación para CD71/transferrina (TfR/Tf 2Ki). Se inyectaron IP ratones con 5 inyecciones de INA01-SDV n.° 1 a 3 mg/kg cada 4 días y se sacrificaron dos días después de la última inyección.
La Figura 6 representa el análisis macroscópico de órganos en ratones WT (Figura 6A) y TfR/Tf 2Ki (Figura 6B). La Tabla 7 a continuación representa el análisis patológico independiente de cada órgano representado en las Figuras 6A y 6B.
T l 7: An li i l i in n i n r n r r n n l Fi r A B
Figure imgf000024_0001
Ejemplo 6: Formulaciones
Se han comparado 4 formulaciones diferentes. Las formulaciones 1 y 2 solo se diferencian por su pH, así como las formulaciones 3 y 4. Las formulaciones contienen ADC, histidina 20 mM o citrato 20 mM, sacarosa al 6 % (6 g por 100 ml de tampón) y polisorbato 80 al 0,02 %.
La formulación 1 contiene un ADC de acuerdo con la divulgación, en particular INA01 e histidina, el pH de esta formulación es 5,5. La formulación 2 contiene un ADC de acuerdo con la divulgación, en particular INA01 e histidina, el pH de esta formulación es 6,5. La formulación 3 contiene un ADC de acuerdo con la divulgación, en particular INA01, y citrato, el pH de esta formulación es 5,5. La formulación 4 contiene un ADC de acuerdo con la divulgación, en particular INA01, y citrato, el pH de esta formulación es 6,5.
Los resultados se muestran en la Tabla 8, a continuación. Indican los valores de DAR (proporción entre anticuerpo y fármaco) para las formulaciones 1 a 4 a T=0 y T=2 semanas de conservación a 5 °C/40 °C y T=4 semanas de conservación a 5 °C/25 °C. A 40 °C, se mide una disminución general de los valores DAR, excepto con la formulación 2. Estos resultados muestran que la formulación 2 es estable, en comparación con las formulaciones 1, 3 y 4.
T l : m r i n 4 f rm l i n
Figure imgf000024_0002
Ejemplo 7: Determinación de la CI 50
La línea celular de leucemia mieloide aguda HL-60 (es decir, células que expresan CD71) se incubó a 37 °C con 10 concentraciones de INA01-SDV n.° 1 que variaban de 0,02 a 10 pg/ml. El efecto de ADC sobre la proliferación celular se muestra en la Figura 7. La curva ajustada se utilizó para calcular la CI50. Por tanto, la CI50 calculada de INA01-SDV n.° 1 es 0,08 pg/ml.
Ejemplo 8: Secreción de TNF-a
Para evaluar si INA01-SDV n.° 1 podría inducir un síndrome de liberación de citocinas (SCR) en pacientes, se analizó la secreción de TNF-a por células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La producción de TNF-a se probó después de la incubación de PBMC con INA01-SDV n.° 1 en tres condiciones diferentes que representan diferentes concentraciones del ADC: alto recubrimiento (secado al aire), bajo recubrimiento (recubrimiento húmedo) o en solución (acuoso).
Material y métodos
Las PBMC se separaron con Ficoll y se suspendieron en medio de cultivo con INA01-SDV n.° 1 secado al aire, recubrimiento húmedo o acuoso a 0,1, 1 o 10 pg/ml como se ha descrito anteriormente para varios procedimientos de

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco de fórmula (I): Ab-L-Z-X-D, en donde:
- Ab es un anticuerpo anti-TfR,
- L es una molécula enlazadora unida a dicho anticuerpo, siendo dicha molécula enlazadora de fórmula (II):
Figure imgf000042_0001
en donde n es un número entero comprendido entre 2 y 20,
- Z es un dipéptido de valina-citrulina unido a L,
- X es un grupo autoinmolante de éster de aminobencilo unido a Z,
- D es un fármaco unido a X.
2. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fármaco es un fármaco citotóxico, en particular, monometil auristatina E.
3. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde X es un grupo éster de para-aminobencilo unido covalentemente a Z, siendo dicho grupo X de la siguiente fórmula (III):
Figure imgf000042_0002
siendo J un sustituyente opcional elegido entre F, Cl, Br, NO2, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3, alquilo y haloalquilo, y siendo m un número entero de 0, 1, 2, 3 y 4,
siendo dicho grupo X preferentemente un éster de para-aminobencilo en donde m es 0.
4. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde L está unido covalentemente a uno o más restos tiol de dicho anticuerpo,
preferentemente, correspondiendo dicha L a una molécula enlazadora de fórmula (IV):
Figure imgf000042_0003
5. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho anticuerpo incluye anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos que contienen porciones de unión a antígeno.
6. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo se une específicamente al receptor de la transferrina de la SEQ ID NO:16, preferentemente con una KD de 10 nM o menos, por ejemplo, con una KD de 1 nM o menos.
7. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo humanizado.
8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde:
- dicho anticuerpo comprende una región constante de isotipo IgG4 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente no confiere o confiere una actividad reducida de ADCC a dicho anticuerpo cuando se compara con un anticuerpo correspondiente con la región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre, o
- dicho anticuerpo comprende una región constante de isotipo IgG1 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente confiere una mayor actividad de ADCC a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo correspondiente con región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre.
9. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho anticuerpo anti-TfR comprende o:
(a) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:5 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;
(b) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:8 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;
(c) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13;
(d) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;
(e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:15;
(f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13;
(g) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;
(h) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:15,
preferentemente dicho anticuerpo es mAb1 que comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO:18 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:17.
10. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde en dicha fórmula (I) Ab-L-Z-X-D:
- Ab es un anticuerpo mAb1 anti-TfR caracterizado por una cadena pesada representada por la SEQ ID NO:18 y una cadena ligera representada por la SEQ ID NO:17,
- L es una molécula enlazadora de fórmula (IV),
- Z es un dipéptido de valina-citrulina,
- X es un grupo autoinmolante de éster de para-aminobencilo de fórmula (III) en donde m es 0,
- D es MMAE.
11. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso como medicamento, y preferentemente para su uso en el tratamiento de un tumor, por ejemplo un tumor sólido o un tumor hematológico, y más concretamente un linfoma o leucemia.
12. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables, que comprende opcionalmente otros principios activos.
13. Una composición que comprende un conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, teniendo dicha composición un pH de 6,5 y comprendiendo además histidina y, opcionalmente, sacarosa y polisorbato 80.
14. Una formulación liofilizada, una jeringa precargada o un vial que comprende un conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
15. Un proceso para la obtención de un conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el método comprende:
- cultivar una célula hospedadora en condiciones adecuadas para la expresión de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se define en las reivindicaciones 1-10,
- aislar el anticuerpo,
- síntesis de la monometil auristatina E unida al enlazador L-Z-X de fórmula (V):
Figure imgf000044_0001
- conjugar dicho anticuerpo con monometil auristatina E unida al enlazador L-Z-X de fórmula (V).
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