TW201934584A - 糖胺聚糖衍生物及其製備方法和用途 - Google Patents

糖胺聚糖衍生物及其製備方法和用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及糖胺聚糖衍生物(特別地，糖胺聚糖羧基化衍生物)、其製備方法，及其用於抑制腫瘤生長和/或轉移的用途。

Description

糖胺聚糖衍生物及其製備方法和用途
發明領域
本發明涉及糖胺聚糖衍生物(特別地，糖胺聚糖羧基化衍生物)、其製備方法，及其用於抑制腫瘤生長和/或轉移的用途。
發明背景
乙醯肝素酶，又名類肝素酶，是一種β-葡萄糖醛酸內切酶，其能夠斷裂硫酸乙醯肝素蛋白聚糖中的硫酸乙醯肝素 (heparan sulfate, HS)，例如多配體聚糖-1 (syndecan-1)，從而釋放與硫酸乙醯肝素結合的生長因子。
乙醯肝素酶在大部分人腫瘤細胞中高表現，並顯著增加腫瘤細胞的血管生成和遷移能力。研究已經證實升高的乙醯肝素酶位準與許多腫瘤類型的晚期進展和轉移相關。例如，高位準的乙醯肝素酶與患者較短的手術後存活時間相關。在Vlodavsky和Sanderson的實驗室已證明乙醯肝素酶在腫瘤轉移中的直接作用。
除了酶促功能(包括釋放與HS結合的生長因子和降解細胞外基質(ECM))，乙醯肝素酶還具有非酶促功能，其可影響腫瘤行為及微環境。
肝素是糖胺聚糖家族中的一種線形多分散的硫酸化多糖，其具有抗凝血和抗血栓形成活性。肝素的糖鏈由交替的糖醛酸和D-葡糖胺組成，主要的重複單元是2-O-硫酸化L-艾杜糖醛酸(IdoA2S)α(1→4)和N-, 6-O-二硫酸化D-葡糖胺(GlcN6S)；較少組分是非硫酸化L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸，以及N-乙醯基D-葡糖胺和N-, 3-O-, 6-O-三硫酸化D-葡糖胺(Casu B., 2005. “Structure and active domains of heparin.” In: Chemistry and biology of heparin and heparan sulfate. Amsterdam: Elsevier. 1-28; Casu B.和Lindahl U., 2001, “Structure and biological interactions of heparin and heparan sulfate.” Adv Carbohydr Chem Biochem, 57: 159-206)。肝素可有效地抑制乙醯肝素酶，但是在乙醯肝素酶抑制策略中，由於其抗凝血活性，將肝素以高劑量使用是不可能的。
有趣的是，比肝素更可被生物利用且較低抗凝血活性的低分子量肝素(LMWH)似乎可能通過對腫瘤生長和轉移的直接作用延長癌症患者的存活期。這可能至少部分由於對乙醯肝素酶活性的抑制(Zacharski L.R.和Lee, A.Y. 2008. Heparin as an anticancer therapeutic. Expert Opin Investig Drugs 17:1029-1037)。
現有技術已經公開了一類可作為乙醯肝素酶抑制劑的非抗凝血肝素，其中大部分包含結構改造後的非硫酸化糖醛酸殘基，此類結構可通過斷裂糖胺聚糖殘基上的2位-3位碳-碳鍵 (二醇裂解) 而使糖苷環開環獲得。
CN105744940A中公開了糖胺聚糖的羧基化衍生物及其抗腫瘤的用途。
發明概要
本發明提供一種糖胺聚糖衍生物，其同時具有抗腫瘤生長和抗腫瘤轉移活性，特別是具有良好的抗腫瘤轉移活性。
本發明的第一方面提供糖胺聚糖衍生物，其包含式(I)的結構單元、式(IV)的結構單元和式(V)的結構單元：


式(I) 式(IV) 式(V)
其中：
R1m 、R1n 和R1x 在每次出現時各自獨立地選自H、-SO3 - ·(1/q Eq+ )和-(C=O)CH3 ，並且R1m 、R1n 和R1x 在每次出現時優選為-SO3 - ·(1/q Eq+ )或-(C=O)CH3 ；
R2m 、R2n 和R2x 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
R3n 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
R4m 、R4n 和R4x 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；
q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數；
所述糖胺聚糖衍生物的重均分子量為7000-14000 Da，優選為8000-13500 Da，例如8500-13000 Da、8500-12500 Da或9000-12500 Da；並且
所述糖胺聚糖衍生物的糖醛酸開環度為25%-80%，優選25-60%。
本發明的第二方面提供藥物組成物，其包含預防或治療有效量的本發明的糖胺聚糖衍生物以及一種或多種藥學上可接受的載體，所述藥物組成物優選為固體製劑、半固體製劑、液體製劑或氣態製劑。
本發明的第三方面提供本發明的糖胺聚糖衍生物或者本發明的藥物組成物在製備用於抑制腫瘤生長和/或轉移的藥物中的用途。
本發明的第四方面提供本發明的糖胺聚糖衍生物或者本發明的藥物組成物，其用於抑制腫瘤生長和/或轉移。
本發明的第五方面提供抑制腫瘤生長和/或轉移的方法，所述方法包括向需要其的個體給藥有效量的本發明的糖胺聚糖衍生物或者本發明的藥物組成物。
本發明的第六方面提供本發明的糖胺聚糖衍生物的製備方法。
較佳實施例之詳細說明
本文中的術語“硫酸化程度”是指磺羧比(SO3 - /COO- 莫耳比率)，其通過根據Casu B.和Gennaro U., 1975, Carbohydr Res 39, 168-176的電導滴定來測定。
本文中的術語“羧基增量”是指原料的硫酸化程度與羧基化衍生物的硫酸化程度的比率。更具體地，原料的硫酸化程度是將原料經第一個氧化步驟後獲得的糖胺聚糖中間體的樣品用NaBH4 還原後測定的硫酸化程度。
本文中的術語“糖醛酸開環度”是指開環的糖醛酸殘基數量/總的糖醛酸殘基數量，並且術語“糖醛酸環氧度”是指式(V)的具有環氧結構的糖醛酸結構單元占總糖醛酸殘基的比例。它們的檢測和計算參考文獻Guerrini, M., Guglieri, S., Naggi, A., Sasisekharan, R., & Torri, G. (2007). Low molecular weight heparins: Structural differentiation by bidimentional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 33, 478–487中的核磁方法進行。
糖胺聚糖衍生物
在一些實施方案中，本發明提供糖胺聚糖衍生物，其包含式(I)的結構單元、式(IV)的結構單元和式(V)的結構單元：

式(I) 式(IV) 式(V)
其中：
R1m 、R1n 和R1x 在每次出現時各自獨立地選自H、-SO3 - ·(1/q Eq+ )和-(C=O)CH3 ，並且R1m 、R1n 和R1x 在每次出現時優選為-SO3 - ·(1/q Eq+ )或-(C=O)CH3 ；
R2m 、R2n 和R2x 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
R3n 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
R4m 、R4n 和R4x 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；
q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數；
所述糖胺聚糖衍生物的重均分子量為7000-14000 Da，優選為8000-13500 Da，例如8500-13000 Da、8500-12500 Da或9000-12500 Da；並且
所述糖胺聚糖衍生物的糖醛酸開環度為25%-80%，優選25-60%。
在優選的實施方案中，本發明提供糖胺聚糖衍生物，其還包含式(II)的結構單元：

式(II)
其中：
R2t 和R3t 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且
q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
在優選的實施方案中，本發明提供糖胺聚糖衍生物，其還包含式(III)的結構單元：

式(III)
其中：
R2p 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且
q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
在優選的實施方案中，本發明提供糖胺聚糖衍生物，其還包含式(VI)的結構單元：

式(VI)
其中：
R2r 和R3r 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且
q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
在優選的實施方案中，本發明提供糖胺聚糖衍生物，其還包含式(VII)的結構單元：

式(VII)
其中：
R1s 在每次出現時各自獨立地選自H、-SO3 - ·(1/q Eq+ )和-(C=O)CH3 ，並且優選為-SO3 - ·(1/q Eq+ )或-(C=O)CH3 ；
R2s 、R3s 和R4s 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )；
E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且
q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含m個所述式(I)的結構單元，其中m選自1-30的任意整數，包括端值；優選選自1-20的任意整數，包括端值。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含t個所述式(II)的結構單元，其中t選自0-26的任意整數，包括端值；優選選自0-8的任意整數，包括端值；更優選選自1-8的任意整數，包括端值。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含p個所述式(III)的結構單元，其中p選自0-26的任意整數，包括端值；優選選自0-4的任意整數，包括端值；更優選選自1-4的任意整數，包括端值。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含n個所述式(IV)的結構單元，其中n選自1-24的任意整數，包括端值；優選選自1-18的任意整數，包括端值。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含x個所述式(V)的結構單元，其中x選自0-18的任意整數，包括端值；優選選自0-8的任意整數，包括端值；更優選選自1-8的任意整數，包括端值。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含r個所述式(VI)的結構單元，其中r選自0-26 (例如1-26)的任意整數，包括端值；優選選自0-4 (例如1-4)的任意整數，包括端值。
任選地，所述糖胺聚糖衍生物的一條或多條多糖鏈可以各自包含s個所述式(VII)的結構單元，其中s選自1-26的任意整數，包括端值；優選選自1-8的任意整數，包括端值。
在本發明的糖胺聚糖衍生物的每條多糖鏈中，各結構單元以任意順序排列。
在優選的實施方案中，Eq+ 為H+ 、Li+ 、Na+ 、K+ 、Mg2+ 、Ca2+ 或Al3+ 。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物中的式(I)的結構單元的個數大於式(II)和式(III)的結構單元的個數的總和。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物中的式(I)的結構單元的個數與式(I)、式(II)和式(III)的結構單元的個數的總和的比值大於0.9。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物中的式(I)的結構單元的個數與式(I)和式(IV)的結構單元的個數的總和的比值為0.3-0.7。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物中的式(V)的結構單元的個數與式(I)、式(IV)和式(V)的結構單元的個數的總和的比值小於0.1。
在優選的實施方案中，糖醛酸環氧度小於25%。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量分佈如下：
。優選地，所述糖胺聚糖衍生物的分子量分佈如下：
或
。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物的磺羧比為0.80-1.65。優選地，所述糖胺聚糖衍生物的磺羧比為1.0-1.4。
本發明涵蓋各個實施方案的任意組合。
在一些實施方案中，本發明提供製備所述糖胺聚糖衍生物的方法，其包括以下步驟：
a) 任選地，將糖胺聚糖的糖醛酸殘基的C2、C3環氧化，其優選在鹼性水溶液(優選氫氧化鈉水溶液)中進行；
b) 任選地，將步驟a)所得環氧化產物水解開環，其優選在中性條件下進行；
c) 在將相鄰的二醇並任選地將相鄰的OH/NH2 有效轉化為二醛的條件下，將糖胺聚糖的10%-100% (優選25%-100%)的2-O-並任選地將2N-, 3-O-非硫酸化殘基氧化，所述氧化優選通過高碘酸鹽(優選高碘酸鈉)進行；以及
d) 在將所述二醛有效轉化為羧基的條件下，且在無氮氣保護下，將得自步驟c)的產物進一步氧化，所述進一步氧化優選通過亞氯酸鹽(優選亞氯酸鈉)進行。
在優選的實施方案中，所述方法還包括葡糖胺殘基的2N-脫硫酸化步驟，該步驟在步驟a)之前，步驟a)之後或者步驟b)之後進行，所述脫硫酸化步驟包括與吡啶成鹽，然後在DMSO與水或甲醇的混合溶劑中攪拌。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖為來自任意動物和器官來源的天然肝素或者合成肝素(其任選地被化學或酶促修飾)，優選選自任選地2-O-和/或2-N-脫硫酸化的肝素、未分級肝素、低分子量肝素(LMWH，其分子量為3,500-8,000 Da)和硫酸類肝素(HS)，其具有0.8-2.8，優選0.9-2.5的磺羧比；更優選選自任選地2-O-和/或2-N-脫硫酸化的未分級肝素和LMWH。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖的重均分子量為10000 Da至30000 Da，優選為15000 Da至25000 Da，例如15000 Da至20000 Da、15000 Da至19000 Da或17000 Da至19000 Da。
作為一個實例，肝素鏈可天然地包含約5%至35%的2-O-非硫酸化糖醛酸殘基、0%至50%的N-乙醯化葡糖胺殘基和約0%-6%的N-未取代的(既未N-硫酸化也未N-乙醯化)葡糖胺殘基。不同的硫酸化程度取決於肝素來源(動物種類、器官來源)以及提取操作。
糖胺聚糖的每個2-O-或2N-非硫酸化殘基(不具有3-O-硫酸根取代基)易於進行開環(裂解)下的氧化以及鄰位的二醇和OH/NH2 向醛的轉化。任選地，起始糖胺聚糖的分級2-O-脫硫酸化允許調節葡糖胺/糖醛酸裂解殘基的比率。
在優選的實施方案中，所述糖胺聚糖衍生物表現出1.3-2.0的羧基增量，其中所述羧基增量以原料的硫酸化程度與糖胺聚糖衍生物的硫酸化程度的比率的形式計算。更具體地，所述原料的硫酸化程度是將原料經第一個氧化步驟(步驟c))後獲得的糖胺聚糖中間體的樣品用NaBH4 還原後測定的硫酸化程度。用於計算羧基增量的具體操作可參見CN105744940A。
藥物組成物和治療方法
在一些實施方案中，本發明提供藥物組成物，其包含預防或治療有效量的本發明的糖胺聚糖衍生物以及一種或多種藥學上可接受的載體，所述藥物組成物優選為固體製劑、半固體製劑、液體製劑或氣態製劑。在一些實施方案中，所述藥物組成物還可包含一種或多種其它治療劑。
在一些實施方案中，本發明提供本發明的糖胺聚糖衍生物或者本發明的藥物組成物在製備用於抑制腫瘤生長和/或轉移的藥物中的用途。
在一些實施方案中，本發明提供本發明的糖胺聚糖衍生物或者本發明的藥物組成物，其用於抑制腫瘤生長和/或轉移。
在一些實施方案中，本發明提供抑制腫瘤生長和/或轉移的方法，所述方法包括向需要其的個體給藥有效量的本發明的糖胺聚糖衍生物或者本發明的藥物組成物。
在一些實施方案中，所述腫瘤為實體瘤、血液腫瘤或軟組織腫瘤；優選為實體瘤，例如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、結腸癌、胃癌或肺癌。
本發明中“藥學上可接受的載體”是指與治療劑一同給藥的稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物，並且其在合理的醫學判斷的範圍內適於接觸人類和/或其它動物的組織而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或與合理的益處/風險比相應的其它問題或併發症。
在本發明的藥物組成物中可使用的藥學上可接受的載體包括但不限於無菌液體，例如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當所述藥物組成物通過靜脈內給藥時，水是示例性載體。還可以使用生理鹽水和葡萄糖及甘油水溶液作為液體載體，特別是用於注射液。適合的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述組成物還可以視需要包含少量的濕潤劑、乳化劑或pH緩衝劑。口服製劑可以包含標準載體，如藥物級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合的藥學上可接受的載體的實例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990)中所述。
本發明的藥物組成物可以系統地作用和/或局部地作用。為此目的，它們可以適合的途徑給藥，例如通過注射(如靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、肌內注射，包括滴注)或經皮給藥；或通過口服、含服、經鼻、透黏膜、局部、以眼用製劑的形式或通過吸入給藥。
對於這些給藥途徑，可以適合的劑型給藥本發明的藥物組成物。
所述劑型包括但不限於片劑、膠囊劑、錠劑、硬糖劑、散劑、噴霧劑、乳膏劑、軟膏劑、栓劑、凝膠劑、糊劑、洗劑、軟膏劑、水性混懸劑、可注射溶液劑、酏劑、糖漿劑。
如本文中所使用的術語“有效量”指被給藥後會在一定程度上緩解所治療病症的一或多種症狀的衍生物的量。
可調整給藥方案以提供最佳所需回應。例如，可給藥單次推注，可隨時間給藥數個分劑量，或可如治療情況的急需所表明而按比例減少或增加劑量。要注意，劑量值可隨要減輕的病況的類型及嚴重性而變化，且可包括單次或多次劑量。要進一步理解，對於任何特定個體，具體的給藥方案應根據個體需要及給藥組成物或監督組成物的給藥的人員的專業判斷來隨時間調整。
所給藥的本發明的糖胺聚糖衍生物的量會取決於所治療的個體、病症或病況的嚴重性、給藥的速率、糖胺聚糖衍生物的處置及處方醫師的判斷。一般而言，有效劑量在每日每kg體重約0.0001 mg至約50 mg，例如約0.01 mg/kg/日至約10 mg/kg/日(單次或分次給藥)。對70 kg的人而言，這會合計為約0.007 mg/日至約3500 mg/日，例如約0.7 mg/日至約700 mg/日。在一些情況下，不高於前述範圍的下限的劑量位準可以是足夠的，而在其它情況下，仍可在不引起任何有害副作用的情況下採用較大劑量，條件是首先將所述較大劑量分成數個較小劑量以在一整天中給藥。
本發明的糖胺聚糖衍生物在藥物組成物中的含量或用量可以是約0.01 mg至約1000 mg，適合地是0.1-500 mg，優選0.5-300 mg，更優選1-150 mg，特別優選1-50 mg，例如1.5 mg、2 mg、4 mg、10 mg、25 mg等。
除非另外說明，否則如本文中所使用，術語“治療”意指逆轉、減輕、抑制這樣的術語所應用的病症或病況或者這樣的病症或病況的一或多種症狀的進展，或預防這樣的病症或病況或者這樣的病症或病況的一或多種症狀。
如本文所使用的“個體”包括人或非人動物。示例性人個體包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人個體(稱為患者)或正常個體。本發明中“非人動物”包括所有脊椎動物，例如非哺乳動物(例如鳥類、兩棲動物、爬行動物)和哺乳動物，例如非人靈長類、家畜和/或馴化動物(例如綿羊、犬、貓、奶牛、豬等)。
在一些實施方案中，本發明的藥物組成物還可以包含一種或多種另外的治療劑或預防劑。
實施例
以下列舉實施例和實驗例，進而詳細地說明本發明，但它們不限制本發明的範圍，另外在不脫離本發明的範圍下可進行變化。
實施例1
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素5 g (Mw = 18306 Da)，溶於62.5 g的1 mol/L NaOH溶液中，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解36h，反應結束後降至室溫。
3) 高碘酸鈉氧化：在低溫條件下向第2)步反應液加入100 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇10.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，透析24h (除鹽)，得到透析液。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入100 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，用30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H0242。收率88.45%，Mw = 7001 Da，SO3 - /COO- = 0.85，羧基增量1.88，糖醛酸開環度73.1%。
實施例2
1) 高碘酸鈉氧化：稱取未分級肝素5 g (Mw = 17000 Da)於250 g水中，攪拌溶解。低溫條件下加入100 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇10.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應。透析24h，得到透析液。
2) 亞氯酸鈉氧化：取第1)步得到的透析液在低溫條件下加入100 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h後，用30% (m/v) NaOH溶液調至中性，反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H0232。收率79.23%，Mw = 12810 Da，SO3 - /COO- = 1.55，羧基增量1.22，糖醛酸開環度為26.3%。
實施例3
1) C2、C3環氧化：稱取50 g未分級肝素(Mw = 17000 Da)，加入625.0 g的1 mol/L NaOH溶液，反應液升溫至60℃附近，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解24h，反應結束後降至室溫，取溶液樣品檢測分子量；透析除鹽，旋蒸凍乾得中間產品，乾品重50g，收率100%，Mw = 16034 Da。
3) 高碘酸鈉氧化：取第2)步得到的中間產品5 g，溶於100 g水中。在低溫條件下，加入233 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌8h。反應結束後，加入乙二醇20.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，透析24h (除鹽)，得到透析液。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入100 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，用30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H1011。收率89.90%，Mw = 9161 Da，SO3 - /COO- = 1.17，羧基增量1.68，糖醛酸開環度為43.1%。
實施例4
1) 與實施例3步驟1)相同。
2) 與實施例3步驟2)相同。
3) 高碘酸鈉氧化：取第2)步得到的中間產品5 g，溶於100 g水中。在低溫條件下，加入116 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇20.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，透析24h (除鹽)，得到透析液。
4) 同實施例3中第4)步，得到的樣品H1015，收率89.69%，Mw = 8717 Da，SO3 - /COO- = 1.08，羧基增量1.81，糖醛酸開環度為45.5%。
實施例5
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素8 g (Mw = 18150 Da)，加入1 mol/L NaOH溶液(約102.4 mL)，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性，向反應液加入酒精進行醇沉，將沉澱溶解並凍乾。
2) 水解開環：稱取第1)步凍乾產品6.4 g，加入96 mL純化水，溶液升溫至70℃，中性條件下水解24h，反應結束後降至室溫，濃縮、凍乾，得到環氧結構開環產物。
3) 高碘酸鈉氧化：向第2)步環氧結構開環產物6.14 g加入177 mL純化水溶解，在低溫條件下加入等體積的0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇17.7 mL，繼續攪拌1h，終止反應。向反應液加入酒精進行醇沉(除鹽)，將醇沉後所得上清液離心，合併沉澱，用少量水溶解，凍乾，獲得鄰二醛中間體。
4) 亞氯酸鈉氧化：向鄰二醛中間體(6 g)加入579 mL純化水，反應液降溫，加入6.03% (m/v) NaClO2 溶液120 mL，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，用1 mol/L NaOH溶液調至中性，分批加入亞硫酸氫鈉固體中和亞氯酸鈉。向反應液加入酒精進行醇沉，沉澱溶解後用截留分子量3500 Da的再生纖維素透析袋透析，透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H7103，Mw = 11790 Da，SO3 - /COO- = 1.26，羧基增量1.75，糖醛酸開環度41.2%。
實施例6
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素(Mw = 17675 Da) 10 g，溶於125 g的1 mol/L NaOH溶液中，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解24h，反應結束後降至室溫。
3) 高碘酸鈉氧化：在低溫條件下向第2)步反應液加入200 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇20.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，透析24h (除鹽)，得到透析液。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入200 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H8261，Mw = 10222 Da，SO3 - /COO- = 1.05，糖醛酸開環度57.6%。
實施例7
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素10 g (Mw = 17806 Da)，溶於125 g的1 mol/L NaOH溶液中，反應液升溫至60℃，反應60 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解24h，反應結束後降至室溫。
3) 高碘酸鈉氧化：在低溫條件下向第2)步反應液加入200 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇20.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，將反應液透析24h。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入200 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H9053，Mw = 7112 Da，SO3 - /COO- = 1.13，糖醛酸開環度46.1%。
實施例8
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素10 g (Mw = 18306 Da)，溶於125 g的1 mol/L NaOH溶液中，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性，溶液透析16h。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解4h，反應結束後降至室溫。
3) 高碘酸鈉氧化：在低溫條件下向第2)步反應液加入200 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇20.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，向反應液加入酒精進行醇沉(除鹽)，將醇沉後所得上清液離心，合併沉澱，用少量水溶解。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入200 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H8073，Mw = 11781 Da，SO3 - /COO- = 1.38，羧基增量為1.41，糖醛酸開環度28.5%。
實施例9
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素5 g (Mw = 17000 Da)，溶於62.5 g的1 mol/L NaOH溶液中，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解24h，反應結束後降至室溫。
3) 高碘酸鈉氧化：在低溫條件下向第2)步反應液加入100 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇10.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，將反應液透析。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入100 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H9252，Mw = 8587 Da，SO3 - /COO- = 1.10，羧基增量為1.76，糖醛酸開環度46.6%。
實施例10
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素5 g (Mw = 18306 Da)，溶於62.5 g的1 mol/L NaOH溶液中，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性。
2) 水解開環：將第1)步溶液升溫至70℃，中性條件下水解24h，反應結束後降至室溫。
3) 高碘酸鈉氧化：在低溫條件下向第2)步反應液加入100 g 0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇10.0 mL，繼續攪拌1h，終止反應，將反應液透析。
4) 亞氯酸鈉氧化：在低溫條件下向第3)步得到的反應液加入100 g的6.03% (m/v) NaClO2 溶液，用冰乙酸調pH至4.0左右，室溫繼續攪拌反應24h，30% (m/v) NaOH溶液調至中性。反應液透析24h，將透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H0123，Mw = 11445 Da，SO3 - /COO- = 1.21，羧基增量為1.64，糖醛酸開環度33.2%。
實施例11
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素4 g (Mw=18839 Da)，加入1 mol/L NaOH溶液(約51.2 mL)，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性，將反應液透析72h，濃縮、凍乾。
2) 水解開環：稱取第1)步凍乾產品3 g，加入45 mL純化水，溶液升溫至70℃，中性條件下水解48h，反應結束後降至室溫，濃縮、凍乾，得到環氧結構開環產物。
3) 高碘酸鈉氧化：向第2)步環氧結構開環產物(2 g)加入57.7 mL純化水溶解，在低溫條件下加入等體積的0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇5.77 mL，繼續攪拌1h，終止反應。反應液在4℃下透析16h，濃縮，凍乾，獲得鄰二醛中間體。
4) 亞氯酸鈉氧化：向鄰二醛中間體(1 g)加入100 mL純化水，反應液降溫至0℃，加入6.03% (m/v) NaClO2 溶液20.6 mL，用冰乙酸調pH至4.0，室溫繼續攪拌反應24h，用0.5 mol/L NaOH溶液調至中性。反應液用截留分子量3500 Da的再生纖維素透析袋透析16h，透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H1301，Mw = 7064 Da，SO3 - /COO- = 1.06，羧基增量1.75，糖醛酸開環度28.9%。
對比例(由於CN105744940A中未說明起始原料的重均分子量，本領域技術人員無法獲得其產品以用於對比。該對比例為重複CN105744940A中實施例1、實施例4和實施例8的操作所得產品，其表徵參數與CN105744940A中實施例8的產品略有差異)
1) C2、C3環氧化：稱取未分級肝素4 g (Mw = 18839 Da)，加入1 mol/L NaOH溶液(約51.2 mL)，反應液升溫至60℃，反應30 min；反應結束後，在室溫下冷卻，用1:1 HCl溶液(將市售36%-38%濃鹽酸與純化水按1:1的體積比配製)調至中性，將反應液透析72h，濃縮、凍乾。
2) 水解開環：稱取第1)步凍乾產品3.0 g，加入45 mL純化水，溶液升溫至70℃，中性條件下水解48 h，反應結束後降至室溫，濃縮、凍乾，得到環氧結構開環產物。
3) 高碘酸鈉氧化：向第2)步環氧結構開環產物(2 g)加入57.7 mL純化水溶解，在低溫條件下加入等體積的0.2 mol/L NaIO4 溶液，避光，控溫4℃，攪拌16h。反應結束後，加入乙二醇5.77 mL，繼續攪拌1h，終止反應。反應液在4℃下透析16h，濃縮，凍乾，獲得鄰二醛中間體。
4) 亞氯酸鈉氧化：向鄰二醛中間體(1 g)加入100 mL純化水，反應液降溫至0℃並在N2 環境中攪拌條件下加入6.03% (m/v) NaClO2 溶液20.6 mL，用冰乙酸調pH至4.0，室溫繼續攪拌反應24h，在室溫下通過流動的N2 攪拌另外3小時後，用0.5 mol/L NaOH溶液調至中性。反應液用截留分子量3500 Da的再生纖維素透析袋透析16h，透析液旋蒸濃縮後凍乾獲得樣品H1302，Mw = 6499 Da，SO3 - /COO- = 1.24，羧基增量1.34，糖醛酸開環度22.6%。
上述實施例與對比例所得產品的理化性質數據匯總如表1所示。

表1
N/A表示未檢測。
所製備獲得的產品的分子量分佈數據如表2所示。
表2
通過比較產品H1301和H1302可見，本申請的產品與通過CN105744940A中的工藝獲得的產品顯著不同(特別是在重均分子量和糖醛酸開環度上有顯著差異)。
生物學實驗
以下分別從體外乙醯肝素酶抑制、抗癌細胞生長、抗癌細胞轉移以及急性毒性的角度對所製備的產品進行檢測。
實驗例1：體外乙醯肝素酶抑制檢測
參照CN105744940A中體外檢測乙醯肝素酶(類肝素酶)抑制活性的方法，檢測本申請中所製備產品的體外乙醯肝素酶抑制活性。結果如下表中所示。


實驗例2：抗MM.1S細胞生長實驗
MM.1S細胞體外懸浮培養，培養條件為RPMI 1640培養基中加10%熱滅活胎牛血清，37℃ 5% CO2 培養。一週三次繼代處理。當細胞處於指數生長期時，收取細胞，計數，將含3×104 個腫瘤細胞的100 μL細胞懸液(細胞懸於RPMI 1640培養基中加10%熱滅活胎牛血清，細胞活力大於95%)接種到96孔板中。細胞培養過夜後，向6個孔中分別加入用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI 1640培養基配製的樣品，使樣品終濃度為100 μg/mL，向另外6個孔中分別加入等體積的含10%熱滅活胎牛血清的RPMI 1640培養基(用於測定0 μg/mL下的細胞吸光度值)，此外還設置六個除不加細胞和樣品外其餘均相同的培養基孔(完全培養基孔)，37℃ 5% CO2 培養48小時後向所有孔中加入20 μL CCK8試劑，37℃ 5% CO2 下培育1-2個小時，在酶標儀下檢測450 nm下的吸光度值，以完全培養基孔的吸光度值為背景，0μg/mL下的細胞吸光度值為100%，計算樣品對細胞生長的影響。
抑制率 = (0 μg/mL下的細胞吸光度值-樣品孔吸光值)/(0 μg/mL下的細胞吸光度值-完全培養基孔吸光值) (以上各值為相應6個孔的平均值)
實驗結果如下表中所示。

結果顯示：本發明的糖胺聚糖的羧基化衍生物能夠顯著地抑制MM.1S細胞的生長，且抑制活性與對比產品H1302相近。
實驗例3：細胞遷移實驗：Transwell實驗(Hela細胞)
實驗方法參考文獻Dai X Y, Yan J, Fu X等人, Aspirin inhibits cancer metastasis and angiogenesis via targeting heparanase. [J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2017, 23(20):6267進行。
Hela細胞體外貼壁培養，培養條件為DMEM培養基中加10%熱滅活胎牛血清，37℃ 5% CO2 培養。一週三次繼代處理。當細胞處於指數生長期時，收取細胞，計數，將含2*104 個腫瘤細胞的100 μL細胞懸液(細胞懸於無胎牛血清的DMEM培養基中，細胞活力大於95%)接種到Transwell小室中，在小室外加入600 μL含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養基。小室內外的培養基中均溶有測試樣品，使其終濃度為100 μg/mL，每個樣品設置3個重複小室，另設3個不加藥物的小室為對照，37℃ 5% CO2 培養24小時後，用預冷的95%乙醇固定30 min，然後用棉花棒輕輕擦拭小室內表面並用PBS洗去未附著的細胞，用1%結晶紫溶液染色，晾乾後拍照對比遷移的細胞數量。
遷移抑制率 = (對照孔遷移細胞的平均值-樣品處理下遷移細胞的平均值)/對照孔遷移細胞的平均值
實驗結果如下表所示。


結果顯示：本申請的糖胺聚糖的羧基化衍生物能夠顯著地抑制Hela細胞的遷移，在會發生惡性轉移的腫瘤治療中極具潛力。而對照樣品H1302抑制Hela細胞遷移的活性較弱。
實驗例4：原位4T1乳腺癌肺轉移動物實驗
4T1細胞體外懸浮培養，培養條件為RPMI 1640培養基中加10%熱滅活胎牛血清，37℃ 5% CO2 培養。一週三次繼代處理。當細胞處於指數生長期時，收取細胞，計數，將含1*105 個腫瘤細胞的50 μL細胞懸液(細胞懸於無胎牛血清的RPMI 1640培養液中)皮下接種於腹部第四脂肪墊，所用小鼠為BALB/c小鼠，雌性，6-8周齡，體重18-22克。根據體重和腫瘤接種順序隨機分組，每組12只小鼠。測試樣品組接種第二天開始給藥。每天兩次腹腔給藥，共20 mg/kg劑量。陰性對照組給予等量生理鹽水。接種腫瘤12天時手術切除原位腫瘤，當天不給藥，術後第二天繼續按照上述方式給藥。
小鼠生存期：每只小鼠達到實驗終點(體重降低大於20%)實施安樂死並記錄生存期，繪製Kaplan-Meier生存曲線。
實驗結果如下表及附圖1中所示。

結果顯示，本申請的衍生物H7103、H1301和H0123均能夠顯著地延長模型小鼠的中位生存期，尤其是H7103和H0123能夠將模型小鼠的中位生存期分別延長34.2%和68%，對比樣品H1302能夠微弱地延長模型小鼠的中位生存期，但是與陰性對照組相比差異並不顯著。
實驗例5：B16鼠黑色素瘤肺轉移實驗
鼠黑色素瘤B16細胞體外貼壁培養，培養條件為RPMI 1640培養基中加10%熱滅活胎牛血清，37℃ 5% CO2 培養。一週三次繼代處理。當細胞處於指數生長期時，收取細胞，計數，用PBS配製成含2.5*106 個細胞/mL的懸液。取體重18-20 g的SPF級健康C57/BL6小鼠，按每組8只小鼠進行分組，分為陰性對照組、模型組和實驗組。分別向實驗組小鼠尾靜脈按2.5 mg/kg小鼠體重注射測試樣品(溶解在生理鹽水中，濃度為0.25 mg/mL)，向陰性對照組和模型組小鼠尾靜脈按10 μL/g小鼠體重注射生理鹽水。依次記錄下注射時間，30分鐘後，將含5*105 個腫瘤細胞的200 μL細胞懸液(細胞懸於PBS，細胞活力大於90%)注射到模型組和實驗組小鼠尾靜脈中，陰性對照組尾靜脈注射等量生理鹽水。每日監控動物並記錄體重，細胞注射後第12-14天的同一時間點處死所有小鼠，取肺組織並固定在Bouin溶液中，在體視顯微鏡下對肺表面的腫瘤轉移節計數。
測試樣品對B16轉移的抑制率=(模型組肺轉移節中位數-實驗組肺轉移節中位數)/模型組肺轉移節中位數*100%
實驗結果如下表中所示。


結果顯示，本申請的衍生物均有顯著的抗腫瘤轉移能力。
除本文中描述的那些外，根據前述描述，本發明的多種修改對本領域技術人員而言會是顯而易見的，這樣的修改也意圖落入所附申請專利範圍的範圍內。本申請中所引用的各參考文獻(包括所有專利、專利申請、期刊文章、書籍及任何其它公開)均以其整體援引加入本文。
圖1顯示給予測試樣品後小鼠的生存率。

Claims (15)

  1. 一種糖胺聚糖衍生物，其包含式(I)的結構單元、式(IV)的結構單元和式(V)的結構單元： 式(I) 式(IV) 式(V)； 其中： R1m 、R1n 和R1x 在每次出現時各自獨立地選自H、-SO3 - ·(1/q Eq+ )和-(C=O)CH3 ，並且R1m 、R1n 和R1x 在每次出現時優選為-SO3 - ·(1/q Eq+ )或-(C=O)CH3 ； R2m 、R2n 和R2x 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； R3n 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； R4m 、R4n 和R4x 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁； q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數； 所述糖胺聚糖衍生物的重均分子量為7000-14000 Da，優選為8000-13500 Da，例如8500-13000 Da、8500-12500 Da或9000-12500 Da；並且’ 所述糖胺聚糖衍生物的糖醛酸開環度為25%-80%，優選25-60%。
  2. 如請求項1的糖胺聚糖衍生物，其還包含式(II)的結構單元： 式(II) 其中： R2t 和R3t 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且 q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
  3. 如請求項1或2的糖胺聚糖衍生物，其還包含式(III)的結構單元： 式(III) 其中： R2p 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且 q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
  4. 如請求項1-3中任一項的糖胺聚糖衍生物，其還包含式(VI)的結構單元：： 式(VI) 其中： R2r 和R3r 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且 q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
  5. 如請求項1-4中任一項的糖胺聚糖衍生物，其還包含式(VII)的結構單元： 式(VII) 其中： R1s 在每次出現時各自獨立地選自H、-SO3 - ·(1/q Eq+ )和-(C=O)CH3 ，並且優選為-SO3 - ·(1/q Eq+ )或-(C=O)CH3 ； R2s 、R3s 和R4s 在每次出現時各自獨立地選自H和-SO3 - ·(1/q Eq+ )； E在每次出現時各自獨立地選自H、鹼金屬(優選鋰、鈉、鉀、銣或銫)、鹼土金屬(優選鎂或鈣)和鋁；並且 q在每次出現時各自獨立地為1、2或3的整數。
  6. 如請求項1-5中任一項的糖胺聚糖衍生物，其中糖醛酸環氧度小於25%。
  7. 如請求項1-6中任一項的糖胺聚糖衍生物，其中所述糖胺聚糖衍生物的分子量分佈如下： 優選地，所述糖胺聚糖衍生物的分子量分佈如下： 或 。
  8. 如請求項1-7中任一項的糖胺聚糖衍生物，其中所述糖胺聚糖衍生物的磺羧比為0.80-1.65，優選1.0-1.4。
  9. 一種藥物組成物，其包含預防或治療有效量的如請求項1-8中任一項的糖胺聚糖衍生物以及藥學上可接受的載體，所述藥物組成物優選為固體製劑、半固體製劑、液體製劑或氣態製劑。
  10. 如請求項1-8中任一項的糖胺聚糖衍生物在製備用於抑制腫瘤生長和/或轉移的藥物中的用途。
  11. 如請求項10的用途，其中所述腫瘤為實體瘤、血液腫瘤或軟組織腫瘤；並且優選為實體瘤，例如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、結腸癌、胃癌或肺癌。
  12. 一種製備如請求項1-8中任一項的糖胺聚糖衍生物的方法，其包括以下步驟： a) 任選地，將糖胺聚糖的糖醛酸殘基的C2、C3環氧化，其優選在鹼性水溶液(優選氫氧化鈉水溶液)中進行； b) 任選地，將步驟a)所得環氧化產物水解開環，其優選在中性條件下進行； c) 在將相鄰的二醇並任選地將相鄰的OH/NH2 有效轉化為二醛的條件下，將糖胺聚糖的10%-100% (優選25%-100%)的2-O-並任選地將2N-, 3-O-非硫酸化殘基氧化，所述氧化優選通過高碘酸鹽(優選高碘酸鈉)進行；以及 d) 在將所述二醛有效轉化為羧基的條件下，且在無氮氣保護下，將得自步驟c)的產物進一步氧化，所述進一步氧化優選通過亞氯酸鹽(優選亞氯酸鈉)進行； 優選地，所述方法還包括葡糖胺殘基的2N-脫硫酸化步驟，該步驟在步驟a)之前，步驟a)之後或者步驟b)之後進行，所述脫硫酸化步驟包括與吡啶成鹽，然後在DMSO與水或甲醇的混合溶劑中攪拌。
  13. 如請求項12的方法，其中所述糖胺聚糖為來自任意動物和器官來源的天然肝素或者合成肝素(其任選地被化學或酶促修飾)，優選選自任選地2-O-和/或2-N-脫硫酸化的肝素、未分級肝素、低分子量肝素(LMWH)和硫酸類肝素，其具有0.8-2.8，優選0.9-2.5的磺羧比；更優選選自任選地2-O-和/或2-N-脫硫酸化的未分級肝素和LMWH。
  14. 如請求項12或13的方法，其中所述糖胺聚糖的重均分子量為10000 Da至30000 Da，優選為15000 Da至25000 Da，例如15000 Da至20000 Da、15000 Da至19000 Da或17000 Da至19000 Da。
  15. 如請求項12-14中任一項的方法，其中所述糖胺聚糖衍生物表現出1.3-2.0的羧基增量。
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