TW201739914A - ω－官能化羧酸及其酯類之生技製造 - Google Patents

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Abstract

提供了一種用於從至少一種烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯的微生物細胞，其中將該細胞遺傳修飾以提高以下相對於野生型細胞的表現(i)能夠將烷轉化為相應之1-烷醇的酶E1；(ii)能夠將(i)的1-烷醇轉化為相應之1-烷醛的酶E2；(iii)能夠將(ii)的1-烷醛轉化為相應之烷酸的酶E3；(iv)能夠將(iii)的烷酸轉化為相應之烷酸酯的酶E4；和(v)能夠將(iv)的烷酸酯轉化為相應之ω-羥基-烷酸酯的酶E5，且其中，該細胞不包含提高選自由下列所組成之群組的酶E20-E24中至少一者相對於野生型細胞的表現之遺傳修飾：- EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22之E20醯基-ACP硫酯酶，- EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22之E21醯基-輔酶A硫酯酶，- E22醯基-輔酶A：ACP轉醯酶，- E23聚酮合成酶，和- E24己酸合成酶。

Description

ω-官能化羧酸及其酯類之生技製造
本發明關於一種生產ω-官能化羧酸酯類的生物技術方法。具體地，該方法可使用烷作為起始材料及使用遺傳修飾細胞以將該烷轉化為相應之ω-官能化羧酸酯。
包括ω-胺基羧酸之ω-官能化羧酸和相應之酯類及它們相應之內醯胺，諸如ω-胺基月桂酸、ω-胺基十一酸、月桂內醯胺等，是用於生產高性能聚醯胺類的重要單體。一些已被用於從石化或可再生原料生產這些單體的現有化學技術包括：
i)自月桂酸甲酯(自棕櫚仁或椰子油所製備的生物柴油餾分)生產ω-胺基月桂酸
ii)自蓖麻油酸(自蓖麻油所製備)生產ω-胺基十一酸
iii)自丁二烯生產月桂內醯胺。
雖然這三種生產方法都維持競爭力，但它們在特定地點和時間點的競爭力取決於許多因素，包括用來執行該些 方法的原料成本和能源成本。
有幾種生產本領域已知的ω-官能化羧酸和/或其酯類的生物技術手段。例如，至少在WO2009077461和EP2322598中已描述了能夠從用作基質的羧酸生產ω-官能化羧酸的遺傳修飾細胞。WO2011008232中描述了非常相似的程序，其使用β-氧化途徑在細胞中被阻斷，且從作基質的脂肪酸形成ω-官能化羧酸的念珠菌屬(Candida)細胞。這些方法的缺點是使用脂肪酸作為起始材料。這是因為，所使用的脂肪酸及其衍生物主要僅來自植物及動物油或脂肪。作為原料的動物脂肪仍然符合少數客戶的接受度，且含有短鏈和中長鏈脂肪酸的植物油難以獲得或僅在熱帶地區產生(雨林破壞的結果)。此外，特定的植物和動物油或脂肪原料具有特定但確定之造成偶合生成的脂肪酸分佈範圍(profiles)。
WO2013024114揭示從簡單的碳源(如，葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉、纖維素和半纖維素，還可以是甘油或非常簡單的有機分子如CO2、CO或合成氣體)生產ω-官能化羧酸和/或其酯類的方法。這些簡單的糖，特別是葡萄糖的取得通常比較昂貴。從簡單的碳源生產ω-官能化羧酸和/或其酯類的方法也可被認為是複雜的，因為該方法中使用的細胞必須進行遺傳修飾以首先從這些簡單的碳源中提高羧酸的生產。此因而提高了生產成本。
因此，在本領域中需要從另一個原料來源生產ω-官能 化羧酸酯類的方法，以使生產能夠有效率及有效。
本發明試圖藉由提供至少一種能從至少一種烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯之遺傳修飾微生物細胞來解決上述問題。該ω-官能化羧酸酯可選自由以下所組成之群組：ω-羥基、ω-氧代、ω-羧基及ω-胺基羧酸酯類。在生產ω-官能化羧酸酯類的方法中使用這些遺傳修飾細胞可藉由使用易於獲得的替代性石化原料來生產化合物以提高生產這些化合物的靈活性。此外，使用能夠將烷類轉化為脂肪酸酯類及其相應之ω-官能化衍生物的全部手段進行整合之全細胞生物催化劑，使該轉化方法更簡單，因為該轉化僅涉及少數的方法步驟。也消除了依賴脂肪酸和簡單碳源作為碳基質。
根據本發明的第一個態樣，提供了一種用於從至少一種烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯的微生物細胞，其中該細胞包含遺傳修飾以提高以下相對於野生型細胞的表現(i)能夠將烷轉化為相應之1-烷醇的酶E1；(ii)能夠將(i)的1-烷醇轉化為相應之1-烷醛的酶E2；(iii)能夠將(ii)的1-烷醛轉化為相應之烷酸的酶E3；(iv)能夠將(iii）的烷酸轉化為相應之烷酸酯的酶E4；和(v)能夠將(iv)的烷酸酯轉化為相應之ω-羥基-烷酸酯 的酶E5。
根據本發明之任一態樣的微生物細胞是指不具有為了提高從至少一種簡單碳源形成羧酸或羧酸酯而之前/先前修飾的細胞。將術語「簡單碳源」理解為在碳骨架上至少一個C-C鍵已被破壞的碳源。具體地，簡單的碳源可為至少一種碳水化合物，諸如例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉、纖維素和半纖維素，但碳源也可包括甘油或非常簡單的有機分子如CO2、CO或合成氣體。更具體地，根據本發明之任一態樣的微生物細胞可能沒有被遺傳修飾以提高下列至少一種酶相對於野生型細胞的表現：- EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22之E20醯基-ACP硫酯酶，- EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22之E21醯基-輔酶A硫酯酶，- E22醯基-輔酶A：ACP轉醯酶，- E23聚酮合成酶，其催化參與羧酸和羧酸酯的合成反應，和- E24己酸合成酶。
在一個實例中，根據本發明之任一態樣的細胞可包含另外的遺傳修飾，以提高以下相對於野生型細胞的表現(vi)能夠將(v)的ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6；和 (vii)能夠將(vi)的ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-胺基烷酸酯的酶E7。
在另一實例中，根據本發明之任一態樣的細胞可包含另外的遺傳修飾，以提高以下相對於野生型細胞的表現(vi)能夠將(v)的ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6；(vii)能夠將(vi)的ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸酯的酶E13；和(viii)能夠將(vi)的ω-羧基烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸二酯的酶E14。
根據本發明之任一態樣的細胞可用於在培養上清液中由所有烷類生產具有高時空產率(space-time yield)、高碳產率和高濃度的ω-官能化羧酸酯。作為這些優點的結果，促進了有效的後處理。
本文中與細胞或微生物連接使用之用語「野生型」可表示具有在野生天然存在的形式之基因組組成(genomemake-up)的細胞。該術語可應用於全細胞和個體基因兩者。因此，該術語「野生型」也可包括在其他方面(即，對於一個或多個基因)有遺傳修飾但無關於感興趣基因的細胞。因此，該術語「野生型」不包括其中特定感興趣基因的基因序列至少部分地由人用重組方法改變的此種細胞。因此，根據本發明之任一態樣的野生型細胞是指細胞對於全基因組和/或特定基不具有基因突變。因此，在一個實例中，對於酶E1的野生型細胞可以指在細胞中具有 酶E1之天然/未改變的表現之細胞。對於酶E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15等的野生型細胞可以相同的方式解釋，並且可以指在細胞中分別具有的酶E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15等的天然/未改變的表現之細胞。
任何根據本發明之任一態樣使用的酶可以是分離的酶。具體地，根據本發明之任一態樣使用的酶可以以活性狀態且在所有的輔因數(cofactor)、基質、輔助和/或活化多肽或對其活性是必需之因數的存在下使用。如本文所用，術語「分離的」是指與其天然存在的細胞相比，所關注的酶是富集的。酶可藉由SDS聚丙烯醯胺電泳和/或活性測定法來富集。例如，藉由目測檢查判定考馬斯藍染料(Coomassie blue dye)染色後的聚丙烯醯胺凝膠，所關注的酶可以構成存在於製劑中的所有多肽之多於5、10、20、50、75、80、85、90、95或99%。
根據本發明之任一態樣使用的酶可以是重組的。本文所用的術語「重組」是指分子或由這樣的分子所編碼的，特別是多肽或核酸，其本身不是天然存在但是是遺傳工程的結果，或是指包含重組分子的細胞。例如，如果核酸分子包含與編碼催化活性多肽的序列功能性連接的啟動子，並且該啟動子已被設計而使得相對於相應之包含原始未改變的核酸分子的野生型細胞中的多肽水平，催化活性多肽被過表現，則核酸分子被重組。
熟習該技術人士將能夠使用本領域已知的任何方法來 遺傳修飾細胞或微生物。根據本發明之任一態樣，遺傳修飾細胞可以被遺傳修飾，使得在規定的時間間隔內，在2小時內，具體地在8小時或24小時內形成比野生型細胞多至少一倍或兩倍、特別是至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍的ω-官能化羧酸酯。產物形成的提高可以被測定，例如，藉由在合適的營養培養基中在相同條件(相同的細胞密度、相同的營養培養基、相同的培養條件)下分別培養根據本發明之任一態樣的細胞和野生型細胞經特定時間間隔，然後確定營養培養基中目標產物(ω-官能化羧酸酯)的量。
遺傳修飾細胞或微生物可能在遺傳上不同於野生型細胞或微生物。根據本發明之任一態樣的遺傳修飾微生物與野生型微生物之間的基因差異可以是在遺傳修飾的微生物中存在野生型微生物中不存在的完整基因、胺基酸、核苷酸等。在一個實例中，根據本發明之任一態樣的遺傳修飾微生物可以包含能夠使微生物產生比野生型細胞更多的1-烷醇、1-烷醛、烷酸、烷酸酯、ω-羥基烷酸酯等的酶。相對於本發明之遺傳修飾微生物，野生型微生物可能沒有或無檢測到能使經遺傳修飾微生物產生1-烷醇、1-烷醛、烷酸、烷酸酯、ω-羥基烷酸酯等的酶活性。如本文所用，術語「遺傳修飾微生物」可以與術語「遺傳修飾細胞」互換使用。根據本發明之任一態樣的遺傳修飾係在微生物的細胞上進行。
根據本發明之任一態樣的細胞係根據本領域已知的任 何方法進行基因轉化。具體地，細胞可以根據WO2013024114所揭示的方法生產。
本文所用之用語「遺傳修飾細胞與其野生型相比具有提高的酶活性」是指相應酶的活性提高至少2倍，具體地至少10倍，更具體地至少100倍，又更具體地至少1000倍，且甚至更具體地至少10000倍。
如本文所用的用語「酶的提高活性」應被理解為提高的細胞內活性。基本上，酶活性的提高可以藉由以下方式實現：提高編碼酶的一條或多條基因序列的拷貝數、使用強啟動子或利用編碼具有提高活性的相應酶的基因或對偶基因、改變基因的密碼子利用、以各種方式提高mRNA或酶的半衰期、修飾基因表現的調節以及任意地組合這些措施。根據本發明之任一態樣所使用的遺傳修飾細胞例如用載體藉由轉化、轉導、接合(conjugation)或這些方法的組合來產生，該載體含有所需基因、該基因的對偶基因或其部分，且該載體能夠表現該基因。異源表現具體藉由將基因或對偶基因整合入細胞的染色體或染色體外複製的載體中來實現。
在同樣的情況下，關於本發明之任一態樣所使用的用語「降低之酶Ex的活性」可以被理解為是指活性降低到至少0.5倍，特別是至少0.1倍，更特別是至少0.01倍，甚至更特別是至少0.001倍，且最特別是至少0.0001倍。用語「降低的活性」亦包含不可檢測的活性(「活性為零」)。某些酶活性的降低可藉由例如選擇性突變或藉由 熟習該領域技術人士已知用於降低某種酶的活性之其它措施來進行。具體地，熟習該領域技術人士藉由中斷特定基因，例如至少在Dubeau等人2009、Singh & Röhm 2008、Lee等人2009等方法中找到供修飾和降低蛋白質表現並伴隨降低酶活性的指示。根據本發明之任一態樣的細胞中酶活性的降低可以藉由修飾包含一個核酸序列的基因來實現，其中該修飾係選自包含以下或由以下所組成之群組：在該基因中插入外源DNA、至少部分基因的缺失、基因序列中的點突變、RNA干擾(siRNA)、反義RNA或調節序列(諸如例如啟動子和終止子或位於基因側邊的核醣體結合位點)的修飾(插入、缺失或點突變)。
外源DNA在這方面應被理解為是指對基因(而不是對生物體)是「外源」的任何DNA序列，即內源DNA序列也可以在這方面用作為「外源DNA」。在這方面，特佳地藉由插入選擇標記基因來中斷基因，因此該外源DNA為選擇標記基因，其中較佳地藉由基因座中的同源重組進行插入。
上述和所有下述之酶和基因的表現可以藉由1維和2維蛋白質凝膠分離然後用合適的評估軟體光學鑑定凝膠中的蛋白質濃度來進行測定。如果酶活性的提高僅基於相應基因表現的提高，則酶活性提高的定量可以簡單地藉由比較野生型和遺傳修飾細胞之間的1維或2維蛋白質分離來確定。製備用於細菌並用於鑑定蛋白質之蛋白質凝膠的常規方法是由Hermann等人描述的方法。(Electrophoresis, 22：1712-23(2001)。蛋白質濃度也可以藉由以對待測定蛋白質具特異性的抗體之西方點墨雜交法(Sambrook等人，Molecular Cloning：a laboratory manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)，隨後用適當的濃度測定軟體進行光學評估(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum,5：32-39；Lottspeich(1999),Angewandte Chemie 111：2630-2647)來進行分析。當由待測定的酶活性催化的反應之可能產物可在微生物中快速代謝時，或者另外當野生型自身中活性對其太低以致於無法根據產物形成來充分確定待測定的酶活性時，該方法也常常是種選擇。
具體地，- 該酶E1可選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)和EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)；- 該酶E2可選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之醇氧化酶(Ec)和醇脫氫酶(Ed)；- 該酶E3係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醛脫氫酶(Ee)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)和雙官能醇脫氫酶(Edii)，其中Ec、Edi、和Edii能夠將1-烷醇經由1-烷醛直接氧化為相應之烷酸； - 該酶E4可選自由以下所組成之群組：蠟-酯合成酶(Ef)和醇O-醯基轉移酶(Eg)；- 該酶E5可選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)和EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)；- 該酶E6可選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醇氧化酶(Ec)和醇脫氫酶(Ed)；- 該酶E7可為ω-轉胺酶(Eh)。
在一個實例中，酶E1、E2、E3和E5可以各自是能夠進行其活性的不同酶。例如，E1可為AlkB烷羥化酶(Eb)，E2可為醇氧化酶(Ec)，E3可為雙官能AlkJ醇脫氫酶，且E5可為AlkB烷羥化酶(Eb)。在另一個實例中，E1可為P450烷羥化酶(Ea)，E2可為醇脫氫酶(Ec)，E3可為醛脫氫酶(Ee)，且E5可為P450烷羥化酶。具體地，可以使用酶E1、E2、E3和E5的任何組合來進行它們的特定功能。在另外的實例中，E1、E2、E3和E5可為相同的酶。在該實例中，E1、E2、E3和E5可選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)和AlkB烷羥化酶(Eb)。在一個實例中，E1、E2、E3和E5可為P450烷羥化酶(Ea)。在該實例中，根據本發明之任一態樣的細胞包含符合酶E1、E2、E3和E5的功能之P450烷羥化酶(Ea)相對於野生型細胞的提高表現。在另一個實例中，E1、E2、E3和E5可為AlkB烷羥化酶(Eb)。在該實例中，根據本發明之任一態樣的細胞包含符合酶E1、E2、E3和E5的功能之AlkB烷羥化酶 (Eb)相對於野生型細胞的提高表現。
酶Ea至Eh可包含多肽序列，其中將多達60%，較佳多達25%，特別是多達15%，特別是多達10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的胺基酸殘基藉由缺失、插入、取代或其組合相較於以下參考序列(檢索號)進行修飾，並且其仍具有至少50%，較佳65%，特佳80%，特別是多於90%的對應於以下參考序列之蛋白質活性，其中將參考蛋白質的100%活性理解為表示用作生物催化劑之細胞活性的提高，即基於所使用的細胞量(單位/克細胞乾重[U/g CDW])，相較於不存在參考蛋白質的生物催化劑活性，每單位時間所轉化的物質量。
給定多肽序列的胺基酸殘基之修飾(其並不引起給定多肽的特性和功能的任何明顯改變)對於熟習該技術領域人士是已知的。因此，例如，許多胺基酸可以經常彼此交換而不引起問題；此類合適的胺基酸取代之實例為：Ser對Ala；Lys對Arg；Gln或His對Asn；Glu對Asp；Ser對Cys；Asn對Gln；Asp對Glu；Pro對Gly；Asn或Gln對His；Leu或Val對Ile；Met或Val對Leu；Arg或Gln或Glu對Lys；Leu或Ile對Met；Met或Leu或Tyr對Phe；Thr對Ser；Ser對Thr；Tyr對Trp；Trp或Phe對Tyr；Ile或Leu對Val。還已知修飾通常不會對多肽的功能產生顯著影響，特別是在多肽的N-或C-末端處以例如胺基酸插入或缺失形式的修飾。
在本說明書中提及之與本發明相關的檢索號對應於日 期為2011年07月26日的NCBI之ProteinBank資料庫條目；通常，條目的版本號在本文中藉由「編號」標識，例如「.1」。
除非另有說明，所有陳述的百分比(%)是指質量%。
根據本發明之任一態樣，微生物細胞可以選自由以下所組成之群組的細菌種類：乏養菌屬(Abiotrophia)、藍藻菌屬(Acaryochloris)、聚磷菌屬(Accumulibacter)、醋弧菌屬(Acetivibrio)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、醋鹽桿菌屬(Acetohalobium)、醋絲菌屬(Acetonema)、無色桿菌屬(Achromobacter)、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus)、酸微菌屬(Acidimicrobium)、嗜酸菌屬(Acidiphilium)、酸硫桿狀菌屬(Acidithiobacillus)、酸桿菌屬(Acidobacterium)、熱酸菌屬(Acidothermus)、食酸菌屬(Acidovorax)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、放線菌屬(Actinomyces)、束絲放線菌屬(Actinosynnema)、氣球菌屬(Aerococcus)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、阿菲波菌屬(Afipia)、凝聚桿菌屬(Aggregatibacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、阿赫蘭氏菌屬(Ahrensia)、疣微菌屬(Akkermansia)、食鹼菌屬(Alcanivorax)、脂環酸芽胞桿菌屬(Alicycliphilus)、脂環酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、弧菌屬(Aliivibrio)、鹼湖生菌屬(Alkalilimnicola)、嗜鹼菌屬(Alkaliphilus)、異著色菌屬(Allochromatium)、交替單胞菌目(Alteromonadales)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、胺基酸細菌屬 (Aminobacterium)、胺基酸單胞菌屬(Aminomonas)、制氨菌屬(Ammonifex)、擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis)、分枝菌酸球菌屬(Amycolicicoccus)、魚腥藻屬(Anabaena)、厭氧小桿菌屬(Anaerobaculum)、厭氧球菌屬(Anaerococcus)、(Anaerofustis)、厭氧繩菌屬(Anaerolinea)、厭氧黏細菌屬(Anaeromyxobacter)、丁酸弧菌(Anaerostipes)、厭氧幹屬(Anaerotruncus)、無形體屬(Anaplasma)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、產液菌屬(Aquifex)、隱穩桿菌屬(Arcanobacterium)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、香茅菌(Aromatoleum)、節桿菌屬(Arthrobacter)、節螺藻屬(Arthrospira)、不黏柄菌屬(Asticcacaulis)、陌生物菌屬(Atopobium)、橙單胞菌屬(Aurantimonas)、固氮弓菌屬(Azoarcus)、固氮根瘤菌屬(Azorhizobium)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、固氮菌屬(Azotobacter)、桿菌屬(Bacillus)、巴通體屬(Bartonella)、巴斯夫菌屬(Basfia)、鮑氏菌(Baumannia)、蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、貝紮托菌屬(Beggiatoa)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)、貝爾曼氏菌屬(Bermanella)、獲山氏菌屬(Beutenbergia)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、芽小梨形菌屬(Blastopirellula)、布洛堤菌屬(Blautia)、(Blochmannia)、博多氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、短螺旋體屬(Brachyspira)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、短小芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、短波單胞菌 屬(Brevundimonas)、布魯菌屬(Brucella)、布赫納氏菌屬(Buchnera)、布拉地亞菌(Bulleidia)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、熱鹼芽胞桿菌屬(Caldalkalibacillus)、厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter)、熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、卡地他里布菌(Calditerrivibrio)、化能自養菌(Caminibacter)、彎麴菌屬(Campylobacter)、羧基假體菌(Carboxydibrachium)、一氧化碳嗜熱菌屬(Carboxydothermus)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、卡森內拉菌(Carsonella)、棒狀桿菌屬(Catenibacterium)、細鏈孢菌屬(Catenulispora)、卡托氏菌屬(Catonella)、柄桿菌屬(Caulobacter)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、蜈蚣菌屬(Centipeda)、根瘤菌屬(Chelativorans)、綠屈撓菌屬(Chloroflexus)、色桿菌屬(Chromobacterium)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)、黃麴黴屬(Chthoniobacter)、檸檬胞菌屬(Citreicella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、檸檬酸微菌屬(Citromicrobium)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、衣原體菌(Cloacamonas)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、科爾韋氏菌屬(Colwellia)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter)、聚集桿菌屬(Congregibacter)、糞芽孢菌屬(Coprobacillus)、糞球菌屬(Coprococcus)、糞熱桿菌屬(Coprothermobacter)、扣拉里歐馬佳里他菌(Coraliomargarita)、寇里氏桿菌屬 (Coriobacterium)、囓蝕菌(corrodens)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、柯克斯體屬(Coxiella)、鱷球藻屬(Crocosphaera)、阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)、短小桿菌屬(Cryptobacterium)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、藍菌屬(Cyanobium)、藍絲菌屬(Cyanothece)、擬筒孢藍細菌屬(Cylindrospermopsis)、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)、鐵還原桿菌屬(Deferribacter)、脫鹵擬球菌屬(Dehalococcoides)、綠彎菌門細菌(Dehalogenimonas)、異常球菌屬(Deinococcus)、代爾夫特菌屬(Delftia)、氮還原弧菌屬(Denitrovibrio)、皮生球菌屬(Dermacoccus)、鏈孢子菌(Desmospora)、脫硫盒菌屬(Desulfarculus)、脫硫酸鋇菌(Desulphateibacillum)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、脫硫橄欖狀菌屬(Desulfobacca)、脫硫桿菌屬(Desulfobacterium)、脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)、脫硫球菌屬(Desulfococcus)、脫硫鹽菌屬(Desulfohalobium)、脫硫微菌屬(Desulfomicrobium)、脫硫散菌屬(Desulfonatronospira)、金礦菌(Desulforudis)、脫硫小桿菌屬(Desulfotalea)、脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、脫硫螺旋菌屬(Desulfurispirillum)、脫硫桿菌屬(Desulfurobacterium)、脫硫單胞菌屬(Desulfuromonas)、脫硫菌屬(Dethiobacter)、脫硫代硫酸鹽弧菌屬(Dethiosulfovibrio)、戴阿利斯特桿菌屬(Dialister)、偶蹄形菌屬(Dichelobacter)、迪基氏菌屬(Dickeya)、網球菌屬 (Dictyoglomus)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、溝鞭藻玫瑰桿菌屬(Dinoroseobacter)、多拉菌(Dorea)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、埃裡希氏體屬(Ehrlichia)、艾肯氏菌屬(Eikenella)、迷蹤菌(Elusimicrobium)、內管蟲菌屬(Endoriftia)、水棲菌屬(Enhydrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、刺骨魚菌(Epulopiscium)、歐文氏桿菌屬(Erwinia)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、赤細菌屬(Erythrobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、產氫新菌屬(Ethanoligenens)、真桿菌屬(Eubacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、柔嫩梭菌(Faecalibacterium)、鐵還原單胞菌屬(Ferrimonas)、閃爍桿菌屬(Fervidobacterium)、絲狀桿菌屬(Fibrobacter)、芬戈爾德菌屬(Finegoldia)、彎枝菌屬(Flexistipes)、法蘭西斯氏菌屬(Francisella)、弗蘭克氏菌屬(Frankia)、乳酸細菌屬(Fructobacillus)、棕黃海水菌屬(Fulvimarina)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、雞桿菌屬(Gallibacterium)、報毛菌屬(Gallionella)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、孿生球菌屬(Gemella)、出芽菌屬(Gemmata)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、土壤芽孢桿菌屬(Geobacillus)、土桿菌屬(Geobacter)、地嗜皮菌屬(Geodermatophilus)、冰居菌屬(Glaciecola)、黏桿菌屬(Gloeobacter)、舌蠅屬(Glossina)、葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)、戈登氏菌屬(Gordonia)、格蘭利菌(Granulibacter)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、格裡蒙菌 屬(Grimontia)、嗜血菌屬(Haemophilus)、河氏菌屬(Hahella)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobiumns)、嗜鹽囊菌(Haliangium)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、鹽紅螺旋菌屬(Halorhodospira)、鹽熱發菌屬(Halothermothrix)、鹽硫桿狀菌屬(Halothiobacillus)、哈密爾頓菌(Hamiltonella)、螺桿菌屬(Helicobacter)、陽光桿菌屬(Heliobacterium)、草螺菌屬(Herbaspirillum)、賀咪單胞菌屬(Herminiimonas)、滑柱菌屬(Herpetosiphon)、希普氏菌屬(Hippea)、海氏菌屬(Hirschia)、嗜組織菌屬(Histophilus)、何杰金菌屬(Hodgkinia)、赫夫勒氏菌屬(Hoeflea)、霍爾德曼氏菌屬(Holdemania)、氫化纖維菌(Hydrogenivirga)、生水小桿菌屬(Hydrogenobaculum)、霍爾氏菌(Hylemonella)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、生絲單胞菌屬(Hyphomonas)、深海桿菌屬(Idiomarina)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、間孢囊菌屬(Intrasporangium)、白蟻菌屬(Isoptericola)、等球菌屬(Isosphaera)、兩面神菌屬(Janibacter)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、鐘斯氏菌屬(Jonesia)、喬納特拉菌(Jonquetella)、薑氏菌屬(Kangiella)、酮古龍酸菌屬(Ketogulonicigenium)、動球菌屬(Kineococcus)、金氏菌屬(Kingella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、考克氏菌屬(Kocuria)、扣里菌(Koribacter)、科莫託加菌(Kosmotoga)、撲科研菌屬(Kribbella)、纖線桿菌屬(Ktedonobacter)、皮球菌屬(Kytococcus)、拉布倫茨氏菌(Labrenzia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬 (Lactococcus)、鷗桿菌屬(Laribacter)、勞特羅普氏菌屬(Lautropia)、勞森氏菌屬(Lawsonia)、軍團菌屬(Legionella)、雷弗松氏菌屬(Leifsonia)、黏膠球形菌屬(Lentisphaera)、纖發鞘絲藍細菌屬(Leptolyngbya)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、纖發菌屬(Leptothrix)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、韌皮桿菌屬(Liberibacter)、湖沉積桿菌屬(Limnobacter)、李斯特氏菌屬(Listeria)、洛克氏菌(Loktanella)、盧埃拉菌(Lutiella)、鞘絲藍細菌屬(Lyngbya)、賴胺酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、巨大球菌屬(Macrococcus)、磁球菌屬(Magnetococcus)、磁螺菌屬(Magnetospirillum)、馬赫拉菌(Mahella)、默罕氏菌屬(Mannheimia)、海洋桿狀菌(Maricaulis)、海棲熱菌屬(Marinithermus)、海桿菌屬(Marinobacter)、海單胞菌屬(Marinomonas)、深海菌屬(Mariprofundus)、海棍狀菌(Maritimibacter)、Marvinbryantia、巨球形菌屬(Megasphaera)、稍熱菌屬(Meiothermus)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、中間根瘤菌屬(Mesorhizobium)、甲烷氧化細菌(Methylacidiphilum)、甲脒菌(Methylibium)、甲基小桿菌屬(Methylobacillus)、甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、甲基麴菌屬(Methylosinus)、甲基轉移 菌(Methyloversatilis)、食甲基菌屬(Methylovorus)、微桿菌屬(Microbacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、微鞘藍細菌屬(Microcoleus)、微囊藍細菌屬(Microcystis)、小月菌屬(Microlunatus)、小單孢菌屬(Micromonospora)、光崗菌屬(Mitsuokella)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、莫爾氏菌屬(Moorella)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、南極嗜冷菌屬(Moritella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、黏球菌屬(Myxococcus)、Nakamurella、鹽鹼厭氧菌屬(Natranaerobius)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、新立克次氏體屬(Neorickettsia)、海王星菌屬(Neptuniibacter)、硝化脫落菌(Nitratifractor)、硝化變形菌(Nitratiruptor)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、節球藍細菌屬(Nodularia)、念珠藍細菌屬(Nostoc)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、海洋球菌屬(Oceanibulbus)、海洋柄菌屬(Oceanicaulis)、海洋生菌屬(Oceanicola)、海洋棲熱菌屬(Oceanithermus)、海洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、十八桿菌屬(Octadecabacter)、歐地希拉菌(Odyssella)、寡養菌屬(Oligotropha)、歐氏菌屬(Olsenella)、豐佑菌屬(Opitutus)、歐里菌(Oribacterium)、東方體屬(Orientia)、鳥胺酸芽胞桿菌屬(Ornithinibacillus)、顫藍細菌屬 (Oscillatoria)、綠顫細菌屬(Oscillochloris)、草酸桿菌屬(Oxalobacter)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、泛菌屬(Pantoea)、副球菌屬(Paracoccus)、類斯氏菌屬(Parascardovia)、副薩特菌屬(Parasutterella)、細小棒菌屬(Parvibaculum)、微單胞菌屬(Parvimonas)、短小盒菌屬(Parvularcula)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、巴斯德氏芽菌屬(Pasteuria)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、片球菌屬(Pediococcus)、絲單囊殼屬(Pedosphaera)、佩拉基菌(Pelagibaca)、遠洋桿菌屬(Pelagibacter)、暗桿菌屬(Pelobacter)、Pelotomaculum、嗜腖菌(Peptoniphilus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、Persephonella、石袍菌屬(Petrotoga)、褐桿菌屬(Phaeobacter)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、發光桿菌屬(Photobacterium)、小小梨形菌屬(Pirellula)、浮黴狀菌屬(Planctomyces)、動性球菌屬(Planococcus)、多囊卵巢菌(Plesiocystis)、極胞菌屬(Polaromonas)、極胞菌屬(Polaromonas)、多形梭桿菌(Polymorphum)、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、海綿桿菌門(Poribacteria)、原綠球菌屬(Prochlorococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、變形菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、假梭桿菌屬(Pseudoflavonifractor)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、假枝桿菌屬 (Pseudoramibacter)、假弧菌屬(Pseudovibrio)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、冷單胞菌屬(Psychromonas)、Puniceispirillum、Pusillimonas、維形桿菌屬(Pyramidobacter)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、尖頭藻屬(Raphidiopsis)、Regiella、Reinekea、腎桿菌屬(Renibacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、紅育菌屬(Rhodoferax)、紅微菌屬(Rhodomicrobium)、紅小梨形菌屬(Rhodopirellula)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、立克次氏體屬(Rickettsia)、立克次氏小體屬(Rickettsiella)、里西亞菌(Riesia)、羅斯伯裡氏菌屬(Roseburia)、玫瑰菌屬(Roseibium)、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、玫瑰桿菌(Roseobacter)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)、玫瑰變色菌屬(Roseovarius)、羅斯氏菌屬(Rothia)、紅長命菌屬(Rubrivivax)、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、魯傑氏菌屬(Ruegeria)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、魯西亞菌(Ruthia)、糖單孢菌屬(Saccharomonospora)、噬糖菌屬(Saccharophagus)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、箭頭菌屬(Sagittula)、放線菌(Salinispora)、沙門氏菌屬(Salmonella)、血桿菌屬(Sanguibacte)、多維亞菌(Scardovia)、塞巴魯德菌屬(Sebaldella)、脂肪酸慢出菌屬(Segniliparus)、月形單胞菌 屬(Selenomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙特爾沃思菌(Shuttleworthia)、Sideroxydans、矽菌(Silicibacter)、西蒙斯氏菌屬(Simonsiella)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、史雷克氏菌屬(Slackia)、伴蠅菌屬(Sodalis)、收里菌(Solibacter)、收羅菌(Solobacterium)、堆囊菌屬(Sorangium)、球桿菌屬(Sphaerobacter)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、鞘磷脂菌(Sphingopyxis)、螺旋體屬(Spirochaeta)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、Stackebrandtia、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、斯塔克耶菌(Starkeya)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、標樁菌屬(Stigmatella)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)、小球菌屬(Subdoligranulum)、近弧狀菌(subvibrioides)、玻拍酸單胞菌屬(Succinatimonas)、亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)、硫化桿菌屬(Sulfobacillus)、兼性硫氧化菌屬(Sulfuricurvum)、硫化氫鈾菌(Sulfurihydrogenibium)、硫單胞菌屬(Sulfurimonas)、硫化螺旋菌屬(Sulfurospirillum)、硫氧化菌(Sulfurovum)、薩特氏菌屬(Sutterella)、(Symbiobacterium)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、共養香腸樣桿菌屬(Syntrophobotulus)、共養單胞菌屬(Syntrophomonas)、互營熱菌屬(Syntrophothermus)、互養 菌屬(Syntrophus)、(taiwanensis)、泰勒氏菌屬(Taylorella)、船蛆桿菌屬(Teredinibacter)、龍舌蘭菌(Terriglobus)、碲化釷菌(Thalassiobium)、索氏菌屬(Thauera)、嗜熱好氧桿菌屬(Thermaerobacter)、熱厭氧弧菌屬(Thermanaerovibrio)、Thermincola、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium)、Thermobaculum、喜熱裂孢菌屬(Thermobifida)、嗜熱雙孢菌屬(Thermobispora)、熱發狀菌屬(Thermocrinis)、熱脫硫菌(Thermodesulphateator)、熱脫硫桿菌屬(Thermodesulfobacterium)、熱脫硫菌屬(Thermodesulfobium)、熱脫硫弧菌屬(Thermodesulfovibrio)、熱微菌屬(Thermomicrobium)、高溫單孢菌屬(Thermomonospora)、熱產氫產乙酸菌屬(Thermosediminibacter)、熱彎菌屬(Thermosinus)、棲熱腔菌屬(Thermosipho)、熱聚球藻屬(Thermosynechococcus)、棲熱孢菌屬(Thermotoga)、熱弧菌屬(Thermovibrio)、棲熱菌屬(Thermus)、球菌屬(Thioalkalimicrobium)、硫鹼弧菌屬(Thioalkalivibrio)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、硫微螺菌屬(Thiomicrospira)、硫單胞菌屬(Thiomonas)、甲苯單胞菌屬(Tolumonas)、密螺旋體屬(Treponema)、tribocorum、束毛藍細菌屬(Trichodesmium)、Tropheryma、特呂珀菌屬(Truepera)、塚村氏菌屬(Tsukamurella)、傳代菌屬(Turicibacter)、貪噬菌屬(Variovorax)、韋榮氏菌屬 (Veillonella)、蟲丘蟲引腎桿菌屬(Verminephrobacter)、疣微菌屬(Verrucomicrobium)、疣孢菌屬(Verrucosispora)、Vesicomyosocius、弧菌屬(Vibrio)、弧菌目(Vibrionales)、食物穀菌屬(Victivallis)、魏斯氏菌屬(Weissella)、威格爾斯沃思氏菌屬(Wigglesworthia)、沃爾巴克氏體屬(Wolbachia)、沃林氏菌屬(Wolinella)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、木聚糖單胞菌屬(Xylanimonas)、木桿菌屬(Xylella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、Zinderia和發酵單孢菌屬(Zymomonas)。
具體地，微生物細胞可以來自大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌種(Pseudomonas sp.)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、不動桿菌屬種(Acinetobacter sp.)、伯克氏菌屬種(Burkholderia sp.)、泰國伯克霍爾德氏菌(Burkholderia thailandensis)、藍綠菌(Cyanobakterien)，克雷伯氏菌屬種(Klebsiella sp.)、產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、沙門氏菌屬種(Salmonella sp.)、根瘤菌屬種(Rhizobium sp.)和苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、芽孢桿菌種(Bacillus sp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、梭狀芽胞桿菌種(Clostridium sp.)、棒狀桿菌種(Corynebacterium sp.)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、短桿菌種(Brevibacterium sp.)、小球藻種(Chlorella sp.)和念珠藻種(Nostoc sp.)。 更具體地，微生物細胞可以來自大腸桿菌。
烷類是具有取決於碳原子數和烷的結構(即支鏈、直鏈、環狀等)之各種應用的飽和烴類。烷類(技術上，經常是無環或開鏈的化合物)具有化學通式CnH2n+2。根據本發明之任一態樣所使用的烷可以包含至少6個C原子。具體地，根據本發明之任一態樣所使用的烷可以包含6-22、6-20、6-18、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、8-20、8-19、8-18、8-16、8-15、8-12、8-10個碳原子(含)。該烷類可以選自由以下所組成之群組：己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷和二十烷。具體地，所使用的烷可為癸烷、十一烷或十二烷。
酶E 1
酶E1能夠將至少一種烷轉化為相應之1-烷醇。具體地，E1可為至少一種EC 1.14.15.1之P450烷羥化酶(Ea)或EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)。該P450烷羥化酶(Ea)是包含以下之反應系統的成分- 兩種酶成分，細胞色素P450烷羥化酶和EC 1.6.2.4之NAD(P)H細胞色素P450氧化還原酶或- 三種酶成分，CYP153型細胞色素P450烷羥化酶、EC 1.18.1.2或EC 1.18.1.3之鐵氧化還原蛋白NAD(P)+還原酶和鐵氧化還原蛋白。
該AlkB烷羥化酶(E1b)是包含以下之反應系統的成分 - EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶，其是包含三種酶成分之反應系統的成分，EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶、EC 1.18.1.1或EC 1.18.1.4之AlkT紅氧化還原蛋白(rubredoxin)NAD(P)+還原酶和紅氧化還原蛋白AlkG。
具體地，E1可為AlkB烷羥化酶(Eb)，也稱為烷單氧化酶(alkane monooxygenase)。更具體地，E1可包含與來自由alkBGT編碼之惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)GPo1之烷單氧化酶至少50%的序列一致性。甚至更具體地，E1可包含與多肽YP_001185946.1至少50%的序列一致性。更具體地，E1可包含與多肽YP_001185946.1具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%的序列一致性之多肽。
酶E a
具體地，酶E1可以至少是一種選自由以下所組成之群組的P450烷羥化酶(Ea)：AAO73954.1、AAO73953.1、XP_002546279.1、AAA34353.2、P30607.1、XP_002421627.1、XP_718670.1、CAA39366.1、XP_001527524.1、AAO73955.1、AAO73956.1、XP_002546278.1、EEQ43157.1、XP_718669.1、AAA34354.1、P10615.3、XP_002421628.1、226487、P16141.3、CAA39367.1、Q9Y757.2、XP_001485567.1、AAO73958.1、 XP_001383506.2、XP_460111.2、AAO73959.1、Q12586.1、XP_460112.2、AAO73960.1、Q12589.1、AAO73961.1、XP_460110.2、EEQ43763.1、XP_710174.1、EDK41572.2、XP_001482650.1、CAA75058.1、XP_002548818.1、Q12588.1、XP_002422222.1、XP_001383636.2、XP_001525381.1、XP_002548823.1、P30610.1、AAO73952.1、XP_002548428.1、CAA36197.1、XP_002421126.1、AAA34320.1、P16496.3、P30608.1、P24458.1、XP_717999.1、XP_001383817.1、Q9Y758.1、XP_001482092.1、XP_001383710.2、P30609.1、AAB24479.1、XP_457792.1、XP_001524144.1、XP_457727.2、XP_001525578.1、XP_002616743.1、XP_002614836.1、XP_001525577.1、AAO73957.1、Q12585.1、XP_001386440.2、XP_002616857.1、XP_001483276.1、XP_500402.1、EDK39907.2、XP_500560.1、XP_001211376.1、XP_002560027.1、XP_504857.1、XP_500855.1、XP_504406.1、BAA31433.1、XP_500856.1、XP_501148.1、XP_746567.1、XP_001262425.1、XP_001274843.1、XP_002840588.1、XP_002377641.1、XP_001825995.1、XP_001400739.1、XP_718066.1、CAA35593.1、XP_664735.1、XP_002150795.1、XP_500097.1、XP_002483325.1、XP_504311.1、XP_500273.1、 XP_002548817.1、EDP54484.1、XP_755288.1、XP_001260447.1、EFY97851.1、ACD75398.1、ADK36660.1、XP_001213081.1、XP_002377989.1、XP_001826299.1、XP_001554811.1、XP_501667.1、XP_002148942.1、ADK36662.1、XP_002565827.1、P30611.1、XP_001267871.1、XP_002372373.1、EFY84686.1、P43083.1、XP_001263094.1、XP_002148355.1、XP_002568429.1、XP_001817314.1、Q12587.1、XP_001396435.1、XP_001938589.1、XP_001388497.2、XP_663661.1、XP_003295335.1、XP_002152088.1、XP_001212071.1、Q12573.1、XP_002379858.1、XP_001821592.1、XP_002844341.1、XP_001394678.1、ACD75400.1、BAK03594.1、XP_003170343.1、XP_001265480.1、XP_002550661.1、EDP55514.1、XP_001528842.1、XP_749919.1、XP_001593058.1、P30612.1、EGC48494.1、EEH04429.1、XP_001585586.1、XP_003236182.1、XP_001400199.1、EEQ46951.1、XP_721410.1、EGP87864.1、XP_002380808.1、XP_001792771.1、XP_001208515.1、XP_001216161.1、XP_003071804.1、EFW16963.1、XP_002542118.1、XP_001936677.1、EGD95268.1、XP_003015678.1、XP_501748.1、XP_003169562.1、EFY96492.1、XP_682653.1、XP_002421356.1、CAK43439.1、EFY93677.1、 XP_747767.1、XP_001244958.1、XP_003019635.1、XP_002847463.1、EGP83273.1、EGR52487.1、XP_002622526.1、XP_002563618.1、CBX99718.1、XP_001552081.1、XP_003066638.1、XP_003176049.1、ACD75402.1、BAA05145.1、XP_002482834.1、XP_001257501.1、XP_001934574.1、XP_001269972.1、XP_001587438.1、XP_001215856.1、XP_002149824.1、XP_001550556.1、XP_003011982.1、XP_001827121.1、XP_003233566.1、XP_003022481.1、EGR47044.1、EFQ34695.1、XP_003170005.1、BAG09241.1、XP_002796370.1、XP_003019300.1、XP_002563873.1、CAK40654.1、EEH19741.1、XP_003012518.1、EGD95716.1、XP_003239409.1、BAJ04363.1、XP_001537012.1、BAE66393.1、EGP85214.1、XP_002487227.1、AAV66104.1、EGE07669.1、XP_362943.2、XP_003016806.1、EFQ27388.1、XP_002384360.1、XP_002836323.1、XP_001274959.1、EFZ03093.1、XP_661521.1、XP_002849803.1、XP_001589398.1、AAR99474.1、XP_003189427.1、XP_001823699.1、XP_364111.1、XP_001262753.1、EFY86805.1、XP_001390153.2、XP_002384738.1、XP_001941811.1、XP_001220831.1、XP_003296981.1、XP_002480829.1、BAD83681.1、XP_001827526.2、XP_369556.1、CAK38224.1、EFQ26532.1、 XP_002562328.1、XP_001904540.1、EGO52476.1、XP_002382002.1、XP_001225874.1、XP_958030.2、XP_002540883.1、XP_001908957.1、XP_001559255.1、XP_364102.1、EDP48064.1、XP_365075.1、XP_381460.1、CBX95930.1、XP_003054099.1、XP_361347.2、XP_002846867.1、XP_001214985.1、EFQ35175.1、XP_002479062.1、XP_001908613.1、XP_003345380.1、EGR50567.1、XP_002479350.1、XP_001394417.2、XP_001394159.2、XP_002146776.1、EGP86783.1、EFX02953.1、CAK45889.1、XP_003006887.1、XP_002541427.1、XP_750735.1、XP_001257962.1、EGO51720.1、XP_003005336.1、EGP83197.1、XP_002149832.1、XP_003052680.1、XP_365851.1、XP_001799910.1、XP_003347175.1、XP_002565258.1、EGR48918.1、EGR52524.1、XP_964653.2、XP_002147083.1、XP_002843935.1、EEH19393.1、CAC10088.1、EEH47609.1、EEQ92528.1、XP_001246560.1、XP_002626168.1、XP_003024880.1、XP_003169255.1、XP_003013780.1、XP_003235691.1、XP_746816.1、EGD98483.1、XP_001389925.2、XP_002842817.1、XP_002797278.1、ADK36666.1、XP_003305469.1、XP_001548471.1、XP_001806478.1、EFQ34989.1、XP_001552987.1、CAC24473.1、XP_002541530.1、EEQ89262.1、XP_001247332.1、 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BAE47478.1、YP_001681656.1、ZP_01618281.1、ZP_01627262.1、YP_001413057.1、YP_760740.1、YP_001242466.1、YP_001203574.1、CAH61454.1、YP_002129656.1、YP_001672075.1、ACP39709.1、YP_001990805.1、NP_946959.1、YP_001203575.1、YP_783213.1、YP_003059227.1、YP_004110202.1、ACP39645.1、YP_487538.1、CAH61451.1、YP_570816.1、YP_534107.1、YP_001413223.1、YP_001242465.1、YP_557448.1、ZP_08631162.1、NP_773883.1、ZP_00997728.1、ACP39683.1、NP_768493.1、NP_773882.1、ZP_08271781.1、CAH61449.1、YP_003883668.1、YP_003332953.1、YP_004535688.1、YP_495502.1、YP_459378.1、ZP_08700267.1、ZP_01863452.1、ZP_06860085.1、BAE47487.1、YP_617903.1、ZP_08207422.1、BAE47486.1、ZP_01041003.1、BAE47484.1、ACR78197.1、CAH61456.1、ZP_01858113.1、ACP39681.1、BAE47485.1、ACP39673.1、BAE47483.1、ACP39669.1、BAE47482.1、ACP39674.1、ACP39704.1、ACP39703.1、YP_497095.1、ACP39672.1、ACP39702.1、ACP39670.1、ACP39666.1、YP_458852.1、ACP39687.1、ACP39688.1、ACP39634.1、ACP39686.1、ACP39660.1、ACP39700.1、YP_001411309.1、ZP_01465241.1、ACP39701.1、ACP39679.1、ACP39657.1、ACP39694.1、 ACP39659.1、ACP39671.1、ACP39693.1和YP_003342921.1。
酶E b
在另一實例中，酶E1可以至少是一種選自由以下所組成之群組的AlkB烷羥化酶(E1b)：YP_001185946.1、Q9WWW6.1、YP_957898.1、YP_957728.1、YP_694427.1、BAC98365.1、ZP_00957064.1、CAC86944.1、YP_001672212.1、CAB59525.1、ACH99213.1、ACH99215.1、ACH99216.1、AAK56792.1、ACH99229.1、ACS91348.1、AAP41820.1、ZP_05128075.1、CAM58121.1、CAM58085.1、ACQ44675.1、ACZ62808.1、ZP_01738706.1、ZP_01916228.1、ZP_01225325.1、YP_001023605.1、ACJ22747.1、ACT91140.1、AAT91722.2、CBA27418.1、YP_001889129.1、EGC97932.1、ACT91201.1、ZP_05083049.1、YP_554098.1、ZP_01900149.1、ADG26619.1、ADG26657.1、ADG26640.1、ZP_06838771.1、ADG26649.1、ADG26651.1、ZP_02374120.1、YP_368326.1、ZP_02380481.1、ADG26643.1、ADG26628.1、YP_442346.1、ADG26620.1、ADG26647.1、ZP_07673680.1、ADG26638.1、YP_002232139.1、YP_001118743.1、ZP_01764629.1、YP_108945.1、YP_334185.1、 ZP_04897834.1、ZP_02889567.1、YP_620386.1、YP_002897546.1、ZP_02166109.1、ZP_02904755.1、ADG26639.1、YP_001892637.1、ADG26642.1、ZP_04939380.1、ZP_02464124.1、YP_102417.1、CAC36356.1、ACJ22727.1、YP_001764240.1、YP_002765609.1、YP_001945311.1、ZP_03586616.1、ACJ22665.1、ZP_03574223.1、CAC37038.1、ZP_02456517.1、YP_001807560.1、YP_002779449.1、AAK97454.1、YP_002912304.1、ACR55689.1、YP_003397515.1、YP_004361423.1、YP_772734.1、ACJ65014.1、ACT31523.1、ACJ22750.1、ZP_07375042.1、YP_002776786.1、ACB11552.1、ZP_02363472.1、ADG26653.1、ZP_04383196.1、ZP_02356342.1、ACJ22751.1、YP_952571.1、ACU43494.1、YP_001135977.1、YP_002764193.1、YP_003855036.1、YP_004078475.1、AAK97448.1、ZP_04388098.1、ACX30747.1、ADG26632.1、ACJ22719.1、ADO21492.1、ZP_05061580.1、ADR72654.1、ACZ65961.1、ACX30755.1、YP_001849604.1、AAV64895.1、YP_004495037.1、YP_702497.1、YP_001069662.1、ZP_06850622.1、BAF34299.1、CAB51024.2、YP_004008018.1、YP_003768535.1、ACJ65013.1、ZP_07282765.1、YP_886209.1、ACJ22725.1、ZP_08155372.1、 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ABI14002.1、AAB70825.1、ACX30751.1、ABI14000.1、YP_003617173.1、ZP_01155421.1、ACX30752.1、NP_542887.1、ADC29546.1、AAC38359.1、ADC29541.1、XP_001020064.1、ZP_01442436.1、ZP_05103090.1、ADC29544.1、ABO61809.1、AAY89939.1、ACH99235.1、CAH55830.1、ABO26095.1、YP_004011670.1、ABO26084.1、ADA71083.1、ABO26087.1、ABO61806.1、ADC29531.1、ABO26109.1、ACJ22753.1、ABO26089.1、ABO26093.1、ABO26092.1、ABO61827.1、ABO26105.1、ABO26112.1、AAT91721.1、ABO26120.1、ABO26090.1、ABO26088.1、ABO61811.1、ABO61783.1、CAH55827.1、ACH99232.1、ABO61828.1、ADC29530.1、ACH99234.1、AAQ88276.1、CAH55823.1、ABO26103.1、ACH99233.1、ABO61836.1、ABO26094.1、ABO61840.1、YP_004534277.1、ZP_05845010.1、ABO61821.1、ACH99231.1、AAV68403.1、ABO61839.1、CAH56098.1、ABO26085.1、ABO61826.1、ABO61822.1、ABO26110.1、ABO61810.1、ABO61844.1、ABO61825.1、ABO26099.1、ACJ22767.1、ABO26102.1、YP_004535707.1、ACJ22762.1、ABO26097.1、BAC65444.1、ABO61829.1、YP_114083.1、CAH55828.1、ABO26106.1、YP_552229.1、NP_049190.1、ABO26116.1、CAH56107.1、CAM32407.1、ABO26101.1、ABO61841.1、 ABM79805.1、ZP_05075249.1、AAC27438.2、YP_003754872.1、ADC29532.1、ADA71139.1、ADA71107.1、ADA71095.1、YP_001268217.1、ADA71126.1、ADA71094.1、CAH56108.1、ADC29533.1、ADA71085.1、ZP_05054453.1、ADA71097.1、ADA71086.1、ADA71114.1、ADC29548.1、ADA71101.1、ADC29547.1、ADA71138.1、ADC29542.1、ADA71098.1、ADA71128.1、ADA71105.1、ADA71093.1、ADA71135.1、ADA71100.1、YP_557479.1、ADA71113.1、ADA71091.1、ADC29537.1、ADA71084.1、ADA71090.1、CAH56094.1、XP_002945767.1、ADA71137.1、ADA71103.1、ADA71118.1、ADA71133.1、ADA71102.1、ADC29536.1、CAH56100.1、CAH56101.1、ACI15225.1、ACI15225.1、ABO26091.1、CAH55826.1、CAH55824.1、ZP_08484419.1、ADA71111.1、ACJ22759.1、CAH55825.1、CAH56106.1、CAH56099.1、CAC40957.1、ZP_05075037.1、CAH56102.1、ZP_06846296.1、ABJ16491.1、ZP_05067177.1、XP_001698107.1、BAH10789.1、BAH10791.1、BAH10793.1、BAH10788.1、ABJ16490.1、BAH10800.1、BAH10790.1、BAH10792.1、ZP_05075214.1、BAH10799.1、BAH10795.1、BAH10787.1、BAH10798.1、BAH10794.1、BAH10801.1、 BAH10796.1、BAH10797.1、BAH10802.1、CAH56095.1、CAH56096.1、ADC29538.1、ABX76425.1、ZP_06727686.1、ZP_07774883.1和YP_001615042.1。
酶E 2
酶E2能夠將1-烷醇轉化為相應之1-烷醛。具體地，E2可為至少一種EC 1.14.15.3之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之醇氧化酶(Ec)或EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶(Ed)。更具體而言，酶E2可選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)、AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之醇氧化酶(Ec)、AlkJ醇脫氫酶(Edi)和EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶(Edii)。
具體地，E2可為AlkB烷羥化酶(Eb)，也稱為烷單氧化酶。更具體地，E2可包含與來自由alkBGT編碼之惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)GPo1之烷單氧化酶至少50%的序列一致性。甚至更具體地，E2可包含與多肽YP_001185946.1至少50%的序列一致性。更具體地，E2可包含與多肽YP_001185946.1具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%的序列一致性之多肽。
酶E c
該醇氧化酶(Ec)可選自由以下所組成之群組： AAS46878.1、ACX81419.1、AAS46879.1、CAB75353.1、AAS46880.1、XP_712350.1、XP_002422236.1、XP_712386.1、EEQ43775.1、XP_001525361.1、XP_001386087.1、XP_459506.2、CAB75351.1、CAB75352.1、XP_001385255.2、EDK39369.2、XP_001484086.1、XP_002618046.1、XP_002548766.1、XP_002548765.1、XP_003041566.1、XP_003328562.1、XP_001214264.1、XP_001904377.1、XP_658227.1、XP_001591990.1、XP_753079.1、XP_002569337.1、XP_001268562.1、XP_003348911.1、EGP90120.1、XP_001389382.1、EER37923.1、XP_001264046.1、EGO58212.1、XP_001554225.1、XP_003298648.1、XP_959005.1、XP_002841296.1、XP_001940486.1、EGR52262.1、EEQ89581.1、EGD99881.1、EFQ33355.1、XP_001821106.1、XP_002622231.1、EGG03784.1、EGC44059.1、XP_003018036.1、XP_003011696.1、EFY90752.1、XP_001227812.1、XP_758170.1、XP_001243546.1、XP_002479333.1、XP_003344707.1、EFW14100.1、XP_003071927.1、XP_003171263.1、XP_003051757.1、XP_002147053.1、EEH19591.1、EEH50473.1、XP_001792978.1、XP_387094.1、EFY98644.1、XP_002788971.1、XP_002842592.1、EFX04185.1、XP_003231449.1、XP_001729067.1、CBX94189.1、 XP_001413535.1、ACF22878.1、B5WWZ9.1、XP_002994642.1、XP_002269629.1、XP_002519938.1、XP_002982582.1、NP_001047464.1、EEC73620.1、XP_002981110.1、XP_002960521.1、NP_566729.1、XP_001541970.1、XP_002967201.1、BAK00483.1、XP_002182547.1、BAK02336.1、XP_002454190.1、XP_002328753.1、XP_002867943.1、XP_002285334.1、CAC87643.1、CAN71289.1、XP_002454188.1、AAL31049.1、XP_002464494.1、AAL31021.1、YP_117187.1、XP_002543430.1、CAA18625.1、XP_002883430.1、NP_193673.2、XP_002529832.1、XP_001753124.1、NP_001142399.1、ACN27562.1、XP_002464495.1、ACR36691.1、BAJ86655.1、B5WWZ8.1、NP_001148058.1、ABR17814.1、EAY78905.1、NP_194586.1、AAM63097.1、AAK64154.1、NP_001064839.2、XP_002869492.1、XP_002314488.1、AAL31024.1、ZP_06967355.1、AAP54248.2、XP_002311685.1、ACF87929.1、YP_907078.1、EGE07035.1、YP_001849908.1、XP_002464496.1、EEC67160.1、AAL31027.1、XP_001761391.1、XP_002961172.1、XP_002528823.1、XP_002966834.1、NP_001176205.1、XP_001763007.1、XP_002272123.1、XP_002889487.1、XP_003003157.1、NP_285451.1、EGG23219.1、NP_171895.2、 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具體地，該醇氧化酶(Ec)可選自由以下所組成之群組：AAS46878.1、ACX81419.1、AAS46879.1、CAB75353.1、AAS46880.1、XP_712350.1、XP_002422236.1、XP_712386.1、EEQ43775.1、CAB75351.1、CAB75352.1、XP_002548766.1和 XP_002548765.1。
酶E di
具體地，該AlkJ醇脫氫酶(Edi)可選自由以下所組成之群組：Q00593.1、Q9WWW2.1、ZP_00957061.1、YP_957894.1、CAC38030.1、YP_694430.1、YP_957725.1、YP_001672216.1、YP_552061.1、YP_130410.1、ZP_06155535.1、ZP_01222730.1、YP_691907.1、YP_002297804.1、YP_004283522.1、YP_001234383.1、YP_004435031.1、ZP_05110316.1、ZP_05042898.1、YP_004466324.1、ZP_08553549.1、YP_004125220.1、ADI22536.1、ADI18461.1、YP_003810975.1、YP_662346.1、YP_004427557.1、YP_692606.1、ZP_05043291.1、YP_440752.1、ZP_02386160.1、ZP_04763547.1、ZP_02361232.1、YP_003376674.1、ZP_02354055.1、ZP_05085930.1、ADQ00130.1、YP_003643016.1、ZP_05040520.1、YP_691922.1、AAX23098.1、BAD07371.1、NP_104379.1、YP_002551960.1、YP_003908558.1、YP_987903.1、ZP_05785860.1、YP_004145612.1、YP_004140926.1、CAZ88300.1、ZP_05041901.1、YP_533645.1、ZP_01754259.1、CBA31223.1、YP_587542.1、YP_106852.1、ZP_08402506.1、 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ZP_06972168.1、ZP_01616404.1、ZP_07659253.1、ZP_05117914.1、YP_585662.1、YP_004230016.1、NP_763554.1、NP_744101.1、ZP_02465308.1、ACN56476.1、YP_004689565.1、YP_001600608.1、ZP_06792595.1、YP_001258553.1、ZP_05165722.1、ZP_03785098.1、YP_002276744.1、YP_002524856.1、ADP98420.1、YP_001669248.1、ZP_04764988.1、ZP_08528163.1、ZP_08529409.1、ZP_05944625.1、YP_676267.1、CBA26630.1、YP_001592413.1、YP_003486465.1、ZP_02187562.1、ZP_03702891.1、YP_760283.1、ZP_05450850.1、YP_004533595.1、ZP_02153313.1、YP_001859265.1、YP_001524099.1、ZP_06126913.1、ZP_07374926.1、ZP_05050787.1、ZP_01035411.1、Q8YFY2.2、YP_002280903.1、EGM21512.1、YP_004603010.1、ZP_05088581.1、YP_004302488.1、YP_004141219.1、NP_697569.1、YP_003908705.1、YP_915505.1、YP_001789228.1、YP_001042739.1、YP_133405.1、ZP_05180516.1、ZP_05174702.1、ZP_01438051.1、ZP_04590345.1、ZP_08411937.1、NP_356519.2、ZP_00964019.1、ZP_00998343.1、ZP_05181994.1、YP_004107969.1、ZP_02168070.1、ZP_01750865.1、YP_574504.1、YP_004579902.1、YP_104440.1、ZP_05452167.1、ZP_05342702.1、YP_001862883.1、YP_004538242.1、 ZP_07471513.1、ZP_05169558.1、ZP_00956995.1、ZP_05096699.1、YP_004610916.1、ZP_01218118.1、AAU95210.1、ZP_02405087.1、ZP_04890639.1、YP_352237.1、ZP_02413594.1、ZP_07474023.1、NP_541317.1、YP_001993222.1、ZP_08199001.1、YP_471839.1、ZP_02492080.1、ZP_04901176.1、ZP_06915396.1、ZP_07474845.1、ZP_07477743.1、YP_004152647.1、YP_004755056.1、ZP_05086419.1、YP_004577547.1、ACD99850.1、YP_980426.1、ZP_05457072.1、ZP_05936041.1、NP_700124.1、ADT85599.1、YP_110012.1、ZP_05076113.1、YP_001068288.1、ZP_02457871.1、ZP_01014169.1、EGE60620.1、YP_001346810.1、YP_003408795.1、YP_003769675.1、YP_001257876.1、EGH93583.1、ZP_01442222.1、YP_331617.1、ZP_05636703.1、YP_001594896.1、YP_002822967.1、YP_118823.1、ZP_01878717.1、ZP_07375284.1、YP_001371250.1、ZP_07658682.1、YP_002898825.1、ZP_01547199.1、YP_223070.1、ZP_05161482.1、ZP_04679742.1、YP_002778618.1、ZP_01626756.1、ZP_05101564.1、YP_002947374.1、NP_385053.1、YP_001328117.1、YP_004493948.1、YP_003339515.1、YP_004699488.1、ZP_05101969.1、YP_485352.1、ZP_01746033.1、ZP_06712293.1、ZP_01158125.1、ZP_01058616.1、 ZP_05739755.1、NP_949067.1、ZP_02364657.1、YP_570690.1、YP_001208663.1、ZP_02357557.1、ZP_04751682.1、YP_001326253.1、YP_487666.1、ZP_05167919.1、ADI18237.1、YP_002825245.1、ZP_02144858.1、ZP_02188790.1、ZP_06794586.1、YP_001809828.1、YP_997974.1、YP_001476791.1、ZP_08635286.1、YP_676287.1、ZP_07308228.1、ZP_04596242.1、YP_001622726.1、NP_699590.1、ZP_01446884.1、YP_001168504.1、ZP_01616388.1、ZP_05117189.1、ZP_05876432.1、ADT64694.1、ZP_01754911.1、ZP_05880498.1、ZP_02360829.1、ZP_06052433.1、ZP_08663540.1、YP_003768966.1、ZP_02165422.1、ZP_00960985.1、ZP_07026655.1、YP_001753039.1、YP_371288.1、YP_002974725.1、YP_776880.1、ZP_05784963.1、ZP_05124380.1、YP_459030.1、ZP_05090690.1、ZP_05064893.1、ZP_02367982.1、ZP_01890564.1、NP_541848.1、ZP_00960263.1、ZP_02961617.1、YP_001242097.1和ZP_05838258.1。
具體地，Edi可選自由以下所組成之群組：Q00593.1、Q9WWW2.1、ZP_00957061.1、YP_957894.1、CAC38030.1、YP_694430.1、YP_957725.1和YP_001672216.1。
酶E dii
該醇脫氫酶(Edii)可為來自細菌(特別是大腸桿菌)之選自由以下所組成之群組：AdhE、AdhP、YjgB、YqhD、GldA、EutG、YiaY、AdhE、AdhP、YhhX、YahK、HdhA、HisD、SerA、Tdh、Ugd、Udg、Gmd、YefA、YbiC、YdfG、YeaU、TtuC、YeiQ、YgbJ、YgcU、YgcT、YgcV、YggP、YgjR、YliI、YqiB、YzzH、LdhA、GapA、Epd、Dld、GatD、Gcd、GlpA、GlpB、GlpC、GlpD、GpsA和YphC。
酶E 3
酶E3能夠將至少一種1-烷醛轉化為相應之烷酸。具體地，酶E3可選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)或雙官能醇脫氫酶(Edii)，能夠將1-烷醇經由1-烷醛直接氧化為相應之烷酸，和醛脫氫酶(Ee)。
酶E e
酶Ee(醛脫氫酶)，可以是能夠催化以下的轉化
ω-氧代烷酸(酯)=ω-羧基烷酸(酯)。
為了催化上述反應，Ee可為EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.5之醛脫氫酶、EC 1.1.3.20之脂肪醇氧化酶、 EC 1.1.99.-之AlkJ醇脫氫酶和EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶。
在一個實例中，Ee可以是能夠特異性催化下列反應：ω-氧代烷酸(酯)+NAD(P)+=ω-羧基烷酸(酯)+NAD(P)H+H+
在這種情況下，酶Ee可為EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.5之醛脫氫酶，且可為來自細菌(特別是大腸桿菌)之選自由以下所組成之群組：Prr、Usg、MhpF、AstD、GdhA、FrmA、Feab、Asd、Sad、PuuE、GabT、YgaW、BetB、PutA、PuuC、FeaB、AldA、Prr、EutA、GabD、AldB、TynA和YneI。
在另一實例中，酶Ee可以是能夠催化下列反應：ω-氧代烷酸(酯)+O2=ω-羧基烷酸(酯)+H2O2
在這種情況下，Ee可為EC 1.1.3.20之脂肪醇氧化酶，且可選自由以上所提供為酶Ec之列表。
在另一實例中，Ee可為至少一種EC 1.1.99之AlkJ醇脫氫酶，且可選自由以上所提供為Edi之列表。
在另外的實例中，Ee可為EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶，其選自由提供為酶Edii之列表。
酶E 4
酶E4能夠將至少一種烷酸轉化為相應之烷酸酯。具體地，酶E4可為至少一種蠟-酯合成酶，也稱為醇O-醯基轉移酶(EC 2.3.1.20、EC 2.3.1.75)(Ef)，或醇O-醯基轉移 酶(Eg)(EC 2.3.1.20、EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.84)。
在一個實例中，E4可為至少一種蠟-酯合成酶(Ef)。更具體地，E4可包含與醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)ADP1或河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)之O-乙醯基轉移酶至少50%的序列一致性。甚至更具體地，E4可包含與多肽YP_045555.1、WP_011398768.1或NP_808414.2至少50%的序列一致性。更具體地，E4可包含與選自由多肽YP_045555.1、WP_011398768.1和NP_808414.2之多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%的序列一致性之多肽。在一個實例中，E4可包含與SEQ ID NO：2具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%的序列一致性之多肽。
酶E f
特別是，該酶Ef可選自由以下所組成之群組：WP_011398768.1、NP_808414.2、NP_001178653.1、XP_003272721.1、XP_002720111.1、NP_001002254.1、XP_529027.1、XP_002831804.1、BAC28882.1、XP_549056.2、XP_002918053.1、XP_001085075.1、XP_002763005.1、XP_002700092.1、XP_599558.4、EDL95940.1、XP_001496780.1、CAD89267.1、EFB28125.1、YP_004747160.1、YP_004746900.1、YP_004746665.1、YP_004746558.1、YP_004746531.1、 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ZP_07282351.1、ZP_07282257.1、ZP_07278697.1、ZP_07277986.1、ZP_07277799.1、ZP_07011797.1、ZP_06913634.1、ZP_06711075.1、ZP_06575037.1、ZP_06523715.1、ZP_06522644.1、ZP_06520408.1、ZP_06518751.1、ZP_06514733.1、ZP_06511304.1、ZP_06510466.1、ZP_06509700.1、ZP_06504004.1、ZP_06452618.1、ZP_06451687.1、ZP_06450049.1、ZP_06444722.1、ZP_06443996.1、ZP_06443677.1、ZP_06438510.1、ZP_06435077.1、ZP_06434554.1、ZP_06432969.1、ZP_06431341.1、ZP_06430915.1、ZP_05129423.1、ZP_05127637.1、ZP_05126217.1、ZP_05096686.1、ZP_05095013.1、ZP_05094400.1、ZP_05093434.1、ZP_05043539.1、ZP_05041631.1、ZP_04959394.1、ZP_04956551.1、ZP_01052702.1、YP_437020.1、YP_436128.1、YP_432512.1、YP_432391.1、ZP_06072118.1、ZP_06069021.1、ZP_06065092.1、ZP_06062254.1、YP_003032200.1、YP_003030813.1、YP_002766854.1、YP_002766842.1、YP_002766292.1、YP_002765623.1、YP_002765076.1、YP_002764977.1、YP_002764976.1、YP_002764693.1、YP_002764633.1、YP_002646305.1、YP_002646304.1、YP_001853537.1、YP_001853530.1、YP_001853214.1、YP_001852100.1、YP_001851711.1、YP_001851686.1、YP_001851684.1、YP_001851611.1、YP_001851610.1、 YP_001851579.1、YP_001850950.1、YP_001850935.1、YP_001850900.1、YP_001850899.1、YP_001850378.1、YP_001849911.1、YP_001849825.1、YP_001849624.1、YP_001849470.1、YP_001848848.1、YP_001848784.1、YP_001822237.1、YP_001289190.1、YP_001289078.1、YP_001288434.1、YP_001287727.1、YP_001286168.1、YP_001085790.1、YP_856793.1、YP_629387.1、YP_615587.1、YP_615252.1、YP_457389.1、YP_263530.1、NP_962591.1、NP_962411.1、NP_962281.1、NP_961234.1、NP_960903.1、NP_960387.1、NP_960090.1、NP_959281.1、NP_959065.1、NP_857403.1、NP_857149.1、NP_857148.1、NP_857047.1、NP_856907.1、NP_856759.1、NP_856156.1、NP_855443.1、NP_855112.1、NP_853892.1、NP_828432.1、NP_603766.1、XP_003081224.1、YP_003778608.1、YP_003730939.1、XP_003059244.1、ADI13131.1、XP_002992800.1、XP_002963877.1、XP_001419779.1、XP_002988280.1、XP_002987493.1、CBH32551.1、CBH32550.1、CBH19575.1、CBH19574.1、YP_003627553.1、XP_002879777.1、XP_002877657.1、XP_002877655.1、XP_002873570.1、XP_002871716.1、XP_002870738.1、XP_002868506.1、XP_002865972.1、XP_002864239.1、XP_002862308.1、ZP_05823139.1、 NP_001043877.1、ZP_06693274.1、ZP_06058985.1、NP_001044374.1、XP_002835451.1、XP_002787542.1、XP_002785958.1、XP_002785645.1、XP_002783220.1、XP_002774061.1、XP_002767852.1、XP_002766051.1、XP_002765456.1、XP_002765455.1、XP_002677788.1、XP_002671612.1、XP_002736281.1、CBA31373.1、XP_002184474.1、XP_002325936.1、XP_002323705.1、XP_002325937.1、XP_002323911.1、XP_002323706.1、XP_002328965.1、XP_002318416.1、XP_002310400.1、ACY38597.1、ACY38596.1、ACY38595.1、ACY38594.1、ACY38593.1、ACY38592.1、ACY38591.1、ACY38590.1、ACX81315.1、ACX81314.1、XP_001868729.1、XP_001847517.1、XP_001847515.1、XP_002502575.1、ACU20370.1、ACU18073.1、XP_002523348.1、XP_002516707.1、XP_002429016.1、BAH89673.1、XP_002440221.1、XP_002459294.1、XP_002458560.1、XP_320167.4、XP_001780431.1、XP_002364905.1、XP_002263196.1、XP_002263137.1、XP_002263409.1、XP_002263252.1、XP_002268615.1、XP_002278404.1、XP_002274522.1、XP_002282418.1、XP_001633379.1、XP_001632267.1、XP_001632004.1、XP_001622638.1、XP_002155609.1、XP_759225.1、XP_002152406.1、XP_001914129.1、XP_001738032.1、XP_001731626.1、XP_001209859.1、CAN79451.1、CAN78449.1、 CAN72806.1、CAN71951.1、CAN71950.1、CAN76656.1、CAN62907.1、AAZ08051.1、ABO21022.1、ABO21021.1、ABO21020.1、ABJ96321.1、BAF01088.1、XP_758106.1、BAC42871.1、BAB09801.1和BAB09102.1。
在另一個實例中，該酶Ef可選自由下列NCBI基因識別碼所組成之群組：6647910、13882037、13883719、50084045、83635736、118163591、118569740、118570272、119538589、119959533、126237252、126567232、126629771、148572721、148572722、149823553、149825234、169147806、196196001、214037899、219677786、257447091、262316603、283813570、301796553、301796826、311312714、311696766、325556018、332970561、333482117、333482229、333482837、333484048、334890574、334890744、353189260、358244577、359308666、359732244、359818908、363993190、365814880、374845325、377531673、378802538、384523048、391857871、391858262、391861199、396932954、396935129、399235093、400203587、407372801、407812577、432156225、433296179、442581482、443888426、444755700、449424446、464803513、479864102、479886236、479966651、480005669、480024154、480028610、490485999、498274456、500625946、 515076064、516264416、516277644、516906883、516908681、516909557、516913828、516945324、517143888、517432433、517516200、518350146、518501601、518568414、518644062、518944419、518947555、521014811、521056034、521076792、521077398、521090665、521712969、521812448、521986522、522129827、522136843、522139413和522139737。
酶E g
具體地，該酶Eg可選自由以下所組成之群組：EGA72844.1、NP_015022.1、S69991、AAP72991.1、EDN63695.1、BAA05552.1、AAP72992.1、S69992、AAP72995.1、XP_002552712.1、XP_001646876.1、XP_002551954.1、EGA82692.1、EDN61766.1、EGA86689.1、EGA74966.1、AAU09735.1、NP_011693.1、XP_445666.1、BAA13067.1、AAP72993.1、EGA62172.1、XP_455762.1和EGA58658.1。
酶E 5
酶E5能夠將至少一種烷酸酯轉化為相應之ω-羥基-烷酸酯。具體地，E5可為任何列為E1之酶。具體地，E5可為至少一種EC 1.14.15.3之P450烷羥化酶(Ea)或EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)。
酶E 6
酶E6能夠將至少一種ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯。具體地，E6可為任何列為E2之酶。具體地，E6可選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之醇氧化酶(Ec)和EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶(Ed)。
關於酶E6所使用的用語「當存在時」是指已被遺傳修飾以產生ω-氧代烷酸酯的細胞。根據本發明之任一態樣的細胞可以包含相對於野生型細胞提高的酶E6之表現，因此能產生ω-氧代烷酸酯。在另一實例中，根據本發明之任一態樣的細胞也可以不包含相對於野生型細胞提高的酶E6之表現，因此不能產生ω-氧代烷酸酯。因此，這些細胞主要可產生ω-羥基-烷酸酯。從而，當根據本發明之任一態樣的細胞包含提高的酶E6表現時(即，當存在時)，則可以產生ω-氧代烷酸酯。
酶E 7
酶E7能夠將至少一種ω-氧代烷酸轉化為相應之ω-胺基烷酸酯。具體地，E7可為EC 2.6.1之ω-轉胺酶(Eh)。
具體地，該酶E7可為選自由以下所組成之群組的胺基轉移酶(Eh)： 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)(WP_016502144；WP_016500675.1)、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)(NP_901695.1)、類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1(YP_353455.1)和3HMU_A、AAD41041.1、AAK15486.1、ABE03917.1、ADR60699.1、ADR61066.1、ADR62525.1、AEL07495.1、CAZ86955.1、EFW82310.1、EFW87681.1、EGC99983.1、EGD03176.1、EGE58369.1、EGH06681.1、EGH08331.1、EGH24301.1、EGH32343.1、EGH46412.1、EGH55033.1、EGH62152.1、EGH67339.1、EGH70821.1、EGH71404.1、EGH78772.1、EGH85312.1、EGH97105.1、EGP57596.1、NP_102850.1、NP_106560.1、NP_248912.1、NP_248990.1、NP_354026.2、NP_421926.1、NP_637699.1、NP_642792.1、NP_744329.1、NP_744732.1、NP_747283.1、NP_795039.1、XP_002943905.1、YP_001021095.1、YP_001059677.1、YP_001061726.1、YP_001066961.1、YP_001074671.1、YP_001120907.1、YP_001140117.1、YP_001170616.1、YP_001185848.1、YP_001188121.1、YP_001233688.1、YP_001268866.1、YP_001270391.1、YP_001345703.1、YP_001412573.1、YP_001417624.1、YP_001526058.1、YP_001579295.1、YP_001581170.1、YP_001668026.1、YP_001669478.1、YP_001671460.1、YP_001685569.1、YP_001747156.1、YP_001749732.1、YP_001765463.1、YP_001766294.1、 YP_001790770.1、YP_001808775.1、YP_001809596.1、YP_001859758.1、YP_001888405.1、YP_001903233.1、YP_001977571.1、YP_002229759.1、YP_002231363.1、YP_002280472.1、YP_002297678.1、YP_002543874.1、YP_002549011.1、YP_002796201.1、YP_002801960.1、YP_002875335.1、YP_002897523.1、YP_002912290.1、YP_002974935.1、YP_003060891.1、YP_003264235.1、YP_003552364.1、YP_003578319.1、YP_003591946.1、YP_003607814.1、YP_003641922.1、YP_003674025.1、YP_003692877.1、YP_003755112.1、YP_003896973.1、YP_003907026.1、YP_003912421.1、YP_004086766.1、YP_004142571.1、YP_004147141.1、YP_004228105.1、YP_004278247.1、YP_004305252.1、YP_004356916.1、YP_004361407.1、YP_004378186.1、YP_004379856.1、YP_004390782.1、YP_004472442.1、YP_004590892.1、YP_004612414.1、YP_004676537.1、YP_004693233.1、YP_004701580.1、YP_004701637.1、YP_004704442.1、YP_108931.1、YP_110490.1、YP_168667.1、YP_237931.1、YP_260624.1、YP_262985.1、YP_271307.1、YP_276987.1、YP_334171.1、YP_337172.1、YP_350660.1、YP_351134.1、YP_364386.1、YP_366340.1、YP_369710.1、YP_370582.1、YP_426342.1、YP_440141.1、YP_442361.1、YP_468848.1、YP_521636.1、 YP_554363.1、YP_608454.1、YP_610700.1、YP_614980.1、YP_622254.1、YP_625753.1、YP_680590.1、YP_751687.1、YP_767071.1、YP_774090.1、YP_774932.1、YP_788372.1、YP_858562.1、YP_928515.1、YP_983084.1、YP_995622.1、ZP_00948889.1、ZP_00954344.1、ZP_00959736.1、ZP_00998881.1、ZP_01011725.1、ZP_01037109.1、ZP_01058030.1、ZP_01076707.1、ZP_01103959.1、ZP_01167926.1、ZP_01224713.1、ZP_01442907.1、ZP_01446892.1、ZP_01550953.1、ZP_01625518.1、ZP_01745731.1、ZP_01750280.1、ZP_01754305.1、ZP_01763880.1、ZP_01769626.1、ZP_01865961.1、ZP_01881393.1、ZP_01901558.1、ZP_02145337.1、ZP_02151268.1、ZP_02152332.1、ZP_02167267.1、ZP_02190082.1、ZP_02242934.1、ZP_02360937.1、ZP_02367056.1、ZP_02385477.1、ZP_02456487.1、ZP_02883670.1、ZP_03263915.1、ZP_03263990.1、ZP_03400081.1、ZP_03452573.1、ZP_03456092.1、ZP_03517291.1、ZP_03529055.1、ZP_03571515.1、ZP_03572809.1、ZP_03587785.1、ZP_03588560.1、ZP_03697266.1、ZP_03697962.1、ZP_04521092.1、ZP_04590693.1、ZP_04890914.1、ZP_04891982.1、ZP_04893793.1、ZP_04902131.1、ZP_04905327.1、ZP_04941068.1、ZP_04944536.1、 ZP_04945255.1、ZP_04959332.1、ZP_04964181.1、ZP_05053721.1、ZP_05063588.1、ZP_05073059.1、ZP_05077806.1、ZP_05082750.1、ZP_05091128.1、ZP_05095488.1、ZP_05101701.1、ZP_05116783.1、ZP_05121836.1、ZP_05127756.1、ZP_05637806.1、ZP_05742087.1、ZP_05783548.1、ZP_05786246.1、ZP_05843149.1、ZP_05945960.1、ZP_06459045.1、ZP_06487195.1、ZP_06492453.1、ZP_06493162.1、ZP_06703644.1、ZP_06731146.1、ZP_06839371.1、ZP_07007312.1、ZP_07266194.1、ZP_07374050.1、ZP_07662787.1、ZP_07778196.1、ZP_07797983.1、ZP_08099459.1、ZP_08138203.1、ZP_08141719.1、ZP_08142973.1、ZP_08177102.1、ZP_08185821.1、ZP_08186468.1、ZP_08208888.1、ZP_08266590.1、ZP_08402041.1、ZP_08406891.1、ZP_08522175.1、ZP_08527488.1、ZP_08631252.1、ZP_08636687.1。
具體地，該酶E7可為選自由以下所組成之群組的胺基轉移酶(Eh)：NP_901695.1、ZP_03697266.1、AAD41041.1、YP_002796201.1、ZP_03697962.1、YP_001859758.1、YP_002229759.1、YP_001120907.1、YP_110490.1、ZP_04964181.1、YP_774932.1、YP_001766294.1、YP_001581170.1、YP_622254.1、ZP_03588560.1、YP_001809596.1、YP_370582.1、ZP_03572809.1、 NP_248990.1、YP_001888405.1、ZP_04905327.1、YP_001061726.1、YP_001668026.1、ZP_01750280.1、ZP_07778196.1、EGH71404.1、NP_744329.1、YP_004147141.1、ADR61066.1、ZP_05783548.1、YP_004701637.1、YP_366340.1、YP_003264235.1、EGD03176.1、YP_001268866.1、ZP_01901558.1、ZP_05121836.1、YP_003692877.1、ZP_03517291.1、YP_002974935.1、YP_001668026.1、ADR61066.1、NP_744329.1、YP_001268866.1、YP_004701637.1、ZP_08142973.1、ADR62525.1、YP_610700.1、NP_747283.1、ADR62525.1、YP_001270391.1、YP_004704442.1、YP_610700.1、YP_001747156.1、ZP_08138203.1、ZP_07266194.1、EGH70821.1、YP_351134.1、EGH32343.1、EGH08331.1、EGH67339.1、YP_001668026.1、YP_004701637.1、YP_237931.1、ZP_03400081.1、ZP_05116783.1、ZP_01550953.1、ZP_07662787.1、YP_928515.1、YP_788372.1、YP_001021095.1、ZP_07797983.1、YP_003578319.1、YP_004305252.1、NP_248912.1、ZP_08636687.1、YP_003912421.1、YP_751687.1、ZP_08142973.1、YP_271307.1、ZP_05082750.1、YP_001417624.1和YP_353455.1。
關於酶E7所使用的用語「當存在時」是指已被遺傳修飾以產生ω-胺基烷酸酯的細胞。根據本發明之任一態 樣的細胞可以包含相對於野生型細胞提高的酶E7之表現，因此能產生ω-胺基烷酸酯。在另一實例中，根據本發明之任一態樣的細胞也可以不包含相對於野生型細胞提高的酶E7之表現，因此不能產生ω-胺基烷酸酯。因此，這些細胞主要可產生ω-氧代-烷酸酯。在一個實例中，包含相對於野生型細胞提高的酶E6而非E7的表現之細胞可能能夠產生ω-氧代-烷酸酯。在另一實例中，當細胞未被遺傳修飾以提高E6而非E7的表現時，細胞可以產生ω-羥基烷酸酯。
酶E h
具體地，該酶Eh可選自由以下所組成之群組：3HMU_A、AAD41041.1、AAK15486.1、ABE03917.1、ADR60699.1、ADR61066.1、ADR62525.1、AEL07495.1、CAZ86955.1、EFW82310.1、EFW87681.1、EGC99983.1、EGD03176.1、EGE58369.1、EGH06681.1、EGH08331.1、EGH24301.1、EGH32343.1、EGH46412.1、EGH55033.1、EGH62152.1、EGH67339.1、EGH70821.1、EGH71404.1、EGH78772.1、EGH85312.1、EGH97105.1、EGP57596.1、NP_102850.1、NP_106560.1、NP_248912.1、NP_248990.1、NP_354026.2、NP_421926.1、NP_637699.1、NP_642792.1、NP_744329.1、NP_744732.1、NP_747283.1、NP_795039.1、NP_901695.1、XP_002943905.1、 YP_001021095.1、YP_001059677.1、YP_001061726.1、YP_001066961.1、YP_001074671.1、YP_001120907.1、YP_001140117.1、YP_001170616.1、YP_001185848.1、YP_001188121.1、YP_001233688.1、YP_001268866.1、YP_001270391.1、YP_001345703.1、YP_001412573.1、YP_001417624.1、YP_001526058.1、YP_001579295.1、YP_001581170.1、YP_001668026.1、YP_001669478.1、YP_001671460.1、YP_001685569.1、YP_001747156.1、YP_001749732.1、YP_001765463.1、YP_001766294.1、YP_001790770.1、YP_001808775.1、YP_001809596.1、YP_001859758.1、YP_001888405.1、YP_001903233.1、YP_001977571.1、YP_002229759.1、YP_002231363.1、YP_002280472.1、YP_002297678.1、YP_002543874.1、YP_002549011.1、YP_002796201.1、YP_002801960.1、YP_002875335.1、YP_002897523.1、YP_002912290.1、YP_002974935.1、YP_003060891.1、YP_003264235.1、YP_003552364.1、YP_003578319.1、YP_003591946.1、YP_003607814.1、YP_003641922.1、YP_003674025.1、YP_003692877.1、YP_003755112.1、YP_003896973.1、YP_003907026.1、YP_003912421.1、YP_004086766.1、YP_004142571.1、YP_004147141.1、YP_004228105.1、YP_004278247.1、YP_004305252.1、YP_004356916.1、YP_004361407.1、YP_004378186.1、YP_004379856.1、YP_004390782.1、YP_004472442.1、YP_004590892.1、 YP_004612414.1、YP_004676537.1、YP_004693233.1、YP_004701580.1、YP_004701637.1、YP_004704442.1、YP_108931.1、YP_110490.1、YP_168667.1、YP_237931.1、YP_260624.1、YP_262985.1、YP_271307.1、YP_276987.1、YP_334171.1、YP_337172.1、YP_350660.1、YP_351134.1、YP_364386.1、YP_366340.1、YP_369710.1、YP_370582.1、YP_426342.1、YP_440141.1、YP_442361.1、YP_468848.1、YP_521636.1、YP_554363.1、YP_608454.1、YP_610700.1、YP_614980.1、YP_622254.1、YP_625753.1、YP_680590.1、YP_751687.1、YP_767071.1、YP_774090.1、YP_774932.1、YP_788372.1、YP_858562.1、YP_928515.1、YP_983084.1、YP_995622.1、ZP_00948889.1、ZP_00954344.1、ZP_00959736.1、ZP_00998881.1、ZP_01011725.1、ZP_01037109.1、ZP_01058030.1、ZP_01076707.1、ZP_01103959.1、ZP_01167926.1、ZP_01224713.1、ZP_01442907.1、ZP_01446892.1、ZP_01550953.1、ZP_01625518.1、ZP_01745731.1、ZP_01750280.1、ZP_01754305.1、ZP_01763880.1、ZP_01769626.1、ZP_01865961.1、ZP_01881393.1、ZP_01901558.1、ZP_02145337.1、ZP_02151268.1、ZP_02152332.1、ZP_02167267.1、ZP_02190082.1、ZP_02242934.1、 ZP_02360937.1、ZP_02367056.1、ZP_02385477.1、ZP_02456487.1、ZP_02883670.1、ZP_03263915.1、ZP_03263990.1、ZP_03400081.1、ZP_03452573.1、ZP_03456092.1、ZP_03517291.1、ZP_03529055.1、ZP_03571515.1、ZP_03572809.1、ZP_03587785.1、ZP_03588560.1、ZP_03697266.1、ZP_03697962.1、ZP_04521092.1、ZP_04590693.1、ZP_04890914.1、ZP_04891982.1、ZP_04893793.1、ZP_04902131.1、ZP_04905327.1、ZP_04941068.1、ZP_04944536.1、ZP_04945255.1、ZP_04959332.1、ZP_04964181.1、ZP_05053721.1、ZP_05063588.1、ZP_05073059.1、ZP_05077806.1、ZP_05082750.1、ZP_05091128.1、ZP_05095488.1、ZP_05101701.1、ZP_05116783.1、ZP_05121836.1、ZP_05127756.1、ZP_05637806.1、ZP_05742087.1、ZP_05783548.1、ZP_05786246.1、ZP_05843149.1、ZP_05945960.1、ZP_06459045.1、ZP_06487195.1、ZP_06492453.1、ZP_06493162.1、ZP_06703644.1、ZP_06731146.1、ZP_06839371.1、ZP_07007312.1、ZP_07266194.1、ZP_07374050.1、ZP_07662787.1、ZP_07778196.1、ZP_07797983.1、ZP_08099459.1、ZP_08138203.1、ZP_08141719.1、ZP_08142973.1、ZP_08177102.1、ZP_08185821.1、ZP_08186468.1、ZP_08208888.1、ZP_08266590.1、ZP_08402041.1、ZP_08406891.1、ZP_08522175.1、 ZP_08527488.1、ZP_08631252.1和ZP_08636687.1。
可將根據本發明之任一態樣的細胞進行遺傳修飾，以提高酶E1至E5相對於野生型細胞的表現。可將該細胞另外進行遺傳修飾，以提高至少酶E6和/或E7的表現。在一個實例中，該酶E1、E2、E3、E5和E6可為至少一種AlkB烷羥化酶(Eb)，且酶E4可為蠟-酯合成酶(Ef)。具體地，- 該AlkB烷羥化酶(Eb)包含相對於SEQ ID NO：1之至少60%序列一致性；且- 該蠟-酯合成酶(Ef)包含相對於SEQ ID NO：2之至少60%序列一致性。
在另一實例中，當根據本發明之任一態樣的細胞經遺傳修飾以生產至少一種ω-胺基烷酸酯時，該細胞可以被修飾以表現至少一種ω-轉胺酶(Eh)，其可包含相對於SEQ ID NO：3之至少60%序列一致性。
酶E 8
根據本發明之任一態樣的細胞可進一步經遺傳修飾以降低至少一種酶E8的表現，該E8在將烷轉化為ω-官能化羧酸酯的過程中分解至少一種中間體。具體地，酶E8可以是能夠在細胞的脂肪酸降解能力中發揮作用的酶。具體地，E8可選自由以下所組成之列表：醯基-輔酶A脫氫酶(Ei)(FadE)、烯醯基輔酶A水合酶(enoyl CoA hydratase)(Ej)(FadB)、3-羥醯基-輔酶A脫氫酶(Ek)(FadB)和β-酮硫解酶，也稱為3-酮醯基-輔酶A硫解酶(FadA)(E1)。
脂肪酸經由轉運/醯基-活化機制被吸收並轉移穿過細胞膜。第一個細胞內步驟涉及經由醯基-輔酶A脫氫酶(Ei)將醯基-輔酶A轉化為烯醯基-輔酶A，後者在大腸桿菌的情況下稱為FadE。可以如現有技術中描述的方式測定醯基-輔酶A脫氫酶的活性，例如，藉由在100mM MOPS，pH 7.4，0.2mM烯醯基-輔酶A，0.4mM NADH以分光光度法於340nm監測NADH的濃度。將得到的烯醯基-輔酶A經由3-羥醯基-輔酶A透過水合和氧化作用轉化為3-酮醯基-輔酶A，由烯醯基-輔酶A水合酶/(R)-3-羥醯基-輔酶A脫氫酶(Ej/Ek)(在大腸桿菌中稱為FadB和FadJ)催化。烯醯基-輔酶A水合酶/3-羥醯基-輔酶A脫氫酶活性，更具體地，產物NADH的形成可以如現有技術中描述的分光光度法測定，例如，以對FadE所概述的方式進行測定。最後，3-酮醯基-輔酶A硫解酶(E1)(大腸桿菌中的FadA和FadI)催化3-酮醯基-輔酶A的裂解，以得到醯基-輔酶A及由兩個碳原子所縮短的輸入醯基-輔酶A。可以如現有技術中(例如，Antonankov,V.等人，1997)所描述的方式測定酮醯基-輔酶A硫解酶的活性。
在一個實例中，本文所用的術語「醯基-輔酶A脫氫酶」可以是能夠催化醯基-輔酶A轉化為烯醯基-輔酶A的多肽，其作為β-氧化途徑的一部分。例如，大腸桿菌中的多肽FadE(檢索號：BAA77891.2)可為醯基-輔酶A脫氫酶。本文所用的術語「烯醯基-輔酶A水合酶」也稱為3-羥醯基-輔酶A脫氫酶，是指能夠透過水合和氧化作用催 化烯醯基-輔酶A轉化為3-酮醯基-輔酶A的多肽，其作為β-氧化途徑的一部分。例如，大腸桿菌中的多肽FadB和FadJ(檢索號：分別為BAE77457.1和P77399.1)是烯醯基-輔酶A水合酶。本文所用的術語「酮醯基-輔酶A硫解酶」可以指能夠催化3-酮醯基-輔酶A裂解的多肽，得到由兩個碳原子所縮短的醯基-輔酶A和醯基-輔酶A，作為β-氧化途徑的最終步驟。例如，大腸桿菌中的多肽FadA和FadI(檢索號分別為：YP_491599.1和P76503.1)是酮醯基-輔酶A硫解酶。
酶E 9 和E 10
可將根據本發明之任一態樣的細胞另外進行遺傳修飾，以提高以下相對於野生型細胞的表現：- 該酶E9為脂肪醯基-輔酶A甲酯酯酶BioH(Em)；和/或- 該酶E10為選自由以下所組成之群組之脂肪醯基-輔酶A硫酯酶(En)：TesA、TesB、YciA、FadM、YbfF和YbgC。
具體地，Em能夠將脂肪酸酯類水解為游離脂肪酸和相應之醇；和/或En能夠將脂肪醯基-輔酶A水解為游離脂肪酸和輔酶A。
酶E 11
根據本發明之任一態樣的細胞可包含提高至少一個轉 運蛋白相對於野生型細胞表現的另外基因突變。此另外的基因突變使細胞得以提高至少一種脂肪酸的攝取。具體地，轉運蛋白可為AlkL(SEQ ID NO：4或5)和/或FadL(SEQ ID NO：6)。相較於野生型細胞，AlkL和/或FadL可以用作為至少一個轉運蛋白。在一個實例中，細胞可以被遺傳修飾以過表現fadL和alkL基因兩者。根據本發明之任一態樣的細胞可以被另外遺傳修飾以提高AlkL和/或FadL相對於野生型細胞的表現。
在一個實例中，該酶E11可為FadL或BAA16205.1。
酶E 12
根據本發明之任一態樣的細胞可包含提高EC 6.2.1.3、EC 2.3.1.86之醯基-輔酶A合成酶(酶E12)相對於野生型細胞之表現的另外基因突變。酶E12可催化脂肪酸轉化為脂肪酸的輔酶A酯(即，分子)，其中羧基的官能基-OH以-S-輔酶A取代。例如，在大腸桿菌中的多肽FadD和FadK(檢索號：分別為BAA15609.1和NP_416216.4)是醯基-輔酶A合成酶。在另一實例中，E12可為YP_001724804.1之長鏈脂肪酸-輔酶A接合酶。
酶E 13
該酶E13能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸酯，具體地，酶E13可為如上所定義的任何酶E3，更具體而言，E13可選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3- 之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)或雙官能醇脫氫酶(Edii)，能夠將ω-羥基烷酸酯經由ω-氧代烷酸酯直接氧化為相應之ω-羧基烷酸酯；和醛脫氫酶(Ee)。
酶E 14
酶E14能夠將ω-羧基烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸二酯。具體地，酶E14可為如上所定義的任何酶E4。更具體而言，E14可為至少一種蠟-酯合成酶(Ef)或醇O-醯基轉移酶(Eg)(EC 2.3.1.20、EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.84)。
根據本發明之任一態樣的細胞不包含提高選自由下列所組成之群組的酶E20-E24中至少一者相對於野生型細胞的表現之遺傳修飾：- EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22之E20醯基-ACP硫酯酶，- EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22之E21醯基-輔酶A硫酯酶，- E22醯基-輔酶A：ACP轉醯酶，- E23聚酮合成酶，和- E24己酸合成酶。
具體地，根據本發明之任一態樣的細胞具有酶E20-E24的野生型表現。因此，根據本發明的方法，酶E20-E24 在細胞中既不過表現也不被剔除。更具體地，酶E20-E24之任一者，也就是說酶E20、E21、E22、E23或E24，所有酶E20、E21、E22、E23和E24的表現在根據本發明之任一態樣的細胞中均無經遺傳修飾。甚至更具體地，根據本發明之任一態樣的細胞可包含天然存在於細胞中的酶E20-E24之任一者的天然野生型表現。因此，根據本發明之任一態樣的細胞可被認為不包含酶E20-E24之任一者的重組表現。這是特別有利的，因為沒有提高酶E20-E24之任一者表現(即，具有酶E20-E24之任一者的野生型表現)的細胞可以容易地選擇使用烷作為形成ω-官能化羧酸酯的碳源。具體地，具有酶E20-E24之任一者表現提高的任何細胞可導致脂肪酸的產生提高，其可以用作為供具有酶E20-E24之任一者表現提高的細胞形成ω-官能化羧酸和/或其酯類的碳源。因此，具有酶E20-E24之任一者表現提高的細胞有利於使用高濃度的脂肪酸作為生產ω-官能化羧酸酯類的基質，且因此烷類不會被細胞用於形成ω-官能化羧酸酯。使用除烷類以外的其他碳源形成ω-官能化羧酸酯可能會大幅提高生產成本，因為產生更多的脂肪酸，細胞將需要其他碳來源，如葡萄糖。據此，根據本發明之任一態樣，使用根據本發明之任一態樣的細胞(其不包含提高至少一種下列酶E20-E24相對於野生型細胞之表現的遺傳修飾)從至少一種烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯。
酶E 20 -E 24
酶E20-E24在WO2013024114中分別被詳細說明，如在WO2013024114第60-79頁的酶Ei至Eiv。
根據本發明之另一態樣，提供了一種生產至少一種ω-官能化羧酸酯的方法，其中該方法包含使根據本發明之任一態樣的至少一種細胞與至少一種烷接觸的步驟。具體地，形成的ω-官能化羧酸酯可選自由以下所組成之群組：ω-羥基-烷酸、ω-氧代-烷酸、ω-羧基-烷酸、ω-胺基-烷酸酯。具體地，ω-官能化羧酸酯可為12-胺基月桂酸甲酯、12-羥基月桂酸甲酯、12-羧基月桂酸甲(二)酯和/或月桂酸甲酯和烷十二烷。在另一個實例中，生產的ω-官能化羧酸酯可為來自烷十一烷之11-胺基十一酸甲酯、11-羥基十一酸甲酯、11-羧基十一酸甲(二)酯和/或十一酸甲酯。在至少一個另外的實例中，可形成視為副產物的單官能醇類和/或醛類。
本文所用的術語「接觸」是指在水溶液中使烷和/或根據本發明之任一態樣的細胞之間直接接觸。例如，細胞和烷可能不在不同的隔間中，這些隔間由諸如無機膜的屏障隔開。如果烷是可溶解的並且可以被細胞攝取或可以擴散過生物膜，則可以簡單地將其添加到水溶液中之根據本發明之任一態樣的細胞。在溶解不足的情況下，可以在加入到水溶液之前將其溶解在合適的有機溶劑中。熟習本技術領域人士能夠藉由加入合適的有機和/或極性溶劑來製備溶解度不足之烷的水溶液。這樣的溶劑可以以包含液體有機溶劑之有機相的形式提供。在一個實例中，當液體在 25℃和標準大氣壓下時，有機溶劑或相可以被視為液體。在另一個實例中，脂肪酸可以以脂肪酸酯的形式提供，諸如分別的甲酯或乙酯。在另一個實例中，化合物和催化劑可以在活體外接觸(即，以或多或少富集或甚至純化的狀態)或者可以原位接觸(即，它們作為細胞代謝的一部分，且隨後在細胞內反應)。
術語「水溶液」與術語「水性培養基」互換使用，並且是指包含水的任何溶液，主要是將水作為可以至少暫時地用於將根據本發明之任一態樣的細胞保持在代謝活性和/或存活狀態的溶劑，並且如果需要，可包含任何另外的基質。熟習本技術領域人士熟悉於製備多種水溶液(通常是指可用於保持本發明細胞的培養基)，例如在大腸桿菌的情況下為LB培養基。將水溶液用作基本培養基(即，相對簡單的組成的培養基)是有利的，其與複合培養基相反，僅包含用於將細胞保持在代謝活性和/或存活狀態所不可或缺之最少量的一組鹽和營養素，以避免產物受到多餘副產物的不必要污染。例如，M9培養基可以用作基本培養基。
根據本發明之另一個態樣，提供了一種從烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯之方法，其中該方法包含：(a)將下列酶與烷接觸：(i)能夠將烷轉化為相應之1-烷醇的酶E1；(ii)能夠將(i)的1-烷醇轉化為相應之1-烷醛的酶E2； (iii)能夠將(ii)的1-烷醛轉化為相應之烷酸的酶E3；(iv)能夠將(iii)的烷酸轉化為相應之烷酸酯的酶E4；和(v)能夠將(iv)的烷酸酯轉化為相應之ω-羥基-烷酸酯的酶E5。
根據本發明之任一態樣的方法可包含以下步驟：(b)將下列酶與ω-羥基-烷酸酯接觸：(vi)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6；或(vii)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6和能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-胺基烷酸酯的酶E7；或(viii)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6和能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸酯的酶E13和能夠將ω-羧基烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸二酯的酶E14。
根據本發明之任一態樣所使用的酶可以與根據本發明細胞情況下所揭示的酶相同。
實例
熟習本技術領域人士將理解，在不背離申請專利範圍之範圍的情況下，可以對前面所述之較佳實施例的設計、 構造或操作進行變化或修改。例如，欲使申請專利範圍之範圍涵蓋這些變化。
實例1
使用含有烷單氧化酶和蠟酯合成酶，且在催化脂肪酸降解的酶和水解脂肪酸酯為游離脂肪酸和相應的醇之酶中減毒的全細胞生物催化劑，分別從十二烷和十一烷生產月桂酸(甲酯)和十一酸(甲酯)(以及甲酯情況下的甲醇)。
實例2
使用含有烷單氧化酶、蠟酯合成酶及ω-轉胺酶，且在催化脂肪酸降解的酶和水解脂肪酸酯為游離脂肪酸和相應的醇之酶中減毒的全細胞生物催化劑，分別從十二烷和十一烷生產12-胺基月桂酸甲酯和11-胺基十一酸甲酯。
實例3 建構用於過表現大腸桿菌fadD基因和編碼蠟酯合成酶的河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)基因的表現載體
載體pCDF-fadD_Ec-wes_Hche(SEQ ID NO：7)含有來自大腸桿菌的fadD基因(編碼醯基-輔酶A合成酶)和來自河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)的蠟酯合成酶基因(SEQ ID NO：2)，其密碼子經優化以供在大腸桿菌中表現。儘管醯基-輔酶A合成酶負責將脂肪酸活化成相應之輔酶A硫酯類，但脂肪醯基-輔酶A和醇(更具體而言是甲醇)之 間需要蠟酯合成酶以供酯形成。該載體係建基於質體pCDFDuet-1(Merck Biosciences；Nottingham,UK)，並且在tac啟動子控制下含有fadD基因，且在T5啟動子控制下含有河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)的蠟酯合成酶編碼基因。藉由PCR從大腸桿菌W3110的基因組DNA分別擴增大腸桿菌fadD以及tac和T5啟動子盒(promptor cassette)，河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)蠟酯合成酶編碼基因係藉由DNA合成獲得。使用市售之用於活體外重組的試劑盒(NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit；NEB；Frankfurt/Main,Germany)融合載體骨架和代表大腸桿菌fadD的四個DNA片段、tac和T5啟動子盒和河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)蠟酯合成酶編碼基因，以得到載體pCDF-fadD_Ec-wes_Hche(SEQ ID NO：7)。
實例4 建構能夠將烷類轉化為相應之ω-官能化脂肪酸甲酯類的大腸桿菌菌株
表現載體pBT10_alkL(參見WO/2011/131420實例1的建構細節和所列之SEQ ID NO：8)含有來自食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)之alk操縱子的alkB、alkG、alkT、alkS和alkL基因。相應之基因產物催化烷類氧化成相應之烷醇、烷醛和脂肪酸(AlkBGT)以及基質(AlkL)的攝取。此外，AlkBGT基因產物亦催化脂肪酸甲酯的氧化，一旦藉由酶(醯基-輔酶A合成酶和蠟酯合成酶)的作 用從脂肪酸和甲醇所形成(參見實例1)。載體pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)(參見WO/2013/024114實例1的構建細節和所列之SEQ ID NO：17)含有來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(編碼丙胺酸脫氫酶)之基因ald和來自紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)之Cv_2505(編碼ω-轉胺酶)。雖然ω-轉胺酶負責將OLAME和OUAME轉化為相應之胺ALAME和AUAME，但需要丙胺酸脫氫酶從丙酮酸和無機氨提供胺供體丙胺酸。
將質體pBT10_alkL和pCDF-fadD_Ec-wes_Hche加上適當時之pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)經由電穿孔轉化到大腸桿菌W3110 △bioH△fadE中，將其平鋪(plate)在可用之含有卡那黴素(kanamycin)(50μg/ml)、氨芐青黴素(ampicillin)(100μg/ml)和壯觀黴素(spectinomycin)(100μg/ml)的LB瓊脂平板(agar plate)上。藉由質體製備和限制性消化分析篩選轉化質體的存在和真實性。產生下列菌株：
‧E.coli W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche
‧E.coli W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche。
實例5 將烷類轉化為相應之ω-官能化脂肪酸甲酯的生物轉化
將菌株大腸桿菌W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/ pCDF-fadD_Ec-wes_Hche和大腸桿菌W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche進行進料-分批發酵(fed-batch fermentation)，隨後進行生物轉化，以研究它們從十二烷生產ω-羥基月桂酸甲酯(HLAME)、ω-氧代月桂酸甲酯(OLAME)、ω-胺基月桂酸甲酯(ALAME)、十二烷二酸單甲酯(DDAME)和十二烷二酸酸二甲酯(DDADME)的能力。亦對菌株進行進料-分批發酵，隨後進行生物轉化，以研究它們從十一烷生產ω-羥基十一烷酸甲酯(HUAME)、ω-氧代十一酸甲酯(OUAME)、ω-胺基十一酸甲酯(AUAME)、十一烷二酸單甲酯(UDAME)和十一烷二酸二甲酯(UDADME)的能力。這是在DASGIP的8倍平行發酵系統中進行的。
對於發酵，使用裝有塔頂攪拌器和葉輪渦輪機的1升反應器。為了監測該製程，對pH和pO2進行在線測量。OTR/CTR測量特別用於估計細胞的代謝活性和適應性(fitness)。
根據DASGIP提供的技術文獻，藉由使用pH 4.0和pH 7.0之測量溶液的兩點校準來校準pH探針。根據DASGIP提供的技術文獻製備具有所需的感測器和連接件之反應器，並安裝攪拌器軸。然後將300ml水裝入應器，並在121℃高壓滅菌20分鐘，以確保無菌性。在連接測量放大器之後，將pO2探針極化隔夜(至少6小時)。然後在清潔工作台上移除水，並以高細胞密度培養基置換，該 高細胞密度培養基由以下所組成：(NH4)2SO4 1.76g/l、K2HPO4 19.08g/l、KH2PO4 12.5g/l、酵母萃取物6.66g/l、檸檬酸三鈉二水合物11.2g/l、17ml/l之過濾滅菌的1%強度之檸檬酸鐵銨(ammonium iron citrate)溶液、及5ml/l之過濾滅菌的微量元素儲備溶液(其由以下所組成：HCl(37%)36.50g/l、MnCl2*4 H2O 1.91g/l、ZnSO4*7 H2O 1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、H3BO3 0.30g/l、Na2MoO4*2 H2O 0.25g/l、CaCl2*2 H2O 4.70g/l、FeSO4*7 H2O 17.80g/l、CuCl2*2 H2O 0.15g/l)與15g/l葡萄糖作為碳源(藉由計量加入30ml/l的無菌進料溶液加入，該無菌進料溶液由以下所組成：500g/l葡萄糖、1%(w/v)MgSO4*7 H2O和2.2%(w/v)NH4Cl)與50mg/l卡那黴素。
隨後，使用單點校準(攪拌器：600rpm/供氣：10sL/h空氣)將pO2探針校準至100%，並根據DASGIP提供的技術文獻藉由現場清潔方式清潔進料、校準劑和誘導劑拉伸(stretch)。為此，將試管首先用70%乙醇沖洗，然後用1M NaOH，隨後用無菌軟化水沖洗，且最後用各別的培養基填充。
將所有上述大腸桿菌菌株首先從具有50mg/l卡那黴素的LB培養基的冷凍培養物(25ml在100ml擋板搖瓶中)中在37℃和200rpm培養隔夜經約18小時。然後，將2ml該培養物轉移到第二預培養階段成為25ml高細胞密度培養基，該高細胞密度培養基由以下所組成：(NH4)2SO4 1.76g/l、K2HPO4 19.08g/l、KH2PO4 12.5g/l、酵母萃取物6.66g/l、檸檬酸三鈉二水合物11.2g/l、17ml/l之過濾滅菌的1%強度之檸檬酸鐵銨(ammonium iron citrate)溶液、及5ml/l之過濾滅菌的微量元素儲備溶液(其由以下所組成：HCl(37%)36.50g/l、MnCl2*4 H2O 1.91g/l、ZnSO4*7 H2O 1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、H3BO3 0.30g/l、Na2MoO4*2 H2O 0.25g/l、CaCl2*2 H2O 4.70g/l、FeSO4*7 H2O 17.80g/l、CuCl2*2 H2O 0.15g/l)與15g/l葡萄糖作為碳源(藉由計量加入30ml/l的無菌進料溶液加入，該無菌進料溶液由以下所組成：500g/l葡萄糖、1%(w/v)MgSO4*7 H2O和2.2%(w/v)NH4Cl)與已描述之抗生素在100ml搖瓶中，並另外以37℃/200rpm培養6小時。
為了接種(inoculate)光密度為0.1的反應器，測量第二預培養階段的OD600，並計算接種所需的培養物量。以5ml注射器將所需量的培養物通過隔膜加入熱處理和充氣反應器中。
使用下列的標準程序：
一方面用12.5%強度之氨溶液將pH調節至pH 6.8。在培養和生物轉化過程中，藉由攪拌器進料和供氣速率將培養物中的溶解氧(pO2或DO)調節為至少30%。接種後，DO從100%下降至30%，其在剩餘的發酵中保持穩定。
以進料分批進行發酵，其中進料開始是以5g/l*h葡萄糖進料(其由以下所組成：500g/l葡萄糖、1%(w/v)MgSO4*7 H2O和2.2%(w/v)NH4Cl)觸發而進行至進料階段，經由DO峰導致分批相的結束。在進料開始時，將37℃的溫度降至30℃。進料開始後10小時後，用 0.025%(v/v)DCPK誘導氧化基因的表現。在進料開始後14小時後開始進行生產(=開始生物轉化)。為此目的，將150ml十二烷或十一烷分批加入發酵液中。
為了量化發酵樣品中的LSME和HLS，在生物轉化開始後1/2/4/20/22小時採集樣品。製備這些樣品以用於實例6中所提供的分析。
實例6 建基於LC-ESI/MS 2 的產物定量
發酵樣品中之HLAME、OLAME、ALAME、DDAME和DDADME以及HUAME、OUAME、AUAME、UDAME和UDADME的定量是藉由參照所有分析物的外部校準(0.1-50mg/l)並使用內部標準胺基十一酸(對於HLSME的AUA)和d3-LSME(對於LSME)以LC-ESI/MS2所進行。
在此使用下列儀器：
‧具有自動進樣器(G1367E)、二元泵(G1312B)和柱式烘箱(G1316A)的HPLC系統1260(Agilent；Böblingen)
‧具有ESI源的質譜儀TripelQuad 6410(Agilent；Böblingen)
‧HPLC管柱：Kinetex C18,100×2.1mm，粒度：2.6μm，孔徑100Å(Phenomenex；Aschaffenburg)
‧前置管柱：KrudKatcher Ultra HPLC在線過濾器；0.5μm過濾深度和0.004mm內徑 (Phenomenex；Aschaffenburg)
藉由在2-ml反應容器中吸移1900μl溶劑(80%(v/v)乙腈、20%再蒸餾H2O(v/v)、+0.1%甲酸)和100μl樣品來製備樣品。將混合物劇烈震盪約10秒，然後以約13000rpm離心5分鐘。使用吸移管移除澄清上清液，在適當稀釋後，以稀釋液(80%(v/v)ACN、20%再蒸餾H2O(v/v)、+0.1%甲酸)進行分析。將100μL之ISTD吸移到每個900μL樣品中(對於90μL樣品體積為10μL)。
以上述管柱和前置管柱進行HPLC分離。注入體積為0.7μL，管柱溫度50℃，流速0.6mL/min。流動相由洗提液A(0.1%(v/v)甲酸水溶液)和洗提液B(含有0.1%(v/v)甲酸的乙腈)所組成。使用下列梯度分佈：
ESI-MS2分析在正電離模式下以下列之ESI源參數進行：
‧氣體溫度280℃
‧氣體流速11L/min
‧霧化壓力(Nebulizing pressure)50psi
‧毛細管電壓4000V
使用下列MRM參數進行化合物HLAME、OLAME、ALAME、DDAME、DDADME、HUAME、OUAME、AUAME、UDAME和UDADME的檢測和定量，在每種情況下使用一種產物離子作為限定劑(qualifier)，且一種作為定量劑(quantifier)。
實例7 藉由大腸桿菌W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche和大腸桿菌W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche將烷類轉化為相應之ω-官能化脂肪酸 甲酯
使用上述方案，可顯示大腸桿菌W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche可由十二烷生產DDAME和DDADME以及從十一烷生產UDAME和UDADME(見表1和2)。此外，可顯示大腸桿菌W3110 △bioH △fadE pBT10_alkL/pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)/pCDF-fadD_Ec-wes_Hche可由十二烷生產HLAME和ALAME以及由十一烷生產HUAME和AUAME(見表2和3)。
<110> 贏創德固賽有限責任公司(Evonik Degussa GmbH)
<120> ω-官能化羧酸及其酯類的生技製造
<150> EP15196180
<151> 2015-11-25
<160> 7
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 401
<212> PRT
<213> 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 1
<210> 2
<211> 458
<212> PRT
<213> 河氏溶藻菌(Hahella chejuensis)
<400> 2
<210> 3
<211> 459
<212> PRT
<213> 紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)
<400> 3
<210> 4
<211> 230
<212> PRT
<213> 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 4
<210> 5
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK L
<400> 5
<210> 6
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FADL
<400> 6
<210> 7
<211> 7387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 載體pCDF-fadD_Ec-wes_Hche
<400> 7

Claims (15)

  1. 一種用於從至少一種烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯的微生物細胞，其中將該細胞遺傳修飾以提高以下相對於野生型細胞的表現(i)能夠將烷轉化為相應之1-烷醇的酶E1；(ii)能夠將(i)的1-烷醇轉化為相應之1-烷醛的酶E2；(iii)能夠將(ii)的1-烷醛轉化為相應之烷酸的酶E3；(iv)能夠將(iii)的烷酸轉化為相應之烷酸酯的酶E4；和(v)能夠將(iv)的烷酸酯轉化為相應之ω-羥基-烷酸酯的酶E5，且其中，該細胞不包含提高選自由下列所組成之群組的酶E20-E24中至少一者相對於野生型細胞的表現之遺傳修飾：- EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22之E20醯基-ACP硫酯酶，- EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22之E21醯基-輔酶A硫酯酶，- E22醯基-輔酶A：ACP轉醯酶，- E23聚酮合成酶，和- E24己酸合成酶。
  2. 如請求項1之細胞，其中將該細胞另外遺傳修飾 以提高以下相對於野生型細胞的表現(vi)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6；或(vii)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6和能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-胺基烷酸酯的酶E7；或(viii)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6和能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸酯的酶E13和能夠將ω-羧基烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸二酯的酶E14。
  3. 如請求項1或2之細胞，其中- 該酶E1係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)和EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)；- 該酶E2係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之醇氧化酶(Ec)和EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶(Ed)；- 該酶E3係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醛脫氫酶(Ee)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)和雙官能醇脫氫酶 (Edii)，其中Ec、Edi、和Edii能夠將ω-羥基烷酸酯直接氧化為相應之ω-羧基烷酸酯；- 該酶E4係選自由以下所組成之群組：EC 2.3.1.75之蠟-酯合成酶(Ef)或EC 2.3.1.84之醇O-醯基轉移酶(Eg)；- 該酶E5係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)和EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)；- 該酶E6係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、EC 1.1.3.20之醇氧化酶(Ec)、醛脫氫酶(Ee)和EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之醇脫氫酶(Ed)；- 當存在時，該酶E7係EC 2.6.1之ω-轉胺酶(Eh)；- 當存在時，該酶E13係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醛脫氫酶(Ee)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)和雙官能醇脫氫酶(Edii)，其中Ec、Edi、和Edii能夠將ω-羥基烷酸酯經由ω-氧代烷酸酯直接氧化為相應之ω-羧基烷酸酯；及- 當存在時，該酶E14係選自由以下所組成之群組：EC 2.3.1.75之蠟-酯合成酶(Ef)或EC 2.3.1.84 之醇O-醯基轉移酶(Eg)。
  4. 如前述請求項中任一項之細胞，其中該酶E1、E2、E3、E5和E6係至少一種AlkB烷羥化酶(Eb)，且酶E4係蠟-酯合成酶(Ef)。
  5. 如請求項4之細胞，其中- 該AlkB烷羥化酶(Eb)包含相對於SEQ ID NO：1之至少60%序列一致性；- 該蠟-酯合成酶(Ef)包含相對於SEQ ID NO：2之至少60%序列一致性；且- 當存在時，該ω-轉胺酶(Eh)包含相對於SEQ ID NO：3之至少60%序列一致性。
  6. 如前述請求項中任一項之細胞，其中將該細胞另外遺傳修飾以提高相對於野生型細胞以下至少一者的表現：EC 6.2.1.3或EC 2.3.1.86之醯基-輔酶A合成酶(acyl-CoA synthetase)(E12)。
  7. 一種生產至少一種ω-官能化羧酸酯之方法，其中該方法包含將如請求項1至6項中任一項之至少一種細胞與至少一種烷接觸的步驟。
  8. 如請求項7之方法，其中- 該ω-官能化羧酸酯係來自烷十二烷(alkane dodecane)之12-胺基月桂酸甲酯、12-羥基月桂酸甲酯、12-羧基月桂酸甲(二)酯和/或月桂酸甲酯；和/或- 該ω-官能化羧酸酯係來自烷十一烷(alkane undecane)之11-胺基十一酸甲酯、11-羥基十一酸甲酯、11-羧基十一酸甲(二)酯和/或十一酸甲酯。
  9. 一種從烷生產至少一種ω-官能化羧酸酯之方法，其中該方法包含：(a)將下列酶與烷接觸：(i)能夠將烷轉化為相應之1-烷醇的酶E1；(ii)能夠將(i)的1-烷醇轉化為相應之1-烷醛的酶E2；(iii)能夠將(ii)的1-烷醛轉化為相應之烷酸的酶E3；(iv)能夠將(iii)的烷酸轉化為相應之烷酸酯的酶E4；和(v)能夠將(iv)的烷酸酯轉化為相應之ω-羥基-烷酸酯的酶E5。
  10. 如請求項9之方法，其中該方法包含(b)將下列酶與ω-羥基-烷酸酯接觸：(vi)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6；或(vii)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6和能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-胺基烷酸酯的酶E7；或(viii)能夠將(v)的相應之ω-羥基-烷酸酯轉化為相應之ω-氧代烷酸酯的酶E6和能夠將ω-氧代烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸酯的酶E13和能夠將(vi)的ω-羧基烷酸酯轉化為相應之ω-羧基烷酸二酯的酶E14。
  11. 如請求項9或10之方法，其中- 該酶E1係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3之P450烷羥化酶(Ea)和AlkB烷羥化酶(Eb)；- 該酶E2係選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醇氧化酶(Ec)和醇脫氫酶(Ed)；- 該酶E3係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醛脫氫酶(Ee)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)和雙官能醇脫氫酶(Edii)，其中Ec、Edi、和Edii能夠將1-烷醇經由1-烷醛直接氧化為相應之烷酸；- 該酶E4係選自由以下所組成之群組：蠟-酯合成酶(Ef)和醇O-醯基轉移酶(Eg)；- 該酶E5係選自由以下所組成之群組：EC 1.14.15.3之P450烷羥化酶(Ea)和AlkB烷羥化酶(Eb)；- 且當存在時，該酶E6係選自由以下所組成之群組：P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醇氧化酶(Ec)和醇脫氫酶(Ed)；- 當存在時，該酶E7係ω-轉胺酶(Eh)；- 當存在時，該酶E13係選自由以下所組成之群 組：EC 1.14.15.3-之P450烷羥化酶(Ea)、EC 1.14.15.3之AlkB烷羥化酶(Eb)、醛脫氫酶(Ee)、EC 1.1.3.20之雙官能醇氧化酶(Ec)、EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2之雙官能AlkJ醇脫氫酶(Edi)和雙官能醇脫氫酶(Edii)，其中Ec、Edi、和Edii能夠將ω-羥基烷酸酯經由ω-氧代烷酸酯直接氧化為相應之ω-羧基烷酸酯；且- 當存在時，該酶E14係選自由以下所組成之群組：蠟-酯合成酶(Ef)和醇O-醯基轉移酶(Eg)。
  12. 如請求項9至11項中任一項之方法，其中該酶E1、E2、E3和E5係至少一種AlkB烷羥化酶(Eb)，且當存在時，酶E6係至少一種AlkB烷羥化酶(Eb)且酶E4係蠟-酯合成酶(Ef)。
  13. 如請求項9至12項中任一項之方法，其中，將該些酶與烷以細胞經遺傳修飾以提高相對於野生型細胞之酶E1至E5及任意地E6和E7表現的形式接觸。
  14. 如請求項13之方法，其中該細胞係選自由以下所組成之群組：大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌種(Pseudomonas sp.)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、不動桿菌屬種(Acinetobacter sp.)、伯克氏菌屬種(Burkholderia sp.)、泰國伯克霍爾德氏菌(Burkholderia thailandensis)、藍綠菌(Cyanobakterien)、克雷伯氏菌屬種(Klebsiella sp.)、產 酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、沙門氏菌屬種(Salmonella sp.)、根瘤菌屬種(Rhizobium sp.)和苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、芽孢桿菌種(Bacillus sp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、梭狀芽胞桿菌種(Clostridium sp.)、棒狀桿菌種(Corynebacterium sp.)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、短桿菌種(Brevibacterium sp.)、小球藻種(Chlorella sp.)和念珠藻種(Nostoc sp.)。
  15. 如請求項9至14項中任一項之方法，其中- 該ω-官能化羧酸酯係來自烷十二烷(alkane dodecane)之12-胺基月桂酸甲酯、12-羥基月桂酸甲酯、12-羧基月桂酸甲(二)酯和/或月桂酸甲酯；和/或- 該ω-官能化羧酸酯係來自烷十一烷(alkane undecane)之11-胺基十一酸甲酯、11-羥基十一酸甲酯、11-羧基十一酸甲(二)酯和/或十一酸甲酯。
TW105138454A 2015-11-25 2016-11-23 ω-官能化羧酸及其酯類之生技製造 TWI790195B (zh)

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