TWI638892B

TWI638892B - 使羧酸酯反應之方法

Info

Publication number: TWI638892B
Application number: TW102141056A
Authority: TW
Inventors: 史帝芬塞弗; 海科安德里; 莫加威索; 翰斯喬格亨尼曼; 哈羅德哈格
Original assignee: 贏創德固賽有限責任公司
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2013-11-12
Publication date: 2018-10-21
Also published as: KR102194560B1; KR20140061971A; TW201439325A; EP2730658A1; MX361669B; US20140141478A1; JP2014094006A; CN103898172A; MX2013013131A; BR102013029193A2; BR102013029193B1; ES2733312T3; AR094632A1; CN103898172B; JP6469342B2; EP2730655A1; HUE044135T2; EP2730658B1; US10745721B2; SG10201913981VA

Abstract

本發明關於一種藉由細胞使式(I)之羧酸酯反應之方法、適用於該方法之細胞及該細胞之用途，R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，且其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基，該方法包含下列步驟：a)使該細胞與該羧酸酯於水溶液中接觸，其中該細胞係重組細胞，該重組細胞相較於野生型細胞具有減少之多肽活性，該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體。

Description

使羧酸酯反應之方法

本發明關於一種藉由細胞使式(I)之羧酸酯反應之方法、適用於該方法之細胞及該細胞之用途，R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，且其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基，該方法包含下列步驟：a)使該細胞與該羧酸酯於水溶液中接觸，其中該細胞係重組細胞，該重組細胞相較於野生型細胞具有減少之多肽活性，該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體。

生物科技係關於使用各種有機體來產製特別是精緻化學品，而該等有機體具有有趣之合成能力。生技製程相較於傳統化學製程具有許多優點。首先，生技製程通常完全不須使用有害物質諸如重金屬催化劑及涉及極端pH值、壓力及溫度之反應條件。另外，生技製程所需之基礎環境通常可以較低之成本及安全之措施建立。生技相關酶之選擇性及專一性，通常顯著超過化學催化劑之該等特性，因此可減少非所欲之二次產物的形成，該非所欲之二次產物通常難以自該產物移除，且一定會在使用有機合成方法之合成中產生。最後，許多情況中生技相關有機體接受例如源自可更新原料之複雜醣化合物作為反應物。因此，生產公司可能減少對石化原料諸如石油及天然氣的依賴。

然而，建立生技製程具有許多困難，因此目前只有極少物質係藉由生技製程工業化量產，主要問題在於具有所欲合成活性之細胞不僅具有負責該合成活性之一種酶，還具有上千種酶同時存在於相同的細胞中，而且彼此競爭底物或甚至催化完全相反之反應。因此，光是在大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組中，大約80個經編碼之多肽已藉由生物資訊方法識別為水解酶，也就是藉由消耗水分子以切割特定鍵之酶。事實上，在何種條件下酶會由細胞產製及由該酶催化之反應及該反應中涉及之底物僅在少數情況中詳細闡述。因此在許多情況中不可能特別選定一種酶以用於催化特定反應。

因此，當使用細胞作為生物催化劑而非使用化學催化劑或經分離之生物催化劑時，很可能也會發生由具有所欲活性之酶產製之產物或中間物或甚至該原始反應物被另一酶轉換成非所欲二次產物之風險。雖然生物資訊之領域的進步，但仍不可能預測這種情況會不會發生及眾多酶中何者具有該非所欲之活性。

在特別是以業界所欲之化學活性物質作為活性反應物，以產製更複雜的產物時，該物質不是不可能在細胞內與該有機體之必要成分反應而產生毒性作用。若發生這種情況，該有機體生長及合成的能力將會受損，最終該細胞將會死亡，發展人無法在第一時間得知該毒性。同樣的，能耐受化學活性物質之有機體及後者之耐受濃度也無法被預測。

在涉及多種各由一酶所催化之反應之製程當中，系統之複雜性使得找尋產率或純度限制性因素更為困難。若產物產率過低，該原因可能是因為某種存在酶的濃度過低，雖然該酶不是已知可能酶當中之酶，也就是說由於合成能力不足，該反應物無法在所欲的時間表內反應或在被競爭酶降解之前反應。或者，很有可能的是，雖然酶係可檢測地以多肽形式存在於細胞中，但其不呈在該特定細胞中具有活性所需之折疊，或者遺漏迄今未知但為該活性必要之輔因子。同樣如前所述，該代謝產物可能對該細胞有毒性或者被分解。

因此，該領域之技藝人士若想建立或改善生物科技製程，將會面臨許多可能的起始點，但大多情況皆無先前技藝可提供任何特定及可執行之指示，吾人無從得知應從哪一個起始點著手以達到目的。

羧酸酯構成工業界高度需求的一群化合物，不論羧酸酯本身或其加工品皆被用來作為醫藥品、美容品、塑膠品及類似者。

然而，製造通常不僅需要酯官能基(其必須先被導入一前體)，還需要在該酯上進行進一步衍生化，且該酯官能基在過程中或後續必須不被水解。後者並不容易達成，因為許多羧酸酯即使在無催化該反應之酶存在下也很容易水解，特別是在水溶液中及在與中性pH有大幅差異之pH值下。

一種重要的進一步衍生化羧酸酯之可能作法，係氧化存在於其中之烷基鏈。此先產生一醇，該醇可照原樣被使用或可能繼續被氧化成醛或酮。該醛或酮可能被還原胺化或繼續被氧化成羧酸，該羧酸接著若需要的話可能再次被酯化。

這些多重的可能反應之中，許多是由內源性酶(即天然存在於有機體中之酶)催化，顯示不受控制之二次產物形成或代謝的問題，在藉由生物科技方法使羧酸酯反應當中特別嚴重。

在工業界具有高度需求且通常自存在於石油中之烴開始製備的一個羧酸酯實例係12-胺基十二酸甲酯(ALSME [12-Aminolaurinsäuremethylester])。ALSME是製備聚合物的重要起始材料，例如用於產製耐綸線系統。ALSME過去以低產率製程由化石原料開始生產。

WO 2009/077461敘述一種前景看好之以生物科技生產ALS或ALSME之新方法。其涉及在第一步驟中藉由單氧化酶氧化十二酸甲酯，然後藉由轉胺酶使該形成之醛反應以得到ALSME。此方法的一個缺點在於二次產物的產生，例如二羧酸，其可自該所欲之產物ALSME移除但具有難度。此會減少產率，而且使得根據PCT/EP2011/071491，可用於將產物自水性反應混合物移除之疏水性溶劑與疏水性陽離子交換劑之回收更為困難，不利於有效益的資源使用。

為了克服這些難題，本發明的目的是要提供一種使羧酸酯反應之生物科技方法，盡可能在產率、碳平衡及/或氮平衡及/或純度方面達到最高效益。

本發明的另一個目的在於提供一種使羧酸酯反應以產生胺化羧酸酯之生物科技方法，該方法在產率、碳平衡及/或氮平衡、所用劑之再利用性及/或產物純度方面都盡可能有效率。就這點上，有效率的碳平衡及/或氮平衡較佳地表示，以適當底物形式餵養給細胞以使羧酸酯反應之碳及/或氮的比例，在所欲之終產物中係盡可能地高，而不是被反應生成例如非所欲之產物。

本發明的另一目的在於改善多相反應混合物自羧酸酯反應被分離純化之能力，特別是關於用於分離純化之疏水性溶劑與液體陽離子交換劑之再利用性，及關於雙相系統中之相形成及分離，該雙相系統包含其中該羧酸酯反應發生之水相及具有有機溶劑及/或液體陽離子交換劑之有機相。

上述及其他目的係藉由本說明書之主題達成，特別是也藉由所包含之申請專利範圍的獨立項之主題達成，以附屬項作為實施態樣。

在第一態樣中，本發明所欲解決之問題係藉由一種藉由細胞使式(I)之羧酸酯反應之方法解決R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，且其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基，該方法包含下列步驟：

a)使該細胞與該羧酸酯於水溶液中接觸，其中該細胞係重組細胞，該重組細胞相較於野生型細胞具有減少之多肽活性，該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體。

在該第一態樣之第一實施態樣中，該問題係藉由另包含下列步驟之方法解決：

b)使該水溶液與包含陽離子交換劑之疏水性有機溶液接觸。

在第二態樣中，本發明所欲解決之問題係藉由一種基因剔除於增加式(I)之羧酸酯產製之用途解決，該基因編碼包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽，且該基因為重組細胞相較於對應之野生型細胞得以增加該式(I)之羧酸酯產製之基因組成的一部分，R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，且其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基，特別是具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之伸烷基。

在第三態樣中，本發明所欲解決之問題係藉由使用一種重組細胞以使式(I)之羧酸酯反應解決，該重組細胞相較於野生型細胞具有減少之多肽活性，該多肽具有SEQ ID NO 2或彼之變異體，R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，且其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基，較佳地具有至少8個碳原子之伸烷基。

在該第一、第二或第三態樣之另一實施態樣中，該問題係藉由一種方法或用途解決，其中A係飽和伸烷基，較佳地為式-(CH₂)_n-之伸烷基，其中n至少為4。

在該第一態樣之另一實施態樣中，該問題係藉由一種方法解決，其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO及 -CH₂NH₂。

在第四態樣中，本發明所欲解決之問題係藉由一種表現重組烷烴羥化酶之細胞解決，其中該包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽的活性比野生型細胞者為低。

在該第四態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種細胞解決，其中該烷烴羥化酶係選自AlkB單氧化酶及CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶中之烷烴羥化酶。

在第五態樣中，本發明所欲解決之問題係藉由一種反應混合物解決，該反應混合物包含於水溶液中如該第四態樣或彼之任何實施態樣之細胞及式(I)之羧酸酯R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基。

在該第五態樣之其他實施態樣中，該問題係藉由該反應混合物解決，其中A係具有至少4個碳原子之伸烷基，特別是飽和伸烷基，較佳為式-(CH₂)_n-之伸烷基，其中n係至少4，其中R¹較佳係選自氫、-CH₂OH、CHO及-CH₂NH₂。

在該第五態樣之一實施態樣中，該問題係藉由另包含疏水性有機溶液之反應混合物解決，該疏水性有機溶液包含陽離子交換劑。

在該第一至五態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種方法、一種細胞或一種用途解決，其中該細胞另表現轉胺酶。

在該第一至五態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種方法、一種細胞或一種用途解決，其中該細胞另表現丙胺酸去氫酶。

在該第一至五態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種方法、一種細胞或一種用途解決，其中該細胞另具有AlkL家族之蛋白。

在該第一至五態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種方法、一種細胞或一種用途解決，其中該細胞具有至少一種催化脂肪酸β-氧化之任何反應之酶活性，該活性相較於彼之野生型者為降低，其中該酶較佳為選自脂肪酸-CoA連接酶、醯基-CoA去氫酶、2,4-二烯醯基-CoA還原酶、烯醯基-CoA水合酶及3-酮醯基-CoA硫解酶、脂肪酸輸入蛋白或彼等之變異體中之一者，特別較佳地為FadL或彼之變異體。

在該第一至五態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種方法、一種細胞或一種用途解決，其中該細胞具有及 /或過度表現選自呈重組形式之烷烴羥化酶、醇去氫酶、轉胺酶、丙胺酸去氫酶及AlkL家族蛋白中之至少一種酶。

在該第一至五態樣之較佳實施態樣中，該問題係藉由一種方法、一種細胞或一種用途解決，其中該包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽的活性比野生型細胞者為低，因為剔除編碼包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽的基因。

本發明係基於發明人之意外發現，即相較於野生型細胞，具有降低活性之多肽(其包含特別是SEQ ID NO 2或彼之變異體)的重組細胞，係適合用於使羧酸酯反應，因為自該反應生成之產物的產率、碳平衡及/或氮平衡及純度皆意外高於與野生型細胞具有相同之該多肽(其包含SEQ ID NO 2)活性之細胞。這對於例如其中該羧酸酯係藉由使用至少一種烷烴羥化酶及選擇性的其他酶加以氧化之反應為真。

本發明係基於發明人其他意外之發現，即相較於野生型細胞具有減少之多肽(該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體)活性之重組細胞，適合用於使羧酸酯反應，特別是因為用於自該羧酸酯之反應分離純化該反應產物之有機溶劑與液體陽離子交換劑，可藉由回收再利用而特別有效率地及/或經常地被回收，而且因為自包含有機溶劑及/或液體陽離子交換劑之疏水性溶液移除該水性反應混合物係經改善。

本發明關於一種藉由細胞使羧酸酯反應之方法，其中該反應可能為任何利用該受關注之羧酸酯作為反應之化學反應，且其中該羧酸酯或衍生自該羧酸酯之化合物的水解或預水解，可能不利於欲自該羧酸酯生成之產物的產率、碳平衡及/或氮平衡及/或純度。本發明之細胞及本發明之方法係特別適合用於其中異於該羧酸酯基之化學官能基(例如末端烷基)係經反應之反應，及其中該目標為保留該羧酸酯基之反應。然而根據本發明，也有可能根據本發明進行如轉酯化該羧酸酯基之反應，其中該目標為避免該羧酸酯基之非特定性預反應。本發明之揭示亦適用於其中包含該羧酸酯基之化合物本身不是將進行反應之反應物之反應，但該反應僅需要該化合物穩定存在一段相對長的時間，例如該化合物係酶之誘導劑或活化劑，而該酶之活性係該反應所必需。

為了實現本發明，本發明之細胞或用於本發明之方法中之細胞必須是重組細胞，該重組細胞相較於野生型細胞具有減少之多肽活性，該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體。該序列編碼一種酶BioH，該酶以轉換丙胺酸及/或醋酸酯為庚二醯基-CoA之能力見長，其與另一酶BioC一起作用以生合成生物素(Barker,D.F.,and Campbell,A.M.(1980)J.Bacteriol.143,789-800)。在大腸桿菌(Escherichia coli)中，BioH係由包含SEQ ID NO 1之核苷酸序列編碼。在較佳之實施態樣中，該包含SEQ ID NO 2之多肽的活性係因基因剔除(例如部分刪除)而降低，或因其他減少包含SEQ ID NO 1或彼之變異體之核苷酸序列表現之手段而降低。

隨著現代基因學、微生物學及分子生物學方法的發展，技藝人士具有許多可選用之工具，以用來例行測量及影響存在於存活細胞中之多肽的活性。呈懸浮液、團塊形式或可能以經細胞培養處理形式存在之酶的活性，可藉由使用如教科書(例如Cornish-Bowden,1995)上描述之酶標準檢定方法測定。一種用於測定包含SEQ ID NO 1或彼之變異體之多肽活性的檢定係描述於X.Xie et al.(2007)Metabolic Engineering 9；379-386。

例行可用之減少細胞中酶活性之方法，例如藉由暴露至放射性輻射接著濃縮或篩選該突變物之細胞隨機突變形成、藉由定點導入點突變或藉由打斷閱讀框或刪除部分之經染色體整合至細胞中之基因的閱讀框(該基因編碼具活性之酶)，亦已描述於先前技術，例如Maniatis et al(1989)或Fuchs & Schlegl(2007)，且可由該領域之技藝人士例行實施。也可能根據RNA干擾(Tuschl,2001)或使用特定抑制劑以減少活性。在較佳之實施態樣中，如此處所使用之敘述「其中該細胞相較於彼之野生型細胞具有減少之多肽活性」，係指在改質細胞中該多肽之活性相對於野生細胞中該相同酶之活性為低。在較佳之實施態樣中，該相對減少係5%、10%、20%、40%、50%、75%、90%、95%、99%或更高之活性(依優先性漸增之順序排列)。在特定較佳之實施態樣中，相較於背景，酶活性無法再被檢測到。

特別較佳的是，藉由基因剔除減少包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽的活性。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「基因剔除」係指任何減少包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽的活性之手段，該活性之減少係永久性或不可逆的，特別是也包括對應細胞之子代，該手段較佳係藉由打斷編碼SEQ ID NO 2或彼之變異體之序列的閱讀框、藉由刪除至少部分之編碼SEQ ID NO 2或彼之變異體之序列(其造成該編碼多肽之酶活性喪失但不打斷閱讀框)或藉由使表現所需之核苷酸序列產生突變，例如啟動子、核糖體結合位點或類似序列。製備具有減少活性之特定多肽之細胞之手段，係該領域之技藝人士例行可用之程序，在現有技術中業已清楚描述，例如Kamionka et al.(2005)Appl Environ Microbiol.2005 February；71(2)：728-733,Geng et al.(2009),Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2009,Article ID 646380,doi：10.1155/2009/646380,and Murphy(2009)Methods Mol Biol.2011；765：27-42。也適用的是市售套組，例如Sigma Aldrich之TargeTron^TM基因剔除系統。

本發明關於使式(I)之羧酸酯反應，R¹-A-COOR² (I),其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、 -CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，其中R³係選自氫及烷基，較佳地甲基、乙基及丙基，且其中A係具有至少4個、更佳地6個、甚至更佳地8個碳原子之經取代、未經取代、直鏈、分支及/或環狀伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基。該伸烷基可為任何特別是直鏈、分支或環狀伸烷基，只要其包含至少4個碳原子。在特別較佳之實施態樣中，A係式-(CH₂)_n-之伸烷基鏈，其中n可為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在最佳之實施態樣中，A代表式-(CH₂)_n-之伸烷基，其中n為4至24，更佳地4至22，且最佳地4至10，R₁係氫、-CH₂OH、-CHO或-COOH，最佳係氫，且R²係甲基或乙基。

關於根據本發明之羧酸酯反應之反應物及所有其他此處所述之化合物，由結構特徵(例如化學式)描述之化合物，通常同樣地表示質子化及去質子化或其他解離化合物。例如，用語「醋酸酯」被理解為同樣表示其質子化形式，即醋酸，與其解離形式，即CH₃-COO-。

本發明欲使用之細胞較佳係呈代謝活性細胞形式之全細胞催化劑，其具有使該羧酸酯反應所需之酶活性，特別較佳地是藉由表現重組酶。在另一較佳之實施態樣中，該細胞係溶解物、萃取物或另一種細胞製劑，其具有至少一種酶活性。

關於有機體之選擇方面，本發明可用之細胞不受任何限制，只要該細胞係可培養、穩定且可利用減弱酶活性之方法(例如基因剔除)處理。因此其可能是原核或真核細胞。以真核細胞為例，特別較佳者為單細胞真核生物，特別是酵母菌如啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、白色念珠菌(Candida albicans)及巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。以原核細胞為例，其可能為例如選自下列之細菌：磁球菌(Magnetococcus)、深海鐵桿菌(Mariprofundus)、醋桿菌(Acetobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)、嗜酸菌屬(Acidiphilium)、軍院菌屬(Afipia)、阿倫斯氏菌(Ahrensia)、不黏柄菌屬(Asticcacaulis)、橙單胞菌屬(Aurantimonas)、固氮根瘤菌屬(Azorhizobium)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、桿菌屬(Bacillus)、巴東體屬(Bartonella)、巴東體屬菌(B.tribocorum)、貝氏固氮菌屬(Beijerinckia)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、近弧狀短波單胞菌(B.subvibrioides)、布氏桿菌屬(Brucella)、柄桿菌屬(Caulobacter)、Chelativorans屬、檸檬胞菌屬(Citreicella)、檸檬酸微菌屬(Citromicrobium)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、溝鞭藻玫瑰桿菌(Dinoroseobacter)、赤桿菌屬(Erythrobacter)、褐黃海水菌屬(Fulvimarina)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)、顆粒桿菌屬(Granulibacter)、海氏菌屬(Hirschia)、赫夫勒氏菌(Hoeflea)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、生絲單胞菌屬(Hyphomonas)、酮古龍酸菌屬(Ketogulonicigenium)、拉布倫茨氏菌屬(Labrenzia)、洛克氏菌屬(Loktanella)、磁螺菌屬(Magnetospirillum)、海洋桿狀菌屬(Maricaulis)、海棍狀菌屬(Maritimibacter)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、甲基營養菌屬(Methylobacterium)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、甲基彎曲菌屬(Methylosinus)、硝化菌屬(Nitrobacter)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、海洋球狀菌屬(Oceanibulbus)、海洋柄菌屬(Oceanicaulis)、海棲菌屬(Oceanicola)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、十八桿菌屬(Octadecabacter)、寡養菌屬(Oligotropha)、副球菌屬(Paracoccus)、細小棒菌屬(Parvibaculum)、短小盒菌屬(Parvularcula)、橄欖球形菌屬(Pelagibaca)、Phaeobacter、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、Polymorphum、假弧菌屬(Pseudovibrio)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、紅微菌屬(Rhodomicrobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、玫瑰菌屬(Roseibium)、玫瑰桿菌屬(Roseobacter)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)、玫瑰變色菌屬(Roseovarius)、魯杰氏菌屬(Ruegeria)、箭頭菌屬(Sagittula)、Silicibacter、鞘脂菌屬(Sphingobium)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、鞘脂羅盤菌屬(Sphingopyxis)、Starkeya、亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)、Thalassiobium、黃桿菌屬 (Xanthobacter)、醱酵單胞菌屬(Zymomonas)、農桿菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、邊蟲屬(Anaplasma)、艾利希體屬(Ehrlichia)、新立克次體屬(Neorickettsia)、東方體屬(Orientia)、立克次體屬(Rickettsia)、沃爾巴克體屬(Wolbachia)、博德氏桿菌屬(Bordetella)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、台灣貪銅菌(C.Taiwanensis)、勞特羅普氏菌屬(Lautropia)、湖沉積桿菌屬(Limnobacter)、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)、色桿菌屬(Chromobacterium)、艾肯氏菌屬(Eikenella)、嚙蝕艾肯氏菌(E.corrodens)、Basfia、金氏菌屬(Kingella)、鷗桿菌屬(Laribacter)、Lutiella、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、西蒙斯氏菌屬(Simonsiella)、無色桿菌屬(Achromobacter)、食酸菌屬(Acidovorax)、Alicycliphilus、Aromatoleum、固氮弧菌屬(Azoarcus)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)、戴爾福特菌屬(Delftia)、披毛菌屬(Gallionella)、草螺菌屬(Herbaspirillum)、赫山單胞菌屬(Herminiimonas)、Hylemonella、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、纖毛菌屬(Leptothrix)、Methylibium、嗜甲基菌屬(Methylobacillus)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、Methyloversatilis、食甲基菌屬(Methylovorus)、亞硝酸單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝酸螺旋菌屬(Nitrosospira)、Oxalobacter、Parasutterella、極胞菌屬(Polaromonas)、極胞菌屬(Polaromonas)、極小單胞菌屬(Pusillimonas)、紅育菌屬(Rhodoferax)、紅長命菌屬(Rubrivivax)、Sideroxydans、薩特菌屬(Sutterella)、華德薩特菌(S.wadsworthensis)、泰勒氏菌屬(Taylorella)、陶厄氏菌屬(Thauera)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、硫單胞菌屬(Thiomonas)、貪噬菌屬(Variovorax)、福爾明菌屬(Verminephrobacter)、厭氧性黏菌屬(Anaeromyxobacter)、布德樓弧菌屬(Bdellovibrio)、噬菌布德樓弧菌(B.bacteriovorus)、嗜膽菌屬(Bilophila)、脫硫盒菌屬(Desulfarculus)、Desulfatibacillum、脫硫橄欖樣菌屬(Desulfobacca)、脫硫桿菌屬(Desulfobacterium)、脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)、脫硫球菌屬(Desulfococcus)、脫硫鹽菌屬(Desulfohalobium)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、脫硫微菌屬(Desulfomicrobium)、Desulfonatronospira、脫硫小桿菌屬(Desulfotalea)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、脫硫單胞菌屬(Desulfuromonas)、地桿菌屬(Geobacter)、嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、希普氏菌屬(Hippea)、勞森菌屬(Lawsonia)、黏球菌屬(Myxococcus)、暗桿菌屬(Pelobacter)、鄰囊菌屬(Plesiocystis)、堆囊菌屬(Sorangium)、標記菌屬(Stigmatella)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、互營菌屬(Syntrophus)、弓形菌屬(Arcobacter)、Caminibacter、彎曲菌屬(Campylobacter)、螺旋桿菌屬(Helicobacter)、Nitratifractor、Nitratiruptor、硫彎曲菌(Sulfuricurvum)、硫單胞菌(Sulfurimonas)、硫螺菌屬(Sulfurospirillum)、硫卵形菌屬(Sulfurovum)、沃林氏菌屬(Wolinella)、布赫納氏菌屬(Buchnera)、Blochmannia、Hamiltonella、Regiella、Riesia、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)、迪基氏菌(Dickeya)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、軟腐菌屬(Pectobacterium)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、伴蠅菌屬(Sodalis)、威格爾斯沃斯氏菌屬(Wigglesworthia)、Glossina、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、酸硫桿狀菌屬(Acidithiobacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、氣單胞桿菌屬(Aeromonas)、食烷菌屬(Alcanivorax)、鹼湖生菌屬(Alkalilimnicola)、異著色菌屬(Allochromatium)、文替單胞菌目(Alteromonadales)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、鮑氏菌屬(Baumannia)、貝扎托菌屬(Beggiatoa)、Bermanella、Carsonella、羅氏菌屬(Ruthia)、Vesicomyosocius、心桿菌屬(Cardiobacterium)、色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)、科爾維爾氏菌屬(Colwellia)、聚集桿菌屬(Congregibacter)、考克斯氏體屬(Coxiella)、腐蹄桿菌屬(Dichelobacter)、Endoriftia、水棲菌屬 (Enhydrobacter)、鐵單胞菌(Ferrimonas)、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、冰居菌屬(Glaciecola)、河氏菌屬(Hahella)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、鹽紅螺旋菌屬(Halorhodospira)、鹽硫桿狀菌屬(Halothiobacillus)、源洋菌屬(Idiomarina)、康氏菌屬(Kangiella)、軍團菌屬(Legionella)、海桿菌屬(Marinobacter)、海單胞菌屬(Marinomonas)、甲基桿菌(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、莫拉菌屬(Moraxella)、莫里特拉氏菌屬(Moritella)、Neptuniibacter、硝化球菌屬(Nitrococcus)、假文替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、冷桿菌屬(Psychrobacter)、冷單胞菌屬(Psychromonas)、Reinekea、立克次小體屬(Rickettsiella)、糖噬胞菌屬(Saccharophagus)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、Succinatimonas、船蛆桿菌屬(Teredinibacter)、Thioalkalimicrobium、硫鹼弧菌屬(Thioalkalivibrio)、硫微螺菌屬(Thiomicrospira)、甲苯單胞菌屬(Tolumonas)、弧菌目(Vibrionales)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、聚集菌屬(Aggregatibacter)、雞桿菌屬(Gallibacterium)、嗜血菌屬(Haemophilus)、嗜組織菌屬(Histophilus)、曼海姆氏菌屬(Mannheimia)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、固氮菌屬(Azotobacter)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Aliivibrio、格里蒙氏菌屬(Grimontia)、發光桿菌屬(Photobacterium)、發光桿菌屬 (Photobacterium)、弧菌屬(Vibrio)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、木桿菌屬(Xylella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、短螺旋菌屬(Brachyspira)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、螺旋體屬(Spirochaeta)、密螺旋體屬(Treponema)、Hodgkinia、Puniceispirillum、Liberibacter、海洋桿菌屬(Pelagibacter)、Odyssella、Accumulibacter，特別是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、巨桿菌(B.megaterium)、麩胺酸棒狀桿菌(C.glutamicum)、大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、臭味假單胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、伯克氏菌屬(Burkholderia sp.)、Burkholderia thailandensis、藍細菌(cyanobacteria)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)及苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)。在特別較佳之實施態樣中，其係腸內細菌(enterobacterium)，最佳為大腸桿菌(Escherichia coli)。

本發明之方法需要使該細胞與該羧酸酯於水溶液中接觸。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「接觸」係指本發明之細胞與特定劑(例如該羧酸酯或液體陽離子交換劑)直接接觸，特別是之間並無任何物理障礙諸如多孔膜或類似物。在最簡單之例子中，接觸包含添加該劑(例如羧酸酯或液體陽離子交換劑)至包含該細胞之水溶液。

可被使用之水溶液係任何適用於維持或培養使該羧酸酯反應所需之細胞及/或彼之活性之水基底溶液。該等水基底溶液同樣包括微生物培養基(包括完全培養基如LB培養基、基本培養基如M9培養基)及選擇性培養基(例如包含高鹽濃度因此僅能讓嗜鹽生物或至少耐鹽生物生長之培養基)。特別較佳之培養基係包含極少成分之基本培養基，該等成分可自該羧酸酯之反應產物輕易移除，以利於該產物之分離純化。

若該所欲反應之產物具有足夠疏水性且具有適當電荷，其可能藉由下列步驟萃取：b)使該水溶液與包含陽離子交換劑之疏水性有機溶液接觸。適當方法係描述於國際專利申請案PCT/EP2011/071491或歐洲專利申請案EP12181153.3。簡言之，該水溶液可能在反應期間或反應後與包含脂肪酸酯(作為溶劑)與脂肪酸(較佳為不飽和脂肪酸)之疏水性溶液接觸。

當設定步驟a)中之溫度及條件時，對細胞、反應及必要酶之需求必須納入考慮。各式生物科技重要細胞之溫度需求可見於微生物學及分子生物學之教科書中，例如Fuchs/Schlegl,Allgemeine Mikrobiologie[General Microbiology],2008，或者可藉由屬於例行程序之培養實驗決定。在較佳之實施態樣中，該水性培養基在接觸時之pH係4至9，更佳地4.5至8.5，最佳地6.5至7.5。在另一較佳實施態樣中，該溫度係0至45℃，更佳地15至40℃，最佳地20至37℃。

本發明之方法較佳為使用一種表現重組烷烴羥化酶之細胞，其中該包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽的活性比野生型細胞者為低。在較佳之實施態樣中，該烷烴羥化酶係CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶。在較佳之實施態樣中，用語「CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶」係指屬於3成分系統之一部分的胞質氧化酶，該3成分系統另包含鐵氧還蛋白及鐵氧還蛋白還原酶，該胞質氧化酶具有烷烴結合部位及羥化烷烴之能力。在特別較佳之實施態樣中，該酶與來自泊庫島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2之CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶(資料庫編號YP_691921)具有至少80%、較佳地90%、最佳地95或99%之序列一致性，或者該酶具有與來自泊庫島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2之CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶(資料庫編號YP_691921)具有至少80%、較佳地90%、最佳地95或99%之序列一致性之多肽序列，且另外具有烷烴羥化酶活性。此處與本說明書他處所述之資料庫編號，係指美國國家生物技術資料中心(NCB,Bethesda,USA)I資料庫，更詳細為2012年11月8日線上可用之版本。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「烷烴羥化酶活性」係指催化烷烴或包含至少6個(較佳12個)碳基之未經取代直鏈烷基之羥化之能力。在另一較佳實施態樣中，用語「CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶」係指一種非膜結合性氧化酶，其包含烷烴、包含至少5個(較佳12個)碳基之未經取代直鏈烷基或單羥基化烷烴之結合位點，且彼之多肽鏈包含模體(motif)LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在較佳之實施態樣中，此處所使用之「CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶」係一種源自泊庫島食烷菌SK2之CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶(資料庫編號YP_691921)或較佳地具有烷烴羥化酶活性之變異體。

本發明所使用之酶較佳係重組酶。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「重組」係指該對應之核酸分子不存在於天然細胞中及/或係利用基因建構方法產製。在較佳之實施態樣中，若蛋白之對應多肽係由重組核酸所編碼，則該蛋白被稱為重組。在較佳之實施態樣中，此處所使用之「重組細胞」係指具有至少一種重組核酸或一種重組多肽之細胞。該領域之技藝人士通曉適用於產製重組分子或細胞之方法，例如該些於Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989)：Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2^nd edition中所述者。重組之酶係較佳地藉由使用例如pET或pGEX載體系統過度表現，該等載體系統為該領域之技藝人士所熟知。

為了以理想方式自還原劑(較佳為NADH)提供電子給CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶，較佳係選用同時表現該單氧化酶與鐵氧還蛋白還原酶及鐵氧還蛋白之細胞，鐵氧還蛋白還原酶及鐵氧還蛋白皆與該單氧化酶功能性交互作用。該多肽可能為經分離或(當使用全細胞催化劑時為)共表現之多肽或與CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶之N端或C端融合之多肽。該領域之技藝人士可輕而易舉地決定鐵氧還蛋白還原酶或鐵氧還蛋白是否與給定之CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶功能性交互作用，藉由該還原劑是否在烷烴底物與該三種多肽存在下被氧化加以判定。或者，可使用由Scheps,D.,Malca,H.,Hoffmann,B.,Nestl,B.M,and Hauer,B.(2011)Org.Biomol.Chem.,9,6727所述之酶檢定，其顯示就功能性交互作用多肽而言反應率顯著增加。在特別較佳之實施態樣中，CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶、鐵氧還蛋白及鐵氧還蛋白還原酶係來自相同有機體。在特別較佳之實施態樣中，鐵氧還蛋白還原酶係來自泊庫島食烷菌SK2者(資料庫編號YP_691923)或為彼之變異體，鐵氧還蛋白係來自泊庫島食烷菌SK2者(資料庫編號YP_691920)或為彼之變異體，且CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶係來自泊庫島食烷菌SK2者(資料庫編號YP_691921)或為彼之變異體。

在另一較佳實施態樣中，該烷烴羥化酶係AlkB單氧化酶。AlkB係一種最先自臭味假單胞菌(Pseudomonas putida)Gpo1 AlkBGT系統得知之氧化還原酶，其依賴另二種多肽AlkG與AlkT。AlkT是一種自NADH傳遞電子至AlkG之FAD依賴性紅素氧還蛋白還原酶。AlkG是一種紅素氧還蛋白，即作為AlkB之直接電子受體之含鐵氧還蛋白。在較佳之實施態樣中，用語「AlkB單氧化酶」係指與臭味假單胞菌Gpo1 AlkB之序列(資料庫編號CAB54050.1；此資料庫編號如同本說明書所使用之所有其他資料庫編號，係來自現有技術，換言之來自NCBI資料庫，更清楚為2012年10月15日於線上發表者)具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%(優先性遞增)序列同源性之多肽，該多肽能氧化烷烴。在特別較佳之實施態樣中，該AlkB單氧化酶係與臭味假單胞菌Gpo1 AlkG(CAB54052.1)與AlkT(CAB54063.1)多肽一起功能性作用之烷烴氧化性氧化還原酶。為了理想地提供電子給AlkB烷烴羥化酶，較佳的是使用一起表現該單氧化酶及與其功能性交互作用之輔助蛋白之細胞，該等輔助蛋白較佳為AlkG及/或AlkT或彼等之個別變異體，在特別較佳之實施態樣中，該等輔助蛋白再次為臭味假單胞菌Gpo1 AlkG(CAB54052.1)及AlkT(CAB54063.1)多肽。

本發明之細胞或用於本發明之方法中之細胞氧化底物之能力，可能藉由該細胞表現醇去氫酶作為該烷烴羥化酶之替代物或除了該烷烴羥化酶以外額外表現醇去氫酶而增進。在較佳之實施態樣中，此處使用之用語「醇去氫酶」係指氧化醛或酮成為對應之一級或二級醇之酶。實例包括下列之醇去氫酶及彼等之個別變異體：富養羅爾斯頓氏菌(Ralstonia eutropha)(ACB78191.1)、短乳桿菌(Lactobacil1us brevis)(YP_795183.1)、來自馬肝臟之開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefiri)(ACF95832.1)、泛養副球菌(Paracoccus pantotrophus)(ACB78182.1)及鞘脂菌(Sphingobium yanoikuyae)(EU427523.1)。

使用全細胞催化劑可能產生底物必須與位於細胞內之酶接觸才能使所欲反應發生之問題。以長鏈烷烴及彼之衍生物而言，較佳為具有AlkL家族之多肽的全細胞催化劑。在較佳之實施態樣中，此處所使用之「AlkL家族之多肽」係一種與臭味假單胞菌AlkL(資料庫編號CAB69081)或臭味假單胞菌AlkL之變異體具有至少80%、較佳地90%、甚至更佳地90%序列一致性之多肽(超過230個連續胺基酸之長度)，且較佳地具有支持輸入長鏈烷烴至細胞內部之能力。在另一實施態樣中，此處所使用之「AlkL家族之多肽」是一種位於革蘭氏陰性細菌外膜之多肽，其具有序列模體DXWAPAXQ(V/A)GXR，其中X係蛋白原性胺基酸，且另外較佳為臭味假單胞菌AlkL(資料庫編號CAB69081)或彼之變異體。AlkL家族之例示性成員包括來自下列之AlkL及彼等之變異體：臭味假單胞菌(資料庫編號CAB69081)、水油海桿菌(Marinobacter aquaeolei)VT8(資料庫編號YP_957722)、亞歷山大海洋柄菌(Oceanicaulis alexandrii)HTCC2633(資料庫編號ZP_00953584)、海洋錳氧化菌(Marinobacter manganoxydans)MnI7-9(資料庫編號ZP_09158756)、柄桿菌屬(Caulobacter sp.)K31(資料庫編號YP_001672217)、食油假單胞菌 (Pseudomonas oleovorans)(資料庫編號Q00595)。

本發明之揭示的實施可藉由利用不僅是具有此處提及之確切胺基酸或核酸序列之大分子，或藉由利用不僅是具有此處提及之確切胺基酸序列之多肽的活性且該活性比特定野生型者為低之細胞，但也可藉由利用該等大分子之變異體或具有該多肽之變異體之活性的細胞，該等變異體可藉由刪除、添加或取代一或超過一個胺基酸或核酸而獲得，且該等變異體之活性相較於特定細胞之特定野生型者為低。在較佳之實施態樣中，此處所使用之核酸序列或胺基酸序列之「變異體」用語(以下與用語「同系物」同義地且可交換地使用)，係指與該對應之原始野生型核酸或胺基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99或更高百分比之同源性(此處與一致性同義地使用)之不同的核酸或胺基酸序列，其中較佳地除了該些形成催化活性位點或為結構或摺疊所需之胺基酸以外之胺基酸係經刪除或取代，要不僅發生保守性取代，例如以麩胺酸取代天冬胺酸或以白胺酸取代纈胺酸。現有技術描述可用於計算二個序列之同源性程度之演算法，例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,3^rd edition。在本發明之另一更佳之實施態樣中，胺基酸序列或核酸序列之變異體除了上述之序列同源性以外，較佳地具有與該野生型分子或原始分子實質上相同之酶活性。例如，具有蛋白酶之酶活性的多肽變異體，與該多肽酶具有相同或實質上相同之蛋白水解活性，也就是催化肽鍵水解之能力。在特定實施態樣中，用語「實質上相同之酶活性」係指對野生型多肽之底物具有顯著高於背景活性之活性，或/及對該相同底物具有與該野生型多肽之K_M及/或k_cat值相差不到3個、更佳地2個、甚至更佳地1個數量級之該等值。在另一較佳之實施態樣中，核酸或胺基酸序列之「變異體」用語包含該核酸或胺基酸序列之至少一個活性部分或片段。在另一較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「活性部分」係指一段胺基酸序列或核酸序列，其短於該全長胺基酸序列或其編碼相較於全長胺基酸序列為短之胺基酸序列，且所包含之長度比野生型胺基酸序列為短之胺基酸序列或該經編碼之胺基酸序列具有與該野生型多肽或彼之變異體(例如蛋白酶)實質上相同之酶活性。在特定實施態樣中，核酸之「變異體」包含其互補股在較佳地嚴謹度條件下與該野生型核酸結合之核酸。雜交反應之嚴謹度可輕而易舉地由該領域之技藝人士決定，通常取決於探針長度、清洗期間之溫度及鹽濃度。大抵上，較長探針需要較高之雜交溫度，而低溫適用於較短探針。雜交是否會發生通常取決於該變性DNA與其周遭之互補股黏合之能力，特別是在熔點溫度以下。雜交反應之嚴謹度及對應條件更詳細地描述於F.M.Ausubel(1995),Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons,Inc.。藉由雜交識別DNA序列之說明可由該領域之技藝人士在特別是"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" of Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim, Germany,1993)一書及Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))中找到。在較佳之實施態樣中，雜交在嚴謹度條件下發生，也就是說只有在其中探針與目標序列(即經該探針處理之多核苷酸)至少為70%一致時才會形成雜交。已知雜交之嚴謹度包括清洗步驟受到不同的緩衝液組成、溫度及鹽濃度之影響或由該等因素決定。雜交反應通常在相較清洗步驟之嚴謹度為低者下進行(Hybaid Hybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。該等雜交反應有可能採用例如在約50℃至68℃之溫度下對應5x SSC緩衝液之緩衝液。此時，探針亦可與具有和探針序列不到70%一致性之多核苷酸雜交。該等雜交較不穩定且可在嚴謹度條件下藉由清洗移除。此可藉由例如降低鹽濃度至2x SSC接著選擇性地0.5x SSC達成(The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)，其中(按漸增之優先性排列)約50℃至68℃、約52℃至68℃、約54℃至68℃、約56℃至68℃、約58℃至68℃、約60℃至68℃、約62℃至68℃、約64℃至68℃、約66℃至68℃之溫度係經調整。較佳為約64℃至68℃或約66℃至68℃之溫度範圍。可任意選擇地將鹽濃度降低至對應0.2x SSC或0.1x SSC之濃度。藉由自50℃至68℃逐步增加雜交溫度(每次增加約1至2℃)，可分離與所使用之核酸分子之序列具有例如(按漸增之優先性排列)至少70%或至少80%或至少90%、至少 91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之多核苷酸片段。有關雜交之其他說明可於市場上以「套組」(例如Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,Germany)之DIG Easy Hyb，產品編號1603558)之形式獲得。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語核酸之「變異體」，包含任何編碼與原始核酸相同之胺基酸序列或此胺基酸序列在基因密碼簡併性範圍內之變異體的核酸序列。

在較佳之實施態樣中，本發明所使用之細胞相較於彼之野生型者具有減少之至少一種催化脂肪酸β-氧化之任何反應之酶活性，該酶係較佳地選自脂肪酸-CoA連接酶、醯基-CoA去氫酶、2,4-二烯醯基-CoA還原酶、烯醯基-CoA水合酶及3-酮醯基-CoA硫解酶、脂肪酸輸入蛋白或彼等之變異體，且特別較佳者為FadL或彼之變異體。脂肪酸之β-氧化係廣泛代謝途徑，其允許原核生物及同樣地真核生物氧化脂肪酸，以使儲存於其中之化學能量為代謝可用。廣義來說，此途徑始於脂肪酸被攝入細胞中，以大腸桿菌為例此係經由轉運蛋白FadL將脂肪酸運送通過該革蘭氏陰性細菌細胞之外膜及內膜，並經由FadD基因產物藉由CoA酯將該脂肪酸釋放至胞質中。此時，若情況需要，該脂肪酸在該脂肪酸-CoA酯之β-位置將先被醯基-CoA去氫酶(在大腸桿菌之例中為FadE)氧化。或者，類似分子亦可自雙元不飽和脂肪酸藉由2,4-二烯醯基-CoA還原酶(大腸桿菌之FadH)還原形成。多功能酶烯醯基 -CoA水合酶/3-羥醯基-CoA去氫酶(大腸桿菌之FadB)接著催化水合反應形成二級醇，該二級醇接著被氧化成酮。在最後步驟中，3-酮醯基-CoA硫解酶(大腸桿菌之FadA)催化酮醯基-CoA之切割，導致乙醯基-CoA與相較於該被釋放之起始分子短二個碳原子之脂肪酸-CoA酯。若後者也不是乙醯基-CoA，其可能再次被餵入β-氧化循環中並經氧化縮短。FadR是Fad操縱子(包含分解脂肪酸所需之基因)之調節物，其亦涉及調節脂肪酸β-氧化，但不會催化β-氧化反應。在較佳之實施態樣中，用語「催化脂肪酸β-氧化之任何反應之酶」係指任何直接與脂肪酸底物或在形成乙醯基-CoA之途徑上自該脂肪酸底物產製之分子(較佳地視其為底物)交互作用，且催化彼之轉換成為在此分解途徑上更接近乙醯基-CoA之代謝物之酶，較佳地包括將該脂肪酸攝入該細胞中之脂肪酸輸入蛋白。根據上述定義，這些酶包括例如醯基-CoA去氫酶，因為其與脂肪酸-CoA酯交互作用且催化彼之轉化成為在該β-氧化代謝途徑上比該脂肪酸-CoA酯更接近乙醯基-CoA之烯醯基-CoA。在特別較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「催化脂肪酸β-氧化之任何反應之酶」係指選自大腸桿菌之基因產物FadA、FadB、FadD、FadL及FadE及/或彼等之來自其他有機體之變異體或同系物之任何酶。大腸桿菌之基因產物FadA、FadB、FadD、FadL及FadE與來自多種其他生技可利用性有機體之變異體及同系物與彼等之核酸及多肽序列係描述於現有技術，例如FadA為編號 AP009048.1、FadB為編號BAE77457.1、FadD為編號BAA15609.1、FadE為編號BAA77891.2及FadL為編號BAA16205.1。

在另一較佳之實施態樣中，本發明之細胞或本發明之方法中所使用之細胞表現轉胺酶。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「轉胺酶」係指催化α-胺基自供體分子(較佳為胺基酸)轉移至受體分子(較佳為α-酮羧酸)之酶。例如，可能使用選自下列之轉胺酶：3HMU_A、AAD41041.1、AAK15486.1、ABE03917.1、ADR60699.1、ADR61066.1、ADR62525.1、AEL07495.1、CAZ86955.1、EFW82310.1、EFW87681.1、EGC99983.1、EGD03176.1、EGE58369.1、EGH06681.1、EGH08331.1、EGH24301.1、EGH32343.1、EGH46412.1、EGH55033.1、EGH62152.1、EGH67339.1、EGH70821.1、EGH71404.1、EGH78772.1、EGH85312.1、EGH97105.1、EGP57596.1、NP_102850.1、NP_106560.1、NP_248912.1、NP_248990.1、NP_354026.2、NP_421926.1、NP_637699.1、NP_642792.1、NP_744329.1、NP_744732.1、NP_747283.1、NP_795039.1、NP_901695.1、XP_002943905.1、YP_001021095.1、YP_001059677.1、YP_001061726.1、YP_001066961.1、YP_001074671.1、YP_001120907.1、YP_001140117.1、YP_001170616.1、YP_001185848.1、YP_001188121.1、YP_001233688.1、YP_001268866.1、YP_001270391.1、YP_001345703.1、 YP_001412573.1、YP_001417624.1、YP_001526058.1、YP_001579295.1、YP_001581170.1、YP_001668026.1、YP_001669478.1、YP_001671460.1、YP_001685569.1、YP_001747156.1、YP_001749732.1、YP_001765463.1、YP_001766294.1、YP_001790770.1、YP_001808775.1、YP_001809596.1、YP_001859758.1、YP_001888405.1、YP_001903233.1、YP_001977571.1、YP_002229759.1、YP_002231363.1、YP_002280472.1、YP_002297678.1、YP_002543874.1、YP_002549011.1、YP_002796201.1、YP_002801960.1、YP_002875335.1、YP_002897523.1、YP_002912290.1、YP_002974935.1、YP_003060891.1、YP_003264235.1、YP_003552364.1、YP_003578319.1、YP_003591946.1、YP_003607814.1、YP_003641922.1、YP_003674025.1、YP_003692877.1、YP_003755112.1、YP_003896973.1、YP_003907026.1、YP_003912421.1、YP_004086766.1、YP_004142571.1、YP_004147141.1、YP_004228105.1、YP_004278247.1、YP_004305252.1、YP_004356916.1、YP_004361407.1、YP_004378186.1、YP_004379856.1、YP_004390782.1、YP_004472442.1、YP_004590892.1、YP_004612414.1、YP_004676537.1、YP_004693233.1、YP_004701580.1、YP_004701637.1、YP_004704442.1、YP_108931.1、YP_110490.1、YP_168667.1、YP_237931.1、YP_260624.1、YP_262985.1、YP_271307.1、YP_276987.1、 YP_334171.1、YP_337172.1、YP_350660.1、YP_351134.1、YP_364386.1、YP_366340.1、YP_369710.1、YP_370582.1、YP_426342.1、YP_440141.1、YP_442361.1、YP_468848.1、YP_521636.1、YP_554363.1、YP_608454.1、YP_610700.1、YP_614980.1、YP_622254.1、YP_625753.1、YP_680590.1、YP_751687.1、YP_767071.1、YP_774090.1、YP_774932.1、YP_788372.1、YP_858562.1、YP_928515.1、YP_983084.1、YP_995622.1、ZP_00948889.1、ZP_00954344.1、ZP_00959736.1、ZP_00998881.1、ZP_01011725.1、ZP_01037109.1、ZP_01058030.1、ZP_01076707.1、ZP_01103959.1、ZP_01167926.1、ZP_01224713.1、ZP_01442907.1、ZP_01446892.1、ZP_01550953.1、ZP_01625518.1、ZP_01745731.1、ZP_01750280.1、ZP_01754305.1、ZP_01763880.1、ZP_01769626.1、ZP_01865961.1、ZP_01881393.1、ZP_01901558.1、ZP_02145337.1、ZP_02151268.1、ZP_02152332.1、ZP_02167267.1、ZP_02190082.1、ZP_02242934.1、ZP_02360937.1、ZP_02367056.1、ZP_02385477.1、ZP_02456487.1、ZP_02883670.1、ZP_03263915.1、ZP_03263990.1、ZP_03400081.1、ZP_03452573.1、ZP_03456092.1、ZP_03517291.1、ZP_03529055.1、ZP_03571515.1、ZP_03572809.1、 ZP_03587785.1、ZP_03588560.1、ZP_03697266.1、ZP_03697962.1、ZP_04521092.1、ZP_04590693.1、ZP_04890914.1、ZP_04891982.1、ZP_04893793.1、ZP_04902131.1、ZP_04905327.1、ZP_04941068.1、ZP_04944536.1、ZP_04945255.1、ZP_04959332.1、ZP_04964181.1、ZP_05053721.1、ZP_05063588.1、ZP_05073059.1、ZP_05077806.1、ZP_05082750.1、ZP_05091128.1、ZP_05095488.1、ZP_05101701.1、ZP_05116783.1、ZP_05121836.1、ZP_05127756.1、ZP_05637806.1、ZP_05742087.1、ZP_05783548.1、ZP_05786246.1、ZP_05843149.1、ZP_05945960.1、ZP_06459045.1、ZP_06487195.1、ZP_06492453.1、ZP_06493162.1、ZP_06703644.1、ZP_06731146.1、ZP_06839371.1、ZP_07007312.1、ZP_07266194.1、ZP_07374050.1、ZP_07662787.1、ZP_07778196.1、ZP_07797983.1、ZP_08099459.1、ZP_08138203.1、ZP_08141719.1、ZP_08142973.1、ZP_08177102.1、ZP_08185821.1、ZP_08186468.1、ZP_08208888.1、ZP_08266590.1、ZP_08402041.1、ZP_08406891.1、ZP_08522175.1、ZP_08527488.1、ZP_08631252.1、ZP_08636687。

在另一較佳之實施態樣中，本發明之細胞或本發明之方法中所使用之細胞表現丙胺酸去氫酶。在較佳之實施態樣中，此處所使用之用語「丙胺酸去氫酶」係指隨著消耗水及NAD⁺，催化L-丙胺酸轉換成丙酮酸鹽、氨及NADH之酶。例如，可能使用選自來自下列之丙胺酸去氫酶之丙胺酸去氫酶：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(資料庫編號L20916)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(資料庫編號CP001622)、溶蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)(資料庫編號AF070716)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(資料庫編號X63069)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)(資料庫編號AB013821)、EGR93259.1、YP_003654745.1、YP_003651439.1、YP_003637111.1、YP_003631815.1、YP_001327051.1、YP_001262560.1、YP_886996.1、YP_882850.1、YP_704410.1、YP_703508.1、ZP_08624689.1、YP_001230376.1、P17557.1、P17556.1、CCB94892.1、CCB73698.1、YP_001168635.1、YP_004668736.1、YP_004569425.1、YP_003513168.1、YP_004561169.1、ZP_08554945.1、YP_400777.1、ZP_08311476.1、ZP_08310170.1、ZP_08267322.1、ZP_08263846.1、ZP_07898723.1、YP_149301.1、YP_148605.1、YP_004340432.1、EFT09946.1、EFS80513.1、EFS51332.1、EFS42459.1、YP_003060895.1、YP_003059033.1、ZP_03305373.1、YP_847214.1、YP_004095847.1、YP_003338282.1、YP_003337256.1、YP_355846.1、YP_253131.1、ZP_08197563.1、ZP_08196283.1、ADW06447.1、YP_734091.1、 NP_372233.1、NP_102173.1、ZP_08170259.1、EGD36706.1、EGD32748.1、ZP_08155540.1、YP_004142849.1、YP_002417649.1、YP_001301040.1、YP_002992892.1、YP_081348.1、YP_080482.1、YP_002476349.1、ZP_08115025.1、ZP_08114403.1、YP_003552869.1、YP_002358112.1、YP_575010.1、YP_477594.1、YP_474564.1、YP_130399.1、YP_129373.1、YP_123314.1、NP_810467.1、NP_646469.1、NP_626044.1、NP_391071.1、ZP_08086822.1、ZP_08084776.1、ZP_08083119.1、ZP_08020768.1、ZP_08013590.1、ZP_08011832.1、YP_003783744.1、YP_002781576.1、YP_002780533.1、ZP_02195873.1、NP_797482.1、ZP_07645051.1、ZP_07643260.1、ZP_06611917.1、AAT40119.1、ZP_07864946.1、YP_004068409.1、YP_002796203.1、YP_002774420.1、YP_003600348.1、YP_003599946.1、YP_003565624.1、YP_003565223.1、YP_335198.1、YP_423850.1、YP_155059.1、ZP_07843538.1、ZP_07841226.1、ZP_06928932.1、ZP_05692073.1、ZP_05687006.1、ZP_04867480.1、YP_775531.1、CBE70214.1、ZP_07721182.1、ZP_04302850.1、ZP_04298961.1、ZP_04287684.1、ZP_04277177.1、ZP_04248389.1、ZP_04235899.1、ZP_02159718.1、ZP_02152178.1、YP_003974610.1、YP_003546595.1、 YP_002317127.1、ZP_07313778.1、ZP_07302778.1、ZP_07298850.1、CBK69442.1、YP_003413835.1、YP_003595089.1、ZP_06807811.1、YP_003582455.1、YP_003464731.1、YP_003496397.1、YP_003421918.1、CBL07274.1、CBK64956.1、YP_003508515.1、AAL87460.1、AAC23579.1、AAC23578.1、AAC23577.1、ACU78652.1、YP_003471439.1、YP_003452777.1、ZP_06384971.1、ACY25368.1、ABC26869.1、AAP44334.1、EEZ80018.1、ZP_05110458.1、1PJB_A、ZP_04717201.1、ZP_04689103.1、CAO90307.1、CAM75354.1、CAA44791.1、BAA77513.1、EGR96638.1、EGL90046.1、YP_004510847.1、ZP_08450330.1、YP_003387804.1、YP_003058152.1、EFS74272.1、EFS67128.1、ZP_06844564.1、YP_826658.1、YP_001195249.1、YP_003095978.1、YP_469292.1、YP_004442054.1、YP_004461174.1、YP_004055616.1、YP_003576656.1、YP_003094537.1、YP_001295973.1、AEE71143.1、YP_004447480.1、YP_003761844.1、YP_040853.1、YP_003154888.1、YP_003142045.1、YP_002280953.1、NP_371963.1、NP_422368.1、EGC98966.1、EGC76398.1、YP_004263661.1、YP_004252039.1、YP_679036.1、YP_499973.1、ZP_08054972.1、ZP_08053009.1、ZP_04067276.1、ZP_03968868.1、ZP_03963857.1、ZP_03933079.1、 ZP_03497046.1、ZP_06668924.1、ZP_06667106.1、ZP_06324464.1、ZP_06196777.1、ZP_05114159.1、ZP_05083968.1、ZP_05070370.1、ZP_05030022.1、ZP_04673064.1、ZP_03517011.1、ZP_03505783.1、XP_001310698.1、ABK27691.1或CAB59281.2。以表現丙胺酸去氫酶之細胞而言，在水溶液中添加足量之無機氮來源(較佳為銨鹽諸如氯化銨或硫酸銨)具有優點。增加丙胺酸濃度之方法係描述於EP12162846.5。

本發明之一態樣提供一種基因剔除於增加式(I)之羧酸酯產製之用途，該基因編碼包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽，且該基因為重組細胞之基因組成的一部分。這表示剔除編碼包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽之基因是為該細胞之特徵，且該基因剔除是為了使式(I)之羧酸酯反應之產物的產率、碳及/或氮平衡及/或純度增加而進行。

在最佳之實施態樣中，本發明提供一種細胞，其係大腸桿菌細胞，該細胞在彼之基因組中具有基因剔除，該基因編碼包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之多肽及多肽FadL，該細胞另表現烷烴羥化酶(較佳為臭味假單胞菌之AlkB)、轉胺酶(較佳為紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12472之轉胺酶)、丙胺酸去氫酶(較佳為枯草芽孢桿菌之丙胺酸去氫酶)及臭味假單胞菌之AlkL。在另一最佳之實施態樣中，該細胞係與脂肪酸酯(較佳為十二酸甲酯)於水溶液中接觸。

圖1顯示不同菌株之Ω-胺基-十二酸產率。

實施例1 使大腸桿菌W3110及BW25113中之bioH失活

需要新穎質體以特定剔除bioH基因(b3412，SEQ ID 1)，使用基礎載體pKO3_E933。新穎質體係以pKO3_E933載體(SEQ ID 14)為基礎，其中500bp被插入bioH基因之上游(SEQ ID 3)且500bp被插入下游(SEQ ID 4)，其間以PspXI切割位點(CCTCGAGG)分開。該完成之質體在內部被稱為AHp-LL-42(SEQ ID 5)。為了完成，使用下列寡核苷酸：

o-LL-314,SEQ ID 6 5'-CCGGGGATCGCGGCCCGGCTTCGCTATCCCATTGGCAGT-3'

o-LL-315,SEQ ID 7 5'-CCTCTGCTTCAACGCCCTCGAGGCATCCGCTATTGTTCTCTTTTGACTTACAAGGATG-3'

o-LL-316,SEQ ID 8 5'-GCGTTGAAGCAGAGGGTGTAGGTG-3'

o-LL-317,SEQ ID 9 5'-TAGAGGATCGCGGCCCAAACTGGCAAGGCAGCTTTATGC-3'

該500bp區域係藉由聚合酶連鎖反應(PCR)利用上述引子提供(該等引子來自大腸桿菌W3110之可用染色體DNA)，o-LL-314+o-LL-315係用於上游區域(SEQ ID 3)，o-LL-316+o-LL-317係用於下游區域(SEQ ID 4)。應用下列PCR參數：初始變性：98℃,10 s

30 x變性：98℃,10 s

30 x黏合：57.9/58.8/59.7/60.6/61.4/62.3/63.2/64.1℃(溫度梯度)

30 x延長：72℃,20 s

最終延長：72℃,4分鐘

在擴增方面，使用New England Biolabs之2x Phusion HF預混試劑(NEB,M0531S)，使用方法根據廠商說明。依照所需純度，PCR產物係直接經由管柱純化(QiaQuick PCR純化套組，Qiagen,Hilden)或經由洋菜膠純化及萃取(QiaQuick膠體萃取套組，Qiagen,Hilden,Germany)。PCR、洋菜膠體電泳、DNA溴化乙啶染色及PCR片段大小測定係以該領域之技藝人士所知之方法進行。兩種情況皆可能提供預期大小之PCR片段。

該經純化之PCR產物藉由重組被選殖至NotI-cut pKO3_E933載體(SEQ ID 14)，根據廠商說明使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech Laboratories Inc.,Mountain View,CA,USA)。經化學勝任之大腸桿菌DH10β(New England Biolabs,Frankfurt,Germany)以該領域之技藝人士所知之方式轉形。目標序列之正確插入係由限制酶分析檢查，導入序列之真偽性係由DNA定序求證。所形成之載體被稱為AHp-LL-42(SEQ ID 5)。

大腸桿菌W3110 △bioH菌株係利用載體AHp-LL-42 (SEQ ID 5)，藉由該領域之技藝人士所知之方法建構(見Link AJ,Phillips D,Church GM.J.Bacteriol.1997.179(20).)。用於本實驗中之菌株BW25113及BW25113 △bioH(JW3375)係購自市售之單一基因剔除變異株集(Keio collection)(見Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants：the Keio collection,Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner and Hirotada Mori,Molecular Systems Biology(2006),2006 EMBO and Nature Publishing Group)。該經建構之菌株之後被稱為：

在W3110中bioH經刪除後之DNA序列係以SEQ ID 10表示。

實施例2

藉由包含bioH基因刪除之大腸桿菌W3110，產製胺基-十二酸甲酯，使用枯草芽孢桿菌ald及紫色色桿菌Cv_2025基因之表現載體與臭味假單胞菌alk操縱子之alkB、alkG、alkT及alkL基因之表現載體之組合。

包含枯草芽孢桿菌ald(編碼丙胺酸去氫酶，經用於大腸桿菌之密碼子最佳化處理)、紫色色桿菌Cv_2025 (編碼轉胺酶，經用於大腸桿菌之密碼子最佳化處理)基因之表現載體與臭味假單胞菌alk操縱子之alkB、alkG、alkT(編碼烷烴單氧化酶、紅素氧還蛋白及紅素氧還蛋白還原酶)及alkL(編碼膜/運輸蛋白)基因之表現載體之組合的大腸桿菌菌株，係藉由製備電勝任性大腸桿菌W3110 △bioH細胞及該對應之E.coli W3110對照菌株產製。此係由該領域之技藝人士所熟知之方式進行。該菌株係如實施例1所述製備。彼等係經質體pBT10_alkL(SEQ ID 11或WO/2011/131420及列於其中之Seq ID NO：8)及pJ294[alaDH_Bs(co)TA_Cv(co)](SEQ ID NO 12或WO/2013/024114之實施例1及列於其中之SEQ ID No.17)轉形，並接種於包含卡那黴素(50μg/ml)及安比西林(100μg/ml)之LB洋菜板。轉形物係藉由質體製備及分析性限制酶分析檢查正確質體是否存在。以此方式建構下列菌株：

該等菌株經饋料批式醱酵處理，以分析自十二酸甲酯產製羥基-十二酸甲酯、側氧-十二酸甲酯、羧基-十二酸甲酯及胺基-十二酸甲酯之能力。利用DASGIP之8倍平行醱酵系統進行。

該醱酵係利用1公升反應器進行。pH探針藉由使用pH 4.0及pH 7.0之標準溶液的二點校正法校正。該反應器裝入300ml自來水，於121℃高壓滅菌20分鐘以確保無菌性。接著在DASGIP系統上極化pO2探針隔夜(至少6小時)。隔天早上，在無塵操作台移除水並以300ml包含100mg/l安比西林、50mg/l卡那黴素及5mg/l四環素之高細胞密度培養基取代之。隨後利用一點校正法校正pO2探針(攪拌：400rpm/通氣：10sL/h空氣)並藉由就地清潔(Clean-in-Place)清潔饋料、校正劑及誘導線。為達成此目的，用70%乙醇沖洗管路，然後用1M NaOH沖洗，接著以無菌去離子水沖洗，最後填充個別培養基。

該等產製ALS及ALSME之大腸桿菌菌株首先自個別冷凍原液生長，於包含100mg/l安比西林之LB培養基(25ml於100ml擋板燒瓶中)在37℃下以200rpm攪拌隔夜約18小時。在各例中，接著將2ml之培養液轉移至包含100mg/l安比西林、50mg/l卡納黴素及5mg/l四環黴素之高細胞密度培養基(葡萄糖15g/l(30ml/l經分開高壓滅菌之500g/l原液，其包含1% MgSO₄*7H₂O及2.2% NH₄Cl)、(NH₄)₂SO₄ 1.76g/l、K₂HPO₄ 19.08g/l、KH₂PO₄ 12.5g/l、酵母菌萃取物6.66g/l、檸檬酸三鈉二水合物2.24g/l、檸檬酸鐵銨17ml/l經分開高壓滅菌之1%強度原液、微量元素溶液5ml/l經分開高壓滅菌原液(HCl(37%)36.50g/l、MnCl₂*4H₂O 1.91g/l、ZnSO₄*7H₂O 1.87g/l、乙二銨四乙酸二水合物0.84g/l、 H₃BO₃ 0.30g/l、Na₂MoO₄*2H₂O 0.25g/l、CaCl₂*2H₂O 4.70g/l、FeSO₄*7H₂O 17.80g/l、CuCl₂*2H₂O 0.15g/l))(每株25ml於100ml擋板燒瓶中)中於37℃/200rpm下再培養5.5小時。

該反應器係經接種為光學密度0.1，藉由(在無菌條件下)抽取對應體積之預培養物至5ml針筒，並經由覆蓋70%乙醇隔膜藉由導管接種該反應器。

使用下列標準計畫：

該進行之實驗可被分成生長及後續生物轉化二相，在生長相期間細胞必須達到特定光學密度，在生物轉化期間，當添加底物十二酸甲酯之後，應該發生藉由表現期間所形成之酶之反應以產生胺基-十二酸酯。該pH值係經氨(12.5%)單方面調整至pH 6.8。在生長及生物轉化期間，培養液中之溶氧(DO)係經由攪拌器之轉速及充氣速率控制在30%。醱酵係藉由饋料批式之方式進行，5g/lh葡萄糖饋料(500g/l葡萄糖，其包含1% MgSO₄*7H₂O及2.2% NH₄Cl)之開始係經由DO尖峰引發。同時，隨著饋料開始，溫度自原先的37℃降低至30℃。轉胺酶、丙胺酸去氫酶及脂肪酸還原酶之表現係於饋料開始後2小時藉由自動添加IPTG(1mM)誘導。該等alk基因係於饋料開始後10小時藉由手動添加DCPK(0.025Vol.-%)誘導。在開始生物轉化之前，測定該培養液之光學密度。

該生物轉化期係於饋料開始後14小時開始。為達此目的，150ml十二酸甲酯與離子交換劑油酸(工業級，90%)之混合物以批式被添加至該醱酵液。為了提供轉胺酶之胺基供體，在生物轉化開始之前的半小時，添加5ml 之3M硫酸銨溶液至該醱酵液。自槽中取出2ml醱酵液樣本，並以丙酮/HCl混合物(c(HCl)=0.1mol/l)稀釋彼之一部分1/20並萃取之。樣本係於生物轉化開始後1h、2h、3h、4h、5h、7.5h、10.5h、19.5h及21h取自所有反應器。氧及碳之轉換率(OTR=氧轉換率，CTR=碳轉換率)係於醱酵期間在DASGIP系統上藉由排氣分析測定。醱酵於生物轉化開始後21小時停止。關閉攪拌器、充氣裝置及溫度和pH控制器，使槽靜置5至10分鐘。

為了量化醱酵樣本中之DDS(C12-二-羧酸)、DDSME(C12-二-羧酸甲酯)、LS(十二酸[Laurinsäure])、LSME(十二酸甲酯[Laurinsäure-Methylester])、HLS(Ω-羥基-十二酸[omega-Hydroxy-Laurinsäure])、HLSME(Ω-羥基-十二酸甲酯[omega-Hydroxy-Laurinsäure-Methylester])、OLS(Ω-側氧-十二酸[omega-Oxo-Laurinsäure])、OLSME OLS(Ω-側氧-十二酸甲酯[omega-Oxo-Laurinsäure-Methylester])、ALS(Ω-胺基-十二酸[omega-Amino-Laurinsäure])及ALSME(Ω-胺基-十二酸甲酯[omega-Amino-Laurinsäure-Methylester])，在培養期間收集樣本。這些樣本係經製備以用於分析(見以LC-ESI/MS²定量產物)。

以LC-ESI/MS²定量產物

ALS、ALSME、DDS、DDSME、LS、LSME、HLS、 HLSME、OLS及OLSME於醱酵樣本中之定量係藉由LC-ESI/MS²進行，根據用於所有分析物之外部校正(0.1至50mg/L)及使用內部標準物如胺基-十一酸(AUD，用於HLS、DDS、OLS、HLSME、OLSME)、d4-ALSME(用於ALSME)、¹³C-DDSME(用於DDSME)、d3-LS(用於LS)及d3-LSME(用於LSME)。

使用下列儀器設備：

‧HPLC系統1260(Agilent；Böblingen,Germany)，配備自動取樣機(G1367E)、雙幫浦(G1312B)及恆溫管柱(G1316A)

‧質譜儀TripelQuad 6410(Agilent；Böblingen,Germany)，配備ESI來源

‧HPLC管柱：Kinetex C18，100 x 2.1mm，粒子大小：2.6μm，孔徑大小100Å(Phenomenex；Aschaffenburg,Germany)

‧前置管柱：KrudKatcher Ultra HPLC管線過濾器；0.5μm濾池深度及0.004mm內徑(Phenomenex；Aschaffenburg,Germany)

樣本係藉由微量吸管吸取1900μl溶劑(80%(v/v)ACN，20%雙蒸餾H₂O(v/v)，+0.1%甲酸)及100μl樣本至2ml反應槽製備。該混合物經震盪約10秒，然後以約13000rpm離心5分鐘。使用微量吸管吸取澄清上清液，經稀釋劑(80%(v/v)ACN，20%雙蒸餾H₂O(v/v)，+0.1%甲酸)適當稀釋後分析。在各例中，添加100μl ISTD至900μl樣本(10μl之樣本體積為90μl)。

利用上述管柱及前置管柱進行HPLC分離。注射體積0.7μl，管柱溫度50℃，流速0.6ml/min。流動相係由洗脫液A(0.1%強度(v/v)甲酸水溶液)與洗脫液B(含0.1%(v/v)甲酸之乙腈)組成。使用下列梯度操作：

ESI-MS²分析係於正離子模式使用下列ESI來源參數進行：

‧氣體溫度280℃

‧氣流11l/min

‧噴霧器壓力50psi

‧毛細管電壓4000V

化合物ALS、ALSME、DDS、DDSME、HLS、HLSME、OLS、OLSME之檢測及定量係利用下列MRM參數進行，各例中一產物離子被用來作為定性離子，一被用來作為定量離子：

分析物LS及LSME係於SIM模式下檢測(m/z 201及215)。

結果

基因剔除大腸桿菌W3110之bioH之後，減少游離酸胺基-十二酸、十二烷二酸及十二酸之形成。

相較於具有完整bioH之對照菌株，bioH基因剔除菌株展現顯著減少之游離酸胺基-十二酸、十二烷二酸及十二酸之形成。計算十二烷二酸(DDS)及十二烷二酸甲酯(DDSME)、胺基-十二酸(ALS)及胺基-十二酸甲酯(ALSME)和十二酸(LS)及十二酸甲酯(LSME)之絕對終力價比，並以百分比表示。

該bioH基因剔除對游離酸形成之影響變得清楚可見，以約7.10之因數(DDS/DDSME)至9.75之因數(ALS/ALSME)之間減少。

基因剔除大腸桿菌W3110之bioH之後改善產物/二次產物比

評估在固定時間之後(=生物轉化結束)所達到的絕對力價。菌株背景W3110 △bioH展現顯著改善之產物(ALS及ALSME)對主要二次產物(DDS及DDSME)比，其終產物力價維持相同。該比自49.17% ALS(ME)上升至82.10% ALS(ME)。

實施例3

藉由具有bioH基因刪除之大腸桿菌，產製胺基-十二酸甲酯，使用枯草芽孢桿菌ald及紫色色桿菌Cv_2025基因與臭味假單胞菌alk操縱子之alkB、alkG、alkT及alkL基因之表現載體。

包含枯草芽孢桿菌ald(編碼丙胺酸去氫酶，經用於大腸桿菌之密碼子最佳化處理)、紫色色桿菌Cv_2025(編碼轉胺酶，經用於熱帶念珠菌(C.tropicalis)之密碼子最佳化處理)、臭味假單胞菌alk操縱子之alkB、alkG、alkT(編碼烷烴單氧化酶、紅素氧還蛋白及紅素氧還蛋白還原酶)及alkL(編碼膜/運輸蛋白)之基因的表現載體之大腸桿菌菌株，係藉由製備電勝任性大腸桿菌BW25113 △bioH細胞及該對應之E.coli BW25113對照菌株產製。此係由該領域之技藝人士所熟知之方式進行。菌株係來自市售Keio collection。這些菌株經質體pACYC184{MCS2.0}[alkST_BFGL][alaDH_Bs(co){PspXI}TAcv(ct)](WO/2013/024114之SEQ ID 13及實施例1及列於其中之SEQ ID No.17)轉形，並接種於包含氯黴素(50μg/ml)之LB洋菜板。轉形物係藉由質體製備及分析性限制酶分析檢查正確質體是否存在。以此方式建構下列菌株：

該等菌株經饋料批式醱酵處理，以分析自十二酸甲酯產製羥基-十二酸甲酯、側氧-十二酸甲酯、羧基-十二酸甲酯及胺基-十二酸甲酯之能力。利用DASGIP之8倍平行醱酵系統進行。其他實驗步驟完全如實施例2所述。

結果

基因剔除大腸桿菌BW25113之bioH之後，減少游離酸胺基-十二酸、十二烷二酸、十二酸及羥基-十二酸之形成。

相較於具有完整bioH之對照菌株，bioH基因剔除菌株展現顯著減少之游離酸胺基-十二酸、十二烷二酸、十二酸及羥基-十二酸之形成，部分低於檢測極限。計算十二烷二酸(DDS)及十二烷二酸甲酯(DDSME)、胺基-十二酸(ALS)及胺基-十二酸甲酯(ALSME)、羥基-十二酸(HLS)及羥基-十二酸甲酯(HLSME)和十二酸(LS)及十二酸甲酯(LSME)之絕對終力價比，並以百分比表示。

DDS/DDSME比係唯一能以數學表示之比：

基因剔除bioH以33.5之因數減少DDS形成，所有其他游離酸低於檢測下限。

基因剔除大腸桿菌BW25113之bioH之後經延長之氧化期

結果發現，相較於對照菌株，bioH基因剔除株之初期氧化表現並未下降，以整個過程中ALSME之形成而言仍維持幾乎穩定。

圖1顯示：在相同條件下，基因剔除bioH造成以終力價為基礎之產率增加47%。

基因剔除大腸桿菌BW25113之bioH之後，增加胺基-十二酸甲酯之形成率

評估在固定時間之後(=生物轉化結束)所達到的絕對力價。此處，該基因剔除株展現顯著較高之產物形成率，即每公升每小時0.75g之ALSME，相較於野生株每公升每小時0.51g之ALSME。

基因剔除大腸桿菌BW25113之bioH之後經改善之產物/二次產物比

評估在固定時間之後(=生物轉化結束)所達到的絕對力價。此處，基因剔除株背景展現顯著改善之產物(ALS及ALSME)對主要二次產物(DDS及DDSME)之比。

該比率因為bioH基因剔除增加43.9%。產物力價增加43.9%，二次產物力價維持不變。

基因剔除大腸桿菌BW25113之bioH之後，增加用於產製胺基-十二酸及胺基-十二酸甲酯之葡萄糖產率係數(Y _P/S )

胺基-十二酸及胺基-十二酸甲酯之最終累積絕對力價係與葡萄糖使用量比較評估。

葡萄糖產率係數自每克葡萄糖0.21g/l ALS(ME)，增加46%至每克葡萄糖0.30g/l ALS(ME)，這是因為bioH基因剔除。

<110> 贏創工業股份有限公司(Evonik Industries AG)

<120> 使羧酸酯反應之方法

<140> TW 102141056

<141> 2013-11-12

<150> EP 12007663.3

<151> 2013-11-12

<160> 14

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 771

<212> DNA

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(771)

<400> 1

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<400> 2

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<400> 3

<210> 4

<211> 500

<212> DNA

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<400> 4

<210> 5

<211> 6654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 載體

<400> 5

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 9

<210> 10

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 形成k/o基因

<400> 10

<210> 11

<211> 12348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 載體

<400> 11

<210> 12

<211> 6834

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 載體

<400> 12

<210> 13

<211>14403

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 載體

<400> 13

<210> 14

<211> 5664

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 載體

<400> 14

Claims

一種藉由細胞使式(I)之羧酸酯反應以產製胺化羧酸酯之方法，R¹-A-COOR² (I)，其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自C_1-4烷基，其中R³係選自氫及C_1-4烷基，且其中A係具有至少4個碳原子之伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基，該方法包含下列步驟：a)使該細胞與該羧酸酯於水溶液中接觸，其中該細胞係表現烷烴羥化酶之重組細胞，該重組細胞相較於對應之野生型細胞具有減少之bioH多肽的活性，該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體，該變異體與SEQ ID NO 2具有至少70%一致性且具有與該包含SEQ ID NO 2之多肽實質相同之酶催化活性，該重組細胞包含多肽，該多肽具有與臭味假單胞菌AlkL之230個連續胺基酸至少80%序列一致性且具有與臭味假單胞菌AlkL實質相同之酶催化活性，其中該多肽可選擇地被過度表現，該細胞相較於該野生型細胞因剔除而具有降低之至少一種催化脂肪酸β-氧化之任何反應的酶之活性，且該催化脂肪酸β-氧化之任何反應的至少一種酶係選自脂肪酸-CoA連接酶、醯基-CoA去氫酶、2,4-二烯醯基-CoA還原酶、烯醯基-CoA水合酶、3-酮醯基-CoA硫解酶及脂肪酸輸入蛋白，其中相較於該野生型細胞所產製者，該重組細胞所產製的衍生自該式(I)之羧酸酯的胺化羧酸和彼之一或多種二羧酸及/或酯二者減少。
如申請專利範圍第1項之方法，其另包含下列步驟：b)使該水溶液與包含陽離子交換劑之疏水性有機溶液接觸。
如申請專利範圍第1項之方法，其中A係式-(CH₂)_n-之伸烷基，其中n係至少4。
如申請專利範圍第1項之方法，其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO及-CH₂NH₂。
如申請專利範圍第1項之方法，其中A係具有至少6個碳原子之伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該細胞另表現轉胺酶。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該細胞另表現丙胺酸去氫酶。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該細胞另具有AlkL家族之蛋白。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該細胞具有一種催化脂肪酸β-氧化之任何反應的酶之活性，該活性相較於彼之野生型者為低，其中該酶係FadL或彼之變異體。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該細胞具有及/或過度表現選自呈重組形式之烷烴羥化酶、醇去氫酶、轉胺酶、丙胺酸去氫酶及AlkL家族蛋白中至少一種酶。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之bioH多肽的活性比該野生型細胞者為低，因為剔除編碼包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之bioH多肽的基因。
一種表現重組烷烴羥化酶之細胞，其中該包含SEQ ID NO 2或彼之變異體之bioH多肽的活性比該野生型細胞者為低。
如申請專利範圍第12項之細胞，其中該烷烴羥化酶係選自AlkB單氧化酶及CYP153家族之細胞色素P450單氧化酶之烷烴羥化酶。
一種反應混合物，其包含於水溶液中如申請專利範圍第12及13項中任一項之細胞及式(I)之羧酸酯，R¹-A-COOR² (I)，其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自C_1-4烷基，其中R³係選自氫及C_1-4烷基，且其中A係具有至少4個碳原子之伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基。
如申請專利範圍第14項之反應混合物，其另包含疏水性有機溶液，該疏水性有機溶液含有陽離子交換劑。
一種重組細胞於使式(I)之羧酸酯反應之用途，該重組細胞相較於野生型細胞具有減少之bioH多肽的活性，該多肽包含SEQ ID NO 2或彼之變異體，R¹-A-COOR² (I)，其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自C_1-4烷基，其中R³係選自氫及C_1-4烷基，且其中A係具有至少4個碳原子之伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基。
一種基因剔除於增加式(I)之羧酸酯產製之用途，該基因編碼包括SEQ ID NO 2或彼之變異體之bioH多肽，且該基因剔除為重組細胞相較於對應之野生型細胞得以增加該式(I)之羧酸酯產製之基因組成的一部分，R¹-A-COOR² (I)，其中R¹係選自氫、-CH₂OH、-CHO、-COOR³、-CH₂SH、-CH₂OR³及-CH₂NH₂，其中R²係選自C_1-4烷基，其中R³係選自氫及C_1-4烷基，且其中A係具有至少4個碳原子之伸烷基、伸烯基、伸芳基或伸芳烷基。