KR20170061088A - ω-관능화 카르복실산 및 그의 에스테르의 생명공학적 생산 - Google Patents

ω-관능화 카르복실산 및 그의 에스테르의 생명공학적 생산 Download PDF

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빌헬름 브뤼긴크
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Abstract

적어도 1종의 알칸으로부터 적어도 1종의 오메가-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하기 위한 미생물 세포이며, 여기서 세포는
(i) 알칸을 상응하는 1-알칸올로 전환시킬 수 있는 효소 E1;
(ii) (i)의 1-알칸올을 상응하는 1-알칸알로 전환시킬 수 있는 효소 E2;
(iii) (ii)의 1-알칸알을 상응하는 알칸산으로 전환시킬 수 있는 효소 E3;
(iv) (iii)의 알칸산을 상응하는 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E4; 및
(v) (iv)의 알칸산 에스테르를 상응하는 오메가-히드록시-알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E5
의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 유전자 변형되고,
세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 E20-E24:
- EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.2.22의 E20 아실-ACP 티오에스테라제,
- EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 또는 EC 3.1.2.22의 E21 아실-CoA 티오에스테라제,
- E22 아실-CoA:ACP 트랜스아실라제,
- E23 폴리케티드 신타제, 및
- E24 헥산산 신타제
중 적어도 1종의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 유전자 변형을 포함하지 않는 것인
미생물 세포가 제공된다.

Description

ω-관능화 카르복실산 및 그의 에스테르의 생명공학적 생산 {BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF ω-FUNCTIONALISED CARBOXYLIC ACIDS AND ESTERS THEREOF}
본 발명은 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 생명공학적 방법에 관한 것이다. 특히, 이 방법은 출발 물질로서의 알칸 및 알칸을 상응하는 ω-관능화 카르복실산 에스테르로 전환시키도록 유전자 변형된 세포를 사용할 수 있다.
ω-아미노카르복실산 및 그의 상응하는 락탐, 예컨대 ω-아미노라우르산, ω-아미노운데칸산, 라우로락탐 등을 비롯한 ω-관능화 카르복실산 및 상응하는 에스테르는 고성능 폴리아미드의 생산에 중요한 단량체이다. 석유화학 또는 재생가능한 공급원료로부터 이들 단량체를 생산하는데 사용되어 온 기존의 화학 기술의 일부는 하기를 포함한다:
i) 팜핵 또는 코코넛 오일로부터 제조된 바이오디젤 분획인, 라우르산 메틸 에스테르로부터의 ω-아미노라우르산의 생산
ii) 피마자 오일로부터 제조된, 리시놀레산으로부터의 ω-아미노운데칸산의 생산
iii) 부타디엔으로부터의 라우로락탐의 생산
이들 3가지 생산 방법은 모두 경쟁적으로 유지되는데, 주어진 위치 및 시점에서의 그의 경쟁성은 방법을 실행하기 위한 원료 비용 및 에너지 비용을 비롯한 다수의 요인에 따라 좌우된다.
관련 기술분야에 공지된 ω-관능화 카르복실산 및/또는 그의 에스테르를 생산하는 여러 생명공학적 수단이 존재한다. 예를 들어, 기질로서 사용된 카르복실산으로부터 ω-관능화 카르복실산을 생산할 수 있는 유전자 변형된 세포는 이전에 적어도 WO2009077461 및 EP2322598에 기재된 바 있다. β-산화 경로가 세포에서 차단되고, ω-관능화 카르복실산이 기질로서 사용된 지방산으로부터 형성되는, 칸디다(Candida) 세포를 사용한 매우 유사한 절차가 WO2011008232에 기재되어 있다. 이들 방법은 출발 물질로서 지방산을 사용하는 단점을 갖는다. 이는 사용되는 지방산 및 그의 유도체가 주로 식물성 및 동물성 오일 또는 지방으로부터만 전적으로 수득되기 때문이다. 원료로서의 동물성 지방은 여전히 거의 클라이언트 허용되지 않고 있으며, 짧은- 및 중간-길이 지방산을 함유하는 식물성 오일은 입수하기 어렵거나 또는 (우림의 파괴의 결과로) 오직 열대 지방에서만 생산된다. 또한, 특정한 식물성 및 동물성 오일 또는 지방 원료는 특정하지만, 한정된 지방산 프로파일을 가져 연계된 생산을 발생시킨다.
WO2013024114는 단순 탄소 공급원, 예컨대 (글루코스, 사카로스, 아라비노스, 크실로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스, 뿐만 아니라 글리세린 또는 매우 단순한 유기 분자, 예컨대 CO2, CO 또는 합성 가스)로부터 ω-관능화 카르복실산 및/또는 그의 에스테르를 생산하는 방법을 개시한다. 이들 단순 당, 특히 글루코스는 통상적으로 입수하기 위해 더 많은 비용이 든다. 단순 탄소 공급원으로부터 ω-관능화 카르복실산 및/또는 그의 에스테르를 생산하는 방법은 또한 이 방법에 사용되는 세포가 우선 이들 단순 탄소 공급원으로부터의 카르복실산의 생산을 증가시키도록 유전자 변형되어야 하기 때문에 복잡한 것으로 여겨질 수 있다. 이에 따라 생산 비용이 증가하게 된다.
따라서, 효율적이고 효과적인 생산을 가능하게 하는 또 다른 원료 공급원으로부터 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 방법에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
본 발명은 적어도 1종의 알칸으로부터 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산할 수 있는 적어도 1종의 유전자 변형된 미생물 세포를 제공함으로써 상기 문제를 해결하고자 한다. ω-관능화 카르복실산 에스테르는 ω-히드록시, ω-옥소, ω-카르복시 및 ω-아미노 카르복실산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 방법에서 이들 유전자 변형된 세포를 사용하는 것은 그의 생산을 위해 용이하게 이용가능한 대안적 석유화학 원료의 사용을 가능하게 함으로써 이들 화합물의 생산에 대해 유연성을 부가할 수 있다. 또한, 그 내부에서 알칸을 지방산 에스테르 및 그의 상응하는 ω-관능화 유도체로 전환시키는 전체 수단을 통합할 수 있는 전세포 생체촉매의 사용은, 단지 적은 수의 공정 단계가 전환에 관여하도록 함으로써 전환 공정을 보다 간단하게 만든다. 지방산 및 탄소 기질로서의 단순 탄소 공급원의 의존이 또한 없어진다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 적어도 1종의 알칸으로부터 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하기 위한 미생물 세포이며, 여기서 세포는
(i) 알칸을 상응하는 1-알칸올로 전환시킬 수 있는 효소 E1;
(ii) (i)의 1-알칸올을 상응하는 1-알칸알로 전환시킬 수 있는 효소 E2;
(iii) (ii)의 1-알칸알을 상응하는 알칸산으로 전환시킬 수 있는 효소 E3;
(iv) (iii)의 알칸산을 상응하는 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E4; 및
(v) (iv)의 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E5
의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 것인 미생물 세포가 제공된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물 세포는 적어도 1종의 단순 탄소 공급원으로부터 카르복실산 또는 카르복실레이트 에스테르의 형성을 증가시키는 이전/사전 변형을 갖지 않는 세포를 지칭한다. 용어 "단순 탄소 공급원"은 탄소 골격에서 적어도 1개의 C-C 결합이 깨진 탄소 공급원을 의미하는 것으로 이해된다. 특히, 단순 탄소 공급원은 적어도 1종의 탄수화물, 예컨대 예를 들어 글루코스, 사카로스, 아라비노스, 크실로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스일 수 있을 뿐만 아니라, 탄소 공급원은 글리세린 또는 매우 단순한 유기 분자, 예컨대 CO2, CO 또는 합성 가스를 포함할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물 세포는 하기 효소:
- EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.2.22의 E20 아실-ACP 티오에스테라제,
- EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 또는 EC 3.1.2.22의 E21 아실-CoA 티오에스테라제,
- E22 아실-CoA:ACP 트랜스아실라제,
- 카르복실산 및 카르복실레이트 에스테르의 합성에 관여하는 반응을 촉매하는 E23 폴리케티드 신타제, 및
- E24 헥산산 신타제
중 적어도 1종의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 유전자 변형되지 않을 수도 있다.
한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는
(vi) (v)의 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6; 및
(vii) (vi)의 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-아미노 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E7
의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 추가의 유전자 변형을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는
(vi) (v)의 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6;
(vii) (vi)의 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E13, 및
(viii) (vii)의 ω-카르복시 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 디에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E14
의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 추가의 유전자 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 높은 시공간 수율, 높은 탄소 수율 및 배양 상청액 중 높은 농도로 모든 알칸으로부터 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는데 사용될 수 있다. 이들 이점의 결과로서, 효율적 후처리가 용이해진다.
세포 또는 미생물과 함께 본원에 사용된 어구 "야생형"은 야생에서 자연적으로 보이는 것과 같은 형태인 게놈 구성을 갖는 세포를 나타낼 수 있다. 이 용어는 전세포 및 개별 유전자 둘 다에 적용가능할 수 있다. 따라서 용어 '야생형'은 또한 다른 측면에서 (즉, 1종 이상의 유전자와 관련하여) 유전자 변형되었으나 관심 유전자와 관련하여 유전자 변형되지는 않은 세포를 포함할 수 있다. 이에 따라 용어 "야생형"은 특정 관심 유전자의 유전자 서열이 재조합 방법을 사용하여 인위적으로 적어도 부분적으로 변경된 이러한 세포는 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 임의의 측면에 따른 야생형 세포는 전체 게놈 및/또는 특정한 유전자와 관련하여 유전자 돌연변이를 갖지 않는 세포를 지칭한다. 따라서, 한 예에서, 야생형 세포는 효소 E1과 관련하여 세포에서 효소 E1의 자연적/비-변경된 발현을 갖는 세포를 지칭할 수 있다. 야생형 세포는 효소 E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11, E12, E13, E14, E15 등과 관련하여 동일한 방식으로 해석될 수 있고, 세포에서 각각 효소 E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11, E12, E13, E14, E15 등의 자연적/비-변경된 발현을 갖는 세포를 지칭할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 임의의 효소는 단리된 효소일 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 효소는 활성 상태로 및 그의 활성에 필수적인 모든 보조인자, 기질, 보조제 및/또는 활성화 폴리펩티드 또는 인자의 존재 하에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 관심 효소가 그것이 자연적으로 발생하는 세포에 비해 풍부화된 것을 의미한다. 효소는 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 및/또는 활성 검정에 의해 풍부화될 수 있다. 예를 들면, 관심 효소는 쿠마시 블루 염료를 사용한 염색 후 폴리아크릴아미드 겔의 시각적 검사에 의해 판단시에 제제에 존재하는 모든 폴리펩티드의 5, 10, 20, 50, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 퍼센트 초과를 구성할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 효소는 재조합적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재조합"은 자연적으로는 그와 같이 발생하지 않으나 유전자 조작의 결과인 분자이거나 또는 이러한 분자에 의해 코딩되는 것, 특히 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭하거나, 또는 재조합 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 핵산 분자는, 그것이 촉매 활성 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하고 촉매 활성 폴리펩티드가 원래의 비변경된 핵산 분자를 포함하는 상응하는 야생형 세포에서의 폴리펩티드의 수준에 비해 과다발현되도록 프로모터가 조작된 경우에, 재조합적이다.
통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포 또는 미생물을 유전자 변형시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 유전자 변형된 세포는 정해진 시간 간격에, 2시간 이내, 특히 8시간 또는 24시간 이내에, 그것이 야생형 세포보다 적어도 1배 또는 2배, 특히 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 적어도 10000배 더 많은 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 형성하도록 유전자 변형될 수 있다. 산물 형성의 증가는 예를 들어 적합한 영양 배지에서 특정된 시간 간격 동안 동일한 조건 (동일한 세포 밀도, 동일한 영양 배지, 동일한 배양 조건) 하에 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포 및 야생형 세포를 각각 별개로 배양한 다음, 영양 배지에서의 표적 산물 (ω-관능화 카르복실산 에스테르)의 양을 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다.
유전자 변형된 세포 또는 미생물은 야생형 세포 또는 미생물과 유전적으로 상이할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물과 야생형 미생물 사이의 유전적 차이는 야생형 미생물에는 부재할 수 있는 유전자 변형된 미생물 내의 완전한 유전자, 아미노산, 뉴클레오티드 등의 존재일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물은 미생물이 야생형 세포에 비해 더 많은 1-알칸올, 1-알칸알, 알칸산, 알칸산 에스테르, 오메가-히드록시 알칸산 에스테르 등을 생산할 수 있도록 하는 효소를 포함할 수 있다. 야생형 미생물은 본 발명의 유전자 변형된 미생물에 비해 유전자 변형된 미생물이 1-알칸올, 1-알칸알, 알칸산, 알칸산 에스테르, 오메가-히드록시 알칸산 에스테르 등을 생산할 수 있도록 하는 효소의 검출가능한 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않을 수 있다. 본원에 사용된 용어 '유전자 변형된 미생물'은 용어 '유전자 변형된 세포'와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형은 미생물의 세포 상에서 수행된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 유전자 변환된다. 특히, 세포는 WO2013024114에 개시된 방법에 따라 생산될 수 있다.
본원에 사용된 어구 '유전자 변형된 세포가 그의 야생형과 비교하여 효소의 증가된 활성을 갖는다'는 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 100배, 보다 더 특히 적어도 1000배 및 훨씬 더 특히 적어도 10000배 증가된 각 효소의 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "효소의 증가된 활성"은 증가된 세포내 활성으로 이해되어야 한다. 기본적으로, 효소 활성의 증가는 효소를 코딩하는 유전자 서열 또는 유전자 서열들의 카피수를 증가시킴으로써, 강력한 프로모터를 사용하거나 또는 증가된 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용함으로써, 유전자의 코돈 용법을 변경시킴으로써, 다양한 방식으로 mRNA 또는 효소의 반감기를 증가시킴으로써, 유전자 발현의 조절을 변형시킴으로써, 및 임의적으로 이들 조치를 조합함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 유전자 변형된 세포는 예를 들면 원하는 유전자, 이 유전자의 대립유전자 또는 그의 일부를 함유하는 벡터, 및 유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터를 사용한 형질전환, 형질도입, 접합 또는 이들 방법의 조합에 의해 생산된다. 이종 발현은 특히 유전자 또는 대립유전자의 세포의 염색체 또는 염색체외 복제 벡터에의 통합에 의해 달성된다.
동일한 맥락에서, 본 발명의 임의의 측면과 관련하여 사용된 어구 "효소 Ex의 감소된 활성"은 적어도 0.5배, 특히 적어도 0.1배, 보다 특히 적어도 0.01배, 훨씬 더 특히 적어도 0.001배 및 가장 특히 적어도 0.0001배 감소된 활성을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 어구 "감소된 활성"은 또한 검출가능한 활성을 포함하지 않는다 ("0의 활성"). 특정 효소의 활성의 감소는 예를 들어 선택적 돌연변이, 또는 특정 효소의 활성을 감소시키기 위한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 조치에 의해 이루어질 수 있다. 특히, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 유전자의 개재에 의한 단백질 발현의 변형 및 감소 및 그에 수반되는 효소 활성의 저하에 대한 지침을, 예를 들어 적어도 [Dubeau et al. 2009. Singh & Roehm. 2008., Lee et al., 2009] 등에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포에서의 효소 활성의 감소는 핵산 서열 중 하나를 포함하는 유전자의 변형에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 변형은 외래 DNA의 유전자에의 삽입, 유전자의 적어도 일부의 결실, 유전자 서열의 점 돌연변이, RNA 간섭 (siRNA), 안티센스 RNA 또는 유전자에 플랭킹된 조절 서열, 예컨대 예를 들어 프로모터 및 터미네이터 또는 리보솜 결합 부위의 변형 (삽입, 결실 또는 점 돌연변이)을 포함하는, 이로 이루어진, 군으로부터 선택된다.
외래 DNA는 이와 관련하여 유전자에 대해 "외래"이고 (유기체에 대해서는 외래가 아닌) 임의의 DNA 서열을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 즉 내인성 DNA 서열은 또한 이와 관련하여 "외래 DNA"로서 기능할 수 있다. 이와 관련하여, 유전자가 선택 마커 유전자의 삽입에 의해 개재되고 이에 따라 외래 DNA가 선택 마커 유전자인 것이 특히 바람직하며, 여기서 바람직하게는 삽입은 유전자좌에서의 상동 재조합에 의해 이루어졌다.
상기에 언급되고 하기에 언급되는 모든 효소 및 유전자의 발현은 1- 및 2-차원 단백질 겔 분리 후 적절한 평가 소프트웨어를 사용한 겔 내의 단백질 농도의 광학적 확인에 의해 결정가능하다. 효소 활성의 증가가 상응하는 유전자 발현의 증가에만 전적으로 기초하는 경우에, 효소 활성의 증가의 정량화는 야생형과 유전자 변형된 세포 사이의 1- 또는 2-차원 단백질 분리의 비교에 의해 간단하게 결정될 수 있다. 박테리아를 사용하는 단백질 겔의 제조 및 단백질의 확인을 위한 통상적인 방법은 문헌 [Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001))에 기재된 절차이다. 단백질 농도는 또한 결정할 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 혼성화 (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) 후에 농도 결정을 위한 적절한 소프트웨어를 사용한 광학적 평가 (Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647)에 의해 분석될 수 있다. 이 방법은 또한 결정할 효소 활성에 의해 촉매될 반응의 가능한 산물이 미생물에서 빠르게 대사될 수 있는 경우에, 또는 다르게는 야생형에서의 활성이 그 자체로 결정할 효소 활성을 산물 형성에 기초하여 적절하게 결정할 수 있도록 하기에는 너무 낮은 경우에 항상 사용된다.
특히,
- 효소 E1은 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- 효소 E2는 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 알콜 옥시다제 (Ec) 및 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- 효소 E3은 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알데히드 데히드로게나제 (Ee), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ec, Edi, 및 Edii는 1-알칸올을 1-알칸알을 통해 상응하는 알칸산으로 직접 산화시킬 수 있고;
- 효소 E4는 왁스-에스테르 신타제 (Ef) 및 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (Eg)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- 효소 E5는 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- 효소 E6은 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알콜 옥시다제 (Ec) 및 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- 효소 E7은 ω-트랜스아미나제 (Eh)일 수 있다.
한 예에서, 효소 E1, E2, E3 및 E5는 각각 그의 활성을 수행할 수 있는 상이한 효소일 수 있다. 예를 들어, E1은 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있고, E2는 알콜 옥시다제 (Ec)일 수 있고, E3은 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제일 수 있고, E5는 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있다. 또 다른 예에서, E1은 P450 알칸 히드록실라제 (Ea)일 수 있고, E2는 알콜 데히드로게나제 (Ec)일 수 있고, E3은 알데히드 데히드로게나제 (Ee)일 수 있고, E5는 P450 알칸 히드록실라제일 수 있다. 특히, E1, E2, E3 및 E5의 효소의 임의의 조합이 그의 특정 기능을 수행하는데 사용될 수 있다. 추가 예에서, E1, E2, E3 및 E5는 동일한 효소일 수 있다. 이러한 예에서, E1, E2, E3 및 E5는 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 예에서, E1, E2, E3 및 E5는 P450 알칸 히드록실라제 (Ea)일 수 있다. 이러한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 효소 E1, E2, E3 및 E5의 기능을 충족시키는 P450 알칸 히드록실라제 (Ea)의 증가된 발현을 포함한다. 또 다른 예에서, E1, E2, E3 및 E5는 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있다. 이러한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 효소 E1, E2, E3 및 E5의 기능을 충족시키는 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)의 증가된 발현을 포함한다.
효소 Ea 내지 Eh는 아미노산 잔기의 최대 60%, 바람직하게는 최대 25%, 특히 최대 15%, 특히 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%가 하기 참조 서열 (수탁 번호)과 비교하여 결실, 삽입, 치환 또는 그의 조합에 의해 변형되고, 상응하는, 하기 참조 서열을 갖는 단백질 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 65%, 특히 바람직하게는 80%, 특히 90% 초과를 여전히 보유하는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 참조 단백질의 100% 활성은 참조 단백질의 부재 하의 생체촉매의 활성과 비교하여 생체촉매로서 사용된 세포의 활성, 즉 사용된 세포 양에 기초한 단위 시간당 전환된 물질의 양 (단위 / 그램 세포 건조 중량 [U/g CDW])의 증가를 의미하는 것으로 이해된다.
주어진 폴리펩티드의 특성 및 기능의 유의한 변형으로 이어지지 않는 주어진 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기의 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 따라서 예를 들어 많은 아미노산은 종종 서로 문제없이 교환될 수 있다; 이러한 적합한 아미노산 치환의 예는 다음과 같다: Ser에 의한 Ala; Lys에 의한 Arg; Gln 또는 His에 의한 Asn; Glu에 의한 Asp; Ser에 의한 Cys; Asn에 의한 Gln; Asp에 의한 Glu; Pro에 의한 Gly; Asn 또는 Gln에 의한 His; Leu 또는 Val에 의한 Ile; Met 또는 Val에 의한 Leu; Arg 또는 Gln 또는 Glu에 의한 Lys; Leu 또는 Ile에 의한 Met; Met 또는 Leu 또는 Tyr에 의한 Phe; Thr에 의한 Ser; Ser에 의한 Thr; Tyr에 의한 Trp; Trp 또는 Phe에 의한 Tyr; Ile 또는 Leu에 의한 Val의 치환. 또한, 변형, 특히 예를 들어 아미노산 삽입 또는 결실의 형태로의 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서의 변형은 종종 폴리펩티드의 기능에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 공지되어 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 언급된 본 발명과 관련하여 언급된 수탁 번호는 2011년 7월 26일의 NCBI 프로테인뱅크(ProteinBank) 데이터베이스 엔트리에 해당하고; 대체로 엔트리의 버전 번호는 여기서 "숫자", 예컨대 예를 들어 ".1"로 식별된다.
달리 언급되지 않는 한, 언급된 모든 백분율 (%)은 질량 퍼센트이다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 미생물 세포는 하기로 이루어진 군으로부터의 박테리아의 종으로부터 선택될 수 있다: 아비오트로피아(Abiotrophia), 아카리오클로리스(Acaryochloris), 악쿠물리박터(Accumulibacter), 아세티비브리오(Acetivibrio), 아세토박터(Acetobacter), 아세토할로비움(Acetohalobium), 아세토네마(Acetonema), 아크로모박터(Achromobacter), 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus), 아시디미크로비움(Acidimicrobium), 아시디필리움(Acidiphilium), 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus), 아시도박테리움(Acidobacterium), 아시도써무스(Acidothermus), 아시도보락스(Acidovorax), 아시네토박터(Acinetobacter), 악티노바실루스(Actinobacillus), 악티노미세스(Actinomyces), 악티노신네마(Actinosynnema), 아에로코쿠스(Aerococcus), 아에로미크로비움(Aeromicrobium), 아에로모나스(Aeromonas), 아피피아(Afipia), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아렌시아(Ahrensia), 악케르만시아(Akkermansia), 알카니보락스(Alcanivorax), 알리시클리필루스(Alicycliphilus), 알리시클로바실루스(Alicyclobacillus), 알리이비브리오(Aliivibrio), 알칼리림니콜라(Alkalilimnicola), 알칼리필루스(Alkaliphilus), 알로크로마티움(Allochromatium), 알테로모나달레스(Alteromonadales), 알테로모나스(Alteromonas), 아미노박테리움(Aminobacterium), 아미노모나스(Aminomonas), 암모니펙스(Ammonifex), 아미콜라톱시스(Amycolatopsis), 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슈도플라보니프락토르(Pseudoflavonifractor), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 슈도라미박터(Pseudoramibacter), 슈도비브리오(Pseudovibrio), 슈도크산토모나스(Pseudoxanthomonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 사이크로모나스(Psychromonas), 푸니세이스피릴룸(Puniceispirillum), 푸실리모나스(Pusillimonas), 피라미도박터(Pyramidobacter), 라넬라(Rahnella), 랄스토니아(Ralstonia), 라피디옵시스(Raphidiopsis), 레기엘라(Regiella), 레이네케아(Reinekea), 레니박테리움(Renibacterium), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 로도코쿠스(Rhodococcus), 로도페락스(Rhodoferax), 로도미크로비움(Rhodomicrobium), 로도피렐룰라(Rhodopirellula), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 리케치아(Rickettsia), 리케치엘라(Rickettsiella), 리에시아(Riesia), 로세부리아(Roseburia), 로세이비움(Roseibium), 로세이플렉수스(Roseiflexus), 로세오박터(Roseobacter), 로세오모나스(Roseomonas), 로세오바리우스(Roseovarius), 로티아(Rothia), 루브리비박스(Rubrivivax), 루브로박터(Rubrobacter), 루에게리아(Ruegeria), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 루티아(Ruthia), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로파구스(Saccharophagus), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 사기툴라(Sagittula), 살리니스포라(Salinispora), 살모넬라(Salmonella), 산구이박터(Sanguibacter), 스카르도비아(Scardovia), 세발델라(Sebaldella), 세그닐리파루스(Segniliparus), 셀레노모나스(Selenomonas), 세라티아(Serratia), 슈와넬라(Shewanella), 시겔라(Shigella), 슈틀레워티아(Shuttleworthia), 시데록시단스(Sideroxydans), 실리시박터(Silicibacter), 시몬시엘라(Simonsiella ,), 시노리조비움(Sinorhizobium), 슬라키아(Slackia), 소달리스(Sodalis), 솔리박터(Solibacter), 솔로박테리움(Solobacterium), 소란기움(Sorangium), 스파에로박터(Sphaerobacter), 스핑고비움(Sphingobium), 스핑고모나스(Sphingomonas), 스핑고픽시스(Sphingopyxis), 스피로카에타(Spirochaeta), 스포로사르시나(Sporosarcina), 스타케브란드티아(Stackebrandtia), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스타르케야(Starkeya), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 스티그마텔라(Stigmatella), 스트렙토바실루스(Streptobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스트렙토스포란기움(Streptosporangium), 서브돌리그라눌룸(Subdoligranulum), 서브비브리오이데스(subvibrioides), 숙시나티모나스(Succinatimonas), 술피토박터(Sulfitobacter), 술포바실루스(Sulfobacillus), 술푸리쿠르붐(Sulfuricurvum), 술푸리히드로게니비움(Sulfurihydrogenibium), 술푸리모나스(Sulfurimonas), 술푸로스피릴룸(Sulfurospirillum), 술푸로붐(Sulfurovum), 수테렐라(Sutterella), 심비오박테리움(Symbiobacterium), 시네코시스티스(Synechocystis), 신트로포박터(Syntrophobacter), 신트로포보툴루스(Syntrophobotulus), 신트로포모나스(Syntrophomonas), 신트로포써무스(Syntrophothermus), 신트로푸스(Syntrophus), 타이와넨시스(taiwanensis), 타일로렐라(Taylorella), 테레디니박터(Teredinibacter), 테리글로부스(Terriglobus), 탈라시오비움(Thalassiobium), 타우에라(Thauera), 써마에로박터(Thermaerobacter), 써마나에로비브리오(Thermanaerovibrio), 써민콜라(Thermincola), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 써모바쿨룸(Thermobaculum), 써모비피다(Thermobifida), 써모비스포라(Thermobispora), 써모크리니스(Thermocrinis), 써모데술파테아토르(Thermodesulphateator), 써모데술포박테리움(Thermodesulfobacterium), 써모데술포비움(Thermodesulfobium), 써모데술포비브리오(Thermodesulfovibrio), 써모미크로비움(Thermomicrobium), 써모모노스포라(Thermomonospora), 써모세디미니박터(Thermosediminibacter), 써모시누스(Thermosinus), 써모시포(Thermosipho), 써모시네코코쿠스(Thermosynechococcus), 써모토가(Thermotoga), 써모비브리오(Thermovibrio), 써무스(Thermus), 티오알칼리미크로비움(Thioalkalimicrobium), 티오알칼리비브리오(Thioalkalivibrio), 티오바실루스(Thiobacillus), 티오미크로스피라(Thiomicrospira), 티오모나스(Thiomonas), 톨루모나스(Tolumonas), 트레포네마(Treponema), 트리보코룸(tribocorum), 트리코데스미움(Trichodesmium), 트로페리마(Tropheryma), 트루에페라(Truepera), 츠카무렐라(Tsukamurella), 투리시박터(Turicibacter), 바리오보락스(Variovorax), 베일로넬라(Veillonella), 베르미네프로박터(Verminephrobacter), 베루코미크로비움(Verrucomicrobium), 베루코시스포라(Verrucosispora), 베시코미오소시우스(Vesicomyosocius), 비브리오(Vibrio), 비브리오날레스(Vibrionales), 빅티발리스(Victivallis), 웨이셀라(Weissella), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 울바키아(Wolbachia), 월리넬라(Wolinella), 크산트로박터(Xanthobacter), 크산토모나스(Xanthomonas), 크세노랍두스(Xenorhabdus), 크실라니모나스(Xylanimonas), 크실렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia), 진데리아(Zinderia) 및 지모모나스(Zymomonas).
특히, 미생물 세포는 이. 콜라이(E. coli), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.), 부르크홀데리아 종(Burkholderia sp.), 부르크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis), 시아노박테리엔(Cyanobakterien), 클레브시엘라 종(Klebsiella sp.), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 살모넬라 종(Salmonella sp .), 리조비움 종(Rhizobium sp.) 및 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 바실루스 종(Bacillus sp.), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리디움 종(Clostridium sp.), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 종(Brevibacterium sp.), 클로렐라 종(Chlorella sp.) 및 노스톡 종(Nostoc sp.)으로부터의 것일 수 있다. 보다 특히, 미생물 세포는 이. 콜라이로부터의 것일 수 있다.
알칸은 탄소 원자의 수 및 알칸의 구조 (즉, 분지형, 선형, 시클릭 등)에 따라 다양한 응용을 갖는 포화 탄화수소이다. 알칸 (기술적으로, 항상 비-시클릭 또는 개방-쇄 화합물)은 일반식 CnH2n +2를 갖는다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 알칸은 적어도 6개의 C 원자를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 알칸은 6-22, 6-20, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 8-20, 8-19, 8-18, 8-16, 8-15, 8-12, 8-10개 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알칸은 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸, 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸 펜타데칸, 헥사데칸 및 이코산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 사용되는 알칸은 데칸, 운데칸 또는 도데칸일 수 있다.
효소 E1
효소 E1은 적어도 1종의 알칸을 상응하는 1-알칸올로 전환시킬 수 있다. 특히, E1은 적어도 1종의 EC 1.14.15.1의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 또는 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있다. P450 알칸 히드록실라제 (Ea)는
- 2종의 효소 성분 시토크롬 P450 알칸 히드록실라제 및 EC 1.6.2.4의 NAD(P)H 시토크롬 P450 옥시도리덕타제 또는
- 3종의 효소 성분 CYP153 유형의 시토크롬 P450 알칸 히드록실라제, EC 1.18.1.2 또는 EC 1.18.1.3의 페레독신 NAD(P)+ 리덕타제 및 페레독신
을 포함하는 반응 시스템의 성분이다.
AlkB 알칸 히드록실라제 (E1b)는
- 3종의 효소 성분 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제, EC 1.18.1.1 또는 EC 1.18.1.4의 AlkT 루브레독신 NAD(P)+ 리덕타제 및 루브레독신 AlkG를 포함하는 반응 시스템의 성분인 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제
를 포함하는 반응 시스템의 성분이다.
특히, E1은 알칸 모노옥시게나제로도 공지되어 있는 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있다. 보다 특히, E1은 alkBGT에 의해 코딩된 슈도모나스 푸티다 GPo1로부터의 알칸 모노옥시게나제에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E1은 폴리펩티드 YP_001185946.1에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E1은 폴리펩티드 YP_001185946.1에 대해 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
효소 Ea
특히, 효소 E1은
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea)일 수 있다.
효소 Eb
또 다른 예에서, 효소 E1은
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 AlkB 알칸 히드록실라제 (E1b)일 수 있다.
효소 E2
효소 E2는 1-알칸올을 상응하는 1-알칸알로 전환시킬 수 있다. 특히, E2는 적어도 1종의 EC 1.14.15.3의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 알콜 옥시다제 (Ec) 또는 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제 (Ed)일 수 있다. 보다 특히, E2는 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 알콜 옥시다제 (Ec), AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi), 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제 (Edii)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히, E2는 알칸 모노옥시게나제로도 공지되어 있는 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있다. 보다 특히, E2는 alkBGT에 의해 코딩된 슈도모나스 푸티다 GPo1로부터의 알칸 모노옥시게나제에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E2는 폴리펩티드 YP_001185946.1에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E2는 폴리펩티드 YP_001185946.1에 대해 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
효소 Ec
알콜 옥시다제 (Ec)는
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히, 알콜 옥시다제 (Ec)는 AAS46878.1, ACX81419.1, AAS46879.1, CAB75353.1, AAS46880.1, XP_712350.1, XP_002422236.1, XP_712386.1, EEQ43775.1, CAB75351.1, CAB75352.1, XP_002548766.1, 및 XP_002548765.1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 Edi
특히, AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi)는
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 Edi는 Q00593.1, Q9WWW2.1, ZP_00957061.1, YP_957894.1, CAC38030.1, YP_694430.1, YP_957725.1, 및 YP_001672216.1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 Edii
알콜 데히드로게나제 (Edii)는 박테리아, 특히 이. 콜라이로부터의 AdhE, AdhP, YjgB, YqhD, GldA, EutG, YiaY, AdhE, AdhP, YhhX, YahK, HdhA, HisD, SerA, Tdh, Ugd, Udg, Gmd, YefA, YbiC, YdfG, YeaU, TtuC, YeiQ, YgbJ, YgcU, YgcT, YgcV, YggP, YgjR, YliI, YqiB, YzzH, LdhA, GapA, Epd, Dld, GatD, Gcd, GlpA, GlpB, GlpC, GlpD, GpsA 및 YphC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 E3
효소 E3은 적어도 1종의 1-알칸알을 상응하는 알칸산으로 전환시킬 수 있다. 특히, E3은 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), 1-알칸올을 1-알칸알을 통해 상응하는 알칸산으로 직접 산화시킬 수 있는 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 또는 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii) 및 알데히드 데히드로게나제 (Ee)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 Ee
효소 Ee, 알데히드 데히드로게나제는 ω-옥소알칸산 (에스테르) = ω-카르복시알칸산 (에스테르)의 전환을 촉매할 수 있다.
상기 반응을 촉매하기 위해, Ee는 EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 또는 EC 1.2.1.5의 알데히드 데히드로게나제, EC 1.1.3.20의 지방 알콜 옥시다제, EC 1.1.99.-의 AlkJ 알콜 데히드로게나제 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제일 수 있다.
한 예에서, Ee는 하기 반응을 특이적으로 촉매할 수 있다:
ω-옥소알칸산 (에스테르) + NAD(P)+ = ω-카르복시알칸산 (에스테르) + NAD(P)H + H+
이 경우에, 효소 Ee는 EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 또는 EC 1.2.1.5의 알데히드 데히드로게나제일 수 있고, 박테리아, 특히 이. 콜라이로부터의 Prr, Usg, MhpF, AstD, GdhA, FrmA, Feab, Asd, Sad, PuuE, GabT, YgaW, BetB, PutA, PuuC, FeaB, AldA, Prr, EutA, GabD, AldB, TynA 및 YneI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, 효소 Ee는 하기 반응을 촉매할 수 있다:
ω-옥소알칸산 (에스테르) + O2 = ω-카르복시알칸산 (에스테르) + H2O2
이 경우에, Ee는 EC 1.1.3.20의 지방 알콜 옥시다제일 수 있고, 상기 효소 Ec로서 제공된 바와 같은 목록으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, Ee는 적어도 1종의 EC 1.1.99의 AlkJ 알콜 데히드로게나제일 수 있고, Edi로서 상기 제공된 목록으로부터 선택될 수 있다.
추가 예에서, Ee는 효소 Edii로서 제공된 목록으로부터 선택된 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제일 수 있다.
효소 E4
효소 E4는 적어도 1종의 알칸산을 상응하는 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있다. 특히, E4는 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.20, EC 2.3.1.75) (Ef), 또는 알콜 O-아세틸 트랜스퍼라제 (Eg) (EC 2.3.1.20, EC 2.3.1.75 또는 EC 2.3.1.84)로도 공지되어 있는 적어도 1종의 왁스-에스테르 신타제일 수 있다.
한 예에서, E4는 적어도 1종의 왁스-에스테르 신타제 (Ef)일 수 있다. 보다 특히, E4는 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) ADP1에 대해, 또는 하헬라 체주엔시스(Hahella chejuensis)의 O-아세틸트랜스퍼라제에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E4는 폴리펩티드 YP_045555.1, WP_011398768.1 또는 NP_808414.2에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E4는 폴리펩티드 YP_045555.1, WP_011398768.1 및 NP_808414.2로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 대해 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 예에서, E4는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
효소 Ef
특히, 효소 Ef는
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, 효소 Ef는 하기 NCBI 유전자 식별자:
Figure pat00027
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 Eg
특히, 효소 Eg는 EGA72844.1, NP_015022.1, S69991, AAP72991.1, EDN63695.1, BAA05552.1, AAP72992.1, S69992, AAP72995.1, XP_002552712.1, XP_001646876.1, XP_002551954.1, EGA82692.1, EDN61766.1, EGA86689.1, EGA74966.1, AAU09735.1, NP_011693.1, XP_445666.1, BAA13067.1, AAP72993.1, EGA62172.1, XP_455762.1, 및 EGA58658.1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 E5
효소 E5는 적어도 1종의 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있다. 특히, E5는 E1로서 열거된 임의의 효소일 수 있다. 특히, E5는 적어도 1종의 EC 1.14.15.3의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 또는 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있다.
효소 E6
효소 E6은 적어도 1종의 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있다. 특히, E6은 E2로서 열거된 임의의 효소일 수 있다. 특히, E6은 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 알콜 옥시다제 (Ec) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 E6과 관련하여 사용된 어구 '존재하는 경우에'는 ω-옥소 알칸산 에스테르를 생산하도록 유전자 변형된 세포를 지칭한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 효소 E6의 증가된 발현을 포함할 수 있고, 따라서 ω-옥소 알칸산 에스테르를 생산할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 또한 야생형 세포에 비해 효소 E6의 전혀 증가되지 않은 발현을 포함할 수 있고, 따라서 ω-옥소 알칸산 에스테르를 생산하지 못할 수 있다. 이들 세포는 따라서 주로 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포가 효소 E6의 증가된 발현을 포함하는 경우에 (즉, 존재하는 경우에), ω-옥소 알칸산 에스테르가 생산될 수 있다.
효소 E7
효소 E7은 적어도 1종의 ω-옥소 알칸산을 상응하는 ω-아미노 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있다. 특히, E7은 EC 2.6.1의 ω-트랜스아미나제 (Eh)일 수 있다.
특히, 효소 E7은 슈도모나스 푸티다 (WP_016502144; WP_016500675.1), 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) (NP_901695.1), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1(YP_353455.1) 및 3HMU_A, AAD41041.1,
Figure pat00028
Figure pat00029
로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노트랜스퍼라제 (Eh)일 수 있다.
특히, 효소 E7은
Figure pat00030
로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노트랜스퍼라제 (Eh)일 수 있다.
효소 E7과 관련하여 사용된 어구 '존재하는 경우에'는 ω-아미노 알칸산 에스테르를 생산하도록 유전자 변형된 세포를 지칭한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 효소 E7의 증가된 발현을 포함할 수 있고, 따라서 ω-아미노 알칸산 에스테르를 생산할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 또한 야생형 세포에 비해 효소 E7의 전혀 증가되지 않은 발현을 포함할 수 있고, 따라서 ω-아미노 알칸산 에스테르를 생산하지 못할 수 있다. 이들 세포는 따라서 주로 ω-옥소-알칸산 에스테르를 생산할 수 있다. 한 예에서, 야생형 세포에 비해 효소 E6의 증가된 발현을 포함하고 E7의 증가된 발현은 포함하지 않는 세포는 ω-옥소-알칸산 에스테르를 생산할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포가 E6의 발현을 증가시키도록 유전자 변형되지 않고 E7에 대해서는 그렇지 않은 경우에, 세포는 ω-히드록시 알칸산 에스테르를 생산할 수 있다.
효소 Eh
특히, 효소 Eh는
Figure pat00031
Figure pat00032
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 효소 E1 내지 E5의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 유전자 변형될 수 있다. 세포는 추가로, 적어도 효소 E6 및/또는 E7의 발현을 증가시키도록 유전자 변형될 수 있다. 한 예에서, 효소 E1, E2, E3, E5 및 E6은 적어도 1종의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)일 수 있고, 효소 E4는 왁스-에스테르 신타제 (Ef)일 수 있다. 특히,
- AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 포함하고;
- 왁스-에스테르 신타제 (Ef)는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포가 적어도 1종의 ω-아미노 알칸산 에스테르를 생산하도록 유전자 변형된 경우에, 세포는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 포함할 수 있는 적어도 1종의 ω-트랜스아미나제 (Eh)를 발현하도록 변형될 수 있다.
효소 E8
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 알칸을 ω-관능화 카르복실산 에스테르로 전환시키는 과정에서 중간체 중 적어도 1종를 파괴하는 적어도 1종의 효소 E8의 발현을 감소시키도록 추가로 유전자 변형될 수 있다. 특히, 효소 E8은 세포의 지방산 분해 능력에서 역할을 할 수 있는 효소일 수 있다. 특히, E8은 아실-CoA 데히드로게나제 (Ei) (FadE), 에노일 CoA 히드라타제 (Ej) (FadB), 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 (Ek) (FadB), 및 3-케토아실-CoA 티올라제 (FadA)로도 공지된 β-케토티올라제 (El)로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다.
지방산은 수송/아실-활성화 메카니즘을 통해 세포 막을 가로질러 흡수 및 전위된다. 제1 세포내 단계는 아실-CoA의 에노일-CoA로의 아실-CoA 데히드로게나제 (Ei)를 통한 전환을 수반하고, 후자는 이. 콜라이의 경우에 FadE로 지칭된다. 아실-CoA 데히드로게나제의 활성은 관련 기술분야에 기재된 바와 같이, 예를 들어 100 mM MOPS, pH 7.4, 0.2 mM 에노일-CoA, 0.4 mM NADH 중에서 340 nm에서 분광광도측정법에 의해 NADH의 농도를 모니터링하는 것에 의해 검정될 수 있다. 생성된 에노일-CoA는 이. 콜라이에서 FadB 및 FadJ로 지칭되는 에노일-CoA 히드라타제/(R)-3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 (Ej/Ek)에 의해 촉매되는, 수화 및 산화를 통해 3-히드록시아실-CoA를 통해 3-케토아실-CoA로 전환된다. 에노일-CoA 히드라타제/3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 활성, 보다 구체적으로 산물 NADH의 형성은 관련 기술분야에 기재된 바와 같이, 예를 들어 FadE에 대해 약술된 바와 같이 분광광도측정법에 의해 검정될 수 있다. 마지막으로, 3-케토아실-CoA 티올라제 (El), 이. 콜라이에서의 FadA 및 FadI는 3-케토아실-CoA의 절단을 촉매하여, 아세틸-CoA를 생성하고 투입된 아실-CoA를 2개의 탄소 원자만큼 단축시킨다. 케토아실-CoA 티올라제의 활성은 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Antonenkov, V., et al., 1997]에 기재된 바와 같이 검정될 수 있다.
한 예에서, 본원에 사용된 용어 "아실-CoA 데히드로게나제"는 β-산화 경로의 부분으로서 아실-CoA의 에노일-CoA로의 전환을 촉매할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이에서의 폴리펩티드 FadE (수탁 번호: BAA77891.2)는 아실-CoA 데히드로게나제일 수 있다. 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제로도 지칭되는 본원에 사용된 용어 "에노일-CoA 히드라타제"는 β-산화 경로의 부분으로서 수화 및 산화를 통해 에노일-CoA의 3-케토아실-CoA로의 전환을 촉매할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 이. 콜라이에서의 폴리펩티드 FadB 및 FadJ (각각 수탁 번호: BAE77457.1 및 P77399.1)는 에노일-CoA 히드라타제이다. 본원에 사용된 용어 "케토아실-CoA 티올라제"는 3-케토아실-CoA의 절단을 촉매하여, β-산화 경로의 최종 단계로서 2개의 탄소 원자만큼 단축된 아실-CoA 및 아세틸-CoA를 발생시킬 수 있는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이에서의 폴리펩티드 FadA 및 FadI (각각 수탁 번호: YP_491599.1 및 P76503.1)는 케토아실-CoA 티올라제이다.
효소 E9 및 E10
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 하기의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 추가로 유전자 변형될 수 있다:
- 효소 E9은 지방 아실-조효소 A 메틸 에스테르 에스테라제 BioH (Em)이고/거나;
- 효소 E10은 TesA, TesB, YciA, FadM, YbfF 및 YbgC로 이루어진 군으로부터 선택된 지방 아실-조효소 A 티오에스테라제 (En)임.
특히, Em은 지방산 에스테르를 유리 지방산 및 각각의 알콜로 가수분해할 수 있고/거나; En은 지방 아실-조효소 A를 유리 지방산 및 조효소 A로 가수분해할 수 있다.
효소 E11
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 적어도 1종의 수송체 단백질의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 추가의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 돌연변이는 세포가 적어도 1종의 지방산을 흡수하는 것을 증가시킬 수 있다. 특히, 수송체 단백질은 AlkL (서열식별번호: 4 또는 5) 및/또는 FadL (서열식별번호: 6)일 수 있다. AlkL 및/또는 FadL은 야생형 세포와 비교하여 적어도 1종의 수송체 단백질로서 기능할 수 있다. 한 예에서, 세포는 fadL 및 alkL 유전자 둘 다를 과다발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 AlkL 및/또는 FadL의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 추가로 유전자 변형될 수 있다.
한 예에서, 효소 E11은 FadL 또는 BAA16205.1일 수 있다.
효소 E12
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 EC 6.2.1.3, EC 2.3.1.86의 아실-CoA 신테타제 (효소 E12)의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 추가의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다. 효소 E12는 지방산을 지방산의 CoA 에스테르, 즉 카르복시 기의 관능기 -OH가 -S-CoA로 대체된 분자로의 전환을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이에서의 폴리펩티드 FadD 및 FadK (각각 수탁 번호: BAA15609.1 및 NP_416216.4)는 아실-CoA 신테타제이다. 또 다른 예에서, E12는 YP_001724804.1의 장쇄-지방산--CoA 리가제일 수 있다.
효소 E13
효소 E13은 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있다. 특히 효소 E13은 상기 정의된 임의의 효소 E3일 수 있다. 보다 특히, E13은 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), ω-히드록시 알칸산 에스테르를 ω-옥소 알칸산 에스테르를 통해 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 직접 산화시킬 수 있는 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 또는 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii); 및 알데히드 데히드로게나제 (Ee)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 E14
효소 E14는 ω-카르복시 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 디에스테르로 전환시킬 수 있다. 특히 효소 E14는 상기 정의된 임의의 효소 E4일 수 있다. 보다 특히, E14는 적어도 1종의 왁스-에스테르 신타제 (Ef) 또는 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (Eg) (EC 2.3.1.20, EC 2.3.1.75 또는 EC 2.3.1.84)일 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하기 효소 E20-E24 중 적어도 1종의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 유전자 변형을 포함하지 않는다:
- EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.2.22의 E20 아실-ACP 티오에스테라제,
- EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 또는 EC 3.1.2.22의 E21 아실-CoA 티오에스테라제,
- E22 아실-CoA:ACP 트랜스아실라제,
- E23 폴리케티드 신타제, 및
- E24 헥산산 신타제.
특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 효소 E20-E24의 야생형 발현을 갖는다. 효소 E20-E24는 따라서 본 발명의 방법에 따른 세포에서 과다발현되지도 녹아웃되지도 않는다. 보다 특히, 효소 E20-E24 중 어느 하나, 즉 효소 E20, E21, E22, E23 또는 E24 모든 효소 E20, E21, E22, E23 및 E24의 발현은 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포에서 유전자 변형되지 않는다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 처음에 세포에 자연적으로 존재할 수 있는 임의의 효소 E20-E24의 천연, 야생형 발현을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 효소 E20-E24 중 어느 하나의 어떠한 재조합 발현도 포함하지 않는 것으로 간주될 수 있다. 이는 특히, 효소 E20-E24 중 어느 하나의 증가된 발현을 갖지 않는 (즉 효소 E20-E24 중 어느 하나의 야생형 발현을 갖는) 세포가 이후 ω-관능화 카르복실산 에스테르 형성을 위한 탄소 공급원으로서 알칸을 사용하는 것을 용이하게 선택할 수 있기 때문에 유리하다. 특히, 효소 E20-E24 중 어느 하나의 증가된 발현을 갖는 임의의 세포는 효소 E20-E24 중 어느 하나의 증가된 발현을 갖는 세포에 의한 그의 ω-관능화 카르복실산 및/또는 에스테르의 형성을 위한 탄소 공급원으로서 사용될 수 있는 지방산의 증가된 생산을 발생시킬 수 있다. 효소 E20-E24 중 어느 하나의 증가된 발현을 갖는 세포는 따라서 ω-관능화 카르복실산 에스테르의 생산을 위한 기질로서 고농도의 지방산의 사용을 선호할 수 있고, 알칸은 따라서 세포에 의한 ω-관능화 카르복실산 에스테르 형성을 위해 사용되지 않을 것이다. ω-관능화 카르복실산 에스테르 형성을 위해 알칸 이외의 다른 탄소 공급원을 사용하는 것은 더 많은 지방산을 생산하는 것과 관련하여 생산 비용을 현저하게 증가시킬 수 있고, 세포는 글루코스와 같은 다른 탄소 공급원을 필요로 할 것이다. 따라서, 하기 효소 E20-E24 중 적어도 1종의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 유전자 변형을 포함하지 않는 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포를 사용하는 것은 적어도 1종의 알칸으로부터 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하기 위해 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용된다.
효소 E20-E24
효소 E20-E24는 WO2013024114에서, WO2013024114의 페이지 60-79에 각각 효소 Ei 내지 Eiv로서 상세하게 설명된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 임의의 측면에 따른 적어도 1종의 세포를 적어도 1종의 알칸과 접촉시키는 단계를 포함하는, 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 방법이 제공된다. 특히, 형성된 ω-관능화 카르복실산 에스테르는 ω-히드록시-알칸산, ω-옥소-알칸산, ω-카르복시-알칸산, ω-아미노-알칸산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, ω-관능화 카르복실산 에스테르는 알칸 도데칸으로부터의 12-아미노 라우르산 메틸 에스테르, 12-히드록시 라우르산 메틸 에스테르, 12-카르복시 라우르산 메틸 (디) 에스테르 및/또는 라우르산 메틸 에스테르일 수 있다. 또 다른 예에서, 생산된 ω-관능화 카르복실산 에스테르는 알칸 운데칸으로부터의 11-아미노 운데칸산 메틸 에스테르, 11-히드록시 운데칸산 메틸 에스테르, 11-카르복시 운데칸산 메틸 (디) 에스테르 및/또는 운데칸산 메틸 에스테르일 수 있다. 적어도 한 추가의 예에서, 일관능성 알콜 및/또는 알데히드는 부산물로서 형성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 수용액 중에서 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포 및/또는 알칸 사이에 직접적인 접촉을 가져오는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포 및 알칸은 장벽, 예컨대 무기 막에 의해 분리된 상이한 구획에 존재하지 않을 수 있다. 알칸이 가용성이고 세포에 의해 흡수될 수 있거나 생물학적 막을 횡단하여 확산될 수 있는 경우에, 그것은 단순히 수용액 중에서 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포에 첨가될 수 있다. 알칸이 불충분하게 가용성인 경우에, 그것은 수용액에의 첨가 전에 적합한 유기 용매 중에 용해될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 유기 및/또는 극성 용매를 첨가하는 것에 의해 불충분한 용해도를 갖는 알칸의 수용액을 제조할 수 있다. 이러한 용매는 액체 유기 용매를 포함하는 유기 상의 형태로 제공될 수 있다. 한 예에서, 유기 용매 또는 상은 25 ℃ 및 표준 대기압에서 액체인 경우에 액체로 간주될 수 있다. 또 다른 예에서, 지방산은 각 메틸 또는 에틸 에스테르와 같은 지방산 에스테르의 형태로 제공될 수 있다. 또 다른 예에서, 화합물 및 촉매는 시험관내에서, 즉 다소 농축되거나 심지어는 정제된 상태로 접촉될 수 있거나, 또는 계내에서, 즉 그것이 세포 대사의 일부로 구성되어 이후 세포 내부에서 반응하도록 접촉될 수 있다.
용어 "수용액"은 용어 "수성 매질"과 상호교환가능하게 사용되고, 물, 주로 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포를 적어도 일시적으로 대사적 활성 및/또는 생존 상태로 유지하는데 사용될 수 있으며 필요한 경우에 임의의 추가의 기질을 포함하는 용매로서의 물을 포함하는 임의의 용액을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 통상적으로 본 발명의 세포를 유지하는데 사용될 수 있는 배지 (예를 들어 이. 콜라이의 경우에 LB 배지)로서 지칭되는 수많은 수용액의 제조에 친숙하다. 산물의 불필요한 오염과 원치않는 부산물을 피하기 위해, 복합 배지와 대조적으로 최소 배지, 즉 세포를 대사적 활성 및/또는 생존 상태로 유지하기 위해 필수불가결한 염 및 영양소의 최소 세트만을 포함하는 합리적으로 단순한 조성의 배지를 수용액으로서 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, M9 배지가 최소 배지로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
(a) 하기 효소:
(i) 알칸을 상응하는 1-알칸올로 전환시킬 수 있는 효소 E1;
(ii) (i)의 1-알칸올을 상응하는 1-알칸알로 전환시킬 수 있는 효소 E2;
(iii) (ii)의 1-알칸알을 상응하는 알칸산으로 전환시킬 수 있는 효소 E3;
(iv) (iii)의 알칸산을 상응하는 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E4; 및
(v) (iv)의 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E5
를 알칸과 접촉시키는 단계를 포함하는, 알칸으로부터 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은
(b) 하기 효소:
(vi) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6; 또는
(vii) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6 및 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-아미노 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E7; 또는
(viii) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6 및 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E13 및 ω-카르복시 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 디에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E14
를 ω-히드록시-알칸산 에스테르와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용된 효소는 본 발명에 따른 세포와 관련하여 개시된 효소와 동일할 수 있다.
실시예
상기는 바람직한 실시양태를 기재하며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 청구범위의 범주를 벗어나지 않고도 설계, 구축 또는 작동에 있어서의 변화 또는 변형에 적용될 수 있다. 이들 변화는, 예를 들어 청구범위의 범주에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
실시예 1
알칸 모노옥시게나제 및 왁스 에스테르 신타제를 보유하고 지방산의 분해를 촉매하는 효소 및 지방산 에스테르를 유리 지방산 및 각 알콜로 가수분해하는 효소는 감쇠되어 있는 전세포 생체촉매를 사용하는, 각각 도데칸 및 운데칸 (메틸 에스테르의 경우에는 메탄올)으로부터의 라우르산 (메틸 에스테르) 및 운데칸산 (메틸 에스테르)의 생산.
실시예 2
알칸 모노옥시게나제, 왁스 에스테르 신타제 및 ω-트랜스아미나제를 보유하고 지방산의 분해를 촉매하는 효소 및 지방산 에스테르를 유리 지방산 및 각 알콜로 가수분해하는 효소는 감쇠되어 있는 전세포 생체촉매를 사용하는, 각각 도데칸 및 운데칸으로부터의 12-아미노 라우르산 메틸 에스테르 및 11-아미노 운데칸산 메틸 에스테르의 생산.
실시예 3
이. 콜라이 fadD 유전자 및 왁스 에스테르 신타제를 코딩하는 하헬라 체주엔시스 유전자의 과다발현을 위한 발현 벡터의 구축
벡터 pCDF-fadD_Ec-wes_Hche (서열식별번호: 7)는 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 이. 콜라이로부터의 유전자 fadD (아실-CoA 신타제를 코딩함) 및 하헬라 체주엔시스로부터의 왁스 에스테르 신타제 유전자 (서열식별번호: 2)를 보유한다. 아실-CoA 신타제가 지방산의 상응하는 CoA 티오에스테르로의 활성화를 담당하는 반면에, 왁스 에스테르 신타제는 지방 아실-CoA와 알콜, 보다 구체적으로는 메탄올 사이의 에스테르 형성에 요구된다. 벡터는 플라스미드 pCDFDuet-1 (머크 바이오사이언시스(Merck Biosciences); 영국 노팅엄)을 기재로 하고, tac 프로모터의 제어 하의 fadD 유전자 및 T5 프로모터의 제어 하의 하헬라 체주엔시스 왁스 에스테르 신타제-코딩 유전자를 보유한다. 이. 콜라이 fadD, 뿐만 아니라 tac 및 T5 프로모터 카세트를 각각 이. 콜라이 W3110의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 하헬라 체주엔시스 왁스 에스테르 신타제-코딩 유전자를 DNA 합성에 의해 수득하였다. 벡터 백본, 및 이. 콜라이 fadD, tac 및 T5 프로모터 카세트 및 하헬라 체주엔시스 왁스 에스테르 신타제-코딩 유전자를 나타내는 4개의 DNA 단편을 시험관내 재조합을 위한 상업적으로 입수가능한 키트 (NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트(NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit); NEB; 독일 프랑크푸르트/마인)를 사용하여 융합시켜 벡터 pCDF-fadD_Ec-wes_Hche (서열식별번호: 7)를 얻었다.
실시예 4
알칸을 상응하는 ω-관능화 지방산 메틸 에스테르로 전환시킬 수 있는 이. 콜라이 균주의 구축
발현 벡터 pBT10_alkL (구축 세부사항 및 열거된 서열식별번호: 8에 대해 WO/2011/131420의 실시예 1 참조)은 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)의 alk 오페론으로부터의 유전자 alkB, alkG, alkT, alkS 및 alkL을 함유한다. 상응하는 유전자 산물은 알칸의 상응하는 알칸올, 알칸알 및 지방산 (AlkBGT)으로의 산화, 뿐만 아니라 기질 (AlkL)의 흡수를 촉매하였다. 추가로, AlkBGT 유전자 산물은 또한 지방산 및 메탄올로부터 효소 아실-CoA 신테타제 및 왁스 에스테르 신타제의 작용에 의해 형성되는 경우에 지방산 메틸 에스테르의 산화를 촉매하였다 (실시예 1 참조). 벡터 pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (구축 세부사항 및 열거된 서열식별번호: 17에 대해 WO/2013/024114의 실시예 1 참조)는 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald (알라닌 데히드로게나제를 코딩함) 및 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 Cv_2505 (ω-트랜스아미나제를 코딩함)를 보유한다. ω-트랜스아미나제가 OLAME 및 OUAME의 상응하는 아민 ALAME 및 AUAME로의 전환을 담당하는 반면에, 알라닌 데히드로게나제는 피루베이트 및 무기 암모니아로부터의 아민 공여자 알라닌의 제공에 요구되었다.
플라스미드 pBT10_alkL 및 pCDF-fadD_Ec-wes_Hche, 이에 더하여 적절한 경우에 pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)를, 적용가능한 경우 카나마이신 (50 μg/ml), 암피실린 (100 μg/ml) 및 스펙티노마이신 (100 μg/ml)을 포함하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅된 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE 내로 전기천공을 통해 형질전환시켰다. 형질전환체를 플라스미드 제조 및 제한 소화 분석에 의해 플라스미드의 존재 및 진위에 대해 스크리닝하였다. 하기 균주가 생성되었다:
Figure pat00033
이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche
Figure pat00034
이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche
실시예 5
알칸의 상응하는 ω-관능화 지방산 메틸 에스테르로의 전환을 위한 생체변환
균주 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche 및 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche를 도데칸으로부터 오메가-히드록시라우르산 메틸에스테르 (HLAME), 오메가-옥소라우르산 메틸에스테르 (OLAME), 오메가-아미노라우르산 메틸에스테르 (ALAME), 도데칸디오산 모노메틸에스테르 (DDAME) 및 도데칸디오산 디메틸에스테르 (DDADME)를 생산하는 그의 능력을 조사하기 위해 유가식 발효에 이어서 생체변환에 적용하였다. 균주를 또한 운데칸으로부터 오메가-히드록시운데칸산 메틸에스테르 (HUAME), 오메가-옥소운데칸산 메틸에스테르 (OUAME), 오메가-아미노운데칸산 메틸에스테르 (AUAME), 운데칸디오산 모노메틸에스테르 (UDAME) 및 운데칸디오산 디메틸에스테르 (UDADME)를 생산하는 그의 능력을 조사하기 위해 유가식 발효에 이어서 생체변환에 적용하였다. 이를 DASGIP로부터 8배 병렬 발효 시스템으로 수행하였다.
발효를 위해, 오버헤드 교반기 및 임펠러 터빈이 구비된 1 l 반응기를 사용하였다. 공정을 모니터링하기 위해, pH 및 pO2를 온라인 측정하였다. OTR/CTR 측정은 특히 세포의 대사 활성 및 적합도를 추정하기 위한 역할을 하였다.
pH 프로브를 DASGIP에 의해 제공된 기술적 참조에 따라 pH 4.0 및 pH 7.0의 측정 용액을 사용하는 2-포인트 보정에 의해 보정하였다. 반응기를 DASGIP에 의해 제공된 기술적 참조에 따라 요구되는 센서 및 연결부를 사용하여 준비하고, 교반기 샤프트를 설치하였다. 이어서, 반응기를 물 300 ml로 채우고, 멸균을 확실히 하기 위해 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하였다. pO2 프로브를 측정 증폭기에의 연결 후 밤새 (적어도 6시간) 분극화하였다. 이어서, 물을 클린 벤치 하에서 제거하고, 탄소 공급원으로서의 15 g/l 글루코스 (500 g/l 글루코스, 1% (w/v) MgSO4*7 H2O 및 2.2% (w/v) NH4Cl로 이루어진 멸균 공급 용액 30 ml/l의 계량 첨가에 의해 첨가됨)와 50 mg/l 카나마이신을 포함하는, (NH4)2SO4 1.76 g/l, K2HPO4 19.08 g/l, KH2PO4 12.5 g/l, 효모 추출물 6.66 g/l, 시트르산삼나트륨 2수화물 11.2 g/l, 17 ml/l의 필터-멸균된 1% 강도 암모늄 철 시트레이트 용액, 및 5 ml/l의 필터-멸균된 미량 원소 원액 (HCl (37%) 36.50 g/l, MnCl2*4 H2O 1.91 g/l, ZnSO4*7 H2O 1.87 g/l, 에틸렌디아민테트라아세트산 2수화물 0.84 g/l, H3BO3 0.30 g/l, Na2MoO4*2 H2O 0.25 g/l, CaCl2*2 H2O 4.70 g/l, FeSO4*7 H2O 17.80 g/l, CuCl2*2 H2O 0.15 g/l로 이루어짐)으로 이루어진 높은-세포-밀도 배지로 대체하였다.
이후에, pO2 프로브를 단일-포인트 보정 (교반기: 600 rpm / 가스발생: 10 sL/h 공기)을 사용하여 100%로 보정하고, 공급, 교정 작용제 및 유도 작용제 스트레치를 DASGIP에 의해 제공된 기술적 참조에 따라 제자리-세정에 의해 세정하였다. 이를 위해, 튜브를 먼저 70% 에탄올, 이어서 1 M NaOH, 이후 멸균 탈염수로 플러싱하고, 최종적으로 각 배지로 채웠다.
모든 상기 언급된 이. 콜라이 균주를 먼저 동결배양물로부터 50 mg/l 카나마이신을 포함하는 LB 배지 (100 ml 배플형 진탕 플라스크 내 25 ml) 중에서 밤새 37℃ 및 200 rpm에서 약 18시간 동안 새로 배양하였다. 이어서, 이러한 배양물 2 ml를 제2 예비배양 단계를 위해 100 ml 진탕 플라스크에서 탄소 공급원으로서의 15 g/l 글루코스 (500 g/l 글루코스, 1% (w/v) MgSO4*7 H2O 및 2.2% (w/v) NH4Cl로 이루어진 멸균 공급 용액 30 ml/l의 계량 첨가에 의해 첨가됨)와 이미 기재된 항생제를 포함하는, (NH4)2SO4 1.76 g/L, K2HPO4 19.08 g/l, KH2PO4 12.5 g/l, 효모 추출물 6.66 g/l, 시트르산삼나트륨 2수화물 11.2 g/l, 17 ml/l의 필터-멸균된 1% 강도 암모늄 철 시트레이트 용액, 및 5 ml/l의 필터-멸균된 미량 원소 원액 (HCl (37%) 36.50 g/l, MnCl2*4 H2O 1.91 g/l, ZnSO4*7 H2O 1.87 g/l, 에틸렌디아민테트라아세트산 2수화물 0.84 g/l, H3BO3 0.30 g/l, Na2MoO4*2 H2O 0.25 g/l, CaCl2*2 H2O 4.70 g/l, FeSO4*7 H2O 17.80 g/l, CuCl2*2 H2O 0.15 g/l로 이루어짐)으로 이루어진 높은-세포-밀도 배지 25 ml 내로 옮기고, 37℃/200 rpm에서 추가의 6시간 동안 인큐베이션하였다.
반응기에 0.1의 광학 밀도로 접종하기 위해, 제2 전배양 단계의 OD600을 측정하고, 접종에 요구되는 배양물의 양을 계산하였다. 요구량의 배양물을 5 ml 시린지의 보조 하에 격막을 통해 가열-처리 및 통기된 반응기 내로 첨가하였다.
하기 표준 프로그램을 사용하였다:
Figure pat00035
Figure pat00036
Figure pat00037
pH를 12.5% 강도 암모니아 용액을 사용하여 한 측면 상에서 pH 6.8로 조절하였다. 배양 및 생체변환 동안에, 배양물 중 용존 산소 (pO2 또는 DO)를 교반기 공급율 및 가스발생률에 의해 적어도 30%로 조절하였다. 접종 후에, DO는 100%에서 30%로 하락하였으며, 이를 나머지 발효를 위해 안정하게 유지시켰다.
발효를 유가식으로 수행하였으며, 여기서 공급 시작은, 배치 상의 종료를 유도하는 DO 피크를 통해, 500 g/l 글루코스, 1% (w/v) MgSO4*7 H2O 및 2.2% (w/v) NH4Cl로 이루어진 5 g/l*h 글루코스 공급물을 사용하는 공급 상으로의 전달로서 작동시켰다. 공급을 시작하면서, 37℃의 온도를 30℃로 낮추었다. 공급 시작 10시간 후에, 산화 유전자의 발현을 0.025% (v/v) DCPK로 유도하였다. 생산의 시작 (= 생체변환의 시작)을 공급 시작 14시간 후에 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 150 ml의 도데칸 또는 운데칸을 배치로서 발효 브로쓰에 첨가하였다.
발효 샘플에서 LSME 및 HLS를 정량화하기 위해, 샘플을 생체변환 시작 1/2/4/20/22시간 후에 취하였다. 이들 샘플을 실시예 6에 제공된 바와 같이 분석을 위해 제조하였다.
실시예 6
산물의 LC-ESI/MS2-기재 정량화
발효 샘플에서 HLAME, OLAME, ALAME, DDAME 및 DDADME, 뿐만 아니라 HUAME, OUAME, AUAME, UDAME 및 UDADME의 정량화를 LC-ESI/MS2에 의해 모든 분석물 (0.1 - 50 mg/l)에 대한 외부 보정을 참조하여 및 내부 표준 아미노운데칸산 (HLSME의 경우 AUA) 및 d3-LSME (LSME의 경우)를 사용하여 수행하였다.
하기 기기를 여기서 사용하였다:
Figure pat00038
오토샘플러 (G1367E), 이원 펌프 (G1312B) 및 칼럼 오븐 (G1316A)이 구비된 HPLC 시스템 1260 (애질런트(Agilent); 뵈블링엔)
Figure pat00039
ESI 공급원이 구비된 질량 분광계 트리펠쿼드(TripelQuad) 6410 (애질런트; 뵈블링엔)
Figure pat00040
HPLC 칼럼: 키네텍스(Kinetex) C18, 100 x 2.1 mm, 입자 크기: 2.6 μm, 세공 크기 100 Å (페노메넥스(Phenomenex); 아샤펜부르크)
Figure pat00041
예비칼럼: 크루드캣처 울트라 HPLC 인-라인 필터(KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter); 0.5 μm 필터 깊이 및 0.004 mm 내부 직경 (페노메넥스; 아샤펜부르크)
2-ml 반응 용기에 용매 (80% (v/v) 아세토니트릴, 20% 이중-증류된 H2O (v/v) + 0.1% 포름산) 1900 μl 및 샘플 100 μl를 피펫팅하여 샘플을 제조하였다. 혼합물을 약 10초 동안 볼텍싱한 다음 약 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 투명한 상청액을 피펫을 사용하여 제거하고, 희석제 (80% (v/v) ACN, 20% 이중-증류된 H2O (v/v) + 0.1% 포름산)로 적절한 희석 후에 분석하였다. 100 μL의 ISTD를 각각의 900 μL 샘플 내로 (90 μL의 샘플 부피의 경우 10 μL) 피펫팅하였다.
상기 언급된 칼럼 및 예비칼럼을 사용하여 HPLC 분리를 수행하였다. 주사 부피는 0.7 μL이고, 칼럼 온도는 50℃이고, 유량은 0.6 mL/분이었다. 이동상은 용리액 A (0.1% (v/v) 수성 포름산) 및 용리액 B (아세토니트릴과 0.1% (v/v) 포름산)로 이루어졌다. 하기 구배 프로파일을 사용하였다:
Figure pat00042
하기 ESI 공급원의 파라미터를 사용하여 양성 이온화 모드로 ESI-MS2 분석을 수행하였다:
Figure pat00043
가스 온도 280℃
Figure pat00044
가스 유량 11 L/분
Figure pat00045
네뷸라이징 압력 50 psi
Figure pat00046
모세관 전압 4000 V
화합물 HLAME, OLAME, ALAME, DDAME, DDADME, HUAME, OUAME, AUAME, UDAME 및 UDADME의 검출 및 정량화를 하기 MRM 파라미터를 사용하여 수행하였으며, 각각의 경우에 생성 이온을 정성자로서 사용하고 하나를 정량자로서 사용하였다.
<표 1> 분석물 LA 및 LAME를 SIM 모드에서 검출하였다 (m/z 201 및 215).
Figure pat00047
실시예 7
이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche 및 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche에 의한 알칸의 상응하는 ω-관능화 지방산 메틸 에스테르로의 전환
상기 기재된 프로토콜을 사용하여 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche는 도데칸으로부터 DDAME 및 DDADME를, 뿐만 아니라 운데칸으로부터 UDAME 및 UDADME를 생산하는 것으로 밝혀질 수 있었다 (표 1 및 표 2 참조). 더욱이, 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche는 도데칸으로부터 HLAME 및 ALAME를, 뿐만 아니라 운데칸으로부터 HUAME 및 AUAME를 생산하는 것으로 밝혀질 수 있었다 (표 2 및 3 참조).
<표 2> 균주 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche (균주 1) 및 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche (균주 2)를 사용하여 도데칸으로부터 형성된 ω-관능화 지방산 메틸 에스테르의 농도.
Figure pat00048
<표 3> 균주 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche (균주 1) 및 이. 콜라이 W3110 ΔbioH ΔfadE pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pCDF-fadD_Ec-wes_Hche (균주 2)를 사용하여 운데칸으로부터 형성된 ω-관능화 지방산 메틸 에스테르의 농도.
Figure pat00049
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF - FUCTIONALISED CARBOXYLIC ACIDS AND ESTERS THEREOF <130> 201500273EP <150> EP15196180 <151> 2015-11-25 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 1 Met Leu Glu Lys His Arg Val Leu Asp Ser Ala Pro Glu Tyr Val Asp 1 5 10 15 Lys Lys Lys Tyr Leu Trp Ile Leu Ser Thr Leu Trp Pro Ala Thr Pro 20 25 30 Met Ile Gly Ile Trp Leu Ala Asn Glu Thr Gly Trp Gly Ile Phe Tyr 35 40 45 Gly Leu Val Leu Leu Val Trp Tyr Gly Ala Leu Pro Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Met Phe Gly Glu Asp Phe Asn Asn Pro Pro Glu Glu Val Val Pro Lys 65 70 75 80 Leu Glu Lys Glu Arg Tyr Tyr Arg Val Leu Thr Tyr Leu Thr Val Pro 85 90 95 Met His Tyr Ala Ala Leu Ile Val Ser Ala Trp Trp Val Gly Thr Gln 100 105 110 Pro Met Ser Trp Leu Glu Ile Gly Ala Leu Ala Leu Ser Leu Gly Ile 115 120 125 Val Asn Gly Leu Ala Leu Asn Thr Gly His Glu Leu Gly His Lys Lys 130 135 140 Glu Thr Phe Asp Arg Trp Met Ala Lys Ile Val Leu Ala Val Val Gly 145 150 155 160 Tyr Gly His Phe Phe Ile Glu His Asn Lys Gly His His Arg Asp Val 165 170 175 Ala Thr Pro Met Asp Pro Ala Thr Ser Arg Met Gly Glu Ser Ile Tyr 180 185 190 Lys Phe Ser Ile Arg Glu Ile Pro Gly Ala Phe Ile Arg Ala Trp Gly 195 200 205 Leu Glu Glu Gln Arg Leu Ser Arg Arg Gly Gln Ser Val Trp Ser Phe 210 215 220 Asp Asn Glu Ile Leu Gln Pro Met Ile Ile Thr Val Ile Leu Tyr Ala 225 230 235 240 Val Leu Leu Ala Leu Phe Gly Pro Lys Met Leu Val Phe Leu Pro Ile 245 250 255 Gln Met Ala Phe Gly Trp Trp Gln Leu Thr Ser Ala Asn Tyr Ile Glu 260 265 270 His Tyr Gly Leu Leu Arg Gln Lys Met Glu Asp Gly Arg Tyr Glu His 275 280 285 Gln Lys Pro His His Ser Trp Asn Ser Asn His Ile Val Ser Asn Leu 290 295 300 Val Leu Phe His Leu Gln Arg His Ser Asp His His Ala His Pro Thr 305 310 315 320 Arg Ser Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Phe Pro Gly Leu Pro Ala Leu Pro 325 330 335 Thr Gly Tyr Pro Gly Ala Phe Leu Met Ala Met Ile Pro Gln Trp Phe 340 345 350 Arg Ser Val Met Asp Pro Lys Val Val Asp Trp Ala Gly Gly Asp Leu 355 360 365 Asn Lys Ile Gln Ile Asp Asp Ser Met Arg Glu Thr Tyr Leu Lys Lys 370 375 380 Phe Gly Thr Ser Ser Ala Gly His Ser Ser Ser Thr Ser Ala Val Ala 385 390 395 400 Ser <210> 2 <211> 458 <212> PRT <213> Hahella chejuensis <400> 2 Met Thr Pro Leu Ser Pro Val Asp Gln Ile Phe Leu Trp Leu Glu Lys 1 5 10 15 Arg Gln Gln Pro Met His Val Gly Gly Leu His Ile Phe Ser Phe Pro 20 25 30 Asp Asp Ala Asp Ala Lys Tyr Met Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Arg 35 40 45 Ala Tyr Ala Thr Pro Gln Ala Pro Phe Asn Arg Arg Leu Arg Gln Arg 50 55 60 Trp Gly Arg Tyr Tyr Trp Asp Thr Asp Ala Gln Phe Asp Leu Glu His 65 70 75 80 His Phe Arg His Glu Ala Leu Pro Lys Pro Gly Arg Ile Arg Glu Leu 85 90 95 Leu Ala His Val Ser Ala Glu His Ser Asn Leu Met Asp Arg Glu Arg 100 105 110 Pro Met Trp Glu Cys His Leu Ile Glu Gly Ile Arg Gly Arg Arg Phe 115 120 125 Ala Val Tyr Tyr Lys Ala His His Cys Met Leu Asp Gly Val Ala Ala 130 135 140 Met Arg Met Cys Val Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Pro Thr Ala Thr Glu 145 150 155 160 Met Pro Pro Ile Trp Ala Ile Ser Lys Asp Val Thr Pro Ala Arg Glu 165 170 175 Thr Gln Ala Pro Ala Ala Gly Asp Leu Val His Ser Leu Ser Gln Leu 180 185 190 Val Glu Gly Ala Gly Arg Gln Leu Ala Thr Val Pro Thr Leu Ile Arg 195 200 205 Glu Leu Gly Lys Asn Leu Leu Lys Ala Arg Asp Asp Ser Asp Ala Gly 210 215 220 Leu Ile Phe Arg Ala Pro Pro Ser Ile Leu Asn Gln Arg Ile Thr Gly 225 230 235 240 Ser Arg Arg Phe Ala Ala Gln Ser Tyr Ala Leu Glu Arg Phe Lys Ala 245 250 255 Ile Gly Lys Ala Phe Gln Ala Thr Val Asn Asp Val Val Leu Ala Val 260 265 270 Cys Gly Ser Ala Leu Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Arg Gln Ala Leu Pro 275 280 285 Asp Gln Pro Leu Ile Ala Met Ala Pro Met Ser Ile Arg Gln Asp Asp 290 295 300 Ser Asp Ser Gly Asn Gln Ile Ala Met Ile Leu Ala Asn Leu Gly Thr 305 310 315 320 His Ile Ala Asp Pro Val Arg Arg Leu Glu Leu Thr Gln Ala Ser Ala 325 330 335 Arg Glu Ser Lys Glu Arg Phe Arg Gln Met Thr Pro Glu Glu Ala Val 340 345 350 Asn Tyr Thr Ala Leu Thr Leu Ala Pro Ser Gly Leu Asn Leu Leu Thr 355 360 365 Gly Leu Ala Pro Lys Trp Gln Ala Phe Asn Val Val Ile Ser Asn Val 370 375 380 Pro Gly Pro Asn Lys Pro Leu Tyr Trp Asn Gly Ala Arg Leu Glu Gly 385 390 395 400 Met Tyr Pro Val Ser Ile Pro Val Asp Tyr Ala Ala Leu Asn Ile Thr 405 410 415 Leu Val Ser Tyr Arg Asp Gln Leu Glu Phe Gly Phe Thr Ala Cys Arg 420 425 430 Arg Thr Leu Pro Ser Met Gln Arg Leu Leu Asp Tyr Ile Glu Gln Gly 435 440 445 Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ala Ala Gly Val 450 455 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum <400> 3 Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg 405 410 415 Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455 <210> 4 <211> 230 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 4 Met Ser Phe Ser Asn Tyr Lys Val Ile Ala Met Pro Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Asn Phe Val Leu Gly Ala Ala Thr Ala Trp Ala Asn Glu Asn Tyr Pro 20 25 30 Ala Lys Ser Ala Gly Tyr Asn Gln Gly Asp Trp Val Ala Ser Phe Asn 35 40 45 Phe Ser Lys Val Tyr Val Gly Glu Glu Leu Gly Asp Leu Asn Val Gly 50 55 60 Gly Gly Ala Leu Pro Asn Ala Asp Val Ser Ile Gly Asn Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Thr Phe Asp Ile Ala Tyr Phe Val Ser Ser Asn Ile Ala Val Asp 85 90 95 Phe Phe Val Gly Val Pro Ala Arg Ala Lys Phe Gln Gly Glu Lys Ser 100 105 110 Ile Ser Ser Leu Gly Arg Val Ser Glu Val Asp Tyr Gly Pro Ala Ile 115 120 125 Leu Ser Leu Gln Tyr His Tyr Asp Ser Phe Glu Arg Leu Tyr Pro Tyr 130 135 140 Val Gly Val Gly Val Gly Arg Val Leu Phe Phe Asp Lys Thr Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Ser Ser Phe Asp Ile Lys Asp Lys Trp Ala Pro Ala Phe Gln 165 170 175 Val Gly Leu Arg Tyr Asp Leu Gly Asn Ser Trp Met Leu Asn Ser Asp 180 185 190 Val Arg Tyr Ile Pro Phe Lys Thr Asp Val Thr Gly Thr Leu Gly Pro 195 200 205 Val Pro Val Ser Thr Lys Ile Glu Val Asp Pro Phe Ile Leu Ser Leu 210 215 220 Gly Ala Ser Tyr Val Phe 225 230 <210> 5 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK L <400> 5 Val Ser Phe Ser Asn Tyr Lys Val Ile Ala Met Pro Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Asn Phe Val Leu Gly Ala Ala Thr Ala Trp Ala Asn Glu Asn Tyr Pro 20 25 30 Ala Lys Ser Ala Gly Tyr Asn Gln Gly Asp Trp Val Ala Ser Phe Asn 35 40 45 Phe Ser Lys Val Tyr Val Gly Glu Glu Leu Gly Asp Leu Asn Val Gly 50 55 60 Gly Gly Ala Leu Pro Asn Ala Asp Val Ser Ile Gly Asn Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Thr Phe Asp Ile Ala Tyr Phe Val Ser Ser Asn Ile Ala Val Asp 85 90 95 Phe Phe Val Gly Val Pro Ala Arg Ala Lys Phe Gln Gly Glu Lys Ser 100 105 110 Ile Ser Ser Leu Gly Arg Val Ser Glu Val Asp Tyr Gly Pro Ala Ile 115 120 125 Leu Ser Leu Gln Tyr His Tyr Asp Ser Phe Glu Arg Leu Tyr Pro Tyr 130 135 140 Val Gly Val Gly Val Gly Arg Val Leu Phe Phe Asp Lys Thr Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Ser Ser Phe Asp Ile Lys Asp Lys Trp Ala Pro Ala Phe Gln 165 170 175 Val Gly Leu Arg Tyr Asp Leu Gly Asn Ser Trp Met Leu Asn Ser Asp 180 185 190 Val Arg Tyr Ile Pro Phe Lys Thr Asp Val Thr Gly Thr Leu Gly Pro 195 200 205 Val Pro Val Ser Thr Lys Ile Glu Val Asp Pro Phe Ile Leu Ser Leu 210 215 220 Gly Ala Ser Tyr Val Phe 225 230 <210> 6 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FADL <400> 6 Met Ser Gln Lys Thr Leu Phe Thr Lys Ser Ala Leu Ala Val Ala Val 1 5 10 15 Ala Leu Ile Ser Thr Gln Ala Trp Ser Ala Gly Phe Gln Leu Asn Glu 20 25 30 Phe Ser Ser Ser Gly Leu Gly Arg Ala Tyr Ser Gly Glu Gly Ala Ile 35 40 45 Ala Asp Asp Ala Gly Asn Val Ser Arg Asn Pro Ala Leu Ile Thr Met 50 55 60 Phe Asp Arg Pro Thr Phe Ser Ala Gly Ala Val Tyr Ile Asp Pro Asp 65 70 75 80 Val Asn Ile Ser Gly Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Leu Lys Ala Asp 85 90 95 Asn Ile Ala Pro Thr Ala Trp Val Pro Asn Met His Phe Val Ala Pro 100 105 110 Ile Asn Asp Gln Phe Gly Trp Gly Ala Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Gly 115 120 125 Leu Ala Thr Glu Phe Asn Asp Thr Tyr Ala Gly Gly Ser Val Gly Gly 130 135 140 Thr Thr Asp Leu Glu Thr Met Asn Leu Asn Leu Ser Gly Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Leu Asn Asn Ala Trp Ser Phe Gly Leu Gly Phe Asn Ala Val Tyr Ala 165 170 175 Arg Ala Lys Ile Glu Arg Phe Ala Gly Asp Leu Gly Gln Leu Val Ala 180 185 190 Gly Gln Ile Met Gln Ser Pro Ala Gly Gln Thr Gln Gln Gly Gln Ala 195 200 205 Leu Ala Ala Thr Ala Asn Gly Ile Asp Ser Asn Thr Lys Ile Ala His 210 215 220 Leu Asn Gly Asn Gln Trp Gly Phe Gly Trp Asn Ala Gly Ile Leu Tyr 225 230 235 240 Glu Leu Asp Lys Asn Asn Arg Tyr Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Val 245 250 255 Lys Ile Asp Phe Lys Gly Asn Tyr Ser Ser Asp Leu Asn Arg Ala Phe 260 265 270 Asn Asn Tyr Gly Leu Pro Ile Pro Thr Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gln 275 280 285 Ser Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Leu Pro Glu Met Trp Glu Val Ser Gly 290 295 300 Tyr Asn Arg Val Asp Pro Gln Trp Ala Ile His Tyr Ser Leu Ala Tyr 305 310 315 320 Thr Ser Trp Ser Gln Phe Gln Gln Leu Lys Ala Thr Ser Thr Ser Gly 325 330 335 Asp Thr Leu Phe Gln Lys His Glu Gly Phe Lys Asp Ala Tyr Arg Ile 340 345 350 Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Tyr Tyr Asp Asp Asn Trp Thr Phe Arg Thr 355 360 365 Gly Ile Ala Phe Asp Asp Ser Pro Val Pro Ala Gln Asn Arg Ser Ile 370 375 380 Ser Ile Pro Asp Gln Asp Arg Phe Trp Leu Ser Ala Gly Thr Thr Tyr 385 390 395 400 Ala Phe Asn Lys Asp Ala Ser Val Asp Val Gly Val Ser Tyr Met His 405 410 415 Gly Gln Ser Val Lys Ile Asn Glu Gly Pro Tyr Gln Phe Glu Ser Glu 420 425 430 Gly Lys Ala Trp Leu Phe Gly Thr Asn Phe Asn Tyr Ala Phe 435 440 445 <210> 7 <211> 7387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector pCDF-fadD_Ec-wes_Hche <400> 7 cgggatctcg acgctctccc ttatgcgact cctgcgttta gggaaagagc atttgtcaga 60 atatttaagg gcgcctgtca ctttgcttga tatatgagaa ttatttaacc ttataaatga 120 gaaaaaagca acgcacttta aataagatac gttgcttttt cgattgatga acacctataa 180 ttaaactatt catctattat ttatgatttt ttgtatatac aatatttcta gtttgttaaa 240 gagaattaag aaaataaatc tcgaaaataa taaagggaaa atcagttttt gatatcaaaa 300 ttatacatgt caacgataat acaaaatata atacaaacta taagatgtta tcagtattta 360 ttatgcattt agaatacctt ttgtgtcgcc cttattcgac tccctataga agttcctatt 420 ctctagaaag tataggaact tcccttcatt ttggatccaa ttgtgagcgg ataacaatta 480 cgagcttcat gcacagtgat cgacgctgtt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt 540 ggatgtggaa ttgtgagcgc tcacaattcc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 600 ttaacaggag gtaaaacata tgttaacggc atgtatatca tttggggttg cgatgacgac 660 gaacacgcat tttagaggtg aagaattgaa gaaggtttgg cttaaccgtt atcccgcgga 720 cgttccgacg gagatcaacc ctgaccgtta tcaatctctg gtagatatgt ttgagcagtc 780 ggtcgcgcgc tacgccgatc aacctgcgtt tgtgaatatg ggggaggtaa tgaccttccg 840 caagctggaa gaacgcagtc gcgcgtttgc cgcttatttg caacaagggt tggggctgaa 900 gaaaggcgat cgcgttgcgt tgatgatgcc taatttattg caatatccgg tggcgctgtt 960 tggcattttg cgtgccggga tgatcgtcgt aaacgttaac ccgttgtata ccccgcgtga 1020 gcttgagcat cagcttaacg atagcggcgc atcggcgatt gttatcgtgt ctaactttgc 1080 tcacacactg gaaaaagtgg ttgataaaac cgccgttcag cacgtaattc tgacccgtat 1140 gggcgatcag ctatctacgg caaaaggcac ggtagtcaat ttcgttgtta aatacatcaa 1200 gcgtttggtg ccgaaatacc atctgccaga tgccatttca tttcgtagcg cactgcataa 1260 cggctaccgg atgcagtacg tcaaacccga actggtgccg gaagatttag cttttctgca 1320 atacaccggc ggcaccactg gtgtggcgaa aggcgcgatg ctgactcacc gcaatatgct 1380 ggcgaacctg gaacaggtta acgcgaccta tggtccgctg ttgcatccgg gcaaagagct 1440 ggtggtgacg gcgctgccgc tgtatcacat ttttgccctg accattaact gcctgctgtt 1500 tatcgaactg ggtgggcaga acctgcttat cactaacccg cgcgatattc cagggttggt 1560 aaaagagtta gcgaaatatc cgtttaccgc tatcacgggc gttaacacct tgttcaatgc 1620 gttgctgaac aataaagagt tccagcagct ggatttctcc agtctgcatc tttccgcagg 1680 cggtgggatg ccagtgcagc aagtggtggc agagcgttgg gtgaaactga ccggacagta 1740 tctgctggaa ggctatggcc ttaccgagtg tgcgccgctg gtcagcgtta acccatatga 1800 tattgattat catagtggta gcatcggttt gccggtgccg tcgacggaag ccaaactggt 1860 ggatgatgat gataatgaag taccaccagg tcaaccgggt gagctttgtg tcaaaggacc 1920 gcaggtgatg ctgggttact ggcagcgtcc cgatgctacc gatgaaatca tcaaaaatgg 1980 ctggttacac accggcgaca tcgcggtaat ggatgaagaa ggattcctgc gcattgtcga 2040 tcgtaaaaaa gacatgattc tggtttccgg ttttaacgtc tatcccaacg agattgaaga 2100 tgtcgtcatg cagcatcctg gcgtacagga agtcgcggct gttggcgtac cttccggctc 2160 cagtggtgaa gcggtgaaaa tcttcgtagt gaaaaaagat ccatcgctta ccgaagagtc 2220 actggtgact ttttgccgcc gtcagctcac gggatacaaa gtaccgaagc tggtggagtt 2280 tcgtgatgag ttaccgaaat ctaacgtcgg aaaaattttg cgacgagaat tacgtgacga 2340 agcgcgcggc aaagtggaca ataaagcctg agcgaattcg gatccatgca cagtgaaatc 2400 atgaaaaatt tatttgcttt gtgagcggat aacaattata atagcatgct ggtcagtatt 2460 gagcgatgca tgcacggttt ccctctagaa ataattttgt ttaactttta ggaggtaaaa 2520 accatgggta gctctcacca tcatcatcat cacagctctg gcctggttcc gcgcggttcc 2580 cacatgacgc cgctgagccc ggtcgatcaa atctttctgt ggctggagaa gcgtcagcag 2640 ccgatgcacg tcggtggctt gcacattttc agcttccctg atgacgcaga cgcgaagtat 2700 atgaccgagc tggcgcagca actgcgtgca tacgcgacgc cgcaggcacc attcaaccgt 2760 cgcctgcgtc agcgctgggg ccgttactat tgggacaccg atgctcagtt cgacctggag 2820 catcattttc gtcacgaagc gctgccgaaa ccgggtcgca ttcgcgaact gttggcccac 2880 gttagcgcgg agcattctaa tctgatggat cgtgaacgtc cgatgtggga gtgccatctg 2940 atcgaaggca tccgtggtcg ccgtttcgcg gtttactaca aggcgcatca ctgtatgctg 3000 gacggtgtag ccgccatgcg tatgtgcgtg aaatcctaca gctttgatcc gaccgcaacg 3060 gagatgccgc cgatttgggc tatcagcaaa gacgttaccc cggctcgtga aactcaagca 3120 ccggcagcgg gtgacctggt gcactccctg tcccagctgg ttgagggtgc cggtcgtcaa 3180 ctggcgaccg tcccgaccct gattcgtgag ctgggcaaaa acttgctgaa ggcgcgtgac 3240 gactctgacg cgggtctgat ttttcgcgct ccgccaagca ttctgaacca acgcatcacc 3300 ggtagccgcc gttttgcggc gcagagctac gcgttggaac gctttaaggc gatcggtaag 3360 gcattccagg ctacggttaa cgatgtggtg ctggcggtgt gcggttccgc actgcgtaac 3420 tatttgctga gccgccaagc cctgccggat caaccgctga ttgcaatggc ccctatgagc 3480 atccgtcagg acgatagcga cagcggcaat cagatcgcga tgatcctggc gaatctgggc 3540 acccacatcg cggacccggt ccgtcgtttg gaactgacgc aagcaagcgc tcgcgagagc 3600 aaagagcgct tccgtcagat gacgccggaa gaggcagtga actataccgc gctgaccctg 3660 gccccgagcg gtctgaatct gctgacgggt ttggccccga aatggcaggc cttcaatgtc 3720 gtgattagca acgttccagg cccgaataag ccgctgtact ggaacggtgc gcgcctggaa 3780 ggcatgtatc cggtttctat tcctgtcgat tatgcggcat tgaatatcac tctggttagc 3840 taccgtgatc aactggaatt tggtttcacc gcatgtcgcc gtaccctgcc gtcgatgcaa 3900 cgtctgttgg attacattga gcaaggcatt gccgagctgg agaaagcggc tggcgtgtaa 3960 ctcgagatcg aatgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 4020 gctcgagtct ggtaaagaaa ccgctgctgc gaaatttgaa cgccagcaca tggactcgtc 4080 tactagcgca gcttaattaa cctaggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4140 ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaacctcagg catttgagaa 4200 gcacacggtc acactgcttc cggtagtcaa taaaccggta aaccagcaat agacataagc 4260 ggctatttaa cgaccctgcc ctgaaccgac gaccgggtca tcgtggccgg atcttgcggc 4320 ccctcggctt gaacgaattg ttagacatta tttgccgact accttggtga tctcgccttt 4380 cacgtagtgg acaaattctt ccaactgatc tgcgcgcgag gccaagcgat cttcttcttg 4440 tccaagataa gcctgtctag cttcaagtat gacgggctga tactgggccg gcaggcgctc 4500 cattgcccag tcggcagcga catccttcgg cgcgattttg ccggttactg cgctgtacca 4560 aatgcgggac aacgtaagca ctacatttcg ctcatcgcca gcccagtcgg gcggcgagtt 4620 ccatagcgtt aaggtttcat ttagcgcctc aaatagatcc tgttcaggaa ccggatcaaa 4680 gagttcctcc gccgctggac ctaccaaggc aacgctatgt tctcttgctt ttgtcagcaa 4740 gatagccaga tcaatgtcga tcgtggctgg ctcgaagata cctgcaagaa tgtcattgcg 4800 ctgccattct ccaaattgca gttcgcgctt agctggataa cgccacggaa tgatgtcgtc 4860 gtgcacaaca atggtgactt ctacagcgcg gagaatctcg ctctctccag gggaagccga 4920 agtttccaaa aggtcgttga tcaaagctcg ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacggtcac 4980 cgtaaccagc aaatcaatat cactgtgtgg cttcaggccg ccatccactg cggagccgta 5040 caaatgtacg gccagcaacg tcggttcgag atggcgctcg atgacgccaa ctacctctga 5100 tagttgagtc gatacttcgg cgatcaccgc ttccctcata ctcttccttt ttcaatatta 5160 ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 5220 aaataaacaa atagctagct cactcggtcg ctacgctccg ggcgtgagac tgcggcgggc 5280 gctgcggaca catacaaagt tacccacaga ttccgtggat aagcagggga ctaacatgtg 5340 aggcaaaaca gcagggccgc gccggtggcg tttttccata ggctccgccc tcctgccaga 5400 gttcacataa acagacgctt ttccggtgca tctgtgggag ccgtgaggct caaccatgaa 5460 tctgacagta cgggcgaaac ccgacaggac ttaaagatcc ccaccgtttc cggcgggtcg 5520 ctccctcttg cgctctcctg ttccgaccct gccgtttacc ggatacctgt tccgcctttc 5580 tcccttacgg gaagtgtggc gctttctcat agctcacaca ctggtatctc ggctcggtgt 5640 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtaagc aagaactccc cgttcagccc gactgctgcg 5700 ccttatccgg taactgttca cttgagtcca acccggaaaa gcacggtaaa acgccactgg 5760 cagcagccat tggtaactgg gagttcgcag aggatttgtt tagctaaaca cgcggttgct 5820 cttgaagtgt gcgccaaagt ccggctacac tggaaggaca gatttggttg ctgtgctctg 5880 cgaaagccag ttaccacggt taagcagttc cccaactgac ttaaccttcg atcaaaccac 5940 ctccccaggt ggttttttcg tttacagggc aaaagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 6000 aagaagatcc tttgatcttt tctactgaac cgctctagat ttcagtgcaa tttatctctt 6060 caaatgtagc acctgaagtc agccccatac gatataagtt gtaattctca tgttagtcat 6120 gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga 6180 tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 6240 ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 6300 cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct 6360 gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc 6420 ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt 6480 cggtatcgtc gtatcccact accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa 6540 tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga 6600 tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt 6660 cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac 6720 gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca 6780 atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt 6840 tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt 6900 ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt 6960 gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg 7020 acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg 7080 acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg 7140 ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt 7200 tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat 7260 aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc 7320 tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga 7380 tggtgtc 7387

Claims (15)

  1. 적어도 1종의 알칸으로부터 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하기 위한 미생물 세포이며, 여기서 세포는
    (i) 알칸을 상응하는 1-알칸올로 전환시킬 수 있는 효소 E1;
    (ii) (i)의 1-알칸올을 상응하는 1-알칸알로 전환시킬 수 있는 효소 E2;
    (iii) (ii)의 1-알칸알을 상응하는 알칸산으로 전환시킬 수 있는 효소 E3;
    (iv) (iii)의 알칸산을 상응하는 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E4; 및
    (v) (iv)의 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E5
    의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 유전자 변형되고,
    세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 E20-E24:
    - EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.2.22의 E20 아실-ACP 티오에스테라제,
    - EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 또는 EC 3.1.2.22의 E21 아실-CoA 티오에스테라제,
    - E22 아실-CoA:ACP 트랜스아실라제,
    - E23 폴리케티드 신타제, 및
    - E24 헥산산 신타제
    중 적어도 1종의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키는 유전자 변형을 포함하지 않는 것인
    미생물 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    (vi) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6; 또는
    (vii) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6 및 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-아미노 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E7; 또는
    (viii) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6 및 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E13 및 ω-카르복시 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 디에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E14
    의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 추가로 유전자 변형된 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    - 효소 E1이 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E2가 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 알콜 옥시다제 (Ec) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E3이 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알데히드 데히드로게나제 (Ee), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ec, Edi, 및 Edii는 ω-히드록시 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 직접 산화시킬 수 있고;
    - 효소 E4가 EC 2.3.1.75의 왁스-에스테르 신타제 (Ef) 또는 EC 2.3.1.84의 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (Eg)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E5가 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E6이 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), EC 1.1.3.20의 알콜 옥시다제 (Ec), 알데히드 데히드로게나제 (Ee) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 존재하는 경우에 효소 E7이 ω-트랜스아미나제 (Eh) EC 2.6.1이고;
    - 존재하는 경우에 효소 E13이 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알데히드 데히드로게나제 (Ee), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ec, Edi, 및 Edii는 ω-히드록시 알칸산 에스테르를 ω-옥소 알칸산 에스테르를 통해 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 직접 산화시킬 수 있고;
    - 존재하는 경우에 효소 E14가 EC 2.3.1.75의 왁스-에스테르 신타제 (Ef) 또는 EC 2.3.1.84의 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (Eg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 E1, E2, E3, E5 및 E6이 적어도 1종의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)이고, 효소 E4가 왁스-에스테르 신타제 (Ef)인 세포.
  5. 제4항에 있어서,
    - AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 포함하고;
    - 왁스-에스테르 신타제 (Ef)가 서열식별번호: 2에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 포함하고;
    - 존재하는 경우에 ω-트랜스아미나제 (Eh)가 서열식별번호: 3에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 것인 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, EC 6.2.1.3 또는 EC 2.3.1.86의 적어도 1종의 아실-CoA 신테타제 (E12)의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 추가로 유전자 변형된 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 세포를 적어도 1종의 알칸과 접촉시키는 단계를 포함하는, 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    - ω-관능화 카르복실산 에스테르가 알칸 도데칸으로부터의 12-아미노 라우르산 메틸 에스테르, 12-히드록시 라우르산 메틸 에스테르, 12-카르복시 라우르산 메틸 (디) 에스테르 및/또는 라우르산 메틸 에스테르이고/거나;
    - ω-관능화 카르복실산 에스테르가 알칸 운데칸으로부터의 11-아미노 운데칸산 메틸 에스테르, 11-히드록시 운데칸산 메틸 에스테르, 11-카르복시 운데칸산 메틸 (디) 에스테르 및/또는 운데칸산 메틸 에스테르인 방법.
  9. (a) 하기 효소:
    (i) 알칸을 상응하는 1-알칸올로 전환시킬 수 있는 효소 E1;
    (ii) (i)의 1-알칸올을 상응하는 1-알칸알로 전환시킬 수 있는 효소 E2;
    (iii) (ii)의 1-알칸알을 상응하는 알칸산으로 전환시킬 수 있는 효소 E3;
    (iv) (iii)의 알칸산을 상응하는 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E4; 및
    (v) (iv)의 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E5
    를 알칸과 접촉시키는 단계를 포함하는, 알칸으로부터 적어도 1종의 ω-관능화 카르복실산 에스테르를 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (b) 하기 효소:
    (vi) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6; 또는
    (vii) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6 및 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-아미노 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E7; 또는
    (viii) (v)의 상응하는 ω-히드록시-알칸산 에스테르를 상응하는 ω-옥소 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E6 및 ω-옥소 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E13 및 (vi)의 ω-카르복시 알칸산 에스테르를 상응하는 ω-카르복시 알칸산 디에스테르로 전환시킬 수 있는 효소 E14
    를 ω-히드록시-알칸산 에스테르와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    - 효소 E1이 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E2가 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알콜 옥시다제 (Ec) 및 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E3이 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알데히드 데히드로게나제 (Ee), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ec, Edi, 및 Edii는 1-알칸올을 1-알칸알을 통해 상응하는 알칸산으로 직접 산화시킬 수 있고;
    - 효소 E4가 왁스-에스테르 신타제 (Ef) 및 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (Eg)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 효소 E5가 P450 알칸 히드록실라제 (Ea) 및 EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 존재하는 경우에 효소 E6이 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알콜 옥시다제 (Ec) 및 알콜 데히드로게나제 (Ed)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 존재하는 경우에 효소 E7이 ω-트랜스아미나제 (Eh)이고;
    - 존재하는 경우에 효소 E13이 EC 1.14.15.3-의 P450 알칸 히드록실라제 (Ea), EC 1.14.15.3의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb), 알데히드 데히드로게나제 (Ee), EC 1.1.3.20의 이관능성 알콜 옥시다제 (Ec), 이관능성 AlkJ 알콜 데히드로게나제 (Edi) 및 EC 1.1.1.1 또는 EC 1.1.1.2의 이관능성 알콜 데히드로게나제 (Edii)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Ec, Edi, 및 Edii는 ω-히드록시 알칸산 에스테르를 ω-옥소 알칸산 에스테르를 통해 상응하는 ω-카르복시 알칸산 에스테르로 직접 산화시킬 수 있고;
    - 존재하는 경우에 효소 E14가 왁스-에스테르 신타제 (Ef) 및 알콜 O-아실 트랜스퍼라제 (Eg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 E1, E2, E3, 및 E5가 적어도 1종의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)이고, 존재하는 경우에 E6이 적어도 1종의 AlkB 알칸 히드록실라제 (Eb)이고, 효소 E4가 왁스-에스테르 신타제 (Ef)인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 E1 내지 E5 및 임의적으로 E6 및 E7의 발현을 야생형 세포에 비해 증가시키도록 유전자 변형된 세포의 형태에서 효소를 알칸과 접촉시키는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포가 이. 콜라이(E. coli), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp .), 부르크홀데리아 종(Burkholderia sp .), 부르크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis), 시아노박테리엔(Cyanobakterien), 클레브시엘라 종(Klebsiella sp .), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 살모넬라 종(Salmonella sp .), 리조비움 종(Rhizobium sp .) 및 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 바실루스 종(Bacillus sp .), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리디움 종(Clostridium sp .), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp .), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 종(Brevibacterium sp.), 클로렐라 종(Chlorella sp .) 및 노스톡 종(Nostoc sp .)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    - ω-관능화 카르복실산 에스테르가 알칸 도데칸으로부터의 12-아미노 라우르산 메틸 에스테르, 12-히드록시 라우르산 메틸 에스테르, 12-카르복시 라우르산 메틸 (디) 에스테르 및/또는 라우르산 메틸 에스테르이고/거나;
    - ω-관능화 카르복실산 에스테르가 알칸 운데칸으로부터의 11-아미노 운데칸산 메틸 에스테르, 11-히드록시 운데칸산 메틸 에스테르, 11-카르복시 운데칸산 메틸 (디) 에스테르 및/또는 운데칸산 메틸 에스테르인 방법.
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