TW201536920A - 於微滴致動器之酵素試驗 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於用於多工新生兒測試代謝失調的微滴致動器裝置及試驗法。該等方法尤其包括用於測試代謝失調的基於微滴之酵素試驗及免疫試驗。本發明包括於單一微滴致動器上對不同代謝失調進行多次試驗，以及於單一微滴致動器上使用來自不同個體之樣本及/或來自同一個體之多個樣本對同一代謝失調進行多次試驗的方法及裝置。在各具體實例中，本發明包括在單一新鮮血液及/或血漿樣本及乾燥血液及/或血漿樣本中進行酵素活性試驗及/或免疫試驗之方法。

Description

於微滴致動器之酵素試驗 相關申請案
除本文中引用之專利申請案(其各自以引用的方式併入本文中)外，本申請案係關於以下各案且主張其申請日期的優先權：2009年12月21日申請之標題為「MPS II Assay on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/288,633號；2009年12月28日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/290,296號；2010年4月19日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/325,580號；2010年5月13日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/334,376號；2010年6月30日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/359,943號；2010年8月31日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/378,705號；2010年9月14日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/382,564；2010年10月13日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/392,633號；及2010年10月25日申請之標題為「Enzyme Assays on a Droplet Actuator」之美國臨時專利申請案第61/406,380號。上述申請案之揭示內容以全文引用的方式特別併入本文中。
本發明大體而言係關於微滴致動器裝置及試驗法。特定言之，本發明係關於用於多工新生兒測試代謝失調的微滴致動器裝置及試驗法。
微滴致動器可包括一或多個基板，其經組態以形成用於進行微滴操作之表面或間隙。該一或多個基板建立用於進行微滴操作之微滴操作表面或間隙且亦可包括經配置以進行微滴操作之電極。微滴操作基板或基板之間的間隙可經與形成微滴之液體不可混溶的填充流體塗佈或填充。
微滴致動器用於各種應用，包括分子診斷試驗，諸如酵素試驗及免疫試驗。在一應用中，酵素試驗及免疫試驗用作測試新生嬰兒之各種遺傳疾病的常規測試方法之一部分。舉例而言，酵素試驗可用以測試各種溶酶體儲積病(LSD)、半乳糖血症及生物素酵素缺乏症(BIOT)。免疫試驗可用以測試先天性甲狀腺功能低下(CH)、先天性腎上腺增生(CAH)及囊腫性纖維化(CF)。新生兒測試中所用之當前酵素試驗及免疫試驗技術基於96孔微量滴定盤相容系統。自新生兒乾血點(DBS)樣本自動打孔式取樣至若干培養盤中(亦即，對於每一欲進行之測試一個孔樣(punch))且根據特定試驗方案操縱各培養盤。各試驗可能需要有管理人員、一或多個技師及設備致力於該試驗之獨立實驗室部門。總體而言，該系統為勞動密集型(儘管一或多個步驟為至少部分自動化)且試劑及設備成本可能較高。因為當前系統為勞動密集型且成本高，所以測試一般侷限於集中實驗室且在發展中國家經常不可得。因此，需要新生兒測試之新穎方法。
本發明提供用於多工新生兒測試代謝失調的微滴致動器裝置及試驗 法。該等方法尤其包括用於測試代謝失調的基於微滴之酵素試驗及免疫試驗。本發明包括於單一微滴致動器上對不同代謝失調進行多次試驗，以及於單一微滴致動器上使用來自不同個體之樣本及/或來自同一個體之多個樣本對同一代謝失調進行多次試驗的方法及裝置。在各具體實例中，本發明包括在單一新鮮血液及/或血漿樣本及乾血液及/或血漿樣本中進行酵素活性試驗及/或免疫試驗之方法。
本發明提供於微滴致動器上偵測一或多種(亦即多工偵測)溶酶體儲積病(LSD)之試驗法。在一個具體實例中，本發明提供於微滴致動器上偵測MSP II(亨特症候群(Hunter's syndrome))之試驗法。該等方法尤其包括針對艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶(iduronate-2-sulfate sulphatase/IDS)酵素活性的基於微滴之酵素試驗。在某些具體實例中，亨特試驗可在室溫下或在諸如37℃之替代溫度下進行。在其他具體實例中，亨特試驗可進行8小時或8小時以下。亨特試驗為單步勻相試驗，其在單一pH值(亦即pH 5.0)下進行，產生結果所需之時間為8小時或8小時以下。
在另一具體實例中，本發明提供於微滴致動器上酵素偵測高雪及尼曼-匹克病(Gaucher and Niemann-Pick disease)之試驗法。
在又一具體實例中，本發明提供於微滴致動器上酵素偵測龐貝及法布裏病(Pompe and Fabry disease)之試驗法。
在又一具體實例中，本發明提供於微滴致動器上酵素偵測莫基奧B症候群(Morquio B syndrome)之試驗法。
在又一具體實例中，本發明提供一種整合式微滴致動器裝置及方法，其用於在單一微滴致動器上使用單一乾血點(DBS)樣本進行多工酵素試驗 及免疫試驗。在一個實例中，本發明之整合式微滴致動器裝置及方法可用於多工偵測先天性腎上腺增生(CAH)、先天性甲狀腺功能低下(CH)、囊腫性纖維化(CF)、半乳糖血症及生物素酵素缺乏症(BIOT)。
使用數位微流體技術，可使用微滴高速傳輸、可靠分配、快速混合、稀釋及處置以提供快速樣本-至-結果測試來操縱亞微升尺寸化微滴。因為樣本測試方案中實質上所有步驟均在晶片上(自動)進行，所以操作員出錯之風險大大降低。微流體平台、其他試驗方案(亦即，用於其他病症)之靈活性、可程式性及模組格式可容易地添加至晶片上測試群組(testing panel)中。
本發明之微滴致動器裝置及方法藉由多工測試不適於MS/MS之代謝失調來作為對串聯質譜分析(MS/MS)測試的補充。
在又一具體實例中，本發明提供用於酵素偵測亨特症候群及法布裏病之基於試驗台之方法。
在又一具體實例中，本發明提供一種數位微流體平台及方法，其用於多工測試高膽紅素血症、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)缺乏症及先天性甲狀腺功能低下(CH)。
定義
如本文所用，以下術語具有指定含義。
關於一或多個電極，「活化(Activate)」意謂實現該一或多個電極之電狀態變化，其在微滴存在下引起微滴操作。電極活化可使用交流電或直流電實現。可使用任何適合之電壓。舉例而言，電極可使用大於約150V，或大於約200V，或大於約250V，或約275V至約375V，或約300V之電壓 來活化。當使用交流電時，可採用任何適合之頻率。舉例而言，電極可使用頻率為約1Hz至約100Hz，或約10Hz至約60Hz，或約20Hz至約40Hz，或約30Hz之交流電來活化。
關於微滴致動器上之珠粒，「珠粒(Bead)」意謂任何能夠與微滴致動器上或附近之微滴相互作用的珠粒或粒子。珠粒可具有多種形狀中之任一者，諸如球形，一般為球形、卵形、圓盤形、立方形、無晶型及其他三維形狀。珠粒可例如能夠進行微滴致動器上微滴中之微滴操作，或另外相對於微滴致動器以使微滴致動器上之微滴與在微滴致動器上及/或離開微滴致動器之珠粒接觸的方式組態。珠粒可提供於微滴中、微滴操作間隙中或微滴操作表面上。珠粒可提供於微滴操作間隙外或遠離微滴操作表面定位之儲集器中，且儲集器可與使包括珠粒之微滴進入微滴操作間隙或與微滴操作表面接觸之流體路徑關聯。珠粒可使用多種材料(包括例如樹脂，及聚合物)製造。珠粒可具有任何適合之尺寸，包括例如微珠、微粒、奈米珠粒及奈米粒子。在一些情況下，珠粒具磁反應性；在其他情況下，珠粒不具有顯著磁反應性。對於磁反應性珠粒，磁反應性材料可構成實質上全部珠粒、珠粒之一部分，或珠粒之僅一種組分。珠粒之其餘部分可尤其包括聚合材料、塗層，及允許附著試驗試劑之部分。適合珠粒之實例包括流動式細胞測量術微珠、聚苯乙烯微粒及奈米粒子、功能化聚苯乙烯微粒及奈米粒子、經塗佈之聚苯乙烯微粒及奈米粒子、二氧化矽微珠、螢光微球及奈米球、功能化螢光微球及奈米球、經塗佈之螢光微球及奈米球、染色微粒及奈米粒子、磁性微粒及奈米粒子、超順磁微粒及奈米粒子(例如DYNABEADS®粒子，可獲自Invitrogen Group,Carlsbad,CA)、螢光微粒及奈 米粒子、經塗佈之磁性微粒及奈米粒子、亞鐵磁性微粒及奈米粒子、經塗佈之亞鐵磁性微粒及奈米粒子、及以下公開案中所述之珠粒：2005年11月24日公開之標題為「Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase」之美國專利公開案第20050260686號；2003年7月17日公開之標題為「Encapsulation of discrete quanta of fluorescent particles」之美國專利公開案第20030132538號；2005年6月2日公開之標題為「Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method」之美國專利公開案第20050118574號；2005年12月15日公開之標題為「Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same」之美國專利公開案第20050277197號；2006年7月20日公開之標題為「Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications」之美國專利公開案第20060159962號；對於其關於珠粒及磁反應性材料及珠粒之教示，該等案之全部揭示內容以引用的方式併入本文中。珠粒可與生物分子或能夠結合至生物分子且與生物分子形成複合物之其他物質預偶合。珠粒可與抗體、蛋白質或抗原、DNA/RNA探針或對所需標靶具有親和力之任何其他分子預偶合。固定磁反應性珠粒及/或非磁反應性珠粒及/或使用珠粒進行微滴操作方案之微滴致動器技術的實例描述於2006年12月15日申請之標題為「Droplet-Based Particle Sorting」之美國專利申請案第11/639,566號；2008年3月25日申請之標題為「Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet」之美國專利申請案第61/039,183號；2008年4月25日申請之標題為「Droplet Actuator Devices and Droplet Operations Using Beads」之美國專利申請案第61/047,789號；2008年8月5日申請之標題為「Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads」之美國專利申 請案第61/086,183號；2008年2月11日申請之標題為「Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads」之國際專利申請案第PCT/US2008/053545號；2008年3月24日申請之標題為「Bead-based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation」之國際專利申請案第PCT/US2008/058018號；March 23,2008申請之「Bead Sorting on a Droplet Actuator」之國際專利申請案第PCT/US2008/058047號；及2006年12月11日申請之標題為「Droplet-based Biochemistry」之國際專利申請案第PCT/US2006/047486號中；其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。珠粒特徵可用於本發明之多工態樣中。具有適於多工之特徵之珠粒，以及偵測及分析自此等珠粒發出之信號之方法的實例可見於2008年12月11日公開之標題為「Systems and Methods for Multiplex Analysis of PCR in Real Time」之美國專利公開案第20080305481號；2008年6月26日公開之美國專利公開案第20080151240號「Methods and Systems for Dynamic Range Expansion」；2007年9月6日公開之標題為「Methods,Products,and Kits for Identifying an Analyte in a Sample」之美國專利公開案第20070207513號；2007年3月22日公開之標題為「Methods and Systems for Image Data Processing」之美國專利公開案第20070064990號；2006年7月20日公開之標題為「Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications」之美國專利公開案第20060159962號；2005年12月15日公開之標題為「Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same」之美國專利公開案第20050277197號；及2005年6月2日公開之標題為「Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method」之美國專利公開案第20050118574號。
「血液樣本(Blood Sample)」包括全血、全血組分，諸如血清或血漿，及乾血點萃取物。乾血可位於薄紙或標準血液收集卡，或不消除血液作為相關標靶之樣本之適用性的任何其他適合基板上。血液可來自個體，且個體可為任何年齡之人類個體，諸如成人、嬰兒或胎兒。在胎兒之情況下，血液可來自母體。
「微滴(Droplet)」意謂微滴致動器上一定體積之液體。微滴可至少部分由填充流體圍住。舉例而言，微滴可完全由填充流體包圍或可由填充流體及一或多個微滴致動器表面圍住。另舉例而言，微滴可由填充流體、一或多個微滴致動器表面及/或空氣圍住。又舉例而言，微滴可由填充流體及空氣圍住。微滴可例如為水性或非水性或可為包括水性及非水性組分之混合物或乳液。1×微滴可為約300nl。微滴可採用多種形狀；非限制性實例一般包括圓盤形、棒條形、經截短球體、橢圓體、球形、部分壓縮球體、半球形、卵形、圓柱形、此等形狀之組合，及在微滴操作(諸如合併或分裂)期間形成或由於此等形狀與一或多個微滴致動器表面接觸而形成之各種形狀。關於可使用本發明方法進行微滴操作的微滴流體之實例，參看2006年12月11日申請之標題為「Droplet-Based Biochemistry」之國際專利申請案第PCT/US 06/47486號。在各具體實例中，微滴可包括諸如以下之生物樣本：全血、淋巴液、血清、血漿、汗液、淚液、唾液、痰、腦脊髓液、羊膜液、精液、陰道排泄物、漿液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、滲出液、溢出液、膀胱液、膽汁、尿液、胃液、腸液、糞便樣本、含有單個或多個細胞之液體、含有細胞器之液體、流化組織、流化生物體、含有多細胞生物體之液體、生物拭樣及生物洗滌物。此外，微滴可包括諸如水、去離子水、 生理鹽水溶液、酸性溶液、鹼性溶液、清潔劑溶液及/或緩衝液之試劑。微滴內容物之其他實例包括諸如以下試劑：用於生化方案之試劑，生化方案諸如核酸擴增方案、基於親和力之試驗方案、酵素試驗方案、定序方案及/或生物流體分析方案。在各具體實例中，微滴可包括界面活性劑以改良微滴操作。應瞭解，當提及特定界面活性劑時，其可容易地經其他類似界面活性劑(諸如具有類似HLB特徵之界面活性劑)補充或替代。
「微滴致動器(Droplet Actuator)」意謂操縱微滴之裝置。關於微滴致動器之實例，參看2005年6月28日頒予之Pamula等人之標題為「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」之美國專利6,911,132；2006年1月30日申請之Pamula等人之標題為「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」之美國專利申請案第11/343,284號；2006年12月11日申請之Pollack等人之標題為「Droplet-Based Biochemistry」之國際專利申請案第PCT/US2006/047486號；2004年8月10日頒予之Shenderov之標題為「Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same」之美國專利6,773,566，及2000年1月24日頒予之標題為「Actuators for Microfluidics Without Moving Parts」之美國專利6,565,727；2003年1月27日申請之Kim及/或Shah等人之標題為「Electrowetting-driven Micropumping」之美國專利申請案第10/343,261號、2006年1月23日申請之標題為「Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle」之美國專利申請案第11/275,668號、2006年1月23日申請之標題為「Small Object Moving on Printed Circuit Board」之美國專利申請案第11/460,188號、2009年5月14日申請之 標題為「Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics」之美國專利申請案第12/465,935號，及2009年4月30日申請之標題為「Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip」之美國專利申請案第12/513,157號；2009年6月16日頒予之Velev之標題為「Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface」之美國專利7,547,380；2007年1月16日頒予之Sterling等人之標題為「Method,Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting,for Chemical,Biochemical and Biological Assays and the Like」之美國專利7,163,612；2010年1月5日頒予之Becke及Gascoyne等人之標題為「Method and Apparatus for Programmable fluidic Processing」之美國專利第7,641,779號，及2005年12月20日頒予之標題為「Method and Apparatus for Programmable fluidic Processing」之美國專利第6,977,033號；2008年2月12日頒予之Decre等人之標題為「System for Manipulation of a Body of Fluid」之美國專利7,328,979；2006年2月23日公開之Yamakawa等人之標題為「Chemical Analysis Apparatus」之美國專利公開案第20060039823號；2008年12月31日公開之Wu之標題為「Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes」之國際專利公開案第WO/2009/003184號；2009年7月30日公開之Fouillet等人之標題為「Electrode Addressing Method」之美國專利公開案第20090192044號；2006年5月30日頒予之Fouillet等人之標題為「Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces」之美國專利7,052,244；2008年5月29日公開之Marchand等人之標題為「Droplet Microreactor」之美國專利公開案第20080124252號； 2009年12月31日公開之Adachi等人之標題為「Liquid Transfer Device」之美國專利公開案第20090321262號；2005年8月18日公開之Roux等人之標題為「Device for Controlling the Displacement of a Drop Between two or Several Solid Substrates」之美國專利公開案第20050179746號；Dhindsa等人，「Virtual Electrowetting Channels：Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality」Lab Chip,10：832-836(2010)；其全部揭示內容連同其優先權文件以引用的方式併入本文中。某些微滴致動器將包括一或多個經配置為其間具有間隙之基板，及與該一或多個基板締合(例如層疊於該一或多個基板上、附接至該一或多個基板，及/或嵌入於該一或多個基板中)且經配置以進行一或多個微滴操作之電極。舉例而言，某些微滴致動器將包括基底(或底部)基板、與基板締合之微滴操作電極、一或多個在基板及/或電極頂上之介電層，及視情況存在之一或多個在基板、介電層及/或電極頂上之形成微滴操作表面的疏水層。亦可提供頂部基板，其與微滴操作表面隔開一間隙，通常稱作微滴操作間隙。上文參考之專利及申請案中論述頂部及/或底部基板上之各種電極配置，且本發明之說明書中論述某些新穎電極配置。在微滴操作期間，微滴較佳保持與接地或參考電極連續接觸或頻繁接觸。接地或參考電極可在間隙中與朝向間隙之頂部基板、朝向間隙之底部基板締合。當兩個基板上均提供電極時，將電極耦接至控制或監測電極之微滴致動儀器的電接點可與一或兩個板締合。在一些情況下，基板上之電極電耦合至另一基板以使僅一個基板與微滴致動器接觸。在一個具體實例中，導電材料(例如環氧樹脂，諸如可獲自Master Bond公司，Hackensack,NJ之BONDTM Polymer System EP79)提供基板上之電極與其他基板上之電路徑 之間的電連接，例如頂部基板上之接地電極可由此導電材料耦合至底部基板上之電路徑。當使用多個基板時，可在基板之間提供間隔物以確定其間之間隙高度且界定分配儲集器。間隔物高度可為例如約5μm至約600μm，或約100μm至約400μm，或約200μm至約350μm，或約250μm至約300μm，或約275μm。間隔物可例如由自頂部或底部基板之突出層，及/或插入頂部基板與底部基板之間的材料形成。可在該一或多個基板中提供一或多個孔口以便形成流體路徑，通過該流體路徑液體可傳遞至微滴操作間隙中。該一或多個孔口在一些情況下可經對齊以便與一或多個電極相互作用，例如經對齊以使流經該孔口之液體將足夠接近一或多個微滴操作電極以使微滴操作可由微滴操作電極，使用該液體來實現。基底(或底部)基板與頂部基板在一些情況下可形成為一個整體組件。可在基底(或底部)基板及/或頂部基板上及/或在間隙中提供一或多個參考電極。在上文參考之專利及專利申請案中提供參考電極配置之實例。在各具體實例中，微滴致動器對微滴之操縱可為電極介導，例如電濕潤介導或介電泳介導或庫侖力(Coulombic force)介導。可用於本發明之微滴致動器的控制微滴操作之其他技術的實例包括使用誘導流體動力學流體壓力之裝置，諸如基於機械原理操作之裝置(例如外部注射泵、氣動膜泵、振動膜泵、真空裝置、離心力、壓電泵/超音波泵及聲學力)；電或磁原理(例如電滲流、電動泵、鐵磁流體塞、電流體動力學泵、使用磁力吸引或排斥及磁流體動力學泵)；熱力學原理(例如氣泡產生/相變誘導之體積膨脹)；其他種類之表面濕潤原理(例如電濕潤及光電濕潤，以及以化學、熱、結構及放射方式誘導之表面張力梯度)；重力；表面張力(例如毛細管作用)；靜電力(例如電滲流)；離心 流(安置於光碟上且旋轉之基板)；磁力(例如振盪離子引起流動)；磁流體動力學之力；及真空或壓差。在某些具體實例中，兩種或兩種以上前述技術之組合可用以在本發明之微滴致動器中進行微滴操作。類似地，一或多種前述技術可用以將液體例如自另一裝置中之儲集器或自微滴致動器之外部儲集器(例如與微滴致動器基板及自儲集器進入微滴操作間隙之流體路徑締合的儲集器)傳遞至微滴操作間隙中。本發明之某些微滴致動器之微滴操作表面可由疏水材料製得或可經塗佈或處理以使其疏水。舉例而言，在一些情況下，微滴操作表面之某些部分或所有部分可用低表面能材料或化學處理(例如藉由沈積，或使用諸如多氟化或全氟化化合物之化合物的溶液或可聚合單體就地合成)衍生。實例包括TEFLON® AF(可獲自DuPont,Wilmington,DE)、cytop家族材料之成員、FLUOROPEL®家族疏水及超疏水塗料中之塗料(可獲自Cytonix Corporation,Beltsville,MD)、矽烷塗料、氟矽烷塗料、疏水膦酸酯衍生物(例如由Aculon公司出售)，及NOVECTM電塗料(可獲自3M Company,St.Paul,MN)，及用於電漿增強化學氣相沈積(PECVD)之其他氟化單體。在一些情況下，微滴操作表面可包括厚度從約10nm至約1,000nm範圍內之疏水塗料。此外，在一些具體實例中，微滴致動器之頂部基板包括導電性有機聚合物，其接著塗以疏水塗層或以其他方式處理以使得微滴操作表面疏水。舉例而言，沈積於塑膠基板上之導電性有機聚合物可為聚(3,4-伸乙二氧基噻吩)聚(苯乙烯磺酸酯)(PEDOT：PSS)。導電性有機聚合物及替代性導電層之其他實例描述於Pollack等人之標題為「Droplet Actuator Devices and Methods」之國際專利申請案第PCT/US2010/040705號中，其全部揭示內容以引用的方式併入本文 中。一或兩個基板可使用印刷電路板(PCB)、玻璃、塗佈氧化銦錫(ITO)之玻璃或聚合物，及/或半導體材料作為基板來製造。當基板為塗佈ITO之玻璃時，ITO塗層之厚度較佳在約20nm至約200nm、較佳約50nm至約150nm，或約75至約125nm之範圍內，或為約100nm。在一些情況下，頂部及/或底部基板包括PCB基板，其塗有介電質，諸如聚醯亞胺介電質，其在一些情況下亦可經塗佈或以其他方式處理以使得微滴操作表面疏水。當基板包括PCB時，以下材料為適合材料之實例：MITSUITM BN-300(可獲自MITSUI Chemicals America公司，San Jose CA)；ARLONTM 11N(可獲自Arlon公司，Santa Ana,CA)；NELCO® N4000-6及N5000-30/32(可獲自Park Electrochemical公司，Melville,NY)；ISOLATM FR406(可獲自Isola Group,Chandler,AZ)，尤其IS620；氟聚合物家族(因為其具有低背景螢光，所以適用於螢光偵測)；聚醯亞胺家族；聚酯；聚萘二甲酸乙二酯；聚碳酸酯；聚醚醚酮；液晶聚合物；環烯烴共聚物(COC)；環烯烴聚合物(COP)；芳族聚醯胺；THERMOUNT®非編織芳族聚醯胺增強體(可獲自DuPont,Wilmington,DE)；NOMEX®牌纖維(可獲自DuPont,Wilmington,DE)；及紙。多種材料亦適用作基板之介電組分。實例包括：氣相沈積介電質，諸如PARYLENETM C(尤其在玻璃上)及PARYLENETM N(可獲自Parylene Coating Services公司，Katy,TX)；TEFLON® AF塗料；cytop；阻焊物(soldermask)，諸如液體感光阻焊物(例如在PCB上)，如TAIYOTM PSR4000系列、TAIYOTM PSR及AUS系列(可獲自Taiyo America公司Carson City,NV)(對於涉及熱控制之應用具有良好熱特徵)，及PROBIMERTM 8165(對於涉及熱控制之應用具有良好熱特徵)(可獲自Huntsman Advanced Materials Americas公司，Los Angeles,CA)；乾膜阻焊物，諸如VACREL®乾膜阻焊物系列中之乾膜阻焊物(可獲自DuPont,Wilmington,DE)；介電膜，諸如聚醯亞胺膜(例如KAPTON®聚醯亞胺膜，可獲自DuPont,Wilmington,DE)、聚乙烯，及氟聚合物(例如FEP)、聚四氟乙烯；聚酯；聚萘二甲酸乙二酯；環烯烴共聚物(COC)；環烯烴聚合物(COP)；任何上列其他PCB基板材料；黑色基質樹脂；及聚丙烯。可針對特定試驗方案中所用之試劑的效能來選擇微滴傳輸電壓及頻率。設計參數可變化，例如晶片上儲集器之數目及置放、獨立電極連接之數目、不同儲集器之尺寸(體積)、磁體/珠粒洗滌區之置放、電極尺寸、電極間之間距，及間隙高度(頂部基板與底部基板之間)可變化以用於特定試劑、方案、微滴體積等。在一些情況下，本發明之基板可用低表面能材料或化學處理(例如使用沈積或使用多氟化或全氟化化合物之溶液或可聚合單體就地合成)衍生。實例包括用於浸漬或噴灑塗佈之TEFLON® AF塗料及FLUOROPEL®塗料，及用於電漿增強化學氣相沈積(PECVD)之其他氟化單體。另外，在一些情況下，微滴操作表面之某些部分或所有部分可塗以減少背景雜訊(諸如來自PCB基板之背景螢光)之物質。舉例而言，減少雜訊之塗料可包括黑色基質樹脂，諸如可獲自Toray industries公司，Japan之黑色基質樹脂。微滴致動器之電極可由控制器或處理器控制，該控制器或處理器自身作為系統之一部分提供，其可包括處理功能以及資料及軟體儲存及輸入及輸出能力。
「微滴操作(Droplet operation)」意謂微滴致動器上微滴之任何操縱。微滴操作可例如包括：將微滴加載至微滴致動器中；分配一或多個來自源微滴之微滴；將微滴分裂、分離或分割成兩個或兩個以上微滴；在任意方 向上將微滴自一個位置傳輸至另一位置；將兩個或兩個以上微滴合併或組合成單一微滴；稀釋微滴；混合微滴；攪動微滴；使微滴變形；保持微滴在適當位置；培育微滴；加熱微滴；蒸發微滴；冷卻微滴；處置微滴；將微滴傳輸至微滴致動器外；本文所述之其他微滴操作；及/或前述操作之任何組合。術語「合併(merge/merging)」、「組合(combine/combining)」及其類似術語用以描述自兩個或兩個以上微滴產生一個微滴。應瞭解，當關於兩個或兩個以上微滴使用此術語時，可使用足以使兩個或兩個以上微滴組合成一個微滴之微滴操作的任何組合。舉例而言，「合併微滴A與微滴B」可藉由傳輸微滴A使其與固定微滴B接觸、傳輸微滴B使其與固定微滴A接觸，或傳輸微滴A與B使其彼此接觸來達成。術語「分裂」、「分離」及「分割」不意欲意味關於以下之任何特定結果：所得微滴之體積(亦即，所得微滴之體積可相同或不同)或所得微滴之數目(所得微滴之數目可為2、3、4、5或5以上)。術語「混合」係指使一或多種組分在微滴中較均勻分佈之微滴操作。「加載」微滴操作之實例包括微量透析加載、壓力輔助加載、機器人加載、被動加載，及吸移管加載。微滴操作可為電極介導。在一些情況下，微滴操作進一步受助於在表面上使用親水區及/或疏水區及/或受助於實體障礙。關於微滴操作之實例，參看上文在「微滴致動器」定義下引用之專利及專利申請案。阻抗或電容感測或成像技術有時可用以測定或確證微滴操作之結果。此等技術之實例描述於2008年8月21日公開之Sturmer等人之標題為「Capacitance Detection in a Droplet Actuator」之國際專利公開案第WO/2008/101194號中，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。一般而言，感測或成像技術可用以確證特定電極處存在或不存在微滴。 舉例而言，在微滴分配操作之後，在目的電極處存在所分配之微滴確證微滴分配操作為有效的。類似地，在試驗方案中之適當步驟，在偵測點存在微滴可確證先前之一組微滴操作已成功產生供偵測之微滴。微滴傳輸時間可相當快。舉例而言，在各具體實例中，將微滴自一個電極傳輸至下一電極可超過約1秒，或約0.1秒，或約0.01秒，或約0.001秒。在一個具體實例中，電極以AC模式操作但轉換為DC模式進行成像。類似於電濕潤區域對微滴覆蓋區域進行微滴操作為有益的；換言之，1×、2×、3×微滴分別使用1、2及3個電極在有效控制下進行操作。若微滴覆蓋區大於可用於在既定時刻進行微滴操作之電極數，則微滴尺寸與電極數之間的差異典型地應不大於1；換言之，2×微滴使用1個電極有效控制且3×微滴使用2個電極有效控制。當微滴包括珠粒時，微滴尺寸等於控制微滴(例如傳輸微滴)之電極數為適當的。
「填充流體(Filler fluid)」意謂與微滴致動器之微滴操作基板締合之流體，該流體與微滴相完全不可混溶，致使微滴相進行電極介導之微滴操作。舉例而言，微滴致動器之間隙可用填充流體填充。填充流體可例如為低黏度油，諸如聚矽氧油，或烷烴填充流體，諸如十六烷填充流體。填充流體可填充微滴致動器之整個間隙或可塗佈微滴致動器之一或多個表面。填充流體可導電或不導電。填充流體可例如摻雜有界面活性劑或其他添加劑。舉例而言，可選擇添加劑來改良微滴操作及/或減少微滴中試劑或目標物質之損失、微滴形成、微滴之間的交叉污染、微滴致動器表面污染、微滴致動器材料降解等。可針對特定試驗方案中所用之試劑的效能及與微滴致動器材料之有效相互作用或無相互作用來選擇填充流體之組成(包括摻雜之 界面活性劑)。適用於本發明之填充流體及填充流體調配物的實例提供於2010年3月11日公開之Srinivasan等人之標題為「Droplet Actuators,Modified Fluids and Methods」之國際專利公開案第WO/2010/027894號，及2009年2月12日公開之標題為「Use of Additives for Enhancing Droplet Operations」之國際專利公開案第WO/2009/021173號；2008年8月14日公開之Sista等人之標題為「Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads」之國際專利公開案第WO/2008/098236號；及2007年5月17日申請之Monroe等人之標題為「Electrowetting Devices」之美國專利公開案第20080283414號；其全部揭示內容以及本文引用之其他專利及專利申請案以引用的方式併入本文中。
關於磁反應性珠粒，「固定(Immobilize)」意謂將珠粒實質上限制於微滴致動器上微滴中或填充流體中之適當位置。舉例而言，在一個具體實例中，經固定之珠粒充分限制於微滴中之適當位置以允許進行微滴分裂操作，得到一個具有實質上所有珠粒之微滴及一個實質上缺乏珠粒之微滴。
「磁反應性(Magnetically responsive)」意謂對磁場有反應。「磁反應性珠粒」包括磁反應性材料或由磁反應性材料構成。磁反應性材料之實例包括順磁材料、亞鐵磁材料、鐵磁材料及介磁材料。適合順磁材料之實例包括鐵、鎳及鈷，以及金屬氧化物，諸如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3及CoMnP。
關於洗滌珠粒，「洗滌(Washing)」意謂自與珠粒接觸之微滴減小一或多種與珠粒接觸或暴露於珠粒之物質的量及/或濃度。物質之量及/或濃度的減小可為局部的、實質上完全或甚至完全的。該物質可為多種物質中之任 一者；實例包括供進一步分析之目標物質，及不想要之物質，諸如樣本組分、污染物及/或過量試劑。在一些具體實例中，洗滌操作以與磁反應性珠粒接觸之起始微滴開始，其中微滴包括初始量及初始濃度之物質。洗滌操作可使用各種微滴操作來進行。洗滌操作可得到包括磁反應性珠粒之微滴，其中微滴所具有之物質總量及/或濃度小於物質初始量及/或濃度。適合洗滌技術之實例描述於2008年10月21日頒予之Pamula等人之標題為「Droplet-Based Surface Modification and Washing」之美國專利7,439,014中，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
術語「頂部」、「底部」、「在......上方」、「在......下」及「在......上」在整篇說明書中關於微滴致動器之組件的相對位置(諸如微滴致動器之頂部基板及底部基板的相對位置)使用。應瞭解，微滴致動器不論其空間定向如何均具功能性。
當任何形式之液體(例如微滴或連續體，無論移動或固定)經描述為「在電極、陣列、基質或表面上」、「在電極、陣列、基質或表面處」或「在電極、陣列、基質或表面上方」時，此液體可與電極/陣列/基質/表面直接接觸，或可與插於液體與電極/陣列/基質/表面之間的一或多個層或膜接觸。
當微滴經描述為「於微滴致動器上」或「加載於微滴致動器上」時，應瞭解該微滴以有助於使用微滴致動器對微滴進行一或多個微滴操作之方式配置於微滴致動器上、微滴以有助於感測微滴特性或來自微滴之信號的方式配置於微滴致動器上，及/或微滴已於微滴致動器上進行微滴操作。
圖1 100‧‧‧酵素試驗方案的流程圖
圖2 200‧‧‧圖
圖3 300‧‧‧圖
圖4A 400‧‧‧圖
圖4B 550‧‧‧圖
圖5 500‧‧‧圖
圖6A 600‧‧‧圖
圖6B 650‧‧‧圖
圖7 700‧‧‧圖
圖8 800‧‧‧微滴致動器
810‧‧‧樣本分配儲集器
812‧‧‧試劑分配儲集器
814‧‧‧受質流體分配儲集器
816‧‧‧廢料收集儲集器
圖9 900‧‧‧圖
圖10 1000‧‧‧圖
圖11 1100‧‧‧微滴致動器
1110‧‧‧樣本分配儲集器
1112‧‧‧試劑分配儲集器
1114‧‧‧洗滌緩衝液分配儲集器
1116a-116b‧‧‧廢料收集儲集器
1118‧‧‧受質流體分配儲集器
1120‧‧‧微滴操作電極
1122‧‧‧酵素試驗區
1124‧‧‧免疫試驗區
1126‧‧‧偵測區
圖12 1200‧‧‧偵測系統
1210‧‧‧成像裝置
1212‧‧‧偵測器
1214a-1214c‧‧‧發光二極體
1216a-1216c‧‧‧光偵測器
1218‧‧‧微滴致動器
1220‧‧‧底部基板
1222‧‧‧頂部基板
1224‧‧‧間隙
1226‧‧‧密封墊
1228‧‧‧微滴操作電極
1230‧‧‧微滴
1232a-1232c‧‧‧微滴
圖13 1300‧‧‧試驗台上試驗方案示圖
圖14A 1400‧‧‧圖
圖14B 1450‧‧‧圖
圖15 1500‧‧‧圖
圖16A-16G 1600‧‧‧實例實驗的螢幕截圖
圖17A 1700‧‧‧數據表
圖17B 1750‧‧‧數據表
V1-V4‧‧‧值
圖18A 1800‧‧‧數據表
圖18B 1850‧‧‧數據表
V1-V3‧‧‧值
圖19 1900‧‧‧數據表
圖20A 2000‧‧‧條形圖
圖20B 2050‧‧‧條形圖
圖21A 2100‧‧‧條形圖
圖21B 2150‧‧‧條形圖
圖22A 2200‧‧‧條形圖
圖22B 2250‧‧‧條形圖
圖23A 2300‧‧‧條形圖
圖23B 2350‧‧‧條形圖
圖24 2400‧‧‧電極配置實例之俯視圖
2410‧‧‧樣本分配儲集器電極
2412a-2412h‧‧‧試劑分配儲集器電極
2414‧‧‧微滴操作電極
2416‧‧‧反應區
2418‧‧‧偵測點
圖25 2500‧‧‧圖
圖26 2600‧‧‧條形圖
圖27 2700‧‧‧條形圖
圖28A 2800‧‧‧圖
圖28B 2850‧‧‧圖
圖29 2900‧‧‧圖
圖30 3000‧‧‧圖
圖31 3100‧‧‧實例方案流程圖
圖32 3200‧‧‧電極配置實例之俯視圖
3210a-3210l‧‧‧樣本分配儲集器電極
3212a-3212l‧‧‧試劑分配儲集器電極
3214‧‧‧洗滌緩衝液分配儲集器
3216‧‧‧受質分配儲集器
3218‧‧‧廢料收集點
3220‧‧‧微滴操作電極
3222‧‧‧專用電極泳道
3224‧‧‧磁體
3226a-3226l‧‧‧偵測電極
圖33 3300‧‧‧微滴致動器部分之俯視圖
3310‧‧‧底部基板
3312‧‧‧微滴操作電極
3314‧‧‧偵測電極
3316‧‧‧金屬穿孔
圖34 3400‧‧‧偵測系統實例之透視圖
3410‧‧‧激發LED
3412‧‧‧偵測器
3414‧‧‧儀器組
3416‧‧‧微滴致動器
圖1顯示亨特症候群之酵素試驗方案的流程圖； 圖2顯示血漿稀釋對經修改之亨特試驗的影響之圖；圖3顯示重組艾杜糖醛酸酶對經修改之亨特試驗的濃度依賴性之圖；圖4A及4B顯示使用圖2之經修改之亨特試驗針對MSPII篩選之受影響及正常血漿樣本的圖；圖5顯示在BSA存在下重組艾杜糖醛酸酶活性之標準曲線之圖；圖6A及6B顯示使用重組艾杜糖醛酸酶與BSA一起調配之亨特試驗的圖；圖7顯示萃取體積對使用DBS萃取物之亨特試驗的影響之圖；圖8說明適用於在新生兒測試方案中進行多工酵素試驗之微滴致動器之實例的俯視圖；圖9顯示使用來自單一DBS孔樣之萃取物對龐貝及法布裏病進行多工測試之圖的實例；圖10顯示促甲狀腺素(TSH)之標準曲線之圖的實例；圖11說明適用於進行整合式酵素試驗及免疫試驗新生兒測試方案之微滴致動器之實例的俯視圖；圖12說明於單一微滴致動器上對多個微滴同時偵測螢光與吸光度之偵測系統之實例的側視圖；圖13顯示評估β-環糊精對4-MU分配之影響的試驗方案之圖；圖14A及14B顯示自由4-MU濃度隨β-環糊精：4-MU莫耳比而變之圖；圖15顯示預期BE信號(反向萃取)隨FE(正向萃取)中平衡時自由4-MU濃度而變之圖；圖16A至16G顯示經設計以評估環糊精、pH值及離子強度對4-MU水 性圍阻之影響的實驗之實例的螢幕截圖；圖17A及17B顯示表5及表6之4-MU分配試驗分別的正向轉移及反向轉移之螢光讀數的數據表；圖18A及18B顯示4-MU分配試驗之另一實例的數據表；圖19顯示用以評估水相界面活性劑對4-MU圍阻之影響的4-MU分配試驗之反向轉移分配(反向萃取；BE)之相對螢光讀數的數據表；圖20A及20B顯示羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精分別對法布裏試驗中受質水解之影響的條形圖；圖21A及21B顯示羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精分別對高雪試驗中受質水解之影響的條形圖；圖22A及22B顯示較低濃度之羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精分別對法布裏試驗中受質水解之影響的條形圖；圖23A及23B顯示較低濃度之羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精分別對高雪試驗中受質水解之影響的條形圖；圖24說明經組態以進行多工龐貝、法布裏及亨特試驗之微滴致動器之電極配置的實例之俯視圖；圖25顯示使用來自DBS樣本之萃取物在數位微流體平台上進行之亨特試驗中IDS活性之圖；圖26顯示亨特症候群之單步試驗台上試驗之螢光數據的條形圖；圖27顯示亨特症候群之單步試驗之螢光數據的另一實例之條形圖；圖28A及28B分別顯示晶片上獲得之膽紅素校準曲線圖及值散佈圖；圖29顯示晶片上進行之G6PD試驗之圖； 圖30顯示晶片上產生之TSH校準曲線圖；圖31說明在微滴致動器上總膽紅素、G6PD及TSH之多工新生兒測試方案之實例的流程圖；圖32顯示經組態用於在微滴致動器上進行多工總膽紅素、G6PD及TSH試驗之微滴致動器的電極配置之實例的俯視圖；圖33說明微滴致動器之一部分的俯視圖，該微滴致動器包括適用於偵測比色反應產物之光學透明偵測電極；及圖34說明偵測比色反應產物之偵測系統的實例之透視圖。
本發明提供諸如針對代謝失調測試樣本之酵素活性的微滴致動器裝置及試驗法。測試包括(但不限於)篩選、監測及診斷。該等方法尤其包括用於測試代謝失調的基於微滴之酵素試驗及免疫試驗。本發明包括於單一微滴致動器上對不同代謝失調進行多次試驗，以及於單一微滴致動器上使用來自不同個體之樣本及/或來自同一個體之多個樣本對同一代謝失調進行多次試驗的方法及裝置。在各具體實例中，本發明包括在單一新鮮血液及/或血漿樣本及乾燥血液及/或血漿樣本中進行酵素活性試驗及/或免疫試驗之方法。可測試其他流體，諸如生物樣本，諸如全血、淋巴液、血清、電漿、汗液、淚液、唾液、痰、腦脊髓液、羊膜液、精液、陰道排泄物、漿液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、滲出液、溢出液、膀胱液、膽汁、尿液、胃液、腸液、糞便樣本、含有單個或多個細胞之液體、含有細胞器之液體、流化組織、流化生物體、含有多細胞生物體之液體、生物拭樣及生物洗滌物。
本發明提供於微滴致動器上偵測一或多種(亦即多工偵測)溶酶體儲積病(LSD)之試驗法。在一個具體實例中，本發明提供於微滴致動器上偵測MSP II(亨特症候群)之試驗法。該等方法尤其包括艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶(IDS)酵素活性的基於微滴之酵素試驗。在某些具體實例中，亨特試驗可在室溫下或在諸如37℃之替代溫度下進行。在其他具體實例中，亨特試驗可進行8小時或8小時以下。亨特試驗為單步勻相試驗，其在單一pH值(亦即pH 5.0)下進行，產生結果所需之時間為8小時或8小時以下。
在一個具體實例中，本發明提供於微滴致動器上偵測一或多種與特定酵素量或活性不足相關之疾病(諸如亨特、高雪及尼曼-匹克病、龐貝及法布裏病，及莫基奧B症候群)的試驗法。
在又一具體實例中，本發明提供一種整合式微滴致動器裝置及方法，其用於於單一微滴致動器上使用單一乾血點(DBS)樣本進行多工酵素試驗及免疫試驗。在一個實例中，本發明之整合式微滴致動器裝置及方法可用於多工偵測先天性腎上腺增生(CAH)、先天性甲狀腺功能低下(CH)、囊腫性纖維化(CF)、半乳糖血症及生物素酵素缺乏症(BIOT)。
使用數位微流體技術，可使用微滴高速傳輸、可靠分配、快速混合、稀釋及處置以提供快速樣本-至-結果測試來操縱亞微升尺寸化微滴。因為樣本測試方案中實質上所有步驟均在晶片上(自動)進行，所以操作員出錯之風險大大降低。微流體平台、其他試驗方案(亦即，用於其他病症)之靈活性、可程式性及模組格式可容易地添加至晶片上測試群組中。
本發明之微滴致動器裝置及方法藉由多工測試不適於MS/MS之代謝失 調來作為對串聯質譜分析(MS/MS)測試的補充。
在又一具體實例中，本發明提供用於酵素偵測亨特症候群及法布裏病之基於試驗台之方法。
在又一具體實例中，本發明提供一種數位微流體平台及方法，其用於多工測試高膽紅素血症、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)缺乏症及先天性甲狀腺功能低下(CH)。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之具較強水溶性的繖酮基受質。
在又一具體實例中，酵素受質(諸如含4-MU之受質)可藉由形成包合複合物(使用環糊精達成對4-MU之水性圍阻所形成)固定於水相(例如水性微滴)中。
7.1 亨特症候群之酵素試驗
本發明提供兩步酵素試驗。該試驗可以標準實驗室配置進行。在一個具體實例中，其可具有約24小時迴轉時間。在另一具體實例中，其可具有小於12小時或約12小時之迴轉時間。在又一具體實例中，其可具有小於6小時或約6小時之迴轉時間。自個體獲得血液樣本且點樣於諸如濾紙之固體介質上，乾燥且送至中心實驗室。因為血液樣本經點樣於固體介質上且經乾燥，所以在分析之前必須使其復原，即需要將樣本稀釋至適合液體介質中之步驟。需要提供可用於新鮮及/或乾燥血液樣本(亦即全血樣本、血漿樣本)之快速單步方案之改良亨特試驗。亨特症候群由酵素艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶(IDS)減少(或不存在)引起。圖1顯示亨特症候群之酵素試驗方案100的流程圖。該試驗可使用基於微量滴定盤之試驗及微 量滴定盤讀取器(例如Biotek KC4盤讀取器)進行。亨特症候群之試驗使用4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯(MU-α IdoA-2S)作為受質。該試驗為兩種酵素兩步試驗，其中IDS首先對MU-α IdoA-2S受質流體起作用以水解硫酸酯，得到4-MU-IdoA中間物(反應1)。第二酵素α-L-艾杜糖醛酸酶對無硫酸酯之中間物(4-MU-IdoA)起作用以釋放4-甲基繖酮(4-MU)，產生螢光信號(反應2)。在不存在活性IDS下，不形成4-MU-IdoA中間物且不產生螢光信號。反應1及2在不同pH值，分別在pH 5.0及pH 3.5下進行。
α-L-艾杜糖醛酸酶(或任何活性艾杜糖醛酸酶)可例如自牛睾丸或兔肝部分純化且可將顯著濃度之污染性硫酸酯酶引入反應中。為使L-艾杜糖醛酸酶萃取物中之污染性硫酸酯酶失活，在第二酵素反應之前將大量磷酸鹽/檸檬酸緩衝液(麥基爾文緩衝液(McIlvain's buffer))添加至反應中。經純化或合成產生之具有類似活性之α-L-艾杜糖醛酸酶或類似物或衍生物可用作經純化α-L-艾杜糖醛酸酶之替代物。
在一個實例中，試驗方案包括以下步驟：1.在37℃下將稀釋5倍之血漿樣本(10μL)與20μL 1.25mM MU-α IdoA-2S(0.1M乙酸鈉、0.1M乙酸緩衝液(pH 5.0)(含有10mM乙酸鉛))一起培育4小時(反應1)；2.向所有樣本(包括受質空白樣本)中均添加20μL麥基爾文磷酸鹽/檸檬酸緩衝液(Pi/Ci緩衝液)且混合(將Pi/Ci緩衝液添加至所有樣本中以淬滅樣本中及所添加LEBT溶液中所有硫酸酯酶之活性(步驟3))；3.將10μL LEBT溶液(pH 3.5)(部分純化之牛睾丸溶酶體萃取物)添 加至血漿樣本中且混合；4.在37℃下培育24小時(反應2)；及將200μL終止緩衝液(碳酸鈉(pH 10.1)、0.01% Tween® 20溶液，可獲自Promega公司，Madison,WI)添加至所有樣本中且讀取4-MU之螢光。
4MU流體受質可用4-三氟甲基繖酮基受質替換或補充。舉例而言，4-三氟甲基繖酮基醣苷可用作LSD水解酶(硫酸酯酶等)試驗之受質。當與4-甲基繖酮相比時，4-三氟甲基繖酮脫離基顯示較強信號且該信號發生較大程度的紅移。
7.2 微滴致動器上對亨特症候群之酵素試驗
在另一具體實例中，本發明提供一種亨特症候群之基於微滴致動器之試驗。該試驗可為使用經純化重組艾杜糖醛酸酶之勻相試驗。因為使用經純化之重組艾杜糖醛酸酶，所以不存在來源於自牛睾丸部分純化之溶酶體艾杜糖醛酸酶(亦即LEBT溶液)的污染性硫酸酯酶且不需要添加麥基爾文磷酸鹽/檸檬酸緩衝液(Pi/Ci緩衝液)。針對pH值、樣本濃度及艾杜糖醛酸酶酵素活性調整亨特試驗。同時將受質MU-α IdoA-2S與重組艾杜糖醛酸酶添加至稀釋血漿樣本中且在例如25℃(室溫)下一起培育歷時整個反應。基於微滴致動器之亨特試驗為勻相單步試驗，其在無需受質pH值變化之情況下進行。
適用於進行酵素試驗之樣本微滴及試劑微滴可根據適當試驗方案，使用微滴致動器上之微滴操作來分配及/或組合。亦可於微滴致動器上進行試驗微滴之培育，需要時包括溫度調節。此外，可在微滴致動器上存在微滴時進行來自試驗微滴之信號的偵測，諸如螢光偵測。此外，此等方法各自 可在微滴由微滴致動器上之填充流體部分或完全包圍時進行。
在一些具體實例中，某些試驗步驟可在微滴致動器外進行且某些試驗步驟可於微滴致動器上進行。舉例而言，在一些具體實例中，樣本及試劑可在微滴致動器外製備且於微滴致動器上組合、培育及偵測。
7.2.1 血漿稀釋之影響
固有地存在於血漿樣本中之陰離子(諸如氯離子、硫酸根及磷酸根)為硫酸酯酶(例如艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶(IDS))活性之抑制劑。舉例而言，在30mM氯離子下，IDS活性經抑制50%且在250mM氯離子下IDS活性經完全抑制。血漿樣本可具有150mM之氯離子濃度，該濃度可減小亨特試驗中之信號輸出。血漿樣本中存在之氯離子之量可例如藉由以適合液體(諸如水)稀釋樣本來減少。血漿樣本中存在之陰離子(例如氯離子、硫酸根及磷酸根)亦可藉由用乙酸鉛(乙酸Pb)沈澱來減少。
圖2顯示血漿稀釋對經修改之亨特試驗的影響之圖200；在試驗台上製備試劑溶液，且使用數位微流體方案於微滴致動器上進行實驗。使用分子級水製備來自正常(n=1)及受影響(n=1)個體之血漿樣本的不同稀釋液(1/10倍、1/4倍、1/3倍、1/2倍及1倍)。使用含1μg/mL重組艾杜糖醛酸酶之0.05M乙酸鈉/0.05M乙酸緩衝液(pH 5.0)製備空白樣本。自0.5mg/mL艾杜糖醛酸酶之儲備液(提供於含有150mM NaCl、0.02% Brij-35(w/v)之0.05M乙酸鈉(pH 3.5)中)製備10μg/mL重組艾杜糖醛酸酶於0.05M乙酸鈉/0.05M乙酸緩衝液(pH 5.0)中的工作儲備液。在0.1M乙酸鈉、0.1M乙酸緩衝液(pH 5.0)(含有10mM乙酸鉛)中製備1.25mM MU-α IdoA-S受質流體之工作儲備液。藉由混合1μL 10μg/mL重組艾杜糖醛酸酶與9 μL 1.25mM MU-α IdoA-S來製備受質流體。
在一個實例中，測試血漿樣本稀釋液之數位微流體方案包括以下步驟：1.將受質流體之11個1×微滴自試劑儲集器分配至微滴致動器之11條反應泳道上；2.自各別樣本儲集器分配血漿樣本之1×微滴；3.合併血漿樣本微滴與受質流體微滴，得到2×反應微滴；4.將各2×反應微滴分裂成兩個1×反應微滴；5.分配終止緩衝液(碳酸鈉(pH 10.1)、0.01% Tween® 20)之11個微滴且使用微滴操作將其與第一組1×反應微滴合併；6.在364nm下偵測螢光(t=0小時)；7.在室溫下培育第二組1×反應微滴歷時8小時；8.8小時後，分配終止緩衝液之11個微滴且將其與第二組1×反應微滴組合；及9.在364nm下偵測螢光(t=8小時)。
參考圖2，在1：4之稀釋度下觀察到正常血漿樣本與受影響血漿樣本之間的最大螢光信號分離。因為一個血漿樣本微滴與一個受質流體微滴混合，所以血漿樣本之最終有效稀釋度為1：8。在此稀釋度下之氯離子濃度對艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶活性的影響極小。
在各具體實例中，血漿血液樣本以約1：2至約1：15血漿：緩衝液，或約1：2、1：3、1：4、1：5、1：6或1：7中之任一者至約1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14或1：15血漿：緩衝液中之任一者稀釋。在其他具體實例中，血漿血液樣本稀釋至至少1：2血漿：緩衝液、至少1：3血漿：緩衝液、至少1：4血漿： 緩衝液、至少1：5血漿：緩衝液、至少1：6血漿：緩衝液、至少1：7血漿：緩衝液、至少1：8血漿：緩衝液。
7.2.2 重組艾杜糖醛酸酶之濃度
圖3顯示重組艾杜糖醛酸酶對經修改之亨特試驗的濃度依賴性之圖300。在經修改之亨特試驗中使用兩種濃度之重組艾杜糖醛酸酶(亦即1μg/mL及10μg/mL)分析八個不同正常血漿樣本。亨特試驗之活性顯示對使用重組艾杜糖醛酸酶之量的顯著濃度依賴性(亦即在10μg/mL下活性較高)。在圖300中，粗實線表示所有讀數之平均值。在圖300中，誤差杠表示讀數間標準差。因為在經修改之亨特試驗中對所用重組艾杜糖醛酸酶之量的濃度依賴性，所以可使用甚至更高濃度(>10μg/mL)之重組艾杜糖醛酸酶。
7.2.3 載體蛋白對重組艾杜糖醛酸酶活性之影響
在微滴致動器外(亦即在試驗台上)製備試劑溶液且於微滴致動器上使用諸如圖2之方案的數位微流體方案進行實驗。
圖4A及4B顯示使用圖2之經修改之亨特試驗，針對MSPII篩選之受影響及正常血漿樣本的圖400及450。受影響(n=10)及正常(n=10)血漿樣本以1：4稀釋且在分開的兩日於同一微滴致動器上加以分析。在第1日分析受影響與正常樣本之樣本1至5。在第2日分析受影響與正常樣本之樣本6至10。圖4A之圖400顯示所有10個受影響樣本及10個正常樣本之分佈(亦即第1日及第2日)。圖4B之圖450顯示樣本在第1日(1-5受影響、1-5正常)及第2日(6-10受影響、6-10正常)之分佈。參考圖4B之圖450，在第1日與第2日之間，正常樣本之信號減小。在第2日，正常血漿樣本 之信號減小可能由於艾杜糖醛酸酶活性隨時間損失。粗實線表示所有讀數之平均值。誤差杠表示讀數間之標準差。
重組艾杜糖醛酸酶活性之穩定性可藉由將諸如牛血清白蛋白(BSA)之載體蛋白併入受質流體中得到充分提高。
圖5顯示在BSA存在下重組艾杜糖醛酸酶活性之標準曲線的圖500。 自含有1mg/mL分子生物級牛血清白蛋白(BSA)之0.5mg/mL重組艾杜糖醛酸酶的儲備液，在0.05M乙酸鈉/0.05M乙酸緩衝液(pH 5.0)中製備重組艾杜糖醛酸酶之連續稀釋液。在含有1mM 4-甲基繖酮基-α-L-艾杜哌喃艾杜糖醛酸(4-MUI)及100μM D-醣二酸1,4-內酯之0.05M乙酸鈉(pH 5.0)中製備受質流體。
艾杜糖醛酸酶標準曲線之數位微流體方案包括以下步驟：1.混合艾杜糖苷酸酶之一個1×微滴與受質流體之一個1×微滴，得到2×反應微滴；2.將該2×反應微滴分裂成兩個1×反應微滴；3.分配終止緩衝液(碳酸鈉(pH 10.1)、0.01% Tween® 20)之11個微滴且將其與第一組1×反應微滴組合；4.在365nm下偵測終點螢光(t=0)；5.在室溫下培育第二組1×反應微滴歷時1小時；6.培育1小時後，分配終止緩衝液之11個微滴且與反應微滴組合；及7.在365nm下偵測終點螢光(t=1小時)。
表1顯示添加終止緩衝液後培育t=1小時之艾杜糖醛酸酶標準曲線的相對螢光。
圖6A及6B分別顯示使用重組艾杜糖醛酸酶與BSA一起調配之亨特試驗的圖600及650。使用分子級水以1：4稀釋來自正常(n=9；樣本2-10)及受影響(n=9；樣本2-10)個體之血漿樣本。使用含1μg/mL重組艾杜糖醛酸酶之0.05M乙酸鈉/0.05M乙酸緩衝液(pH 5.0)製備空白樣本。自0.5mg/mL艾杜糖醛酸酶之儲備液(提供於含150mM NaCl、0.02% Brij-33(w/v)之0.05M乙酸鈉(pH 3.5)中)製備10μg/mL重組艾杜糖醛酸酶於0.05M乙酸鈉/0.05M乙酸緩衝液(pH 5.0)(含有1mg/mL分子級BSA)中之工作儲備液。在含有10mM乙酸鉛之0.1M乙酸鈉、0.1M乙酸緩衝液(pH 5.0)中提供1.25mM MU-IdoA-S受質流體之儲備液。藉由混合1μL 10μg/mL重組艾杜糖醛酸酶與9μL 1.25mM MU-α IdoA-S來製備受質流體。微滴中反應混合物中之重組艾杜糖醛酸酶及MU-α IdoA-S之最終濃度分別為0.5μg/mL及0.5625mM。
在不同的兩日分析血漿樣本(2-10號正常及2-10號亨特)。參考圖6A之圖600，在第1日，在第一微滴致動器及儀器上分析正常及亨特患者樣本之第一等分試樣。參考圖6B之圖650，在第2日，在第二微滴致動器及儀器上分析正常及亨特患者樣本之第二等分試樣。第1日及第2日之試驗由 不同操作員進行。
測試血漿樣本之數位微流體方案包括以下步驟：1.將受質流體之11個1×微滴自試劑儲集器分配至微滴致動器之11條反應泳道上；2.自各別樣本儲集器分配血漿樣本之1×微滴；3.合併血漿樣本微滴與受質流體微滴，得到2×反應微滴；4.將2×反應微滴分裂成兩個1×反應微滴；5.分配終止緩衝液(0.1M碳酸氫鈉(pH 10.1)、0.01% Tween® 20)之11個微滴且使用微滴操作將其與第一組1×反應微滴合併；6.在365nm下偵測螢光(t=0小時)；7.在室溫下培育第二組1×反應微滴歷時8小時；8.8小時後，分配終止緩衝液之11個微滴且將其與1×反應微滴組合；及9.在365nm下偵測螢光(t=8小時)。
再次參考圖6A之圖600及圖6B之圖650，在t=8小時之培育時間時，亨特患者之血漿樣本與正常血漿樣本之間存在顯著螢光信號分離。在試驗方案中，在第1日及第2日分析之正常樣本的螢光信號一致表明穩定性。在圖600及650中，粗實線表示所有讀數之平均值。在圖600及650中，誤差杠表示讀數間標準差。亨特影響之樣本的所有數據點均相互重疊。
因為亨特患者之血漿樣本與正常血漿樣本之間存在約20-100倍螢光信號分離，所以經修飾之亨特試驗的產生結果所需之時間及產量可能進一步顯著增加。在一個具體實例中，試驗之總培育時間可顯著減少至小於約12、 8、6、4或2小時。在另一具體實例中，亨特試驗之產生結果所需的時間可藉由在37℃下進行反應而縮短。
7.3 對DBS及DPS之亨特試驗
亨特試驗可在中心實驗室對乾血點(DBS)樣本進行。為了評估對乾燥樣本之基於微滴致動器之亨特試驗的功效，將血漿樣本、新鮮血液及來自新鮮血液之血漿點樣於1/8〃直徑濾紙上且風乾。
將冷凍血漿樣本(n=10受影響及n=10正常)解凍且將1.4μL樣本點樣於濾紙上且風乾約3小時。將各DBS置於各別離心管中且儲存在-20℃下。
將新鮮全血收集於肝素鋰管中。將全血(3.1μL)點樣於濾紙上且風乾約3小時。藉由離心自血液樣本製備血漿且將其點樣於濾紙上且風乾約3小時。將各DBS及DPS置於各別離心管中。
使用含有萃取緩衝液之水自濾紙萃取樣本，該萃取緩衝液可包括界面活性劑，諸如0.1% Tween® 20。在含有0.1% Tween® 20之40μL及100μL水中萃取來自冷凍血漿樣本(n=10受影響及n=10正常)之乾血漿點及獲自新鮮血液樣本之血漿。在含有0.1% Tween® 20之100μL及150μL水中萃取自新鮮血液製備之DBS。所有樣本均在攪動下培育30分鐘。離心該等管以使濾紙沈積於管底且將樣本萃取物轉移至微滴致動器上之樣本儲集器中。針對MPS II(亨特症候群)試驗所有萃取物，以及獲自全血之新鮮血漿。測試DBS及DPS樣本之數位微流體方案如參考圖6A及6B所描述。數據顯示於表2中。
表2之數據明確顯示亨特患者DPS與正常DPS之間存在分離。使用100μL萃取體積，自新鮮全血製備之DPS及DBS的萃取物得到類似螢光值。對自全血製備且使用水以1：4稀釋之新鮮血漿的試驗用作陽性對照。獲自新鮮血漿之螢光信號在如獲自圖6A及6B中血漿樣本之螢光信號的範圍內。
7.3.1 溫度對亨特試驗之影響
為檢查溫度對亨特試驗之影響，試驗(參考圖6A及6B之方案)在37℃下用8小時之培育時間來進行。如參考圖6A及6B所述，以1：4稀釋血漿樣本。如參考表2所述，在含有0.1% Tween® 20之150μL水中萃取歸檔DBS樣本。數據顯示於表3中。在亨特影響血漿樣本與正常血漿樣本之間觀察到明確的螢光信號分離。來自歸檔DBS之螢光信號與亨特影響樣本相比亦增加，且與來自新鮮DBS之信號相當。
7.3.2 萃取體積對使用乾血點萃取物之亨特試驗的影響
為了檢查萃取體積對亨特試驗之影響，在含有0.1% Tween® 20之50μL、100μL或150μL水中萃取歸檔正常DBS(1264N、1265N)及新鮮正常DBS。於微滴致動器上使用諸如圖6A及6B之方案的數位微流體方案分析樣本。
圖7顯示萃取體積對使用DBS萃取物之亨特試驗的影響之圖700。數據顯示於表4中。數據顯示當萃取體積減小(亦即自150μL減小至50μL)時，樣本之相對螢光信號增加。信號強度增加可能由於在較低萃取體積下，樣本中艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶(IDS)之濃度增加。在一較佳具體實例中，可使用約100μL之萃取體積來製備DBS萃取物。
7.4 高雪及尼曼-匹克病之酵素試驗
本發明提供於微滴致動器上偵測高雪及尼曼-匹克病之試驗法。高雪氏病及尼曼-匹克病分別由溶酶體酵素酸性β-D-葡糖苷酶及酸性神經髓磷脂酶活性不足引起。在一個具體實例中，本發明提供酸性β-D-葡糖苷酶活性之基於微滴之酵素試驗的方法。舉例而言，多氟乙基繖酮基-β-D-糖苷(諸如4-五氟乙基繖酮基-β-D-糖苷)可用作酸性β-D-葡糖苷酶酵素活性的基於微滴之酵素試驗中之受質流體。氟數目增加使得受質流體較容易發生水解。4-五氟乙基繖酮基-β-D-糖苷之激發/發射波長為385/495nm。當在微滴致動器中測試高雪氏病時，當使用4-五氟乙基繖酮基-B-D-糖苷受質流體時之酶活性可例如高達使用4-甲基繖酮基-β-D-糖苷受質流體時的八倍。
4MU流體受質可用4-三氟甲基繖酮基受質替換或補充。舉例而言，4-三氟甲基繖酮基醣苷可用作LSD水解酶(醣苷酶等)試驗之受質。當與4-甲基繖酮相比時，4-三氟甲基繖酮脫離基顯示較強信號且該信號發生較大程度的紅移。另外，4-三氟甲基繖酮基醣苷可能比4-甲基繖酮基醣苷更易裂解，從而產生更大信號。
在另一具體實例中，本發明提供殼三糖苷酶活性之基於微滴之酵素試驗的方法。在患有某些病狀(諸如高雪氏病)之患者的血漿中，殼三糖苷酶顯著增加。在一個實例中，殼三糖苷酶活性可用作殼三糖苷酶活性改變之病狀(諸如高雪氏病)的代用血漿標誌物。在另一實例中，殼三糖苷酶活性可用作尼曼-匹克病之代用血漿標誌物。酵素試驗中殼三糖苷酶之受質流體可例如為螢光受質4-三氟甲基繖酮基殼三糖苷(chitroside)。酵素試驗 之樣本可例如為血漿微滴或乾燥血液萃取物微滴。因為在患有高雪及尼曼-匹克病之患者的血漿中殼三糖苷酶增加，所以患者之血漿樣本與正常血漿樣本之間可能存在顯著螢光信號分離。使用殼三糖苷酶亦可減少需要在對溶酶體儲積病之測試群組中進行之測試的數目。
殼三糖苷酶活性之測試試驗的實例可涉及(但不限於)以下：使用微滴操作將樣本微滴(例如乾燥血液萃取物微滴)與受質微滴(例如螢光受質4-三氟甲基繖酮基殼三糖苷)微滴組合以形成2×微滴。使用微滴操作分裂2×微滴以形成兩個1×反應微滴。使用微滴操作將一個1×反應微滴與終止緩衝液微滴組合。量測組合之微滴的螢光(t-0小時)。將第二1×反應微滴培育預定時間，接著使反應微滴與終止緩衝液微滴組合。量測終點螢光(t-END小時)。在此實例中，分配並分析單個樣本微滴。然而，可分配並分析任何數目之樣本微滴。
在另一具體實例中，殼三糖苷酶活性的基於微滴之酵素試驗可與用於溶酶體儲積病之測試群組的一組測試中之其他基於微滴的酵素試驗組合。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之繖酮基受質。
7.5 莫基奧B症候群之酵素試驗
本發明提供於微滴致動器上偵測溶酶體儲存病症莫基奧B症候群(IV型黏多醣病)之試驗法。莫基奧B症候群由溶酶體酵素β-半乳糖苷酶活性不足引起。酵素試驗中β-半乳糖苷酶之受質流體可例如為螢光受質4-甲基繖酮基-β-半乳糖(4-MU-β-半乳糖；360nm激發、460nm發射)。酵素試驗之樣本可例如為血漿微滴或乾燥血液萃取物微滴。因為在患有莫基奧B症候群之患者體內β-半乳糖苷酶不足，所以在患者之血液樣本與正常血液 樣本之間可能存在顯著螢光信號分離。血液樣本中可能存在之第二酵素β-半乳糖腦苷酶亦可裂解4-MU-β-半乳糖受質。然而，β-半乳糖腦苷酶含量顯著低於(例如約1/200)β-半乳糖苷酶含量。
血液樣本中之β-半乳糖苷酶活性之試驗台上試驗可調整並描述為個別基於微滴之方案。β-半乳糖苷酶活性之試驗台上試驗的一個實例包括以下步驟：
1.在緩衝液(0.1M檸檬酸鹽/0.2M磷酸鹽(pH 4.6))中10倍稀釋受質(4-MU-β-半乳糖)之250mM儲備液；
2.將4μL稀釋10倍之受質添加至196μL緩衝液(0.1M檸檬酸鹽/0.2M磷酸鹽(pH 4.6))中；製備於DMSO中之25mM儲備液。最終濃度：0.5mM。
3.將10μL受質添加至10μL乾燥血液萃取物中且在37℃下培育21小時；及
4.在50之增益下在360/460nm下量測螢光。
β-半乳糖苷酶活性之數位微流體測試試驗的實例可包括(但不限於)以下：使用微滴操作將樣本微滴(例如乾燥血液萃取物微滴)與莫基奧B試劑(例如4-MU-B-半乳糖)微滴組合並混合以形成2×反應微滴。使用微滴操作分裂2×反應微滴以形成兩個1×反應微滴。使用微滴操作將一個1×反應微滴與終止緩衝液微滴組合。量測組合微滴的螢光(t-0小時)。在特定溫度(例如37℃)下培育第二1×反應微滴歷時預定時間，接著使反應微滴與終止緩衝液微滴組合。量測終點螢光(t-END小時)。在此實例中，分配並分析單個樣本微滴。然而，可分配並分析任何數目之樣本微滴。由t-0小 時與t-END小時之差計算B-半乳糖苷酶活性。
在另一具體實例中，β-半乳糖苷酶活性的基於微滴之酵素試驗可與用於溶酶體儲積病之測試群組的一組測試中之其他基於微滴的酵素試驗組合。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之繖酮基受質。
7.6 於微滴致動器上之多工酵素試驗
圖8說明適用於在新生兒測試方案中進行多工酵素試驗之微滴致動器800之實例的俯視圖。微滴致動器800包括多個分配儲集器，其可例如分派作為用於分配樣本流體(例如乾血點萃取物)之樣本分配儲集器810(例如48個樣本分配儲集器810)；一或多個用於分配不同試劑流體之試劑分配儲集器812；一或多個用於分配受質流體之受質流體分配儲集器814；及一或多個用於接收廢料微滴之廢料收集儲集器816。微滴致動器800經組態以對各樣本進行5重(5-plex)酵素試驗，亦即對48個樣本各進行5個酵素試驗，總共240個試驗。
本文所述之任一酵素試驗方案均可經調整以適於在微滴致動器上使用，例如用於測試新生兒之酵素病症。在一個實例中，龐貝及法布裏病之酵素試驗可經調整並在微滴致動器上進行。圖9顯示使用來自單一DBS孔樣之萃取物對龐貝及法布裏病進行多工測試之圖900的實例。圖9顯示龐貝試驗與法布裏試驗之受影響(酵素不足)與正常樣本之間的明顯分離。該等試驗可對100個以上正常新生兒DBS樣本及20個受影響新生兒樣本以可再現方式進行。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之繖酮基受質。
7.7 生物素酵素(BIOT)及半乳糖血症之酵素試驗
分別用於BIOT及半乳糖血症測試之生物素酵素及總半乳糖試驗當前可用且由全世界的許多新生兒測試(NBS)實驗室進行。生物素酵素試驗可為比色沃爾夫試驗(colorimetric Wolf's assay)(吸光度偵測試驗)。總半乳糖之試驗為螢光試驗(365nm激發/465nm發射)。生物素酵素之比色試驗及總半乳糖之螢光試驗可經調整以適於在微滴致動器上使用。在一個具體實例中，本發明提供使用來自DBS樣本之單一孔樣進行BIOT及半乳糖血症之新生兒測試的晶片上酵素試驗方案。DBS萃取物可使用單一萃取緩衝液製備且各試驗所需之專用組分可包括於試劑調配物中。晶片上酵素試驗針對各酵素反應進行調整且可再現。舉例而言，可選擇不同濃度之分析物(例如在約50μL或約100μL或約150μL或約200μL萃取緩衝液中萃取之DBS孔樣)，使得最少量之DBS萃取物提供可偵測信號。因為使用最少量之DBS萃取物，所以可進行多個NBS試驗。不同試劑之濃度、緩衝能力及pH值可經調整以適於在數位微流體方案中使用。可基於動力學資料選擇各酵素反應之培育時間。試驗台上方案中之相對較大反應體積可減小，亦即統一為與數位微流體格式相容之微滴體積。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之繖酮基受質。
7.8 CH、CAH及CF測試之免疫試驗
本發明提供使用來自DBS樣本之單一孔樣對先天性甲狀腺功能低下(CH)、先天性腎上腺增生(CH)及囊腫性纖維化(CF)進行新生兒測試之晶片上免疫試驗方案。DBS萃取物可使用單一萃取緩衝液來製備且各試驗所需之專用組分可包括於試劑調配物中。
在一個具體實例中，本發明提供CF之免疫活性胰蛋白酶原(IRT)之晶片上免疫試驗方案。在另一具體實例中，本發明提供CH之促甲狀腺素(TSH)及自由甲狀腺素(T4)之晶片上免疫試驗方案。在又一具體實例中，本發明提供CAH之17 α-羥基孕酮(17-OHP)之晶片上免疫試驗方案。IRT及TSH之免疫試驗為夾層免疫試驗。17-OHP及T4之免疫試驗為競爭性試驗。
在一個具體實例中，所有晶片上免疫試驗之酵素標記(經標記之二次抗體)均可為鹼性磷酸酶(ALP)。偵測可例如基於螢光。ALP之受質流體可例如為激發/發射波長為365/460nm之4-甲基繖酮磷酸酯(4-MUPi)。晶片上免疫試驗可針對各酵素反應進行調整。舉例而言，可選擇不同濃度之分析物(例如在約50μL或約100μL或約150μL萃取緩衝液中萃取之DBS孔樣)，使得最少量之DBS萃取物提供可偵測信號。因為使用最少量之DBS萃取物，所以可進行多個NBS試驗。可調整不同試劑(例如標記有ALP之一次抗體及二次抗體)之濃度以便用於數位微流體方案中。在一個實例中，達成足夠敏感性所需之一次抗體及二次抗體之濃度可使用抗原標準物來確定。可基於結合動力學資料來選擇各免疫試驗之培育時間。結合培育可例如使用微滴混合方案來確定，在該微滴混合方案中在晶片上連續混合試劑及樣本之微滴混合物以確保上面結合有免疫複合物之磁反應性珠粒實質上完全再懸浮。在另一實例中，4-MUPi與上面結合有免疫複合物之經洗滌磁反應性珠粒之反應的螢光動力學資料可用以選擇足以達成所需敏感性之培育時間。來自DBS萃取物之蛋白質及其他污染性物質吸附於磁反應性免疫捕捉珠粒上可藉由在洗滌緩衝液中使用適合阻斷溶液及/或界面活 性劑來實質上消除。基於微滴之免疫試驗的例示性方案闡述於2010年10月19日頒予之Pamula，等人之美國專利7,815,871中，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
圖10顯示促甲狀腺素(TSH)之標準曲線之圖1000的實例。在試驗台上製備含有等體積之結合於磁反應性珠粒(免疫捕捉珠粒)之一次抗體、阻斷溶液，及標記有ALP之二次抗體的試劑混合物。在試驗台上製備TSH標準物。與圖1000中所示之TSH標準曲線相關之數位微流體方案包括以下步驟：將一個試劑混合物微滴與兩個不同濃度之TSH標準物之微滴混合以形成反應微滴。培育反應微滴4分鐘。使用珠粒洗滌方案洗滌上面結合有免疫複合物之磁反應性珠粒以移除任何未結合之二次抗體。使用微滴操作將一個化學發光受質流體微滴與反應微滴組合且培育2分鐘。使用光子計數光電倍增管量測終點化學發光。使用4參數邏輯擬合來擬合數據。誤差杠表示來自四個不同試驗之標準差。美國大多數新生兒實驗室所用之TSH的截止濃度為20μlU/mL。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之繖酮基受質。
7.9 整合式微滴致動器裝置
新生兒測試可在集中實驗室中進行且經常針對不同病狀需要不同試驗類型。舉例而言，免疫試驗可用以測試先天性甲狀腺功能低下(CH)、先天性腎上腺增生(CAH)及囊腫性纖維化(CF)且酵素試驗用以測試生物素酵素缺乏症(BIOT)及半乳糖血症。用於測試此等病狀之當前技術使用各別儀器。舉例而言，大多數新生兒測試實驗室使用Perkin Elmer's Autodelfia免疫分析儀來測試CF、CH及CAH且使用Astoria Pacific's Spotcheck(基於 螢光之分析儀)來測試半乳糖血症。其他實驗室可使用手動螢光測定法來測試半乳糖血症。為測試BIOT，大多數新生兒測試實驗室使用呈96孔格式之手動比色試驗(例如沃爾夫試驗)。因為使用各別試驗及儀器，所以不能節約寶貴的新生兒樣本體積。
本發明提供一種於單一微滴致動器上進行酵素試驗及免疫試驗之整合式微滴致動器裝置及方法。在一個實例中，本發明之整合式微滴致動器裝置及方法可用於使用例如來自單一乾血點樣本之萃取物對CAH、CH、CF、半乳糖血症及BIOT進行多工偵測。
圖11說明適用於進行整合式酵素試驗及免疫試驗新生兒測試方案之微滴致動器1100之實例的俯視圖；微滴致動器1100包括多個分配儲集器，其可例如分派作為用於分配樣本流體(例如乾血點萃取物)之樣本分配儲集器1110(例如12個樣本分配儲集器1110)；用於分配不同試劑流體之試劑分配儲集器1112(例如8個試劑分配儲集器1112)；用於分配洗滌緩衝液之洗滌緩衝液分配儲集器1114；一或多個用於接收廢料微滴之廢料收集儲集器1116(例如廢料收集儲集器1116a及1116b)；及用於分配受質流體之受質流體分配儲集器1118。在一個實例中，兩個試劑分配儲集器1112可用以分配CAH免疫試驗(例如17-OHP)之試劑；一個試劑分配儲集器1112可用以分配BIOT酵素試驗之試劑；一個試劑分配儲集器1112可用以分配半乳糖血症酵素試驗之試劑；兩個試劑分配儲集器1112可用以分配CR免疫試驗(例如IRT)之試劑；且兩個試劑分配儲集器1112可用以分配CH免疫試驗(例如TSH/T4)之試劑。受質流體分配儲集器1118可用以分配基於螢光之免疫試驗的螢光受質流體，諸如4-MUPi。樣本分配儲集器1110、試 劑分配儲集器1112、洗滌緩衝液分配儲集器1114、廢料收集儲集器1116，及受質流體分配儲集器1118與分配電極對齊且經由微滴操作電極1120(例如電濕潤電極)之配置(諸如路徑或陣列)互連。在微滴操作電極1120頂上在微滴操作表面上進行微滴操作。
微滴致動器1100可包括進行酵素試驗(諸如BIOT及半乳糖血症酵素試驗)之酵素試驗區1122(例如2重酵素試驗區)。微滴致動器1100可進一步包括進行免疫試驗(諸如CH、CAH及CF之免疫試驗)之免疫試驗區1124(例如3重免疫試驗區)。微滴致動器1100可進一步包括偵測區1126。偵測區1126可包括偵測螢光信號之特定區域及偵測吸光度之特定區域(如參考圖12所述)。
圖12說明於單一微滴致動器上對多個微滴同時偵測螢光與吸光度之偵測系統1200之實例的側視圖。本發明之偵測系統包括用於比色試驗之量測吸光度的偵測器，及用於低水準(例如約0.55nM 4-MU)螢光偵測之敏感螢光計。
偵測系統1200可包括成像裝置1210及偵測器1212。成像裝置1210可例如為敏感螢光計。偵測器1212可包括一定配置之發光二極體(LED)1214(例如三個LED 1214a、1214b及1214c)，及一定配置之光偵測器1216(例如三個光偵測器1216a、1216b及1216c)。光偵測器1216可例如為光電二極體。LED 1214及光偵測器1216之配置為使得光偵測器1216實質上與LED 1214對齊。偵測系統1200為用於操作微滴致動器之儀器(圖中未示)之一部分。
微滴致動器可與偵測系統1200組合使用。舉例而言，微滴致動器1218 可定位於儀器組(圖中未示)中使得微滴致動器1218之特定區域與偵測系統1200對齊。微滴致動器1218可包括底部基板1220及頂部基板1222，其由間隙1224隔開。密封墊1226可用以設定間隙1224之尺寸。底部基板1220可包括微滴操作電極1228(例如電濕潤電極)之配置。在微滴操作電極1228頂上在微滴操作表面上進行微滴操作。
微滴致動器1218定位於儀器組(圖中未示)中使得成像裝置1210及偵測器1212與特定微滴操作電極1228對齊。特定言之，LED 1214及光偵測器1216實質上與特定微滴操作電極1228對齊。
微滴致動器1218可包括微滴1230。微滴1230可例如為待評估樣本流體之微滴。微滴1230可例如具有約300nL之體積。在一個實例中，微滴1230可含有一定量之珠粒(圖中未示)。舉例而言，珠粒可為用於在微滴致動器1218之試驗操作(亦即免疫試驗)期間靶向某一物質(例如蛋白質、DNA及/或抗原)之免疫捕捉珠粒。與試劑相互作用後，微滴1230可針對對其中之免疫捕捉珠粒具有親和性之目標物質來評估。一種實例性評估方法可藉由數位成像以便鑑別例如螢光信號來達成。在另一實例中，微滴1230可含有在酵素試驗(諸如用以測試半乳糖血症之試驗)期間產生之一定量之螢光反應產物。
在操作中，成像裝置1210實質上與特定微滴操作電極1228對齊，使得該特定微滴操作電極1228在成像裝置1210之成像場內。成像裝置1210可用以捕捉可能自微滴1230發射之影像(例如螢光信號)。成像裝置1210可通過頂部基板1222捕捉影像，該頂部基板1222可例如為實質上透明之玻璃板。此外，頂部基板1222之厚度可經最優化以提供微滴1230之有效成像。
微滴致動器1218可進一步包括一或多個待評估微滴1232(例如微滴1232a、1232b及1232c)。各微滴1232可例如具有約300nL之體積。微滴1232可例如含有在酵素試驗(諸如用以測試BIOT之比色試驗)期間產生之一定量反應產物。一種實例性評估方法可藉由吸光度偵測著色反應產物來達成。
微滴致動器上之多工酵素試驗及免疫試驗之所有操作均可在控制微滴致動器之軟體中程式化。在一個實例中，將複雜試驗方案轉化成簡單流程圖之軟體可用以為微滴致動器之電子設備提供輸入命令。
多工測試試驗方案之實例可包括(但不限於)以下：分配五個樣本微滴(例如自單一DBS孔樣)且使用微滴操作將微滴傳輸至適當反應區(例如酵素試驗區或免疫試驗區)。對於酵素試驗(例如半乳糖血症、BIOT)，分配一個試劑微滴且使用微滴操作將其與一個樣本微滴組合以形成反應微滴。培育反應微滴歷時足以產生反應產物之時段。分配一個終止/淬滅緩衝液微滴且使用微滴操作將其與反應微滴組合。偵測螢光(例如半乳糖血症試驗)或吸光度(例如BIOT試驗)。對於夾層免疫試驗(例如CF、CH)，分配磁反應性免疫捕捉珠粒、阻斷溶液及標記有ALP之二次抗體各自之一個微滴。使用微滴操作合併所有微滴(試劑微滴及樣本微滴)且培育足以形成免疫複合物之時段。使用珠粒洗滌方案洗滌上面結合有免疫複合物之磁反應性珠粒以移除任何未結合之二次抗體。分配一個受質流體(例如4-MUPi)微滴，且使用微滴操作將其與經洗滌之珠粒微滴組合。偵測螢光。對於競爭性免疫試驗(例如CH及CAH)，分配一個磁反應性免疫捕捉珠粒微滴且使用微滴操作將其與一個樣本微滴及一個ALP標記分析物微滴組合以形成反應微滴。培育反應微滴歷時足以達成抗原-抗體結合之時段。使用 珠粒洗滌方案洗滌磁反應性珠粒以移除過量物質。分配一個受質流體(例如4-MUPi)微滴，且使用微滴操作將其與經洗滌之珠粒微滴組合。偵測螢光。
7.10 減少污染
在新生兒測試試驗中，污染可由液體處理故障(諸如微滴分裂，或先前微滴釘紮於同一電極路徑上)引起。污染可導致經污染路徑上之一或多個微滴的假陰性。在一個具體實例中，藉由使用終止緩衝液微滴以洗滌先前泳道來避免污染。終止緩衝液之實例為經常用於酵素試驗(諸如代謝失調之新生兒測試試驗)中之終止緩衝液。泳道或路徑洗滌方案之實例描述於2009年5月13日申請之標題為Droplet Actuator Devices,Systems,and Methods之國際專利申請案第PCT/US09/43774號，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
舉例而言，洗滌微滴可沿各潛在污染性微滴之間的共同路徑傳輸。潛在污染性微滴可包括試劑微滴、樣本微滴及/或反應微滴，其包括潛在污染性物質，諸如目標酵素。洗滌微滴可例如包括洗滌緩衝液，諸如終止緩衝液。洗滌微滴可包括降解污染物之化合物。洗滌微滴可包括結合於污染物之組分。洗滌微滴可沿相對於潛在污染性微滴相同之方向或相反或橫向之方向中的共同路徑傳輸。在一些情況下，將多個洗滌微滴插入潛在污染性微滴之間的路徑上。在一些情況下，洗滌微滴大於潛在污染性微滴，例如2倍、3倍、4倍或4倍以上之微滴可用作洗滌微滴。
7.10.1 固定4-甲基繖酮(4-MU)
將含4-MU之受質(亦稱作7-羥基4-甲基香豆素)用於許多生物試驗， 包括偵測新生兒體內溶酶體儲存病症之試驗。螢光酵素試驗基於含4-MU之受質經特定酵素水解得到螢光分子4-MU。在微滴致動器之微滴操作環境中，4-MU分配於水相(亦即微滴)與有機相(填充流體)之間可能潛在地污染電極路徑。4-MU受質之酵素週轉(enzymatic turnover)需要低pH值環境(酸性環境)。在低pH值(4-MU之PK=7.9)下，4-MU為非離子性及疏水性，且優先自水性微滴相分配至油填料相(100：1)中。隨後準備進行生物試驗之偵測步驟的微滴處於高pH值下。4-MU之螢光在高pH值(pH>10)下最佳。高pH值(pH>10)有助於使4-MU自油相反向分配回水相微滴中。當高酵素濃度(產生大量4-MU產物)之酸性微滴在實質上較低4-MU濃度之鹼性微滴附近時，可能發生微滴交叉污染會成問題。
本發明提供實質上消除微滴致動器上基於4-MU之生物試驗(例如新生兒測試試驗)中微滴之間的交叉污染或來自微滴之信號損失的方法。該方法使得基於4-MU之生物試驗中陽性信號與陰性信號之間的辨別顯著改良。在一個具體實例中，含酵素4-MU之受質可固定於固體支撐物上。在另一實例中，含酵素4-MU之受質可固定於磁反應性珠粒上。在又一實例中，含酵素4-MU之受質可固定於水凝膠珠粒上。含酵素4-MU之受質可例如經由受質分子之4-MU組分固定於固體支撐物上。可選擇固體支撐物(例如磁反應性珠粒或水凝膠珠粒)使得珠粒在微滴操作期間保持懸浮於水性微滴中且隨水性微滴一起移動。將4-MU固定於固體支撐物(例如磁反應性珠粒或水凝膠珠粒)上使得在任何pH值下酵素4-MU受質均滯留於水性微滴內且實質上消除4-MU分配至油填料相中。4-MU固定亦可發生於大分子(諸如纖維素)上。
在另一具體實例中，酵素受質(諸如含酵素4-MU之受質)可藉由形成「包合複合物(inclusion complex)」固定於水相(例如水性微滴)中。在一個實例中，環糊精可用以形成含有4-MU之包合複合物。環糊精為含疏水性內腔及親水性外表面之環形環葡萄糖分子。環糊精以各種尺寸市售。舉例而言，α-環糊精具有6個葡萄糖單元、β-環糊精具有7個葡萄糖單元且γ-環糊精具有8個葡萄糖單元。內腔之尺寸自α環糊精至γ環糊精增加。
圖13顯示評估添加劑(例如β-環糊精、界面活性劑)對4-MU分配之影響的試驗台上試驗方案1300之圖。試驗格式包括4-MU自水相至油相之正向轉移分配(正向萃取；FE)，及4-MU自油相至水相之反向轉移分配(反向萃取；BE)。該試驗在96孔微量滴定受質；透明96孔受質(例如Costar 3631)中進行以便用底部探針螢光偵測來評估正向轉移分配，且在固體黑色96孔受質(例如Costar 3915)中進行以便用頂部探針螢光偵測來評估反向轉移分配。具有3mm頂部探針及5mm底部探針之BioTek Synergy HT儀器可例如用於螢光量測。在一個實例中，在評估4-MU之水性圍阻中之環糊精的試驗中可變化的參數包括(但不限於)水相溶液之離子強度、水相溶液之pH值(例如pH 2或pH 5)，及環糊精與4-MU之莫耳比。
用於測試環糊精對經由4-MU分配污染之影響的試驗格式之實例包括(但不限於)以下步驟：將含有界面活性劑(諸如0.01% Tween® 20)之水相溶液(例如在pH 2、pH 5或pH 10.5下)之等分試樣(20μL)吸移至96孔透明微量滴定盤之一孔中。水相溶液亦可包括4-MU(例如100μM)、NaCl(例如50mM)，及β-環糊精(例如100μM、1mm、10mM或100mM)。將130μL聚矽氧油(5 cSt，0.1% Triton X-15)添加至含有水相微滴之各孔 中。以鋁箔密封該盤且在室溫下使用試驗台上型震盪器(例如在速度設定5下之Thermofisher震盪器)震盪30分鐘。謹慎移除鋁箔且觀察各孔以注意並記錄微滴品質之任何缺陷(將此步驟期間之曝光量減到最小)。使用底部探針在增益40、45及50下量測各孔之螢光。在不干擾水性微滴之情況下將50μL油相(FE油)自各孔轉移至各孔含有50μL 200mM NaHCO3之固體黑色微量滴定盤之各別孔中。以鋁箔密封該盤且在室溫下使用例如Thermofisher試驗台上型震盪器(例如速度設定5)震盪30分鐘。移除鋁箔且使用頂部探針在增益50、60、70及80下量測各孔之螢光。
可隨β-環糊精與4-MU之莫耳比而變來檢查4-MU之水性圍阻。圖14A及14B分別顯示隨β-環糊精：4-MU莫耳比而變之自由4-MU濃度的圖1400(線性-線性標度(linear-linear scale))及圖1450(對數-對數標度)。數據在100mM KCl、MeOH/水(2/98 v/v)中在pH 2下產生。
圖15顯示預期BE信號(反向萃取)隨FE(正向萃取)中平衡時自由4-MU濃度而變之圖1500。在增益70下量測相對螢光。β-環糊精與4-MU之莫耳比為0：1至200：1。
圖16A至16G顯示經設計以評估環糊精、pH值及離子強度對4-MU水性圍阻之影響的實驗之實例的螢幕截圖。參考圖16D，較之相應背景信號(B)，最低污染信號(A)在200：1之Me-bCD與4-MU之莫耳比下達成。實驗顯示β-環糊精(甲基-β-環糊精、羥丙基-β-環糊精)在4-MU之水性圍阻中有效。β-環糊精對4-MU之水性圍阻的影響與pH值無關。尤其當初始4-MU濃度較低時，可能需要β-環糊精相對於4-MU較大莫耳過量(例如>1,000：1)，以便達成有利平衡偏移。
表5及表6顯示用以評估環糊精(CD)對4-MU之水性圍阻的影響之微量滴定盤佈局之實例。用於正向轉移分配之盤佈局顯示於表5中。在此實例中，水相之pH值為pH 2或pH 5。β-環糊精之濃度為100μM、10mM或100mM。4-MU之濃度為0μM或100μM。
反向轉移(反向萃取)之相應微量滴定盤佈局顯示於表6中。第二微量滴定盤(亦即固體黑色微量滴定盤)之各孔含有50μL pH 10.5之水溶液(200mM NaHCO3)。各孔亦含有來自參考表5所述之正向轉移反應之相應 孔的油(亦即FE油)之等分試樣(50μL)。對於螢光校準，將含有4-MU(0、0.01、0.1或1μM)之水溶液添加至表5之相應「空」孔中且與50μL新鮮油等分試樣重疊。
圖17A及17B分別顯示表5及表6之4-MU分配試驗分別的正向轉移及反向轉移之螢光讀數的數據表1700及1750。正向轉移螢光(圖17A)在45之增益下讀取且反向轉移螢光(圖17B)在70之增益下讀取。參考圖17B，值V1對應於表5之單元格B1、2、3、4，值V2對應於表5之單元格D5、6、7、8，值V3對應於表5之單元格F9、10、11、12，且值V4對應於單元格H1、2、3、4。數據顯示在較高濃度之CD，亦即100mM(b-環糊精：4-MU莫耳比>>200：1)下，4-MU自水相至油相之正向轉移顯著減少。
圖18A及18B分別顯示4-MU分配試驗之另一實例的數據表1800及1850。正向及反向轉移之微量滴定盤佈局分別顯示於下文表7及表8中。在此實例中，4-MU濃度為10μM。正向轉移(圖18A)在45之增益下讀取且反向轉移(圖18B)在70之增益下讀取。參考圖18B，值V1對應於表7之單元格B1、2、3、4，值V2對應於表7之單元格D5、6、7、8，且值V3對應於表7之單元格F1、2、3、4。數據顯示在較高濃度之環糊精，亦即100mM(b-環糊精：4-MU莫耳比>>200：1)下，4-MU自水相至油相之正向轉移顯著減少。
在微滴致動器之微滴操作環境中，4-MU與環糊精之間形成包合複合物可用以藉由防止在低pH值下4-MU自水相滲漏至填充流體(例如聚矽氧油) 相中來將微滴交叉污染實質上減到最小。在一個實例中，環糊精可用作包括含酵素4-MU之受質之試劑微滴的添加劑。使用微滴操作使樣本微滴(例如乾燥血液萃取物微滴)與試劑微滴組合並混合。因為環糊精包括於試劑微滴中，所以酵素產物(亦即4-MU)一旦由樣本微滴中存在之酵素釋放即螯合於包合複合物內。
在又一具體實例中，界面活性劑可用以將4-MU(或衍生物)滯留在水相(例如水相微滴)內。可例如使用分配試驗(諸如參考圖13所述之4-MU分配試驗)來評估並選擇不同界面活性劑將4-MU(或衍生物)含於水相中之功效。在此實例中，在評估4-MU(或衍生物)水性圍阻中之界面活性劑的試驗中可變化之參數包括(但不限於)水相溶液之pH值(例如pH 2或pH 10.5範圍)及界面活性劑之臨界微胞濃度。
用於測試界面活性劑對經由4-MU分配污染之影響的試驗格式之實例包括(但不限於)以下步驟：將含有所選濃度(例如界面活性劑臨界微胞濃度之1.5倍)之界面活性劑的水相溶液(例如pH值範圍為pH 2至pH 10.5)之等分試樣(20μL)吸移至96孔透明底部微量滴定盤(例如Costar® 3631)之孔中。水相溶液亦包括4-MU(例如1mM)。將130μL聚矽氧油(5 cSt，0.1% TritonTM X-15)添加至含有水相微滴之各孔中。以鋁箔密封該盤且在室溫下使用試驗台上型震盪器(例如在速度設定5下之Thermofisher震盪器)震盪30分鐘。謹慎移除鋁箔且觀察各孔以注意並記錄微滴品質之任何缺陷(將此步驟期間之曝光量減到最小)。使用底部探針在例如40之增益下量測各孔之螢光。在不干擾水性微滴之情況下將50μL油相(FE油)自各孔轉移至各孔含有50μL 200mM NaHCO3(pH 10.5)之固體黑色微量滴定盤 之各別孔中。以鋁箔密封該盤且在室溫下使用例如Thermofisher試驗台上型震盪器(例如速度設定5)震盪30分鐘。移除鋁箔且使用頂部探針在增益45、50、55、60、65及70下量測各孔之螢光。
圖19顯示用以評估水相界面活性劑對4-MU圍阻之影響的4-MU分配試驗之反向轉移分配(反向萃取；BE)之相對螢光讀數的數據表1900。在此實例中，界面活性劑選自Hampton Research公司之清潔劑測試套組HR2-408中可得之一系列不同界面活性劑。使用含0.1% w/v Triton X-15之5 cSt聚矽氧油作為有機相(油相)進行實驗。各界面活性劑在界面活性劑之臨界微胞濃度(CMC)的1.5倍下使用。各界面活性劑之身分列於表9中。AS17(ANAPOE®-20或Tween® 20)用作參考信號(43,000-44,000 RFU)且反映微滴致動器上進行之新生兒測試試驗中可觀察到之微滴交叉污染程度的實例。數據以不同界面活性劑將4-MU滯留於水相微滴中之效率遞減的順序呈現。
7.10.2 NBS之4-MU及HMU受質的修飾
新生兒測試試驗(NBS)中所用之基於微滴致動器之溶酶體酵素測試為基於螢光之測試，其量測受質酵素水解後4-甲基繖酮(4-MU)或6-十六醯胺基-4-甲基繖酮(HMU)之釋放。本發明之酵素試驗可在微滴致動器之填充油之間隙內的水性微滴中進行。在一個實例中，油填充流體可為聚二甲基矽氧烷矽油(PDMS)。溶酶體酵素測試在pH 2.8至pH 5.6之範圍內的酸 性pH值下進行。在一些具體實例中，在培育後，酵素反應可藉由添加碳酸氫鈉(pH 10.1)來終止，碳酸氫鈉亦使質子自繖酮羥基解離，從而使得螢光信號實質上增加。在測試溶酶體酵素所用之酸性pH值下，試驗產物4-MU及HMU經質子化且可自水性微滴分配至PDMS填充流體中。4-MU及HMU分配至油相中可使試驗信號減小且相鄰樣本可能受污染。
本發明提供實質上減小或消除在微滴致動器上基於螢光之試驗(例如NBS樣本、試驗、糖苷酶、蛋白酶及免疫試驗)期間繖酮基衍生物(例如4-MU及HMU)之油溶性的方法。在一個具體實例中，4-MU及HMU之化學修飾可用以形成在油填充流體(例如PDMS)中之溶解性實質上減小的衍生物。可用以減小繖酮基衍生物之油溶性之化學修飾的實例可包括添加胺基、碳鏈長度、將4-MU或HMU與諸如纖維素或聚離胺酸之分子繫鏈。可選擇化學修飾使得酵素反應(例如各種溶酶體酵素試驗)之活性及/或特異性不實質上改變(破壞)。亦可選擇化學修飾使得4-MU或HMU之螢光信號不消除。較佳保留足夠之4-MU或HMU螢光信號以在測試中區分陽性或陰性。亦可選擇化學修飾使得繖酮基衍生物與用以製備個別試驗受質之下游合成反應相容。亦可選擇化學修飾使得繖酮基衍生物具有適於特定NBS試驗之足夠水溶性。在一個實例中，可針對在pH 3.5至pH 6.0之範圍內的試驗條件來選擇繖酮基衍生物之水溶性。適合之繖酮基衍生物可例如使用在pH 3.5及pH 6.0下之Log D值來選擇。
在一個實例中，4-MU及HMU之4-甲基可用增加4-MU及HMU親水性之化學結構修飾。因為4-MU及HMU衍生物具親水性，所以水相反應微滴中之螢光衍生物之滯留實質上增加。可用以修飾4-MU及HMU以增加其親 水性之適合化學結構的實例包括(但不限於)聚合物，包括線性或分枝聚烷二醇(PAG)，諸如聚乙二醇(PEG)，及/或聚丙二醇(PPG)，或PEG與PPG之組合；磺酸；及胺基。促進4-MU及HMU滯留於水相中之化學修飾的功效可例如使用晶片上分配試驗來評估。
本文所述之化合物為4-甲基繖酮(4-MU)及6-十六醯基-4-甲基繖酮之類似物。
4-MU類似物具有以下通式之一：
其中：X獨立地選自由O、S及NH組成之群，R1選自由以下組成之群：H、C1-15氧基烷基、-C1-15胺基烷基、-C1-15烷基胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣及雙醣；R2為H、單醣、雙醣或多元醇；R3為親水性寡聚物或聚合物，其可選自由以下組成之群：聚烷二醇，諸如聚乙二醇，其中聚烷二醇可視情況進一步包括NH或S部分；聚陽離子聚合物，諸如聚離胺酸；碳水化合物，包括單醣及雙醣、C1-15氧基烷基、-C1-15 胺基烷基、-C1-15烷基胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣及雙醣，且n為1至100，或1至50，或1至25，或1至10之整數。
如熟習此項技術者所瞭解，親水性聚合物或寡聚物可為各種包含聚烷二醇部分之寡聚物中之任一者。寡聚物之聚烷二醇部分較佳具有1-100個聚烷二醇次單元。聚烷二醇部分更佳具有1-50個聚烷二醇次單元且聚烷二醇部分最佳具有1-25個聚烷二醇次單元。
如熟習此項技術者所瞭解，親水性聚合物或寡聚物可為各種包含聚乙二醇部分之寡聚物中之任一者。寡聚物之聚乙二醇部分較佳具有1-100個聚乙二醇次單元。聚乙二醇部分更佳具有1-50個聚乙二醇次單元且聚乙二醇部分最佳具有1-25個聚乙二醇次單元。
如熟習此項技術者所瞭解，親水性聚合物或寡聚物可為各種包含聚丙二醇部分之寡聚物中之任一者。寡聚物之聚丙二醇部分較佳具有1-100個聚丙二醇次單元。聚丙二醇部分更佳具有1-50個聚丙二醇次單元且聚丙二醇部分最佳具有1-25個聚丙二醇次單元。
其他親水性寡聚物及聚合物包括含有極性或帶電官能基致使其可溶於水之寡聚物及聚合物。舉例而言，丙烯酸系物包括丙烯酸、丙烯醯胺，及順丁烯二酸酐聚合物及共聚物。胺官能性聚合物包括烯丙胺、伸乙亞胺、噁唑啉，及在主鏈或側鏈中含有胺基團之其他聚合物，諸如聚離胺酸。其可與PAG組合。
如熟習此項技術者所瞭解，寡聚物可包含一或多個其他部分，包括(但 不限於)其他親水性部分、親脂性部分、間隔部分、連接部分及封端部分。寡聚物中之各種部分由可水解鍵或不可水解鍵彼此共價偶合。
該一或多個其他親水性部分(亦即除聚乙二醇部分外之部分)可包括(但不限於)糖、多元醇、聚氧化烯，及多元胺/PEG共聚物。因為聚乙二醇為聚氧化烯，所以其他親水性部分可為聚乙二醇部分。相鄰聚乙二醇部分若由醚鍵偶合，則被認為是同一部分。舉例而言，部分--O--C2H4--O--C2H4-O--C2H4--O--C2H4--O--C2H4-O--C2H4-為具有六個聚乙二醇次單元之單一聚乙二醇部分。相鄰聚乙二醇部分若由不為醚鍵之鍵偶合，則被認為是不同部分。
如熟習此項技術者所瞭解，寡聚物可進一步包含一或多個間隔部分。間隔部分較佳選自由糖、膽固醇及甘油部分組成之群。
寡聚物可在不與4-HU或6HMU主鏈偶合之寡聚物之一或多個末端進一步包含一或多個封端部分。封端部分較佳為烷基或烷氧基部分，且更佳為低碳烷基或低碳烷氧基部分(其中低碳意謂C1-6)。封端部分最佳為甲基或甲氧基。儘管封端部分較佳為烷基或烷氧基部分，但應瞭解，封端部分可為如熟習此項技術者所瞭解之各種部分，包括(但不限於)糖、膽固醇、醇及脂肪酸。寡聚物或聚合物可包括一或多個陰離子或自形成部分，諸如第三陰離子(tertiary anion)。
以下顯示一部分式1-5，其中各R2為H。
其中：R1選自由以下組成之群：H、C1-15氧基烷基、-C1-15胺基烷基、-C1-15烷基胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣及雙醣。
R3為線性或分枝親水性寡聚物或聚合物，其可選自由以下組成之群：聚烷二醇，諸如聚乙二醇，其中聚烷二醇可視情況進一步包括NH或S部分； 聚陽離子聚合物，諸如聚離胺酸；碳水化合物，包括單醣及雙醣、C1-15氧基烷基、-C1-15胺基烷基、-C1-15烷基胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣及雙醣。
X獨立地選自由O、S及NH組成之群，且n為1至100，或1至50，或1至25，或1至10之整數。
可與4-MU核心結構在位置R2偶合之代表性糖部分包括(但不限於)：
所示糖部分為阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖、甘露糖、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖及塔羅糖(talose)各自之a-哌喃糖、b-哌喃糖、a-呋喃糖及b-呋喃糖形式。可使用醚化技術將糖部分連接至酚部分以形成醚鍵，理想地使用以下醚化技術：其中在醚化步驟期間保護偶合化學反應中不涉及之羥基，且在總合成中之稍後時刻脫除保護基。適合之保護基為描述於例如Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons,1999中，其內容以引用的方式併入本文中。
當葡萄糖為糖且與R2之酚反應時，所得化合物稱為葡萄哌喃糖苷。熟 習此項技術者熟知葡萄哌喃糖苷之形成。
核糖及去氧核糖亦可與位置R2之酚偶合：
代表性多元醇包括乙二醇(2碳)、甘油(3碳)、赤藻糖醇(4碳)、蘇糖醇(4碳)、阿拉伯糖醇(5碳)、木糖醇(5碳)、核糖醇(5碳)、甘露糖醇(6碳)、山梨糖醇(6碳)、半乳糖醇(6碳)、艾杜糖醇(6碳)、巴糖醇(12碳)、麥芽糖醇(12碳)、乳糖醇(12碳)及聚醣醇(polyglycitol)。
個別4-MU類似物之實例包括以下：
其一或多個胺經四級銨化以得到四級銨鹽之型式，及其鹽。
式1化合物可根據以下通用合成策略來製備：以4-甲基香豆素-3-乙酸,丁二醯亞胺酯(AnaSpec，目錄號81239)為起 始物：
與適合之含胺部分(R3-NH2)反應置換丁二醯亞胺基(NHS)酯且形成醯胺鍵：
NHS-酯交聯反應最通常在磷酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、HEPES或硼酸鹽緩衝液中、在pH 7.2-8.5下、在室溫或4℃下進行0.5-4小時。諸如Tris(TBS)之一級胺緩衝液因其競爭反應而不相容；然而，在一些程序中，適於在接合程序結束時添加Tris或甘胺酸緩衝液以淬滅(停止)反應。
為了製備存在硫醯胺或C(NH)-NHR3部分之化合物，可以丁二醯亞胺酯中之羰基經C(S)或C(NH)部分置換之類似物為起始物。
為了製備式2化合物，可使用以下反應：
在此反應中，酚若存在於位置R2，則在偶合化學反應完成之前應受到保護。
適合C1-15氧基烷基、-C1-15胺基烷基、-C1-15烷基胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣、雙醣，及其他部分為熟習此項技術者所熟知，且可容易地製備。
在酯形成之情況下，可使具有羧酸(其中X為O)部分之所需醇回流且使用迪恩-斯達克分離器(Dean-Stark trap)來移除水，水之形成促使平衡朝向產物。
為了製備式3化合物，可使用以下反應： 其中R1上鍵結於鹵素(較佳為Cl、Br或I)或者另一適合之脫離基之碳為一級碳或二級碳。
在此等反應中，酚若存在於位置R2，則在偶合化學反應完成之前應受到保護。
其中X為烷氧基或硫烷氧基部分。當X為胺時，該胺可用以置換脫離基，而無需將胺去質子化(亦即無需形成R1-NH-)。
為了製備式4化合物，可使用以下反應：
其中X為烷氧基或硫烷氧基部分。當X為胺時，該胺可用以置換脫離基，而無需將胺去質子化(亦即無需形成R1-NH-)。
或者，該化學反應可以逐步方式進行，其中將部分HX-CH2-C(O)-XH去質子化，且鹼性較強之X-陰離子(亦即連接至CH2部分而非C(O)部分者)充當置換脫離基之親核體。接著，可將鹼性較弱之X-陰離子質子化，且轉化為適合脫離基(亦即酸鹵化物、酐及其類似物)，且使R1XH部分與脫離基反應形成最終產物。
在此等反應中，酚若存在於位置R2，則在偶合化學反應完成之前應受到保護。
為了製備式4化合物，可使用以下反應：
在此反應中，酚若存在於位置R2，則在偶合化學反應完成之前應受到保護。類似地，應保護R1上否則將與異氰酸酯反應之任何官能基。
6-HMU類似物之實例具有以下通式：
其中：X獨立地選自由O、S及NH組成之群，R1選自由以下組成之群：H、C1-15氧基烷基、-C1-15胺基烷基、-C1-15烷基 胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣及雙醣。
R2為H、單醣、雙醣或多元醇；R3為親水性寡聚物或聚合物，其可選自由以下組成之群：聚烷二醇，諸如聚乙二醇，其中聚烷二醇可視情況進一步包括NH或S部分；聚陽離子聚合物，諸如聚離胺酸；碳水化合物，包括單醣及雙醣、C1-15氧基烷基、-C1-15胺基烷基、-C1-15烷基胺基、-(CH2CH2O)n-CH3、-(CH2CH2O)n-SO3H、C1-6烷基-C(O)NH2、-(CH2CH2NH)n-H、-SO3H、-C1-6烷基-C(O)OH、-SO3Me、C1-6烷基-雜環基、單醣及雙醣。
R4為C5-16烷基、氧基烷基，或胺基-氧基烷基部分，且n為1至100，或1至50，或1至25，或1至10之整數，及其一或多個胺經四級銨化以得到四級銨鹽之型式，及其鹽。
個別6-HMU類似物之實例包括以下：
式6-10化合物可使用製備式1-5化合物所用之相同通用反應來製備，但起始物質進一步包括-NH-C(X)-R4部分。醯胺、硫醯胺或-C(NH)-NH-部分在用以製備化合物之偶合條件下無反應性，因此可在進行偶合化學反應時存在。或者，經保護之苯胺部分(緊接於酚部分)可存在，且可在偶合化學反應完成後之適當時刻脫除保護基。自此，可使苯胺基團與適合酸氯化物(亦即R4-C(O)-鹵基)或酸酐(R4-C(O)-O-C(O)-R4)反應形成胺。
7.11 增強之酵素受質水解
酵素NBS試驗中所用之螢光受質可具有不同程度之疏水性。因為螢光受質可具疏水性，所以其與較具親水性之酵素(諸如乾燥血液萃取物中之酵素)之相互作用可減小。本發明提供增強酵素受質(諸如NBS試驗中所用之螢光受質)水解之方法。在一個具體實例中，酵素受質(例如含4-MU或HMU之受質)之水解可藉由形成將受質穩定於水性環境內之包合複合物來增強。舉例而言，環糊精(例如羥丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精)可用以形成含有疏水性受質之包合複合物。帶負電之環糊精可用以進一步增強受質水解。本發明之方法使法布裏、高雪、龐貝、克拉貝(Krabbe)及尼曼-匹克病之基於酵素-受質之生物試驗(諸如NBS試驗)中較弱信號與較強信號之間的分離改良。
為了評估環糊精在增強NBS試驗中所用之酵素受質(4-MU受質)水解之功效，自品質控制(QC)乾血點樣本(亦即，基本池(base pool/BP)、低(L)、中(M)及高(H)活性樣本)製備DBS萃取物。自CDC,Atlanta GA獲得QC樣本。基本池(BP)QC樣本自用血清調節至50%之血球比容的去白細胞人類紅血球(leukoreduced human red blood cell)池製備。高(H)活性QC樣本自用血清調節至50%之血球比容的彙集臍血製備。中(M)活性QC樣本藉由使用50%基本池(BP)及50%高(H)活性樣本製備。低(L)活性QC樣本藉由使用95%基本池(BP)及5%高(H)活性樣本製備。BP樣本用作對白細胞溶酶體酵素不具特異性之水解的對照。使用法布裏、高雪、克拉貝及龐貝病之試驗台上方案分析DBS萃取物。對於各試驗，將晶片上試劑調配物按比例放大至試驗台體積。在適當試驗緩衝液中製備羥丙基-β-環糊精或甲基-β-環糊精試劑儲備液(300mM)。對於各反應，將10μL 適當受質與10μL DBS萃取物混合。培育期(在37℃下20小時)之後，將50μL終止緩衝液(0.2M NaCO3，pH 10.1)添加至反應物中。在75之增益下在360/460nm下讀取螢光。對於各試驗，一式兩份分析QC樣本(BP、L、M及H)。
圖20A及20B分別顯示羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精對法布裏試驗中受質水解之影響的條形圖2000及2050。法布裏試驗中之4-MU受質為β-D-哌喃半乳糖苷。反應混合物(受質+DBS萃取物)中β-環糊精之濃度為10mM、30mM及100mM。數據顯示低濃度(10mM)之甲基-β-環糊精增加法布裏試驗中4-MU受質之水解且改良低、中及高QC乾血點樣本之間的分離。羥丙基-β-環糊精之影響不太有效。
圖21A及21B分別顯示羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精對高雪試驗中受質水解之影響的條形圖2100及2150。高雪試驗中之4-MU受質為β-D-葡萄哌喃糖苷。反應混合物(受質+DBS萃取物)中β-環糊精之濃度為10mM、30mM及100mM。數據顯示低濃度(10mM)之羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精增加高雪試驗中4-MU受質之水解且改良低、中及高QC乾血點樣本之間的分離。
為了進一步評估較低濃度環糊精增強4-MU受質水解之功效，使用從1mM至25mM範圍內之環糊精濃度重複法布裏及高雪試驗。圖22A及22B分別顯示較低濃度之羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精分別對法布裏試驗中受質水解之影響的條形圖2200及2250。法布裏試驗中之4-MU受質為β-D-哌喃半乳糖苷。反應混合物(受質+DBS萃取物)中β-環糊精之濃度為1、5、10、15、20及25mM。數據顯示甲基-β-環糊精(10mM)對法布 裏試驗具有正性影響，其使QC-H信號增加37%。甲基-β-環糊精之較佳濃度為約1mM至約20mM，或約5mM至約15mM，或約7mM至約13mM，或約9mM至約11mM，或約9.5mM至約11.5mM。羥丙基-β-環糊精對法布裏試驗中受質水解之影響不太有效。
圖23A及23B分別顯示較低濃度之羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精分別對高雪試驗中受質水解之影響的條形圖2300及2350。高雪試驗中之4-MU受質為β-D-葡萄哌喃糖苷。反應混合物(受質+DBS萃取物)中β-環糊精之濃度為1、5、10、15、20及25mM。數據顯示羥丙基-β-環糊精與甲基-β-環糊精均對高雪試驗具有正性影響，其增加螢光信號。較佳β-環糊精為約5mM至約15mM，或約7mM至約13mM，或約9mM至約11mM，或約9.5mM至約11.5mM濃度之羥丙基-β-環糊精。
羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精對龐貝試驗中受質水解之影響不太有效(數據在圖中未示)。羥丙基-β-環糊精及甲基-β-環糊精對克拉貝試驗中受質水解之影響為抑制性(數據在圖中未示)。
7.12 法布裏試驗中之凝血
用以製備法布裏病之受質-抑制劑調配物之緩衝系統可包括含有1%牛磺膽酸鈉之0.1M檸檬酸鈉，pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6。儘管此調配物使正常乾血點萃取物與法布裏影響乾血點萃取物之間產生統計學上顯著之分離，但本發明者已發現其引起微滴內形成凝塊。因為酵素可被圈閉於凝塊中致使酵素不可為受質所用，所以此凝血可能對試驗再現性產生不利影響。在試驗中似乎很早(自開始起30分鐘)就出現凝塊。本發明者已發現使用含0.01% Tween® 20之0.04M檸檬酸鈉(pH值為 約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6)之緩衝系統根本不影響信號，且消除凝塊形成。在另一實例中，使用含0.01% Tween® 20之0.04M乙酸鈉(pH 4.6)製備受質-抑制劑調配物，其產生與檸檬酸鈉緩衝液相同的結果。因此，在一個具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，但不含牛磺膽酸鈉之受質抑制劑調配物。在另一具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，且包含檸檬酸鈉之受質抑制劑調配物。在另一具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，且包含乙酸鈉之受質抑制劑調配物。在另一具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，且包含檸檬酸鈉且不含乙酸鈉之受質抑制劑調配物。在另一具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，且包含乙酸鈉及不含乙酸鈉之受質抑制劑調配物。在另一具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，且包含檸檬酸鈉及界面活性劑之受質抑制劑調配物。在另一具體實例中，本發明提供利用血液、血液組分或復原血點之酵素試驗，且進一步利用pH值為約4-5，或約4.2-4.8，或約4.5-4.7，或約4.6，且包含乙酸鈉及界面活性劑之受質抑制劑調配物。
7.13 替代試驗方案
在一個具體實例中，本發明之試驗涉及以下：使用微滴操作將一組乾血點萃取物微滴與一組受質流體微滴組合。使用微滴操作分裂所得組之2×微滴，形成兩組1×微滴。使用微滴操作將第一組1×微滴中之各微滴與終止緩衝液微滴組合。量測組合之微滴的終點螢光。將第二組1×反應微滴培育預定時間，接著使各反應微滴與終止緩衝液微滴組合。再次量測終點螢光。報導時刻t-END小時與t-0小時之間的差異。然而，在一些方案中，t-0時刻不進行量測，由此使微滴處理操作數目減少一半。
在一個具體實例中，本發明之微滴致動器經組態以對48個樣本進行5重試驗(240個試驗)，其意謂240個2×微滴必須在晶片上之有限面積中儲存20小時。因為2×微滴不可儲存於3相匯流排上，所以2×微滴可使用微滴操作來分裂，且1×微滴可傳輸至廢料同時培育剩餘1×微滴。在一個具體實例中，所有分配電極(試劑及樣本)均小於晶片其餘部分上之電極(900微米或750微米；間隙高度285微米)。在此微滴致動器中，較小電極上之2×微滴實際上將接近於較大電極上之1×微滴。此組態將免去分裂微滴之需要，且將簡化微滴致動器設計且工作流程更容易。
如已指出，在時刻t=0及t=20小時進行偵測之缺點在於應處理之微滴數目。對「n」數目之樣本進行「m」重試驗所需之微滴總數為「m*n*2」，其限制可於單一微滴致動器篩選之樣本總數。為了將儘可能多之樣本裝配於單一筒上，免去t=0時刻量測為有益的。進行t=0時刻量測之主要原因在於評估受質品質；測定非酵素水解；及解釋螢光之血色素淬滅的影響。
然而，如已論述，本發明者已令人驚訝地發現螢光之DBS淬滅因路徑 長度短而在晶片上極少。因此可安全地認為血色素不影響螢光。藉由在開始實際試驗之前偵測所有受質之背景螢光，可獲得所有受質之QC。空白樣本萃取物可與受質一起培育作為非酵素水解之對照。藉由採用此等步驟，可去除t=0時刻量測，從而將待處理微滴之總數減少一半。可使用微滴操作分配已知濃度4-MU鈉鹽之微滴且可偵測其螢光以提供校準物。可分配各受質之一個微滴且使用微滴操作與終止緩衝液微滴合併。可偵測此組合之終點螢光以評估受質QC且提供t=0時刻量測。接著，可將各受質之一個微滴與相應DBS萃取物微滴合併，得到一組反應微滴。在培育期結束時，可使反應微滴與終止緩衝液微滴組合，且可偵測終點螢光。
7.13.1 NBS試驗之血色素淬滅校正
因為個體之間的血球比容變化及血液在濾紙上的不規則沈積，所以用於測試溶酶體儲積病(LSD)酵素之來自新生兒之乾血點(DBS)具固有可變性。此變化致使在LSD目標酵素之最終試驗中產生血色素量之差異。在一些情況下，DBS樣本中之血色素(或其他淬滅物質)可淬滅自反應產物(例如4-MU或HMU)發射之螢光。若血色素淬滅螢光，則樣本之酵素活性可能被低估。
本發明提供在基於微滴致動器之NBS試驗中量測復原DBS樣本中之螢光(例如4-MU或HMU)淬滅之試驗法。在基於微滴致動器之NBS試驗的一個實例中，使用微滴操作將已知濃度之4-MU微滴(4-MU標準物微滴)與反應終止緩衝液微滴(終止緩衝液)組合且在晶片上偵測螢光以提供酵素試驗之校準值。此同一4-MU標準物微滴亦可用以測定待測試之各DBS樣本微滴的淬滅係數。量測復原DBS樣本中之螢光淬滅之試驗格式的實例 包括(但不限於)以下步驟：在試驗開始時，分配DBS樣本微滴且使用微滴操作將其與4-MU標準物微滴在終止緩衝液中組合，且讀取螢光(無需培育期)。若無血色素或淬滅物質存在於DBS樣本微滴中，則組合之DBS樣本/4-MU微滴之螢光將等於4-MU標準物微滴之螢光。淬滅係數將為1.0或未觀察到淬滅。若有血色素或淬滅物質存在於DBS樣本微滴中，則相在組合之DBS樣本/4-MU微滴中偵測到的螢光信號低於4-MU標準物微滴之螢光。組合之DBS樣本/4-MU微滴的螢光除以4-MU標準物微滴之螢光為樣本中之螢光淬滅之量度(淬滅係數)。各樣本之螢光淬滅係數可用以校正來自所有DBS試驗樣本之所有螢光輸出信號且消除由各樣本中血色素含量(或其他淬滅物質)差異所致之信號輸出差異。
7.14 於微滴致動器上之多工龐貝、法布裏及亨特試驗
本發明提供於單一微滴致動器上對龐貝、法布裏及亨特溶酶體儲存病症(LSD)進行多工測試(對12個樣本之3重試驗)之微滴致動器裝置及方法。在一個具體實例中，用於多工測試LSD之樣本可在加載於微滴致動器上之前使用試驗台上方案自乾血點(DBS)製備。試劑製劑(例如終止緩衝液、萃取緩衝液、受質調配物及校準物)亦可在加載於微滴致動器上之前使用試驗台上方案製備。在另一具體實例中，試劑及/或樣本可在微滴致動器上之儲集器中製備，接著流至不同操作間隙，或在微滴操作間隙中製備。
7.14.1 受質調配物及試劑製劑
龐貝、法布裏及亨特試驗所需之所有試劑及調配物均可在試驗台上製備且隨後加載於微滴致動器之流體分配儲集器中。所有三種試驗共用之試 劑包括：用以校準螢光偵測之終止緩衝液(STB；含0.01% Tween® 20之0.2M碳酸氫鈉(pH 10.0))及校準物(CAL；在終止緩衝液中製備之0.15μM 4-甲基繖酮)。將龐貝、法布裏及亨特試驗之特定受質調配物概述於表10中。在另一具體實例中，試劑及/或樣本可在微滴致動器上之儲集器中製備，接著流至不同操作間隙，或在微滴操作間隙中製備。
可製備龐貝受質(PS；70mM 4-MU-α-D-葡萄哌喃糖苷(4-MU gluc)之DMSO溶液)及龐貝抑制劑(PI；在0.04M乙酸鈉中製備之8mM醣祿，pH 3.8)之儲備液，等分且在使用之前儲存於-80℃下。
製備龐貝試驗之受質調配物包括以下步驟：1.自冷凍器移除PS及PI之等分試樣且在室溫下在黑暗中(例如以鋁箔覆蓋)解凍5分鐘；2.藉由將3μL PI(8mM醣祿儲備液)添加至197μL龐貝試驗緩衝液(PB；0.04M乙酸鈉，pH 3.8)中製備PI-DIL之工作儲備液(含120μM醣祿之0.04M乙酸鈉，pH 3.8)；及3.添加41.4μL PB(0.04M乙酸鈉，pH 3.8)、5μL PI-DIL(120μM醣祿溶液)及3.6μL PS(70mM受質儲備液)以得到50μL試劑調配物。充分渦旋。試劑調配物中之最終受質濃度為5mM。試劑調配物中之最終醣 祿(抑制劑)濃度為12μM。
可在分子級水中製備法布裏受質(FS；4-甲基繖酮基α-D-哌喃半乳糖苷(4-MUGal))及法布裏抑制劑(FI；750μm N-乙醯基-D-半乳糖胺(GalNaC))之儲備液，等分且在使用之前儲存於-80℃下。
製備法布裏試驗之受質調配物包括以下步驟：1.自冷凍器移除FS及FI之等分試樣且在室溫下在黑暗中(例如以鋁箔覆蓋)解凍5分鐘；及2.添加39.3μL法布裏緩衝液(FB；含0.01% Tween® 20之0.04M乙酸鈉，pH 4.6)、10μL FI(750μM N-乙醯基半乳糖胺)及0.7μL FS(700mM受質儲備液)，以獲得50μL試劑調配物。充分渦旋。試劑調配物中之最終受質濃度為10mM。試劑調配物中之最終抑制劑濃度為150μM。
可製備亨特受質(HS；在含有10mM乙酸鉛；0.01% Tween® 20之0.1M乙酸鈉(pH 5.0)中製備之1.25mM 4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯)及重組艾杜糖醛酸酶(HE；含10μg/mL艾杜糖醛酸酶之亨特試驗緩衝液(HB；含0.01% Tween® 20及1mg/mL BSA之0.05M乙酸鈉(pH 5.0))之儲備液，等分(10μL)且在使用之前儲存於-80℃下。
製備亨特試驗之受質調配物包括以下步驟：1.自冷凍器移除HS及HE之等分試樣且在室溫下在黑暗中(例如以鋁箔覆蓋)解凍5分鐘；及2.將2μL HE(10μg/mL艾杜糖醛酸酶)添加至18μL HS(1.25mM 4-MU-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯)中。試劑調配物中之最終受質濃度為1.125mM。試劑調配物中之最終艾杜糖醛酸酶濃度為1.0μg/mL。
7.14.2 樣本及QC DBS製劑
對照DBS樣本(「高」及「低」QC點)可獲自美國疾病控制中心(U.S.Centers for Disease Control/CDC)(Atlanta GA)。自QC點及患者DBS樣本製備DBS萃取物之試驗台上方案包括以下步驟：1.使用手動或自動打孔機自各DBS(例如12個DBS樣本)打孔式選取3.2mm孔樣且將各孔樣置於圓底96孔盤(例如Fisherbrand®96孔盤)之各別孔中；2.使用20-200μL多通道吸移管，將100μL萃取緩衝液(EXT；含0.1% Tween® 20之分子級水)添加至含有DBS孔樣之各孔中；3.以透明黏著箔覆蓋該等孔；及4.在盤震盪器上在室溫下培育DBS孔樣30分鐘以萃取DBS樣本。
在萃取DBS樣本期間，微滴致動器及儀器可準備運作多工試驗。
7.14.3 微滴致動器
圖24說明經組態以進行多工龐貝、法布裏及亨特試驗之微滴致動器之電極配置2400的實例之俯視圖。微滴致動器可包括底部基板(圖中未示)及頂部基板(圖中未示)，其由間隙隔開。電極配置2400可安置於底部基板上。以諸如聚矽氧油或十六烷填充流體之填充流體填充間隙。在一個實例中，填充流體為含0.1% Triton X15之5 cSt聚矽氧油。可在底部基板與頂部基板之間提供間隔物(圖中未示)以決定其間之間隙高度且界定流體分配儲集器。提供頂部基板中之孔口(圖中未示)用於將油填充流體引入筒中且將試劑及樣本流體分配至各晶片上分配儲集器中。流體分配儲集器與分配電極對齊且可用以將液體通過流體路徑傳遞至微滴致動器之間隙中及各 晶片上分配儲集器電極中。
電極配置2400包括多個流體分配儲集器電極，其可例如分派作為用於分配樣本流體(例如乾血點萃取物)之樣本分配儲集器電極2410(例如12個樣本分配儲集器電極2410)，及用於分配試劑流體之試劑分配儲集器電極2412(例如8個試劑分配儲集器2412a至2412h)。在一個實例中，試劑分配儲集器電極2412a可用以分配龐貝試驗之受質調配物(POM)；試劑分配儲集器電極2412b可用以分配法布裏試驗之受質調配物(FAB)；試劑分配儲集器電極2412c可用以分配亨特試驗之受質調配物(HUN)；試劑分配儲集器電極2412d可用以分配萃取緩衝液；試劑分配儲集器電極2412e至2412g可用以分配反應終止緩衝液；且試劑分配儲集器電極2412h可用以分配用於儀錶校準之校準流體。表11中顯示參考圖24之儲集器配置之概述。
樣本分配儲集器電極2410及試劑分配儲集器電極2412經由微滴操作電極2414(例如電濕潤電極)之配置(諸如路徑或陣列)互連。微滴操作在 微滴操作電極2414之頂上在微滴操作表面上進行。電極配置2400包括反應區2416。電極配置2400亦包括偵測點2418。
包括電極配置2400之微滴致動器經設計以裝配於儀器組上，該儀器組容納微滴致動器外特徵，諸如一或多個控制特定處理區中之溫度之熱控制器(加熱器總成)，及用於螢光偵測之螢光計。在一個實例中，微滴致動器經設計以裝配至連接至安裝有SpotLogic軟體之桌上型電腦的NBS-LSD100分析儀器中。微滴致動器在使用前可提供並儲存於真空密封之鋁袋中。
7.14.4 試驗方案
下表12中顯示用以準備微滴致動器及運作數位微流體方案進行多工龐貝、法布裏及亨特試驗之步驟之實例的高度概述。在此實例中，該儀器為連接至安裝有SpotLogic軟體之桌上型電腦的NBS-LSD100分析儀。
儀器初始化(參考表12之步驟0)包括以下步驟：
1.在開始各運作之前，如儀器手冊中所規定，將與儀器一起提供之「測試筒(test cartridge)」插入儀器組。
2.藉由降低NBS-LSD1000儀器上之藍色桿使測試筒與電壓I/O銷嚙合；及
3.打開SpotLogicTM軟體應用程式且按「Test」以測試電濕潤效應物、螢光計及熱控制器。
在微滴致動器中加載填充流體(參考表12之步驟1)包括以下步驟：1.將微滴致動器自其真空密封之鋁袋中移出且將其平置於試驗台表面上；2.使用1000μL吸移管(例如Fisherbrand®噴霧吸移管梢部)將930μL填充流體(例如含0.1% Triton® X15之5 cSt聚矽氧油)經由頂部基板中之2mm油輸入口分配至微滴致動器中。緩慢進行以免形成氣泡。重複此過程兩次以使筒中油之總體積為1.86mL；3.藉由使用20μL吸移管自儲集器謹慎吸出空氣及一些油來移除儲集器中形成之任何氣泡；4.以30-50μL油充滿其餘2mm孔口以便在所有孔口中均存在過量油。使填充油之筒平置於試驗台表面上歷時3分鐘以測試任何經由頂部基板與底部基板(例如PCB)之間的膠合線滲漏之油。若油自頂部基板與底部基板之間的膠合線滲漏，則拒用該微滴致動器且將其棄置於生物危害品袋中。獲得新微滴致動器且加載填充流體；及 5.將填充流體加載於微滴致動器中且測試NBS-LSD100分析儀之所有主要組件(表12之步驟0)之後，以軟體選擇意欲進行測試之儀器序列號且按「Start」。按照軟體提示且藉由提昇藍色桿將微滴致動器安裝於儀器組中。當軟體提示「Load Samples」時停止。
將試劑及樣本流體加載於微滴致動器中(參考表12之步驟2)包括以下步驟：
1.按照軟體指令，使用20μL吸移管將樣本及試劑加載於指定儲集器中。如SpotLogicTM軟體中設定之儲集器部署參考圖24及表11來描述。
2.如SpotLogicTM軟體中之模板中所定義，將3.4μL DBS萃取物加載於樣本儲集器中；
3.如SpotLogicTM軟體所指定將6.6μL試劑流體(POM、FAB、HUN、EXT、CAL及STB)加載於其各別試劑分配儲集器中。參考表11，試劑加載順序為STB於儲集器R5、R6及R7中，CAL於儲集器R8中，EXT於儲集器R4中，POM於儲集器R1中，FAB於儲集器R2中及HUN於儲集器R3中；
4.在加載各儲集器期間以目視進行加載檢查(例如存在氣泡、體積)。在試劑及樣本加載期間，填充流體可漏出頂部基板中之儲集器口。漏油可導致儲集器中形成氣泡。為保持填充流體位準及避免形成氣泡，可將約30μL至50μL油添加至所有儲集器口中。流體加載及目視檢查之專業知識可例如在關於儀器及NBS試驗方案之訓練階段獲得及評估；
5.將所有樣本及試劑加載於其各別儲集器中後，再次檢查油位且確認所有輸入信息均正確；及
6.藉由按軟體中之「Start」按鈕開始試驗。
運作該試驗(參考表12之步驟3至10)包括以下步驟：1.監測試驗之初始步驟，校準(步驟3及4)及受質QC(步驟5)以鑑別任何「旗標(flag)」。旗標可因微滴致動器或儀器故障而產生。若觀察到任何旗標，則停止試驗，移除筒且啟始新運作；2.若未觀察到旗標，則關閉儀器蓋且留出約2.5小時獲得36個數據點(對12個樣本之3重試驗)；及3.運作完成之後，提昇藍色桿以使微滴致動器自I/O連接銷脫離且自儀器組謹慎移除微滴致動器。將微滴致動器棄置於生物危害品袋中以便處置。
7.15 使用DBS樣本於微滴致動器上進行之亨特試驗
本發明提供使用乾血點(DBS)樣本來偵測溶酶體儲存病症亨特症候群(II型黏多醣病)之數位微流體平台及試驗法。亨特症候群由溶酶體酵素艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯硫酸酯酶(IDS)活性不足引起。在酵素試驗中IDS之受質流體可例如為螢光受質4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯(MU-α IdoA-2S)。如參考圖1所述，使用MU-α IdoA-2S作為螢光受質來量測IDS活性需要第二酵素α-L艾杜糖醛酸酶之連續作用，以將硫酸酯酶產物4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸轉化為艾杜糖醛酸及4-MU。微流體方案為使用經純化重組艾杜糖醛酸酶之單步勻相試驗，其在單一pH值(亦即pH值為約4.5-5.5，或約4.8-5.2，或約4.9-5.1，或約5.0)下進行，產生結果所需之時間為8小時或8小時以下。在一個較佳具體實例中，進行微流體方案產生結果(自萃取DBS至產生結果)的時間為約2小時或約90分鐘或90分鐘以下。其他具體實例可利用本文所述之替代受質。
數位微流體平台可例如包括拋棄式自含微滴致動器，其中酵素反應在微滴致動器之填充油之間隙中的水性微滴中進行。樣本及試驗試劑(例如受質、終止緩衝液)以個別微滴形式在電極配置(數位電濕潤)上操縱。電極配置可例如製造於印刷電路板(PCB)上且封裝於填充油(例如聚二甲基矽氧烷2 cst，Gelest公司)之微滴致動器中。微滴致動器可經設計以裝配於併有所有控制及偵測能力之儀器組中，或以其他方式電耦合至該儀器。微滴致動器與儀器裝置之間的界面可例如由裝置與微滴致動器上之接觸墊之間的彈簧加載連接銷來提供。將樣本及試劑經由流體加載口及晶片上儲集器引入微滴致動器中。可將微滴致動器插入自動進行所有試驗操縱(包括分配所需體積之樣本及試劑、混合、培育、反應終止及偵測)之裝置中。微滴可選擇性地自任何儲集器分配、傳輸、與其他微滴組合並分割，從而複製進行酵素試驗所需之所有液體操縱。微滴致動器上單一微滴之體積可例如為300nL。可例如使用直接安裝於微滴致動器偵測電極上方之呈落射照明(epi-illumination)組態之螢光計模組來偵測螢光鈉繖酮產物(4-MU；360nM激發、460nM發射)。將來自紫外LED之經過濾激發光引導至樣本且沿同一光徑收集回。大於427nm波長之螢光穿過二向色分光器及發射過濾器到達光電二極體。LED激發及收集電子設備可呈鎖定組態以減少背景雜訊。特定言之，LED在1kHz下振盪且在32kHz下對光電二極體信號進行取樣一秒。所報導之螢光信號藉由使用快速傅裏葉變換(fast Fourier transform)在1kHz下檢查所收集信號之量值來獲得。
圖25顯示使用來自DBS樣本之萃取物在數位微流體平台上進行之亨特試驗中IDS活性之圖2500。製備重組人類α-L-艾杜糖醛酸酶之儲備液(>7.5 nmol/min/μg；含10μg/ml艾杜糖醛酸酶之0.05M乙酸鈉、0.5M氯化鈉、1mg/mL BSA、0.01% Tween® 20，pH 5.0緩衝液)且以10μL等分試樣儲存於-80℃下。藉由解凍艾杜糖醛酸酶之等分試樣來新鮮製備艾杜糖醛酸酶-2-硫酸硫酸酯酶(IDS)試驗溶液。棄置未用過之艾杜糖醛酸酶且不重新冷凍。藉由在室溫下於微量離心管中於100μL 0.1% Tween® 20中溫和混合30分鐘，在試驗台上復原來自推測正常個體及來自亨特影響個體之乾血點(3mM孔樣)。將所製備之試劑及DBS樣本加載於微滴致動器之流體分配儲集器上。
量測IDS活性之數位微流體方案包括以下步驟：使用微滴操作將一個復原DBS萃取物微滴與一個試驗溶液(1.125mM 4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯、1μg/ml重組人類α-L-艾杜糖醛酸酶、0.1M乙酸鈉及0.01M乙酸鉛，pH 5.0)微滴組合得到2×反應微滴。使用微滴操作分裂2×反應微滴，得到兩個1×反應微滴。立即使用微滴操作將一個1×反應微滴與一個終止緩衝液(0.2M碳酸氫鈉、0.01% Tween®，pH 10.0)1×微滴組合且傳輸至偵測電極以量測在零時刻之螢光信號。在微滴致動器上在37℃下培育第二1×反應微滴一小時。培育期之後，使1×反應微滴與1×終止緩衝液微滴組合且傳輸至偵測電極以量測在時刻t=1小時之螢光信號。IDS活性以每公升血液每小時形成之產物微莫耳數表述。基於含有3.1μL血液之3mm DBS孔樣計算IDS活性。使用含4-甲基繖酮鈉之0.2M碳酸氫鈉、0.01% Tween® 20(pH 10.0)終止緩衝液作為標準物在微滴致動器上進行試驗校準。
在此實例中，IDS試驗中1μg/ml之艾杜糖醛酸酶濃度足以在自4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯以IDS移除硫酸酯部分之後自4-甲基繖酮 基-α-L-艾杜糖醛酸釋放4-甲基繖酮(4-MU)(數據在圖中未示)。在萃取DBS期間稀釋(31倍)血液及如章節14.1中在受質緩衝液中存在10mM乙酸鉛足以實質上防止反應微滴中諸如氯離子、磷酸根及硫酸根之陰離子抑制艾杜糖醛酸酶-2-硫酸硫酸酯酶活性。
由兩個操作員使用兩個不同儀器及微滴致動器來量測來自隨機新生兒(n=105個隨機新生兒DBS樣本)及亨特患者(n=6個受影響DBS樣本)之DBS的萃取物中之IDS活性。數據顯示亨特患者中之IDS活性(範圍0-2.7；平均值1.1；中值1.0μmol/h/L，標準差為1.48)遠低於在推測正常新生兒中所見IDS活性(範圍10.4-56.9；平均值22.9；中值20.2μmol/h/L，標準差為9.7)且與其明確分離。不知來自隨機新生兒池之DBS中是否有任何來自亨特特性之攜帶者。
7.16 亨特症候群之單步試驗
本發明提供亨特症候群之酵素試驗。微流體方案為使用經純化重組艾杜糖醛酸酶之單步勻相試驗，其在單一pH值(亦即pH 5.0)下進行，產生結果所需之時間為8小時或8小時以下。在一個具體實例中，晶片上反應體積，亦即2μL亨特酵素及18μL亨特受質可按比例放大至試驗台上體積，亦即10μL亨特酵素及90μL亨特受質。可針對應用選擇達成受質充分酵素水解之培育時間及產生結果所需之時間。試驗可例如使用自乾血點(DBS)樣本製備之萃取物以測試亨特病。可在亨特受質緩衝液(HSB；0.1M乙酸鈉、10mM乙酸鉛(II)(Sigma Aldrich)、0.01%(w/v)Tween® 20)中製備亨特受質之儲備液(HS；4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2硫酸二鈉；Moscerdam Substrates)。亨特受質緩衝液(HSB)之pH值可為約4至約6， 較佳為約4.5至約5.5，理想地為約5。亨特酵素調配物之儲備液(HE；重組人類α-L-艾杜糖醛酸酶；10μg/20μL；R&D Systems)可在亨特酵素緩衝液(HEB；0.05M乙酸鈉、0.01%(w/v)Tween® 20、1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)；Sigma Aldrich)中製備。亨特酵素緩衝液(HEB)之pH值可為約4至約6，較佳為約4.5至約5.5，理想地為約5。可製備儲備液、等分且在使用之前儲存於-80℃下。
製備試驗台上亨特試驗之亨特受質調配物(HS)包括以下步驟：
1.將3mL亨特受質緩衝液(HSB；0.1M乙酸鈉(pH 5.0)、10mM乙酸鉛(II)(Sigma Aldrich)、0.01%(w/v)Tween® 20)添加至4-甲基繖酮基-α-L-艾杜糖醛酸-2硫酸二鈉之5mg小瓶中。溶解並將溶液轉移至包紮於箔中之10mL聚苯乙烯錐形管中；
2.藉由將第二個3mL HSB添加至小瓶中且劇烈混合來沖洗小瓶。將此溶液轉移至同一10mL錐形管中；
3.將2.33mL HSB添加至同一10mL錐形管中，得到8.33mL之總體積。
4.等分105μL溶液至個別微量離心管中；及
5.在-80℃下避光儲存。
製備亨特試驗之亨特酵素(HE)包括以下步驟：1.將20μL艾杜糖醛酸酶添加至980μL亨特酵素緩衝液(HEB；0.05M乙酸鈉(pH 5.0)、0.01%(w/v)Tween® 20、1mg/mL牛血清白蛋白(BSA；Sigma Aldrich))中；2.溫和渦旋直至完全溶解；3.等分13μL溶液至個別微量離心管中；及 4.在-80℃下儲存。
亨特症候群之試驗方案包括(但不限於)以下步驟：1.在1400rpm下之震盪平台上在室溫下在100μL萃取緩衝液(含0.1% w/v Tween® 20之分子級水)中萃取一個3mm DBS樣本孔樣歷時30分鐘；2.在萃取結束時，將液體轉移至1.5mL微量離心管中；3.一式兩份測試各樣本。HS及HE之各等分試樣足以一式兩份測試5個樣本，總共10個反應；4.藉由組合99μL HS與11μL HE來製備亨特工作受質溶液(HWSS)。充分混合且保護避光；5.在Costar黑色一半面積微量滴定盤中組合10μL DBS萃取物與10μL HWSS。避免使用盤邊之孔(亦即，A列及H列，及1行及12行)；6.以黏著性盤密封劑密封該盤且將盤包紮於鋁箔中；7.在37℃下培育反應物20小時；8.在培育期結束時，以50μL終止緩衝液(0.2M碳酸氫鈉，pH 10.1)停止反應且充分混合；及9.在60之增益下在360/460激發/發射下讀取螢光。
圖26顯示亨特症候群之單步試驗台上試驗之螢光數據的條形圖2600。DBS萃取物自品質控制(QC)樣本，亦即基本池(BP)、低(L)、中(M)及高(H)活性樣本製備。基本池(BP)QC樣本自以經加熱處理之血清調節至50%之血球比容的去白細胞人類紅血球池製備。高(H)活性QC樣本自以經加熱處理之血清調節至50%之血球比容的臍血製備。中(M)活性QC樣本藉由使用50%基本池(BP)及50%高(H)活性樣本製備。低(L) 活性QC樣本藉由使用95%基本池(BP)及5%高(H)活性樣本製備。BP樣本用作對白細胞溶酶體酵素不具有特異性之水解的對照。數據顯示L、M及H樣本之間的強信號及明確分離。
圖27顯示亨特症候群之單步試驗台上試驗之螢光數據的另一實例之條形圖2700。在此實例中，DBS萃取物自BP、L、M及H QC樣本、10個正常(N；未受影響)DBS樣本及2個亨特(MPS-II；受影響)DBS樣本製備。數據顯示正常與受影響(MPS-II)樣本之間的強信號及明確分離。相對於QC樣本，正常樣本中較高程度之酵素活性可能由於在未經熱處理之正常樣本中存在酵素活性。亨特樣本中酵素活性之程度基本上降至BP程度。
7.17 法布裏病之試驗
本發明提供法布裏病之酵素試驗(參考表10及12及圖24描述)，其可經調整以適於試驗台上方案。在一個具體實例中，該試驗使用自乾血點(DBS)樣本製備之萃取物以測試法布裏病。法布裏受質4-甲基繖酮基α-D-哌喃半乳糖苷(40MUGal；MW=338.3g/mol；Sigma)之儲備液可以700mM之濃度在二甲亞碸(DMSO，99.9%)中製備。法布裏抑制劑(750μM N-乙醯基-D-半乳糖胺；Sigma)之儲備液可在分子生物級水中製備。可製備法布裏受質及抑制劑儲備液、等分且在使用之前儲存在-80℃下。試驗台上試驗可例如在多孔微量滴定盤(例如Costar黑色一半面積盤)中進行。A微量滴定盤讀取器(例如Biotek KC4盤讀取器)可用於螢光偵測。
法布裏病之試驗台上試驗方案包括(但不限於)以下步驟：1.在1400rpm下之震盪平台上在室溫下在100μL萃取緩衝液(含0.1% w/v Tween® 20之分子級水)中萃取一個3mm DBS樣本孔樣歷時30分鐘； 2.在萃取結束時，將液體轉移至1.5mL微量離心管中；3.藉由組合78.6μL法布裏酵素緩衝液(含0.01%(w/v)Tween® 20之0.04M乙酸鈉，pH 4.6)與20μL法布裏抑制劑儲備液及1.4μL法布裏受質儲備液來製備法布裏工作受質溶液(FWS)；4.在Costar黑色一半面積微量滴定盤中，組合10μL DBS萃取物與10μL法布裏工作受質溶液(FWS)。一式兩份運作各樣本；5.以黏著性盤密封劑密封微量滴定盤且將該盤包紮於鋁箔中；6.在37℃下培育反應物20小時；7.在培育期結束時，以50μL終止緩衝液(0.2M碳酸氫鈉，pH 10.1)停止反應且充分混合；及8.在75之增益下在360/460激發/發射下讀取螢光。
7.18 酵素介導之自DBS釋放核酸
在公眾健康社區中普遍將收集在濾紙上之乾血點(DBS)用於傳染性疾病、新生兒測試及SCIDS的基於核酸之測試。在基於核酸之測試方案(諸如PCR)中，將整個DBS樣本插入PCR管中且擴增。對於微滴致動器上之核酸測試，可在分析之前自濾紙萃取DBS樣本。然而，當使用化學萃取法時自DBS樣本釋放核酸(例如DNA及RNA)困難且低效，且可能導致將目標核酸濃度粗略低估多達幾個數量級。自DBS樣本萃取核酸之低效性歸因於核酸分子與濾紙纖維之物理相互作用(例如纏結)。
在公眾健康社區中普遍將收集在濾紙上之DBS用於傳染性疾病、新生兒測試及SCIDS的基於酵素之測試。對於微滴致動器上的基於酵素之測試，可在分析之前自濾紙萃取DBS樣本。然而，當使用化學萃取法時自DBS 樣本釋放酵素困難且低效，且可能導致將目標酵素酸濃度粗略低估多達幾個數量級。自DBS樣本萃取酵素之低效性已歸因於酵素分子與濾紙纖維之物理相互作用(例如纏結)。
本發明提供使用酵素來釋放收集於濾紙上之DBS樣本中之核酸的方法。在一個具體實例中，諸如纖維素酶之纖維素降解酵素可用以部分或完全溶解濾紙基質以將樣本中之實質上所有核酸釋放至萃取緩衝液中。在一個實例中，來自裏氏木黴(Trichoderma reesei)(先前稱作綠色木黴(T.viride))之纖維素酶複合物可用以釋放收集於濾紙上之DBS樣本中之核酸。來自裏氏木黴(T.reesei)之纖維素酶複合物將纖維素定量轉化為葡萄糖。自收集於濾紙上之DBS釋放核酸的試驗台上方案之實例可包括以下：可用水性緩衝液洗滌(例如兩次或三次)DBS樣本以自DBS移除可溶性PCR抑制性組分。可將經洗滌DBS樣本與纖維素降解酵素(諸如來自裏氏木黴之纖維素酶)一起培育以釋放DBS中之核酸。可使用基於磁性珠粒之方案濃縮樣本中之核酸以減小樣本體積，隨後將經萃取血液樣本加載於微滴致動器上。可將濃縮之DBS萃取物加載於微滴致動器之樣本分配儲集器上且使用數位微流體方案來分配以便定量PCR分析。
該方法可用於本文所述之酵素試驗。在一個具體實例中，諸如纖維素酶之纖維素降解酵素可用以部分或完全溶解濾紙基質以將樣本中之實質上所有酵素釋放至萃取緩衝液中。
7.19 膽紅素、G6PD及CH新生兒測試之數位微流體平台
本發明提供一種用於多工測試新生兒之數位微流體平台及試驗法。數位微流體平台包括多孔微滴致動器，其可組態用於新生兒測試之一或多種 分子試驗。因為數位微流體之軟體可程式性，所以大部分參數在方案之間及在方案內變化，諸如培育時間、試劑添加順序及熱程式可容易地調整以適於不同試驗方案。
在一個具體實例中，數位微流體平台可組態用於多工測試處於高膽紅素血症及其最常見潛在病理學原因，葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)缺乏症及先天性甲狀腺功能低下(CH)之風險中的新生兒。測定總膽紅素、G6PD活性及CH(亦即TSH試驗)之試驗台上試驗可作為個別基於微滴之逐步方案描述且在微滴致動器上實施。試驗方案參數可例如針對線性、高敏感性(偵測極限)、特異性、微滴留存物(droplet carryover)及較短的產生結果所需之時間來選擇。
微滴致動器可經設計為裝配於容納在微滴致動器外部之其他組件之儀器組中，或以其他方式電耦合至該儀器組。外部組件之實例包括(但不限於)一或多個用於固定磁反應性珠粒之磁體、一或多個用於控制特定處理區中之溫度之加熱器總成，及偵測系統。
7.19.1 總膽紅素試驗
測定總膽紅素(血清或血漿)含量之試驗可經調整以適於在微滴致動器上使用。在一個實例中，可獲自Teco Diagnostics之總膽紅素試驗套組(B576-480)可經調整以適於在微滴致動器上使用。總膽紅素試驗為基於膽紅素與重氮化磺胺酸之間產生偶氮膽紅素之反應的比色試驗，偶氮膽紅素在560nm波長下在二甲亞碸(DMSO)溶劑存在下具有最大吸光度。套組包括以下試劑：總膽紅素試劑(32mM磺胺酸、165mM鹽酸、7M二甲亞碸(55% w/v))；及膽紅素亞硝酸鹽試劑(60mM亞硝酸鈉)；膽紅素校準 物(20mg/dL N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽)。工作試劑及校準溶液在試驗台上如下製備：在各實驗之前在試驗台上藉由將50μL亞硝酸鈉試劑添加至1.0mL總膽紅素試劑中來製備總膽紅素工作試劑。在試驗台上藉由使用去離子水稀釋20mg/dL校準物儲備液以3、7、10、14及20mg/dL製備膽紅素校準物溶液。
圖28A及28B分別顯示在晶片上獲得之膽紅素校準曲線圖2800及試驗台上值之散佈圖2850。自杜克大學(Duke University)(Durham,NC)，連同總膽紅素值一起獲得棄置及身分無法鑑別之嬰兒血清樣本。在晶片上試驗之前(例如之前一日)進行試驗台上參考試驗(杜克法(Duke Method))。將所製備之試劑、校準物及血清樣本加載於微滴致動器之流體分配儲集器上。晶片上試驗方案包括以下步驟：對於校準，使用微滴操作將校準物1×微滴與工作試劑之兩個1×微滴組合以得到3×微滴。使用微滴操作將3×微滴分裂成1×微滴及2×微滴。使1×微滴與工作試劑之兩個1×微滴組合。對於血清空白樣本，使用微滴操作將血清之1×微滴與總膽紅素試劑之兩個1×微滴組合以得到3×微滴。使用微滴操作將3×微滴分裂成1×微滴及2×微滴。使1×微滴與總膽紅素試劑之兩個1×微滴組合。對於未知之血清膽紅素，使用微滴操作將血清之1×微滴與工作試劑之兩個1×微滴組合以得到3×微滴。在37℃下培育組合之微滴歷時5分鐘。使用微滴操作將3×微滴分裂成1×微滴及2×微滴。使1×微滴與工作試劑之兩個1×微滴組合。在37℃下培育組合之微滴歷時約5分鐘。使用LED光電二極體比色計在560nm波長下讀取吸光度。所有實驗均於三個不同微滴致動器上一式三份進行。對於試驗台上實驗與晶片上實驗，校準曲線均藉由Microsoft Excel®中之線性回歸分析來獲 得。將血清吸光度減去血清空白樣本之吸光度。使用回歸方程，使用空白樣本校正之血清吸光度值來獲得未知之膽紅素值。使用電濕潤介導之微滴操作在矽油中進行實驗。
數據顯示校準曲線為線性，直至20mg/dL。檢查散佈圖表明當與試驗台上參考試驗相比時在筒上之試驗中存在小比例之偏差。此可在使用膽紅素試驗之重氮方法時預期。相關性良好且可藉由同時進行參考試驗與晶片上試驗來改良。在此實例中，在參考測試與晶片上試驗之間存在約一日之延遲。膽紅素為極不穩定之分析物且方法比較理想地應同時進行。在另一實例中，作為高膽紅素血症之標誌物的直接膽紅素測試可經調整以適於在微滴致動器上使用。
7.19.2 G6PD試驗
葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)缺乏症之新生兒測試測試套組為市售且可經調整以適於在微滴致動器上使用。在一個實例中，可獲自Interscientific公司之G6PD缺乏症新生兒測試測試套組可經調整以適於在微滴致動器上使用。該試驗係基於在葡萄糖-6-磷酸去氫酶存在下葡萄糖-6-磷酸鹽氧化為6-磷酸葡糖酸鹽，及NADP還原為NADPH。在甲基硫酸吩(phenazine methosulfate)存在下，所產生之NADPH還原四唑鎓染料(MTT)以產生在565nm具有吸收峰之有色產物。套組包括以下試劑：R1(溶離/溶解緩衝液)、R2(工作試劑)、R3(呈色試劑)、R4(CRB；呈色試劑緩衝液)。為製備工作呈色試劑，在試驗台上將1份CRB(R4)與10份呈色試劑(R3)混合在一起。套組亦包括代表正常、中間及不足G6PD值之試驗對照。
圖29顯示在晶片上進行之G6PD試驗之圖2900。嬰兒全血樣本(n=8 個推測正常樣本)獲自杜克大學。將所製備之試劑、試驗對照(正常、中間及不足)及全血樣本(n=8個推測正常)加載於微滴致動器之流體分配儲集器上。全血樣本及對照物之晶片上試驗方案包括以下步驟：使用微滴操作將全血(或對照)之1×微滴與溶離/溶解緩衝液(R1)之三個1×微滴組合且培育1分鐘。使用微滴操作分裂組合之4×微滴，得到1×微滴及3×微滴。使用微滴操作將1×微滴與工作試劑(R2)之1×微滴組合且培育30秒。使用微滴操作分裂組合之2×微滴，得到兩個1×微滴。使用微滴操作將一個1×微滴與工作試劑(R2)之兩個1×微滴組合且培育30秒。使用微滴操作將組合之3×微滴分裂成1×微滴及2×微滴。使用微滴操作將2×微滴傳輸至偵測點且在405nm波長下讀取吸光度以作血色素校正。使用微滴操作將剩餘1×微滴與1×工作呈色試劑微滴組合且在560nm波長下以動力學模式讀取吸光度。樣本濃度可使用下式表述：
數據顯示在晶片上G6PD試驗中不足、中間及正常樣本之間的良好分離。
7.19.3 先天性甲狀腺功能低下(CH)試驗
目前在一些新生兒測試程式中使用初級促甲狀腺素(TSH)試驗來篩選先天性甲狀腺功能低下(CH)。測定TSH含量之試驗可經調整以適於在微滴致動器上使用。在一個實例中，可獲自Beckman Coulter之Access HYPERsensitive hTSH套組(目錄號33820)可經調整以適於在微滴致動器上 使用。該試驗為用於定量測定人類促甲狀腺激素(hTSH)之順磁粒子化學發光試驗。套組包括以下試劑：塗有一次捕捉抗體之順磁珠粒、阻斷溶液及鹼性磷酸酶(ALP)標記之二次抗體。Attoglow(Michigan Diagnostics)可用作化學發光受質。
圖30顯示晶片上產生之TSH校準曲線之圖3000。在試驗台上藉由混合等體積之結合於磁反應性珠粒之一次抗體、阻斷溶液及ALP標記之二次抗體來製備試劑混合物。將所製備之試劑混合物、TSH標準物(在不同濃度下)、洗滌緩衝液及化學發光受質加載於微滴致動器之流體分配儲集器上。晶片上試驗方案包括以下步驟：使用微滴操作將試劑混合物之1×微滴(nL)與TSH標準物之兩個1×微滴組合且在室溫下培育4分鐘。培育期之後，如下洗滌磁反應性珠粒以移除任何未結合之二次抗體：使用外部永久磁體將珠粒固定於4×反應微滴之邊緣，及藉由活化相鄰電極且去活化中間電極來移除過量未結合之物質。使化學發光受質之一個1×微滴與含有珠粒之微滴組合。培育2分鐘後，使用光子計數光電倍增管量測終點化學發光。使用4參數邏輯擬合來擬合數據。誤差杠表示四個不同試驗之標準差。大多數測試實驗室(美國)所用之TSH截止濃度為20μL U/mL。
在另一實例中，化學發光TSH試驗可經調整以適於在微滴致動器上用作比色試驗。在此實例中，鹼性磷酸酶(ALP)標記之二次抗體可與諸如磷酸對硝基苯酚(偵測波長405nm)之比色受質一起用於偵測ALP。可選擇試驗參數以便提高比色試驗中之敏感性。舉例而言，與一次捕捉珠粒一起培育之樣本體積可自約0.3μL增加至約25μL。偵測反應時間可例如自約2分鐘增加至約15分鐘。試驗溫度可例如自室溫增加至37℃。在偵測視窗 之路徑長度可例如自約0.3mm增加至約1mm。
7.19.4 微滴致動器上之多工膽紅素、G6PD及TSH試驗
圖31說明微滴致動器上之總膽紅素、G6PD及TSH之多工新生兒測試方案3100之實例的流程圖。方案3100可包括(但不限於)以下步驟：在一個步驟中，使用100μL毛細血液收集管(例如來自Ram Scientific之SAFE-T-FILL®收集管)刺紮腳跟收集全血樣本(例如約100μL)。在另一步驟中，將全血等分試樣(例如約10μL)轉移至微滴致動器之流體儲集器中以進行G6PD試驗。在另一步驟中，離心剩餘全血樣本(例如約90μL)以獲得血清。在一個具體實例中，可使用試驗台上型離心機自全血分離血清。在另一具體實例中，可使用晶片上分離方法(例如橫向流過濾器)自全血製備血清。在另一步驟中，將血清等分試樣(例如約30μL)轉移至微滴致動器之另一流體儲集器中以便分配用於進行總膽紅素及TSH試驗。對於膽紅素試驗，使用約0.5μL血清。對於TSH試驗，使用約25μL血清。
圖32顯示經組態在微滴致動器上進行多工總膽紅素、G6PD及TSH試驗之微滴致動器的電極配置3200之實例的俯視圖。在此實例中，微滴致動器經組態對6個樣本進行3重試驗。微滴致動器可包括底部基板(圖中未示)及頂部基板(圖中未示)，其由間隙隔開。底部基板可例如為印刷電路板(PCB)。電極配置3200可安置於底部基板上。間隙以諸如聚矽氧油之填充流體填充。提供頂部基板中之孔口(圖中未示)用於將油填充流體引入筒中且.將試劑及樣本流體分配至各晶片上分配儲集器中。流體分配儲集器與分配電極對齊且可用以將液體通過流體路徑傳遞至微滴致動器之間隙中 及各晶片上分配儲集器電極中。在一個具體實例中，包括填充流體(例如油)之批量液體試劑可提供於滴瓶中以便於試劑加載且將吸移步驟減到最少，吸移步驟可由機器人進行。因為試劑之精密等分在微滴致動器內使用基於電濕潤之微滴操作進行，所以易耐受流體輸入體積之變化。無水試劑可提供於計量式容器中，在該等計量式容器中其可經復原且必要時經冷凍。
電極配置3200包括多個流體分配儲集器電極，其可例如經分派作為用於分配樣本流體(例如全血、血漿或血清)之樣本分配儲集器電極3210(例如12個樣本分配儲集器電極3210a至3210l)、用於分配試劑流體之試劑分配儲集器電極3212(例如12個試劑分配儲集器3212a至3212l)、洗滌緩衝液分配儲集器3214、受質分配儲集器3216，及廢料收集點3218。在一個實例中，試劑分配儲集器電極3212a至3212c可用以分配TSH試驗之試劑(例如一次抗體及二次抗體、校準調節劑)；試劑分配儲集器電極3212d至3212f可用以分配總膽紅素試驗之試劑(例如試劑及校準物)；試劑分配儲集器電極3212g及3212h可用以分配稀釋緩衝液；試劑分配儲集器電極3212i至3212l可用以分配G6PD試驗之試劑(例如溶解緩衝液、試劑、標準物)。樣本分配儲集器3210可用以分配來自六個不同樣本組之血漿及全血樣本。舉例而言，樣本分配儲集器電極3210a及3210b可分別用以分配來自第一樣本之血漿及全血；樣本分配儲集器電極3210c及3210d可分別用以分配來自第二樣本之血漿及全血；樣本分配儲集器電極3210e及3210f可分別用以分配來自第三樣本之血漿及全血；樣本分配儲集器電極3210g及3210h可分別用以分配來自第四樣本之血漿及全血；樣本分配儲集器電極3210i及3210j可分別用以分配來自第五樣本之血漿及全血；樣本分配儲集器電極3210k及3210l 可分別用以分配來自第六樣本之血漿及全血。
樣本分配儲集器電極3210、試劑分配儲集器電極3212、洗滌緩衝液分配儲集器電極3214、受質分配儲集器電極3214及廢料收集點3218經由微滴操作電極3220(例如電濕潤電極)之配置(諸如路徑或陣列)互連。微滴操作在微滴操作電極3220之頂上在微滴操作表面上進行。自各樣本分配電極延伸之微滴操作電極3220之路徑形成專用電極泳道3222，亦即12條專用電極泳道3222a至3222l。專用電極泳道3222證明處理不同樣本及樣本類型(亦即血漿及全血)之個別反應區。使用樣本微滴之專用泳道將樣本間交叉污染減到最少。
一或多個磁體3224(例如六個磁體3224a至3224f)可經定位接近於特定微滴操作電極3220以便滯留一定量之磁反應性珠粒。各磁體3224可例如為永久磁體或電磁體。各磁體3224以確保在洗滌步驟期間間隔固定磁反應性珠粒之方式定位。混合及培育可在遠離磁體之特定微滴操作電極3220上進行。
電極配置3200包括多個偵測電極3226(例如12個偵測電極3226a至3226l)。偵測電極3226經定位接近於各專用電極泳道3222中之特定微滴操作電極。針對樣本微滴使用獨立偵測電極將樣本間交叉污染減到最少。偵測電極3226可製造為如參考圖33所述之光學透明電極。如參考圖34所述，偵測電極3226可與特定光學偵測通道(例如560nm通道或405nm通道)對齊。
因為微滴致動器之靈活性及可程式性，所以微滴致動器之架構可容易地經組態以容納較少或較多樣本。
對於總膽紅素及G6PD試驗，因為在所需範圍內，試驗實質上為線性的，所以可在晶片上產生單點校準曲線。對於TSH試驗，可針對每一微滴致動器批號或試劑批次產生主校準曲線。校準調節劑可在晶片上運作以對校準曲線進行調節。此方法常用於免疫試驗分析儀中。可運作陽性及陰性對照物以鑑別系統誤差，諸如有缺陷微滴致動器或不良試劑批次。可進行詳細之設計失效模式與效應分析(Design Failure Modes and Effects Analysis/FMEA)以鑑別外部與內部品質控制需要。
圖33說明微滴致動器3300之一部分的俯視圖，該微滴致動器3300包括適於偵測比色反應產物之光學透明偵測電極。微滴致動器3300可包括底部基板3310。底部基板3310可例如為PCB。微滴操作電極3312(例如電濕潤電極)之配置(諸如路徑或陣列)可安置於底部基板3310上。微滴操作在微滴操作電極3312之頂上在微滴操作表面上進行。微滴致動器3300可包括偵測電極3314。偵測電極3314中可製造金屬穿孔3316。金屬穿孔3316可例如製造為未填充之通孔。金屬穿孔3316之直徑可例如為約250μm。金屬穿孔3316提供通過底部基板3310之光透射(例如自LED)。因為金屬穿孔3316相對於偵測電極3314之尺寸足夠小(例如約1000μm)，所以電濕潤效能實質上未受影響。
7.19.5 儀器台
在一個具體實例中，本發明提供一種適用於有限資源配置之儀器台。在一個具體實例中，儀器可為試驗台上型輕質攜帶型小型儀器。在另一具體實例中，儀器可為電池供電(例如8 AA電池)之小型手持型裝置(例如約10〃×5〃×5〃)。儀器容納在微滴致動器外部之組件。外部組件之實例包 括(但不限於)一或多個用於固定磁反應性珠粒之磁體、一或多個用於控制特定處理區中之溫度之加熱器總成，及偵測系統。定位於儀器組中之微滴致動器可使用電控制器來控制，電控制器例如具有微處理器及轉換電路以控制108個高電壓電I/O。電子介面可例如使用彈簧加載之連接銷以與微滴致動器電接觸。在此實例中，控制器及軟體獨立地提供108個高壓通道之轉換。可選擇對轉換電路具有不同程度控制之高程度使用者親和套裝軟體以滿足終端使用者之需求。
可使用儀器中之一或多個可撓性加熱電路及被動冷卻來控制微滴致動器上特定處理區中之溫度。因為僅加熱特定處理區，所以在儀器使用期間之電力消耗實質上減小。加熱器溫度、加熱器功率及微滴溫度之間的關係可視加熱器總成與微滴致動器之間的熱接觸而定。可選擇加熱器總成物質以在加熱器總成/微滴致動器界面提供可再現之低熱阻接觸。舉例而言，可使用導熱性彈性體來幫助將箔加熱器構形成微滴致動器特徵。在另一實例中，可在微滴致動器上提供熱學子系統。舉例而言，加熱元件(例如網版印刷)可直接製造於微滴致動器上。因為在微滴致動器上提供加熱元件，所以在儀器使用期間之電力消耗可進一步減小。
圖34說明用於偵測比色反應產物之偵測系統3400的實例之透視圖。偵測系統3400可包括多個激發LED 3410，其與多個偵測器3412對齊。偵測器3412可例如為光電二極體。在一個實例中，LED 3410定位於儀器組3414下方且與定位於儀器組3414頂上之偵測器3412對齊。舉例而言，偵測系統3400可包括四個LED(例如LED 3410a至3410d)，其與四個偵測器3412(例如偵測器3412a至3412d)對齊。可選擇LED 3410及偵測器3412以提供一 或多種光波長之光學通道。舉例而言，可選擇LED 3410及偵測器3412以提供膽紅素及G6PD新生兒測試試驗所需之560nm波長的光學通道，及血色素量測及TSH試驗所需之405nm波長的光學通道。
微滴致動器3416可定位於儀器組3414中接近成像系統3400。特定言之，微滴致動器3416可經定位以使得微滴致動器3416上之一或多個偵測電極(例如4個偵測電極；圖中未示)實質上與偵測系統3400對齊。
本發明之新生兒測試儀器台為低成本攜帶型低維護儀器。該儀器台適用於有限資源配置(例如開發中國家，諸如中國及印度)及新生兒測試環境，諸如產科醫院或出生中心實驗室。
7.20 微滴致動器上之山菲立普(Sanfilippo)A(MPS ⅢA)及B(MPS ⅢB)症候群之酵素試驗
本發明提供於微滴致動器上偵測山菲立普A(MPS IIIA)及B(MPS)症候群之試驗法。山菲立普A症候群及山菲立普B症候群分別由溶酶體酵素硫酸肝素磺醯胺酶(SGSH)及α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶(NAGLU)活性不足引起。在一個具體實例中，本發明提供生物樣本中硫酸肝素磺醯胺酶活性之基於微滴之酵素試驗的方法。酵素試驗之樣本可例如為乾燥血液萃取物微滴。硫酸肝素磺醯胺酶活性的基於微滴之酵素試驗可例如在約6之pH值下進行。酵素試驗中之硫酸肝素磺醯胺酶之受質流體可例如為螢光受質4-甲基繖酮基-α-N-磺基-D-葡萄胺糖(MU-α GlcNS；Moscerdam Substrates)。自MU-α GlcN受質產生螢光信號需要兩種酵素(硫酸肝素磺醯胺酶及補充之第二酵素α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶)之活性。在此試驗中，硫酸肝素磺醯胺酶首先作用於MU-α GlcNS受質流體，得到4-MU-α GlcNH2 中間物。第二酵素α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶作用於4-MU-α GlcNH2中間物以釋放4-甲基繖酮基(4-MU)，從而產生螢光信號。在無硫酸肝素磺醯胺酶存在下，不形成4-MU-α GlcNH2中間物且不產生螢光信號。在一個實例中，補充之α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性可藉由使用酵母α-葡糖苷酶來提供。在另一實例中，補充之α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性可藉由使用重組α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶來提供。
在另一具體實例中，本發明提供生物樣本中α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶(NAGLU)活性進行基於微滴之一步酵素試驗的方法。酵素試驗之樣本可例如為乾燥血液萃取物微滴。酵素試驗中α-N-乙醯葡糖胺糖苷酶之受質流體可例如為螢光受質4-甲基繖酮基-α-D-N-乙醯胺基葡萄糖(Moscerdam Substrates)。
其他具體實例可利用本文所述之經修飾之繖酮基受質。
7.21 微滴致動器上之異染性白質失養症(Metachromatic Leukodystrophy/MLD)及馬拉二氏症候群(Maroteaux-Lamy Syndrome/MPS VI)之酵素試驗
本發明提供於微滴致動器上偵測異染性白質失養症(MLD)及馬拉二氏症候群之試驗法。MLD及MPS VI分別由溶酶體酵素芳基硫酸酯酶A及芳基硫酸酯酶B之活性不足引起。測定芳基硫酸酯酶A及芳基硫酸酯酶B活性之當前基於試驗台之試驗作為個別基於微滴之逐步方案描述且在微滴致動器上實施。在一個具體實例中，使用比色受質對硝基兒茶酚硫酸鹽(PNCS；Sigma)之方案可經調整以適於在微滴致動器上使用。在一個實例中，使用PNCS來偵測芳基硫酸酯酶A活性之基於試驗台之方案可經調整 以適於在微滴致動器上使用。在基於試驗台之試驗中，試驗緩衝液為50mM NaOAc、0.5M NaCl(pH 4.5)。在37℃之反應溫度下，PNCS可用作偵測芳基硫酸酯酶A與芳基硫酸酯酶B活性之受質。對於芳基硫酸酯酶A活性(亦即MLD)之特異性偵測，在0℃下進行酵素試驗。在516nm下讀取吸光度。基於試驗台之方案轉為基於微滴之方案可例如包括反應組分(例如試驗緩衝液、pH值及反應體積)及培育時間之修改。微滴致動器可例如經組態用於吸光度(比色)偵測。微滴致動器可經設計以裝配於儀器組上，該儀器組容納微滴致動器外部特徵，諸如用於進行芳基硫酸酯酶A特異性反應(亦即MLD)之冷卻總成(例如0℃)，及用於偵測比色反應產物之偵測系統。
在另一實例中，使用PNCS來偵測芳基硫酸酯酶B活性之基於試驗台之方案可經調整以適於在微滴致動器上使用。在基於試驗台之試驗中，試驗緩衝液為50mM MES(pH 6.5)。在516nm下讀取吸光度。基於試驗台之方案轉為基於微滴之方案可例如包括反應組分(例如試驗緩衝液、pH值及反應體積)及培育時間之修改。微滴致動器可例如經組態用於吸光度(比色)偵測。微滴致動器可經設計以裝配於儀器組上，該儀器組容納微滴致動器外部特徵，諸如用於偵測比色反應產物之偵測系統。
在另一具體實例中，諸如3-O-硫酸酯-β-D-半乳糖-4-甲基繖酮基之螢光受質可用於偵測芳基硫酸酯酶A活性(亦即MLD)。自3-O-硫酸酯-β-D-半乳糖-4-甲基繖酮基受質產生螢光信號需要兩種酵素(芳基硫酸酯酶A及補充之第二酵素β-半乳糖苷酶)之活性。在此試驗中，芳基硫酸酯酶A首先作用於3-O-硫酸酯-β-D-半乳糖-4-甲基繖酮基受質流體，得到4-甲基繖酮基-β-D-半乳糖中間物。第二酵素β-半乳糖苷酶作用於4-甲基繖酮基-β-D- 半乳糖以釋放4-甲基繖酮基(4-MU)，從而產生螢光信號。在無芳基硫酸酯酶A存在下，不形成4-甲基繖酮基-β-D-半乳糖中間物且不產生螢光信號。可選擇補充性β-半乳糖苷酶使得酵素對3-O-硫酸酯-β-D-半乳糖-4-半乳糖-4-甲基繖酮基實質上不具有活性。在一個實例中，補充之β-半乳糖苷酶活性可藉由使用牛睾丸β-半乳糖苷酶來提供。在另一實例中，補充之β-半乳糖苷酶活性可藉由使用人類半乳糖腦苷酶來提供。
7.22 系統
螢光及吸光度偵測可於諸如參考圖11所述之微滴致動器裝置的單一微滴致動器上進行。微滴致動器上之螢光偵測及/或在一些具體實例中吸光度偵測之路徑長度可例如為約300μm。因為路徑長度小，所以其可適用於減少DBS萃取物中之血色素干擾。舉例而言，在LSD測試試驗中，DBS萃取物中之血色素不實質上影響在365nm下之螢光。微滴致動器裝置可進一步經調整以達成增加之偵測靈敏度。在一個實例中，可選擇填充流體以實質上將反應產物向填充流體中之分配減到最小。在另一實例中，可選擇微滴致動器之底部基板及/或頂部基板上之基板塗層以實質上將背景螢光減到最小。另外，基於光電倍增器之偵測系統中之適當濾波器可用以提高偵測靈敏度。在又一實例中，因為試驗為酵素試驗，所以受質流體可過量添加以歷經較長時段得到較好信號。在又一實例中，可添加諸如DMSO及其他離子界面活性劑之添加劑以提高反應產物在水性微滴內之溶解性。
本發明之各種態樣可以方法、系統、電腦可讀媒體及/或電腦程式產品之形式實施。本發明之態樣可採用硬體具體實例、軟體具體實例(包括韌體、常駐軟體、微碼等)，或組合軟體與硬體態樣之具體實例(在本文中可 能所有均一般稱作「迴路」、「模組」或「系統」)的形式。此外，本發明之方法可採用電腦可用儲存媒體上之電腦程式產品的形式，在該媒體中實施電腦可用程式碼。
任何適合之電腦可用媒體均可用於本發明之軟體態樣。電腦可用或電腦可讀媒體可為例如(但不限於)電子、磁性、光學、電磁、紅外或半導體系統、儀器、裝置或傳播媒體。電腦可讀媒體可包括暫時性及/或非暫時性具體實例。電腦可讀媒體之更特定實例(非詳盡清單)將包括一些或所有以下各者：具有一或多根電線之電連接、攜帶型電腦磁片、硬碟、隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、可抹除可程式化唯讀記憶體(EPROM或快閃記憶體)、光纖、攜帶型光碟唯讀記憶體(CD-ROM)、光學儲存裝置、傳輸媒體(諸如支援網際網路或企業內部網路之傳輸媒體)，或磁性儲存裝置。應注意，電腦可用或電腦可讀媒體甚至可為上面印刷有式之紙張或另一適合媒體，該程式可經由例如對紙張或其他媒體之光學掃描來以電子方式捕捉，接著經編譯、解譯或另外必要時以適合之方式處理，接著儲存於電腦記憶體中。在本文件之上下文中，電腦可用或電腦可讀媒體可為任何可含有、儲存、傳達、傳播或傳輸由指令執行系統、儀器或裝置使用或與執行系統、儀器或裝置相關使用的程式之媒體。
實現本發明之操作的程式碼可寫入物件導向程式語言，諸如Java、Smalltalk、C++或其類似語言。然而，實現本發明之操作的程式碼亦可寫入程序程式設計語言，諸如「C」程式設計語言或類似程式設計語言。程式碼可由處理器、特殊應用積體電路(ASIC)或執行程式碼之其他組件來執行。程式碼可簡稱為儲存於記憶體(諸如上文論述之電腦可讀媒體)中之軟體 應用程式。程式碼可使得處理器(或任何處理器控制裝置)產生圖形使用者介面(「GUI」)。圖形使用者介面可於顯示裝置上以視覺方式產生，然而圖形使用者介面亦可具有可聞特徵。然而，程式碼可在任何處理器控制裝置(諸如電腦、伺服器、個人數位助理、電話、電視，或任何利用處理器及/或數位信號處理器之處理器控制裝置)中操作。
程式碼可在本地及/或遠程執行。程式碼例如可完全或部分儲存於處理器控制裝置之本地記憶體中。然而，程式碼亦可至少部分遠程儲存、存取，及下載至處理器控制裝置。使用者電腦例如可完全執行程式碼或僅部分執行程式碼。程式碼可為獨立套裝軟體，其至少部分在使用者電腦上及/或在遠程電腦上部分執行或完全在遠程電腦或伺服器上。在後一情況下，遠程電腦可經由通信網路連接至使用者電腦。
不論網路連結環境如何，本發明均可應用。通信網路可為在射頻域及/或網際網路協定(IP)域中操作之電纜網路。然而，通信網路亦可包括分佈式計算網路，諸如網際網路(有時或者稱為「全球資訊網(World Wide Web)」、企業內部網路、局域網(LAN)及/或廣域網(WAN)。通信網路可包括同軸電纜、銅線、光纖線及/或雜合同軸線(hybrid-coaxial line)。通信網路可甚至包括利用任何部分之電磁光譜及任何信號傳導標準物(諸如IEEE 802家族之標準物，GSM/CDMA/TDMA，或任何蜂窩標準物，及/或ISM帶)的無線部分。通信網路可甚至包括電源線部分，其中信號經由電線來傳達。本發明可應用於任何無線/纜線通信網路，而不論物理元件部分、物理組態或通信標準如何。
參考各種方法及方法步驟描述本發明之某些態樣。應瞭解，各方法步 驟可由程式碼及/或由機器指令來實施。程式碼及/或機器指令可產生實施方法中指定之功能/行動的手段。
程式碼亦可儲存於可引導處理器、電腦或其他可程式資料處理儀器以特定方式起作用之電腦可讀記憶體中，使得儲存於電腦可讀記憶體中之程式碼產生或轉化包括實施方法步驟之各種態樣的指令手段之製品。
程式碼亦可加載於電腦或其他可程式資料處理儀器上以使一系列操作步驟進行以產生處理器/電腦實施之處理，使得程式碼提供實施本發明方法中指定之各種功能/行動的步驟。
8.總結性陳述
具體實例之前述實施方式提及說明本發明之特定具體實例的隨附圖式。具有不同結構及操作之其他具體實例不脫離本發明之範疇。術語「本發明」或其類似術語關於本說明書中所述之申請者之發明的許多替代性態樣或具體實例之某些特定實例來使用，且其使用與其不存在均不意欲限制申請者之發明的範疇或申請專利範圍之範疇。僅為了讀者方便將本說明書分為各章節。不應將標題視為限制本發明之範疇。定義意欲作為本發明描述的一部分。應瞭解，本發明之各種細節可在不脫離本發明之範疇的情況下變化。此外，前述描述僅為了說明之目的，且不為限制之目的。
100‧‧‧酵素試驗方案的流程圖

Claims (14)

  1. 一種水解酵素受質之方法，該方法包含：(a)在與油接觸之水性微滴中，以該受質形成包合複合物；及(b)水解該受質；且其中該受質為含有4-MU或HMU之受質。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使用環糊精以形成該包合複合物。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該環糊精包含羥丙基-β-環糊精。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中羥丙基-β-環糊精之濃度包含約5mM至約15mM。
  5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中羥丙基-β-環糊精之濃度包含約7mM至約13mM。
  6. 如申請專利範圍第3項之方法，其中羥丙基-β-環糊精之濃度包含約9mM至約11mM。
  7. 如申請專利範圍第3項之方法，其中羥丙基-β-環糊精之濃度包含約9.5mM至約11.5mM。
  8. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該環糊精包含甲基-β-環糊精。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中甲基-β-環糊精之濃度包含約1mM至約20mM。
  10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中甲基-β-環糊精之濃度包含約5mM至約15mM。
  11. 如申請專利範圍第8項之方法，其中甲基-β-環糊精之濃度包含約7 mM至約13mM。
  12. 如申請專利範圍第8項之方法，其中甲基-β-環糊精之濃度包含約9mM至約11mM。
  13. 如申請專利範圍第8項之方法，其中甲基-β-環糊精之濃度包含約9.5mM至約11.5mM。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該水性微滴被油包圍。
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