TW201420115A - 醣結合方法及組合物 - Google Patents

醣結合方法及組合物 Download PDF

Info

Publication number
TW201420115A
TW201420115A TW102129348A TW102129348A TW201420115A TW 201420115 A TW201420115 A TW 201420115A TW 102129348 A TW102129348 A TW 102129348A TW 102129348 A TW102129348 A TW 102129348A TW 201420115 A TW201420115 A TW 201420115A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sugar
conjugate
capsular polysaccharide
polysaccharide
carrier protein
Prior art date
Application number
TW102129348A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI480049B (zh
Inventor
Jianxin Gu
Jin-Hwan Kim
A Krishna Prasad
Yu-Ying Yang
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of TW201420115A publication Critical patent/TW201420115A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI480049B publication Critical patent/TWI480049B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

本發明提供eTEC連接之醣結合物，其包含醣經由(2-((2-側氧基(oxo)乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔體共價結合至載體蛋白；包含該等醣結合物之免疫原性組合物；以及該等醣結合物及免疫原性組合物之製備方法及用途。

Description

醣結合方法及組合物
本發明概言之係關於醣結合物，其包含經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔體共價結合至載體蛋白之醣；包含該等醣結合物之免疫原性組合物；以及該等醣結合物及免疫原性組合物之製備方法及用途。
幾十年來已利用藉由將差免疫原性分子結合至「載體」分子來增加該等分子之免疫原性的方法(例如，參見Goebel等人，(1939)J.Exp.Med.69：53)。舉例而言，已闡述許多免疫原性組合物，其中純化莢膜聚合物結合至載體蛋白以藉由利用此「載體效應」產生更有效之免疫原性組合物。Schneerson等人，(1984)Infect.Immun.45：582-591)。亦已顯示結合可避免在經自由多醣免疫時通常在嬰兒中觀察到之差抗體反應(Anderson等人，(1985)J.Pediatr.107：346；Insel等人，(1986)J.Exp.Med.158：294)。
已使用各種交聯或偶合試劑(例如同雙官能基、異雙官能基或零長度之交聯劑)成功地產生結合。目前許多方法可用於使免疫原性分子(例如醣、蛋白質及肽)與肽或蛋白載體偶合。大多數方法產生胺、醯胺、胺基甲酸酯、異硫脲或二硫鍵，或在一些情形下產生硫醚。使用將反應位點引入載體及/或免疫原性分子上之反應性胺基酸分子之側鏈中的交聯或偶合試劑的缺點在於，反應位點若未經中和則自由地 與任何不期望分子在活體外反應(由此潛在有害地影響結合物之功能及穩定性)或在活體內反應(由此在經製劑免疫之人或動物中提出不良事件之潛在風險)。可使用各種已知化學反應使該等過量反應位點反應或「經封端」，以便使該等位點滅活，但該等反應原本可破壞結合物之功能。在試圖藉由將反應位點引入載體分子中產生結合時，此可尤其成問題，此乃因其較大大小及更複雜結構(相對於免疫原性分子)可使得其更易於破壞化學治療之效應。因此，業內仍需要製備近似封端之載體蛋白結合物之新方法，以便保持載體之功能且結合保留引發期望免疫反應之能力。
本發明係關於製備醣結合物之方法，該等醣結合物包含經由在本文中稱作(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔體之二價雙異官能基連接體共價結合至載體蛋白的醣。eTEC間隔體包括7個線性原子(亦即，-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)且在醣與載體蛋白之間提供穩定硫醚及醯胺鍵。本發明進一步提供eTEC連接之醣結合物、包含其之免疫原性組合物及使用該等醣結合物及免疫原性組合物之方法。
在一個態樣中，本發明提供包含經由eTEC間隔體結合至載體蛋白之醣的醣結合物，其中醣經由胺基甲酸酯鍵聯共價連接至eTEC間隔體，且其中載體蛋白經由醯胺鍵聯共價連接至eTEC間隔體。
在一些實施例中，醣係多醣，例如源自細菌、具體而言源自病原性細菌之莢膜多醣。在其他實施例中，醣係寡醣或單醣。
本發明之eTEC連接之醣結合物可由通式(I)代表： 其中包含eTEC間隔體之原子包含於中心框中。
納入本發明醣結合物中之載體蛋白係選自通常適於該等目的之載體蛋白之群，如本文進一步闡述或彼等熟習此項技術者所知。在特定實施例中，載體蛋白係CRM197。
在另一態樣中，本發明提供製造醣結合物之方法，該醣結合物包含經由eTEC間隔體結合至載體蛋白之醣，該方法包含以下步驟：a)使醣與碳酸衍生物在有機溶劑中反應以產生活化醣；b)使活化醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使硫醇化醣與還原劑反應以產生包含一或多個自由巰基殘基之活化硫醇化醣；d)使活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵代乙醯胺基團之活化載體蛋白反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白結合物；及e)使硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下物質反應：(i)能夠使活化載體蛋白之未結合α-鹵代乙醯胺基團封端的第一封端劑；及/或(ii)能夠使活化硫醇化醣之未結合自由巰基殘基封端的第二封端劑；藉此產生eTEC連接之醣結合物。
在常見實施例中，碳酸衍生物係1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)。較佳地，碳酸衍生物係CDT且有機溶劑係極性非質子溶劑，例如二甲亞碸(DMSO)。在較佳實施例中，藉由使活化醣與雙官能基對稱硫基烷基胺試劑、胱胺或其鹽反應產生硫醇化醣。或者，硫醇化醣可藉由使活化醣與半胱胺或其鹽反應形成。藉由本發明方法產生之eTEC連接之醣結合物可由通式(I)代表。
在常見實施例中，第一封端劑係N-乙醯基-L-半胱胺酸，其在載體蛋白之離胺酸殘基上與未結合之α-鹵代乙醯胺基團反應以形成經由硫醚鍵聯共價連接至活化離胺酸殘基之S-羧甲基半胱胺酸(CMC)殘基。在其他實施例中，第二封端劑係碘乙醯胺(IAA)，其與活化硫醇化醣之未結合自由巰基反應以提供經封端硫代乙醯胺。通常，步驟e)包含用第一封端劑及第二封端劑封端。在某些實施例中，步驟e)包含 用N-乙醯基-L-半胱胺酸作為第一封端劑及用IAA作為第二封端劑封端。
在一些實施例中，封端步驟e)進一步包含在與第一及/或第二封端劑反應後與還原劑(例如，DTT、TCEP或巰基乙醇)反應。
在一些實施例中，步驟d)進一步包含在活化硫醇化醣與活化載體蛋白反應之前提供包含一或多個α-鹵代乙醯胺基團之活化載體蛋白。在常見實施例中，活化載體蛋白包含一或多個α-溴乙醯胺基團。
在另一態樣中，本發明提供eTEC連接之醣結合物，其包含經由根據本文所揭示之任何方法產生之eTEC間隔體結合至載體蛋白的醣。
對於本發明之每一態樣，在本文所述方法及組合物之特定實施例中，eTEC連接之醣結合物包含醣，其係細菌莢膜多醣，具體而言源自病原性細菌之莢膜多醣。
在一些該等實施例中，eTEC連接之醣結合物包含源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)之肺炎球菌(Pn)莢膜多醣。在具體實施例中，Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
在其他該等實施例中，eTEC連接之醣結合物包含源自腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)之腦膜炎球菌(Mn)莢膜多醣。在具體實施例中，Mn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
在尤佳實施例中，醣係經由eTEC間隔體共價結合至CRM197之細菌莢膜多醣，例如Pn或Mn莢膜多醣。
本文所述組合物及方法可用於多種應用中。舉例而言，本發明之醣結合物可用於產生包含eTEC連接之醣結合物之免疫原性組合 物。該等免疫原性組合物可用於保護接受者免受(例如)病原性細菌(例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌)之細菌感染。
因此，在另一態樣中，本發明提供免疫原性組合物，其包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑，其中醣結合物包含經由eTEC間隔體共價結合至載體蛋白之醣，如本文所述。
在常見實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑，其中醣結合物包含細菌莢膜多醣。
在一些該等實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含源自肺炎鏈球菌之Pn莢膜多醣。在一些具體實施例中，Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
在其他該等實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含源自腦膜炎奈瑟菌之Mn莢膜多醣。在一些具體實施例中，Mn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
在較佳實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含經由eTEC間隔體共價結合至CRM197之細菌莢膜多醣(例如Pn或Mn莢膜多醣)。
在一些實施例中，免疫原性組合物包含佐劑。在一些該等實施例中，佐劑係選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群之基於鋁之佐劑。在一個實施例中，本文所述之免疫原性組合物包含佐劑磷酸鋁。
在另一態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體之細菌感 染、疾病或病況的方法，其包含向該個體投與免疫有效量之本發明免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含含有細菌抗原(例如細菌莢膜多醣)之eTEC連接之醣結合物。
在一個實施例中，感染、疾病或病況與肺炎鏈球菌細菌相關且醣結合物包含Pn莢膜多醣。在另一實施例中，感染、疾病或病況與腦膜炎奈瑟菌細菌相關且醣結合物包含Mn莢膜多醣。
在其他態樣中，本發明提供誘發針對病原性細菌之免疫反應的方法；預防、治療或改善由病原性細菌引起之疾病或病況之方法；及減輕由病原性細菌引起之感染、疾病或病況之至少一種症狀的嚴重程度之方法，在每一情形下皆係藉由向個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的免疫原性組合物來達成，其中醣結合物包含細菌抗原，例如源自病原性細菌之細菌莢膜多醣。
在另一態樣中，本發明提供誘發個體之免疫反應之方法，其包含向個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的免疫原性組合物，其中醣結合物包含細菌抗原，例如細菌莢膜多醣。在較佳實施例中，該方法涉及在個體中產生保護性免疫反應，如本文進一步所述。
在另一態樣中，本發明提供向個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物之免疫原性組合物，以在個體中產生保護性免疫反應，如本文進一步所述。
在又一態樣中，本發明提供對本發明之eTEC連接之醣結合物反應產生之抗體或包含該醣結合物之免疫原性組合物。該等抗體可用於研究及臨床實驗室分析(例如細菌檢測及血清分型)中或可用於賦予個體被動免疫性。
在又一態樣中，本發明提供包含本發明之eTEC連接之醣結合物 的免疫原性組合物，其用於預防、治療或改善細菌感染，例如由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之感染。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之eTEC連接之醣結合物的免疫原性組合物之用途，其用於製備用以預防、治療或改善細菌感染(例如由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之感染)的藥劑。
在上述預防性及/或治療性方法及用途之某些較佳實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含經由eTEC間隔體共價連接至載體蛋白之細菌莢膜多醣。在本文所述方法及用途之常見實施例中，細菌莢膜多醣係Pn莢膜多醣或Mn莢膜多醣。在一些該等實施例中，Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。在其他該等實施例中，Mn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
在某些較佳實施例中，載體蛋白係CRM197。在尤佳實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含經由eTEC間隔體共價結合至CRM197之細菌莢膜多醣，例如Pn或Mn莢膜多醣。
圖1顯示本發明之eTEC連接之醣結合物、包含共價結合至CRM197之多醣之醣結合物的製備之通用反應圖。
圖2顯示肺炎鏈球菌血清型33F(Pn-33F)莢膜多醣之重複多醣結構。
圖3顯示肺炎鏈球菌血清型22F(Pn-22F)莢膜多醣之重複多醣結構。
圖4顯示肺炎鏈球菌血清型10A(Pn-10A)莢膜多醣之重複多醣結構。
圖5顯示肺炎鏈球菌血清型11A(Pn-11A)莢膜多醣之重複多醣結 構。
圖6顯示納入eTEC連接體(A)及潛在封端及未封端自由巰基位點(B)之Pn-33F醣結合物的代表性結構。
圖7顯示用於製備與CRM197之Pn-33F醣結合物之活化(A)及結合(B)製程的代表性製程流程圖。
圖8顯示隨用於活化步驟中之CDT之莫耳濃度當量變化的Pn-33F莢膜多醣之硫醇化程度。
參照以下本發明較佳實施例之詳細說明及其中所包括之實例可更容易地理解本發明。除非另有說明，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解的意義相同之意義。儘管在本發明之實踐或測試中可使用與彼等本文所闡述者相類似或等價之任何方法及材料，但本文仍對某些較佳方法及材料加以闡述。在闡述實施例並主張本發明時，應根據下文所展示定義使用某些術語。
除非另外指明，否則如本文所用單數形式「一」(「a」、「an」)及「該」包括複數個指示物。因此，例如，在提及「該方法」時包括本文所述類型之一或多種方法及/或步驟，且在提及「eTEC間隔體」時係指一或多種eTEC間隔體，如彼等熟習此項技術者在閱讀本揭示內容後所明瞭。
本文所用術語「約」意指值(例如所述濃度範圍、時間框、分子量、溫度或pH)之統計上有意義之範圍。該範圍可在一數量級內，通常在指示值或範圍之20%內，更通常在10%內，且甚至更通常在5%內。有時，該範圍可在用於量測及/或測定給定值或範圍之典型標準方法之實驗誤差內。由術語「約」涵蓋之可允許變化將端視研究下之特定系統而定，且可由彼等熟習此項技術者容易地瞭解。每當在本申請案中敍述時，亦涵蓋範圍內之每一整數作為本發明之實施例。
應注意，在本揭示內容中，諸如「包含」(「comprises」、「comprised」、「comprising」)、「含有」(「contains」、「containing」)及諸如此類等術語可具有屬於美國專利法之含義；例如，其可意指「包括」(「includes」、「included」、「including」)及諸如此類。該等術語係指納入特定成份或成份組，而不排除任何其他成份。諸如「基本上由......組成」(「consisting essentially of」及「consists essentially of」)等術語具有屬於美國專利法之含義，例如，其允許納入不會有損於本發明之新穎或基本特徵之額外成份或步驟，亦即，其排除有損於本發明之新穎或基本特徵之額外未闡述成份或步驟。術語「由......組成」(「consists of」及「consisting of」)具有屬於美國專利法之含義；亦即，該等術語經封閉封端。因此，該等術語係指納入特定成份或成份組且排除所有其他成份。
本文所用術語「醣」可指多醣、寡醣或單醣。通常，在提及醣時係指細菌莢膜多醣，具體而言源自病原性細菌(例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌)之莢膜多醣。
術語「結合物」或「醣結合物」在本文中互換使用以指共價結合至載體蛋白之醣。本發明之醣結合物在本文中有時稱作「eTEC連接」之醣結合物，其包含經由至少一個eTEC間隔體共價結合至載體蛋白之醣。本發明之eTEC連接之醣結合物及包含其免疫原性組合物可含有一定量之自由醣。
本文所用術語「自由醣」意指未共價結合至載體蛋白之醣或以高的醣/蛋白質比率(>5：1)共價附接至極少載體蛋白之醣，但仍然存於醣結合物組合物中。自由醣可與結合之醣-載體蛋白醣結合物非共價締合(亦即，非共價結合至、吸附至或誘捕於其中或與其一起誘捕)。術語「自由多醣」及「自由莢膜多醣」可在本文中用於表達關於醣結合物之相同涵義，其中醣分別係多醣或莢膜多醣。
本文所用「結合」(「to conjugate」、「conjugated」及「conjugating」)係指醣(例如細菌莢膜多醣)共價附接至載體分子或載體蛋白之製程。在本發明之方法中，醣經由至少一個eTEC間隔體共價結合至載體蛋白。結合可根據下文所述方法或藉由業內已知之其他方法實施。結合至載體蛋白會增強細菌莢膜多醣之免疫原性。
醣結合物
本發明係關於醣結合物，其包含經由一或多個eTEC間隔體共價結合至載體蛋白之醣，其中醣經由胺基甲酸酯鍵聯共價結合至eTEC間隔體，且其中載體蛋白經由醯胺鍵聯共價結合至eTEC間隔體。
除一或多個eTEC間隔體存在外，本發明醣結合物之新穎特徵亦包括醣及所得eTEC連接之醣結合物之分子量特性、每載體蛋白之結合離胺酸之比率及經由eTEC間隔體共價連接至多醣之離胺酸之數目、載體蛋白與醣之間隨醣之重複單元變化之共價連接之數目及自由醣與醣之總量相比之相對量。
本發明之eTEC連接之醣結合物可由通式(I)代表：
eTEC間隔體包括7個線性原子(亦即，-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)且在醣與載體蛋白之間提供穩定硫醚及醯胺鍵。eTEC連接之醣結合物之合成涉及使醣之活化羥基與硫基烷基胺試劑(例如，胱胺或半胱胺酸胺或其鹽)之胺基反應，從而形成與醣之胺基甲酸酯連接以提供硫醇化醣。藉由與還原劑反應以提供活化硫醇化醣來完成一或多個巰基之產生。活化硫醇化醣之自由巰基與在含有胺基之殘基上具有一或多個α-鹵代乙醯胺基團之活化載體蛋白的反應會產生硫醚鍵以形成結 合，其中載體蛋白經由醯胺鍵附接至eTEC間隔體。
在本發明之醣結合物中，醣可為多醣、寡醣或單醣，且載體蛋白可選自任何適宜載體，如本文進一步所述或彼等熟習此項技術者已知。在常見實施例中，醣係細菌莢膜多醣。在一些該等實施例中，載體蛋白係CRM197。
在一些該等實施例中，eTEC連接之醣結合物包含源自肺炎鏈球菌之Pn莢膜多醣。在具體實施例中，Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。在其他實施例中，莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型10A、11A、22F及33F莢膜多醣。在一個該實施例中，莢膜多醣係Pn-33F莢膜多醣。在另一該實施例中，莢膜多醣係Pn-22F莢膜多醣。在另一該實施例中，莢膜多醣係Pn-10A莢膜多醣。在又一該實施例中，莢膜多醣係Pn-11A莢膜多醣。
在其他實施例中，eTEC連接之醣結合物包含源自腦膜炎奈瑟菌之Mn莢膜多醣。在具體實施例中，Mn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。在一個該實施例中，莢膜多醣係Mn-A莢膜多醣。在另一該實施例中，莢膜多醣係Mn-C莢膜多醣。在另一該實施例中，莢膜多醣係Mn-W135莢膜多醣。在又一該實施例中，莢膜多醣係Mn-Y莢膜多醣。
在尤佳實施例中，eTEC連接之醣結合物包含Pn或Mn細菌莢膜多醣，例如Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F莢膜多醣，或Mn-血清型A、C、W135或Y莢膜多醣，其經由eTEC間隔體共價結合至CRM197。
在一些實施例中，本發明之eTEC連接之醣結合物包含經由eTEC 間隔體共價結合至載體蛋白之醣，其中醣之分子量介於10kDa與2,000kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50kDa與2,000kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50kDa與1,750kDa之間；介於50kDa與1,500kDa之間；介於50kDa與1,250kDa之間；介於50kDa與1,000kDa之間；介於50kDa與750kDa之間；介於50kDa與500kDa之間；介於100kDa與2,000kDa之間；介於100kDa與1,750kDa之間；介於100kDa與1,500kDa之間；介於100kDa與1,250kDa之間；介於100kDa與1,000kDa之間；介於100kDa與750kDa之間；介於100kDa與500kDa之間；介於200kDa與2,000kDa之間；介於200kDa與1,750kDa之間；介於200kDa與1,500kDa之間；介於200kDa與1,250kDa之間；介於200kDa與1,000kDa之間；介於200kDa與750kDa之間；或介於200kDa與500kDa之間。在一些該等實施例中，醣係細菌莢膜多醣，例如Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F莢膜多醣，或Mn-血清型A、C、W135或Y莢膜多醣，其中莢膜多醣之分子量在如所述分子量範圍中之任一者內。
在一些實施例中，本發明之eTEC連接之醣結合物的分子量介於50kDa與20,000kDa之間。在其他實施例中，eTEC連接之醣結合物的分子量介於500kDa與10,000kDa之間。在其他實施例中，eTEC連接之醣結合物的分子量介於200kDa與10,000kDa之間。在又一些實施例中，eTEC連接之醣結合物的分子量介於1,000kDa與3,000kDa之間。
在其他實施例中，本發明之eTEC連接之醣結合物的分子量介於200kDa與20,000kDa之間；介於200kDa與15,000kDa之間；介於200kDa與10,000kDa之間；介於200kDa與7,500kDa之間；介於200kDa與5,000kDa之間；介於200kDa與3,000kDa之間；介於200kDa與 1,000kDa之間；介於500kDa與20,000kDa之間；介於500kDa與15,000kDa之間；介於500kDa與12,500kDa之間；介於500kDa與10,000kDa之間；介於500kDa與7,500kDa之間；介於500kDa與6,000kDa之間；介於500kDa與5,000kDa之間；介於500kDa與4,000kDa之間；介於500kDa與3,000kDa之間；介於500kDa與2,000kDa之間；介於500kDa與1,500kDa之間；介於500kDa與1,000kDa之間；介於750kDa與20,000kDa之間；750kDa與15,000kDa之間；介於750kDa與12,500kDa之間；介於750kDa與10,000kDa之間；介於750kDa與7,500kDa之間；介於750kDa與6,000kDa之間；介於750kDa與5,000kDa之間；介於750kDa與4,000kDa之間；介於750kDa與3,000kDa之間；介於750kDa與2,000kDa之間；介於750kDa與1,500kDa之間；介於1,000kDa與15,000kDa之間；介於1,000kDa與12,500kDa之間；介於1,000kDa與10,000kDa之間；介於1,000kDa與7,500kDa之間；介於1,000kDa與6,000kDa之間；介於1,000kDa與5,000kDa之間；介於1,000kDa與4,000kDa之間；介於1,000kDa與2,500kDa之間；介於2,000kDa與15,000kDa之間；介於2,000kDa與12,500kDa之間；介於2,000kDa與10,000kDa之間；介於2,000kDa與7,500kDa之間；介於2,000kDa與6,000kDa之間；介於2,000kDa與5,000kDa之間；介於2,000kDa與4,000kDa之間；或介於2,000kDa與3,000kDa之間。
表徵本發明之eTEC連接之醣結合物的另一方式係藉由經由eTEC間隔體結合至醣之載體蛋白中之離胺酸殘基的數目，其可表徵為結合離胺酸之範圍。
在常見實施例中，載體蛋白經由與載體蛋白上之離胺酸殘基之一或多個ε-胺基的醯胺鍵聯共價結合至eTEC間隔體。在一些該等實施例中，載體蛋白包含2至20個共價結合至醣之離胺酸殘基。在其他該等實施例中，載體蛋白包含4至16個共價結合至醣之離胺酸殘基。
在較佳實施例中，載體蛋白包含含有39個離胺酸殘基之CRM197。在一些該等實施例中，CRM197可包含39個共價連接至醣之離胺酸殘基中之4至16個。表示此參數之另一方式係約10%至約41% CRM197離胺酸共價連接至醣。在另一該實施例中，CRM197可包含39個共價連接至醣之離胺酸殘基中之2至20個。表示此參數之另一方式係約5%至約50% CRM197離胺酸共價連接至醣。
本發明之eTEC連接之醣結合物亦可由醣對載體蛋白之比(重量/重量)表徵。在一些實施例中，醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.2與4之間。在其他實施例中，醣：載體蛋白之比(w/w)介於1.0與2.5之間。在其他實施例中，醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.4與1.7之間。在一些該等實施例中，醣係細菌莢膜多醣，及/或載體蛋白係CRM197。
醣結合物亦可由隨醣之重複單元變化之載體蛋白與醣之間之共價連接數目表徵。在一個實施例中，對於每多醣之4個醣重複單元，本發明之醣結合物在載體蛋白與多醣之間包含至少一個共價連接。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間之共價連接在多醣之每10個醣重複單元中出現至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間之共價連接在多醣之每15個醣重複單元中出現至少一次。在又一實施例中，載體蛋白與多醣之間之共價連接在多醣之每25個醣重複單元中出現至少一次。
在常見實施例中，載體蛋白係CRM197且經由CRM197與多醣之間之eTEC間隔體之共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中出現至少一次。
結合期間之重要考慮因素係容許個別組份之潛在敏感性非醣取代基官能基(例如可構成醣表位之部分之O-醯基、磷酸酯或甘油磷酸酯側鏈)保留的條件之發展。
在一個實施例中，醣結合物包含O-乙醯基化程度介於10%至 100%之醣。在一些該等實施例中，醣之O-乙醯基化程度介於50%至100%。在其他該等實施例中，醣之O-乙醯基化程度介於75%至100%。在其他實施例中，醣之O-乙醯基化程度大於或等於70%(70%)。
本發明之eTEC連接之醣結合物及免疫原性組合物可含有非共價結合至載體蛋白、但仍然存於醣結合物組合物中之自由醣。自由醣可與醣結合物非共價締合(亦即，非共價結合至、吸附至或誘捕於其中或與其一起誘捕)。
在一些實施例中，eTEC連接之醣結合物包含相對於醣之總量小於約45%自由醣、小於約40%自由醣、小於約35%自由醣、小於約30%自由醣、小於約25%自由醣、小於約20%自由醣、小於約15%自由醣、小於約10%自由醣或小於約5%自由醣。較佳地，醣結合物包含小於15%自由醣、更佳小於10%自由醣且仍更佳小於5%自由醣。
在某些較佳實施例中，本發明提供eTEC連接之醣結合物，其包含經由eTEC間隔體共價結合至載體蛋白且單獨或組合具有以下特徵中之一或多者的莢膜多醣、較佳Pn或Mn莢膜多醣：多醣之分子量介於50kDa與2,000kDa之間；醣結合物之分子量介於500kDa至10,000KDa之間；載體蛋白包含2至20個共價連接至醣之離胺酸殘基；醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.2與4之間；對於多醣之每4、10、15或25個醣重複單元，醣結合物包含在載體蛋白與多醣之間至少一個共價連接；醣之O-乙醯基化程度介於75%至100%之間；結合物包含相對於多醣小於約15%之自由多醣；載體蛋白係CRM197；莢膜多醣係選自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F莢膜多醣，或莢膜多醣係選自Mn-血清型A、C、W135或Y莢膜多醣。
eTEC連接之醣結合物亦可由其分子大小分佈(Kd)表徵。結合物 之分子大小係藉由Sepharose CL-4B固定相尺寸排除層析(SEC)介質使用高壓液相層析系統(HPLC)測定。對於Kd測定而言，首先校正層析管柱以測定V0(其代表空隙體積或總排除體積)及Vi(即試樣中之最小分子洗脫之體積，其亦稱作粒子間體積)。所有SEC分離在V0與Vi之間發生。所收集每一部分之Kd值係藉由以下表達式測定：Kd=(Ve-Vi)/(Vi-V0)，其中Ve代表化合物之滯留體積。所洗脫部分%(主峰)0.3界定結合物Kd(分子大小分佈)。在一些實施例中，本發明提供分子大小分佈(Kd)35%之eTEC連接之醣結合物。在其他實施例中，本發明提供分子大小分佈(Kd)15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%或90%之eTEC連接之醣結合物。
本發明之eTEC連接之醣結合物及免疫原性組合物可含有自由巰基殘基。在一些情況下，藉由本文所提供方法形成之活化硫醇化醣將含有多個自由巰基殘基，其中之一些在結合步驟期間可不經歷與載體蛋白之共價結合。該等殘餘自由巰基殘基藉由與硫醇反應性封端劑(例如碘乙醯胺(IAA))反應以使潛在反應官能基封端得以封端。亦涵蓋其他硫醇反應性封端劑(例如，含有馬來醯亞胺之試劑及諸如此類)。
另外，本發明之eTEC連接之醣結合物及免疫原性組合物可含有殘餘未結合之載體蛋白，其可包括在封端製程步驟期間經歷修飾之活化載體蛋白。
本發明之醣結合物可用於產生免疫原性組合物以保護接受者免受(例如)病原性細菌(例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌)之細菌感染。因此，在另一態樣中，本發明提供免疫原性組合物，其包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑，其中醣結合物包含經由eTEC間隔體共價結合至載體蛋白之醣，如本文所述。
在常見實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑，其中醣結合物包含細菌莢膜多醣。
在一些該等實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含源自肺炎鏈球菌之Pn莢膜多醣。在一些具體實施例中，Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
在其他該等實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含源自腦膜炎奈瑟菌之Mn莢膜多醣。在一些具體實施例中，Mn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
在尤佳實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含經由eTEC間隔體共價結合至CRM197之細菌莢膜多醣，例如Pn或Mn莢膜多醣。
在一些實施例中，免疫原性組合物包含佐劑。在一些該等實施例中，佐劑係選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群之基於鋁之佐劑。在一個實施例中，免疫原性組合物包含佐劑磷酸鋁。
本發明之eTEC連接之醣結合物及包含其之免疫原性組合物可含有一定量之自由醣。在一些實施例中，免疫原性組合物包含與多醣之總量相比小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、或小於約5%之自由多醣。較佳地，免疫原性組合物包含小於15%自由醣、更佳小於10%自由醣且仍更佳小於5%自由醣。
在另一態樣中，本發明之醣結合物或免疫原性組合物可用於產生抗體，其藉由在動物功效模型中殺死細菌或經由調理吞噬殺死分析 如所量測具有功能。包含細菌莢膜多醣之本發明之醣結合物可用於產生針對該細菌莢膜多醣之抗體。該等抗體隨後可用於研究及臨床實驗室分析，例如細菌檢測及血清分型。該等抗體亦可用於賦予個體被動免疫性。在一些實施例中，針對細菌多醣產生之抗體在動物功效模型中或在調理吞噬殺死分析中具有功能。
本文所述eTEC連接之醣結合物及免疫原性組合物亦可用於各種治療或預防方法中用於預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病況。具體而言，包含細菌抗原(例如來自病原性細菌之細菌莢膜多醣)之eTEC連接之醣結合物可用於預防、治療或改善個體中由病原性細菌引起之細菌感染、疾病或病況。
因此，在一個態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病況之方法，其包含向該個體投與免疫有效量之本發明免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含含有細菌莢膜多醣之eTEC連接之醣結合物。
在一個實施例中，感染、疾病或病況與肺炎鏈球菌細菌相關且醣結合物包含Pn莢膜多醣。在一些該等實施例中，感染、疾病或病況係選自由以下組成之群：肺炎、竇炎、中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸腔積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窩織炎、軟組織感染及腦膿腫。
在另一實施例中，感染、疾病或病況與腦膜炎奈瑟菌細菌相關且醣結合物包含Mn莢膜多醣。在一些該等實施例中，感染、疾病或病況係選自由腦膜炎、腦膜炎球菌血症、菌血症及敗血症組成之群。
在另一態樣中，本發明提供誘發個體之免疫反應之方法，其包含向個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的免疫原性組合物，其中醣結合物包含細菌莢膜多醣。
在又一態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體中由病原性細菌引起之疾病或病況的方法，其包含向該個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的免疫原性組合物，其中醣結合物包含細菌莢膜多醣。
在另一態樣中，本發明提供減輕經病原性細菌感染引起之疾病或病況之至少一種症狀的嚴重程度之方法，其包含向該個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的免疫原性組合物，其中醣結合物包含細菌莢膜多醣，例如Pn或Mn莢膜多醣。
在另一態樣中，本發明提供向個體投與免疫有效量之包含本發明之eTEC連接之醣結合物的免疫原性組合物之方法，以在個體中產生保護性免疫反應，如本文進一步所述。
在又一態樣中，本發明提供包含如本文所述本發明之eTEC連接之醣結合物的免疫原性組合物，其用於預防、治療或改善細菌感染，例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之感染。
在另一態樣中，本發明提供包含如本文所述本發明之eTEC連接之醣結合物的免疫原性組合物之用途，其用於製備用以預防、治療或改善細菌感染(例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之感染)的藥劑。
在上述治療及/或預防方法及用途中，免疫原性組合物通常包含eTEC連接之醣結合物，其包含細菌莢膜多醣經由eTEC間隔體共價連接至載體蛋白。在本文所述方法及用途之常見實施例中，細菌莢膜多醣係Pn莢膜多醣或Mn莢膜多醣。在一些該等實施例中，莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。在其他該等實施例中，莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
在某些較佳實施例中，載體蛋白係CRM197。在一個尤佳實施例中，免疫原性組合物包含eTEC連接之醣結合物，其包含細菌莢膜多醣，例如Pn或Mn莢膜多醣，經由eTEC間隔體共價結合至CRM197。
另外，本發明提供誘發個體針對肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌細菌之免疫反應的方法，預防、治療或改善個體中由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌細菌引起之感染、疾病或病況的方法，及減輕個體由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌感染所引起之感染、疾病或病況之至少一種症狀的嚴重性之方法，在各情形下向個體投與免疫有效量之包含eTEC連接之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑的免疫原性組合物，其中醣結合物包含分別源自肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之細菌莢膜多醣。
醣
醣可包括多醣、寡醣及單醣。在常見實施例中，醣係多醣，具體而言細菌莢膜多醣。莢膜多醣係藉由彼等熟習此項技術者已知之標準技術製備。
在本發明中，莢膜多醣可自(例如)肺炎鏈球菌之Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F製備。在一個實施例中，每一肺炎球菌多醣血清型可在基於大豆之培養基中生長。經由離心、沈澱、超濾及/或管柱層析純化個別多醣。可活化純化多醣以使得其能夠與eTEC間隔體反應且隨後納入本發明之醣結合物中，如本文進一步所述。
莢膜多醣之分子量係用於免疫原性組合物中之考慮因素。由於抗原表面上存在之表位之價較高，高分子量莢膜多醣能夠誘發某些抗體免疫反應。預計高分子量莢膜多醣之分離及純化可用於本發明之結合物、組合物及方法中。
在一些實施例中，醣之分子量介於10kDa與2,000kDa之間。在 其他該等實施例中，醣之分子量介於50kDa與2,000kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50kDa與1,750kDa之間；介於50kDa與1,500kDa之間；介於50kDa與1,250kDa之間；介於50kDa與1,000kDa之間；介於50kDa與750kDa之間；介於50kDa與500kDa之間；介於100kDa與2,000kDa之間；介於100kDa與1,750kDa之間；介於100kDa與1,500kDa之間；介於100kDa與1,250kDa之間；介於100kDa與1,000kDa之間；介於100kDa與750kDa之間；介於100kDa與500kDa之間；介於200kDa與2,000kDa之間；介於200kDa與1,750kDa之間；介於200kDa與1,500kDa之間；介於200kDa與1,250kDa之間；介於200kDa與1,000kDa之間；介於200kDa與750kDa之間；或介於200kDa與500kDa之間。在一些該等實施例中，醣係細菌莢膜多醣，例如Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F莢膜多醣，或Mn-血清型A、C、W135或Y莢膜多醣，其中莢膜多醣之分子量在如所述分子量範圍之一者中。
在一些實施例中，本發明之醣經O-乙醯基化。在一些實施例中，醣結合物包含O-乙醯基化程度介於10-100%之間、介於20-100%之間、介於30-100%之間、介於40-100%之間、介於50-100%之間、介於60-100%之間、介於70-100%之間、介於75-100%、80-100%、90-100%、50-90%之、60-90%、70-90%或80-90%之間之醣。在其他實施例中，O-乙醯基化程度係10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或約100%。
在一些實施例中，本發明之莢膜多醣、醣結合物或免疫原性組合物用於產生抗體，其藉由在動物功效模型中殺死細菌或證實抗體殺死細菌之調理吞噬殺死分析如所量測具有功能。
莢膜多醣可使用彼等熟習此項技術者已知之分離程序直接自細 菌獲得。例如，參見Fournier等人，(1984)，上文；Fournier等人，(1987)Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.138：561-567；美國專利申請公開案第2007/0141077號；及國際專利申請公開案第WO 00/56357號；其各自以引用方式併入本文中，如同闡述其全文一般)。另外，其可使用合成方案產生。此外，莢膜多醣可使用彼等熟習此項技術者亦已知之遺傳改造程序產生(參見Sau等人，(1997)Microbiology 143：2395-2405；及美國專利第6,027,925號；其各自以引用方式併入本文中，如同闡述其全文一般)。
用於製造用於本發明醣結合物中之各別多醣之肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌的細菌菌株可自已確立培養物保藏中心或臨床樣品獲得。
載體蛋白
本發明醣結合物之另一組份係與醣結合之載體蛋白。術語「蛋白載體」或「載體蛋白」或「載體」在本文中可互換使用。載體蛋白較佳係非毒性且非反應原性且可以足夠量及純度獲得之蛋白質。載體蛋白應順從於標準結合程序。在本發明之新穎醣結合物中，載體蛋白經由eTEC間隔體共價連接至醣。
載體之結合可增強抗原(例如細菌抗原，例如細菌莢膜多醣)之免疫原性。抗原之較佳蛋白載體係來自破傷風、白喉、百日咳、假單胞菌(Pseudomonas)、埃希氏大腸桿菌、葡萄球菌(Staphylococcus)及鏈球菌(Streptococcus)之毒素、類毒素或毒素之任何突變體交叉反應物質(CRM)。在一個實施例中，尤佳載體係源自產生CRM197蛋白質之白喉棒桿菌(C.diphtheriae)菌株C7(β197)的白喉類毒素CRM197。此菌株具有ATCC登錄號53281。產生CRM197之方法闡述於美國專利第5,614,382號中，其以引用方式併入本文中，如同闡述其全文一般。
或者，可使用蛋白載體或其他免疫原性蛋白質之片段或表位。舉例而言，半抗原可偶合至細菌毒素、類毒素或CRM之T細胞表位。 參見於1988年2月1日提出申請且標題為「Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines」之美國專利申請案第150,688號，其以引用方式併入本文中，如同闡述其全文一般。其他適宜載體蛋白包括滅活細菌毒素，例如霍亂類毒素(例如，如國際專利申請案第WO 2004/083251號中所述)、埃希氏大腸桿菌LT、埃希氏大腸桿菌ST及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白(例如外膜複合物c(OMPC))、孔蛋白、鐵傳遞蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏著蛋白(PsaA)或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。亦可使用其他蛋白質(例如卵白蛋白、鑰孔蟲戚血蘭素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD))作為載體蛋白。
因此，在常見實施例中，eTEC連接之醣結合物包含CRM197作為載體蛋白，其中莢膜多醣經由胺基甲酸酯鍵聯共價連接至eTEC間隔體，且其中CRM197經由醯胺鍵聯共價連接至eTEC間隔體，該醯胺連接通常經由一或多個離胺酸殘基之ε-胺基由蛋白質之活化胺基酸殘基形成。
結合至醣之載體蛋白中之離胺酸殘基的數目可表徵為結合離胺酸之範圍。舉例而言，在免疫原性組合物之一些實施例中，CRM197可包含39個共價連接至醣之離胺酸殘基中之4至16個。表示此參數之另一方式係約10%至約41% CRM197離胺酸共價連接至醣。在其他實施例中，CRM197可包含39個共價連接至醣之離胺酸殘基中之2至20個。表示此參數之另一方式係約5%至約50% CRM197離胺酸共價連接至醣。
醣鏈附接至載體蛋白上之離胺酸之頻率係表徵本發明之醣結合物之另一參數。舉例而言，在一些實施例中，對於多醣之每4個醣重 複單元，載體蛋白與多醣之間存在至少一個共價連接。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間之共價連接在每多醣之10個醣重複單元中出現至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間之共價連接在每多醣之15個醣重複單元中出現至少一次。在又一實施例中，載體蛋白與多醣之間之共價連接在多醣之每25個醣重複單元中出現至少一次。
在常見實施例中，載體蛋白係CRM197且經由CRM197與多醣之間之eTEC間隔體之共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中出現至少一次。在一些該等實施例中，多醣係源自肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之細菌莢膜多醣。
在其他實施例中，對於每5至10個醣重複單元、每2至7個醣重複單元、每3至8個醣重複單元、每4至9個醣重複單元、每6至11個醣重複單元、每7至12個醣重複單元、每8至13個醣重複單元、每9至14個醣重複單元、每10至15個醣重複單元、每2至6個醣重複單元，每3至7個醣重複單元、每4至8個醣重複單元、每6至10個醣重複單元、每7至11個醣重複單元、每8至12個醣重複單元、每9至13個醣重複單元、每10至14個醣重複單元、每10至20個醣重複單元、或每4至25個醣重複單元，結合物包含載體蛋白與醣之間之至少一個共價連接。
在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，出現載體蛋白與醣之間之至少一個連接。
製造eTEC連接之醣結合物之方法
本發明提供包含經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔體共價結合至載體蛋白之醣的eTEC連接之醣結合物之方法。eTEC間隔體含有7個線性原子(亦即，-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)，其包含穩定硫醚及醯胺鍵，且用於共價連接醣及載體蛋白。eTEC間隔體之一個末端經由胺基甲酸酯鍵聯共價結合至醣之羥基。eTEC 間隔體之另一末端經由醯胺鍵聯共價結合載體蛋白之含有胺基之殘基，通常ε-離胺酸殘基。
包含結合至活化載體蛋白CRM197之多醣的本發明醣結合物之代表性製備路徑示於圖1中。使用eTEC間隔體製程具有潛在位點修飾之代表性細菌莢膜多醣、源自肺炎鏈球菌之肺炎球菌血清型33F、10A、11A及22F多醣的化學結構分別示於圖2、圖3、圖4及圖5中。
包含使用eTEC連接體化學法共價結合至CRM197之肺炎球菌血清型33F多醣的本發明之代表性eTEC連接之醣結合物的結構示於圖6(A)中。出於闡釋性目的，潛在封端及未封端自由巰基位點示於圖6(B)中。多醣通常含有多個羥基，且因此，eTEC間隔體與多醣重複單元內之特定羥基經由胺基甲酸酯連接之附接位點可變。
在一個態樣中，該方法包含以下步驟：a)使醣與碳酸衍生物(例如1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI))在有機溶劑中反應以產生活化醣；b)使活化醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使硫醇化醣與還原劑反應以產生包含一或多個自由巰基殘基之活化硫醇化醣；d)使活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵代乙醯胺基團之活化載體蛋白反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白結合物；及e)使硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下物質反應：(i)能夠使活化載體蛋白之未結合α-鹵代乙醯胺基團封端的第一封端劑；及/或(ii)能夠使活化硫醇化醣之未結合自由巰基殘基封端的第二封端劑；藉此產生eTEC連接之醣結合物。
在尤佳實施例中，該方法包含以下步驟：a)使Pn-33F莢膜多醣與CDT或CDI在有機溶劑中反應以產生活化Pn-33F多醣；b)使活化Pn-33F多醣與胱胺或半胱胺酸胺、其鹽反應，以產生硫醇化Pn-33F多醣；c)使硫醇化Pn-33F多醣與還原劑反應以產生包含一或多個自由巰基殘基之活化硫醇化Pn-33F多醣；d)使活化硫醇化Pn-33F多醣與 包含一或多個α-溴乙醯胺基團之活化CRM197載體蛋白反應，以產生硫醇化Pn-33F多醣-CRM197結合物；及e)使硫醇化Pn-33F多醣-CRM197結合物與以下物質反應：(i)N-乙醯基-L-半胱胺酸作為能夠使活化載體蛋白之未結合α-溴乙醯胺基團封端的第一封端劑；及(ii)碘乙醯胺作為能夠使活化硫醇化Pn-33F多醣之未結合自由巰基殘基封端的第二封端劑；藉此產生eTEC連接之Pn-33F多醣-CRM197醣結合物。
在常見實施例中，碳酸衍生物係CDT或CDI。較佳地，碳酸衍生物係CDT，且有機溶劑係極性非質子溶劑，例如二甲亞碸(DMSO)。在硫醇化及/或結合步驟之前無需活化醣之凍乾。
在較佳實施例中，藉由使活化醣與雙官能對稱硫基烷基胺試劑胱胺或其鹽反應產生硫醇化醣。此試劑之潛在優勢在於對稱胱胺連接體可與兩分子活化醣反應，由此在二硫鍵還原後每分子胱胺形成兩分子硫醇化醣。或者，可藉由使活化醣與半胱胺或其鹽反應形成硫醇化醣。藉由本發明方法產生之eTEC連接之醣結合物可由通式(I)代表。
彼等熟習此項技術者應瞭解，在活化醣與含有自由巰基殘基之半胱胺或其鹽反應時，步驟c)係可選的。實際上，包含半胱胺之硫醇化醣通常在步驟c)中與還原劑反應以還原可在反應期間形成之任何氧化二硫化物副產物。
在此態樣之一些實施例中，步驟d)進一步包含在活化硫醇化醣與活化載體蛋白反應以產生硫醇化醣-載體蛋白結合物之前提供包含一或多個α-鹵代乙醯胺基團之活化載體蛋白。在常見實施例中，活化載體蛋白包含一或多個α-溴乙醯胺基團。
可用一或多種能夠與存於反應混合物中之殘餘活化官能基反應之封端劑處理硫醇化醣-載體蛋白結合物。由於不完全結合或反應混合物中存在過量組份之一，故該等殘餘反應基團可存於未反應醣或載體蛋白組份上。在該情形下，封端可有助於純化或分離醣結合物。在 一些情形下，殘餘活化官能基可存於醣結合物中。
舉例而言，活化載體蛋白上之過量α-鹵代乙醯胺基團可藉由與低分子量硫醇(例如N-乙醯基-L-半胱胺酸，其可過量使用以確保完全封端)反應封端。利用N-乙醯基-L-半胱胺酸封端亦容許藉由檢測封端位點處之半胱胺酸殘基之獨特胺基酸S-羧甲基半胱胺酸(CMC)來確認結合效率，其可藉由結合產物之酸性水解及胺基酸分析測定。此胺基酸之檢測確認反應性溴乙醯胺基團之成功封端，由此使得其不可用於任何不期望化學反應。共價及封端之可接受等級對於CMCA/Lys介於約1-15之間且對於CMC/Lys介於約0-5之間。類似地，過量自由巰基殘基可藉由與低分子量親電子試劑(例如碘乙醯胺)反應來封端。一部分CMCA可源自由碘乙醯胺直接封端且未參與與載體蛋白之鹵代醯基結合的多醣硫醇。因此，需要藉由胺基酸分析(CMCA)檢查結合後反應試樣(在由碘乙醯胺封端之前)以測定直接參與結合之硫醇之精確含量。對於含有10-12個硫醇之硫醇化醣而言，通常經測定5-6個硫醇直接參與多醣硫醇與溴乙醯化蛋白之間之結合且4-5個硫醇由碘乙醯胺封端。
在較佳實施例中，第一封端劑係N-乙醯基-L-半胱胺酸，其與載體蛋白上之未結合α-鹵代乙醯胺基團反應。在其他實施例中，第二封端劑係碘乙醯胺(IAA)，其與活化硫醇化醣之未結合自由巰基反應。通常，步驟e)包含利用N-乙醯基-L-半胱胺酸作為第一封端劑及IAA作為第二封端劑封端。在一些實施例中，封端步驟e)進一步包含在與第一及/或第二封端劑反應後與還原劑(例如，DTT、TCEP或巰基乙醇)反應。
在一些實施例中，該方法進一步包含藉由(例如)超濾/滲濾純化eTEC連接之醣結合物之步驟。
在較佳實施例中，雙官能對稱硫基烷基胺試劑係胱胺或其鹽， 其與活化醣反應以提供含有二硫化物部分之硫醇化醣或其鹽。
該等硫醇化醣衍生物與還原劑反應產生包含一或多個自由巰基殘基之活化硫醇化多醣。該等活化硫醇化醣可藉由(例如)超濾/滲濾得以分離及純化。或者，活化硫醇化醣可藉由(例如)尺寸排除層析(SEC)方法或離子交換層析方法(例如業內已知之DEAE)得以分離及純化。
在胱胺衍生之硫醇化醣之情形下，與還原劑反應會解離二硫鍵以提供包含一或多個自由巰基殘基之活化硫醇化醣。在半胱胺衍生之硫醇化醣之情形下，與還原劑反應係可選的且可用於還原藉由氧化試劑或產物形成之二硫鍵。
用於本發明方法中之還原劑包括(例如)叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)、二硫蘇醣醇(DTT)或巰基乙醇。然而，可使用任何適宜二硫化物還原劑。
在一些實施例中，該等方法進一步包含提供包含一或多個α-鹵代乙醯胺基團、較佳一或多個α-溴乙醯胺基團之活化載體蛋白。
活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵代乙醯胺部分之活化載體蛋白反應會引起活化載體蛋白之α-鹵基由活化硫醇化醣之一或多個自由巰基親核置換，從而形成eTEC間隔體之硫醚鍵。
載體蛋白之α-鹵基乙醯基化胺基酸殘基通常附接至載體蛋白之一或多個離胺酸殘基之ε-胺基。在常見實施例中，載體蛋白含有一或多個α-溴乙醯基化胺基酸殘基。在一個實施例中，載體蛋白經溴乙酸試劑(例如溴乙酸之N-羥基琥珀醯亞胺酯(BAANS))活化。
在一個實施例中，該方法包括以下步驟：提供包含一或多個α-鹵代乙醯胺基團之活化載體蛋白及使活化硫醇化多醣與活化載體蛋白反應以產生硫醇化多醣-載體蛋白結合物，藉此產生包含經由eTEC間隔體結合至載體蛋白之多醣的醣結合物。
在本文方法之一些較佳實施例中，細菌莢膜多醣係源自肺炎鏈球菌之Pn莢膜多醣。在一些該等實施例中，Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。在某些較佳實施例中，載體蛋白係CRM197且Pn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
在本文所提供方法之其他較佳實施例中，細菌莢膜多醣係源自腦膜炎奈瑟菌之Mn莢膜多醣。在一些該等實施例中，Mn莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。在某些較佳實施例中，載體蛋白係CRM197且莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
在本文所提供方法之每一者之一些實施例中，醣經咪唑或三唑複合且隨後與碳酸衍生物(例如CDT)在含有約0.2% w/v水之有機溶劑(例如，DMSO)中反應以產生活化醣。在活化步驟中使用經複合醣可增加醣於有機溶劑中之溶解性。通常，醣經10克1,2,4-三唑賦形劑/克多醣複合，之後於環境溫度下混合以提供經複合醣。
因此，在某些實施例中，該等方法進一步包含在活化步驟a)之前用三唑或咪唑複合醣之步驟，以產生經複合醣。在一些該等實施例中，將複合醣殼冷凍(shell-frozen)，凍乾並在有機溶劑(例如DMSO)中復原並在經碳酸衍生物(例如CDT)活化之前添加約0.2% w/v水。
在一個實施例中，視情況用N-乙醯基-離胺酸甲基酯處理硫醇化醣反應混合物以使任何未反應之活化醣封端。在一些該等實施例中，藉由超濾/滲濾純化封端硫醇化醣混合物。
在常見實施例中，使硫醇化醣與還原劑反應以產生活化硫醇化醣。在一些該等實施例中，還原劑係叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)、二硫 蘇醣醇(DTT)或巰基乙醇。在一些該等實施例中，藉由超濾/滲濾純化活化硫醇化醣。
在一個實施例中，產生eTEC連接之醣結合物之方法包含於約5℃下將活化硫醇化醣及載體蛋白之反應混合物之pH調節至約8至約9之pH並維持約20小時的步驟。
在一個實施例中，產生本發明之醣結合物之方法包含在硫醇化醣-載體蛋白結合物產生後對其進行分離之步驟。在常見實施例中，藉由超濾/滲濾分離醣結合物。
在另一實施例中，產生本發明之eTEC連接之醣結合物之方法包含在經分離醣-載體蛋白結合物產生後對其進行分離之步驟。在常見實施例中，藉由超濾/滲濾分離醣結合物。
在再一實施例中，產生活化醣之方法包含將有機溶劑中包含醣及CDT之反應混合物的水濃度調節至介於約0.1%與0.4%之間的步驟。 在一個實施例中，將有機溶劑中包含醣及CDT之反應混合物的水濃度調節至約0.2%。
在一個實施例中，活化醣之步驟包含使多醣與相對於有機溶劑中包含莢膜多醣及CDT之反應混合物中存在之多醣的量約5莫耳濃度過量的量之CDT反應。
在另一實施例中，產生本發明之醣結合物之方法包含測定包含醣之反應混合物之水溶度的步驟。在一個該實施例中，CDT添加至反應混合物中以活化醣之量係以與有機溶劑中包含醣及CDT之反應混合物中存在之水之量等莫耳濃度之CDT之大約量提供。
在另一實施例中，CDT添加至反應混合物中以活化醣之量係以與有機溶劑中包含醣及CDT之反應混合物中存在之水之量相比約0.5：1之莫耳濃度比之CDT之大約量提供。在一個實施例中，CDT添加至反應混合物中以活化醣之量係以與有機溶劑中包含醣及CDT之反應混合物 中存在之水之量相比0.75：1之莫耳濃度比之CDT之大約量提供。
在一個實施例中，該方法包含藉由滲濾分離硫醇化多醣之步驟。在另一實施例中，該方法包含藉由滲濾分離活化硫醇化多醣之步驟。
在一個實施例中，用於產生分離Pn莢膜多醣-載體蛋白結合物之方法中之載體蛋白包含CRM197。在另一實施例中，用於產生分離Mn莢膜多醣-載體蛋白結合物之方法中之載體蛋白包含CRM197。
在一些實施例中，醣：活化載體蛋白之比(w/w)介於0.2與4之間。在其他實施例中，醣：活化載體蛋白之比(w/w)介於1.0與2.5之間。在其他實施例中，醣：活化載體蛋白之比(w/w)介於0.4與1.7之間。在其他實施例中，醣：活化載體蛋白之比(w/w)係約1：1。在一些該等實施例中，醣係細菌莢膜多醣且活化載體蛋白係藉由CRM197之活化(溴乙醯基化)產生。
在另一實施例中，產生活化醣之方法包含使用有機溶劑。在常見實施例中，有機溶劑係極性非質子溶劑。在一些該等實施例中，極性非質子溶劑係選自由以下組成之群：二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)及六甲基磷醯胺(HMPA)或其混合物。在較佳實施例中，有機溶劑係DMSO。
在常見實施例中，eTEC連接之醣結合物之分離包含超濾/滲濾之步驟。
在一個實施例中，用於產生本發明之醣結合物之方法中之醣的分子量介於約10kDa與約2,000kDa之間。在另一實施例中，用於產生本發明之醣結合物之方法中之醣的分子量介於約50kDa與約2,000kDa之間。
在一個實施例中，產生莢膜多醣-載體蛋白醣結合物之方法中產 生之醣結合物的大小介於約50kDa與約20,000kDa之間。在另一實施例中，產生莢膜多醣-載體蛋白醣結合物之方法中產生之醣結合物的大小介於約500kDa與約10,000kDa之間。在一個實施例中，產生莢膜多醣-載體蛋白醣結合物之方法中產生之醣結合物的大小介於約1,000kDa與約3,000kDa之間。
在另一態樣中，本發明提供eTEC連接之醣結合物，其包含經由藉由本文所揭示之任何方法產生之eTEC間隔體結合至載體蛋白的醣。
在另一態樣中，本發明提供免疫原性組合物，其包含藉由本文所述任何方法產生之eTEC連接之醣結合物。
醣之O-乙醯基化程度可藉由業內已知之任何方法(例如，藉由質子NMR(Lemercinier及Jones(1996)Carbohydrate Research 296；83-96,Jones及Lemercinier(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30；1233-1247，WO 05/033148或WO 00/56357))測定。另一常用方法由Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180；249-261加以闡述。再一方法係基於HPLC-離子排除層析。藉由評定試樣中存在之自由乙酸酯之量並將該值與弱鹼水解後釋放之乙酸酯之量進行比較來測定O-乙醯基化程度。自試樣之其他組份拆分乙酸酯並用210nm下之紫外(UV)檢測進行定量。另一方法係基於HPLC-離子排除層析。藉由評定試樣中存在之自由乙酸酯之量並將該值與弱鹼水解後釋放之乙酸酯之量進行比較來測定O-乙醯基。自試樣之其他組份拆分乙酸酯並用210nm下之紫外(UV)檢測進行定量。
藉由胺基酸分析測定結合程度
使用溴乙醯基活化化學法產生之「IAA封端前」結合物試樣之酸水解可自胱胺於結合位點處形成酸穩定之S-羧甲基半胱胺(CMCA)且自半胱胺酸於封端位點處形成酸穩定之S-羧甲基半胱胺酸(CMC)。使 用溴乙醯基活化化學法產生之「IAA封端後」結合物(最終)之酸水解可自胱胺於結合位點處及IAA封端位點處形成酸穩定之S-羧甲基半胱胺(CMCA)且自半胱胺酸於封端位點處形成酸穩定之S-羧甲基半胱胺酸(CMC)。所有未結合及未封端離胺酸皆轉化回離胺酸並由此進行檢測。將所有其他胺基酸水解回自由胺基酸，色胺酸及半胱胺酸除外，其由水解條件破壞。天冬醯胺及麩胺醯胺分別轉化為天冬胺酸及麩胺酸。
使用離子交換層析分離每一水解試樣及對照之胺基酸，之後於135℃下與Beckman Ninhydrin NinRX溶液反應。隨後在可見範圍內於570nm及440nm下檢測衍生胺基酸(參見表1)。對於每一組分析，將含有500皮莫耳每一胺基酸之胺基酸之標準套組[Pierce胺基酸標準物H]與試樣及對照一起運行。向標準物中添加S-羧甲基半胱胺酸[Sigma-Aldrich]。
離胺酸係基於其與半胱胺酸及半胱胺之共價附接及預計類似水解進行選擇用於評價。隨後比較胺基酸之所得莫耳數與蛋白質之胺基酸組合物並與CMC及CMCA之值一起進行報告。CMCA值直接用於評價結合程度且CMC值直接用於評價封端程度。
在一個實施例中，醣結合物係由其分子大小分佈(Kd)表徵。結合物之分子大小係藉由Sepharose CL-4B固定相尺寸排除層析(SEC)介質使用高壓液相層析系統(HPLC)測定。對於Kd測定而言，首先校正層析管柱以測定V0(其代表空隙體積或總排除體積)及Vi(即試樣中之最小分子洗脫之體積，亦稱作粒子間體積)。所有SEC分離在V0與Vi之間發生。所收集每一部分之Kd值係藉由以下表達式測定：Kd=(Ve-Vi)/(Vi-V0)，其中Ve代表化合物之滯留體積。所洗脫部分%(主峰)0.3界定結合物Kd(分子大小分佈)。
免疫原性組合物
術語「免疫原組合物」涉及含有抗原(例如，微生物或其組份)之任何醫藥組合物，該組合物可用於在哺乳動物中引發免疫反應。
如本文所用「免疫原性」意指抗原(或抗原之表位)(例如細菌莢膜多醣或醣結合物或包含細菌莢膜多醣之免疫原性組合物)在宿主個體(例如哺乳動物)中引發免疫反應(體液或細胞介導或二者)之能力。
醣結合物可用於藉由呈遞抗原與MHC分子於細胞表面處締合使宿主敏感。另外，可產生抗原特異性T細胞或抗體以提供經免疫宿主之將來保護。醣結合物由此可保護宿主免受與細菌感染相關之一或多種症狀影響，或可保護宿主免於因與莢膜多醣相關之細菌感染而死亡。醣結合物可用於產生多株或單株抗體，其可用於賦予個體被動免疫性。醣結合物亦可用於產生抗體，其藉由在動物功效模型中殺死細菌或經由調理吞噬殺死分析如所量測具有功能。
「抗體」係能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變區中之至少一個抗原識別位點特異性結合至靶標(例如碳水化合物、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。除非上下文另外指明，否則本文所用之該術語意欲不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且亦涵蓋經改造抗體(例如，嵌合、人類化及/或衍生化以改變效應子功能、穩定性及其他生物活性)及其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)及結構域抗體，包括鯊及駱駝抗體)、及包含抗體部分之融合蛋白、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要其呈現期望生物活性即可)及如本文所述抗體片段以及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾構型。抗體包括人類種類之抗體，例如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且抗體無需屬於任何特定種類。端視抗體重鏈中恆定結構域之胺基酸序列，可將免疫球蛋白歸類為不同種類。存在5個主要種類之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且可將該等種類中若干種類進一步劃分成亞類(同型物)，例如人類中之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白種類之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同免疫球蛋白種類之亞單位結構及三維構型係為吾人所熟知。
「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留至少一種(較佳大多數或全部)當存在於完整抗體中時通常與該部分有 關之功能。
術語「抗原」通常係指免疫原性組合物或免疫原性物質(包括注射或吸收至個體中之組合物)中可刺激在個體中產生抗體或T細胞反應或二者之生物分子，通常蛋白質、肽、多醣或結合物。可對整個分子或分子之不同部分(例如，表位或半抗原)產生免疫反應。該術語可用於指個別分子或抗原分子之均質或異質群體。藉由抗體、T細胞受體或特定體液及/或細胞免疫性之其他要素識別抗原。「抗原」亦包括所有有關抗原表位。可使用業內熟知之任何數量之表位定位技術來鑑別給定抗原之表位。參見(例如)Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編輯，1996)Humana Press,Totowa,N.J.。舉例而言，可藉由下述方法來確定線性表位：例如在固態支撐體上同時合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子各部分，且在該等肽仍附接至支撐體上時使該等肽與抗體反應。該等技術為業內所習知且闡述於(例如)美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23：709-715；其各自以引用方式併入本文中，如同闡述其全文一般。類似地，構象性表位可藉由用(例如)x射線結晶照相術及二維核磁共振測定胺基酸空間構象加以鑑別。參見(例如)上文Epitope Mapping Protocols。此外，出於本發明目的，「抗原」亦可用於指包括相對於天然序列之修飾(例如缺失、添加及取代(通常在性質上保守，但其可為非保守的)的蛋白質，只要蛋白質維持引發免疫反應之能力即可。該等修飾可係特意進行，如經由定點誘變，或經由特定合成程序，或經由遺傳改造方法，或可係偶然進行，例如經由宿主突變，此會產生抗原。此外，抗原可源自微生物(例如細菌)、自其獲得或分離，或可為全有機體。類似地，寡核苷酸或多核苷酸在(例如)核酸應用中表現抗原，其亦包括於定義中。亦包括合成抗原，例 如，多表位、側接表位及其他重組或合成源抗原(Bergmann等人，(1993)Eur.J.Immunol.23：27772781；Bergmann等人，(1996)J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier(1997)Immunol.Cell Biol.75：402408；Gardner等人，(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland，1998年6月28日至7月3日)。
「保護性」免疫反應係指免疫原性組合物引發(體液或細胞介導或二者)免疫反應之能力，其用於保護個體免於感染。若與對照個體群體(例如未投與疫苗或免疫原性組合物之經感染動物)相比，存在統計上顯著之改良，則所提供保護無需絕對，亦即，無需完全防止或根除感染。保護可限於減輕感染之症狀之嚴重程度或發作之快速性。一般而言，「保護性免疫反應」可包括誘發至少50%個體中對特定抗原具有特異性之抗體含量之增加，包括對每一抗原之可量測功能抗體反應之一定含量。在特定情況下，「保護性免疫反應」可包括誘發至少50%個體中對特定抗原具有特異性之抗體含量增加兩倍或抗體含量增加四倍，包括對每一抗原之可量測功能抗體反應之一定含量。在某些實施例中，受調理素作用抗體與保護性免疫反應相關。因此，可藉由量測調理吞噬分析(例如彼等下文所述者)中細菌計數之減少百分比分析保護性免疫反應。較佳地，細菌計數減少至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。
術語「免疫原性量」及「免疫有效量」在本文中可互換使用，係指足以引發免疫反應(其可為細胞(T細胞)或體液(B細胞或抗體)反應或二者)之抗原或免疫原性組合物之量，其中該免疫反應可藉由彼等熟習此項技術者已知之標準分析量測。通常，免疫有效量將引發個體之保護性免疫反應。
本發明之免疫原性組合物可用於藉助經由全身、皮膚或黏膜途徑投與免疫原性組合物預防性或治療性預防或治療易受細菌(例如， 由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌細菌)感染之個體，或可用於多株或單株抗體製備，該抗體可用於賦予個體被動免疫性。該等投與可包括經由肌內、腹膜腔內、皮內或皮下途徑；或經由黏膜投與至口腔/消化、呼吸或生殖泌尿道。免疫原性組合物可用於產生抗體，其藉由在動物功效模型中殺死細菌或經由調理吞噬殺死分析如所量測具有功能。
可藉由涉及觀察個體適當免疫反應之標準研究確定特定免疫原性組合物之組份之最佳量。在初始疫苗接種後，個體可接受一次或幾次充分間隔之加強免疫。
在某些實施例中，免疫原性組合物將包含一或多種佐劑。如本文所定義，「佐劑」係用於增強本發明之免疫原性組合物之免疫原性的物質。因此，經常給予佐劑以加強免疫反應，且該等佐劑為熟習此項技術者熟知。適於增強組合物之效率之佐劑包括(但不限於)：(1)鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳液調配物(有或無其他特定免疫刺激試劑，例如胞壁醯肽(下文定義)或細菌細胞壁組份)，例如，(a)MF59(PCT公開案第WO 90/14837號)，其含有5%角鯊烯、0.5% Tween 80及0.5% Span 85(視情況含有各種量之MTP-PE(參見下文，儘管不需要))，使用微流化床(例如110Y型微流化床(Microfluidics,Newton,Mass.))調配成亞微米顆粒，(b)SAF，其含有10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5% pluronic封阻之聚合物L121及thr-MDP(參見下文)，微流化成亞微米乳液或渦旋以產生較大粒徑乳液，及(c)RibiTM佐劑系統(RAS)，(Corixa,Hamilton,Mont.)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種由以下組成之群之細菌細胞壁組份：3-O-脫醯化單磷醯脂質A(MPLTM)(闡述於美國專利第4,912,094 號(Corixa)中)、海藻醣二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐劑，例如可使用Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics,Framingham.Mass.)(美國專利第5,057,540號)或自其產生之顆粒，例如ISCOMs(免疫刺激複合物)；(4)細菌脂多醣、合成脂質A類似物，例如胺基烷基葡醣胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或類似物，其係自Corixa購得，且其闡述於美國專利第6,113,918號中；一種該AGP係2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]乙基2-去氧基-4-O-膦醯基-3-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基]-2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]-b-D-葡萄吡喃醣苷，其亦稱作529(先前稱作RC529)，其調配為水性形式或穩定乳液、含有CpG基元之合成多核苷酸(例如寡核苷酸)(美國專利第6,207,646號)；(5)細胞因子，例如介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干擾素(例如，γ干擾素)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、協同刺激分子B7-1及B7-2等；(6)細菌ADP-核醣基化毒素(例如呈野生型或突變形式之霍亂毒素(CT)，例如，其中根據已公開國際專利申請案第WO 00/18434號，胺基酸位置29處之麩胺酸由另一胺基酸(較佳)組胺酸替代)(亦參見WO 02/098368及WO 02/098369)、百日咳毒素(PT)或埃希氏大腸桿菌不耐熱毒素(LT)(具體而言LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(例如，參見WO 93/13302及WO 92/19265))之去毒突變體；及(7)用作免疫刺激試劑以增強組合物之效率之其他物質。
胞壁醯肽包括(但不限於)N-乙醯基胞壁醯-L-蘇胺醯基-D-異麩胺醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基正胞壁醯-L-丙胺酸-2-(1'-2'二棕櫚醯基-sn- 甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些實施例中，佐劑係基於鋁之佐劑，例如鋁鹽。在具體實施例中，基於鋁之佐劑係選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群。在具體實施例中，佐劑係磷酸鋁。
免疫原組合物可視情況包含醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑包括由聯邦、州政府管理機構或其他管理機構批准或列舉於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認藥典中可用於個體(包括人類以及非人類哺乳動物)中的載劑。術語載劑可用於指與醫藥組合物一起投與之稀釋劑、賦形劑或媒劑。亦可採用水、鹽水溶液及水性右旋醣及甘油溶液作為液體載劑，尤其對於可注射溶液而言。適宜醫藥載劑之實例闡述於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。調配物應適合投與方式。
除複數種莢膜多醣-蛋白結合物外，本發明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種防腐劑。FDA需要多劑量(multiple-dose，multi-dose)小瓶中之生物產品含有防腐劑，僅少量例外。含有防腐劑之疫苗產品包括含有苄索氯銨(anthrax)、2-苯氧基乙醇(DTaP,HepA,Lyme,Polio(非經腸))、苯酚(Pneumo,Typhoid(非經腸)，Vaccinia)及硫柳汞(DTaP,DT,Td,HepB,Hib,Influenza,JE,Mening,Pneumo,Rabies)之疫苗。批准用於可注射藥物中之防腐劑包括(例如)氯丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯銨、苯紮氯銨、苯甲酸、苄醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
在某些實施例中，與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種非離子型表面活性劑(包括但不限於聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(Tween 80)、聚山梨醇酯-60(Tween 60)、聚山梨醇酯-40(Tween 40)及聚山梨醇酯-20(Tween 20))、聚氧乙烯烷基醚(包括但不限於Brij 58、Brij 35)、以及其他物質，例如Triton X-100、 Triton X- 114、NP40、Span 85及Pluronic系列非離子型表面活性劑(例如，Pluronic 121)，其中較佳組份聚山梨醇酯-80濃度為約0.001%至約2%(高達約0.25%較佳)或聚山梨醇酯-40濃度為約0.001%至1%(高達約0.5%較佳)。
包裝及投藥形式
藉由非經腸投與(經肌內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內或投與至組織之間質空間)；或經由黏膜投與至口腔/消化、呼吸或生殖泌尿道；或藉由局部、經皮、鼻內、經眼、經耳、經肺或其他黏膜投與來完成本發明之免疫原性組合物直接遞送至個體。
在一個實施例中，非經腸投與係藉由肌內注射，例如投與至個體之大腿或上臂。注射可經由針(例如皮下針)，但或者可使用無針注射。典型肌內劑量係0.5mL。在另一實施例中，鼻內投與用於治療肺炎或中耳炎(由於可更有效地防止鼻咽部肺炎球菌，由此減弱其最早階段之感染)。
本發明組合物可以各種形式製備，例如，以液體溶液或懸浮液形式注射。在某些實施例中，組合物可製備為粉劑或噴霧用於經肺投與，例如在吸入器中。在其他實施例中，組合物可製備為栓劑或陰道栓，或用於以(例如)噴霧、滴劑、凝膠或粉劑形式經鼻、經耳或經眼投與。
醣結合物於每一免疫原性組合物劑量中之量選擇為誘發免疫保護反應而無顯著有害效應之量。該量可端視醣結合物中存在之細菌血清型變化。通常，每一劑量將包含0.1μg至100μg、具體而言0.1μg至10μg且更具體而言1μg至5μg多醣。
在本發明之特定實施例中，免疫原性組合物係經由eTEC連接體個別結合至CRM197之Pn或Mn莢膜多醣的無菌液體調配物，其中每一0.5mL劑量經調配以含有1-5μg多醣，其可進一步含有0.125mg元素 鋁(0.5mg磷酸鋁)佐劑及氯化鈉及琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。
可藉由涉及個體中之適當免疫反應之觀察之標準研究確定對於特定免疫原性組合物之最佳組份量。在初始疫苗接種後，個體可接受一次或若干次充分間隔之加強免疫。
本發明之免疫原性組合物可以單位劑量或多劑量形式(例如，2個劑量、4個劑量或更多個劑量)包裝。對於多劑量形式而言，小瓶通常(但不必)優於預填充注射器。適宜多劑量模式包括(但不限於)2至10個劑量/容器，0.1mL至2mL/劑量。在某些實施例中，劑量係0.5mL劑量。參見(例如)國際專利申請案WO 2007/127668，其以引用方式併入本文中。
組合物可提供於小瓶或其他適宜儲存容器中，或可提供於預填充遞送裝置(例如，單一或多個組份注射器)中，該等裝置可供應有或無針。注射器通常(但不必)含有含防腐劑之本發明免疫原性組合物的單一劑量，但亦預期多劑量之預填充注射器。同樣，小瓶可包括單一劑量，但或者可包括多劑量。
可按照常規確立有效劑量體積，但用於注射之組合物之典型劑量具有0.5mL之體積。在某些實施例中，劑量調配用於投與人類個體。在某些實施例中，劑量調配用於投與成人、少年、青少年、幼兒或嬰兒(亦即，不超過1歲)人類個體且在較佳實施例中可藉由注射投與。
本發明之液體免疫原性組合物亦適於復原以凍乾形式提供之其他免疫原性組合物。若免疫原性組合物欲用於該臨時復原，則本發明提供具有兩個或更多個小瓶、兩個或更多個即填充注射器或每一者之一或多個的套組，其中注射器之內容物用於在注射之前復原小瓶之內容物或反之亦然。
在再一實施例中，多劑量模式之容器選自由以下組成之群之一 或多者(但不限於)：通用實驗室玻璃儀器、燒瓶、燒杯、量筒、發酵器、生物反應器、管道系統、管、袋、罐、小瓶、小瓶密封件(例如，橡膠塞、蓋上之螺釘)、安瓿、注射器、雙重或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡膠封閉件、塑膠封閉件、玻璃封閉件、芯柱及可棄式筆及諸如此類。本發明之容器並不受製造材料限制，且包括諸如玻璃、金屬(例如，鋼、不銹鋼、鋁等)及聚合物(例如，熱塑性塑膠、彈性體、熱塑性-彈性體)等材料。在特定實施例中，模式之容器係具有丁基塞之5mL Schott 1型玻璃小瓶。本發明.熟習此項技術者應瞭解，上述模式絕非窮盡性列表，而是僅用作熟習此項技術者關於各種可用本發明之模式之指南。預計用於本發明中之額外模式可參見來自實驗室設備供應商及製造商(例如United States Plastic公司(Lima,OH),VWR)之已公開目錄。
誘發免疫反應及保護抵抗感染之方法
本發明亦包括預防性或治療性使用eTEC連接之醣結合物及包含其之免疫原性組合物的方法。舉例而言，本發明之一個態樣提供誘發針對病原性細菌(例如肺炎球菌或腦膜炎球菌細菌)之免疫反應的方法，其包含向個體投與免疫有效量之本文所述包含細菌抗原(例如源自病原性細菌之細菌莢膜多醣)之任何免疫原性組合物。本發明之一個實施例提供保護個體免於病原性細菌感染之方法、或預防、治療或改善與病原性細菌相關之感染疾病或病況的方法或減輕與由病原性細菌引起之感染相關之至少一種症狀的嚴重程度或延遲其發展的方法，在每一情形下，該等方法皆包含向個體投與免疫有效量之本文所述包含細菌抗原(例如源自病原性細菌之細菌莢膜多醣)之任何免疫原性組合物。
本發明之一個實施例提供預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病況的方法，其包含向該個體投與免疫有效量之本發明免疫原 性組合物，其中該免疫原性組合物包含含有細菌抗原(例如細菌莢膜多醣)之eTEC連接之醣結合物。
在一些實施例中，預防、治療或改善細菌感染、疾病或病況之方法包含人類、獸醫、動物或農業治療。另一實施例提供預防、治療或改善個體中與病原性細菌相關之細菌感染、疾病或病況的方法，該方法包含自本文所述免疫原性組合物產生多株或單株抗體製劑及使用該抗體製劑以賦予個體被動免疫性。本發明之一個實施例提供預防經歷手術程序之個體之細菌感染的方法，該方法包含在手術程序之前向個體投與預防有效量之本文所述免疫原性組合物的步驟。
在每一上述方法之較佳實施例中，病原性細菌係肺炎球菌或腦膜炎球菌細菌，例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌細菌。在一些該等實施例中，細菌抗原係選自由以下組成之群之莢膜多醣：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。在其他該等實施例中，細菌抗原係選自由以下組成之群之莢膜多醣：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
對抗原或免疫原性組合物之免疫反應的特徵在於在個體中對目標抗原或免疫原性組合物中存在之分子發生體液及/或細胞介導之免疫反應。出於本發明之目的，「體液免疫反應」係抗體介導之免疫反應且涉及誘發及產生識別本發明免疫原性組合物中之抗原之一定親和性並與其結合之抗體，而「細胞介導之免疫反應」係由T細胞及/或其他白血球介導者。「細胞介導之免疫反應」係藉由呈遞與主要組織相容性複合物(MHC)之I類或II類分子、CD1或其他非典型MHC樣分子締合之抗原表位來引發。此活化抗原特異性CD4+ T輔助細胞或CD8+細胞毒性T淋巴細胞(「CTL」)。CTL對與由典型或非典型MHC編碼且在細胞表面上表現之蛋白質締合呈遞的肽抗原具有特異性。CTL有助 於誘發並促進細胞內微生物之細胞內破壞或經該等微生物感染之細胞之裂解。細胞免疫性之另一態樣涉及由輔助T細胞之抗原特異性反應。輔助T細胞用於幫助刺激非特異性效應子細胞對抗表面上展示與經典或非經典MHC分子締合之肽或其他抗原之細胞的功能，且集中於此活性上。「細胞介導之免疫反應」亦係指細胞因子、趨化因子及由活化T細胞及/或其他白血球(包括彼等源自CD4+及CD8+ T細胞者)產生之其他該等分子的產生。特定抗原或組合物刺激細胞介導之免疫反應之能力可藉由多種分析(例如藉由淋巴組織增殖(淋巴細胞活化)分析、CTL細胞毒性細胞分析、藉由分析對敏感化個體中之抗原具有特異性之T淋巴細胞或藉由量測由T細胞因應抗原之重新刺激的細胞因子產生)測定。該等分析已為業內所熟知。參見(例如)Erickson等人，(1993)J.Immunol.151：4189-4199；及Doe等人，(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376。
本發明之免疫原性組合物及方法可用於以下中之一或多者：(i)預防感染或再感染，如在傳統疫苗中，(ii)減輕症狀之嚴重程度或消除症狀，及/或(iii)實質上或完全消除所述病原體或病症。因此，治療可以預防方式(在感染之前)或以治療方式(在感染後)實施。在本發明中，預防性治療係較佳模式。根據本發明之特定實施例，提供治療(包括預防及/或治療性免疫)宿主個體抵抗由(例如)肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌之細菌感染的組合物及方法。本發明方法可用於賦予個體預防及/或治療免疫性。本發明方法亦可在個體上實踐用於生物醫學研究應用。
本文所用術語「個體」意指人類或非人類動物。更具體而言，個體係指分類為哺乳動物(包括人類)、家養及農村動物、及研究、動物園、運動及寵物伴侶動物(例如家庭寵物及其他馴養動物(包括(但不限於)牛、羊、雪貂、豬、馬、兔、山羊、狗、貓及諸如此類))。較佳 伴侶動物係狗及貓。較佳地，個體係人類。
通常基於結合及未結合該結合物之多醣之總量計算組合物中之特定結合物之量。舉例而言，在100μg多醣劑量中，具有20%自由多醣之結合物將具有約80μg結合多醣及約20μg未結合多醣。在計算結合物之劑量時，通常不考慮蛋白質對結合物之貢獻。結合物或免疫原性組合物之免疫原性量可端視細菌血清型變化。通常，每一劑量將包含0.1μg至100μg、具體而言0.1μg至10μg且更具體而言1μg至10μg多醣。免疫原性組合物中之不同多醣組份之免疫原性量可有差異且各自可包含1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg或約100μg任何特定多醣抗原。
術語「侵襲性疾病」係指細菌自正常無菌位點分離，其中存在疾病之相關臨床體徵/症狀。正常無菌體位點包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關節/滑液、骨、內部體位點(淋巴結、腦、心臟、肺、脾、玻璃體液、腎、胰臟、卵巢)或其他正常無菌位點。表徵侵襲性疾病之臨床病況包括菌血症、肺炎、蜂窩織炎、骨髓炎、心內膜炎、敗血性休克及更多病況。
可藉由增殖分析、藉由細胞溶解分析(例如用於量測T細胞溶解其特異性靶細胞之能力的鉻釋放分析)或藉由量測B細胞活性量(其係藉由量測對血清中之抗原具有特異性之循環抗體之量來完成)來量測作為免疫原之抗原之效率。亦可藉由量測在投與抗原後誘發之抗原特異性抗體之血清含量、且更特定而言藉由量測如此誘發之抗體增強如本文所述特定白血球之調理吞噬能力來檢測免疫反應。可藉由攻擊用已投與之抗原免疫之宿主來量測免疫反應之保護程度。舉例而言，若期望免疫反應之抗原係細菌，則藉由檢測用細菌細胞攻擊動物後之存活百分比或死亡百分比量測由抗原之免疫原性量誘發之保護程度。在一 個實施例中，可藉由量測至少一種與細菌感染相關之症狀(例如與感染相關之發熱)來量測保護之量。多抗原或多組份疫苗或免疫原性組合物中之每一抗原之量可相對於其他每一組份變化且可藉由彼等熟習此項技術者已知之方法測定。該等方法可包括量測免疫原性及/或活體內功效之程序。
在另一態樣中，本發明提供特異性並選擇性結合至莢膜多醣或本發明之醣結合物的抗體及抗體組合物。在一些該等實施例中，本發明提供特異性並選擇性結合至Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F莢膜多醣或包含其之醣結合物的抗體及抗體組合物。在其他該等實施例中，本發明提供特異性並選擇性結合至Mn-血清型A、C、W135或Y莢膜多醣或包含其之醣結合物的抗體及抗體組合物。在一些實施例中，在向個體投與莢膜多醣或本發明之醣結合物後產生抗體。在一些實施例中，本發明提供針對莢膜多醣或本發明之醣結合物中之一或多者之純化或分離抗體。本發明之抗體藉由在動物功效模型中殺死細菌或經由調理吞噬殺死分析如所量測具有功能。本發明之抗體或抗體組合物可用於治療或預防個體中與病原性細菌(例如，肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟菌細菌)相關之細菌感染、疾病或病況的方法，該方法包含產生多株或單株抗體製劑並使用該抗體或抗體組合物以賦予個體被動免疫性。本發明之抗體亦可用於診斷方法，例如，檢測莢膜多醣或其醣結合物之存在或對其含量進行定量。舉例而言，本發明之抗體亦可用於檢測Pn或Mn莢膜多醣或其醣結合物之存在或對其含量進行定量，其中醣結合物包含經由eTEC間隔體結合至載體蛋白之細菌莢膜多醣。
可使用業內已知之若干分析及動物模型來評定本文所述免疫原性組合物中之任一者之功效。舉例而言，Chiavolini等人，Clin. Microbiol.Rev.(2008),21(4)：666-685)闡述肺炎鏈球菌疾病之動物模型。Gorringe等人，METHODS IN MOLECULAR MEDICINE，第66卷(2001)，第17章，Pollard及Maiden編輯(Humana Press公司)闡述腦膜炎球菌疾病之動物模型。
調理吞噬活性(OPA)分析
OPA分析程序係基於由先前Hu等人(Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005；12(2)：287-95)闡述之方法，具有以下修飾。將熱滅活血清在緩衝液中連續稀釋2.5倍。將靶細菌添加至分析板中並於25℃下在振盪器上培育30min。隨後將仔兔補體(3至4週齡，Pel-Freez，12.5%最終濃度)及分化HL-60細胞以200：1之近似效應子對靶比率添加至每一孔中。將分析板於37℃下在振盪器上培育45min.為終止反應，將80μL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，並將10-μL等份試樣轉移至含有200μL水之Millipore,MultiScreenHTS HV濾板之孔。在真空下經由板過濾液體，並向每一孔中添加150μL HySoy培養基並進行過濾。隨後將濾板於37℃、5% CO2下培育過夜且隨後利用Destain溶液(Bio-Rad)固定。隨後將板用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色並脫色一次。使純系成像並在Cellular Technology Limited(CTL)ImmunoSpot Analyzer®上計數。自涵蓋與不含免疫血清之對照孔相比細菌純系之數目減少50%之點的兩個血清稀釋液之倒數內插OPA抗體效價。
以上揭示內容概括闡述了本發明。藉由參照以下特定實例可獲得更全面理解。該等實例僅用於闡釋目的而非意欲限定本發明之範圍。
實例 實例1. eTEC連接之醣結合物之製備之一般製程 醣之活化及利用胱胺二鹽酸鹽之硫醇化
將醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由卡費雪(Karl Fischer，KF)分析測定溶液之水份含量且對其進行調節以達到0.1%及0.4%、通常0.2%之水份含量。
為開始活化，以100mg/mL之濃度在DMSO中新鮮製備1,1'-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)之溶液。利用不同量CDT/CDI(1-10莫耳濃度當量)活化醣且於23±2℃下使反應進行1小時。可藉由HPLC測定活化程度。以50mg/mL之濃度在無水DMSO中新鮮製備胱胺二鹽酸鹽。使活化醣與1莫耳當量胱胺二鹽酸鹽反應。或者，使活化醣與1莫耳當量半胱胺二鹽酸鹽反應。於23±2℃下使硫醇化反應進行21±2小時，以產生硫醇化醣。藉由CDT/CDI之添加量測定硫醇化程度。
藉由添加100mM四硼酸鈉(pH 9.0溶液)驟冷活化反應溶液中之殘餘CDT/CDI。實施計算以測定四硼酸酯之添加量並將最終水份含量調節至佔總水性溶液之至多1-2%。
活化硫醇化醣之還原及純化
藉由添加至0.9%鹽水中之預先冷藏之5mM琥珀酸鈉(pH 6.0)中將硫醇化醣反應混合物稀釋10倍並經由5μm濾膜過濾。以40倍體積倍數之WFI實施硫醇化醣之滲濾。在滯留物由10體積%之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)稀釋後向其中添加1-5莫耳當量之叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)溶液。於5±3℃下使此還原反應進行20±2小時。較佳藉由以預先冷藏之10mM磷酸二氫鈉(pH 4.3)超濾/滲濾實施活化硫醇化醣之純化。或者，藉由標準尺寸排除層析(SEC)程序或離子交換層析方法純化硫醇化醣。抽出活化硫醇化醣滯留物之等份試樣以測定醣濃度及硫醇含量(Ellman)分析。
溴乙醯基化載體蛋白之活化及純化
藉由與溴乙醯化試劑(例如溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯 (BAANS)、溴乙醯基溴化物)或另一適宜試劑反應使載體蛋白之自由胺基溴乙醯化。
在活化之前，首先將載體蛋白(存於0.1M磷酸鈉中，pH 8.0±0.2)保持於8±3℃、約pH 7下。向蛋白溶液中以0.25-0.5 BAANS：蛋白質(w/w)之比率添加溴乙酸之N-羥基琥珀醯亞胺酯(BAANS)作為二甲亞碸(DMSO)儲存溶液(20mg/mL)。於5±3℃下將反應物輕輕混合30-60分鐘。藉由(例如)超濾/滲濾使用10kDa MWCO膜使用10mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液純化所得溴乙醯基化(活化)。在純化後，藉由Lowry蛋白分析估計溴乙醯基化載體蛋白之蛋白質濃度。
藉由總溴化物分析藉由離子交換液相層析伴隨抑制電導檢測(離子層析)測定活化程度。自分析試樣製劑中之蛋白質解離活化溴乙醯基化蛋白質上之結合溴化物並與可存在之任何自由溴化物一起定量。蛋白質上之任何剩餘共價結合溴化物藉由在鹼性2-巰基乙醇中加熱試樣轉化成溴離子得以釋放。
溴乙醯基化CRM 197 之活化及純化
將CRM197用10mM磷酸鹽緩衝之0.9% NaCl pH 7(PBS)稀釋至5mg/mL且隨後使用1M儲存溶液製得0.1M NaHCO3 pH 7.0。使用20mg/mL DMSO之BAANS儲存溶液以1：0.35(w：w)之CRM197：BAANS比率添加BAANS。將反應混合物於3℃與11℃之間培育30min至1小時，隨後藉由超濾/滲濾使用10K MWCO膜及10mM磷酸鈉/0.9% NaCl(pH 7.0)純化。藉由Lowry分析來分析純化之活化CRM197以測定蛋白質濃度且隨後用PBS稀釋至5mg/mL。添加作為冷凍保護劑之蔗醣至5% wt/vol且將活化蛋白質於-25℃下冷凍並儲存直至結合需要為止。
CRM197之離胺酸殘基之溴乙醯基化極為一致，從而引起39個可用離胺酸之15至25個離胺酸活化。反應產生高活化蛋白質產率。
活化硫醇化醣與溴乙醯基化載體蛋白之結合
在開始結合反應之前，將反應容器預冷卻至5℃。隨後添加溴乙醯基化載體蛋白及活化硫醇化醣並以150-200rpm之攪動速度混合。醣/蛋白質輸入比率係0.9±0.1。用1M NaOH溶液將反應pH調節至8.0±0.1。於5℃下使結合反應進行20±2小時。
殘餘反應性官能基之封端
藉由於5℃下與2莫耳當量N-乙醯基-L-半胱胺酸作為封端劑反應3小時使載體蛋白上之未反應溴乙醯基化殘基驟冷。於5℃下用4莫耳當量碘乙醯胺(IAA)使殘餘自由巰基封端20小時。
eTEC連接之醣結合物之純化
經由0.45μm濾膜過濾結合反應(IAA封端後)混合物。以5mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)實施醣結合物之超濾/滲濾。隨後經由0.2μm濾膜過濾醣結合物滯留物。抽出醣結合物之等份試樣用於分析。於5℃下儲存剩餘醣結合物。
實例2. Pn-33F eTEC結合物之製備 活化製程 Pn33F多醣之活化
用500mM 1,2,4-三唑(存於WFI中)複合Pn-33F多醣以獲得10克三唑/克多醣。將混合物在乾燥冰-乙醇浴中殼冷凍且隨後凍乾至乾燥。將凍乾之33F多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由卡費雪(KF)分析測定經凍乾之33F/DMSO溶液之水份含量。藉由將WFI添加至33F/DMSO溶液中調節水份含量以達到0.2%之水份含量。
為開始活化，以存於DMSO溶液中之100mg/mL新鮮製備1,1'-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)。在硫醇化步驟之前用不同量之CDT活化Pn33F多醣。於23±2℃下實施CDT活化1小時。藉由HPLC(A220/A205)測定活化程度。添加100mM四硼酸鈉(pH 9.0溶液)以驟冷活化反應溶液中之任何殘餘CDT。實施計算以測定四硼酸酯之量並 使得最終水份含量為總水性溶液之1.2%。使反應於23±2℃下進行1小時。
活化Pn-33F多醣之硫醇化
在無水DMSO中新鮮製備胱胺-二鹽酸鹽並向活化多醣反應溶液中添加1莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽。使反應於23±2℃下進行21±2小時。藉由添加至0.9%鹽水中之預先冷藏之5mM琥珀酸鈉(pH 6.0)將硫醇化醣溶液稀釋10倍。經由5μm濾膜過濾稀釋之反應溶液。利用100K MWCO超濾膜盒使用注射用水(WFI)實施硫醇化Pn-33F多醣之滲濾。
隨CDT之莫耳濃度當量變化之活化Pn-33F多醣之硫醇化程度示於圖8中。
活化硫醇化Pn-33F多醣之還原及純化
在滯留物由10體積%之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)稀釋後向其中添加5莫耳當量之叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)溶液。於23±2℃下使此還原反應進行2±1小時。利用100K MWCO超濾膜盒實施硫醇化33F多醣之滲濾。以預先冷藏之10mM磷酸鈉(pH 4.3)實施滲濾。抽出硫醇化33F多醣滯留物用於醣濃度及硫醇(Ellman)分析。活化製程之流程圖提供於圖7(A)中。
結合製程 硫醇化Pn33F多醣與溴乙醯基化CRM 197 之結合
藉由溴乙醯基化單獨活化CRM197載體蛋白，如實例1中所述，且隨後使其與活化Pn-33F多醣反應用於結合反應。在開始結合反應之前，將反應容器預冷卻至5℃。以150-200rpm之攪動速度將溴乙醯基化CRM197及硫醇化33F多醣在反應容器中混合在一起。醣/蛋白質輸入比率係0.9±0.1。將反應pH調節至8.0-9.0。於5℃下使結合反應進行20±2小時。
溴乙醯基化CRM 197 及硫醇化Pn33F多醣上之反應基團之封端
藉由於5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3小時使CRM197蛋白質上之未反應之溴乙醯基化殘基封端，之後藉由於5℃下與4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)反應20小時使硫醇化33F-多醣之任何殘餘自由巰基封端。
eTEC連接之Pn-33F醣結合物之純化
經由0.45μm或5μm濾膜過濾結合溶液。利用300K MWCO超濾膜盒實施33F醣結合物之滲濾。以5mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)實施滲濾。隨後經由0.22μm濾膜過濾Pn-33F醣結合物300K滯留物並於5℃下儲存。
結合製程之流程圖提供於圖7(B)中。
結果
若干批次之Pn-33F eTEC醣結合物之反應參數及表徵數據示於表2中。利用胱胺二鹽酸鹽之CDT活化-硫醇化產生具有63%至90%醣產率及<1%至13%自由醣之醣結合物。
與CRM 197 之Pn-33F eTEC醣結合物之OPA效價
在標準條件下測定小鼠中之Pn-33F OPA效價。4週及7週時之OPA效價(GMT，具有95% CI)示於表3中，此證實血清型33F Pn醣結合物在鼠類免疫原性模型中引發OPA效價。
實例3. Pn-22F eTEC結合物之製備 活化製程 Pn-22F多醣之活化
用500mM 1,2,4-三唑(存於WFI中)複合Pn-22F多醣以獲得10克三唑/克多醣。將混合物在乾燥冰-乙醇浴中殼冷凍且隨後凍乾至乾燥。將凍乾之22F多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由卡費雪(KF)分析測定經凍乾之33F/DMSO溶液之水份含量。藉由將WFI添加至Pn-22F/DMSO溶液中調節水份含量以達到0.2%之水份含量。
為開始活化，以存於DMSO溶液中之100mg/mL新鮮製備1,1'-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)。用不同量之CDT活化Pn-22F多醣，之後用1莫耳當量胱胺二鹽酸鹽硫醇化。於23±2℃下實施CDT活化1小時。藉由HPLC(A220/A205)測定活化程度。添加100mM四硼酸鈉(pH 9.0溶液)以驟冷活化反應溶液中之任何殘餘CDT。實施計算以測定四硼酸酯之量並使得最終水份含量為總水性溶液之1.2%。使反應於23±2℃下進行1小時。
活化Pn-22F多醣之硫醇化
在無水DMSO中新鮮製備胱胺-二鹽酸鹽並將其添加至反應溶液中。使反應於23±2℃下進行21±2小時。藉由添加至0.9%鹽水中之 預先冷藏之5mM琥珀酸鈉(pH 6.0)將硫醇化醣溶液稀釋10倍。經由5μm濾膜過濾稀釋之反應溶液。利用100K MWCO超濾膜盒使用注射用水(WFI)實施硫醇化Pn-22F多醣之滲濾。
活化硫醇化Pn-22F多醣之還原及純化
在滯留物由10體積%之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)稀釋後向其中添加5莫耳當量之叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)溶液。於23±2℃下使此還原反應進行2±1小時。利用100K MWCO超濾膜盒實施硫醇化22F多醣之滲濾。以預先冷藏之10mM磷酸鈉(pH 4.3)實施滲濾。抽出硫醇化22F多醣滯留物用於醣濃度及硫醇(Ellman)分析。
Pn-22F eTEC醣結合物之結合、封端及純化
根據實例2中所述製程實施活化硫醇化Pn22F多醣與活化CRM197之結合、Pn-22F eTEC醣結合物之封端及純化。
結果
與CRM197之代表性Pn-22F eTEC醣結合物之表徵及製程數據提供於表4中。
實例4 與CRM 197 之Pn-10A eTEC結合物之製備 Pn-10A eTEC醣結合物之製備
根據實例2中所述之製程製備包含肺炎球菌莢膜多醣血清型10A(Pn-10A)且經由eTEC間隔體結合至CRM197之醣結合物。
Pn-10A eTEC醣結合物之表徵
與CRM197之代表性Pn-10A eTEC醣結合物之表徵及製程數據提供於表5中。
Pn-10A OPA效價
在標準條件下測定針對小鼠中與CRM197之Pn-10A eTEC結合物的OPA效價。隨劑量變化之OPA效價示於表6中。
實例5 與CRM 197 之Pn-11A eTEC結合物之製備 Pn-11A eTEC醣結合物之製備
根據實例2中所述之製程製備包含肺炎球菌莢膜多醣血清型11A(Pn-11A)且經由eTEC間隔體結合至CRM197之醣結合物。
Pn-11A eTEC醣結合物之表徵
與CRM197之代表性Pn-11A eTEC醣結合物之表徵及製程數據提供於表7中。
Pn-11A OPA效價
在標準條件下測定針對小鼠中與CRM197之Pn-11A eTEC結合物的OPA效價。隨劑量變化之OPA效價示於表8中。
說明書中所提及之所有出版物及專利申請案皆可顯示熟習本發明所屬領域技術者之熟練程度。所有出版物及專利申請案均以引用方式併入本文中，其程度如同將每一個別出版物或專利申請案特定地及個別地所指以引用方式併入本文中。
儘管出於清晰理解之目的藉助闡釋及實例在某些細節上闡述了上述發明，但可在隨附申請專利範圍之範疇內實踐某些變化及修飾。

Claims (62)

  1. 一種製造醣結合物之方法，該醣結合物包含醣經由(2-((2-側氧基(oxo)乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔體結合至載體蛋白，該方法包含以下步驟：a)使醣與1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)在有機溶劑中反應以產生活化醣；b)使該活化醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使該硫醇化醣與還原劑反應以產生包含一或多個自由巰基殘基之活化硫醇化醣；d)使該活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵乙醯胺基團之活化載體蛋白反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白結合物；及e)使該硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下反應：(i)能夠使該活化載體蛋白之未結合α-鹵乙醯胺基團封端(capping)之第一封端試劑；及/或(ii)能夠使未結合之自由巰基殘基封端之第二封端試劑；藉此產生eTEC連接之醣結合物。
  2. 如請求項1之方法，其中該封端步驟e)包含使該硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下反應：(i)作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸，及/或(ii)作為第二封端試劑之碘乙醯胺。
  3. 如請求項1或2之方法，其進一步包含使該醣與三唑或咪唑反應以提供複合醣(compounded saccharide)的複合步驟，其中該複合醣經殼冷凍(shell frozen)，凍乾及在步驟a)之前在有機溶劑中復原。
  4. 如請求項1、2或3之方法，其進一步包含純化步驟c)中產生之該 硫醇化多醣，其中該純化步驟包含滲濾(diafiltration)。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中步驟c)中之該還原劑係叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)、二硫蘇醣醇(DTT)或巰基乙醇。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中用活化之溴乙酸衍生物活化該載體蛋白。
  7. 如請求項6之方法，其中該溴乙酸衍生物係溴乙酸之N-羥基琥珀醯亞胺酯(BAANS)。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該方法進一步包含藉由滲濾純化該eTEC連接之醣結合物。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中步驟a)中之有機溶劑係選自由以下組成之群之極性非質子溶劑：二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)及六甲基磷醯胺(HMPA)或其混合物。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.2與4之間。
  11. 如請求項10之方法，其中該醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.4與1.7之間。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該醣係源自肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)之莢膜多醣。
  13. 如請求項12之方法，其中該莢膜多醣係選自由以下組成之群：肺炎球菌(Pn)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
  14. 如請求項13之方法，其中該莢膜多醣係Pn-血清型33F莢膜多醣。
  15. 如請求項13之方法，其中該莢膜多醣係Pn-血清型22F莢膜多醣。
  16. 如請求項13之方法，其中該莢膜多醣係Pn-血清型10A莢膜多醣。
  17. 如請求項13之方法，其中該莢膜多醣係Pn-血清型11A莢膜多醣。
  18. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該醣係源自腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)之莢膜多醣。
  19. 如請求項19之醣結合物，其中該莢膜多醣係選自由以下組成之群：腦膜炎球菌(Mn)-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該載體蛋白係CRM197。
  21. 一種醣結合物，其係由如請求項1至20中任一項之方法產生。
  22. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項21之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  23. 一種醣結合物，其包含細菌莢膜多醣經由eTEC間隔體結合至載體蛋白，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵聯共價連接至該eTEC間隔體，且其中該載體蛋白經由醯胺鍵聯共價連接至該eTEC間隔體。
  24. 如請求項23之醣結合物，其中該莢膜多醣係源自肺炎鏈球菌。
  25. 如請求項24之醣結合物，其中該莢膜多醣係選自由以下組成之群：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
  26. 如請求項25之醣結合物，其中該莢膜多醣係Pn-血清型33F莢膜多醣。
  27. 如請求項25之醣結合物，其中該莢膜多醣係Pn-血清型22F莢膜多醣。
  28. 如請求項25之醣結合物，其中該莢膜多醣係Pn-血清型10A莢膜多醣。
  29. 如請求項25之醣結合物，其中該莢膜多醣係Pn-血清型11A莢膜多醣。
  30. 如請求項23之醣結合物，其中該莢膜多醣係源自腦膜炎奈瑟菌。
  31. 如請求項30之醣結合物，其中該莢膜多醣係選自由以下組成之群：Mn-血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
  32. 如請求項23至31中任一項之醣結合物，其中該多醣具有介於10kDa與2,000kDa之間之分子量。
  33. 如請求項32之醣結合物，其中該多醣具有介於50kDa與2,000kDa之間之分子量。
  34. 如請求項23至33中任一項之醣結合物，其中該醣結合物具有介於50kDa與20,000kDa之間之分子量。
  35. 如請求項34之醣結合物，其中該醣結合物具有介於500kDa與10,000kDa之間之分子量。
  36. 如請求項23至35中任一項之醣結合物，其中該多醣具有介於75%至100%之間之O-乙醯基化程度。
  37. 如請求項23至36中任一項之醣結合物，其中該載體蛋白係CRM197。
  38. 如請求項37之醣結合物，其中該CRM197包含2至20個離胺酸殘基經由eTEC間隔體共價連接至該多醣。
  39. 如請求項37之醣結合物，其中該CRM197包含4至16個離胺酸殘基經由eTEC間隔體共價連接至該多醣。
  40. 如請求項23至39中任一項之醣結合物，其中該醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.2與4之間。
  41. 如請求項40之醣結合物，其中該醣：載體蛋白之比(w/w)介於0.4與1.7之間。
  42. 如請求項37之醣結合物，其中CRM197與醣之間至少一個鍵聯發生在該醣之每25個醣重複單元。
  43. 如請求項37之醣結合物，其中CRM197與醣之間至少一個鍵聯發生在該醣之每15個醣重複單元。
  44. 如請求項37之醣結合物，其中CRM197與醣之間至少一個鍵聯發生在該醣之每10個醣重複單元。
  45. 如請求項37之醣結合物，其中CRM197與醣之間至少一個鍵聯發生在該醣之每4個醣重複單元。
  46. 如請求項23至45中任一項之醣結合物，其包含與醣之總量相比小於15%之自由醣。
  47. 如請求項23至46中任一項之醣結合物，其於0.3具有35%之分子大小分佈(Kd)。
  48. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項23至47中任一項之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  49. 如請求項48之免疫原性組合物，其進一步包含另外抗原。
  50. 如請求項49之免疫原性組合物，其中該另外抗原包含蛋白抗原或源自肺炎鏈球菌之莢膜多醣的醣結合物。
  51. 如請求項50之免疫原性組合物，其中該另外抗原包含選自由以下組成之群之莢膜多醣的醣結合物：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
  52. 如請求項49之免疫原性組合物，其中該另外抗原包含蛋白抗原或源自腦膜炎奈瑟菌之莢膜多醣的醣結合物。
  53. 如請求項52之免疫原性組合物，其中該另外抗原包含選自由以下組成之群之莢膜多醣之醣結合物：血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
  54. 如請求項48至53中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
  55. 如請求項54之免疫原性組合物，其中該佐劑係基於鋁之佐劑。
  56. 如請求項55之免疫原性組合物，其中該基於鋁之佐劑係選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群。
  57. 一種預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病況的方法，其包含向該個體投與免疫有效量之如請求項48至56中任一項之免疫原性組合物。
  58. 如請求項57之方法，其中該感染、疾病或病況係與肺炎鏈球菌細菌相關，且該醣結合物包含選自由以下組成之群之莢膜多醣：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
  59. 如請求項57之方法，其中該感染、疾病或病況係與腦膜炎奈瑟菌細菌相關，且該醣結合物包含選自由以下組成之群之莢膜多醣：血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
  60. 一種誘發個體之保護性免疫反應之方法，其包含向該個體投與免疫有效量之如請求項48至56中任一項之免疫原性組合物。
  61. 如請求項60之方法，其中該細菌莢膜多醣係選自由以下組成之群之莢膜多醣：Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F莢膜多醣。
  62. 如請求項60之方法，其中該細菌莢膜多醣係選自由以下組成之群之莢膜多醣：血清型A、C、W135及Y莢膜多醣。
TW102129348A 2012-08-16 2013-08-15 醣結合方法及組合物 TWI480049B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261684043P 2012-08-16 2012-08-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201420115A true TW201420115A (zh) 2014-06-01
TWI480049B TWI480049B (zh) 2015-04-11

Family

ID=49385307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102129348A TWI480049B (zh) 2012-08-16 2013-08-15 醣結合方法及組合物

Country Status (30)

Country Link
US (6) US9517274B2 (zh)
EP (2) EP3421051B1 (zh)
JP (1) JP6291495B2 (zh)
KR (1) KR101742406B1 (zh)
CN (1) CN104661684B (zh)
AR (1) AR092368A1 (zh)
AU (1) AU2013303826B2 (zh)
BR (1) BR112015003227B1 (zh)
CA (1) CA2881420C (zh)
DK (2) DK3421051T3 (zh)
ES (2) ES2800479T3 (zh)
FR (1) FR22C1037I2 (zh)
HK (1) HK1210021A1 (zh)
HU (3) HUE049531T2 (zh)
IL (1) IL237066B (zh)
IN (1) IN2015DN00694A (zh)
MX (1) MX363511B (zh)
MY (1) MY167579A (zh)
NL (1) NL301188I2 (zh)
NZ (1) NZ704490A (zh)
PE (1) PE20150464A1 (zh)
PH (1) PH12015500243A1 (zh)
PL (2) PL2885007T3 (zh)
PT (2) PT3421051T (zh)
RU (2) RU2724840C2 (zh)
SA (1) SA515360035B1 (zh)
SG (1) SG11201500566XA (zh)
SI (2) SI3421051T1 (zh)
TW (1) TWI480049B (zh)
WO (1) WO2014027302A1 (zh)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2015DN00694A (zh) 2012-08-16 2015-06-26 Pfizer
PT3096786T (pt) * 2014-01-21 2021-08-24 Pfizer Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos
WO2015110941A2 (en) * 2014-01-21 2015-07-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN105934251A (zh) * 2014-01-21 2016-09-07 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
US11160855B2 (en) * 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
JP2017505792A (ja) 2014-02-14 2017-02-23 ファイザー・インク 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート
PT3116887T (pt) 2014-03-13 2021-04-30 Univ Basel Ligantes de hidratos de carbono que se ligam a anticorpos igm contra a glicoproteína associada à mielina
PT3244917T (pt) 2015-01-15 2023-05-31 Pfizer Composições imunogénicas para utilização em vacinas pneumocócicas
EP3292146A1 (en) * 2015-05-04 2018-03-14 Pfizer Inc Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
US10729780B2 (en) * 2015-06-08 2020-08-04 Serum Institute Of India Private Ltd. Methods for improving the adsorption of polysaccharide-protein conjugates and multivalent vaccine formulation obtained thereof
SG10202005253TA (en) * 2015-07-21 2020-07-29 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
US11091591B2 (en) 2015-09-16 2021-08-17 Universität Basel Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids
EP3377098A1 (en) 2015-11-20 2018-09-26 Pfizer Inc Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
CN109862908B (zh) 2016-08-05 2023-05-02 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
CN109890415B (zh) 2016-08-05 2023-04-04 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
MX2019002489A (es) 2016-09-02 2019-10-21 Sanofi Pasteur Inc Vacuna contra neisseria meningitidis.
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
KR102459629B1 (ko) 2017-01-20 2022-10-28 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물
KR102634811B1 (ko) * 2017-06-10 2024-02-06 인벤트프라이즈 인크. 면역원성과 항원항체 결합성이 개선된 2가 또는 다가 접합체 다당류를 가진 다가 접합체 백신
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
AU2018328036B2 (en) 2017-09-07 2024-03-07 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
JP6950099B2 (ja) 2018-02-05 2021-10-13 サノフィ パスツール インコーポレイティッド 多価肺炎球菌多糖体−タンパク質複合体組成物
SG11202006387QA (en) 2018-02-05 2020-07-29 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR20200141053A (ko) * 2018-03-23 2020-12-17 코라넥스 캐피탈 치료 도구로서의 정밀 당 접합체
EP3782642A4 (en) 2018-04-18 2022-04-13 SK Bioscience Co., Ltd. CAPSULE POLYSACCHARIDES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AND CONJUGATES THEREOF
US11260119B2 (en) * 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CA3136278A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
CN111024832B (zh) * 2019-10-29 2022-05-03 北京成大天和生物科技有限公司 多糖结合疫苗中残余NaCNBH3的离子色谱检测方法
IL292494A (en) 2019-11-01 2022-06-01 Pfizer Preparations of Escherichia coli and their methods
CN115362177A (zh) 2020-02-21 2022-11-18 辉瑞公司 糖类的纯化
JP2023514697A (ja) 2020-02-23 2023-04-07 ファイザー・インク 大腸菌組成物およびその方法
KR20230043157A (ko) 2020-09-17 2023-03-30 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 다가 백신 조성물 및 이의 용도
CA3199094A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
AU2021368151A1 (en) 2020-10-27 2023-06-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US20240000912A1 (en) 2020-11-04 2024-01-04 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
CA3218544A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections
US20220387613A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US578573A (en) 1897-03-09 Brake-actuating mechanism
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
JPH07507854A (ja) 1991-12-23 1995-08-31 ツォッヒェ，ミヒャエル 油除去装置を備えたエンジン
DE69434079T2 (de) 1993-03-05 2005-02-24 Wyeth Holdings Corp. Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6027925A (en) 1997-06-12 2000-02-22 Shin-Etsu Bio, Inc. Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacterial host
DE69937571T2 (de) 1998-09-30 2008-09-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Uniformed Services University Of The Health Sciences Mutiertes cholera holotoxin als hilfsmittel
US6936258B1 (en) 1999-03-19 2005-08-30 Nabi Biopharmaceuticals Staphylococcus antigen and vaccine
DE19926475A1 (de) * 1999-06-10 2000-12-14 Ktb Tumorforschungs Gmbh Träger-Pharmaka-Konjugate
JP2005504718A (ja) * 2001-01-23 2005-02-17 アヴェンティス パストゥール 多価髄膜炎菌多糖−タンパク質複合ワクチン
DE60234695D1 (de) 2001-06-07 2010-01-21 Univ Colorado Mutantenformen von cholera holotoxin als adjuvans
CA2449670A1 (en) 2001-06-07 2002-12-12 Wyeth Holdings Corporation Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
CN1394867A (zh) * 2001-07-06 2003-02-05 中国科学院生态环境研究中心 可作药物的寡糖和其制备方法及含该寡糖的药物组合物
US6995001B2 (en) * 2002-10-03 2006-02-07 Wyeth Holdings Corporation Processing for preparing monoprotected diols from symmetric diols
NZ561879A (en) * 2003-03-07 2009-05-31 Wyeth Corp Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
WO2004083251A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
US7445916B2 (en) * 2004-04-14 2008-11-04 Wyeth Process for preparing rapamycin 42-esters and FK-506 32-esters with dicarboxylic acid, precursors for rapamycin conjugates and antibodies
US7910753B2 (en) * 2004-09-10 2011-03-22 Anaspec Incorporated Cyanine dyes and their applications as luminescence quenching compounds
IL308456A (en) 2005-04-08 2024-01-01 Wyeth Llc A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation
GB0513069D0 (en) * 2005-06-27 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
TWI457133B (zh) * 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
PT1962899E (pt) * 2005-12-22 2011-10-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina conjugada polissacarídica pneumocócica
TW200806685A (en) * 2006-02-21 2008-02-01 Wyeth Corp Processes for the convergent synthesis of calicheamicin derivatives
AU2007223963A1 (en) * 2006-03-07 2007-09-13 Wyeth Process for preparing water-soluble polyethylene glycol conjugates of macrolide immunosuppressants
US20070253985A1 (en) 2006-04-26 2007-11-01 Wyeth Novel processes for coating container means which inhibit precipitation of polysaccharide-protein conjugate formulations
DE102006026436A1 (de) * 2006-06-07 2007-12-13 Continental Aktiengesellschaft Verfahren und Messfahrzeug zur Ermittlung objektiver Reifeneigenschaften auf einer Fahrbahnoberfläche
US20100189740A1 (en) * 2007-06-20 2010-07-29 Francis Michon Modified polysaccharides for conjugate vaccines
RU2378015C2 (ru) * 2008-04-02 2010-01-10 Равшан Иноятович Атауллаханов Конъюгат для иммунизации и вакцинации и способ повышения иммуногенности
SG10201406432RA (en) * 2009-06-22 2014-11-27 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
WO2011000958A1 (en) * 2009-07-03 2011-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compounds targeting the cation-independent mannose 6-phosphate receptor
WO2011066291A2 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Talecris Biotherapeutics, Inc. Lyophilization methods, compositions, and kits
BR112013012626A2 (pt) * 2010-12-10 2016-07-19 Merck Sharp & Dohme formulação, composição imunogênica, e, seringa pré-carregada
CA2848142C (en) * 2011-09-07 2021-05-18 Prolynx Llc Hydrogels with biodegradable crosslinking
IN2015DN00694A (zh) 2012-08-16 2015-06-26 Pfizer
WO2015110941A2 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
JP2017505792A (ja) 2014-02-14 2017-02-23 ファイザー・インク 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013303826B2 (en) 2017-06-29
PE20150464A1 (es) 2015-04-25
BR112015003227A2 (pt) 2017-07-04
DK3421051T3 (da) 2020-06-22
RU2015103017A (ru) 2016-10-10
US11110160B2 (en) 2021-09-07
RU2016136630A3 (zh) 2019-12-30
US10583187B2 (en) 2020-03-10
FR22C1037I2 (fr) 2023-05-26
US20230355735A1 (en) 2023-11-09
BR112015003227B1 (pt) 2020-10-27
NL301188I2 (nl) 2024-05-15
AU2013303826A1 (en) 2015-02-12
JP2015524839A (ja) 2015-08-27
HUS2200034I1 (hu) 2022-08-28
US20150216996A1 (en) 2015-08-06
SI3421051T1 (sl) 2020-08-31
MX2015001992A (es) 2015-10-05
NZ704490A (en) 2017-07-28
DK2885007T3 (en) 2018-12-03
PH12015500243B1 (en) 2015-03-30
US11723965B2 (en) 2023-08-15
US20180221467A1 (en) 2018-08-09
KR101742406B1 (ko) 2017-05-31
HUE049531T2 (hu) 2020-10-28
SA515360035B1 (ar) 2015-09-15
ES2700824T3 (es) 2019-02-19
RU2724840C2 (ru) 2020-06-25
PT3421051T (pt) 2020-06-26
RU2016136630A (ru) 2018-12-11
US20170224804A1 (en) 2017-08-10
IN2015DN00694A (zh) 2015-06-26
EP2885007A1 (en) 2015-06-24
PT2885007T (pt) 2018-12-10
EP3421051B1 (en) 2020-05-13
HUE041381T2 (hu) 2019-05-28
IL237066B (en) 2019-03-31
EP2885007B1 (en) 2018-10-10
CN104661684A (zh) 2015-05-27
SI2885007T1 (sl) 2018-12-31
AR092368A1 (es) 2015-04-15
FR22C1037I1 (fr) 2022-09-09
MX363511B (es) 2019-03-26
WO2014027302A1 (en) 2014-02-20
US9517274B2 (en) 2016-12-13
SG11201500566XA (en) 2015-04-29
CA2881420C (en) 2016-11-15
RU2645071C2 (ru) 2018-02-15
ES2800479T3 (es) 2020-12-30
CA2881420A1 (en) 2014-02-20
HK1210021A1 (zh) 2016-04-15
CN104661684B (zh) 2018-03-20
PL2885007T3 (pl) 2019-02-28
TWI480049B (zh) 2015-04-11
JP6291495B2 (ja) 2018-03-14
PL3421051T3 (pl) 2020-10-05
US20220096619A1 (en) 2022-03-31
PH12015500243A1 (en) 2015-03-30
US20200246448A1 (en) 2020-08-06
MY167579A (en) 2018-09-20
EP3421051A1 (en) 2019-01-02
KR20150041139A (ko) 2015-04-15
US9950054B2 (en) 2018-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11110160B2 (en) Glycoconjugation processes and compositions
US11707529B2 (en) Immunogenic glycoprotein conjugates
JP2012530785A (ja) 組成物および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法