CN104661684A - 糖缀合方法和组合物 - Google Patents
糖缀合方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104661684A CN104661684A CN201380049088.XA CN201380049088A CN104661684A CN 104661684 A CN104661684 A CN 104661684A CN 201380049088 A CN201380049088 A CN 201380049088A CN 104661684 A CN104661684 A CN 104661684A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sugar
- glycoconjugate
- polysaccharide
- capsular polysaccharide
- etec
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明提供包含通过(2-((2-氧代乙基)硫基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔基共价缀合到载体蛋白的糖的eTEC连接的糖缀合物、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物以及制备和使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。
Description
技术领域
概括地说,本发明涉及包含通过(2-((2-氧代乙基)硫基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔基共价缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物(glycoconjugate)、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物以及制备和使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。
背景技术
通过使弱免疫原性分子缀合到“载体”分子来增加这些分子的免疫原性的方法已被成功地利用了数十年(参见例如Goebel等人(1939)J.Exp.Med.69:53)。例如,许多免疫原性组合物已被描述,其中纯化的荚膜聚合物已被缀合到载体蛋白以通过利用这一“载体效应”来产生更有效的免疫原性组合物。Schneerson等人(1984)Infect.Immun.45:582-591)。还证明缀合可绕开当用游离多糖对婴儿进行免疫时通常在其体内观察到的弱抗体反应(Anderson等人(1985)J.Pediatr.107:346;Insel等人(1986)J.Exp.Med.158:294)。
已使用多种交联试剂或偶联试剂(例如同型双官能(homobifunctional)交联剂、异型双官能(heterobifunctional)交联剂或零长度(zero-length)交联剂)成功地生成缀合物。许多方法目前可用于将免疫原性分子(例如糖、蛋白和肽)偶联到肽或蛋白载体。多数方法产生胺、酰胺、聚氨酯、异硫脲或二硫键,或在一些情况下产生硫醚。使用向载体和/或免疫原性分子上的反应性氨基酸分子的侧链中引入反应性位点的交联试剂或偶联试剂的缺点是所述反应性位点如果不被中和,则能够自由地在体外(由此可能不利地影响所述缀合物的功能性或稳定性)或在体内(从而在用所述制剂免疫的人或动物中构成潜在不利事件的风险)与任何不期望的分子反应。可利用多种已知的化学反应使此类过量的反应性位点反应或“加帽”,以使这些位点灭活,但这些反应可能会以其它方式破坏所述缀合物的功能性。当尝试通过向载体分子中引入反应性位点来产生缀合物时,这可能尤其会引发问题,因为缀合物的大尺寸和更复杂的结构(相对于免疫原性分子)可能使其更易于受到化学处理的破坏性影响的作用。因此,仍然需要制备经适当加帽的载体蛋白缀合物从而使载体的功能性得以保持并且所述缀合物保留引发期望的免疫应答的能力的新方法。
发明内容
本发明涉及制备包含通过异型双官能二价连接体(在本文中被称作(2-((2-氧代乙基)硫基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔基)共价缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物的方法。所述eTEC间隔基包括7个线性原子(即,-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-),并且在糖与载体蛋白之间提供稳定的硫醚键和酰胺键。本发明还提供eTEC连接的糖缀合物、包含它们的免疫原性组合物以及使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。
在一个方面中,本发明提供包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物,其中所述糖通过氨基甲酸酯键共价连接到所述eTEC间隔基,并且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价连接到所述eTEC间隔基。
在一些实施方案中,所述糖是多糖,例如源自细菌、尤其源自病原细菌的荚膜多糖。在其它实施方案中,所述糖是寡糖或单糖。
本发明的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示:
其中包含eTEC间隔基的原子含于中央框中。
并入本发明的糖缀合物中的载体蛋白选自如本文进一步所述的或本领域技术人员已知的通常适于此类目的的载体蛋白。在具体实施方案中,所述载体蛋白是CRM197。
在另一方面中,本发明提供制备包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物的方法,其包括以下步骤:a)使糖与碳酸衍生物在有机溶剂中反应以产生活化的糖;b)使所述活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应,以产生硫醇化(thiolated)糖;c)使所述硫醇化糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖;d)使所述活化的硫醇化糖与包含一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化的载体蛋白反应,以产生硫醇化糖-载体蛋白缀合物;以及e)使所述硫醇化糖-载体蛋白缀合物与(i)能够将所述活化的载体蛋白的未缀合的α-卤代乙酰胺基加帽的第一加帽试剂;和/或(ii)能够将所述活化的硫醇化糖的未缀合的游离巯基残基加帽的第二加帽试剂反应;由此产生eTEC连接的糖缀合物。
在常见的实施方案中,所述碳酸衍生物是1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI)。优选地,所述碳酸衍生物是CDT,并且所述有机溶剂是极性非质子溶剂,例如二甲基亚砜(DMSO)。在优选实施方案中,所述硫醇化糖是通过使活化的糖与双官能对称硫代烷基胺试剂、胱胺或其盐反应产生的。或者,所述硫醇化糖可通过使活化的糖与半胱胺或其盐反应形成。通过本发明的方法产生的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示。
在常见的实施方案中,第一加帽试剂是N-乙酰基-L-半胱氨酸,其与载体蛋白的赖氨酸残基上的未缀合的α-卤代乙酰胺基反应而形成通过硫醚键共价连接到活化的赖氨酸残基的S-羧甲基半胱氨酸(CMC)残基。在其它实施方案中,第二加帽试剂是碘乙酰胺(IAA),其与所述活化的硫醇化糖的未缀合的游离巯基反应以提供加帽的硫代乙酰胺。通常,步骤e)包括用第一加帽试剂和第二加帽试剂两者进行加帽。在某些实施方案中,步骤e)包括用作为第一加帽试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸和作为第二加帽试剂的IAA进行加帽。
在一些实施方案中,加帽步骤e)还包括在与第一和/或第二加帽试剂反应后与例如DTT、TCEP或巯基乙醇等还原剂的反应。
在一些实施方案中,步骤d)还包括提供包含一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化的载体蛋白,然后使所述活化的硫醇化糖与所述活化的载体蛋白反应。在常见的实施方案中,所述活化的载体蛋白包含一个或多个α-溴代乙酰胺基。
在另一方面中,本发明提供根据本文所公开的任何方法产生的包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的糖的eTEC连接的糖缀合物。
对于本发明的各个方面来说,在本文所述的方法和组合物的具体实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含作为细菌荚膜多糖、特别是源自病原细菌的荚膜多糖的糖。
在一些此类实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌(Pn)荚膜多糖。在特定实施方案中,所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。
在其它此类实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的脑膜炎球菌(Mn)荚膜多糖。在特定实施方案中,Mn荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
在特别优选的实施方案中,所述糖是细菌荚膜多糖,例如通过eTEC间隔基共价缀合到CRM197的Pn或Mn荚膜多糖。
本文所述的组合物和方法用于多种应用。例如,本发明的糖缀合物可用于产生包含eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物。此类免疫原性组合物可用于保护受者免于细菌感染,例如由例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌等病原细菌引起的细菌感染。
因此,在另一方面中,本发明提供包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物,其中所述糖缀合物包含如本文所述的通过eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白的糖。
在常见的实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂,其中所述糖缀合物包含细菌荚膜多糖。
在一些此类实施方案中,免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自肺炎链球菌的Pn荚膜多糖。在一些特定实施方案中,所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。
在其它此类实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟球菌的Mn荚膜多糖。在一些特定实施方案中,所述Mn荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
在优选实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价缀合到CRM197的细菌荚膜多糖(例如Pn或Mn荚膜多糖)。
在一些实施方案中,所述免疫原性组合物包含佐剂。在一些此类实施方案中,所述佐剂是选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的铝系佐剂。在一个实施方案中,本文所述的免疫原性组合物包含磷酸铝佐剂。
在另一方面中,本发明提供预防、治疗或改善个体的细菌感染、疾病或病症的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的本发明的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含细菌抗原(例如细菌荚膜多糖)。
在一个实施方案中,所述感染、疾病或病症与肺炎链球菌细菌相关,并且所述糖缀合物包含Pn荚膜多糖。在另一实施方案中,所述感染、疾病或病症与奈瑟球菌细菌相关,并且所述糖缀合物包含Mn荚膜多糖。
在其它方面中,本发明提供诱导抗病原细菌的免疫应答的方法;预防、治疗或改善由病原细菌引起的疾病或病症的方法;和降低由病原细菌引起的感染、疾病或病症的至少一种症状的严重性的方法,在每种情况下都是通过向个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物来进行,其中所述糖缀合物包含细菌抗原,例如源自病原细菌的细菌荚膜多糖。
在另一方面中,本发明提供在个体中诱导免疫应答的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物,其中所述糖缀合物包含细菌抗原,例如细菌荚膜多糖。在优选实施方案中,所述方法涉及在个体中产生保护性免疫应答,如本文进一步所述。
在另一方面中,本发明提供向个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物以在所述个体中生成保护性免疫应答的方法,如本文进一步所述。
在又一方面中,本发明提供响应本发明的eTEC连接的糖缀合物而生成的抗体,或包含此类糖缀合物的免疫原性组合物。此类抗体可用于研究和临床实验室测定,例如细菌检测和血清分型,或可用于赋予个体被动免疫。
在再一方面中,本发明提供包含本发明的eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物,其用于预防、治疗或改善细菌感染,例如由肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌引起的感染。
在另一方面中,本发明提供包含本发明的eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物在制备用于预防、治疗或改善细菌感染(例如由肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌引起的感染)的药物中的用途。
在上述治疗性和/或预防性方法和用途的某些优选实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价连接到载体蛋白的细菌荚膜多糖。在本文所述的方法和用途的常见实施方案中,所述细菌荚膜多糖是Pn荚膜多糖或Mn荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。在其它此类实施方案中,所述Mn荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
在某些优选实施方案中,所述载体蛋白是CRM197。在特别优选的实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价缀合到CRM197的细菌荚膜多糖(例如Pn或Mn荚膜多糖)。
附图说明
图1示出用于制备本发明的eTEC连接的糖缀合物(例如包含共价缀合到CRM197的多糖的糖缀合物)的一般路线。
图2示出肺炎链球菌血清型33F(Pn-33F)荚膜多糖的重复多糖结构。
图3示出肺炎链球菌血清型22F(Pn-22F)荚膜多糖的重复多糖结构。
图4示出肺炎链球菌血清型10A(Pn-10A)荚膜多糖的重复多糖结构。
图5示出肺炎链球菌血清型11A(Pn-11A)荚膜多糖的重复多糖结构。
图6示出并入eTEC连接体(A)和潜在加帽和未加帽的游离巯基位点(B)的Pn-33F糖缀合物的代表性结构。
图7示出用于制备缀合到CRM197的Pn-33F糖缀合物的活化方法(A)和缀合方法(B)的代表性工艺流程图。
图8示出作为用于活化步骤的CDT的摩尔当量的函数的Pn-33F荚膜多糖的硫醇化水平。
发明详述
通过参考本发明的优选实施方案的以下详细说明和本文中所包括的实施例可以更容易地理解本发明。除非另有定义,否则本文所用的所有技术术语和科学术语都与本发明所属领域技术人员通常所理解的含义相同。虽然本文中描述了某些优选方法和材料,但类似或等同于本文所述的那些的任何方法和材料均可用于实践或测试本发明。在描述实施方案和要求保护本发明时,会根据下文所述的定义使用某些术语。
除非另有说明,否则如本文所使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。因此,例如,“所述方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或一个或多个步骤,并且“eTEC间隔基”是指一个或多个eTEC间隔基,如本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明了。
如本文所使用的术语“约”意指在某一值的统计学上有意义的范围内,例如所述浓度范围、时间范围、分子量、温度或pH。此类范围可在所指示的值或范围的一个数量级内,通常在20%内,更通常在10%内,甚至更通常在5%内。有时,此类范围可在用于测量和/或测定给定值或范围的标准方法的典型实验误差内。术语“约”所涵盖的允许变化会取决于所研究的具体系统,并且可容易被本领域技术人员所理解。无论何时在本申请内列举一个范围,所述范围内的每个整数也被涵盖作为本发明的实施方案。
应注意,在本公开内容中,诸如“包括”、“包含”等术语可具有在美国专利法中所归属于它们的含义;例如,它们可意指“包括”等。此类术语是指包括具体成分或成分组而不排除任何其它的成分。诸如“基本上由……组成”等术语具有在美国专利法中所归属于它们的含义,例如,它们允许包括不损害本发明的新颖或基本特征的其它成分或步骤,即,它们排除损害本发明的新颖或基本的特征的其它未列举的成分或步骤。术语“由……组成”具有在美国专利法中所归属于它们的含义;也就是说,这些术语是封闭式的。因此,这些术语是指包括具体成分或成分组并且排除所有其它成分。
如本文所使用的术语“糖”可指多糖、寡糖或单糖。通常,糖是指细菌荚膜多糖,特别是源自例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌等病原细菌的荚膜多糖。
术语“缀合物”或“糖缀合物”在本文中可互换使用,指共价缀合到载体蛋白的糖。本发明的糖缀合物在本文中有时被称作“eTEC连接的”糖缀合物,其包含通过至少一个eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白的糖。本发明的eTEC连接的糖缀合物和包含它们的免疫原性组合物可含有一定量的游离糖。
如本文所使用的术语“游离糖”意指未共价缀合到载体蛋白但仍然存在于糖缀合物组合物中的糖或共价连接到极少的载体蛋白(以高的糖/蛋白比(>5:1)连接)但仍然存在于糖缀合物组合物中的糖。所述游离糖可与缀合的糖-载体蛋白糖缀合物非共价缔合(即,非共价结合到缀合的糖-载体蛋白糖缀合物、吸附到缀合的糖-载体蛋白糖缀合物或截留于缀合的糖-载体蛋白糖缀合物中或与其一起被截留)。术语“游离多糖”和“游离荚膜多糖”可在本文中用于传达关于糖缀合物的相同含义,其中所述糖分别是多糖或荚膜多糖。
如本文所使用的“缀合”是指借以使例如细菌荚膜多糖等糖共价连接到载体分子或载体蛋白的过程。在本发明的方法中,糖通过至少一个eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白。可根据下文所述的方法或通过本领域内已知的其它方法进行缀合。缀合到载体蛋白增强了细菌荚膜多糖的免疫原性。
糖缀合物
本发明涉及包含通过一个或多个eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物,其中所述糖通过氨基甲酸酯键共价缀合到eTEC间隔基,并且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价缀合到eTEC间隔基。
除了存在一个或多个eTEC间隔基以外,本发明的糖缀合物的新颖特征还包括所述糖和得到的eTEC连接的糖缀合物的分子量分布(profile)、每个载体蛋白缀合的赖氨酸与通过一个或多个eTEC间隔基共价连接到多糖的赖氨酸的数量的比率、作为糖的重复单元的函数的载体蛋白与所述糖之间的共价键的数量、以及游离糖相对于糖的总量的相对量。
本发明的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示:
所述eTEC间隔基包括7个线性原子(即,-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-),并且在糖与载体蛋白之间提供稳定的硫醚键和酰胺键。eTEC连接的糖缀合物的合成包括使糖的活化的羟基与硫代烷基胺试剂(例如,胱胺或半胱氨酸胺或其盐)的氨基反应,形成与所述糖连接的氨基甲酸酯键以提供硫醇化糖。一个或多个游离巯基的生成是通过与还原剂反应以提供活化的硫醇化糖而实现的。所述活化的硫醇化糖的游离巯基与在含胺残基上具有一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化载体蛋白反应生成硫醚键以形成缀合物,其中所述载体蛋白通过酰胺键连接到eTEC间隔基。
在本发明的糖缀合物中,所述糖可为多糖、寡糖或单糖,并且所述载体蛋白可选自如本文进一步所述或本领域技术人员已知的任何合适的载体。在常见的实施方案中,所述糖是细菌荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述载体蛋白是CRM197。
在一些此类实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自肺炎链球菌的Pn荚膜多糖。在特定实施方案中,所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。在其它实施方案中,所述荚膜多糖选自Pn-血清型10A、11A、22F和33F荚膜多糖。在一个此类实施方案中,所述荚膜多糖是Pn-33F荚膜多糖。在另一此类实施方案中,所述荚膜多糖是Pn-22F荚膜多糖。在另一此类实施方案中,所述荚膜多糖是Pn-10A荚膜多糖。在再一此类实施方案中,所述荚膜多糖是Pn-11A荚膜多糖。
在其它实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟球菌的Mn荚膜多糖。在特定实施方案中,所述Mn荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。在一个此类实施方案中,所述荚膜多糖是Mn-A荚膜多糖。在另一此类实施方案中,所述荚膜多糖是Mn-C荚膜多糖。在另一此类实施方案中,所述荚膜多糖是Mn-W135荚膜多糖。在再一此类实施方案中,所述荚膜多糖是Mn-Y荚膜多糖。
在特别优选的实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价缀合到CRM197的Pn或Mn细菌荚膜多糖,例如Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F荚膜多糖,或者Mn-血清型A、C、W135或Y荚膜多糖。
在一些实施方案中,本发明的eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白的糖,其中所述糖具有10kDa-2,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中,所述糖具有50kDa-2,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中,所述糖具有50kDa-1,750kDa;50kDa-1,500kDa;50kDa-1,250kDa;50kDa-1,000kDa;50kDa-750kDa;50kDa-500kDa;100kDa-2,000kDa;100kDa-1,750kDa;100kDa-1,500kDa;100kDa-1,250kDa;100kDa-1,000kDa;100kDa-750kDa;100kDa-500kDa;200kDa-2,000kDa;200kDa-1,750kDa;200kDa-1,500kDa;200kDa-1,250kDa;200kDa-1,000kDa;200kDa-750kDa;或者200kDa-500kDa的分子量。在一些此类实施方案中,所述糖是细菌荚膜多糖,例如Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F荚膜多糖,或者Mn-血清型A、C、W135或Y荚膜多糖,其中所述荚膜多糖具有落在任何所述分子量范围内的分子量。
在一些实施方案中,本发明的eTEC连接的糖缀合物具有50kDa-20,000kDa的分子量。在其它实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物具有500kDa-10,000kDa的分子量。在其它实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物具有200kDa-10,000kDa的分子量。在其它实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物具有1,000kDa-3,000kDa的分子量。
在其它实施方案中,本发明的eTEC连接的糖缀合物具有200kDa-20,000kDa;200kDa-15,000kDa;200kDa-10,000kDa;200kDa-7,500kDa;200kDa-5,000kDa;200kDa-3,000kDa;200kDa-1,000kDa;500kDa-20,000kDa;500kDa-15,000kDa;500kDa-12,500kDa;500kDa-10,000kDa;500kDa-7,500kDa;500kDa-6,000kDa;500kDa-5,000kDa;500kDa-4,000kDa;500kDa-3,000kDa;500kDa-2,000kDa;500kDa-1,500kDa;500kDa-1,000kDa;750kDa-20,000kDa;750kDa-15,000kDa;750kDa-12,500kDa;750kDa-10,000kDa;750kDa-7,500kDa;750kDa-6,000kDa;750kDa-5,000kDa;750kDa-4,000kDa;750kDa-3,000kDa;750kDa-2,000kDa;750kDa-1,500kDa;1,000kDa-15,000kDa;1,000kDa-12,500kDa;1,000kDa-10,000kDa;1,000kDa-7,500kDa;1,000kDa-6,000kDa;1,000kDa-5,000kDa;1,000kDa-4,000kDa;1,000kDa-2,500kDa;2,000kDa-15,000kDa;2,000kDa-12,500kDa;2,000kDa-10,000kDa;2,000kDa-7,500kDa;2,000kDa-6,000kDa;2,000kDa-5,000kDa;2,000kDa-4,000kDa;或者2,000kDa-3,000kDa的分子量。
表征本发明的eTEC连接的糖缀合物的另一方式是经由通过通过eTEC间隔基变得缀合到糖的载体蛋白中的赖氨酸残基的数量,其可表征为缀合的赖氨酸的范围。
在常见的实施方案中,所述载体蛋白通过连接到载体蛋白上的赖氨酸残基的一个或多个ε-氨基的酰胺键共价缀合到eTEC间隔基。在一些此类实施方案中,所述载体蛋白包含2-20个共价缀合到糖的赖氨酸残基。在其它此类实施方案中所述,载体蛋白包含4-16个共价缀合到糖的赖氨酸残基。
在一个优选实施方案中,所述载体蛋白包含含有39个赖氨酸残基的CRM197。在一些此类实施方案中,所述CRM197可在39个赖氨酸残基中包含4-16个共价连接到糖的赖氨酸残基。表示此参数的另一方式是约10%至约41%的CRM197赖氨酸共价连接到糖。在另一此类实施方案中,所述CRM197可在39个赖氨酸残基中包含2-20个共价连接到糖的赖氨酸残基。表示此参数的另一方式是约5%至约50%的CRM197赖氨酸共价连接到糖。
本发明的eTEC连接的糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比率(重量/重量)表征。在一些实施方案中,糖:载体蛋白比(w/w)是0.2-4。在其它实施方案中,糖:载体蛋白比(w/w)是1.0-2.5。在其它实施方案中,糖:载体蛋白比(w/w)是0.4-1.7。在一些此类实施方案中,糖是细菌荚膜多糖,和/或载体蛋白是CRM197。
糖缀合物还可通过作为糖的重复单元的函数的载体蛋白与糖之间的共价键的数量来表征。在一个实施方案中,对于多糖的每4个糖重复单元,本发明的糖缀合物在载体蛋白与多糖之间包含至少一个共价键。在另一实施方案中,在多糖的每10个糖重复单元中发生至少一次载体蛋白与多糖之间的共价键合。在另一实施方案中,在多糖的每15个糖重复单元中发生至少一次载体蛋白与多糖之间的共价键合。在又一实施方案中,在多糖的每25个糖重复单元中发生至少一次载体蛋白与多糖之间的共价键合。
在常见的实施方案中,所述载体蛋白是CRM197,并且在多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元中发生至少一次通过CRM197与多糖之间的eTEC间隔基实现的共价键合。
缀合期间的重要考虑因素是研发允许保留单个组分的潜在敏感的非糖取代基官能团(例如可形成糖表位的一部分的O-酰基、磷酸酯或磷酸甘油酯侧链)的条件。
在一个实施方案中,所述糖缀合物包含具有10-100%的O-乙酰化程度的糖。在一些此类实施方案中,所述糖具有50-100%的O-乙酰化程度。在其它此类实施方案中,所述糖具有75-100%的O-乙酰化程度。在其它实施方案中,所述糖具有大于或等于70%(≥70%)的O-乙酰化程度。
本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合到载体蛋白、但仍然存在于糖缀合物组合物中的游离糖。所述游离糖可与糖缀合物非共价缔合(即,非共价结合到糖缀合物、吸附到糖缀合物或截留于糖缀合物中与其一起被截留)。
在一些实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含相对于糖的总量少于约45%的游离糖、少于约40%的游离糖、少于约35%的游离糖、少于约30%的游离糖、少于约25%的游离糖、少于约20%的游离糖、少于约15%的游离糖、少于约10%的游离糖或少于约5%的游离糖。优选地,所述糖缀合物包含少于15%的游离糖,更优选少于10%的游离糖,甚至更优选少于5%的游离糖。
在某些优选实施方案中,本发明提供包含通过eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白的荚膜多糖(优选Pn或Mn荚膜多糖)的eTEC连接的糖缀合物,所述糖缀合物单独具有一个或多个以下特征或其组合:所述多糖具有50kDa-2,000kDa的分子量;所述糖缀合物具有500kDa-10,000KDa的分子量;所述载体蛋白包含2-20个共价连接到所述糖的赖氨酸残基;糖:载体蛋白比(w/w)是0.2-4;对于所述多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元,所述糖缀合物在载体蛋白与多糖之间包含至少一个共价键;所述糖具有75-100%的O-乙酰化程度;所述缀合物包含相对于总的多糖少于约15%的游离多糖;所述载体蛋白是CRM197;所述荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F荚膜多糖,或者所述荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135或Y荚膜多糖。
所述eTEC连接的糖缀合物还可通过其分子大小分布(Kd)来表征。通过Sepharose CL-4B固定相尺寸排阻色谱(SEC)介质使用高压液相色谱系统(HPLC)来确定缀合物的分子大小。对于Kd的确定,首先校准色谱柱以确定V0(其表示空体积或总排斥体积(exclusion volume))以及Vi(即样品中最小分子洗脱时的体积,也被称为粒子间体积(interparticle volume))。所有SEC分离均发生在V0与Vi之间。所收集到的每个流分的Kd值是通过以下表达式Kd=(Ve-Vi)/(Vi-V0)确定的,其中Ve表示化合物的保留体积。洗脱≤0.3的流分%(主峰)限定缀合物的Kd(分子大小分布)。在一些实施方案中,本发明提供具有≥35%的分子大小分布(Kd)的eTEC连接的糖缀合物。在其它实施方案中,本发明提供具有≥15%、≥20%、≥25%、≥30%、≥35%、≥40%、≥45%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%或≥90%的分子大小分布(Kd)的eTEC连接的糖缀合物。
本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可含有游离巯基残基。在一些情况下,通过本文所提供的方法形成的活化的硫醇化糖会含有多个游离巯基残基,其中的一些可能在缀合步骤期间不经历共价缀合到载体蛋白。通过与硫醇反应性加帽试剂(例如碘乙酰胺(IAA))反应将此类残余的游离巯基残基加帽,以将潜在的反应性官能团加帽。还包括其它硫醇反应性加帽试剂,例如,含马来酰亚胺试剂等。
另外,本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可含有残余的未缀合的载体蛋白,所述残余的未缀合的载体蛋白可包括已在加帽过程步骤期间经历修饰的活化的载体蛋白。
本发明的糖缀合物可用于产生免疫原性组合物以保护受体免于细菌感染,例如由例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌等病原细菌引起的细菌感染。因此,在另一方面中,本发明提供包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物,其中所述糖缀合物包含如本文所述的通过eTEC间隔基共价缀合到载体蛋白的糖。
在常见的实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂,其中所述糖缀合物包含细菌荚膜多糖。
在一些此类实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自肺炎链球菌的Pn荚膜多糖。在一些特定实施方案中,所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。
在其它此类实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含源自脑膜炎奈瑟球菌的Mn荚膜多糖。在一些特定实施方案中,所述Mn荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
在特别优选实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价缀合到CRM197的细菌荚膜多糖(例如Pn或Mn荚膜多糖)。
在一些实施方案中,所述免疫原性组合物包含佐剂。在一些此类实施方案中,所述佐剂是选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的铝系佐剂。在一个实施方案中,所述免疫原性组合物包含磷酸铝佐剂。
本发明的eTEC连接的糖缀合物和包含它们的免疫原性组合物可含有一定量的游离糖。在一些实施方案中,所述免疫原性组合物包含相对于多糖总量少于约45%、少于约40%、少于约35%、少于约30%、少于约25%、少于约20%、少于约15%、少于约10%或少于约5%的游离多糖。优选地,所述免疫原性组合物包含少于15%的游离糖,更优选少于10%的游离糖,甚至更优选少于5%的游离糖。
在另一方面中,本发明的糖缀合物或免疫原性组合物可用于生成功能性的抗体,如通过在动物效力模型或调理吞噬杀灭测定中对细菌的杀灭所测量的。包含细菌荚膜多糖的本发明的糖缀合物可用于产生针对此类细菌荚膜多糖的抗体。此类抗体随后可用于研究和临床实验室测定,例如细菌检测和血清分型。此类抗体还可用于赋予个体被动免疫。在一些实施方案中,所产生的针对细菌多糖的抗体在动物效力模型中或在调理吞噬杀灭测定中是功能性的。
本文所述的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物还可用于用以预防、治疗或改善个体的细菌感染、疾病或病症的多种治疗性或预防性方法中。具体来说,包含细菌抗原(例如来自病原细菌的细菌荚膜多糖)的eTEC连接的糖缀合物可用于预防、治疗或改善个体的由病原细菌引起的细菌感染、疾病或病症。
因此,在一个方面中,本发明提供预防、治疗或改善个体的细菌感染、疾病或病症的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的本发明的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含细菌荚膜多糖。
在一个实施方案中,所述感染、疾病或病症与肺炎链球菌细菌相关,并且所述糖缀合物包含Pn荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述感染、疾病或病症选自肺炎、鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血症、胸腔积脓、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、心包炎、乳突炎、软组织感染和脑脓肿。
在另一实施方案中,所述感染、疾病或病症与奈瑟球菌细菌相关,并且所述糖缀合物包含Mn荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述感染、疾病或病症选自脑膜炎、脑膜炎球菌血症、菌血症和败血症。
在另一方面中,本发明提供在个体中诱导免疫应答的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物,其中所述糖缀合物包含细菌荚膜多糖。
在再一方面中,本发明提供预防、治疗或改善个体的由病原细菌引起的疾病或病症的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物,其中所述糖缀合物包含细菌荚膜多糖。
在另一方面中,本发明提供降低由病原细菌感染引起的疾病或病症的至少一种症状的严重性的方法,其包括向个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物,其中所述糖缀合物包含细菌荚膜多糖,例如,Pn或Mn荚膜多糖。
在另一方面中,本发明提供向个体给药免疫有效量的包含本发明的eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物以在所述个体中生成保护性免疫应答的方法,如本文进一步所述。
在再一方面中,本发明提供如本文所述的包含本发明的eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物,其用于预防、治疗或改善细菌感染,例如由肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌引起的感染。
在另一方面中,本发明提供如本文所述的包含本发明的eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物在制备用于预防、治疗或改善细菌感染(例如由肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌引起的感染)的药物中的用途。
在上述治疗性和/或预防性方法和用途中,所述免疫原性组合物通常包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价连接到载体蛋白的细菌荚膜多糖。在本文所述的方法和用途的常见实施方案中,所述细菌荚膜多糖是Pn荚膜多糖或Mn荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。在其它此类实施方案中,所述荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
在某些优选实施方案中,所述载体蛋白是CRM197。在特别优选的实施方案中,所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含通过eTEC间隔基共价缀合到CRM197的细菌荚膜多糖(例如Pn或Mn荚膜多糖)。
另外,本发明提供在个体中诱导抗肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌细菌的免疫应答的方法;预防、治疗或改善个体的由肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌细菌引起的感染、疾病或病症的方法;和降低个体的由肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌的感染引起的感染、疾病或病症的至少一种症状的严重性的方法,在每种情况下都是通过向所述个体给药免疫有效量的包含eTEC连接的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的免疫原性组合物来进行,其中所述糖缀合物包含分别源自肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌的细菌荚膜多糖。
糖
糖可包括多糖、寡糖和单糖。在常见的实施方案中,所述糖是多糖,尤其是细菌荚膜多糖。荚膜多糖是通过本领域技术人员已知的标准技术制备的。
在本发明中,荚膜多糖可例如由肺炎链球菌的Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F制备。在一个实施方案中,每种肺炎球菌多糖血清型可在大豆系培养基中生长。通过离心、沉淀、超过滤和/或柱色谱法纯化单个多糖。可将纯化的多糖活化以使其能够与eTEC间隔基反应,然后并入到本发明的糖缀合物中,如本文进一步所述。
荚膜多糖的分子量是供在免疫原性组合物中使用的一个考虑因素。高分子量荚膜多糖由于存在于抗原表面上的表位的化合价较高而能够诱导某些抗体免疫应答。高分子量荚膜多糖的分离和纯化被涵盖用于本发明的缀合物、组合物和方法中。
在一些实施方案中,所述糖具有10kDa-2,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中,所述糖具有50kDa-2,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中,所述糖具有50kDa-1,750kDa;50kDa-1,500kDa;50kDa-1,250kDa;50kDa-1,000kDa;50kDa-750kDa;50kDa-500kDa;100kDa-2,000kDa;100kDa-1,750kDa;100kDa-1,500kDa;100kDa-1,250kDa;100kDa-1,000kDa;100kDa-750kDa;100kDa-500kDa;200kDa-2,000kDa;200kDa-1,750kDa;200kDa-1,500kDa;200kDa-1,250kDa;200kDa-1,000kDa;200kDa-750kDa;或者200kDa-500kDa的分子量。在一些此类实施方案中,所述糖是细菌荚膜多糖,例如Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F荚膜多糖,或者Mn-血清型A、C、W135或Y荚膜多糖,其中所述荚膜多糖具有落在所述分子量范围之一内的分子量。
在一些实施方案中,本发明的糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中,所述糖缀合物包含具有10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、75-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%的O-乙酰化程度的糖。在其它实施方案中,所述O-乙酰化程度为≥10%、≥20%、≥30%、≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、或≥90%或约100%。
在一些实施方案中,本发明的荚膜多糖、糖缀合物或免疫原性组合物用于生成功能性的抗体,如通过在证实抗体杀灭细菌的动物效力模型或调理吞噬杀灭测定中对细菌的杀灭所测量的。
可使用本领域技术人员已知的分离操作直接从细菌获得荚膜多糖。参见例如Fournier等人(1984),见上文;Fournier等人(1987)Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.138:561-567;美国专利申请公开第2007/0141077号;以及国际专利申请公开第WO 00/56357号;这些文献各自以其整体援引加入本文)。另外,可使用合成方案产生荚膜多糖。此外,可使用本领域技术人员还已知的基因工程操作重组产生荚膜多糖(参见Sau等人(1997)Microbiology143:2395-2405;以及美国专利第6,027,925号;这些文献各自以其整体援引加入本文)。
用于制备用于本发明的糖缀合物中的相应多糖的肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌菌株可从已确定的培养收集物或临床样本获得。
载体蛋白
本发明的糖缀合物的另一组分是与所述糖缀合的载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文中可互换使用。载体蛋白优选无毒且无反应原性(non-reactogenic)且可以足够的量和纯度获得的蛋白。载体蛋白应适用于标准缀合操作。在本发明的新颖的糖缀合物中,所述载体蛋白通过eTEC间隔基共价连接到所述糖。
缀合到载体可增强抗原(例如细菌抗原,例如细菌荚膜多糖)的免疫原性。用于所述抗原的优选蛋白载体是毒素、类毒素或来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌属(Pseudomonas)、大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)的毒素的任何突变交叉反应性物质(CRM)。在一个实施方案中,特别优选的载体是源自产生CRM197蛋白的白喉棒杆菌(C.diphtheriae)菌株C7(β197)的白喉类毒素CRM197。这一菌株具有ATCC保藏号53281。产生CRM197的方法描述于美国专利第5,614,382号中,该美国专利以其整体援引加入本文。
或者,可使用蛋白载体或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如,半抗原可偶联到细菌毒素、类毒素或CRM的T细胞表位。参见1988年2月1日提交的标题为“Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a CarrierMolecule For Conjugate Vaccines”的美国专利申请第150,688号;该美国专利申请以其整体援引加入本文。其它合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素,例如霍乱类毒素(例如,如国际专利申请第WO 2004/083251号中所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。还可使用细菌外膜蛋白,例如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘着蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。还可使用其它蛋白(例如卵白蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD))作为载体蛋白。
因此,在常见的实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物包含作为载体蛋白的CRM197,其中所述荚膜多糖通过氨基甲酸酯键共价连接到eTEC间隔基,并且其中所述CRM197通过由所述蛋白的活化的氨基酸残基(通常通过一个或多个赖氨酸残基的ε-胺基)形成的酰胺键共价连接到eTEC间隔基。
变得缀合到所述糖的载体蛋白中的赖氨酸残基的数量可被表征为缀合的赖氨酸的范围。例如,在免疫原性组合物的一些实施方案中,所述CRM197可在39个赖氨酸残基中包含4-16个共价连接到糖的赖氨酸残基。表示此参数的另一方式是约10%至约41%的CRM197赖氨酸共价连接到糖。在其它实施方案中,所述CRM197可在39个赖氨酸残基中包含2-20个共价连接到糖的赖氨酸残基。表示此参数的另一方式是约5%至约50%的CRM197赖氨酸共价连接到糖。
糖链连接到载体蛋白上的赖氨酸的频率是用于表征本发明的糖缀合物的另一参数。例如,在一些实施方案中,对于多糖的每4个糖重复单元,在载体蛋白与多糖之间有至少一个共价键。在另一实施方案中,在多糖的每10个糖重复单元中发生至少一次载体蛋白与多糖之间的共价键合。在另一实施方案中,在多糖的每15个糖重复单元中发生至少一次载体蛋白与多糖之间的共价键合。在又一实施方案中,在多糖的每25个糖重复单元中发生至少一次载体蛋白与多糖之间的共价键合。
在常见的实施方案中,所述载体蛋白是CRM197,并且在多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元中发生至少一次通过CRM197与多糖之间的eTEC间隔基实现的共价键合。在一些此类实施方案中,所述多糖是源自肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌的细菌荚膜多糖。
在其它实施方案中,对于每5-10个糖重复单元;每2-7个糖重复单元;每3-8个糖重复单元;每4-9个糖重复单元;每6-11个糖重复单元;每7-12个糖重复单元;每8-13个糖重复单元;每9-14个糖重复单元;每10-15个糖重复单元;每2-6个糖重复单元、每3-7个糖重复单元;每4-8个糖重复单元;每6-10个糖重复单元;每7-11个糖重复单元;每8-12个糖重复单元;每9-13个糖重复单元;每10-14个糖重复单元;每10-20个糖重复单元;或者每4-25个糖重复单元,所述缀合物在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价键。
在另一实施方案中,对于多糖的每2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个糖重复单元,在载体蛋白与糖之间发生至少一个键合。
制备eTEC连接的糖缀合物的方法
本发明提供制备包含通过(2-((2-氧代乙基)硫基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔基共价缀合到载体蛋白的糖的eTEC连接的糖缀合物的方法。所述eTEC间隔基含有7个线性原子(即,-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-),其包含稳定的硫醚键和酰胺键,并且用于共价连接糖与载体蛋白。eTEC间隔基的一端通过氨基甲酸酯键共价结合到所述糖的羟基。eTEC间隔基的另一端通过酰胺键共价结合到所述载体蛋白的含氨基残基,通常为ε-赖氨酸残基。
制备包含缀合到活化的载体蛋白CRM197的多糖的本发明的糖缀合物的代表性途径示于图1中。源自肺炎链球菌的代表性细菌荚膜多糖肺炎球菌血清型33F、10A、11A和22F多糖(具有使用eTEC间隔基方法的潜在修饰位点)的化学结构分别示于图2、图3、图4和图5中。
包含使用eTEC连接体化学共价缀合到CRM197的肺炎链球菌血清型33F多糖的本发明的代表性eTEC连接的糖缀合物的结构示于图6(A)中。出于说明性目的,潜在加帽和未加帽的游离巯基位点示于图6(B)中。多糖通常含有多个羟基,因此eTEC间隔基的通过氨基甲酸酯键连接到多糖重复单元内的特定羟基的位点可变化。
在一个方面中,所述方法包括以下步骤:a)使糖与碳酸衍生物(例如1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI))在有机溶剂中反应以产生活化的糖;b)使所述活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应,以产生硫醇化糖;c)使所述硫醇化糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖;d)使所述活化的硫醇化糖与包含一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化的载体蛋白反应,以产生硫醇化糖-载体蛋白缀合物;以及e)使所述硫醇化糖-载体蛋白缀合物与(i)能够将所述活化的载体蛋白的未缀合的α-卤代乙酰胺基加帽的第一加帽试剂;和/或(ii)能够将所述活化的硫醇化糖的未缀合的游离巯基残基加帽的第二加帽试剂反应;由此产生eTEC连接的糖缀合物。
在特别优选的实施方案中,所述方法包括以下步骤:a)使Pn-33F荚膜多糖与CDT或CDI在有机溶剂中反应以产生活化的Pn-33F多糖;b)使所述活化的Pn-33F多糖与胱胺或半胱氨酸胺或其盐反应,以产生硫醇化Pn-33F多糖;c)使所述硫醇化Pn-33F多糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化Pn-33F多糖;d)使所述活化的硫醇化Pn-33F多糖与包含一个或多个α-溴代乙酰胺基的活化的CRM197载体蛋白反应,以产生硫醇化Pn-33F多糖-CRM197缀合物;以及e)使所述硫醇化Pn-33F多糖-CRM197缀合物与(i)能够将所述活化的载体蛋白的未缀合的α-溴代乙酰胺基加帽的作为第一加帽试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸;以及(ii)能够将所述活化的硫醇化Pn-33F多糖的未缀合的游离巯基残基加帽的作为第二加帽试剂的碘乙酰胺反应;由此产生eTEC连接的Pn-33F多糖-CRM197糖缀合物。
在常见的实施方案中,所述碳酸衍生物是CDT或CDI。优选地,所述碳酸衍生物是CDT,并且所述有机溶剂是极性非质子溶剂,例如二甲基亚砜(DMSO)。在硫醇化和/或缀合步骤前无需将活化的糖冻干。
在一个优选实施方案中,所述硫醇化糖是通过使活化的糖与双官能对称硫代烷基胺试剂胱胺或其盐反应而产生的。这一试剂的潜在优点是对称胱胺连接体可与两分子的活化的糖反应,由此在还原二硫键后形成两分子的硫醇化糖/分子胱胺。或者,所述硫醇化糖可通过使活化的糖与半胱胺或其盐反应而形成。通过本发明的方法产生的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示。
本领域技术人员应理解,当活化的糖与含有游离巯基残基的半胱胺或其盐反应时,步骤c)是可选的。在实践中,常规地在步骤c)中使包含半胱胺的硫醇化糖与还原剂反应以将可能在反应期间形成的任何氧化的二硫化物副产物还原。
在这一方面的一些实施方案中,步骤d)还包括提供包含一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化的载体蛋白,然后使所述活化的硫醇化糖与所述活化的载体蛋白反应,以产生硫醇化糖-载体蛋白缀合物。在常见的实施方案中,所述活化的载体蛋白包含一个或多个α-溴代乙酰胺基。
所述硫醇化糖-载体蛋白缀合物可与一种或多种能够与存在于反应混合物中的残余的活化官能团反应的加帽试剂反应。此类残余的反应性基团可由于不完全缀合或反应混合物中存在过量的所述组分之一而存在于未反应的糖或载体蛋白组分上。在该情况下,加帽可有助于糖缀合物的纯化或分离。在一些情况下,残余的活化官能团可存在于糖缀合物中。
例如,活化的载体蛋白上的过量的α-卤代乙酰胺基可通过与低分子量硫醇(例如N-乙酰基-L-半胱氨酸)反应来加帽,所述低分子量硫醇可过量使用以确保完全加帽。用N-乙酰基-L-半胱氨酸加帽还允许通过从被加帽位点处的半胱氨酸残基中检测独特的氨基酸S-羧甲基半胱氨酸(CMC)来确认缀合效率,所述CMC可以通过对缀合产物的酸性水解和氨基酸分析来测定。检测到这一氨基酸确认反应性溴代乙酰胺基的成功加帽,从而使其不可用于任何不期望的化学反应。可接受的共价和加帽水平是约1-15(对于CMCA/Lys)和约0-5(CMC/Lys)。类似地,过量的游离巯基残基可通过与低分子量亲电子试剂(例如碘乙酰胺)反应来加帽。一部分CMCA可源自直接通过碘乙酰胺加帽的多糖硫醇,所述多糖硫醇不参与与载体蛋白的卤代酰基的缀合。因此,缀合后反应样品(在通过碘乙酰胺加帽前)需要通过氨基酸分析(CMCA)进行检查以确定直接参与缀合的硫醇的准确水平。对于含有10-12个硫醇基的硫醇化糖来说,通常确定5-6个硫醇基直接参与多糖硫醇与溴乙酰化蛋白之间的缀合,并且通过碘乙酰胺将4-5个硫醇基加帽。
在优选实施方案中,第一加帽试剂是N-乙酰基-L-半胱氨酸,其与载体蛋白上未缀合的α-卤代乙酰胺基反应。在其它实施方案中,第二加帽试剂是碘乙酰胺(IAA),其与所述活化的硫醇化糖的未缀合的游离巯基反应。通常,步骤e)包括用作为第一加帽试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸和作为第二加帽试剂的IAA进行加帽。在一些实施方案中,加帽步骤e)还包括在与第一和/或第二加帽试剂反应后与例如DTT、TCEP或巯基乙醇等还原剂的反应。
在一些实施方案中,所述方法还包括通过例如超滤/渗滤纯化eTEC连接的糖缀合物的步骤。
在优选实施方案中,所述双官能对称硫代烷基胺试剂是胱胺或其盐,其与活化的糖反应以提供含有二硫化物部分的硫醇化糖或其盐。
此类硫醇化糖衍生物与还原剂反应产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化多糖。此类活化的硫醇化糖可通过例如超滤/渗滤来分离和纯化。或者,所述活化的硫醇化糖可通过例如标准的尺寸排阻色谱(SEC)法或离子交换色谱法(例如业内已知的DEAE)分离和纯化。
在胱胺衍生的硫醇化糖的情况下,与还原剂反应裂解二硫键以提供包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖。在半胱胺衍生的硫醇化糖的情况下,与还原剂反应是可选的,并且可用于还原通过试剂或产物的氧化而形成的二硫键。
用于本发明方法中的还原剂包括例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇。然而,可使用任意合适的二硫化物还原剂。
在一些实施方案中,所述方法还包括提供包含一个或多个α-卤代乙酰胺基(优选一个或多个α-溴代乙酰胺基)的活化的载体蛋白。
所述活化的硫醇化糖与包含一个或多个α-卤代乙酰胺部分的活化的载体蛋白反应导致活化的载体蛋白的α-卤基被所述活化的硫醇化糖的一个或多个游离巯基亲核置换,从而形成eTEC间隔基的硫醚键。
所述载体蛋白的α-卤代乙酰化氨基酸残基通常连接到载体蛋白的一个或多个赖氨酸残基的ε-氨基。在常见的实施方案中,所述载体蛋白含有一个或多个α-溴乙酰化氨基酸残基。在一个实施方案中,用溴乙酸试剂(例如溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS))活化载体蛋白。
在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:提供包含一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化的载体蛋白,并且使所述活化的硫醇化多糖与所述活化的载体蛋白反应以产生硫醇化多糖-载体蛋白缀合物,由此产生包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的多糖的糖缀合物。
在本文所述方法的一些优选实施方案中,所述细菌荚膜多糖是源自肺炎链球菌的Pn荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。在某些优选实施方案中,所述载体蛋白是CRM197,并且所述Pn荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。
在本文所提供的方法的其它优选实施方案中,所述细菌荚膜多糖是源自脑膜炎奈瑟球菌的Mn荚膜多糖。在一些此类实施方案中,所述Mn荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。在某些优选实施方案中,所述载体蛋白是CRM197,并且所述荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
在本文所提供的每一种方法的一些实施方案中,使所述糖与咪唑或三唑复合,然后与例如CDT等碳酸衍生物在含有约0.2%w/v水的有机溶剂(例如,DMSO)中反应以产生活化的糖。在活化步骤中使用复合糖增加了糖在有机溶剂中的溶解度。通常,使所述糖与10克1,2,4-三唑赋形剂/克多糖复合,随后在环境温度下混合以提供复合糖。
因此,在某些实施方案中,所述方法还包括在活化步骤a)前使所述糖与三唑或咪唑复合以得到复合糖的步骤。在一些此类实施方案中,将复合糖壳形冷冻(shell-frozen),冻干并且在有机溶剂(例如DMSO)中复原,并且添加约0.2%w/v水,然后用碳酸衍生物(例如,CDT)活化。
在一个实施方案中,任选地用N-乙酰基-赖氨酸甲酯处理硫醇化糖反应混合物以将任何未反应的活化的糖加帽。在一些此类实施方案中,通过超滤/渗滤纯化加帽的硫醇化糖混合物。
在常见的实施方案中,使硫醇化糖与还原剂反应以产生活化的硫醇化糖。在一些此类实施方案中,上述还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇。在一些此类实施方案中,通过超滤/渗滤纯化活化的硫醇化糖。
在一个实施方案中,产生所述eTEC连接的糖缀合物的方法包括在约5℃将活化的硫醇化糖与载体蛋白的反应混合物的pH调节到约8至约9的pH并且维持约20小时的步骤。
在一个实施方案中,产生本发明的糖缀合物的方法包括在产生硫醇化糖-载体蛋白缀合物后将其分离的步骤。在常见的实施方案中,通过超滤/渗滤分离糖缀合物。
在另一实施方案中,产生本发明的eTEC连接的糖缀合物的方法包括在产生分离的糖-载体蛋白缀合物后将其分离的步骤。在常见的实施方案中,通过超滤/渗滤分离糖缀合物。
在再一实施方案中,产生活化的糖的方法包括将包含糖和CDT的反应混合物在有机溶剂中的水浓度调节到约0.1%-0.4%的步骤。在一个实施方案中,将包含糖和CDT的反应混合物在有机溶剂中的水浓度调节到约0.2%。
在一个实施方案中,活化糖的步骤包括使多糖与相对于存在于包含荚膜多糖与CDT的反应混合物中的多糖的量约5摩尔过量的量的CDT在有机溶剂中反应。
在另一实施方案中,产生本发明的糖缀合物的方法包括确定包含糖的反应混合物的水浓度的步骤。在一个此类实施方案中,添加到反应混合物中以活化所述糖的CDT的量是在有机溶剂中以大约如下量的CDT提供的:所述量与存在于包含糖和CDT的反应混合物中的水的量等摩尔。
在另一实施方案中,添加到反应混合物中以活化所述糖的CDT的量是在有机溶剂中以大约如下量的CDT提供的:所述量相对于存在于包含糖和CDT的反应混合物中的水的量的摩尔比为约0.5:1。在一个实施方案中,添加到反应混合物中以活化所述糖的CDT的量是在有机溶剂中以大约如下量的CDT提供的:所述量相对于存在于包含糖和CDT的反应混合物中的水的量的摩尔比为0.75:1。
在一个实施方案中,所述方法包括通过渗滤分离硫醇化多糖的步骤。在另一实施方案中,所述方法包括通过渗滤分离活化的硫醇化多糖的步骤。
在一个实施方案中,用于产生分离的Pn荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法中的载体蛋白包括CRM197。在另一实施方案中,用于产生分离的Mn荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法中的载体蛋白包括CRM197。
在一些实施方案中,糖:活化的载体蛋白比(w/w)是0.2-4。在其它实施方案中,糖:活化的载体蛋白比(w/w)是1.0-2.5。在其它实施方案中,糖:活化的载体蛋白比(w/w)是0.4-1.7。在其它实施方案中,糖:活化的载体蛋白比(w/w)是约1:1。在一些此类实施方案中,所述糖是细菌荚膜多糖,并且所述活化的载体蛋白是通过CRM197的活化(溴乙酰化)生成的。
在另一实施方案中,产生活化的糖的方法包括使用有机溶剂。在常见的实施方案中,所述有机溶剂是极性非质子溶剂。在一些此类实施方案中,所述极性非质子溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酰胺(HMPA)或其混合物。在优选实施方案中,所述有机溶剂是DMSO。
在常见的实施方案中,所述eTEC连接的糖缀合物的分离包括超滤/渗滤步骤。
在一个实施方案中,用于产生本发明的糖缀合物的方法中的糖具有约10kDa至约2,000kDa的分子量。在另一实施方案中,用于产生本发明的糖缀合物的方法中的糖具有约50kDa至约2,000kDa的分子量。
在一个实施方案中,产生荚膜多糖-载体蛋白糖缀合物的方法中所产生的糖缀合物具有约50kDa至约20,000kDa的大小。在另一实施方案中,产生荚膜多糖-载体蛋白糖缀合物的方法中所产生的糖缀合物具有约500kDa至约10,000kDa的大小。在一个实施方案中,产生荚膜多糖-载体蛋白糖缀合物的方法中所产生的糖缀合物具有约1,000kDa至约3,000kDa的大小。
在另一方面中,本发明提供通过本文所公开的任何方法产生的包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的糖的eTEC连接的糖缀合物。
在另一方面中,本发明提供包含通过本文所述的任何方法产生的eTEC连接的糖缀合物的免疫原性组合物。
所述糖的O-乙酰化程度可通过本领域内已知的任何方法测定,例如,通过质子NMR(Lemercinier和Jones(1996)Carbohydrate Research 296;83-96,Jones和Lemercinier(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis30;1233-1247,WO 05/033148或WO 00/56357)测定。另一种常用方法由Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180;249-261描述。再一种方法基于HPLC-离子排斥色谱法。O-乙酰化程度是通过评价存在于样品中的游离乙酸根的量并且比较该值与弱碱水解后释放的乙酸根的量而确定的。利用在210nm下的紫外(UV)检测从样品的其它组分中分辨出乙酸根并且定量。另一种方法基于HPLC-离子排斥色谱法。O-乙酰基是通过评价存在于样品中的游离乙酸根的量并且比较该值与弱碱水解后释放的乙酸根的量确定的。从样品的其它组分中分辨出乙酸根并且利用在210nm下的紫外(UV)检测来定量。
通过氨基酸分析确定缀合程度
使用溴乙酰基活化化学生成的“IAA加帽前的”缀合物样品的酸水解导致由缀合位点处的胱胺形成酸稳定性S-羧甲基半胱胺(CMCA)并且由被加帽位点处的半胱氨酸形成酸稳定性S-羧甲基半胱氨酸(CMC)。使用溴乙酰基活化化学生成的“IAA加帽后的”(最终)缀合物的酸水解导致由缀合位点和IAA加帽位点处的胱胺形成酸稳定性S-羧甲基半胱胺(CMCA)并且从被加帽位点处的半胱氨酸形成酸稳定性S-羧甲基半胱氨酸(CMC)。将所有未缀合的和未加帽的赖氨酸转化回赖氨酸并且照此进行检测。除了被水解条件破坏的色氨酸和半胱氨酸以外,将所有其它氨基酸水解回游离氨基酸。将天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化成天冬氨酸和谷氨酸。
使用离子交换色谱法分离每种水解的样品和对照的氨基酸,随后与Beckman茚三酮NinRX溶液在135℃下反应。然后在可见光范围内在570nm和440nm下检测衍生化的氨基酸(参见表1)。将含有500皮摩尔每种氨基酸的标准氨基酸组[Pierce氨基酸标准品H]与样品和对照一起进行每组分析。将S-羧甲基半胱氨酸[Sigma-Aldrich]添加到标准品中。
表1
在Beckman 6300氨基酸分析仪上使用梯度程序1得到的氨基酸的保留时间
基于其与半胱氨酸和半胱胺的共价连接以及所预期的类似水解而选择赖氨酸用于评估。然后比较得到的氨基酸摩尔数与所述蛋白的氨基酸组成并且将其与CMC和CMCA的值一起报告。将CMCA值直接用于评估缀合程度并且将CMC值直接用于评估加帽程度。
在一个实施方案中,通过分子大小分布(Kd)来表征糖缀合物。通过Sepharose CL-4B固定相尺寸排阻色谱(SEC)介质使用高压液相色谱系统(HPLC)来确定缀合物的分子大小。对于Kd的确定,首先校准色谱柱以确定V0(其表示空体积或总排斥体积)以及Vi(即样品中最小分子洗脱时的体积,也被称为粒子间体积)。所有SEC分离均发生在V0与Vi之间。所收集到的每个流分的Kd值是通过以下表达式Kd=(Ve-Vi)/(Vi-V0)确定的,其中Ve表示化合物的保留体积。洗脱≤0.3的流分%(主峰)限定缀合物的Kd(分子大小分布)。
免疫原性组合物
术语“免疫原性组合物”是指可用于在个体中诱发免疫应答的含有抗原(例如,微生物或其组分)的任何药物组合物。
如本文所使用的“免疫原性”意指抗原(或抗原的表位)例如细菌荚膜多糖或包含细菌荚膜多糖的糖缀合物或免疫原性组合物在宿主个体(例如哺乳动物)中诱发体液或细胞介导的免疫应答或二者的能力。
所述糖缀合物可通过在细胞表面提供与MHC分子相关的抗原用于使宿主敏化。另外,可生成抗原特异性T细胞或抗体以允许对被免疫宿主的未来保护。因此,糖缀合物可保护宿主免于一种或多种与细菌感染相关的症状,或可保护宿主免于因与荚膜多糖相关的细菌感染所致的死亡。还可使用糖缀合物来生成可用于赋予个体被动免疫的多克隆抗体或单克隆抗体。还可使用糖缀合物来生成功能性的抗体,如通过在动物效力模型中或通过调理吞噬杀灭测定对细菌的杀灭所测量的。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合到靶标(例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所使用,除非上下文另有说明,否则所述术语意图不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体,而且涵盖工程抗体(例如,经嵌合、人源化和/或衍生化以改变效应子功能、稳定性和其它生物活性)及其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)和域抗体(包括鲨鱼和骆驼抗体)和包含抗体部分的融合蛋白、多价抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体,只要它们表现出期望的生物活性即可)和如本文所述的抗体片段,以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体,例如IgG、IgA或IgM(或其亚类),并且所述抗体不必属于任何具体类别。取决于其重链的恒定域的抗体氨基酸序列,可将免疫球蛋白归属于不同类别。存在5大类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些中的若干类别可进一步被划分为亚类(同种型),例如,人类中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分,其中该部分在存在于完整抗体中时优选保留通常与该部分相关的至少一种、优选大部分或所有功能。
术语“抗原”通常是指免疫原性组合物中的生物分子,通常为蛋白、肽、多糖或缀合物,或者可刺激个体中产生抗体或T细胞反应或两者的免疫原性物质,包括被注射或吸收到个体中的组合物。可针对整个分子或针对所述分子的各个部分(例如,表位或半抗原)生成免疫应答。该术语可用于指单个分子或同源或异源抗原分子群体。抗原由抗体、T细胞受体或具有特定体液免疫性和/或细胞免疫性的其它成分识别。“抗原”还包括所有相关的抗原表位。给定抗原的表位可使用本领域内熟知的任何数量的表位定位技术来鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编辑,1996)Humana Press,Totowa,N.J。例如,线性表位可例如通过以下方式来确定:在固体支撑物上同时合成大量肽,所述肽对应于蛋白分子的各部分,并且在使所述肽仍然连接到所述支撑物的情况下使所述肽与抗体反应。此类技术为本领域内已知并且描述于例如美国专利第4,708,871号;Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中;这些文献各自以其整体援引加入本文。类似地,构象表位可通过例如x射线晶体学和二维核磁共振确定氨基酸的空间构象来鉴别。参见例如Epitope MappingProtocols,见上文。此外,出于本发明的目的,“抗原”还可用于指包括对天然序列所作的修饰(例如缺失、添加和取代)(通常性质保守,但它们可为不保守的)的蛋白,只要所述蛋白维持诱发免疫应答的能力即可。这些修饰可以是人为的,如通过定点诱变、或通过特定合成操作、或通过遗传工程方法,或可为偶发性的,例如通过产生抗原的宿主的突变。此外,抗原可从微生物(例如,细菌)衍生、获得或分离,或可为整个生物体。类似地,所述定义中还包括在例如核酸免疫应用中表达抗原的低聚核苷酸或多核苷酸。合成抗原还包括例如多表位、侧接表位(flanking epitope)和其它重组或合成衍生抗原(Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:27772781;Bergmann等人(1996)J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier(1997)Immunol.Cell Biol.75:402408;Gardner等人(1998)第12届世界艾滋病会议(12th World AIDSConference),瑞士日内瓦,1998年6月28日-7月3日)。
“保护性”免疫应答是指免疫原性组合物诱发用于保护个体免于感染的体液或细胞介导的免疫应答或两者的能力。所提供的保护不必是绝对的,即,不必完全阻止或根除感染,如果相对于对照个体群体(例如未给药疫苗或免疫原性组合物的受感染动物)存在统计学上显著的改进即可。保护可限于缓和感染症状的严重性或发作快速性。通常,“保护性免疫应答”会包括在至少50%的个体中诱导对特定抗原具有特异性的抗体水平增加,包括对各抗原的可测量功能性抗体反应的一定水平的增加。在特定情况下,“保护性免疫应答”可包括在至少50%的个体中诱导对特定抗原具有特异性的抗体水平增加两倍或抗体水平增加4倍,包括对各抗原的可测量功能性抗体反应的一定水平的增加。在某些实施方案中,调理吞噬抗体与保护性免疫应答相关。因此,保护性免疫应答可通过在调理吞噬测定(例如下述测定)中测量细菌计数减少百分比而测定。优选地,细菌计数减少至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或以上。
术语“免疫原性量”和“免疫有效量”在本文中可互换使用,是指抗原或免疫原性组合物足以诱发免疫应答的量,所述免疫应答可为细胞(T细胞)应答或体液(B细胞或抗体)应答或两者,其中此类免疫应答可通过本领域技术人员已知的标准测定测量。通常,免疫有效量会在个体中诱发保护性免疫应答。
本发明的免疫原性组合物可用于借助于通过全身性、皮肤或粘膜途径给药所述免疫原性组合物来预防性或治疗性地保护或治疗易受由例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌细菌引起的细菌感染的个体,或可用于生成可用于赋予另一个体被动免疫的多克隆或单克隆抗体制剂。这些给药可包括通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射;或通过粘膜给药到口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。还可使用免疫原性组合物来生成功能性的抗体,如通过在动物效力模型中或通过调理吞噬杀灭测定对细菌的杀灭所测量的。
用于特定免疫原性组合物的组分的最佳量可通过涉及在个体中观察适当免疫应答的标准研究来确定。在进行初始疫苗接种后,个体可接受一次或若干次充分间隔的加强免疫。
在某些实施方案中,所述免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。如本文所定义,“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。因此,通常给予佐剂以加强免疫应答并且佐剂为本领域技术人员所熟知。增强组合物的有效性的合适佐剂包括但不限于:
(1)铝盐(明矾),例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等;
(2)水包油乳液制剂(具有或不具有其它特异性免疫刺激剂,例如胞壁肽(定义于下文中)或细菌细胞壁组分),例如,
(a)使用微型流化器(例如110Y型微型流化器(Microfluidics,Newton,Mass.))配制成亚微米粒子的MF59(PCT公开第WO 90/14837号),其含有5%角鲨烯、0.5%Tween 80和0.5%Span 85(任选地含有不同量的MTP-PE(参见下文,虽然不是必需的)),
(b)微流化为亚微米乳液或涡旋生成较大粒度的乳液的SAF,其含有10%角鲨烯、0.4%Tween 80、5%Pluronic封阻的聚合物Ll21和thr-MDP(参见下文),以及
(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Corixa,Hamilton,Mont.),其含有2%角鲨烯、0.2%Tween 80和一种或多种来自描述于美国专利第4,912,094号(Corixa)中的3-O-去酰基化单磷酰脂质A(MPLTM)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(优选MPL+CWS(DetoxTM))的细菌细胞壁组分;
(3)皂苷佐剂,例如可使用Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics,Framingham.Mass.)(美国专利第5,057,540号),或由其生成的粒子,例如ISCOM(免疫刺激复合物);
(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物(例如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP))或其衍生物或类似物,其可购自Corixa并且描述于美国专利第6,113,918号中;一种此类AGP是2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷,其也被称为529(以前称为RC529),其被配制为含水形式或稳定乳液,合成多核苷酸,例如含有CpG基序的低聚核苷酸(美国专利第6,207,646号);
(5)细胞因子,例如白细胞介素(例如,IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如,γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等;
(6)细菌ADP-核糖基化毒素的解毒突变体,所述毒素是例如呈野生型或突变体形式(例如,根据已公开的国际专利申请第WO 00/18434号(还参见WO 02/098368和WO 02/098369),其中29位氨基酸处的谷氨酸被另一氨基酸、优选组胺酸替代)的霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)、或大肠杆菌热不稳定的毒素(LT),尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(参见例如WO 93/13302和WO 92/19265);以及
(7)充当免疫刺激剂以增强所述组合物的有效性的其它物质。
胞壁肽包括但不限于N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些实施方案中,所述佐剂是铝系佐剂,例如铝盐。在特定实施方案中,所述铝系佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。在特定实施方案中,所述佐剂是磷酸铝。
所述免疫原性组合物可任选地包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括获得联邦、州政府的管理机构或另一管理机构批准或列示于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或另一公认药典中用于个体(包括人类以及非人类哺乳动物)的载体。术语载体可用于指与药物组合物一起给药的稀释剂、赋形剂或媒介物。可采用水、盐水溶液以及含水的右旋糖和甘油溶液作为尤其用于注射溶液剂的液体载体。合适药物载体的示例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。所述制剂应适合给药方式。
除多种荚膜多糖-蛋白缀合物外,本发明的免疫原性组合物还可包含一种或多种防腐剂。FDA要求存于多剂量(multiple-dose、multi-dose)小瓶中的生物产品含有防腐剂,只有少数例外。含有防腐剂的疫苗产品包括含有苄索氯铵(炭疽热)、2-苯氧基乙醇(DTaP、HepA、莱姆病(Lyme)、小儿麻痹症(肠胃外))、苯酚(肺炎(Pneumo)、伤寒(肠胃外)、牛痘病)和硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流行性感冒、JE、脑膜炎(Mening)、肺炎、狂犬病)的疫苗。被批准用于注射药物的防腐剂包括例如氯代丁醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞和硝酸苯汞。
在某些实施方案中,与肠胃外给药相容的本发明的制剂包含一种或多种非离子型表面活性剂,包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨酯-80(Tween 80)、聚山梨酯-60(Tween 60)、聚山梨酯-40(Tween 40)和聚山梨酯-20(Tween 20),聚氧乙烯烷基醚,包括但不限于Brij 58、Brij 35,以及其它,例如Triton X-100、Triton X-114、NP40、Span 85和Pluronic系列的非离子型表面活性剂(例如,Pluronic 121),其中优选组分为约0.001%至约2%(优选至多约0.25%)的浓度的聚山梨酯-80或约0.001%至1%(优选至多约0.5%)的浓度的聚山梨酯-40。
包装和给药形式
将本发明的免疫原性组合物直接递送到个体可通过肠胃外给药(肌内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内或到组织间隙);或通过粘膜给药到口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道;或者通过局部、经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜给药实现。
在一个实施方案中,肠胃外给药是通过肌内注射到例如个体的大腿或上臂来进行的。注射可通过针(例如皮下注射针)进行,或者可使用无针注射。典型的肌内剂量是0.5mL。在另一实施方案中,鼻内给药用于治疗肺炎或中耳炎(因为肺炎球菌的鼻咽运送可被更有效地阻止,从而在其最早阶段减弱感染)。
本发明的组合物可以多种形式制备,例如,作为液体溶液剂或混悬剂用于注射。在某些实施方案中,所述组合物可被制备成粉末或喷雾剂用于肺部给药,例如呈吸入剂形式。在其它实施方案中,所述组合物可被制备成栓剂或阴道栓,或用于鼻、耳或眼给药,例如,制备成喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末。
将每个免疫原性组合物剂量中的糖缀合物的量选择为诱导免疫保护应答而没有显著不良影响的量。此类量可根据存在于糖缀合物中的细菌血清型而变化。通常,每个剂量包含0.1μg-100μg,特别是0.1μg-10μg,更特别是1μg-5μg的多糖。
在本发明的具体实施方案中,免疫原性组合物是通过eTEC连接体单个地缀合到CRM 197的Pn或Mn荚膜多糖的无菌液体制剂,其中每0.5mL剂量被配制成含有1-5μg的多糖,其可进一步含有0.125mg铝元素(0.5mg磷酸铝)佐剂;以及作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲剂。
用于特定免疫原性组合物的组分的最佳量可通过涉及在个体中观察适当免疫应答的标准研究来确定。在进行初始疫苗接种后,个体可接受一次或若干次充分间隔的加强免疫。
本发明的免疫原性组合物可以单位剂量或多剂量形式(例如,2剂量、4剂量或更多剂量)包装。对于多剂量形式来说,小瓶通常但未必优于载药注射器。合适的多剂量形式包括但不限于:每个容器2-10剂量,每剂量0.1mL-2mL。在某些实施方案中,所述剂量是0.5mL剂量。参见例如国际专利申请WO 2007/127668,其援引加入本文。
组合物可提供于小瓶或其它合适的储存容器中,或可提供于预装药递送装置中,所述装置是例如可供给有针或无针的单组份或多组份注射器。注射器通常但未必含有单剂量的含防腐剂的本发明免疫原性组合物,但还包括预装药多剂量注射器。同样,小瓶可包括单剂量,但也可包括多剂量。
可常规地确定有效剂量体积,但所述组合物的典型注射剂量具有0.5mL的体积。在某些实施方案中,配制剂量用于给药到人类个体。在某些实施方案中,配制剂量用于给药到成人、少年、青年、幼儿或婴儿(即,不超过1岁)的人类个体并且在优选实施方案中可通过注射给药。
本发明的液体免疫原性组合物还适合用于复原以冻干形式提供的其它免疫原性组合物。倘若免疫原性组合物将用于此类即时复原,则本发明提供具有两个或更多个小瓶、两个或更多个即时装药的(ready-filled)注射器、或每一者中的一个或多个的药盒,其中注射器的内容物用于在注射前复原小瓶的内容物,或反之亦然。
在再一实施方案中,多剂量形式的容器选自但不限于以下中的一种或多种:一般实验室玻璃器皿、烧瓶、烧杯、量筒、发酵器、生物反应器、管道、管、袋、罐、小瓶、小瓶盖(例如,橡皮塞、螺口盖(screw on cap))、安瓿、注射器、双室或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡皮盖、塑料盖、玻璃盖、药筒和一次性笔等。本发明的容器不受制造材料限制,并且包括例如玻璃、金属(例如,钢、不锈钢、铝等)和聚合物(例如,热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)等材料。在具体实施方案中,所述形式的容器是具有丁基塞的5mL Schott 1型玻璃小瓶。本领域技术人员会了解,上述形式决不是详尽列表,而仅仅就可用于本发明的形式种类充当技术人员的指导。用于本发明中的其它形式可在来自实验室设备供应商和制造商(例如United States Plastic公司(Lima,OH),VWR)的公开目录中找到。
诱导免疫应答和保护免于感染的方法
本发明还包括预防性或治疗性地使用eTEC连接的糖缀合物和包含它们的免疫原性组合物的方法。例如,本发明的一个方面提供诱导抗病原细菌(例如肺炎链球菌或脑膜炎球菌细菌)的免疫应答的方法,其包括向个体给药免疫有效量的本文所述的任何免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含细菌抗原,例如源自病原细菌的细菌荚膜多糖。本发明的一个实施方案提供保护个体免于病原细菌感染的方法,或预防、治疗或改善与病原细菌相关的感染疾病或病症的方法,或降低与由病原细菌引起的感染相关的至少一种症状的严重性或延迟与由病原细菌引起的感染相关的至少一种症状的发作的方法,在每种情况下,所述方法都包括向个体给药免疫有效量的本文所述的任何免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含细菌抗原,例如源自病原细菌的细菌荚膜多糖。
本发明的一个实施方案提供预防、治疗或改善个体的细菌感染、疾病或病症的方法,所述方法包括向所述个体给药免疫有效量的本发明的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物,所述eTEC连接的糖缀合物包含细菌抗原(例如细菌荚膜多糖)。
在一些实施方案中,预防、治疗或改善细菌感染、疾病或病症的方法包括人类、兽类、动物或农业治疗。另一实施方案提供预防、治疗或改善个体的与病原细菌相关的细菌感染、疾病或病症的方法,所述方法包括由本文所述的免疫原性组合物生成多克隆或单克隆抗体制剂,并且使用所述抗体制剂来赋予所述个体被动免疫。本发明的一个实施方案提供预防经历手术操作的个体的细菌感染的方法,所述方法包括在所述手术操作前向所述个体给药预防有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。
在上述方法中每一种的优选实施方案中,所述病原细菌是肺炎链球菌或脑膜炎球菌细菌,例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌细菌。在一些此类实施方案中,所述细菌抗原是选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖的荚膜多糖。在其它此类实施方案中,所述细菌抗原是选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖的荚膜多糖。
对抗原或免疫原性组合物的免疫应答的特征在于个体中产生对存在于目标抗原或免疫原性组合物中的分子的体液和/或细胞介导的免疫应答。出于本发明的目的,“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答并且涉及引入和生成以一定亲和力识别和结合本发明的免疫原性组合物中的抗原的抗体,而“细胞介导的免疫应答”是由T细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”是通过提供与主要组织相容性复合物(MHC)的I类或II类分子、CD1或其它非典型MHC样分子相关的抗原表位而诱发的。这激活了抗原特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)。CTL对表现出与典型或非典型MHC编码并且在细胞表面上表达的蛋白有关的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进对细胞内微生物的细胞内破坏、或对受此类微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一方面涉及通过辅助T细胞进行的抗原特异性反应。辅助T细胞用于帮助刺激针对表现出与其表面上的典型或非典型MHC分子相关的肽或其它抗原的细胞的非特异性效应细胞的功能,并且集中于所述非特异性效应细胞的活性。“细胞介导的免疫应答”还指由活化的T细胞和/或其它白细胞(包括那些源自CD4+和CD8+T细胞的细胞)产生的细胞因子、趋化因子和其它此类分子的产生。特定抗原或组合物刺激细胞介导的免疫应答的能力可通过多种测定来确定,例如通过淋巴组织增生(淋巴细胞活化)测定、CTL细胞毒性细胞测定,通过测定敏化个体中对所述抗原具有特异性的T-淋巴细胞,或通过测量T细胞响应抗原再刺激而实现的细胞因子产生。此类测定为本领域内所熟知。参见例如Erickson等人(1993)J.Immunol.151:4189-4199;以及Doe等人(1994)Eur.J.Immunol.24:2369-2376。
本发明的免疫原性组合物和方法可用于以下中的一个或多个:(i)预防感染或再感染,如在传统疫苗中,(ii)降低症状的严重性或消除症状,和/或(iii)基本上或完全消除目标病原体或病症。因此,可预防性地(在感染前)或治疗性地(在感染后)实现治疗。在本发明中,预防性治疗是优选方式。根据本发明的具体实施方案,提供治疗宿主个体的由例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌引起的细菌感染的组合物和方法,所述治疗包括预防性地和/或治疗性地使所述宿主个体对由例如肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌引起的细菌感染免疫。本发明的方法可用于赋予个体预防性和/或治疗性免疫。还可对用于生物医学研究应用的个体实施本发明的方法。
如本文所使用的术语“个体”意指人类或非人类动物。更具体地,个体是指归类为哺乳动物的任何动物,包括人类、驯养和农场动物以及研究用动物、动物园动物、运动型动物和宠物伴侣动物,例如家庭宠物和其它家养动物,包括但不限于牛、绵羊、雪貂、猪、马、兔、山羊、狗、猫等。优选的伴侣动物是狗和猫。优选地,个体是人类。
组合物中特定缀合物的量通常是基于用于该缀合物的多糖(缀合的和非缀合的两者)的总量来计算的。例如,在100μg多糖剂量中,含有20%游离多糖的缀合物会含有约80μg缀合多糖和约20μg未缀合多糖。在计算缀合物的剂量时,通常不考虑蛋白对缀合物的作用。缀合物或免疫原性组合物的免疫原性量可根据细菌血清型而变化。通常,每个剂量包含0.1μg-100μg,特别是0.1μg-10μg,更特别是1μg-10μg的多糖。免疫原性组合物中不同多糖组分的免疫原性量可存在差异并且各自可包含1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg或约100μg的任何特定多糖抗原。
术语“侵袭性疾病”是指从存在相关的临床疾病体征/症状的通常无菌的部位分离细菌。通常无菌的身体部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、关节/滑液、骨、内部身体部位(淋巴结、脑、心脏、肝、脾、玻璃体液、肾、胰、卵巢)或其它通常无菌的部位。特征为侵袭性疾病的临床病症包括菌血症、肺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎、败血性休克等。
抗原作为免疫原的有效性可通过增殖测定、通过细胞溶解测定(例如铬释放测定以测量T细胞溶解其特异性靶细胞的能力)、或通过测量B细胞活性水平(通过测量对血清中抗原具有特异性的循环抗体的水平来测量B细胞活性水平)来测量。如本文所述,免疫应答还可通过测量给药所述抗原之后诱导的抗原特异性抗体的血清水平来检测,并且更特别地,通过测量这样诱导的抗体增强特定白细胞的调理吞噬能力的能力来检测。所述免疫应答的保护水平可通过用已给药的抗原攻击免疫的宿主来测量。例如,如果需要免疫应答的抗原是细菌,则通过检测用所述细菌细胞攻击动物之后的存活百分比或死亡百分比来测量免疫原性量的抗原所诱导的保护水平。在一个实施方案中,保护量可通过测量与细菌感染相关的至少一种症状(例如,与感染相关的发热)来测量。多抗原或多组分疫苗或免疫原性组合物中每种抗原的量会相对于每种其它组分而变化,并且可通过本领域技术人员已知的方法来确定。此类方法包括用于测量免疫原性和/或体内效力的操作。
在另一方面中,本发明提供特异性且选择性地结合到本发明的荚膜多糖或糖缀合物的抗体和抗体组合物。在一些此类实施方案中,本发明提供特异性地且选择性地结合到Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F荚膜多糖或包含它们的糖缀合物的抗体和抗体组合物。在其它此类实施方案中,本发明提供特异性且选择性地结合到Mn-血清型A、C、W135或Y荚膜多糖或包含它们的糖缀合物的抗体和抗体组合物。在一些实施方案中,在向个体给药本发明的荚膜多糖或糖缀合物后生成抗体。在一些实施方案中,本发明提供针对本发明的一种或多种荚膜多糖或糖缀合物的纯化或分离的抗体。在一些实施方案中,本发明的抗体是功能性的,如通过在动物效力模型中或通过调理吞噬杀灭测定对细菌的杀灭所测量的。本发明的抗体或抗体组合物可用于治疗或预防个体的与病原细菌(例如,肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟球菌细菌)相关的细菌感染、疾病或病症的方法中,所述方法包括生成多克隆或单克隆抗体制剂,和使用该抗体或抗体组合物来赋予所述个体被动免疫。本发明的抗体还可用于诊断方法,例如,检测荚膜多糖或其糖缀合物的存在或对荚膜多糖或其糖缀合物的水平进行定量。例如,本发明的抗体还可用于检测Pn或Mn荚膜多糖或其糖缀合物的存在或对Pn或Mn荚膜多糖或其糖缀合物的水平进行定量,其中所述糖缀合物包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的细菌荚膜多糖。
本领域内已知的若干测定和动物模型可用于评价本文所述的任一种免疫原性组合物的效力。例如,Chiavolini等人,Clin.Microbiol.Rev.(2008),21(4):666-685)描述了肺炎链球菌疾病的动物模型。Gorringe等人,METHODSIN MOLECULAR MEDICINE,第66卷(2001),第17章,Pollard和Maiden编辑(Humana Press公司)描述了用于脑膜炎球菌疾病的动物模型。
调理吞噬活性(OPA)测定
OPA测定操作基于先前由Hu等人(Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005;12(2):287-95)描述的方法,该方法进行了以下修改。将热失活的血清在缓冲液中连续稀释2.5倍。将靶细菌添加到测定板上,并在振荡器上在25℃下孵育30min。然后将幼兔补体(3-4周龄,Pel-Freez,12.5%最终浓度)和分化的HL-60细胞以200:1的近似效应器与靶器官比率添加到各孔中。将测定板在振荡器上在37℃下孵育45min。为了终止反应,将80μL的0.9%NaCl添加到所有孔中,混合,并且将10μL等分试样转移到含有200μL水的Millipore,MultiScreenHTS HV过滤板的孔中。使液体在真空下滤过板,并且将150μLHySoy培养基添加到各孔中并滤过。然后将过滤板在37℃、5%CO2下孵育过夜,然后用脱色溶液(Bio-Rad)固定。然后用考马斯蓝(Coomassie Blue)将板染色并且脱色一次。使菌落成像并且在Cellular Technology Limited(CTL)ImmunoSpot上计数。从涵盖相对于不含有免疫血清的对照孔细菌菌落数降低50%的点的两个血清稀释度的倒数内插OPA抗体效价。
上述公开内容概述了本发明。可通过参考以下具体实施例获得更全面的理解。描述这些实施例的目的仅仅是为了说明且并不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1.用于制备eTEC连接的糖缀合物的一般方法
糖的活化和用胱胺二盐酸盐硫醇化
将糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原。通过卡尔费歇尔(Karl Fischer)(KF)分析确定所述溶液的水分含量并且进行调节以达到0.1%-0.4%(通常为0.2%)的水分含量。
为了起始活化,以100mg/mL的浓度在DMSO中新制备1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI)的溶液。用不同量的CDT/CDI(1-10摩尔当量)将糖活化并且使反应在23±2℃下进行1小时。活化水平可通过HPLC确定。在无水DMSO中以50mg/mL的浓度新制备胱胺二盐酸盐。使活化的糖与1摩尔当量的胱胺二盐酸盐反应。或者,使活化的糖与1摩尔当量的半胱胺盐酸盐反应。使硫醇化反应在23±2℃下进行21±2小时,以产生硫醇化糖。通过CDT/CDI的添加量来确定硫醇化水平。
通过添加100mM四硼酸钠pH 9.0溶液来淬灭活化反应溶液中的残余CDT/CDI。进行计算以确定四硼酸盐的添加量并且将最终水分含量调节为至多1-2%的总含水量。
活化的硫醇化糖的还原和纯化
通过添加到存于0.9%盐水(pH 6.0)中的预冷却的5mM琥珀酸钠中将硫醇化糖反应混合物稀释10倍并且滤过5μm过滤器。针对40倍渗滤体积(diavolume)的WFI进行硫醇化糖的渗滤。在通过10%体积的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)稀释后向渗余物中添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(1-5摩尔当量)溶液。使这一还原反应在5±3℃下进行20±2小时。优选通过针对预冷却的10mM磷酸二氢钠(pH 4.3)进行超滤/渗滤进行所述活化的硫醇化糖的纯化。或者,通过标准尺寸排阻色谱法(SEC)操作或离子交换色谱方法来纯化硫醇化糖。吸取(pull)活化的硫醇化糖渗余物的等分试样以确定糖浓度和硫醇含量(Ellman)测定。
活化的硫醇化糖的另一种还原和纯化
作为上述纯化操作的替代,还如下纯化活化的硫醇化糖。
向硫醇化糖反应混合物中添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(5-10摩尔当量)溶液并且使其在23±2℃下进行3±1小时。然后通过添加到存于0.9%盐水(pH 6.0)中的预冷却的5mM琥珀酸钠中将反应混合物稀释5倍并且滤过5μm过滤器。使用40倍渗滤体积的预冷却的10mM磷酸二氢钠(pH 4.3)进行硫醇化糖的渗滤。吸取活化的硫醇化糖渗余物的等分试样以确定糖浓度和硫醇含量(Ellman)测定。
溴乙酰化载体蛋白的活化和纯化
通过与溴乙酰化剂反应将载体蛋白的游离氨基溴乙酰化,所述溴乙酰化剂例如溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)、溴乙酰溴或另一合适试剂。
在活化前首先使载体蛋白(于0.1M磷酸钠中,pH 8.0±0.2)保持在8±3℃,约pH 7。以0.25-0.5BAANS:蛋白(w/w)的比率向蛋白溶液中添加呈二甲基亚砜(DMSO)储备溶液(20mg/mL)的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。将反应在5±3℃下轻轻地混合30-60分钟。例如通过超滤/渗滤使用10kDa MWCO膜使用10mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液来纯化得到的溴乙酰化(活化的)蛋白。在纯化后,通过Lowry蛋白测定估计溴乙酰化载体蛋白的蛋白浓度。
通过总溴化物测定通过偶联抑制型电导检测的离子交换液相色谱(离子色谱)来确定活化程度。使活化的溴乙酰化蛋白上的结合溴化物从测定样品制剂中的蛋白裂解并且与可能存在的任何游离的溴化物一起定量。通过在碱性2-巯基乙醇中加热所述样品使其转化成离子溴化物来释放所述蛋白上任何残留的共价结合的溴化物。
溴乙酰化CRM
197
的活化和纯化
用10mM磷酸盐缓冲的0.9%NaCl pH 7(PBS)将CRM197稀释成5mg/mL,然后使用1M储备溶液制成0.1M NaHCO3pH 7.0。使用20mg/mLDMSO的BAANS储备溶液,以CRM197:BAANS 1:0.35(w:w)的比率添加BAANS。使反应混合物在3℃-11℃下孵育30分钟-1小时,然后通过超滤/渗滤使用10K MWCO膜和10mM磷酸钠/0.9%NaCl(pH 7.0)纯化。通过Lowry测定来测定纯化的活化CRM197以确定蛋白浓度,然后用PBS稀释成5mg/mL。将蔗糖作为冷冻保护剂添加到5%wt/vol并且将活化的蛋白在-25℃下冷冻并储存直到需要进行缀合。
CRM197的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致,使得来自39个赖氨酸的15-25个赖氨酸可用于活化。所述反应产生高产率的活化蛋白。
活化的硫醇化糖与溴乙酰化载体蛋白的缀合
在开始缀合反应前,将反应容器预冷到5℃。随后添加溴乙酰化载体蛋白和活化的硫醇化糖并且以150-200rpm的搅动速度混合。糖/蛋白输入比率为0.9±0.1。用1M NaOH溶液将反应pH调节到8.0±0.1。使缀合反应在5℃下进行20±2小时。
残余的反应性官能团的加帽
通过与作为加帽试剂的2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3小时来淬灭载体蛋白上未反应的溴乙酰化残基。在5℃下用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)将残余的游离巯基加帽20小时。
eTEC连接的糖缀合物的纯化
使缀合反应(IAA加帽后的)混合物滤过0.45μm过滤器。针对5mM琥珀酸盐-0.9%盐水(pH 6.0)进行糖缀合物的超滤/渗滤。然后使糖缀合物渗余物滤过0.2μm过滤器。吸取糖缀合物的等分试样用于测定。将残留的糖缀合物在5℃下储存。
实施例2.Pn-33F eTEC缀合物的制备
活化方法
Pn33F多糖的活化
使Pn-33F多糖与500mM 1,2,4-三唑(于WFI中)复合以获得每克多糖10克三唑。将混合物在干冰-乙醇浴中壳形冷冻,然后冻干到干燥。使冻干的33F多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原。通过卡尔费歇尔(KF)分析确定冻干的33F/DMSO溶液的水分含量。通过将WFI添加到33F/DMSO溶液中来调节水分含量以达到0.2%的水分含量。
为了起始活化,新制备100mg/mL 1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)的DMSO溶液。在硫醇化步骤前用不同量的CDT活化Pn33F多糖。CDT活化在23±2℃下实施1小时。通过HPLC(A220/A205)确定活化水平。添加100mM四硼酸钠溶液(pH 9.0)以淬灭活化反应溶液中任何残余的CDT。进行计算以确定四硼酸盐的添加量并且使最终水分含量为1.2%的总含水量。使反应在23±2℃下进行1小时。
活化的Pn-33F多糖的硫醇化
在无水DMSO中新制备胱胺-盐酸盐并且将1摩尔当量的胱胺二盐酸盐添加到活化的多糖反应溶液中。使反应在23±2℃下进行21±2小时。通过添加到存于0.9%盐水(pH 6.0)中的预冷却的5mM琥珀酸钠中将硫醇化糖溶液稀释10倍。使稀释的反应溶液滤过5μm过滤器。利用100K MWCO超滤膜盒使用注射用水(WFI)实施硫醇化Pn-33F多糖的渗滤。
随CDT的摩尔当量而变化的活化的Pn-33F多糖的硫醇化水平示于图8中。
活化的硫醇化Pn-33F多糖的还原和纯化
在通过10%体积的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)稀释后向渗余物中添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(5摩尔当量)溶液。使这一还原反应在23±2℃下进行2±1小时。利用100K MWCO超滤膜盒实施硫醇化33F多糖的渗滤。针对预冷却的10mM磷酸钠(pH 4.3)进行渗滤。吸收硫醇化33F多糖渗余物用于糖浓度和硫醇(Ellman)测定两者。
活化的硫醇化Pn-33F多糖的另一种还原和纯化
作为上述纯化操作的替代,还如下纯化33F活化的硫醇化糖。
向硫醇化糖反应混合物中添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(5摩尔当量)溶液并且使其在23±2℃下进行3±1小时。然后通过添加到存于0.9%盐水(pH 6.0)中的预冷却的5mM琥珀酸钠中将反应混合物稀释5倍并且滤过5μm过滤器。使用40倍渗滤体积的预冷却的10mM磷酸二氢钠(pH 4.3)与100KMWCO超滤膜盒进行硫醇化糖的渗滤。吸收硫醇化33F多糖渗余物用于糖浓度和硫醇(Ellman)测定两者。活化方法的流程图提供于图7(A)中。
缀合方法
硫醇化Pn33F多糖与溴乙酰化CRM
197
的缀合
如实施例1中所述,通过溴乙酰化将CRM197载体蛋白单独地活化,然后与用于缀合反应的活化的Pn-33F多糖反应。在开始缀合反应前,将反应容器预冷到5℃。将溴乙酰化CRM197和硫醇化33F多糖在反应容器中以150-200rpm的搅动速度混合在一起。糖/蛋白输入比率为0.9±0.1。将反应pH调节成8.0-9.0。使缀合反应在5℃下进行20±2小时。
溴乙酰化CRM
197
和硫醇化Pn33F多糖上反应性基团的加帽
通过以下方式将CRM197蛋白上未反应的溴乙酰化残基加帽:与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3小时,随后在5℃下用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)将硫醇化33F-多糖的任何残余的游离巯基加帽20小时。
eTEC连接的Pn-33F糖缀合物的纯化
使缀合溶液滤过0.45μm或5μm过滤器。利用300K MWCO超滤膜盒实施33F糖缀合物的渗滤。针对5mM琥珀酸盐-0.9%盐水(pH 6.0)进行渗滤。然后使Pn-33F糖缀合物300K渗余物滤过0.22μm过滤器并且储存在5℃下。
缀合方法的流程图提供于图7(B)中。
结果
几批Pn-33F eTEC糖缀合物的反应参数和表征数据示于表2中。利用胱胺二盐酸盐进行CDT活化-硫醇化生成具有63%-90%糖产率和<1%-13%游离糖的糖缀合物。
表2.Pn33F eTEC缀合物的实验参数和表征数据
Pn-33F eTEC与CRM
197
的糖缀合物的OPA效价
在标准条件下测定小鼠中的Pn-33F OPA效价。4周和7周的OPA效价(具有95%CI的GMT)示于表3中,证实血清型33F Pn糖缀合物在鼠类免疫原性模型中诱发OPA效价。
表3.Pn-33F OPA效价(具有95%CI的GMT)
实施例3.Pn-22F eTEC缀合物的制备
活化方法
Pn-22F多糖的活化
使Pn-22F多糖与500mM 1,2,4-三唑(于WFI中)复合以获得每克多糖10克三唑。将混合物在干冰-乙醇浴中壳形冷冻,然后冻干到干燥。使冻干的22F多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原。通过卡尔费歇尔(KF)分析确定冻干的22F/DMSO溶液的水分含量。通过将WFI添加到Pn-22F/DMSO溶液中来调节水分含量以达到0.2%的水分含量。
为了起始活化,新制备100mg/mL 1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)的DMSO溶液。用不同量的CDT活化Pn-22F多糖,随后用1摩尔当量的胱胺二盐酸盐将其硫醇化。CDT活化在23±2℃下实施1小时。通过HPLC(A220/A205)确定活化水平。添加100mM四硼酸钠溶液(pH 9.0)以淬灭活化反应溶液中任何残余的CDT。进行计算以确定四硼酸盐的添加量并且使最终水分含量为1.2%的总含水量。使反应在23±2℃下进行1小时。
活化的Pn-22F多糖的硫醇化
在无水DMSO中新制备胱胺-二盐酸盐并且添加到反应溶液中。使反应在23±2℃下进行21±2小时。通过添加到存于0.9%盐水(pH 6.0)中的预冷却的5mM琥珀酸钠中将硫醇化糖溶液稀释10倍。使稀释的反应溶液滤过5μm过滤器。利用100K MWCO超滤膜盒使用注射用水(WFI)实施硫醇化Pn-22F多糖的渗滤。
活化的硫醇化Pn-22F多糖的还原和纯化
在通过10%体积的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)稀释后向渗余物中添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)(5-10摩尔当量)溶液。使这一还原反应在23±2℃下进行2±1小时。利用100K MWCO超滤膜盒实施硫醇化22F多糖的渗滤。针对预冷却的10mM磷酸钠(pH 4.3)进行渗滤。吸收硫醇化22F多糖渗余物用于糖浓度和硫醇(Ellman)测定两者。
Pn-22F eTEC糖缀合物的缀合、加帽和纯化
根据实施例2中所述的方法进行活化的硫醇化Pn22F多糖与活化的CRM197的缀合、Pn-22F eTEC糖缀合物的加帽和纯化。
结果
代表性的Pn-22F eTEC与CRM197的糖缀合物的表征和方法数据提供于表4中。
表4.Pn-22F eTEC缀合物的实验参数和表征数据
实施例4.结合到CRM
197
的Pn-10A eTEC缀合物的制备
Pn-10A eTEC糖缀合物的制备
根据实施例2中所述的方法制备包含通过eTEC间隔基缀合到CRM197的肺炎链球菌荚膜多糖血清型10A(Pn-10A)的糖缀合物。
Pn-10A eTEC糖缀合物的表征
代表性的Pn-10A eTEC与CRM197的糖缀合物的表征和方法数据提供于表5中。
表5.Pn-10A糖缀合物的实验参数和表征数据
Pn-10A OPA效价
在标准条件下在小鼠中确定针对结合到CRM197的Pn-10A eTEC缀合物的OPA效价。随剂量而变化的OPA效价示于表6中。缀合物的OPA效价显著高于未缀合的血清型10A多糖的OPA效价。
表6.Pn-10A OPA效价(具有95%CI的GMT)
10A Pn变体 | 0.001μg | 0.01μg | 0.1μg |
Pn-10A eTEC缀合物 | 691(389,1227) | 1208(657,2220) | 3054(1897,4918) |
未缀合的PS | 602(193,1882) |
实施例5.结合到CRM197的Pn-11A eTEC缀合物的制备
Pn-11A eTEC糖缀合物的制备
根据实施例2中所述的方法制备包含通过eTEC间隔基缀合到CRM197的肺炎链球菌荚膜多糖血清型11A(Pn-11A)的糖缀合物。
Pn-11A eTEC糖缀合物的表征
代表性的Pn-11A eTEC与CRM197的糖缀合物的表征和方法数据提供于表7中。
表7.Pn-11A糖缀合物的实验参数和表征数据
Pn-11A OPA效价
在标准条件下在小鼠中确定针对结合到CRM197的Pn-11A eTEC缀合物的OPA效价。随剂量而变化的OPA效价示于表8中。
表8.Pn-11A OPA效价(具有95%CI的GMT)
11A Pn变体 | 0.001μg | 0.01μg | 0.1μg |
Pn-11A eTEC缀合物 | 206(166,256) | 906(624,1316) | 5019(3648,6904) |
实施例6.结合到CRM197的Pn-33F RAC/含水缀合物的制备
Pn-33F RAC/含水糖缀合物的制备
使用含水相中的还原性胺化(RAC/含水)来制备Pn-33F糖缀合物,所述含水相中的还原性胺化已被成功地用于产生肺炎链球菌缀合物疫苗(参见例如WO 2006/110381)。这种方法包括两个步骤。第一个步骤是多糖氧化而从邻二醇生成醛官能团。第二个步骤是使活化的多糖缀合到CRM197的赖氨酸(Lys)残基。
简单地说,将冷冻的多糖解冻并且通过添加不同量的高碘酸钠(NaIO4)在pH 6.0下的磷酸钠缓冲液中实施氧化。实施活化的多糖的浓缩和渗滤并且将纯化的活化多糖储存在4℃。使活化的多糖与CRM197蛋白复合。充分地混合多糖与CRM197,然后将瓶置于干冰/乙醇浴中,随后将多糖/CRM197混合物冻干。使冻干混合物在0.1M磷酸钠缓冲液中复原。通过添加1.5摩尔当量的氰基硼氢化钠并且在23℃下孵育20hr且在37℃下再孵育44hr来起始缀合反应。将反应物用1×体积的0.9%盐水稀释且在23℃下使用2摩尔当量的硼氢化钠加帽3hr。将反应混合物用1×体积的0.9%盐水稀释,然后滤过0.45μm过滤器,随后纯化。使用100K MWCO超滤膜盒来实施缀合物的浓缩和渗滤。
使用上述方法通过改变不同参数(例如pH、反应温度和多糖的浓度)获得几种缀合物。
对于这些缀合物来说,典型的多糖产率为约50%,并且游离糖为15%,缀合物分子量在2000-3500kDa范围内。
然而,天然血清型33F多糖在其5-呋喃半乳糖基残基的C2上带有O-乙酰基,并且发现在整个缀合方法中使用含水相中的还原性胺化去除了约80%的乙酰基官能团。观察到五元环结构(5-呋喃半乳糖苷)上的O-乙酰基可发生迁移并且可以使用含水相中的还原性胺化化学方法容易地去除。
Pn-33F RAC/含水糖缀合物稳定性的评估
将通过上述方法制备的代表性的RAC/含水缀合物的等分试样分配到聚丙烯管中。将这些管储存在25℃或37℃下并且监测稳定性长达3.5个月。在每个稳定性时间点,评估游离糖水平%。将两个温度下的稳定性数据汇总于表9中。如表9中所示,游离糖水平%在25℃和37℃下显著地增加。储存期间游离糖水平%的增加是缀合物中发生多糖降解的潜在指标。
表9:RAC/含水缀合物在25℃和37℃下的稳定性数据
wk=周;M=月。
虽然通过与高碘酸钠反应将血清型33F多糖成功地活化且随后利用含水还原性胺化化学使其缀合到CRM197,但结合加速条件下的游离糖稳定性%结果与在缀合期间不能保留乙酰基官能团(免疫原性的关键多糖表位)表明RAC/含水方法并非用于血清型33F缀合的最佳方法。
实施例7.结合到CRM197的Pn-33F RAC/DMSO缀合物的制备
Pn-33F RAC/DMSO糖缀合物的制备
相对于RAC/含水方法,通过DMSO中的还原性胺化(RAC/DMSO)进行的缀合通常具有显著更低的脱-O-乙酰化几率。鉴于与使用实施例6中所述的RAC/含水方法保留O-乙酰基官能团相关的挑战,对使用RAC/DMSO溶剂的替代方法进行评估,所述替代方法已被成功地用于产生肺炎链球菌缀合物疫苗(参见例如WO 2006/110381)。
使用每克活化的多糖25克蔗糖的比率使活化的多糖与蔗糖(50%w/v于WFI中)复合。将各组分充分混合,然后在干冰/乙醇浴中壳形冷冻。然后将复合混合物的壳形冷冻瓶冻干到干燥。
使冻干的活化多糖在二甲基亚砜(DMSO)中复原。将DMSO添加到冻干的CRM197中用于复原。将复原的活化多糖与复原的CRM197合并于反应容器中。通过将NaCNBH3添加到反应混合物中来起始缀合。将反应在23℃下孵育20hr。通过添加NaBH4实现缀合(加帽)反应的终止并且使反应再继续3hr。将反应混合物用4倍体积的5mM琥珀酸盐-0.9%盐水pH 6.0缓冲液稀释,然后滤过5μm过滤器,随后纯化。使用100K MWCO膜来实施缀合物的浓缩和渗滤。针对40倍渗滤体积的5mM琥珀酸盐-0.9%盐水pH 6.0缓冲液进行渗滤。使渗余物滤过0.45μm和0.22μm的过滤器并进行分析。
使用上述方法通过改变不同参数(例如糖-蛋白输入比、反应浓度、氰基硼氢化钠的摩尔当量和含水量)获得几种缀合物。从通过RAC/DMSO方法制备的缀合物生成的全部数据被证实优于RAC/含水方法并且允许制备具有良好缀合产率、低游离糖%(<5%)和更高的缀合程度(缀合的赖氨酸)的缀合物。另外,可在整个RAC/DMSO缀合方法中保留超过80%的乙酰基官能团。
Pn-33F RAC/DMSO糖缀合物稳定性的评估
将通过上述方法制备的代表性RAC/DMSO缀合物的等分试样分配到聚丙烯管中,将所述聚丙烯管储存在4℃或25℃下并且将游离糖的稳定性监测3个月。如表10中所示,储存在4℃下的样品显示游离糖在3个月内增加了4.8%。然而,储存在25℃下的样品显示游离糖%在3个月内增加了15.4%。RAC缀合物中的游离糖%的增加归因于缀合物的降解,尤其是在25℃下。
表10.RAC/DMSO缀合物在4℃和25℃下的稳定性结果
wk=周;M=月。
还在4℃、25℃和37℃下研究了另一批次的RAC/DMSO缀合物的稳定性。将等分试样分配到聚丙烯管中并且监测游离糖%的潜在趋势。如表11中所示,储存在4℃下的样品显示游离糖%在2个月内增加了4.7%。游离糖在25℃和37℃下的增加显著更高,指示缀合物的潜在降解。
表11.RAC/DMSO缀合物在4℃、25℃和37℃下的稳定性结果
wk=周;M=月。
即使通过RAC/DMSO方法生成的缀合物保留了O-乙酰基,但使用这一途径尤其在25℃下也观察到游离糖%的增加和上述潜在的不稳定性。鉴于RAC/DMSO缀合物的潜在不稳定性的这一观察,不将RAC/DMSO视为最适用于血清型33F缀合并且研发替代化学途径来生成更稳定的缀合物(eTEC缀合物)。
实施例8.其它Pn-33F eTEC缀合物的制备
使用实施例2中所述的方法生成其它Pn-33F eTEC缀合物。这些其它批次的Pn-33F eTEC糖缀合物的反应参数和表征数据示于表12中。
表12.其它Pn33F eTEC缀合物的实验参数和表征数据
LOQ=定量极限。
如上文和表12中所示,使用上述eTEC缀合获得了几种Pn33F缀合物。eTEC化学允许制备具有高产率、低游离糖%和高缀合程度(缀合的赖氨酸)的缀合物。另外,使用eTEC缀合方法可保留超过80%的乙酰基官能团。
实施例9.Pn-33F eTEC糖缀合物稳定性的评估:游离糖%趋势
将缀合物批次33F-2B(参见表2)的等分试样分配到聚丙烯管中并且分别储存在4℃、25℃和37℃,并且监测游离糖%的趋势。数据(游离糖%)示于表13中。如此表中所示,游离糖%没有显著变化。
表13.Pn-33F eTEC糖缀合物在4℃、25℃和37℃下的游离糖%稳定性
wk=周;M=月。
还在37℃下进行了另一缀合物批料(批次33F-3C)长达1个月的加速稳定性测试。如表14中所示,游离糖%在37℃下长达1个月没有显著变化。
表14.Pn-33F eTEC糖缀合物在37℃下的游离糖%稳定性
为了进一步确认eTEC缀合物的稳定性,将储存在4℃下的其它缀合物批次(33F-3C和33F-5E(参见表2和表12))的游离糖%的潜在趋势监测长达约1年。如表15中所示,储存在4℃下的缀合物的游离糖%水平在长达约1年的延长时期内没有显著变化。
表15.Pn-33F eTEC糖缀合物在4℃下的游离糖%稳定性结果
M=月
与RAC/含水缀合物和RAC/DMSO缀合物相比,通过33F eTEC化学生成的血清型33F缀合物被证实显著更稳定,没有明显降解,如通过各温度下的游离糖趋势所监测的(实时和加速的)。
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请均在此援引加入,其程度如同具体且个别地指示将每一个别出版物或专利申请援引加入。
虽然已出于清晰理解的目的通过说明和实施例方式相当详细地描述了本发明,但可在所附权利要求的范围内进行某些变化和修改。
Claims (62)
1.制备包含通过(2-((2-氧代乙基)硫基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔基缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物的方法,其包括以下步骤:
a)使糖与1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI)在有机溶剂中反应以产生活化的糖;
b)使所述活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应,以产生硫醇化糖;
c)使所述硫醇化糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖;
d)使所述活化的硫醇化糖与包含一个或多个α-卤代乙酰胺基的活化的载体蛋白反应,以产生硫醇化糖-载体蛋白缀合物;以及
e)使所述硫醇化糖-载体蛋白缀合物与(i)能够将所述活化的载体蛋白的未缀合的α-卤代乙酰胺基加帽的第一加帽试剂;和/或(ii)能够将未缀合的游离巯基残基加帽的第二加帽试剂反应;
由此产生eTEC连接的糖缀合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述加帽步骤e)包括使所述硫醇化糖-载体蛋白缀合物与(i)作为第一加帽试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或(ii)作为第二加帽试剂的碘乙酰胺反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其还包括通过反应使所述糖与三唑或咪唑复合以提供复合糖的步骤,其中在步骤a)前将所述复合糖壳形冷冻,冻干并且在有机溶剂中复原。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法,其还包括将步骤c)中产生的硫醇化多糖纯化,其中所述纯化步骤包括渗滤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中步骤c)中的所述还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中用活化的溴乙酸衍生物将所述载体蛋白活化。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述溴乙酸衍生物是溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述方法还包括通过渗滤来纯化所述eTEC连接的糖缀合物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中步骤a)中的所述有机溶剂是选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酰胺(HMPA)或其混合物的极性非质子溶剂。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中糖:载体蛋白比率(w/w)是0.2-4。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述糖:载体蛋白比率(w/w)是0.4-1.7。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述糖是源自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的荚膜多糖。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述荚膜多糖选自肺炎球菌(Pn)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型33F荚膜多糖。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型22F荚膜多糖。
16.根据权利要求13所述的方法,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型10A荚膜多糖。
17.根据权利要求13所述的方法,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型11A荚膜多糖。
18.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述糖是源自脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)的荚膜多糖。
19.根据权利要求19所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖选自脑膜炎球菌(Mn)-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述载体蛋白是CRM197。
21.糖缀合物,其是通过根据权利要求1-20中任一项所述的方法产生的。
22.免疫原性组合物,其包含根据权利要求21所述的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
23.糖缀合物,其包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的细菌荚膜多糖,其中所述多糖通过氨基甲酸酯键共价连接到所述eTEC间隔基,并且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价连接到所述eTEC间隔基。
24.根据权利要求23所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖源自肺炎链球菌。
25.根据权利要求24所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖。
26.根据权利要求25所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型33F荚膜多糖。
27.根据权利要求25所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型22F荚膜多糖。
28.根据权利要求25所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型10A荚膜多糖。
29.根据权利要求25所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖是Pn-血清型11A荚膜多糖。
30.根据权利要求23所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖源自脑膜炎奈瑟球菌。
31.根据权利要求30所述的糖缀合物,其中所述荚膜多糖选自Mn-血清型A、C、W135和Y荚膜多糖。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的糖缀合物,其中所述多糖具有10kDa-2,000kDa的分子量。
33.根据权利要求32所述的糖缀合物,其中所述多糖具有50kDa-2,000kDa的分子量。
34.根据权利要求23-33中任一项所述的糖缀合物,其中所述糖缀合物具有50kDa-20,000kDa的分子量。
35.根据权利要求34所述的糖缀合物,其中所述糖缀合物具有500kDa-10,000kDa的分子量。
36.根据权利要求23-35中任一项所述的糖缀合物,其中所述多糖具有75-100%的O-乙酰化程度。
37.根据权利要求23-36中任一项所述的糖缀合物,其中所述载体蛋白是CRM197。
38.根据权利要求37所述的糖缀合物,其中所述CRM197包含2-20个通过eTEC间隔基共价连接到所述多糖的赖氨酸残基。
39.根据权利要求37所述的糖缀合物,其中所述CRM197包含4-16个通过eTEC间隔基共价连接到所述多糖的赖氨酸残基。
40.根据权利要求23-39中任一项所述的糖缀合物,其中糖:载体蛋白比率(w/w)是0.2-4。
41.根据权利要求40所述的糖缀合物,其中所述糖:载体蛋白比率(w/w)是0.4-1.7。
42.根据权利要求37所述的糖缀合物,其中在所述糖的每25个糖重复单元处发生至少一个CRM197与糖之间的键合。
43.根据权利要求37所述的糖缀合物,其中在所述糖的每15个糖重复单元处发生至少一个CRM197与糖之间的键合。
44.根据权利要求37所述的糖缀合物,其中在所述糖的每10个糖重复单元处发生至少一个CRM197与糖之间的键合。
45.根据权利要求37所述的糖缀合物,其中在所述糖的每4个糖重复单元处发生至少一个CRM197与糖之间的键合。
46.根据权利要求23-45中任一项所述的糖缀合物,其包含相对于糖的总量的少于15%的游离糖。
47.根据权利要求23-46中任一项所述的糖缀合物,其具有在≤0.3下≥35%的分子大小分布(Kd)。
48.免疫原性组合物,其包含根据权利要求23-47中任一项所述的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
49.根据权利要求48所述的免疫原性组合物,其还包含其它抗原。
50.根据权利要求49所述的免疫原性组合物,其中所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺炎链球菌的荚膜多糖的糖缀合物。
51.根据权利要求50所述的免疫原性组合物,其中所述其它抗原包括选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖的荚膜多糖的糖缀合物。
52.根据权利要求49所述的免疫原性组合物,其中所述其它抗原包括蛋白抗原或源自脑膜炎奈瑟球菌的荚膜多糖的糖缀合物。
53.根据权利要求52所述的免疫原性组合物,其中所述其它抗原包括选自血清型A、C、W135和Y荚膜多糖的荚膜多糖的糖缀合物。
54.根据权利要求48-53中任一项所述的免疫原性组合物,其还包含佐剂。
55.根据权利要求54所述的免疫原性组合物,其中所述佐剂是铝系佐剂。
56.根据权利要求55所述的免疫原性组合物,其中所述铝系佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
57.预防、治疗或改善个体的细菌感染、疾病或病症的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的根据权利要求48-56中任一项所述的免疫原性组合物。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述感染、疾病或病症与肺炎链球菌细菌相关,并且所述糖缀合物包含选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖的荚膜多糖。
59.根据权利要求57所述的方法,其中所述感染、疾病或病症与脑膜炎奈瑟球菌细菌相关,并且所述糖缀合物包含选自血清型A、C、W135和Y荚膜多糖的荚膜多糖。
60.在个体中诱导保护性免疫应答的方法,其包括向所述个体给药免疫有效量的根据权利要求48-56中任一项所述的免疫原性组合物。
61.根据权利要求60所述的方法,其中所述细菌荚膜多糖是选自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F荚膜多糖的荚膜多糖。
62.根据权利要求60所述的方法,其中所述细菌荚膜多糖是选自血清型A、C、W135和Y荚膜多糖的荚膜多糖。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261684043P | 2012-08-16 | 2012-08-16 | |
US61/684,043 | 2012-08-16 | ||
PCT/IB2013/056597 WO2014027302A1 (en) | 2012-08-16 | 2013-08-12 | Glycoconjugation processes and compositions |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104661684A true CN104661684A (zh) | 2015-05-27 |
CN104661684B CN104661684B (zh) | 2018-03-20 |
Family
ID=49385307
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380049088.XA Active CN104661684B (zh) | 2012-08-16 | 2013-08-12 | 糖缀合方法和组合物 |
Country Status (30)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US9517274B2 (zh) |
EP (2) | EP3421051B1 (zh) |
JP (1) | JP6291495B2 (zh) |
KR (1) | KR101742406B1 (zh) |
CN (1) | CN104661684B (zh) |
AR (1) | AR092368A1 (zh) |
AU (1) | AU2013303826B2 (zh) |
BR (1) | BR112015003227B1 (zh) |
CA (1) | CA2881420C (zh) |
DK (2) | DK3421051T3 (zh) |
ES (2) | ES2800479T3 (zh) |
FR (1) | FR22C1037I2 (zh) |
HK (1) | HK1210021A1 (zh) |
HU (3) | HUE049531T2 (zh) |
IL (1) | IL237066B (zh) |
IN (1) | IN2015DN00694A (zh) |
MX (1) | MX363511B (zh) |
MY (1) | MY167579A (zh) |
NL (1) | NL301188I2 (zh) |
NZ (1) | NZ704490A (zh) |
PE (1) | PE20150464A1 (zh) |
PH (1) | PH12015500243A1 (zh) |
PL (2) | PL2885007T3 (zh) |
PT (2) | PT3421051T (zh) |
RU (2) | RU2724840C2 (zh) |
SA (1) | SA515360035B1 (zh) |
SG (1) | SG11201500566XA (zh) |
SI (2) | SI3421051T1 (zh) |
TW (1) | TWI480049B (zh) |
WO (1) | WO2014027302A1 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107847571A (zh) * | 2015-06-08 | 2018-03-27 | 印度血清研究所私人有限公司 | 用于改善多糖‑蛋白质缀合物及其获得的多价疫苗配制剂的吸附的方法 |
CN108026134A (zh) * | 2015-09-16 | 2018-05-11 | 巴塞尔大学 | 结合抗糖鞘脂糖蛋白表位抗体的碳水化合物配体 |
CN108367063A (zh) * | 2015-07-21 | 2018-08-03 | 辉瑞公司 | 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途 |
CN111615400A (zh) * | 2018-03-23 | 2020-09-01 | 科纳克斯资本 | 作为治疗工具的精确糖缀合物 |
US11220523B2 (en) | 2014-03-13 | 2022-01-11 | Universität Basel | Carbohydrate ligands that bind to IgM antibodies against myelin-associated glycoprotein |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IN2015DN00694A (zh) | 2012-08-16 | 2015-06-26 | Pfizer | |
PT3096786T (pt) * | 2014-01-21 | 2021-08-24 | Pfizer | Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos |
WO2015110941A2 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
CN105934251A (zh) * | 2014-01-21 | 2016-09-07 | 辉瑞大药厂 | 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物 |
US11160855B2 (en) * | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
JP2017505792A (ja) | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
PT3244917T (pt) | 2015-01-15 | 2023-05-31 | Pfizer | Composições imunogénicas para utilização em vacinas pneumocócicas |
EP3292146A1 (en) * | 2015-05-04 | 2018-03-14 | Pfizer Inc | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
EP3377098A1 (en) | 2015-11-20 | 2018-09-26 | Pfizer Inc | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
CN109862908B (zh) | 2016-08-05 | 2023-05-02 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
CN109890415B (zh) | 2016-08-05 | 2023-04-04 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
MX2019002489A (es) | 2016-09-02 | 2019-10-21 | Sanofi Pasteur Inc | Vacuna contra neisseria meningitidis. |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
KR102459629B1 (ko) | 2017-01-20 | 2022-10-28 | 화이자 인코포레이티드 | 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물 |
KR102634811B1 (ko) * | 2017-06-10 | 2024-02-06 | 인벤트프라이즈 인크. | 면역원성과 항원항체 결합성이 개선된 2가 또는 다가 접합체 다당류를 가진 다가 접합체 백신 |
US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
AU2018328036B2 (en) | 2017-09-07 | 2024-03-07 | Merck Sharp & Dohme Llc | Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates |
JP6950099B2 (ja) | 2018-02-05 | 2021-10-13 | サノフィ パスツール インコーポレイティッド | 多価肺炎球菌多糖体−タンパク質複合体組成物 |
SG11202006387QA (en) | 2018-02-05 | 2020-07-29 | Sanofi Pasteur Inc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
EP3782642A4 (en) | 2018-04-18 | 2022-04-13 | SK Bioscience Co., Ltd. | CAPSULE POLYSACCHARIDES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AND CONJUGATES THEREOF |
US11260119B2 (en) * | 2018-08-24 | 2022-03-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
JP7239509B6 (ja) | 2019-02-22 | 2023-03-28 | ファイザー・インク | 細菌多糖類を精製するための方法 |
CA3136278A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
CN111024832B (zh) * | 2019-10-29 | 2022-05-03 | 北京成大天和生物科技有限公司 | 多糖结合疫苗中残余NaCNBH3的离子色谱检测方法 |
IL292494A (en) | 2019-11-01 | 2022-06-01 | Pfizer | Preparations of Escherichia coli and their methods |
CN115362177A (zh) | 2020-02-21 | 2022-11-18 | 辉瑞公司 | 糖类的纯化 |
JP2023514697A (ja) | 2020-02-23 | 2023-04-07 | ファイザー・インク | 大腸菌組成物およびその方法 |
KR20230043157A (ko) | 2020-09-17 | 2023-03-30 | 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 | 다가 백신 조성물 및 이의 용도 |
CA3199094A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Pfizer Inc. | Methods for purifying bacterial polysaccharides |
AU2021368151A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-06-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
US20240000912A1 (en) | 2020-11-04 | 2024-01-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
US20220202923A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Pfizer Inc. | E. coli fimh mutants and uses thereof |
WO2022234416A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
CA3218544A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections |
US20220387613A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-08 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
EP4346893A2 (en) | 2021-05-28 | 2024-04-10 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2024084397A1 (en) | 2022-10-19 | 2024-04-25 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1610560A (zh) * | 2001-01-23 | 2005-04-27 | 安万特巴斯德公司 | 多价脑膜炎球菌多糖-蛋白质缀合疫苗 |
CN101247827A (zh) * | 2005-06-27 | 2008-08-20 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 疫苗生产方法 |
CN101378778A (zh) * | 2005-12-22 | 2009-03-04 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 肺炎球菌多糖缀合物疫苗 |
CN102625713A (zh) * | 2009-06-22 | 2012-08-01 | 惠氏有限责任公司 | 用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法 |
Family Cites Families (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US578573A (en) | 1897-03-09 | Brake-actuating mechanism | ||
US4708871A (en) | 1983-03-08 | 1987-11-24 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Antigenically active amino acid sequences |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
JPH0832638B2 (ja) | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 |
IL101715A (en) | 1991-05-02 | 2005-06-19 | Amgen Inc | Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs |
JPH07507854A (ja) | 1991-12-23 | 1995-08-31 | ツォッヒェ,ミヒャエル | 油除去装置を備えたエンジン |
DE69434079T2 (de) | 1993-03-05 | 2005-02-24 | Wyeth Holdings Corp. | Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin |
US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US6113918A (en) | 1997-05-08 | 2000-09-05 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors |
US6027925A (en) | 1997-06-12 | 2000-02-22 | Shin-Etsu Bio, Inc. | Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacterial host |
DE69937571T2 (de) | 1998-09-30 | 2008-09-04 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Uniformed Services University Of The Health Sciences | Mutiertes cholera holotoxin als hilfsmittel |
US6936258B1 (en) | 1999-03-19 | 2005-08-30 | Nabi Biopharmaceuticals | Staphylococcus antigen and vaccine |
DE19926475A1 (de) * | 1999-06-10 | 2000-12-14 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Träger-Pharmaka-Konjugate |
DE60234695D1 (de) | 2001-06-07 | 2010-01-21 | Univ Colorado | Mutantenformen von cholera holotoxin als adjuvans |
CA2449670A1 (en) | 2001-06-07 | 2002-12-12 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant |
CN1394867A (zh) * | 2001-07-06 | 2003-02-05 | 中国科学院生态环境研究中心 | 可作药物的寡糖和其制备方法及含该寡糖的药物组合物 |
US6995001B2 (en) * | 2002-10-03 | 2006-02-07 | Wyeth Holdings Corporation | Processing for preparing monoprotected diols from symmetric diols |
NZ561879A (en) * | 2003-03-07 | 2009-05-31 | Wyeth Corp | Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections |
WO2004083251A2 (en) | 2003-03-17 | 2004-09-30 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein |
GB0323103D0 (en) | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
US7445916B2 (en) * | 2004-04-14 | 2008-11-04 | Wyeth | Process for preparing rapamycin 42-esters and FK-506 32-esters with dicarboxylic acid, precursors for rapamycin conjugates and antibodies |
US7910753B2 (en) * | 2004-09-10 | 2011-03-22 | Anaspec Incorporated | Cyanine dyes and their applications as luminescence quenching compounds |
IL308456A (en) | 2005-04-08 | 2024-01-01 | Wyeth Llc | A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation |
TWI457133B (zh) * | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
TW200806685A (en) * | 2006-02-21 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Processes for the convergent synthesis of calicheamicin derivatives |
AU2007223963A1 (en) * | 2006-03-07 | 2007-09-13 | Wyeth | Process for preparing water-soluble polyethylene glycol conjugates of macrolide immunosuppressants |
US20070253985A1 (en) | 2006-04-26 | 2007-11-01 | Wyeth | Novel processes for coating container means which inhibit precipitation of polysaccharide-protein conjugate formulations |
DE102006026436A1 (de) * | 2006-06-07 | 2007-12-13 | Continental Aktiengesellschaft | Verfahren und Messfahrzeug zur Ermittlung objektiver Reifeneigenschaften auf einer Fahrbahnoberfläche |
US20100189740A1 (en) * | 2007-06-20 | 2010-07-29 | Francis Michon | Modified polysaccharides for conjugate vaccines |
RU2378015C2 (ru) * | 2008-04-02 | 2010-01-10 | Равшан Иноятович Атауллаханов | Конъюгат для иммунизации и вакцинации и способ повышения иммуногенности |
WO2011000958A1 (en) * | 2009-07-03 | 2011-01-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Compounds targeting the cation-independent mannose 6-phosphate receptor |
WO2011066291A2 (en) * | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Lyophilization methods, compositions, and kits |
BR112013012626A2 (pt) * | 2010-12-10 | 2016-07-19 | Merck Sharp & Dohme | formulação, composição imunogênica, e, seringa pré-carregada |
CA2848142C (en) * | 2011-09-07 | 2021-05-18 | Prolynx Llc | Hydrogels with biodegradable crosslinking |
IN2015DN00694A (zh) | 2012-08-16 | 2015-06-26 | Pfizer | |
WO2015110941A2 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
JP2017505792A (ja) | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
-
2013
- 2013-08-12 IN IN694DEN2015 patent/IN2015DN00694A/en unknown
- 2013-08-12 PE PE2015000211A patent/PE20150464A1/es active IP Right Grant
- 2013-08-12 MY MYPI2015700444A patent/MY167579A/en unknown
- 2013-08-12 PT PT181836610T patent/PT3421051T/pt unknown
- 2013-08-12 EP EP18183661.0A patent/EP3421051B1/en active Active
- 2013-08-12 CN CN201380049088.XA patent/CN104661684B/zh active Active
- 2013-08-12 BR BR112015003227-3A patent/BR112015003227B1/pt active IP Right Grant
- 2013-08-12 AU AU2013303826A patent/AU2013303826B2/en active Active
- 2013-08-12 PL PL13779365T patent/PL2885007T3/pl unknown
- 2013-08-12 WO PCT/IB2013/056597 patent/WO2014027302A1/en active Application Filing
- 2013-08-12 MX MX2015001992A patent/MX363511B/es unknown
- 2013-08-12 US US14/420,822 patent/US9517274B2/en active Active
- 2013-08-12 SG SG11201500566XA patent/SG11201500566XA/en unknown
- 2013-08-12 JP JP2015527054A patent/JP6291495B2/ja active Active
- 2013-08-12 SI SI201331739T patent/SI3421051T1/sl unknown
- 2013-08-12 HU HUE18183661A patent/HUE049531T2/hu unknown
- 2013-08-12 ES ES18183661T patent/ES2800479T3/es active Active
- 2013-08-12 RU RU2016136630A patent/RU2724840C2/ru active
- 2013-08-12 KR KR1020157006296A patent/KR101742406B1/ko active IP Right Grant
- 2013-08-12 SI SI201331242T patent/SI2885007T1/sl unknown
- 2013-08-12 PL PL18183661T patent/PL3421051T3/pl unknown
- 2013-08-12 DK DK18183661.0T patent/DK3421051T3/da active
- 2013-08-12 ES ES13779365T patent/ES2700824T3/es active Active
- 2013-08-12 PT PT13779365T patent/PT2885007T/pt unknown
- 2013-08-12 HU HUE13779365A patent/HUE041381T2/hu unknown
- 2013-08-12 DK DK13779365.9T patent/DK2885007T3/en active
- 2013-08-12 NZ NZ704490A patent/NZ704490A/en unknown
- 2013-08-12 RU RU2015103017A patent/RU2645071C2/ru active
- 2013-08-12 EP EP13779365.9A patent/EP2885007B1/en active Active
- 2013-08-12 CA CA2881420A patent/CA2881420C/en active Active
- 2013-08-15 TW TW102129348A patent/TWI480049B/zh active
- 2013-08-15 AR ARP130102904A patent/AR092368A1/es unknown
-
2015
- 2015-02-02 IL IL237066A patent/IL237066B/en active IP Right Grant
- 2015-02-04 PH PH12015500243A patent/PH12015500243A1/en unknown
- 2015-02-15 SA SA515360035A patent/SA515360035B1/ar unknown
- 2015-10-30 HK HK15110760.0A patent/HK1210021A1/zh unknown
-
2016
- 2016-11-09 US US15/347,034 patent/US9950054B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-05 US US15/946,664 patent/US10583187B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-28 US US16/774,309 patent/US11110160B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-05 US US17/395,108 patent/US11723965B2/en active Active
-
2022
- 2022-07-25 NL NL301188C patent/NL301188I2/nl unknown
- 2022-07-28 HU HUS2200034C patent/HUS2200034I1/hu unknown
- 2022-07-28 FR FR22C1037C patent/FR22C1037I2/fr active Active
-
2023
- 2023-06-21 US US18/338,961 patent/US20230355735A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1610560A (zh) * | 2001-01-23 | 2005-04-27 | 安万特巴斯德公司 | 多价脑膜炎球菌多糖-蛋白质缀合疫苗 |
CN101247827A (zh) * | 2005-06-27 | 2008-08-20 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 疫苗生产方法 |
CN101378778A (zh) * | 2005-12-22 | 2009-03-04 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 肺炎球菌多糖缀合物疫苗 |
CN102625713A (zh) * | 2009-06-22 | 2012-08-01 | 惠氏有限责任公司 | 用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11220523B2 (en) | 2014-03-13 | 2022-01-11 | Universität Basel | Carbohydrate ligands that bind to IgM antibodies against myelin-associated glycoprotein |
CN107847571A (zh) * | 2015-06-08 | 2018-03-27 | 印度血清研究所私人有限公司 | 用于改善多糖‑蛋白质缀合物及其获得的多价疫苗配制剂的吸附的方法 |
CN108367063A (zh) * | 2015-07-21 | 2018-08-03 | 辉瑞公司 | 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途 |
US11020469B2 (en) | 2015-07-21 | 2021-06-01 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
CN108026134A (zh) * | 2015-09-16 | 2018-05-11 | 巴塞尔大学 | 结合抗糖鞘脂糖蛋白表位抗体的碳水化合物配体 |
US11091591B2 (en) | 2015-09-16 | 2021-08-17 | Universität Basel | Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids |
CN111615400A (zh) * | 2018-03-23 | 2020-09-01 | 科纳克斯资本 | 作为治疗工具的精确糖缀合物 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11723965B2 (en) | Glycoconjugation processes and compositions | |
US11707529B2 (en) | Immunogenic glycoprotein conjugates | |
JP6153581B2 (ja) | 組成物および黄色ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)血清型5および8莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1210021 Country of ref document: HK |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1210021 Country of ref document: HK |