KR20150041139A - 당접합 공정 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체, 이러한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이러한 당접합체 및 면역원성 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

당접합 공정 및 조성물 {GLYCOCONJUGATION PROCESSES AND COMPOSITIONS}
본 발명은 일반적으로, (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하는 당접합체, 이러한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 상기 당접합체 및 면역원성 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
불량하게 면역원성인 분자를 "운반" 분자와 접합시킴으로써 이들 분자의 면역원성을 증가시키는 접근 방식은 수십 년간 성공적으로 활용되어 왔었다 (예를 들어, 문헌 [Goebel et al. (1939) J. Exp . Med . 69: 53] 참조). 예를 들어, 정제된 피막 중합체를 운반 단백질과 접합시킴으로써, 이러한 "운반체 효과"를 활용하여 보다 유효한 면역원성 조성물을 생성시켜 왔던 많은 면역원성 조성물이 보고되었다 (Schneerson et al. (1984) Infect. Immun . 45: 582-591). 접합은 또한, 유리 폴리사카라이드로 면역시킨 경우에 유아에게서 통상적으로 관찰되는 불량한 항체 반응을 우회하는 것으로 밝혀졌다 (Anderson et al. (1985) J. Pediatr . 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).
접합체는 다양한 가교 결합제 또는 커플링 시약, 예컨대 동종이관능성, 이종이관능성, 또는 제로-길이 가교결합제를 이용하여 성공적으로 생성시켜 왔었다. 면역원성 분자, 예컨대 사카라이드, 단백질 및 펩티드를 펩티드 또는 단백질 운반체와 커플링시키기 위한 많은 방법이 현재 이용 가능하다. 대부분의 방법은 아민, 아미드, 우레탄, 이소티오우레아, 또는 디술피드 결합을 생성하거나, 또는 일부 경우에는 티오에테르를 생성한다. 반응성 부위를 운반체 및/또는 면역원성 분자 상의 반응성 아미노산 분자의 측쇄 내로 도입시켜 주는 가교 결합제 또는 커플링 시약을 사용하는 것의 단점은 이러한 반응성 부위가 중화되지 않을 경우에는, 이것이 불필요한 어떠한 분자와도 시험관 내에서 자유롭게 반응하거나 (이로써, 접합체의 기능성 또는 안정성에 잠재적으로 불리한 영향을 미침) 또는 생체 내에서 자유롭게 반응한다는 것이다 (이로써, 상기 제제로 면역시킨 사람이나 동물에게서 잠재적인 부작용 위험이 초래됨). 이러한 과도한 반응성 부위는 다양한 공지된 화학적 반응을 활용하여 이들 부위가 불활성화되도록 반응시키거나 또는 "캡핑"할 수 있지만, 이들 반응은 접합체의 기능성에 달리 지장을 줄 수도 있다. 이는 반응성 부위를 운반체 분자 내로 도입함으로써 접합체를 생성하고자 한 경우에 특히 문제를 일으킬 수 있으며, 이는 (면역원성 분자와 비교하여) 크기가 더 크고 구조가 더 복잡하여, 화학적 처리의 지장을 주는 효과에 더 취약해질 수 있기 때문이다. 따라서, 운반체의 기능성이 보존되고 접합체가 목적하는 면역 반응을 유발시킬 수 있는 능력을 보유하도록, 적당하게 캡핑된 운반 단백질 접합체를 제조하는 새로운 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 본원에서 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서로서 지칭되는 2가 이종이관능성 링커를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하는 당접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 eTEC 스페이서는 7개의 선형 원자를 포함하고 (즉, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-), 상기 사카라이드와 운반 단백질 사이에 안정한 티오에테르 및 아미드 결합을 제공한다. 본 발명은 추가로, eTEC 연결된 당접합체, 이를 포함하는 면역원성 조성물, 및 상기 당접합체 및 면역원성 조성물의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 사카라이드를 포함하는 당접합체를 제공하며, 이러한 사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 연결되고, 운반 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, 사카라이드는 폴리사카라이드, 예컨대 박테리아, 특히 병원성 박테리아로부터 유래된 피막 폴리사카라이드이다. 다른 실시양태에서, 사카라이드는 올리고사카라이드 또는 모노사카라이드이다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 다음 화학식 I로 나타내어질 수 있다:
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서, eTEC 스페이서를 포함하는 원자는 중앙 박스 내에 함유된다.
본 발명의 당접합체 내로 혼입된 운반 단백질은 본원에 추가로 기재되거나 또는 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 상기 목적에 일반적으로 적합한 운반 단백질의 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 사카라이드를 유기 용매 중에서 탄산 유도체와 반응시켜 활성화 사카라이드를 생성하는 단계; b) 상기 활성화 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시켜 티올화 사카라이드를 생성하는 단계; c) 상기 티올화 사카라이드를 환원제와 반응시켜 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화 사카라이드를 생성하는 단계; d) 상기 활성화된 티올화 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질과 반응시켜 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 상기 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 (i) 상기 활성화 운반 단백질의 접합되지 않은 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약; 및/또는 (ii) 상기 활성화된 티올화 사카라이드의 접합되지 않은 유리 술프히드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시킴으로써, eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 단계를 포함하는, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 사카라이드를 포함하는 당접합체의 제조 방법을 제공한다.
빈번한 실시양태에서, 탄산 유도체는 1,1'-카르보닐-디-(1,2,4-트리아졸) (CDT) 또는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI)이다. 바람직하게, 탄산 유도체는 CDT이고, 유기 용매는 극성 비양성자성 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO)이다. 바람직한 실시양태에서, 티올화 사카라이드는 활성화 사카라이드를 이관능성 대칭적 티오알킬아민 시약, 시스타민 또는 그의 염과 반응시킴으로써 생성된다. 대안적으로, 티올화 사카라이드는 활성화 사카라이드를 시스테아민 또는 그의 염과 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 eTEC 연결된 당접합체는 화학식 I로 나타내어질 수 있다.
빈번한 실시양태에서, 제1 캡핑 시약은 N-아세틸-L-시스테인이며, 이는 운반 단백질의 리신 잔기 상의 접합되지 않은 α-할로아세트아미드 기와 반응하여, 티오에테르 연결을 통해 상기 활성화된 리신 잔기와 공유 연결된 S-카르복시메틸시스테인 (CMC) 잔기를 형성한다. 다른 실시양태에서, 제2 캡핑 시약은 요오도아세트아미드 (IAA)이며, 이는 활성화된 티올화 사카라이드의 접합되지 않은 유리 술프히드릴 기와 반응하여 캡핑된 티오아세트아미드를 제공한다. 빈번하게, 단계 e)는 제1 캡핑 시약과 제2 캡핑 시약 둘 다로 캡핑하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단계 e)는 제1 캡핑 시약으로서의 N-아세틸-L-시스테인과 제2 캡핑 시약으로서의 IAA로 캡핑하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 캡핑 단계 e)는 제1 및/또는 제2 캡핑 시약과 반응시킨 후, 환원제, 예를 들어 DTT, TCEP, 또는 메르캅토에탄올과 반응시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 d)는 활성화된 티올화 사카라이드를 활성화 운반 단백질과 반응시키는 것에 앞서, 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 활성화 운반 단백질은 하나 이상의 α-브로모아세트아미드 기를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 따라서 생성된 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다.
본 발명의 측면들 각각의 경우, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정한 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 박테리아 피막 폴리사카라이드, 특히 병원성 박테리아로부터 유래된 피막 폴리사카라이드인 사카라이드를 포함한다.
이러한 일부 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된 폐렴구균성 (Pn) 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 구체적 실시양태에서, Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 다른 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis)로부터 유래된 수막구균성 (Mn) 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 구체적 실시양태에서, Mn 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특별히 바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 공유 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 다양한 적용에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 당접합체는 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 면역원성 조성물은, 예를 들어 병원성 박테리아, 예컨대 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 또는 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)에 의한 박테리아 감염으로부터 수용자를 보호하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서 본 발명은 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 당접합체는 본원에 기재된 바와 같이, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함한다.
빈번한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하며, 상기 당접합체는 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
이러한 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에로부터 유래된 Pn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, Mn 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 공유 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 아주반트를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 아주반트는 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 알루미늄계 아주반트이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 아주반트 인산알루미늄을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 박테리아 항원, 예컨대 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 것인, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 감염, 질환 또는 상태는 에스. 뉴모니아에 박테리아와 연관되고, 당접합체는 Pn 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 감염, 질환 또는 상태는 엔. 메닌기티디스 박테리아와 연관되고, 당접합체는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 각 경우에 있어서, eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하여, 병원성 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법; 병원성 박테리아에 의해 야기된 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법; 및 병원성 박테리아에 의해 야기된 감염, 질환 또는 상태의 한 가지 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 당접합체는 박테리아 항원, 예컨대 병원성 박테리아로부터 유래된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 당접합체는 박테리아 항원, 예컨대 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 대상체에서 보호 면역 반응을 생성하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하여, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 이러한 대상체에서 보호 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체, 또는 이러한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 반응하여 생성된 항체를 제공한다. 이러한 항체는 조사 및 임상 실험실 검정, 예컨대 박테리아 검출 및 혈청형별 검사에 사용될 수 있거나, 또는 대상체에게 수동 면역을 부여하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 박테리아 감염, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스에 의한 감염의 예방, 치료 또는 완화에 사용하기 위한, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 박테리아 감염, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스에 의한 감염을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
상기 언급된 치료적 및/또는 예방적 방법 및 용도의 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 연결된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 용도의 빈번한 실시양태에서, 박테리아 피막 폴리사카라이드는 Pn 피막 폴리사카라이드 또는 Mn 피막 폴리사카라이드이다. 이러한 일부 실시양태에서, Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 다른 실시양태에서, Mn 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 공유 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다.
도 1은 CRM197과 공유 접합된 폴리사카라이드를 포함하는 당접합체에 대한, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체의 제조를 위한 일반적 도식을 도시한 것이다..
도 2는 에스. 뉴모니아에 혈청형 33F (Pn-33F) 피막 폴리사카라이드의 반복되는 폴리사카라이드 구조를 도시한 것이다.
도 3은 에스. 뉴모니아에 혈청형 22F (Pn-22F) 피막 폴리사카라이드의 반복되는 폴리사카라이드 구조를 도시한 것이다.
도 4는 에스. 뉴모니아에 혈청형 10A (Pn-10A) 피막 폴리사카라이드의 반복되는 폴리사카라이드 구조를 도시한 것이다.
도 5는 에스. 뉴모니아에 혈청형 11A (Pn-11A) 피막 폴리사카라이드의 반복되는 폴리사카라이드 구조를 도시한 것이다.
도 6은 eTEC 링커 (A)와 잠재적 캡핑된 및 캡핑되지 않은 유리 술프히드릴 부위 (B)를 혼입한 Pn-33F 당접합체의 대표적 구조를 도시한 것이다.
도 7은 CRM197과의 Pn-33F 당접합체의 제조시 사용된 활성화 공정 (A) 및 접합 공정 (B)에 대한 대표적인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
도 8은 활성화 단계에서 사용된 CDT의 몰 당량의 함수로서의 Pn-33F 피막 폴리사카라이드의 티올화 수준을 도시한 것이다.
본 발명은 본원에 포함된 본 발명의 바람직한 실시양태의 다음 상세한 설명 및 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 어떠한 방법 및 물질도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 특정의 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다. 실시양태를 기재하고 본 발명을 청구하는 데 있어서, 특정의 전문 용어가 다음에 제시된 정의에 따라서 사용될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 달리 명시되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함하고, "eTEC 스페이서"에 대한 언급은 하나 이상의 eTEC 스페이서를 지칭하며, 이는 본 개시내용의 판독시 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 특정 값, 예컨대 언급된 농도 범위, 기간, 분자량, 온도 또는 pH의 통계학상 의미 있는 범위 이내를 의미한다. 이러한 범위는 명시된 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 보다 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. 종종, 이러한 범위는 소정의 값 또는 범위의 측정 및/또는 결정을 위해 사용된 표준 방법 특유의 실험적 오차 이내일 수 있다. 용어 "약"에 의해 포괄된 허용 가능한 변동은 연구 중인 특정한 시스템에 좌우될 것이고, 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지될 수 있다. 특정 범위가 본 출원 내에서 인용될 때마다, 이러한 범위 이내의 모든 전체 수 정수가 또한 본 발명의 실시양태로서 고려된다.
본 개시내용에서, "포함하는", "포함된", "포함", "함유하는", "함유" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에 대해 부여된 의미를 가질 수 있다는 것에 유의해야 하며, 예를 들어 이들은 "포함하는", "포함된", "포함" 등을 의미할 수 있다. 이러한 용어는 다른 어떠한 성분도 배제하지 않으면서 특정한 성분 또는 성분 세트를 포함하는 것을 지칭한다. "~로 본질적으로 이루어진" 및 "~로 본질적으로 이루어지는"과 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에 대해 부여된 의미를 갖고 있고, 예를 들어 이들 용어는 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 떨어뜨리지 않는 부가의 성분 또는 단계의 포함을 허용하며, 즉 상기 용어는 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 떨어뜨리는 부가의 언급되지 않은 성분 또는 단계를 배제한다. 용어 "이루어지는" 및 "이루어진"은 미국 특허법에서 이들에 대해 부여된 의미를 갖고 있으며, 즉 이들 용어는 폐쇄형이다. 따라서, 이들 용어는 특정한 성분 또는 성분 세트를 포함하고 다른 모든 성분은 배제하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사카라이드"는 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 또는 모노사카라이드를 지칭할 수 있다. 흔히, 사카라이드에 대한 언급은 박테리아 피막 폴리사카라이드, 특히 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스와 같은 병원성 박테리아로부터 유래된 피막 폴리사카라이드를 지칭한다.
용어 "접합체" 또는 "당접합체"는 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 당접합체는 종종, 하나 이상의 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하는 "eTEC 연결된" 당접합체로서 본원에 지칭된다. 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 이를 포함하는 면역원성 조성물은 일정량의 유리 사카라이드를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유리 사카라이드"는 운반 단백질에 공유 접합되지 않은 사카라이드, 또는 높은 사카라이드/단백질 비 (>5:1)로 부착된 극소수의 운반 단백질에 공유 부착되긴 하지만, 그럼에도 불구하고 당접합체 조성물에 존재하는 사카라이드를 의미한다. 유리 사카라이드는 접합된 사카라이드-운반 단백질 당접합체와 비-공유 연합될 수 있다 (즉, 상기 당접합체와 비공유 결합되거나, 이에 흡착되거나, 또는 이러한 당접합체 내에 또는 함께 봉입됨). 용어 "유리 폴리사카라이드" 및 "유리 피막 폴리사카라이드"는 사카라이드가 각각 폴리사카라이드 또는 피막 폴리사카라이드인 당접합체와 관련하여 동일한 의미를 전달하기 위해 본원에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "접합시키는", "접합된" 및 "접합하는"은 사카라이드, 예를 들어 박테리아 피막 폴리사카라이드를 운반체 분자 또는 운반 단백질에 공유 부착시켜 주는 공정을 지칭한다. 본 발명의 방법에서, 사카라이드는 하나 이상의 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된다. 접합은 다음에 기재된 방법에 따라서 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 공정에 의해 수행될 수 있다. 운반 단백질과의 접합은 박테리아 피막 폴리사카라이드의 면역원성을 증강시켜 준다.
당접합체
본 발명은 하나 이상의 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하는 당접합체에 관한 것이며, 이러한 사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 접합되고, 운반 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 접합된다.
하나 이상의 eTEC 스페이서의 존재 이외에도, 본 발명의 당접합체의 신규 특성은 사카라이드 및 이로써 생성된 eTEC 연결된 당접합체의 분자량 프로파일, 운반 단백질당 접합된 리신의 비 및 eTEC 스페이서(들)를 통해 폴리사카라이드와 공유 연결된 리신의 수, 사카라이드의 반복 단위의 함수로서 운반 단백질과 사카라이드 사이의 공유 연결의 수, 및 사카라이드의 총량과 비교한 유리 사카라이드의 상대적 양을 포함한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 다음 화학식 I로 나타내어질 수 있다:
<화학식 I>
Figure pct00002
eTEC 스페이서는 7개의 선형 원자를 포함하고 (즉, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-), 상기 사카라이드와 운반 단백질 사이에 안정한 티오에테르 및 아미드 결합을 제공한다. eTEC 연결된 당접합체의 합성은 사카라이드의 활성화 히드록실 기를 티오알킬아민 시약, 예를 들어 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염의 아미노 기와 반응시켜, 사카라이드에 대한 카르바메이트 연결을 형성하여 티올화 사카라이드를 제공하는 것을 포함한다. 하나 이상의 유리 술프히드릴 기를 생성하는 것은 환원제와 반응시켜 활성화된 티올화 사카라이드를 제공함으로써 달성된다. 상기 활성화된 티올화 사카라이드의 유리 술프히드릴 기를, 아민 함유 잔기 상에 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 갖는 활성화된 운반 단백질과 반응시키면, 접합체를 형성하기 위한 티오에테르 결합이 생성되며, 상기 운반 단백질은 아미드 결합을 통해 eTEC 스페이서에 부착된다.
본 발명의 당접합체에서, 사카라이드는 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 또는 모노사카라이드일 수 있고, 운반 단백질은 본원에 추가로 기재되거나 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 적합한 어떠한 운반체로부터도 선택될 수 있다. 빈번한 실시양태에서, 사카라이드는 박테리아 피막 폴리사카라이드이다. 이러한 일부 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이다.
이러한 일부 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 에스. 뉴모니아에로부터 유래된 Pn 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 구체적 실시양태에서, Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 10A, 11A, 22F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Pn-33F 피막 폴리사카라이드이다. 또 다른 상기 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Pn-22F 피막 폴리사카라이드이다. 또 다른 상기 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Pn-10A 피막 폴리사카라이드이다. 또한 또 다른 상기 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Pn-11A 피막 폴리사카라이드이다.
다른 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 구체적 실시양태에서, Mn 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Mn-A 피막 폴리사카라이드이다. 또 다른 상기 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Mn-C 피막 폴리사카라이드이다. 또 다른 상기 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Mn-W135 피막 폴리사카라이드이다. 또한 또 다른 상기 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Mn-Y 피막 폴리사카라이드이다.
특히 바람직한 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 Pn 또는 Mn 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F 피막 폴리사카라이드, 또는 Mn-혈청형 A, C, W135 또는 Y 피막 폴리사카라이드 (이는 eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 공유 접합됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하며, 이러한 사카라이드는 10 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는다. 이러한 다른 실시양태에서, 사카라이드는 50 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는다. 추가의 상기 실시양태에서, 사카라이드는 50 kDa 내지 1,750 kDa; 50 kDa 내지 1,500 kDa; 50 kDa 내지 1,250 kDa; 50 kDa 내지 1,000 kDa; 50 kDa 내지 750 kDa; 50 kDa 내지 500 kDa; 100 kDa 내지 2,000 kDa; 100 kDa 내지 1,750 kDa; 100 kDa 내지 1,500 kDa; 100 kDa 내지 1,250 kDa; 100 kDa 내지 1,000 kDa; 100 kDa 내지 750 kDa; 100 kDa 내지 500 kDa; 200 kDa 내지 2,000 kDa; 200 kDa 내지 1,750 kDa; 200 kDa 내지 1,500 kDa; 200 kDa 내지 1,250 kDa; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 200 kDa 내지 750 kDa; 또는 200 kDa 내지 500 kDa의 분자량을 갖는다. 이러한 일부 실시양태에서, 사카라이드는 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F 피막 폴리사카라이드, 또는 Mn-혈청형 A, C, W135 또는 Y 피막 폴리사카라이드이며, 이러한 피막 폴리사카라이드는 기재된 바와 같은 분자량 범위 중 어느 것 이내에 속하는 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 50 kDa 내지 20,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 500 kDa 내지 10,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 200 kDa 내지 10,000 kDa의 분자량을 갖는다. 또한 다른 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 1,000 kDa 내지 3,000 kDa의 분자량을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 200 kDa 내지 20,000 kDa; 200 kDa 내지 15,000 kDa; 200 kDa 내지 10,000 kDa; 200 kDa 내지 7,500 kDa; 200 kDa 내지 5,000 kDa; 200 kDa 내지 3,000 kDa; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 500 kDa 내지 20,000 kDa; 500 kDa 내지 15,000 kDa; 500 kDa 내지 12,500 kDa; 500 kDa 내지 10,000 kDa; 500 kDa 내지 7,500 kDa; 500 kDa 내지 6,000 kDa; 500 kDa 내지 5,000 kDa; 500 kDa 내지 4,000 kDa; 500 kDa 내지 3,000 kDa; 500 kDa 내지 2,000 kDa; 500 kDa 내지 1,500 kDa; 500 kDa 내지 1,000 kDa; 750 kDa 내지 20,000 kDa; 750 kDa 내지 15,000 kDa; 750 kDa 내지 12,500 kDa; 750 kDa 내지 10,000 kDa; 750 kDa 내지 7,500 kDa; 750 kDa 내지 6,000 kDa; 750 kDa 내지 5,000 kDa; 750 kDa 내지 4,000 kDa; 750 kDa 내지 3,000 kDa; 750 kDa 내지 2,000 kDa; 750 kDa 내지 1,500 kDa; 1,000 kDa 내지 15,000 kDa; 1,000 kDa 내지 12,500 kDa; 1,000 kDa 내지 10,000 kDa; 1,000 kDa 내지 7,500 kDa; 1,000 kDa 내지 6,000 kDa; 1,000 kDa 내지 5,000 kDa; 1,000 kDa 내지 4,000 kDa; 1,000 kDa 내지 2,500 kDa; 2,000 kDa 내지 15,000 kDa; 2,000 kDa 내지 12,500 kDa; 2,000 kDa 내지 10,000 kDa; 2,000 kDa 내지 7,500 kDa; 2,000 kDa 내지 6,000 kDa; 2,000 kDa 내지 5,000 kDa; 2,000 kDa 내지 4,000 kDa; 또는 2,000 kDa 내지 3,000 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 명확히 규명하기 위한 또 다른 방식은 eTEC 스페이서를 통해 사카라이드와 접합되는 운반 단백질 중의 리신 잔기의 수에 의한 것이며, 이는 접합된 리신의 범위로서 명확히 규명될 수 있다.
빈번한 실시양태에서, 운반 단백질은 운반 단백질 상의 리신 잔기의 하나 이상의 ε-아미노 기와의 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 접합된다. 이러한 일부 실시양태에서, 운반 단백질은 사카라이드와 공유 접합된 2 내지 20개 리신 잔기를 포함한다. 이러한 다른 실시양태에서, 운반 단백질은 사카라이드와 공유 접합된 4 내지 16개 리신 잔기를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 운반 단백질은 39개 리신 잔기를 함유하는 CRM197을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, CRM197은 사카라이드와 공유 연결된 39개 중에서 4 내지 16개 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 약 10% 내지 약 41%의 CRM197 리신이 사카라이드와 공유 연결된다는 것이다. 또 다른 상기 실시양태에서, CRM197은 사카라이드와 공유 연결된 39개 중에서 2 내지 20개 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 약 5% 내지 약 50%의 CRM197 리신이 사카라이드와 공유 연결된다는 것이다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 또한, 사카라이드 대 운반 단백질의 비 (중량/중량)로써 명확히 규명할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)는 0.2 내지 4이다. 다른 실시양태에서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)는 1.0 내지 2.5이다. 추가 실시양태에서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)는 0.4 내지 1.7이다. 이러한 일부 실시양태에서, 사카라이드는 박테리아 피막 폴리사카라이드이고/이거나 운반 단백질은 CRM197이다.
당접합체는 사카라이드의 반복 단위의 함수로서 운반 단백질과 사카라이드 사이의 공유 연결의 수로써 명확히 규명될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체는 폴리사카라이드의 4개 사카라이드 반복 단위마다 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이에 적어도 하나의 공유 연결을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결은 폴리사카라이드의 10개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다. 또 다른 실시양태에서, 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결은 폴리사카라이드의 15개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다. 추가 실시양태에서, 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결은 폴리사카라이드의 25개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다.
빈번한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이고, CRM197과 폴리사카라이드 사이의 eTEC 스페이서를 통한 공유 연결은 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다.
접합시 중요하게 고려해야 할 것은 개별 성분의 잠재적으로 민감한 비-사카라이드 치환체 관능기, 예컨대 사카라이드 에피토프의 일부를 형성할 수도 있는 O-아실, 포스페이트 또는 글리세롤 포스페이트 측쇄의 잔류를 허용하는 조건의 개발이다.
한 실시양태에서, 당접합체는 10 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖는 사카라이드를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 사카라이드는 50 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖는다. 이러한 다른 실시양태에서, 사카라이드는 75 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖는다. 추가 실시양태에서, 사카라이드는 70% 이상 (≥70%)의 O-아세틸화도를 갖는다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 운반 단백질과 공유 접합되지 않지만, 그럼에도 불구하고 당접합체 조성물에 존재하는 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 유리 사카라이드는 당접합체와 비-공유 연합될 수 있다 (즉, 당접합체와 비공유 결합되거나, 이에 흡착되거나 또는 이러한 당접합체 내에 또는 함께 봉입됨).
일부 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 사카라이드의 총량을 기준으로 하여 약 45% 미만의 유리 사카라이드, 약 40% 미만의 유리 사카라이드, 약 35% 미만의 유리 사카라이드, 약 30% 미만의 유리 사카라이드, 약 25% 미만의 유리 사카라이드, 약 20% 미만의 유리 사카라이드, 약 15% 미만의 유리 사카라이드, 약 10% 미만의 유리 사카라이드, 또는 약 5% 미만의 유리 사카라이드를 포함한다. 바람직하게, 당접합체는 15% 미만의 유리 사카라이드, 보다 바람직하게 10% 미만의 유리 사카라이드, 보다 더 바람직하게 5% 미만의 유리 사카라이드를 포함한다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 다음 특성 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 갖는, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 피막 폴리사카라이드, 바람직하게 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다: 폴리사카라이드가 50 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖고; 당접합체가 500 kDa 내지 10,000 KDa의 분자량을 가지며; 운반 단백질이 사카라이드와 공유 연결된 2 내지 20개 리신 잔기를 포함하고; 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)가 0.2 내지 4이고; 당접합체가 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개 사카라이드 반복 단위마다 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이에 적어도 하나의 공유 연결을 포함하며; 사카라이드가 75 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖고; 접합체가 폴리사카라이드 총량을 기준으로 하여 약 15% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함하며; 운반 단백질이 CRM197이고; 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F 피막 폴리사카라이드로부터 선택되거나 또는 피막 폴리사카라이드가 Mn-혈청형 A, C, W135 또는 Y 피막 폴리사카라이드로부터 선택된다.
eTEC 연결된 당접합체는 그들의 분자 크기 분포도 (Kd)로써 명확히 규명될 수있다. 접합체의 분자 크기는 고압 액체 크로마토그래피 시스템 (HPLC)를 이용하여 세파로스(Sepharose) CL-4B 정지 상 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 매질에 의해 결정된다. Kd 결정을 위해, 크로마토그래피 칼럼을 먼저 보정하여 V0 (이는 허공 용적 또는 총 배제 용적을 나타냄), 및 Vi (샘플 중의 가장 작은 분자가 용출되는 용적; 입자간 용적으로서 공지되기도 함)를 결정한다. 모든 SEC 분리는 V0와 Vi 사이에서 일어난다. 수집된 각 분획에 대한 Kd 값은 다음 표현에 의해 결정된다: Kd = (Ve-Vi)/(Vi-V0) (여기서, Ve는 화합물의 잔류 용적을 나타냄). ≤ 0.3 용출되는 % 분획 (주요 피크)이 접합체 Kd (분자 크기 분포도)를 규정한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 ≥35%의 분자 크기 분포도 (Kd)를 갖는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 ≥15%, ≥20%, ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, 또는 ≥90%의 분자 크기 분포도 (Kd)를 갖는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 유리 술프히드릴 잔기를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 의해 형성된 활성화된 티올화 사카라이드는 다수의 유리 술프히드릴 잔기를 함유할 것이며, 이중 일부는 접합 단계 동안 운반 단백질과의 공유 접합을 진행하지 않을 수 있다. 이러한 잔류 유리 술프히드릴 잔기는 잠재적으로 반응성인 관능기를 캡핑하기 위하여, 티올-반응성 캡핑 시약, 예를 들어 요오도아세트아미드 (IAA)와 반응시킴으로써 캡핑시킨다. 다른 티올-반응성 캡핑 시약, 예를 들어 말레이미드 함유 시약 등이 고려되기도 한다.
또한, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 접합되지 않은 잔류 운반 단백질을 함유할 수 있으며, 이는 캡핑 공정 단계 동안 변형을 진행한 활성화 운반 단백질을 포함할 수도 있다.
본 발명의 당접합체는, 예를 들어 병원성 박테리아, 예컨대 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스에 의한 박테리아 감염으로부터 수용자를 보호하기 위한 면역원성 조성물의 생성에 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이러한 당접합체는 본원에 기재된 바와 같이, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함한다.
빈번한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하며, 상기 당접합체는 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
이러한 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에로부터 유래된 Pn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 일부 구체적 실시양태에서, Mn 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 공유 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 아주반트를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 아주반트는 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 알루미늄계 아주반트이다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 아주반트 인산알루미늄을 포함한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 이를 포함하는 면역원성 조성물은 일정 량의 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리사카라이드 총량과 비교하여 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직하게, 면역원성 조성물은 15% 미만의 유리 사카라이드, 보다 바람직하게 10% 미만의 유리 사카라이드, 보다 더 바람직하게 5% 미만의 유리 사카라이드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 당접합체 또는 면역원성 조성물은 동물 효능 모델에서 또는 옵소닌 식세포(opsonophagocytic) 사멸 검정을 통해 박테리아를 사멸시킴으로써 측정된 바와 같이 기능적인 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 본 발명의 당접합체는 이러한 박테리아 피막 폴리사카라이드에 대한 항체의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 나중에, 조사 및 임상 실험실 검정, 예컨대 박테리아 검출 및 혈청형별 검사에 사용될 수 있다. 상기 항체는 대상체에게 수동 면역을 부여하기 위해 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 폴리사카라이드에 대해 생성된 항체는 동물 효능 모델이나 옵소닌 식세포 사멸 검정에서 기능적이다.
본원에 기재된 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 또한, 특정 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 다양한 치료적 또는 예방적 방법에 사용될 수 있다. 특히, 박테리아 항원, 예컨대 병원성 박테리아로부터의 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체는 병원성 박테리아에 의해 야기된 대상체 내에서의 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위해 사용될 수 있다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 특정 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 (상기 면역원성 조성물은 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함함), 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 감염, 질환 또는 상태는 에스. 뉴모니아에 박테리아와 연관되고, 당접합체는 Pn 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 상기 감염, 질환 또는 상태는 폐렴, 축농증, 중이염, 수막염, 균혈증, 패혈증, 흉막 농흉, 결막염, 골수염, 화농성 관절염, 심내막염, 복막염, 심낭염, 유양 돌기염, 봉와직염, 연질 조직 감염 및 뇌 농양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 감염, 질환 또는 상태는 엔. 메닌기티디스 박테리아와 연관되고, 당접합체는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 상기 감염, 질환 또는 상태는 수막염, 수막구균 균혈증, 균혈증 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 대상체에게 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 (이러한 당접합체는 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함함), 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 대상체에게 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 (이러한 당접합체는 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함함), 대상체에서 병원성 박테리아에 의해 야기된 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 대상체에게 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 (이러한 당접합체는 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예를 들어 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함함), 병원성 박테리아로의 감염에 의해 야기된 질환 또는 상태의 한 가지 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하여, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 이러한 대상체에서 보호 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 박테리아 감염, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스에 의한 감염의 예방, 치료 또는 완화에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 박테리아 감염, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스에 의한 감염을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
상기 언급된 치료적 및/또는 예방적 방법 및 용도에서, 면역원성 조성물은 종종, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 연결된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 용도의 빈번한 실시양태에서, 박테리아 피막 폴리사카라이드는 Pn 피막 폴리사카라이드 또는 Mn 피막 폴리사카라이드이다. 이러한 일부 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 공유 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다.
또한, 본 발명은 각 경우에 있어서, 특정 대상체에게 eTEC 연결된 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여함으로써 (이러한 당접합체는 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스로부터 각각 유래된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함함), 대상체에서 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법; 대상체에서 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스 박테리아에 의해 야기된 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법; 및 대상체에서 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스로의 감염에 의해 야기된 감염, 질환 또는 상태의 한 가지 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다.
사카라이드
사카라이드는 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 및 모노사카라이드를 포함할 수 있다. 빈번한 실시양태에서, 사카라이드는 폴리사카라이드, 특히 박테리아 피막 폴리사카라이드이다. 피막 폴리사카라이드는 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조된다.
본 발명에서, 피막 폴리사카라이드는, 예를 들어 에스. 뉴모니아에의 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 각 폐렴구균성 폴리사카라이드 혈청형은 대두에 의거한 배지에서 성장시킬 수 있다. 개개의 폴리사카라이드는 원심분리, 침전, 한외여과, 및/또는 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제한다. 정제된 폴리사카라이드는 eTEC 스페이서와 반응할 수 있도록 활성화시킨 다음, 이를 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 당접합체 내로 혼입시킬 수 있다.
피막 폴리사카라이드의 분자량은 면역원성 조성물에 사용하기 위한 고려 사항이다. 고 분자량 피막 폴리사카라이드는 항원 표면 상에 존재하는 에피토프의 보다 고 차수의 원자가로 인해 특정의 항체 면역 반응을 유도시킬 수 있다. 고 분자량 피막 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 본 발명의 접합체, 조성물 및 방법에 사용하기 위해 고려된다.
일부 실시양태에서, 사카라이드는 10 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는다. 이러한 다른 실시양태에서, 사카라이드는 50 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 상기 실시양태에서, 사카라이드는 50 kDa 내지 1,750 kDa; 50 kDa 내지 1,500 kDa; 50 kDa 내지 1,250 kDa; 50 kDa 내지 1,000 kDa; 50 kDa 내지 750 kDa; 50 kDa 내지 500 kDa; 100 kDa 내지 2,000 kDa; 100 kDa 내지 1,750 kDa; 100 kDa 내지 1,500 kDa; 100 kDa 내지 1,250 kDa; 100 kDa 내지 1,000 kDa; 100 kDa 내지 750 kDa; 100 kDa 내지 500 kDa; 200 kDa 내지 2,000 kDa; 200 kDa 내지 1,750 kDa; 200 kDa 내지 1,500 kDa; 200 kDa 내지 1,250 kDa; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 200 kDa 내지 750 kDa; 또는 200 kDa 내지 500 kDa의 분자량을 갖는다. 이러한 일부 실시양태에서, 사카라이드는 박테리아 피막 폴리사카라이드, 예컨대 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F 피막 폴리사카라이드, 또는 Mn-혈청형 A, C, W135 또는 Y 피막 폴리사카라이드이며, 이러한 피막 폴리사카라이드는 기재된 바와 같은 분자량 중 하나 이내에 속하는 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 O-아세틸화된다. 일부 실시양태에서, 당접합체는 10 내지 100%, 20 내지 100%, 30 내지 100%, 40 내지 100%, 50 내지 100%, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 90 내지 100%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 70 내지 90% 또는 80 내지 90%의 O-아세틸화도를 갖는 사카라이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, O-아세틸화도는 ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, 또는 ≥ 90%, 또는 약 100%이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 피막 폴리사카라이드, 당접합체 또는 면역원성 조성물은 항체가 박테리아를 사멸시킨다는 것을 입증해 주는 옵소닌 식세포 사멸 검정 또는 동물 효능 모델에서 박테리아를 사멸시킴으로써 측정된 바와 같이 기능적인 항체를 생성하기 위해 사용된다.
피막 폴리사카라이드는 통상의 기술자에게 공지된 단리 과정을 이용하여 박테리아로부터 직접 수득할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Fournier et al. (1984), 상기 문헌; Fournier et al. (1987) Ann. Inst . Pasteur/ Microbiol. 138:561-567]; 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0141077; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/56357 참조; 이들 각각은 그의 전문이 제시되는 바와 같이 본원에 참조로 포함됨). 또한, 이들은 합성 프로토콜을 이용하여 생성될 수 있다. 더욱이, 피막 폴리사카라이드는 통상의 기술자에게 또한 공지된 유전 공학 과정을 이용하여 재조합적으로 생성할 수 있다 (문헌 [Sau et al. (1997) Microbiology 143:2395-2405]; 및 미국 특허 번호 6,027,925 참조; 이들 각각은 그의 전문이 제시되는 바와 같이 본원에 참조로 포함됨).
본 발명의 당접합체에 사용되는 각각의 폴리사카라이드를 제조하기 위해 사용된 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스의 박테리아 균주는 정립된 배양 컬렉션 또는 임상 표본으로부터 수득할 수 있다.
운반 단백질
본 발명의 당접합체의 또 다른 성분은 사카라이드와 접합되는 운반 단백질이다. 용어 "단백질 운반체", "운반 단백질" 또는 "운반체"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 운반 단백질은 바람직하게, 무독성이고 면역학적 반응을 일으키지 않으며, 충분한 양 및 순도로 수득 가능한 단백질이다. 운반 단백질은 표준 접합 과정을 받을 수 있어야 한다. 본 발명의 신규 당접합체에서, 운반 단백질은 eTEC 스페이서를 통해 사카라이드와 공유 연결된다.
특정 운반체에 대한 접합은 항원, 예를 들어 박테리아 항원, 예컨대 박테리아 피막 폴리사카라이드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 항원에 대한 바람직한 단백질 운반체는 독소, 톡소이드, 또는 파상풍, 디프테리아, 백일해, 슈도모나스(Pseudomonas), 이. 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus)로부터의 독소의 모든 돌연변이체 교차 반응성 물질 (CRM)이다. 한 실시양태에서, 특히 바람직한 운반체는 CRM197 단백질을 생산하는 씨. 디프테리아에(C. diphtheriae) 균주 C7 (β197)로부터 유래된 디프테리아 톡소이드 CRM197의 것이다. 이러한 균주는 ATCC 수탁 번호 53281을 갖는다. CRM197을 생성하는 방법은 미국 특허 번호 5,614,382 (이는 그의 전문이 제시되는 바와 같이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
대안적으로, 단백질 운반체 또는 다른 면역원성 단백질의 단편 또는 에피토프를 사용할 수 있다. 예를 들어, 합텐성 항원을 박테리아 독소, 톡소이드 또는 CRM의 T-세포 에피토프와 커플링시킬 수 있다 ("Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines"란 발명의 명칭으로 1988년 2월 1일에 출원된 미국 특허 출원 번호 150,688 참조; 이는 그의 전문이 제시되는 바와 같이 본원에 참조로 포함됨). 다른 적합한 운반 단백질은 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질, 예컨대 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합성 단백질, 뉴모리신, 폐렴구균성 표면 단백질 A (PspA), 폐렴구균성 부착 단백질 (PsaA) 또는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 단백질 D를 사용할 수도 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)를 운반 단백질로서 사용할 수도 있다.
따라서, 빈번한 실시양태에서 eTEC 연결된 당접합체는 운반 단백질로서 CRM197을 포함하고, 피막 폴리사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 연결되며, CRM197은 전형적으로 하나 이상의 리신 잔기의 ε-아민 기를 통하여, 상기 단백질의 활성화된 아미노산 잔기에 의해 형성된 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 연결된다.
사카라이드와 접합되는 운반 단백질 중의 리신 잔기의 수는 접합된 리신의 범위로서 명확히 규명될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물의 일부 실시양태에서, CRM197은 사카라이드와 공유 연결된 39개 중에서 4 내지 16개 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 약 10% 내지 약 41%의 CRM197 리신이 사카라이드와 공유 연결된다는 것이다. 다른 실시양태에서, CRM197은 사카라이드와 공유 연결된 39개 중에서 2 내지 20개 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 약 5% 내지 약 50%의 CRM197 리신이 사카라이드와 공유 연결된다는 것이다.
운반 단백질 상의 리신에 대한 사카라이드 쇄의 부착 빈도는 본 발명의 당접합체를 명확히 규명하기 위한 또 다른 파라미터이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드의 4개 사카라이드 반복 단위마다 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이에 적어도 하나의 공유 연결이 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결은 폴리사카라이드의 10개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다. 또 다른 실시양태에서, 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결은 폴리사카라이드의 15개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다. 추가 실시양태에서, 운반 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유 연결은 폴리사카라이드의 25개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다.
빈번한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이고, CRM197과 폴리사카라이드 사이의 eTEC 스페이서를 통한 공유 연결은 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 일어난다. 이러한 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드는 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 박테리아 피막 폴리사카라이드이다.
다른 실시양태에서, 접합체는 5 내지 10개 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 7개 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 8개 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 9개 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 11개 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 12개 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 13개 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 14개 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 15개 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 6개 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 7개 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 8개 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 10개 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 11개 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 12개 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 13개 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 14개 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 20개 사카라이드 반복 단위마다; 또는 4 내지 25개 사카라이드 반복 단위마다 운반 단백질과 사카라이드 사이에 적어도 하나의 공유 연결을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 사카라이드 반복 단위마다 운반 단백질과 사카라이드 사이에 적어도 하나의 연결이 존재한다.
eTEC 연결된 당접합체의 제조 방법
본 발명은 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 운반 단백질과 공유 접합된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 eTEC 스페이서는 안정한 티오에테르 및 아미드 결합을 포함하는, 7개의 선형 원자를 함유하고 (즉, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-), 상기 사카라이드와 운반 단백질을 공유 연결시켜 주는 작용을 한다. eTEC 스페이서의 한쪽 말단은 카르바메이트 연결을 통해 사카라이드의 히드록실 기와 공유 결합된다. eTEC 스페이서의 다른 쪽 말단은 아미드 연결을 통해 운반 단백질의 아미노 함유 잔기, 전형적으로 ε-리신 잔기와 공유 결합된다.
활성화된 운반 단백질 CRM197과 접합된 폴리사카라이드를 포함하는, 본 발명의 당접합체를 제조하는 대표적인 경로가 도 1에 도시되어 있다. eTEC 스페이서 공정을 이용하여 잠재적 변형 부위를 갖는 대표적인 박테리아 피막 폴리사카라이드, 즉 에스. 뉴모니아에로부터 유래된 폐렴구균성 혈청형 33F, 10A, 11A 및 22F 폴리사카라이드의 화학적 구조가 도 2, 도 3, 도 4 및 도 5에 각각 도시되어 있다.
eTEC 링커 화학을 이용하여 CRM197과 공유 접합된 폐렴구균성 혈청형 33F 폴리사카라이드를 포함하는, 본 발명의 대표적인 eTEC 연결된 당접합체의 구조가 도 6(A)에 도시되어 있다. 잠재적 캡핑된 및 캡핑되지 않은 유리 술프히드릴 부위가 예시 목적을 위해 도 6(B)에 도시되어 있다. 폴리사카라이드는 전형적으로, 다수의 히드록실 기, 및 카르바메이트 연결을 통해 폴리사카라이드 반복 단위 내에서 특이적 히드록실에 대한 eTEC 스페이서의 부착 부위를 함유하므로, 다양할 수 있다.
한 측면에서, 상기 방법은 a) 사카라이드를 유기 용매 중에서 탄산 유도체, 예컨대 1,1'-카르보닐-디-(1,2,4-트리아졸) (CDT) 또는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI)과 반응시켜 활성화 사카라이드를 생성하는 단계; b) 상기 활성화 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시켜 티올화 사카라이드를 생성하는 단계; c) 상기 티올화 사카라이드를 환원제와 반응시켜 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화 사카라이드를 생성하는 단계; d) 상기 활성화된 티올화 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질과 반응시켜 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 상기 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 (i) 상기 활성화 운반 단백질의 접합되지 않은 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약; 및/또는 (ii) 상기 활성화된 티올화 사카라이드의 접합되지 않은 유리 술프히드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시킴으로써, eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 a) Pn-33F 피막 폴리사카라이드를 유기 용매 중에서 CDT 또는 CDI와 반응시켜 활성화 Pn-33F 폴리사카라이드를 생성하는 단계; b) 이러한 활성화 Pn-33F 폴리사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시켜 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드를 생성하는 단계; c) 상기 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드를 환원제와 반응시켜 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드를 생성하는 단계; d) 상기 활성화된 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드를 하나 이상의 α-브로모아세트아미드 기를 포함하는 활성화 CRM197 운반 단백질과 반응시켜 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드-CRM197 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 상기 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드-CRM197 접합체를 (i) 상기 활성화 운반 단백질의 접합되지 않은 α-브로모아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약으로서의 N-아세틸-L-시스테인 및 (ii) 상기 활성화된 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드의 접합되지 않은 유리 술프히드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약으로서의 요오도아세트아미드와 반응시킴으로써, eTEC 연결된 Pn-33F 폴리사카라이드-CRM197 당접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
빈번한 실시양태에서, 카본산 유도체는 CDT 또는 CDI이다. 바람직하게, 카본산 유도체는 CDT이고, 유기 용매는 극성 비양성자성 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO)이다. 티올화 및/또는 접합 단계 이전에 활성화 사카라이드를 동결 건조시킬 필요는 없다.
바람직한 실시양태에서, 티올화 사카라이드는 활성화 사카라이드를 이관능성 대칭적 티오알킬아민 시약 시스타민, 또는 그의 염과 반응시킴으로써 생성된다. 이러한 시약에 대한 잠재적 이점은 대칭적 시스타민 링커가 활성화 사카라이드의 2개 분자와 반응하여, 디술피드 결합의 환원시 시스타민 분자당 티올화 사카라이드 2개 분자를 형성할 수 있다는 것이다. 대안적으로, 티올화 사카라이드는 활성화 사카라이드를 시스테아민 또는 그의 염과 반응시킴으로써 형성시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 eTEC 연결된 당접합체는 화학식 I로 나타내어질 수 있다.
단계 c)가 활성화 사카라이드를, 유리 술프히드릴 잔기를 함유하는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시킨 경우에 임의 단계라는 것은 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 실제적인 문제로서, 시스테아민을 포함하는 티올화 사카라이드는 단계 c)에서 환원제와 통상적으로 반응시켜, 이러한 반응 동안 형성될 수 있는 모든 산화된 디술피드 부산물을 환원시킨다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 단계 d)는 활성화된 티올화 사카라이드를 활성화 운반 단백질과 반응시키기에 앞서, 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질을 제공하여 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 상기 활성화 운반 단백질은 하나 이상의 α-브로모아세트아미드 기를 포함한다.
티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체는 반응 혼합물에 존재하는 잔류 활성화 관능기와 반응할 수 있는 하나 이상의 캡핑 시약으로 처리할 수 있다. 이러한 잔류 반응성 기는 불완전한 접합으로 인해 또는 반응 혼합물 중의 성분들 중 하나가 과량으로 존재하는 것으로부터, 반응되지 않은 사카라이드 또는 운반 단백질 성분 상에 존재할 수 있다. 그러한 경우, 캡핑은 당접합체의 정제 또는 단리에 도움을 줄 수 있다. 일부 경우에, 잔류 활성화 관능기가 당접합체에 존재할 수도 있다.
예를 들어, 활성화 운반 단백질 상의 과량의 α-할로아세트아미드 기는 완전한 캡핑을 보장하기 위해 과량으로 사용될 수 있는 저 분자량 티올, 예컨대 N-아세틸-L-시스테인과의 반응에 의해 캡핑시킬 수 있다. N-아세틸-L-시스테인을 이용한 캡핑은 또한, 접합 생성물의 아미노산 분석 및 산성 가수분해에 의해 결정될 수 있는, 캡핑된 부위에서 시스테인 잔기로부터 독특한 아미노산 S-카르복시메틸시스테인 (CMC)을 검출함으로써, 접합 효율을 확증시켜 줄 수 있다. 이러한 아미노산의 검출 결과, 반응성 브로모아세트아미드 기가 성공적인 캡핑됨으로써, 이들이 불필요한 어떠한 화학적 반응에도 이용되지 못한다는 사실이 확증되었다. 공유 원자가와 캡핑의 허용되는 수준은 CMCA/Lys의 경우 약 1 내지 15이고, CMC/Lys의 경우에는 약 0 내지 5이다. 유사하게, 과량의 유리 술프히드릴 잔기는 저 분자량 친전자성 시약, 예컨대 요오도아세트아미드와의 반응에 의해 캡핑시킬 수 있다. CMCA의 일부는 운반 단백질의 할로아실 기와의 접합에는 관여하지 않았던 요오도아세트아미드에 의해 직접적으로 캡핑된 폴리사카라이드 티올로부터 유래될 수 있다. 따라서, 접합 후 반응 샘플 (요오도아세트아미드에 의한 캡핑 이전)은 접합에 직접적으로 관여한 티올의 정확한 수준을 결정하기 위해 아미노산 분석 (CMCA)에 의해 검사할 필요가 있다. 10 내지 12개의 티올을 함유하는 티올화 사카라이드의 경우에는, 전형적으로 5 내지 6개의 티올이 폴리사카라이드 티올과 브로모아세틸화 단백질 사이의 접합에 직접적으로 관여할 것으로 결정되고, 4 내지 5개의 티올은 요오도아세트아미드에 의해 캡핑된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 캡핑 시약은 N-아세틸-L-시스테인이며, 이는 운반 단백질 상의 접합되지 않은 α-할로아세트아미드 기와 반응한다. 다른 실시양태에서, 제2 캡핑 시약은 요오도아세트아미드 (IAA)이며, 이는 활성화된 티올화 사카라이드의 접합되지 않은 유리 술프히드릴 기와 반응한다. 빈번하게도, 단계 e)는 제1 캡핑 시약으로서의 N-아세틸-L-시스테인과 제2 캡핑 시약으로서의 IAA를 이용하여 캡핑시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 단계 e)는 제1 및/또는 제2 캡핑 시약과의 반응 후에, 환원제, 예를 들어 DTT, TCEP, 또는 메르캅토에탄올과 반응시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어, 한외여과/정용여과에 의해 eTEC 연결된 당접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 이관능성 대칭적 티오알킬아민 시약은 시스타민 또는 그의 염이고, 활성화 사카라이드와 반응하여, 디술피드 모이어티를 함유하는 티올화 사카라이드 또는 그의 염을 제공한다.
이러한 티올화 사카라이드 유도체를 환원제와 반응시키면, 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화 폴리사카라이드가 생성된다. 이러한 활성화된 티올화 사카라이드는, 예를 들어 한외여과/정용여과에 의해 단리 및 정제할 수 있다. 대안적으로, 활성화된 티올화 사카라이드는, 예를 들어 표준 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 방법 또는 이온 교환 크로마토그래피 방법, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 DEAE에 의해 단리 및 정제할 수 있다.
시스타민-유래된 티올화 사카라이드의 경우에는, 환원제와 반응시키면 디술피드 결합이 절단되어, 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화 사카라이드가 제공된다. 시스테아민-유래된 티올화 사카라이드의 경우에는, 환원제와 반응시키는 것은 임의적이고, 이를 사용하여 상기 시약 또는 생성물의 산화에 의해 형성된 디술피드 결합을 환원시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 환원제는, 예를 들어 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT) 또는 메르캅토에탄올을 포함한다. 그러나, 적합한 어떠한 디술피드 환원제도 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기, 바람직하게 하나 이상의 α-브로모아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질을 제공하는 것을 추가로 포함한다.
활성화된 티올화 사카라이드를, 하나 이상의 α-할로아세트아미드 모이어티를 포함하는 활성화 운반 단백질과 반응시키면, 이러한 활성화 운반 단백질의 α-할로 기가 상기 활성화된 티올화 사카라이드의 하나 이상의 유리 술프히드릴 기에 의해 친핵성 치환되어 eTEC 스페이서의 티오에테르 결합이 형성된다.
운반 단백질의 α-할로아세틸화 아미노산 잔기는 전형적으로, 운반 단백질의 하나 이상의 리신 잔기의 ε-아미노 기에 부착시킨다. 빈번한 실시양태에서, 운반 단백질은 하나 이상의 α-브로모아세틸화 아미노산 잔기를 함유한다. 한 실시양태에서, 운반 단백질은 브로모아세트산 시약, 예컨대 브로모아세트산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (BAANS)로 활성화시킨다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질을 제공하는 단계, 및 활성화된 티올화 폴리사카라이드를 상기 활성화 운반 단백질과 반응시켜 티올화 폴리사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성시킴으로써, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 폴리사카라이드를 포함하는 당접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
본원의 방법의 일부 바람직한 실시양태에서, 박테리아 피막 폴리사카라이드는 에스. 뉴모니아에로부터 유래된 Pn 피막 폴리사카라이드이다. 이러한 일부 실시양태에서, Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이고 Pn 피막 폴리사카라이드는 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 제공된 방법의 다른 바람직한 실시양태에서, 박테리아 피막 폴리사카라이드는 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Mn 피막 폴리사카라이드이다. 이러한 일부 실시양태에서, Mn 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 운반 단백질은 CRM197이고 피막 폴리사카라이드는 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 제공된 방법 각각의 일부 실시양태에서, 사카라이드는 이미다졸 또는 트리아졸과 화합한 다음, 약 0.2% w/v 물을 함유하는 유기 용매 (예를 들어, DMSO) 중에서 카본산 유도체, 예컨대 CDT와 반응시켜 활성화 사카라이드를 생성하였다. 활성화 단계에서 상기 화합된 사카라이드를 사용하면, 유기 용매에서의 사카라이드의 용해도가 증가된다. 전형적으로, 사카라이드는 폴리사카라이드 1 그램당 1,2,4-트리아졸 부형제 10 그램과 화합시킨 다음, 주위 온도 하에 혼합시켜 화합된 사카라이드를 제공하였다.
따라서, 특정의 실시양태에서 상기 방법은 활성화 단계 a) 이전에, 사카라이드를 트리아졸 또는 이미다졸과 화합하여 화합된 사카라이드를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 상기 화합된 사카라이드는 카본산 유도체, 예를 들어 CDT로 활성화시키기 전에, 쉘-냉동시키고, 동결 건조시키며 유기 용매 (예컨대 DMSO) 중에서 재구성하고 약 0.2% w/v 물을 첨가한다.
한 실시양태에서, 티올화 사카라이드 반응 혼합물을 임의로, N-아세틸-리신 메틸 에스테르로 처리하여 반응되지 않은 모든 활성화 사카라이드를 캡핑한다. 이러한 일부 실시양태에서, 이와 같이 캡핑된 티올화 사카라이드 혼합물은 한외여과/정용여과에 의해 정제한다.
빈번한 실시양태에서, 티올화 사카라이드는 환원제와 반응시켜 활성화된 티올화 사카라이드를 생성시킨다. 이러한 일부 실시양태에서, 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT) 또는 메르캅토에탄올이다. 이러한 일부 실시양태에서, 활성화된 티올화 사카라이드는 한외여과/정용여과에 의해 정제된다.
한 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 방법은 활성화된 티올화 사카라이드와 운반 단백질의 반응 혼합물의 pH를 약 5℃에서 약 20시간 동안 약 8 내지 약 9의 pH로 조정 및 유지시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체를 생성하는 방법은 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성시킨 후 이를 단리시키는 단계를 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 당접합체는 한외여과/정용여과에 의해 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 방법은 상기 단리된 사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성시킨 후 이를 단리시키는 단계를 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 당접합체는 한외여과/정용여과에 의해 단리된다.
또한 또 다른 실시양태에서, 활성화 사카라이드를 생성하는 방법은 유기 용매 중의 사카라이드와 CDT를 포함하는 반응 혼합물의 물 농도를 약 0.1 내지 0.4%로 조정하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 유기 용매 중의 사카라이드와 CDT를 포함하는 반응 혼합물의 물 농도를 약 0.2%로 조정한다.
한 실시양태에서, 사카라이드를 활성화시키는 단계는 폴리사카라이드를, 유기 용매 중의 피막 폴리사카라이드와 CDT를 포함하는 반응 혼합물에 존재하는 폴리사카라이드의 양에 비해 약 5몰 과량인 양의 CDT와 반응시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 당접합체를 생성하는 방법은 사카라이드를 포함하는 반응 혼합물의 물 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 사카라이드를 활성화시키기 위해 반응 혼합물에 부가된 CDT의 양은 유기 용매 중의 사카라이드와 CDT를 포함하는 반응 혼합물에 존재하는 물의 양과 대략 등 몰인 CDT의 양으로 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 사카라이드를 활성화시키기 위해 반응 혼합물에 부가된 CDT의 양은 유기 용매 중의 사카라이드와 CDT를 포함하는 반응 혼합물에 존재하는 물의 양과 비교하여 약 0.5:1의 몰 비로 존재하는 CDT의 양으로 제공된다. 한 실시양태에서, 사카라이드를 활성화시키기 위해 반응 혼합물에 부가된 CDT의 양은 유기 용매 중의 사카라이드와 CDT를 포함하는 반응 혼합물에 존재하는 물의 양과 비교하여 0.75:1의 몰 비로 존재하는 CDT의 양으로 제공된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 티올화 폴리사카라이드를 정용여과에 의해 단리시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 활성화된 티올화 폴리사카라이드를 정용여과에 의해 단리시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 Pn 피막 폴리사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성하는 방법에 사용된 운반 단백질은 CRM197을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 Mn 피막 폴리사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성하는 방법에 사용된 운반 단백질은 CRM197을 포함한다.
일부 실시양태에서, 사카라이드:활성화 운반 단백질 비 (w/w)는 0.2 내지 4이다. 다른 실시양태에서, 사카라이드:활성화 운반 단백질 비 (w/w)는 1.0 내지 2.5이다. 추가 실시양태에서, 사카라이드:활성화 운반 단백질 비 (w/w)는 0.4 내지 1.7이다. 다른 실시양태에서, 사카라이드:활성화 운반 단백질 비 (w/w)는 약 1:1이다. 이러한 일부 실시양태에서, 사카라이드는 박테리아 피막 폴리사카라이드이고 활성화 운반 단백질은 CRM197의 활성화 (브로모아세틸화)에 의해 생성된다.
또 다른 실시양태에서, 활성화 사카라이드를 생성하는 방법은 유기 용매의 사용을 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 유기 용매는 극성 비양성자성 용매이다. 이러한 일부 실시양태에서, 극성 비양성자성 용매는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 아세토니트릴, 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2(1H)-피리미디논 (DMPU) 및 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
빈번한 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체의 단리는 한외여과/정용여과의 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체를 생성하는 방법에 사용된 사카라이드는 약 10 kDa 내지 약 2,000 kDa의 분자량을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 당접합체를 생성하는 방법에 사용된 사카라이드는 약 50 kDa 내지 약 2,000 kDa의 분자량을 갖는다.
한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드-운반 단백질 당접합체를 생성하는 방법에서 생성된 당접합체는 약 50 kDa 내지 약 20,000 kDa의 크기를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드-운반 단백질 당접합체를 생성하는 방법에서 생성된 당접합체는 약 500 kDa 내지 약 10,000 kDa의 크기를 갖는다. 한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드-운반 단백질 당접합체를 생성하는 방법에서 생성된 당접합체는 약 1,000 kDa 내지 약 3,000 kDa의 크기를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 의해 생성된, eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법 중 어느 것에 의해 생성된 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
사카라이드의 O-아세틸화도는 관련 기술분야에 공지된 모든 방법, 예를 들어 양성자 NMR에 의해 결정될 수 있다 (Lemercinier and Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones and Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 or WO 00/56357). 통상적으로 사용되는 또 다른 방법은 문헌 (Hestrin (1949) J. Biol . Chem . 180; 249-261)에 기재되어 있다. 또한 또 다른 방법은 HPLC-이온 배제 크로마토그래피에 기초한다. O-아세틸화도는 특정 샘플에 존재하는 유리 아세테이트의 양을 평가하고, 그 값을 순한 염기 가수분해 후 방출된 아세테이트의 양과 비교함으로써 결정된다. 아세테이트는 상기 샘플의 다른 성분으로부터 분해되고, 210 nm 하에서의 자외선 (UV) 검출을 이용하여 정량화한다. 또 다른 방법은 HPLC-이온 배제 크로마토그래피에 기초한다. O-아세틸은 특정 샘플에 존재하는 유리 아세테이트의 양을 평가하고, 그 값을 순한 염기 가수분해 후 방출된 아세테이트의 양과 비교함으로써 결정된다. 아세테이트는 상기 샘플의 다른 성분으로부터 분해되고, 210 nm 하에서의 자외선 (UV) 검출을 이용하여 정량화한다.
접합도는 아미노산 분석에 의해 결정되었다
브로모아세틸 활성화 화학을 이용하여 생성된 "IAA 캡핑 이전" 접합체 샘플을 산 가수분해시키면, 접합된 부위에서 시스타민으로부터 산 안정한 S-카르복시메틸시스테아민 (CMCA)이 형성되었고, 캡핑된 부위에서 시스테인으로부터 산 안정한 S-카르복시메틸시스테인 (CMC)이 형성되었다. 브로모아세틸 활성화 화학을 이용하여 생성된 "IAA 캡핑 이후" 접합체 (최종)를 산 가수분해시키면, 접합된 부위 및 IAA 캡핑된 부위에서 시스타민으로부터 산 안정한 S-카르복시메틸시스테아민 (CMCA)이 형성되었고, 캡핑된 부위에서 시스테인으로부터 산 안정한 S-카르복시메틸시스테인 (CMC)이 형성되었다. 접합되지 않은 리신 및 캡핑되지 않은 리신 모두를 리신으로 다시 전환시키고, 그 자체로 검출하였다. 다른 모든 아미노산을, 가수분해 조건에 의해 파괴되는 트립토판과 시스테인을 제외한 유리 아미노산으로 다시 전환시켰다. 아스파라긴 및 글루타민을 각각 아스파르트산 및 글루탐산으로 전환시켰다.
각각의 가수분해된 샘플 및 대조군의 아미노산을, 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 다음, 135℃에서 벡크만 닌히드린 닌알엑스(Beckman Ninhydrin NinRX) 용액과 반응시켜 분리시켰다. 이어서, 이와 같이 유도체화된 아미노산을 570 nm 및 440 nm 하의 가시 범위에서 검출하였다 (표 1 참조). 각 아미노산 500 피코몰을 함유하는 아미노산의 표준 세트 [피어스(Pierce) 아미노산 표준 H]를, 각 분석 세트를 위한 샘플 및 대조군과 함께 수행하였다. S-카르복시메틸시스테인 [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]을 상기 표준물에 첨가하였다.
표 1
벡크만 6300 아미노산 분석기 상의 구배 프로그램 1을 이용한 아미노산에 대 한 체류 시간
Figure pct00003
리신이 시스테인 및 시스테아민에 대한 그의 공유 부착에 기초한 평가 및 예상된 유사한 가수분해를 위해 선택되었다. 이어서, 이로써 생성된 아미노산의 몰 수를 단백질의 아미노산 조성과 비교하고, CMC 및 CMCA에 대한 값과 함께 보고하였다. CMCA 값은 접합도의 평가를 위해 직접 사용되었고, CMC 값은 캡핑도의 평가를 위해 직접 사용되었다.
한 실시양태에서, 당접합체는 그의 분자 크기 분포도 (Kd)로써 명확히 규명될 수있다. 접합체의 분자 크기는 고압 액체 크로마토그래피 시스템 (HPLC)을 이용하여 세파로스 CL-4B 정지 상 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 매질에 의해 결정된다. Kd 결정을 위해, 크로마토그래피 칼럼을 먼저 보정하여 V0 (이는 허공 용적 또는 총 배제 용적을 나타냄), 및 Vi (샘플 중의 가장 작은 분자가 용출되는 용적; 입자간 용적으로서 공지되기도 함)를 결정한다. 모든 SEC 분리는 V0와 Vi 사이에서 일어난다. 수집된 각 분획에 대한 Kd 값은 다음 표현에 의해 결정된다: Kd = (Ve-Vi)/(Vi-V0) (여기서, Ve는 화합물의 잔류 용적을 나타냄). ≤ 0.3 용출되는 % 분획 (주요 피크)이 접합체 Kd (분자 크기 분포도)를 규정한다.
면역원성 조성물
용어 "면역원성 조성물"은 특정 대상체에서 면역 반응을 유발시키기 위해 사용될 수 있는 항원 (예를 들어, 미생물 또는 그의 성분)을 함유하는 모든 제약 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "면역원성"은 체액상 또는 세포상 매개되거나, 또는 둘 다 매개된, 숙주 대상체, 예컨대 포유류에서 면역 반응을 유발시킬 수 있는 항원 (또는 항원의 에피토프), 예컨대 박테리아 피막 폴리사카라이드, 또는 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 당접합체 또는 면역원성 조성물의 능력을 의미한다.
당접합체는 세포 표면에 MHC 분자와 연합하여 항원을 제시함으로써 상기 숙주를 감작시키기 위해 제공될 수 있다. 또한, 면역된 숙주를 미래에 보호해줄 수 있는 항원-특이적 T-세포 또는 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 당접합체는 박테리아에 의한 감염과 연관된 한 가지 이상의 증상으로부터 숙주를 보호해줄 수 있거나 또는 피막 폴리사카라이드와 연관된 박테리아로의 감염으로 인한 사망으로부터 숙주를 보호해줄 수 있다. 당접합체는 또한, 대상체에게 수동 면역을 부여하기 위해 사용될 수있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 당접합체는 또한, 동물 효능 모델에서 또는 옵소닌 식세포 사멸 검정을 통해 박테리아를 사멸시킴으로써 측정된 바와 같이 기능적인 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은, 문맥에 의해 달리 명시되지 않는 한, 상기 용어는 온전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 조작된 항체 (예를 들어, 효과기 기능, 안정성 및 다른 생물학적 활성을 변경시키기 위해 인간화 및/또는 유도체화되거나 키메라임) 및 그의 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (ScFv) 및 도메인 단편 (상어 및 낙타과 항체 포함), 및 항체 일부, 다가 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중-특이적 항체) 및 본원에 기재된 바와 같은 항체 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 다른 모든 변형된 입체 배치를 포괄하고자 한다. 항체는 모든 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하고, 항체는 특정한 어떠한 부류일 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중 몇 가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 인간에게서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 이러한 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 불리운다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 소단위 구조와 3차원적 배위는 널리 공지되어 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 특정 부분 만을 포함하며, 이러한 부분은 바람직하게, 온전한 항체 내에 존재하는 경우에 그 부분과 정상적으로 연관된 기능들 중 적어도 한 가지, 바람직하게는 대부분 또는 모두를 보유하고 있다.
용어 "항원"은 일반적으로, 특정 대상체에서 항체 또는 T-세포 반응, 또는 둘 다의 생성을 자극할 수 있는 면역원성 물질 또는 면역원성 조성물 (상기 대상체 내로 주사되거나 흡수되는 조성물 포함) 중의 생물학적 분자, 통상적으로 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드 또는 접합체에 관한 것이다. 면역 반응은 전체 분자, 또는 분자의 다양한 부분 (예를 들어, 에피토프 또는 합텐)에 대해 생성될 수 있다. 상기 용어는 항원성 분자의 개개의 분자 또는 동질적 또는 이질적 집단을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 항원은 항체, T-세포 수용체, 또는 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역의 다른 요소에 의해 인식된다. "항원"은 또한, 관련된 모든 항원성 에피토프를 포함한다. 소정의 항원의 에피토프는 관련 기술분야에 널리 공지된 수많은 에피토프 지도화 기술을 이용하여 확인할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J.] 참조). 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어 고체 지지체 상의 다수의 펩티드를 동시에 합성하고 (이러한 펩티드는 단백질 분자의 일부분에 상응함), 이러한 펩티드가 상기 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 이 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol . 23:709-715] (이들 각각은 그의 전문이 제시되는 바와 같이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 유사하게, 입체 형태적 에피토프는, 예를 들어 X선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간 입체 형태를 결정함으로써 확인할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상기 문헌] 참조). 더욱이, 본 발명의 목적상, "항원"은 또한, 특정 단백질이 면역학적 반응을 유발시킬 수 있는 능력을 유지하고 있는 한은, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로, 사실상 보존적이지만, 보존적이지 않을 수도 있음)을 포함하는 상기 단백질을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 이들 변형은, 예를 들어 부위 지시된 돌연변이 유발을 통하여, 또는 특정한 합성 과정을 통하여, 또는 유전 공학 접근 방식을 통해 의도한 것일 수 있거나, 또는 예를 들어, 항원을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통한 우발적인 것일 수 있다. 더욱이, 항원은 미생물 (예를 들어, 박테리아)로부터 유래, 수득 또는 단리될 수 있거나, 또는 전체 유기체일 수 있다. 유사하게, 핵산 면역 적용에서와 같이, 항원을 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 또한 상기 정의에 포함된다. 합성 항원, 예를 들어 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유래된 항원이 또한 포함된다 (Bergmann et al. (1993) Eur . J. Immunol . 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol . 157:3242-3249; Suhrbier (1997) Immunol . Cell Biol . 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 to Jul. 3, 1998).
"보호" 면역 반응은 대상체를 감염으로부터 보호하기 위해 제공되는, 체액성 또는 세포 매개되거나, 또는 둘 다 매개된 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역원성 조성물의 능력을 지칭한다. 제공된 보호가 절대적일 필요는 없으며, 즉 대상체의 대조군 집단, 예를 들어 백신이나 면역원성 조성물을 투여하지 않은 감염된 동물과 비교하여 통계학상 유의적인 개선이 있다면, 감염을 전적으로 방지하거나 근절시킬 필요는 없다. 보호는 감염 증상의 중증도 또는 발병 신속도를 경감시키는 것으로 제한될 수 있다. 일반적으로, "보호 면역 반응"은 대상체의 적어도 50%에게서 특정한 항원에 대해 특이적인 항체 수준 (각 항원에 대한 측정 가능한 기능적 항체 반응의 일부 수준 포함)의 증가를 유도시키는 것을 포함할 것이다. 특정한 상황 하에서는, "보호 면역 반응"이 대상체의 적어도 50%에게서 특정한 항원에 대해 특이적인 항체 수준 (각 항원에 대한 측정 가능한 기능적 항체 반응의 일부 수준 포함)의 2배 증가 또는 4배 증가를 유도시키는 것을 포함할 수 있었다. 특정 실시양태에서, 옵소닌화 항체는 보호 면역 반응과 상관이 있다. 따라서, 보호 면역 반응은 옵소닌 식세포 검정, 예를 들어 다음에 기재되는 검정에서 박테리아 계수치의 감소 %를 측정함으로써 검정할 수 있다. 바람직하게, 적어도 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 박테리아 계수치 감소가 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "면역원성 양" 및 "면역학적 유효량"은 세포성 (T-세포) 또는 체액성 (B-세포 또는 항체) 반응이거나 또는 둘 다의 반응일 수 있는 면역 반응을 유발시키기에 충분한 면역원성 조성물 또는 항원의 양을 지칭하며, 이러한 면역 반응은 통상의 기술자에게 공지된 표준 검정에 의해 측정될 수 있다. 전형적으로, 면역학적 유효량은 대상체에서 보호 면역 반응을 유발시킬 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 전신, 피부 또는 점막 경로를 통해 면역원성 조성물을 투여함으로써, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스 박테리아에 의한 박테리아 감염에 걸리기 쉬운 대상체를 예방적 또는 치료적으로 보호하거나 처치하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 또 다른 대상체에 수동 면역을 부여하기 위해 사용될 수 있었던 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 투여는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화관, 기도 또는 비뇨생식기관으로의 점막 투여를 통한 주사를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한, 동물 효능 모델에서 또는 옵소닌 식세포 사멸 검정을 통해 박테리아를 사멸시킴으로써 측정된 바와 같이 기능적인 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
특정한 면역원성 조성물에 대한 성분들의 최적의 양은 대상체에서 적당한 면역 반응을 관찰하는 것을 포함한 표준 연구에 의해 확인할 수 있다. 초기 백신 접종한 후, 적절한 간격을 두고 대상체에게 한차례 또는 여러 차례의 부스터 예방 접종을 수행할 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 아주반트를 포함할 것이다. 본원에 정의된 바와 같은, "아주반트"는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증강시키기 위해 제공되는 물질이다. 따라서, 아주반트는 종종, 면역 반응을 부스터하기 위해 제공되고, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 조성물의 유효성을 증강시키기에 적합한 아주반트는 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다:
(1) 알루미늄 염 (알룸), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등;
(2) 수중유 에멀젼 제제 (다른 특이적 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩티드 (다음에 정의됨) 또는 박테리아 세포벽 성분을 수반하거나 수반하지 않음), 예를 들어
(a) 모델 110Y 마이크로유동화기 (마이크로플루이딕스 (Microfluidics); 매사추세츠주 뉴턴)와 같은 마이크로유동화기를 이용하여 서브마이크론 입자로 제제화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈(Tween) 80, 및 0.5% 스팬(Span) 85 (다양한 양의 MTP-PE를 임의로 함유함 (하기 참조; 반드시 요구되지는 않음))를 함유하는 MF59 (PCT 공개 번호 WO 90/14837),
(b) 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 와동시키거나 또는 서브마이크론 에멀젼으로 마이크로유동화시킨, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 Ll21, 및 thr-MDP (하기 참조)를 함유하는 SAF, 및
(c) 2% 스쿠알렌; 0.2% 트윈 80; 및 미국 특허 번호 4,912,094 (코릭사(Corixa))에 기재된 3-O-탈아실화 모노포스포릴리피드 A (MPL)™, 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS), 바람직하게 MPL+CWS (데톡스(Detox)™)로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분을 함유하는 리비(Ribi)™ 아주반트 시스템 (RAS) (코릭사; 몬태나주 해밀턴);
(3) 사포닌 아주반트, 예컨대 퀼(Quil) A 또는 STIMULON™ QS-21 (안티제닉스(Antigenics); 매사추세츠주 프레이밍햄) (미국 특허 번호 5,057,540)을 사용할 수 있거나 이로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOM (면역자극성 복합체)을 사용할 수 있다;
(4) 코릭사로부터 입수 가능하고 미국 특허 번호 6,113,918에 기재되어 있는, 박테리아 리포폴리사카라이드, 합성 지질 A 유사체, 예컨대 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그의 유도체 또는 유사체; 상기 AGP 중 하나는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노시드이며, 이는 529로서 공지되기도 하고 (이전에는 RC529로서 공지됨), 수성 형태로서 제제화되거나 또는 안정한 에멀젼, 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티프(들)를 함유하는 올리고뉴클레오티드로서 제제화된다 (미국 특허 번호 6,207,646);
(5) 시토카인, 예컨대 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 공-자극 분자 B7-1 및 B7-2 등;
(6) 박테리아 ADP-리보실화 독소, 예컨대 야생형 또는 돌연변이체 형태의 콜레라 독소 (CT) (예를 들어, 여기서 아미노산 위치 29에서의 글루탐산은 공개된 국제 특허 출원 번호 WO 00/18434 (또한 WO 02/098368 및 WO 02/098369 참조)에 따라서, 또 다른 아미노산, 바람직하게 히스티딘으로 대체됨), 페투시아 독소 (PT), 또는 이. 콜라이 열-불안정 독소 (LT), 특히 LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (예를 들어, WO 93/13302 및 WO 92/19265 참조)의 번역된 돌연변이체; 및
(7) 본 발명의 조성물의 유효성을 증강시키기 위한 면역자극제로서 작용하는 다른 물질.
무라밀 펩티드는 N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸노르무라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 아주반트는 알루미늄계 아주반트, 예컨대 알루미늄 염이다. 구체적 실시양태에서, 알루미늄계 아주반트는 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적 실시양태에서, 아주반트는 인산알루미늄이다.
면역원성 조성물은 임의로, 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 연방 또는 주 정부의 규제 기관, 또는 다른 규제 기관에 의해 승인되거나, 또는 미국 약전에 열거되거나 또는 인간뿐만 아니라 비-인간 포유류를 포함한 대상체에게 사용하도록 일반적으로 인식된 다른 약전에 열거된 담체를 포함한다. 용어 담체는 제약 조성물과 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 물, 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 액상 담체, 특히 주사 가능한 용제용 액상 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 이 제제는 투여 방식에 맞춰야 한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 추가로, 복수 개의 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체 이외에도 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. FDA는 수 회분 용량 (다중-용량) 바이알 내의 생물학적 제품이 몇 가지 예외를 제외하고는 보존제를 함유해야 한다고 요구하고 있다. 보존제를 함유하는 백신 제품은 벤제토늄 클로라이드를 함유하는 백신 (탄저병), 2-페녹시에탄올을 함유하는 백신 (DTaP, HepA, 라임(Lyme), 폴리오(Polio) (비경구)), 페놀을 함유하는 백신 (뉴모(Pneumo), 티포이드(Typhoid) (비경구), 백시니아(Vaccinia)) 및 티메로살을 함유하는 백신 (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, 인플루엔자, JE, 메닝(Mening), 뉴모, 광견병)을 포함한다. 주사용 약물에 사용하도록 승인된 보존제는, 예를 들어 클로로부탄올, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알콜, 페놀, 티메로살 및 페닐메르쿠릭 니트레이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여와 화합성인 본 발명의 제제는 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 포함하며, 이는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트-80 (트윈 80), 폴리소르베이트-60 (트윈 60), 폴리소르베이트-40 (트윈 40) 및 폴리소르베이트-20 (트윈 20), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (이는 브리지(Brij) 58, 브리지 35를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 뿐만 아니라 다른, 예컨대 트리톤(Triton) X-100; 트리톤 X-114, NP40, 스팬 85 및 플루로닉 계열의 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 플루로닉 121)를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 바람직한 성분은 약 0.001% 내지 약 2%의 농도 (약 0.25% 이하가 바람직함)의 폴리소르베이트-80, 또는 약 0.001% 내지 1%의 농도 (약 0.5% 이하가 바람직함)의 폴리소르베이트-40이다.
패키징 및 투여 형태
본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 직접적으로 전달하는 것은 비경구 투여 (근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 조직의 간질 공간)에 의해; 또는 구강/소화관, 기도 또는 비뇨 생식기관으로의 점막 투여를 통하여; 또는 국소, 경피, 비내, 안구, 청각, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 비경구 투여는, 예를 들어 대상체의 허벅지 또는 팔뚝에 근육내 주사한다. 바늘 (예를 들어, 피하 바늘)을 통해서 주사할 수 있지만, 바늘이 없는 주사도 사용할 수 있다. 전형적인 근육내 용량은 0.5 ml이다. 또 다른 실시양태에서, 비내 투여는 폐렴 또는 중이염을 치료하는 데 사용된다 (폐렴구균의 비인두 캐리지가 더 효과적으로 방지될 수 있기 때문에, 따라서 그의 초기 단계에서 감염을 약화시킴).
본 발명의 조성물은, 예를 들어 액상 용제 또는 현탁제로서 주사하기 위하여 다양한 형태로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물은, 예를 들어 흡입기로 폐 투여하기 위한 산제 또는 분무제로서 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 조성물은 좌제 또는 페서리로서 제조될 수 있거나, 또는 비내, 청각 또는 안구 투여하는 경우에는, 분무제, 점적제, 젤 또는 산제로서 제조될 수 있다.
각 면역원성 조성물 용량 중의 당접합체의 양은 상당한 부작용없이 면역보호 반응을 유도시키는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 당접합체에 존재하는 박테리아 혈청형에 따라서 다양할 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 0.1 내지 100 ㎍의 폴리사카라이드, 특히 0.1 내지 10 ㎍, 및 보다 특히 1 내지 5 ㎍을 포함할 것이다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 eTEC 링커를 통해 CRM197과 개별적으로 접합된 Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드의 멸균성 액상 제제이며, 각 0.5 ml 용량은 1 내지 5 ㎍의 폴리사카라이드를 함유하도록 제제화되고, 이는 추가로, 0.125 mg의 원소 알루미늄 (0.5 mg 인산알루미늄) 아주반트; 및 부형제로서의 염화나트륨 및 소듐 숙시네이트를 함유할 수 있다.
특정한 면역원성 조성물에 대한 성분들의 최적의 양은 대상체에서 적당한 면역 반응을 관찰하는 것을 포함한 표준 연구에 의해 확인할 수 있다. 초기 백신 접종한 후, 적절한 간격을 두고 대상체에게 한차례 또는 여러 차례의 부스터 예방 접종을 수행할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 단위 용량 또는 다중-용량 형태 (예를 들어, 2회 용량, 4회 용량, 또는 그 초과)로 패키징할 수 있다. 다중-용량 형태의 경우에는, 미리-충전된 시린지 보다는 바이알이 반드시는 아니지만 전형적으로 바람직하다. 적합한 다중-용량 포맷은 용량당 0.1 내지 2 ml로 각 용기당 2 내지 10회 용량을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.5 ml 용량이다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 WO 2007/127668 참조).
조성물은 바이알 또는 다른 적합한 저장 용기에 제시될 수 있거나, 또는 예비-충전된 전달 장치, 예를 들어 단일 또는 다중 성분 시린지 (이에는 바늘이 공급되거나 공급되지 않을 수 있음)에 제시될 수 있다. 시린지는 반드시는 아니지만 전형적으로, 본 발명의 보존제 함유 면역원성 조성물의 단일 용량을 함유하지만, 다중-용량의 예비-충전된 시린지가 고려되기도 한다. 마찬가지로, 바이알은 단일 용량을 포함할 수 있지만, 대안적으로 수 회분 용량을 포함할 수도 있다.
유효 투여 용적이 통상적으로 정립될 수 있지만, 전형적인 주사용 조성물의 용량은 0.5 ml의 용적을 갖는다. 특정 실시양태에서, 용량은 인간 대상체에게 투여하도록 제제화된다. 특정 실시양태에서, 용량은 성인, 10대, 청소년, 유아 또는 영아 (즉, 1세 이하) 인간 대상체에게 투여하도록 제제화되고, 바람직한 실시양태에서는 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 액상 면역원성 조성물은 또한, 동결건조된 형태로 제시되는 다른 면역원성 조성물을 재구성하는 데 적합하다. 면역원성 조성물을 이러한 즉석 재구성을 위해 사용해야 하는 경우, 본 발명은 2개 이상의 바이알, 2개 이상의 즉시-충전되는 시린지, 또는 이들 각각의 하나 이상 (시린지의 내용물은 주사에 앞서 바이알의 내용물을 재구성하기 위해 사용되거나 그 반대도 가능함)를 수반하는 키트를 제공한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 다중-용량 포맷의 용기는 일반 실험실 유리 그룻, 플라스크, 비커, 눈금 실린더, 발효기, 생물 반응기, 튜빙, 파이프, 가방, 항아리, 바이알, 바이알 마개 (예를 들어, 고무 마개, 캡 나사), 앰풀, 시린지, 이중 또는 다중-챔버 시린지, 시린지 마개, 시린지 플런저, 고무 마개, 플라스틱 마개, 유리 마개, 카트리지 및 일회용 펜 등으로 이루어진 (이에 제한되지 않음) 군 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명의 용기는 제조의 재료로써 제한되지 않고, 유리, 금속 (예를 들어, 강, 스텐레스 강, 알루미늄 등) 및 중합체 (예를 들어, 열가소성, 탄성중합체, 열가소성-탄성중합체)와 같은 재료를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 포맷의 용기는 부틸 마개가 있는 5 ml용 스코트(Schott) 유형 1 유리 바이알이다. 통상의 기술자는 상기 제시된 포맷이 결코 완전 목록은 아니지만, 단지 본 발명에 이용 가능한 다양한 포맷과 관련하여 통상의 기술자에게 지침으로서 제공된다는 것을 인지할 것이다. 본 발명에 사용하기 위해 고려된 부가의 포맷은 실험실 장비 공급업체 및 제조업체, 예컨대 미국 플라스틱 코포레이션 (United States Plastic Corp.; 오하이오주 리마), VWR로부터의 공개된 카탈로그에서 찾을 수 있다.
면역 반응을 유도시키고 감염에 대해 보호하기 위한 방법
본 발명은 또한, eTEC 연결된 당접합체 및 이를 포함하는 면역원성 조성물을 예방적 또는 치료적으로 사용하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 측면은 특정 대상체에게 박테리아 항원, 예컨대 병원성 박테리아로부터 유래된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 본원에 기재된 면역원성 조성물 중 어느 것의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 병원성 박테리아, 예를 들어 폐렴구균성 또는 수막구균성 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태는 병원성 박테리아에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는 방법, 또는 병원성 박테리아와 연관된 감염 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법, 또는 병원성 박테리아에 의해 야기된 감염과 연관된 한 가지 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나 이러한 증상의 발병을 지연시키는 방법을 제공하며, 각 경우에 있어서 상기 방법은 특정 대상체에게 박테리아 항원, 예컨대 병원성 박테리아로부터 유래된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 본원에 기재된 면역원성 조성물 중 어느 것의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 박테리아 항원, 예컨대 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함하는 것인, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법은 인간, 수의과, 동물, 또는 농업적 처치를 포함한다. 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 면역원성 조성물로부터 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 생성하고, 특정 대상체에게 수동 면역을 부여하기 위하여 상기 항체 제제를 사용하는 것을 포함하는, 이러한 대상체에서 병원성 박테리아와 연관된 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태는 수술 절차에 앞서 대상체에게 본원에 기재된 면역원성 조성물의 예방학상 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 수술 절차를 진행하고 있는 대상체에서 박테리아 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
전술된 방법 각각의 바람직한 실시양태에서, 병원성 박테리아는 폐렴구균성 또는 수막구균성 박테리아, 예컨대 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스 박테리아이다. 이러한 일부 실시양태에서, 박테리아 항원은 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드이다. 이러한 다른 실시양태에서, 박테리아 항원은 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드이다.
항원 또는 면역원성 조성물에 대한 면역 반응은 관심 항원 또는 면역원성 조성물에 존재하는 분자에 대한 체액성 및/또는 세포 매개된 면역 반응이 대상체에서 발생하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 목적상, "체액성 면역 반응"은 항체 매개된 면역 반응이고, 본 발명의 면역원성 조성물 중의 항원을 인식하고 이에 대한 일부 친화도로 결합하는 항체를 유도 및 생성하는 것을 포함하는 반면, "세포 매개된 면역 반응"은 T-세포 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개된 면역 반응이다. "세포 매개된 면역 반응"은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 부류 I 또는 부류 II 분자, CD1 또는 다른 비-전통적 MHC-유사 분자와 연관된 항원성 에피토프의 제시에 의해 유발된다. 이는 항원 특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 또는 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 ("CTL")를 활성화시킨다. CTL은 전통적 또는 비-전통적 MHC에 의해 암호화되고 세포의 표면 상에 발현된 단백질과 연합하여 제시되는 펩티드 항원에 대한 특이성을 지니고 있다. CTL은 세포내 미생물의 세포내 파괴 또는 이러한 미생물로 감염된 세포의 용해를 유도 및 증진시키는 것을 도와준다. 세포성 면역의 또 다른 측면은 헬퍼 T-세포에 의한 항원 특이적 반응을 포함한다. 헬퍼 T-세포는 상기 기능을 자극하는 것을 도와주는 작용을 하고, 그들의 표면 상에 전통적 또는 비-전통적 MHC 분자와 연합되는 펩티드 또는 다른 항원을 표시하는 세포에 대항하는 비특이적 효과기 세포의 활성에 초점을 맞춘다. "세포 매개된 면역 반응"은 또한, 시토카인; 케모카인; 및 활성화된 T-세포 및/또는 다른 백혈구 (CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래된 것 포함)에 의해 생성된 이러한 다른 세포의 생성을 지칭한다. 세포 매개된 면역학적 반응을 자극할 수 있는 특정한 항원 또는 조성물의 능력은 수많은 검정, 예컨대 림프구의 과잉 생성 (림프구 활성화) 검정, CTL 세포독성 세포 검정에 의해, 감작된 대상체에서 항원에 대해 특이적인 T-림프구에 대해 검정함으로써, 또는 항원으로 재자극하는 것에 반응하여 T 세포에 의한 시토카인 생성의 측정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Erickson et al. (1993) J. Immunol . 151:4189-4199]; 및 [Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376] 참조).
본 발명의 면역원성 조성물 및 방법은 다음 중 하나 이상에 유용할 수 있다: (i) 전통적인 백신에서와 같이, 감염 또는 재감염의 예방, (ii) 증상의 중증도 감소, 또는 증상의 제거, 및/또는 (iii) 해당 병원체 또는 장애의 실질적 또는 완전한 제거. 따라서, 처치는 예방적으로 (감염에 앞서) 또는 치료적으로 (감염 후) 수행될 수 있다. 본 발명에서는, 예방적 처치가 바람직한 방식이다. 본 발명의 특정한 실시양태에 따르면, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스에 의한 박테리아 감염에 대해 숙주 대상체를 처치하는 (예방적 및/또는 치료적으로 면역시키는 것 포함) 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 대상체에게 예방적 및/또는 치료적 면역을 부여하는 데 유용하다. 본 발명의 방법은 또한, 생물의학 연구 적용을 위해 대상체 상에서 실시할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다. 보다 특히, 대상체는 포유류 (인간 포함), 가축용 및 농장용 동물, 및 연구, 동물원, 스포츠 및 애완 반려 동물, 예컨대 가정용 애완 동물 및 다른 가축용 동물로서 분류된 모든 동물을 지칭하며, 이에는 소, 양, 흰족제비, 돼지, 말, 토끼, 염소, 개, 고양이 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 바람직한 반려 동물은 개와 고양이이다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.
조성물 중의 특정한 접합체의 양은 일반적으로, 그 접합체에 대해 접합된 폴리사카라이드와 접합되지 않은 폴리사카라이드 둘 다의 총량을 기초로 하여 계산된다. 예를 들어, 20% 유리 폴리사카라이드를 수반한 접합체는 100 ㎍ 폴리사카라이드 용량 중에 약 80 ㎍의 접합된 폴리사카라이드와 약 20 ㎍의 접합되지 않은 폴리사카라이드를 가질 것이다. 접합체에 대한 단백질 기여는 접합체의 용량을 계산할 때 통상적으로 고려되지 않는다. 접합체 또는 면역원성 조성물의 면역원성 양은 박테리아 혈청형에 따라서 다양할 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 0.1 내지 100 ㎍의 폴리사카라이드, 특히 0.1 내지 10 ㎍, 및 보다 특히 1 내지 10 ㎍을 포함할 것이다. 면역원성 조성물 중의 상이한 폴리사카라이드 성분의 면역원성 양은 달라질 수 있고, 각각 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 10 ㎍, 15 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍, 40 ㎍, 50 ㎍, 60 ㎍, 70 ㎍, 80 ㎍, 90 ㎍, 또는 약 100 ㎍의 특정한 어떠한 폴리사카라이드 항원도 포함할 수 있다.
용어 "침습성 질환"은 질환의 관련 임상적 징후/증상이 있는, 정상적 멸균 부위로부터 박테리아가 단리되는 것을 지칭한다. 정상적 멸균 신체 부위는 혈액, CSF, 흉수, 심낭액, 복강액, 관절액/활액, 뼈, 내부 신체 부위 (림프절, 뇌, 심장, 간, 비장, 유리체액, 신장, 췌장, 난소) 또는 다른 정상적 멸균 부위를 포함한다. 침습성 질환을 특징으로 하는 임상적 상태는 균혈증, 폐렴, 봉와직염, 골수염, 심내막염, 패혈성 쇼크 등을 포함한다.
면역원으로서의 항원의 유효성은 증식 검정에 의해; 그의 특이적 표적 세포를 용해시킬 수 있는 T-세포의 능력을 측정하는 크롬 방출 검정과 같은 세포용해성 검정에 의해; 또는 혈청 중의 항원에 대해 특이적인 순환성 항체의 수준을 측정함으로써 B-세포 활성 수준을 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다. 면역 반응은 또한, 항원을 투여한 후 유도된 항원 특이적 항체의 혈청 수준을 측정함으로써, 보다 구체적으로는 본원에 기재된 바와 같이, 특정한 백혈구의 옵소닌 식세포 능력을 증강시킬 수 있는 상기와 같이 유도된 항체의 능력을 측정함으로써 검출할 수 있다. 면역 반응의 보호 수준은 면역시킨 숙주를, 투여한 항원으로 시험감염시킴으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 그에 대한 면역 반응이 요망되는 항원이 박테리아인 경우, 이러한 항원의 면역원성 양에 의해 유도된 보호 수준은, 동물을 상기 박테리아 세포로 시험감염시킨 후의 생존률 또는 사망률을 검출함으로써 측정된다. 한 실시양태에서, 보호 양은 박테리아 감염과 연관된 한 가지 이상의 증상, 예를 들어 감염과 연관된 발열을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다중 항원 또는 다중 성분 백신 또는 면역원성 조성물 중의 각각의 항원의 양은 각각의 다른 성분과 관련하여 다양할 것이고, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 면역원성 및/또는 생체내 효능을 측정하는 과정을 포함할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 피막 폴리사카라이드 또는 당접합체와 특이적이고도 선택적으로 결합하는 항체 및 항체 조성물을 제공한다. 이러한 일부 실시양태에서, 본 발명은 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F 피막 폴리사카라이드 또는 이를 포함하는 당접합체와 특이적이고도 선택적으로 결합하는 항체 및 항체 조성물을 제공한다. 이러한 다른 실시양태에서, 본 발명은 Mn-혈청형 A, C, W135 또는 Y 피막 폴리사카라이드 또는 이를 포함하는 당접합체와 특이적이고도 선택적으로 결합하는 항체 및 항체 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 피막 폴리사카라이드 또는 당접합체를 대상체에게 투여시 항체가 생성된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 피막 폴리사카라이드 또는 당접합체 중 하나 이상에 대해 생성된 정제되거나 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 동물 효능 모델에서 또는 옵소닌 식세포 사멸 검정을 통해 박테리아를 사멸시킴으로써 측정된 바와 같이 기능적이다. 본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 생성하고, 특정 대상체에게 수동 면역을 부여하기 위하여 상기 항체 또는 항체 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 대상체에서 병원성 박테리아, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 또는 엔. 메닌기티디스 박테리아와 연관된 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한, 진단 방법, 예를 들어 피막 폴리사카라이드 또는 그의 당접합체의 존재를 검출하거나 또는 그의 수준을 정량화하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또한, Pn 또는 Mn 피막 폴리사카라이드 또는 그의 당접합체의 존재를 검출하거나 또는 그의 수준을 정량화하는 데 유용할 수 있으며, 상기 당접합체는 eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 몇 가지 검정 및 동물 모델을 사용하여 본원에 기재된 면역원성 조성물 중 어느 하나의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chiavolini et al. Clin . Microbiol . Rev. (2008), 21(4):666-685]에는 에스. 뉴모니아에 질환의 동물 모델이 기재되어 있다. 문헌 [Gorringe et al. METHODS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 66 (2001), Chapter 17, Pollard and Maiden eds. (Humana Press Inc.)]에는 수막구균성 질환에 대한 동물 모델이 기재되어 있다.
옵소닌 식세포 활성 ( OPA ) 검정
OPA 검정 과정은 다음 변형을 수반한 문헌 [Hu, et al. (Clin . Diagn . Lab. Immunol. 2005; 12(2):287-95)]에 앞서 기재된 방법에 기초하였다. 열 불활성화 혈청을 완충제에서 2.5배로 일련으로 희석시켰다. 표적 박테리아를 흑색 플레이트에 첨가하고, 진탕기 상에서 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 어린 토끼 보체 (3주 내지 4주령, 펠-프리즈(Pel-Freez), 12.5% 최종 농도) 및 분화된 HL-60 세포를 거의 정확한 효과기에서 200:1의 표적 비가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 흑색 플레이트를 진탕기 상에서 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 종결시키기 위하여, 80 ㎕의 0.9% NaCl을 모든 웰에 첨가하고, 혼합하며, 10 ㎕의 분취액을, 200 ㎕의 물을 함유하는 밀리포어(Millipore), 멀티스크린(MultiScreen)HTS HV 필터 플레이트의 웰에 옮겼다. 액체를 진공 하에 상기 플레이트를 통해 여과시키고, 150 ㎕의 하이소이(HySoy) 배지를 각 웰에 첨가하고 여과시켰다. 이어서, 필터 플레이트를 37℃, 5% CO2 하에 밤새 인큐베이션한 다음, 데스타인(Destain) 용액 (바이오-라드(Bio-Rad))으로 고정시켰다. 이어서, 상기 플레이트를 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색시키고 1회 탈염시켰다. 콜로니를 영상화하고, 셀룰러 테크놀로지 리미티드 (CTL) 임뮤노스폿 어날라이저(Cellular Technology Limited (CTL) ImmunoSpot Analyzer)® 상에서 열거하였다. OPA 항체 역가를, 면역 혈청을 함유하지 않은 대조군 웰과 비교한 경우 박테리아 콜로니 수에 있어서 50% 감소 지점을 포괄하는 두 혈청 희석액의 역수로부터 외삽하였다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 설명한다. 다음의 구체적 실시예를 참조로 하여 보다 완전하게 이해할 수 있다. 이들 실시예는 단지 예시 목적으로 기재된 것이고 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1. eTEC 연결된 당접합체의 일반적 제조 공정
사카라이드의 활성화 및 시스타민 디히드로클로라이드를 이용한 티올화
사카라이드를 무수 디메틸술폭시드 (DMSO)에서 재구성한다. 용액의 수분 함량은 칼 피셔[Karl Fischer (KF)] 분석에 의해 결정하고, 0.1 및 0.4%, 전형적으로 0.2%의 수분 함량에 도달하도록 조정한다.
활성화를 개시하기 위하여, 1,1'-카르보닐-디-1,2,4-트리아졸 (CDT) 또는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI)의 용액을 DMSO 중에서 100 mg/ml의 농도로 신선하게 제조한다. 사카라이드를 다양한 양의 CDT/CDI (1 내지 10 몰 당량)로 활성화시키고, 반응을 23 ± 2℃에서 1시간 동안 진행시켰다. 활성화 수준을 HPLC에 의해 결정할 수 있다. 시스타민 디히드로클로라이드를 50 mg/ml의 농도로 무수 DMSO 중에서 신선하게 제조한다. 활성화된 사카라이드를 1 몰 당량의 시스타민 디히드로클로라이드와 반응시킨다. 대안적으로, 활성화된 사카라이드를 1 몰 당량의 시스테아민 디히드로클로라이드와 반응시킨다. 티올화 반응을 23 ± 2℃에서 21 ± 2시간 동안 진행시켜 티올화 사카라이드를 생성하였다. 티올화 수준을 부가된 양의 CDT/CDI에 의해 결정한다.
100 mM 사붕산나트륨, pH 9.0 용액을 부가함으로써 활성화 반응 용액 중의 잔류 CDT/CDI를 켄칭한다. 사붕산염의 부가 양을 결정하고 최종 수분 함량이 총 수용액의 1 내지 2% 이하가 되도록 조정하기 위한 계산을 수행한다.
활성화된 티올화 사카라이드의 환원 및 정제
티올화 사카라이드 반응 혼합물을 0.9% 염수, pH 6.0 중의 예비-냉각된 5 mM 소듐 숙시네이트에 부가함으로써 10배 희석시키고, 5 ㎛ 필터를 통해 여과시킨다. WFI의 40배 정용여과부피에 대해 티올화 사카라이드의 정용여과를 수행한다. 10% 용적의 0.1 M 인산나트륨 완충제, pH 6.0에 의해 희석시킨 후, 상기 잔류물에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 1 내지 5 몰 당량의 용액을 첨가한다. 이러한 환원 반응을 5 ± 3℃에서 20 ± 2시간 동안 진행시킨다. 활성화된 티올화 사카라이드의 정제는 바람직하게, 예비-냉각된 10 mM 일염기성 인산나트륨, pH 4.3에 대해 한외여과/정용여과시킴으로써 수행한다. 대안적으로, 티올화 사카라이드를 표준 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 과정 또는 이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해 정제한다. 활성화된 티올화 사카라이드 잔류물의 분취액을 추출하여 사카라이드 농도와 티올 함량 (엘만(Ellman)) 검정을 결정한다.
활성화된 티올화 사카라이드의 또 다른 환원 및 정제
상기 언급된 정제 과정에 대한 대안으로서, 활성화된 티올화 사카라이드를 또한 다음과 같이 정제하였다.
티올화 사카라이드 반응 혼합물에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 5 내지 10 몰 당량의 용액을 첨가하고 23 ± 2℃에서 3 ± 1시간 동안 진행시켰다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 0.9% 염수, pH 6.0 중의 예비-냉각된 5 mM 소듐 숙시네이트에 부가함으로써 5배 희석시키고, 5 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 예비-냉각된 10 mM 일염기성 인산나트륨, pH 4.3의 40배 정용여과부피를 이용하여, 티올화 사카라이드의 정용여과를 수행하였다. 활성화된 티올화 사카라이드 잔류물의 분취액을 추출하여 사카라이드 농도와 티올 함량 (엘만) 검정을 결정하였다.
브로모아세틸화 운반 단백질의 활성화 및 정제
운반 단백질의 유리 아미노 기를 브로모아세틸화제, 예컨대 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (BAANS), 브로모아세틸브로마이드, 또는 또 다른 적합한 시약과 반응시킴으로써 브로모아세틸화시킨다.
운반 단백질 (0.1 M 인산나트륨, pH 8.0 ± 0.2 중)를 먼저, 활성화시키기에 앞서 약 pH 7에서 8 ± 3℃로 유지시킨다. 단백질 용액에 스톡 디메틸술폭시드 (DMSO) 용액 (20 mg/ml)으로서 브로모아세트산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (BAANS)를 0.25 내지 0.5의 BAANS:단백질 (w/w) 비로 첨가한다. 이 반응물을 5 ± 3℃에서 30 내지 60분 동안 온화하게 혼합한다. 이로써 생성된 브로모아세틸화 (활성화) 단백질을, 예를 들어 10 mM 인산염 (pH 7.0) 완충제를 이용하는 10 kDa MWCO 막을 사용하여 한외여과/정용여과함으로써 정제한다. 정제시킨 후, 브로모아세틸화 운반 단백질의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 단백질 검정에 의해 평가한다.
억제 전도도 검출 (이온 크로마토그래피)와 결부된 이온-교환 액체 크로마토그래피에 의한 총 브로마이드 검정에 의해 활성화 정도를 결정한다. 활성화된 브로모아세틸화 단백질 상의 결합된 브로마이드를 검정 샘플 제제 중의 단백질로부터 절단시키고, 존재할 수도 있는 모든 유리 브로마이드와 함께 정량화한다. 단백질 상의 공유 결합된 나머지 모든 브로마이드는 알칼리성 2-메르캅토에탄올 중의 샘플을 가열함으로써 이온성 브로마이드로 전환시킴으로써 방출시킨다.
브모로아세틸화 CRM 197 의 활성화 및 정제
CRM197을 10 mM 인산염 완충된 0.9% NaCl pH 7 (PBS)을 이용하여 5 mg/ml로 희석시킨 다음, 1 M 원액을 사용하여 0.1 M NaHCO3 pH 7.0을 만들었다. 20 mg/ml DMSO의 BAANS 원액을 이용하여 BAANS를 CRM197:BAANS 비 1:0.35 (w:w)로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3℃ 내지 11℃에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 10 K MWCO 막 및 10 mM 인산나트륨/0.9% NaCl, pH 7.0을 이용하여 한외여과/정용여과함으로써 정제하였다. 이와 같이 정제된 활성화 CRM197을 로우리 검정에 의해 검정하여 단백질 농도를 결정한 다음, PBS를 이용하여 5 mg/ml로 희석시켰다. 수크로스를 한랭보호제로서 5% wt/vol로 첨가하고, 활성화된 단백질을 동결시킨 다음, 접합을 위해 필요할 때까지 -25℃에서 저장하였다.
CRM197의 리신 잔기를 브로모아세틸화시키는 것은 매우 일관되었으며, 이로써 이용 가능한 39개 리신으로부터 15 내지 25개 리신이 활성화되었다. 이 반응으로, 활성화된 단백질이 고 수율로 생성되었다.
활성화된 티올화 사카라이드와 브로모아세틸화 운반 단백질의 접합
접합 반응을 시작하기 전에, 반응 용기를 5℃로 미리 냉각시킨다. 브로모아세틸화 운반 단백질 및 활성화된 티올화 사카라이드를 연속해서 첨가하고, 150 내지 200 rpm의 진탕 속도로 혼합한다. 사카라이드/단백질 유입 비는 0.9 ± 0.1이다. 1 M NaOH 용액을 이용하여 반응 pH를 8.0 ± 0.1로 조정한다. 접합 반응을 5℃에서 20 ± 2 시간 동안 진행시킨다.
잔류 반응성 관능기의 캡핑
운반 단백질 상의 반응되지 않은 브로모아세틸화 잔기를, 5℃에서 3시간 동안 캡핑 시약으로서 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 반응시킴으로써 켄칭한다. 잔류 유리 술프히드릴 기를 5℃에서 20시간 동안 4 몰 당량의 요오도아세트아미드 (IAA)로 캡핑한다.
eTEC -연결된 당접합체의 정제
접합 반응 (IAA 캡핑 후) 혼합물을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시킨다. 당접합체의 한외여과/정용여과를 5 mM 숙시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 수행한다. 이어서, 당접합체 잔류물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과시킨다. 검정을 위해 당접합체의 분취액을 추출한다. 나머지 당접합체를 5℃에서 저장한다.
실시예 2. Pn -33F eTEC 접합체의 제조
활성화 공정
Pn33F 폴리사카라이드의 활성화
Pn-33F 폴리사카라이드를 500 mM의 1,2,4-트리아졸 (WFI 중)과 화합하여 폴리사카라이드 1 그램당 10 그램의 트리아졸을 수득하였다. 혼합물을 드라이 아이스-에탄올 욕에서 쉘-냉동시킨 다음, 동결건조시켰다. 이와 같이 동결건조된 33F 폴리사카라이드를 무수 디메틸술폭시드 (DMSO)에서 재구성하였다. 동결건조된 33F/DMSO 용액의 수분 함량을 칼 피셔 (KF) 분석에 의해 결정하였다. WFI를 33F/DMSO 용액에 가함으로써 수분 함량을 조정하여 0.2%의 수분 함량에 도달하게 하였다.
활성화를 개시하기 위하여, 1,1'-카르보닐-디-1,2,4-트리아졸 (CDT)을 DMSO 용액 중의 100 mg/ml로서 신선하게 제조하였다. 티올화 단계 이전에 다양한 양의 CDT를 이용하여 Pn33F 폴리사카라이드를 활성화시켰다. 이러한 CDT 활성화는 23 ± 2℃에서 1시간 동안 수행하였다. 활성화 수준은 HPLC (A220/A205)에 의해 결정하였다. 사붕산나트륨 100 mM, pH 9.0 용액을 첨가하여, 활성화 반응 용액 중의 모든 잔류 CDT를 켄칭하였다. 사붕산염의 부가 양을 결정하고 최종 수분 함량이 총 수용액의 1.2%가 될 수 있도록 하기 위한 계산을 수행한다. 이 반응을 23 ± 2℃에서 1시간 동안 진행시켰다.
활성화 Pn -33F 폴리사카라이드의 티올화
시스타민-디히드로클로라이드를 무수 DMSO에서 신선하게 제조하고, 1 몰 당량의 시스타민 디히드로클로라이드를 상기 활성화 폴리사카라이드 반응 용액에 첨가하였다. 이 반응을 23 ± 2℃에서 21 ± 2시간 동안 진행시켰다. 티올화 사카라이드 용액을 0.9% 염수, pH 6.0 중의 예비-냉각된 5 mM 소듐 숙시네이트에 부가함으로써 10배 희석시켰다. 이와 같이 희석된 반응 용액을 5 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 주사용수 (WFI)를 이용하여, 100 K MWCO 한외여과기 막 카세트를 사용하여 티올화 Pn-33F 폴리사카라이드의 정용여과를 수행하였다.
CDT의 몰 당량의 함수로서 활성화 Pn-33F 폴리사카라이드의 티올화 수준이 도 8에 도시되어 있다.
활성화된 티올화 Pn -33F 폴리사카라이드의 환원 및 정제
10% 용적의 0.1 M 인산나트륨 완충제, pH 6.0에 의해 희석시킨 후, 상기 잔류물에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 5 몰 당량의 용액을 첨가하였다. 이러한 환원 반응을 23 ± 2℃에서 2 ± 1시간 동안 진행시켰다. 티올화 33F 폴리사카라이드의 정용여과는 100 K MWCO 한외여과기 막 카세트를 이용하여 수행하였다. 예비-냉각된 10 mM 인산나트륨, pH 4.3에 대해 정용여과를 수행하였다. 사카라이드 농도와 티올 (엘만) 검정 둘 다를 위해 티올화 33F 폴리사카라이드 잔류물을 추출하였다.
활성화된 티올화 Pn -33F 폴리사카라이드의 또 다른 환원 및 정제
상기 언급된 정제 과정에 대한 대안으로서, 활성화된 티올화 33F 사카라이드를 또한 다음과 같이 정제하였다.
티올화 사카라이드 반응 혼합물에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 5 몰 당량의 용액을 첨가하고 23 ± 2℃에서 3 ± 1시간 동안 진행시켰다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 0.9% 염수, pH 6.0 중의 예비-냉각된 5 mM 소듐 숙시네이트에 부가함으로써 5배 희석시키고, 5 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 100 K MWCO 한외여과기 막 카세트를 사용하고 예비-냉각된 10 mM 일염기성 인산나트륨, pH 4.3의 40배 정용여과부피를 이용하여, 티올화 사카라이드의 정용여과를 수행하였다. 사카라이드 농도와 티올 (엘만) 검정 둘 다를 위해 티올화 33F 폴리사카라이드 잔류물을 추출하였다. 그 활성화 공정의 흐름도가 도 7(A)에 제공되어 있다.
접합 공정
티올화 Pn -33F 폴리사카라이드와 브로모아세틸화 CRM 197 의 접합
CRM197 운반 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이, 브로모아세틸화에 의해 별개로 활성화시킨 다음, 접합 반응을 위해 상기 활성화 Pn-33F 폴리사카라이드와 반응시켰다. 접합 반응을 시작하기 전에, 반응 용기를 5℃로 미리 냉각시켰다. 브로모아세틸화 CRM197 및 티올화 33F 폴리사카라이드를 150 내지 200 rpm의 진탕 속도로 반응 용기에서 함께 혼합하였다. 사카라이드/단백질 유입 비는 0.9 ± 0.1이었다. 반응물 pH를 8.0 내지 9.0으로 조정하였다. 접합 반응을 5℃에서 20 ± 2 시간 동안 진행시켰다.
브롬화아세틸화 CRM 197 및 티올화 Pn33F 폴리사카라이드 상의 반응성 기의 캡핑
CRM197 단백질 상의 반응되지 않은 브로모아세틸화 잔기를, 5℃에서 3시간 동안 2 몰 당량의 N-아세틸-L-시스테인과 반응시킨 다음, 티올화 33F-폴리사카라이드의 모든 잔류 유리 술프히드릴 기를 5℃에서 20시간 동안 4 몰 당량의 요오도아세트아미드 (IAA)로 캡핑하였다.
eTEC -연결된 Pn -33F 당접합체의 정제
접합 용액을 0.45 ㎛ 또는 5 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 33F 당접합체의 정용여과를, 300K MWCO 한외여과기 막 카세트를 이용하여 수행하였다. 정용여과를 5 mM 숙시네이트-0.9% 염수, pH 6.0에 대해 수행하였다. 이어서, Pn-33F 당접합체 300K 잔류물을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시키고 5℃에서 저장하였다.
접합 공정의 흐름도가 도 7(B)에 제공되어 있다.
결과
Pn-33F eTEC 당접합체의 몇 가지 배치에 대한 반응 파라미터 및 특성화 데이터가 표 2에 제시되어 있다. 시스타민 디히드로클로라이드로 CDT 활성화-티올화하면, 63 내지 90% 사카라이드 수율과 <1% 내지 13% 유리 사카라이드를 갖는 당접합체가 생성되었다.
표 2. Pn33F eTEC 접합체의 실험적 파라미터 및 특성화 데이터
Figure pct00004
CRM 197 에 대한 Pn -33F eTEC 당접합체의 OPA 역가
마우스에서 Pn-33F OPA 역가를 표준 조건 하에 결정하였다. 4주 및 7주째의 OPA 역가 (95% CI를 갖는 GMT)가 표 3에 제시되어 있으며, 이는 혈청형 33F Pn 당접합체가 뮤린 면역원성 모델에서 OPA 역가를 유발시켰다는 것을 입증해준다.
표 3. Pn -33F OPA 역가 (95% CI를 갖는 GMT)
Figure pct00005
실시예 3. Pn -22F eTEC 접합체의 제조
활성화 공정
Pn -22F 폴리사카라이드의 활성화
Pn-22F 폴리사카라이드를 500 mM의 1,2,4-트리아졸 (WFI 중)과 화합하여 폴리사카라이드 1 그램당 10 그램의 트리아졸을 수득하였다. 혼합물을 드라이 아이스-에탄올 욕에서 쉘-냉동시킨 다음, 동결건조시켰다. 이와 같이 동결건조된 22F 폴리사카라이드를 무수 디메틸술폭시드 (DMSO)에서 재구성하였다. 동결건조된 22F/DMSO 용액의 수분 함량을 칼 피셔 (KF) 분석에 의해 결정하였다. WFI를 Pn-22F/DMSO 용액에 가함으로써 수분 함량을 조정하여 0.2%의 수분 함량에 도달하게 하였다.
활성화를 개시하기 위하여, 1,1'-카르보닐-디-1,2,4-트리아졸 (CDT)을 DMSO 용액 중의 100 mg/ml로서 신선하게 제조하였다. 다양한 양의 CDT를 이용하여 Pn-22F 폴리사카라이드를 활성화시킨 다음, 1 몰 당량의 시스타민 디히드로클로라이드로 티올화시켰다. 이러한 CDT 활성화는 23 ± 2℃에서 1시간 동안 수행하였다. 활성화 수준은 HPLC (A220/A205)에 의해 결정하였다. 사붕산나트륨 100 mM, pH 9.0 용액을 첨가하여, 활성화 반응 용액 중의 모든 잔류 CDT를 켄칭하였다. 사붕산염의 부가 양을 결정하고 최종 수분 함량이 총 수용액의 1.2%가 될 수 있도록 하기 위한 계산을 수행한다. 이 반응을 23 ± 2℃에서 1시간 동안 진행시켰다.
활성화 Pn -22F 폴리사카라이드의 티올화
시스타민-디히드로클로라이드를 무수 DMSO에서 신선하게 제조하고, 반응 용액에 첨가하였다. 이 반응을 23 ± 2℃에서 21 ± 2시간 동안 진행시켰다. 티올화 사카라이드 용액을 0.9% 염수, pH 6.0 중의 예비-냉각된 5 mM 소듐 숙시네이트에 부가함으로써 10배 희석시켰다. 이와 같이 희석된 반응 용액을 5 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 주사용수 (WFI)를 이용하여, 100 K MWCO 한외여과기 막 카세트를 사용하여 티올화 Pn-22F 폴리사카라이드의 정용여과를 수행하였다.
활성화된 티올화 Pn -22F 폴리사카라이드의 환원 및 정제
10% 용적의 0.1 M 인산나트륨 완충제, pH 6.0에 의해 희석시킨 후, 상기 잔류물에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 5 내지 10 몰 당량의 용액을 첨가하였다. 이러한 환원 반응을 23 ± 2℃에서 2 ± 1시간 동안 진행시켰다. 티올화 22F 폴리사카라이드의 정용여과는 100K MWCO 한외여과기 막 카세트를 이용하여 수행하였다. 예비-냉각된 10 mM 인산나트륨, pH 4.3에 대해 정용여과를 수행하였다. 사카라이드 농도와 티올 (엘만) 검정 둘 다를 위해 티올화 22F 폴리사카라이드 잔류물을 추출하였다.
Pn -22F eTEC 당접합체의 접합, 캡핑 및 정제
활성화된 티올화 Pn22F 폴리사카라이드와 활성화 CRM197의 접합, 캡핑, 및 Pn-22F eTEC 당접합체의 정제는 실시예 2에 기재된 공정에 따라서 수행하였다.
결과
CRM197과의 대표적인 Pn-22F eTEC 당접합체에 대한 특성화 및 공정 데이터가 표 4에 제공되어 있다.
표 4. Pn -22F eTEC 접합체의 실험적 파라미터 및 특성화 데이터
Figure pct00006
실시예 4. CRM 197 과의 Pn -10A eTEC 접합체의 제조
Pn -10A eTEC 당접합체의 제조
eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 접합된 폐렴구균성 피막 폴리사카라이드 혈청형 10A (Pn-10A)를 포함하는 당접합체를 실시예 2에 기재된 공정에 따라서 제조하였다.
Pn -10A eTEC 당접합체의 특성화
CRM197과의 대표적인 Pn-10A eTEC 당접합체에 대한 특성화 및 공정 데이터가 표 5에 제공되어 있다.
표 5. Pn -10A 당접합체의 실험적 파라미터 및 특성화 데이터
Figure pct00007
Pn -10A OPA 역가
마우스에서 CRM197과의 Pn-10A eTEC 접합체에 대한 OPA 역가를 표준 조건 하에 결정하였다. 용량의 함수로서의 OPA 역가가 표 6에 제시되어 있다. 이러한 OPA 역가는 접합되지 않은 혈청형 10A 폴리사카라이드와 비교하여 상기 접합체에 대해 상당히 더 놓았다.
표 6. Pn -10A OPA 역가 (95% CI를 갖는 GMT)
Figure pct00008
실시예 5. CRM 197 과의 Pn -11A eTEC 접합체의 제조
Pn -11A eTEC 당접합체의 제조
eTEC 스페이서를 통해 CRM197과 접합된 폐렴구균성 피막 폴리사카라이드 혈청형 11A (Pn-11A)를 포함하는 당접합체를 실시예 2에 기재된 공정에 따라서 제조하였다.
Pn -11A eTEC 당접합체의 특성화
CRM197과의 대표적인 Pn-11A eTEC 당접합체에 대한 특성화 및 공정 데이터가 표 7에 제공되어 있다.
표 7. Pn -11A 당접합체의 실험적 파라미터 및 특성화 데이터
Figure pct00009
Pn -11A OPA 역가
마우스에서 CRM197과의 Pn-11A eTEC 접합체에 대한 OPA 역가를 표준 조건 하에 결정하였다. 용량의 함수로서의 OPA 역가가 표 8에 제시되어 있다.
표 8. Pn -11A OPA 역가 (95% CI를 갖는 GMT)
Figure pct00010
실시예 6. CRM 197 과의 Pn -33F RAC /수성 접합체의 제조
Pn -33F RAC /수성 당접합체의 제조
폐렴구균성 접합체 백신을 생성하기 위해 성공적으로 적용되어 왔던 (예를 들어, WO 2006/110381 참조), 수성 상 중의 환원적 아민화 (RAC/수성)를 이용하여 Pn-33F 당접합체를 제조하였다. 이러한 접근 방식을 2가지 단계를 포함한다. 첫 번째 단계는 폴리사카라이드를 산화시켜 근접한 디올로부터 알데히드 관능기를 생성하는 것이다. 두 번째 단계는 활성화 폴리사카라이드를 CRM197의 리신 (Lys) 잔기와 접합시키는 것이다.
간략하게 언급하면, 냉동된 폴리사카라이드를 해동시키고, 상이한 양의 과요오드화 나트륨 (NaIO4)을 부가함으로써 인산나트륨 완충제 (pH 6.0)에서 산화를 수행하였다. 활성화된 폴리사카라이드의 농축 및 정용여과를 수행하였고, 정제된 활성화 폴리사카라이드를 4℃에서 저장하였다. 활성화 폴리사카라이드를 CRM197 단백질과 화합하였다. 병을 드라이 아이스/에탄올 욕에 놓아두기 전에 폴리사카라이드와 CRM197을 철저하게 혼합한 다음, 이러한 폴리사카라이드/CRM197 혼합물을 동결건조시켰다. 이와 같이 동결건조된 혼합물을 0.1 M 인산나트륨 완충제에서 재구성하였다. 1.5 몰 당량의 소듐 시아노보로히드라이드를 부가하고 23℃에서 20시간 동안 인큐베이션하고 37℃에서 44시간 더 인큐베이션함으로써 접합 반응을 개시하였다. 이 반응물을 1x 용적의 0.9% 염수로 희석시키고, 2 몰 당량의 수소화붕소 나트륨을 이용하여 23℃에서 3시간 동안 캡핑하였다. 반응 혼합물을 1x 용적의 0.9% 염수로 희석시킨 다음, 정제하기에 앞서 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 100K MWCO UF 막 카세트를 이용하여, 상기 접합체의 농축 및 정용여과를 수행하였다.
상이한 파라미터 (예를 들어, pH, 반응물의 온도 및 폴리사카라이드의 농도)를 다양하게 함으로써 상기 언급된 공정을 이용하여 몇 가지 접합체를 수득하였다.
이들 접합체에 대한 전형적인 폴리사카라이드 수율은 대략 50%였고, 2,000 내지 3,500 kDa 범위의 접합체 MW의 경우에는 유리 사카라이드가 15%였다.
그러나, 천연 혈청형 33F 폴리사카라이드는 5-갈락토푸라노실 잔기의 C2 상에 O-아세틸 기를 보유하고 있고, 이러한 아세틸 관능기의 대략 80%가 수성 상 중의 환원적 아민화를 이용한 접합 공정 내내 제거되는 것으로 밝혀졌다. 5개 구성원 고리 구조 (5-갈락토푸라노시드) 상의 O-아세틸 기를 이동시킬 수 있고, 수성 상 중의 환원적 아민화 화학 공정을 이용하여 이를 용이하게 제거할 수 있는 것으로 관찰되었다.
Pn -33F RAC /수성 당접합체 안정성의 평가
상기 공정에 의해 제조된 대표적인 RAC/수성 접합체의 분취액을 폴리프로필렌 튜브 내로 분배하였다. 이들 튜브를 25℃ 또는 37℃에서 저장하고, 3.5개월까지 안정성을 모니터링하였다. 각 안정성 시점에, % 유리 사카라이드 수준을 평가하였다. 양 온도에서의 안정성 데이터가 표 9에 요약되어 있다. 표 9에 제시된 바와 같이, % 유리 사카라이드 수준은 25℃ 및 37℃에서 상당히 증가되었다. 저장 동안 % 유리 사카라이드 수준이 증가하는 것은 접합체 중의 폴리사카라이드가 분해된다는 잠재적 지표이다.
표 9. 25℃ 및 37℃에서서 RAC /수성 접합체에 대한 안정성 데이터
Figure pct00011
wk= 주; M=개월.
혈청형 33F 폴리사카라이드를 과요오드화 나트륨과의 반응에 의해 성공적으로 활성화시킨 다음, 수성 환원적 아민화 화학을 활용하여 CRM197과 접합시키긴 하였지만, 접합 동안 아세틸 관능기 (면역원성을 위한 주요 폴리사카라이드 에피토프)를 보존할 수 없다는 것과 더불어 가속화된 조건 하에서의 % 유리 사카라이드 안정성 결과는, RAC/수성 공정이 혈청형 33F 접합을 위한 최적의 공정이 아니라는 것을 제안하였다.
실시예 7. CRM 197 과의 Pn -33F RAC / DMSO 접합체의 제조
Pn -33F RAC / DMSO 당접합체의 제조
RAC/수성 공정과 비교하여, DMSO 중에서의 환원적 아민화 (RAC/DMSO)를 통해 수행된 접합은 일반적으로, 상당히 더 낮은 탈-O-아세틸화 확률을 갖고 있다. 실시예 6에 기재된 RAC/수성 공정을 이용하여 O-아세틸 관능기를 보존하는 것과 연관된 문제의 관점에서, 폐렴구균성 접합체 백신을 생성하기 위해 성공적으로 적용되어 왔던 (예를 들어, WO 2006/110381 참조) RAC/DMSO 용매를 이용한 또 다른 접근 방식을 평가하였다.
활성화 폴리사카라이드를, 이러한 활성화 폴리사카라이드 1 그램당 수크로스 25 그램의 비를 이용하여 수크로스 (WFI 중 50% w/v)와 화합하였다. 이 성분들을 드라이 아이스/에탄올 욕에서 쉘 냉동시키기에 앞서 잘 혼합하였다. 이어서, 화합된 혼합물의 쉘-냉동된 병을 동결건조시켰다.
동결건조시킨 활성화 폴리사카라이드를 디메틸 술폭시드 (DMSO)에서 재구성하였다. 재구성하기 위하여 DMSO를 동결건조된 CRM197에 첨가하였다. 재구성된 활성화 폴리사카라이드를 반응 용기 내에서 재구성된 CRM197과 합하였다. NaCNBH3을 반응 혼합물에 가함으로써 접합을 개시하였다. 이 반응물을 23℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. NaBH4를 부가함으로써 접합 (캡핑) 반응을 종결시켰고, 그 반응을 3시간 더 지속하였다. 반응 혼합물을 4배 용적의 5 mM 숙시네이트-0.9% 염수, pH 6.0 완충제로 희석시킨 다음, 정제하기에 앞서 5 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 100K MWCO 막을 이용하여 접합체의 농축 및 정용여과를 수행하였다. 40배 정용여과부피의 5 mM 숙시네이트-0.9% 염수, pH 6.0 완충제에 대해 정용여과를 수행하였다. 잔류물을 0.45 및 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시킨 다음 분석하였다.
상이한 파라미터 (예를 들어, 사카라이드-단백질 유입 비, 반응물 농도, 소듐 시아노보로히드라이드의 몰 당량, 및 수분 함량)를 다양하게 함으로써 상기 언급된 공정을 이용하여 몇 가지 접합체를 수득하였다. RAC/DMSO 공정에 의해 제조된 접합체로부터 생성된 전반적인 데이터는 RAC/수성 공정과 비교하여 탁월한 것으로 입증되었고, 우수한 접합 수율, 낮은 % 유리 사카라이드 (<5%) 및 보다 높은 접합도 (접합된 리신)를 지닌 접합체를 제조할 수 있었다. 부가적으로, RAC/DMSO 접합 공정 내내 80% 초과의 아세틸 관능기를 보존시키는 것이 가능하였다.
Pn -33F RAC / DMSO 당접합체 안정성의 평가
상기 공정에 의해 제조된 대표적인 RAC/DMSO 접합체의 분취액을 폴리프로필렌 튜브 내로 분배하였고, 이들을 4℃ 또는 25℃에서 저장하고, 3개월 동안 유리 사카라이드를 대상으로 하여 안정성을 모니터링하였다. 표 10에 제시된 바와 같이, 4℃에서 저장된 샘플은 3개월 내에 유리 사카라이드가 4.8% 정도 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 25℃에서 저장된 샘플은 3개월 내에 % 유리 사카라이드가 15.4% 증가한 것으로 나타났다. RAC 접합체 중의 % 유리 사카라이드가 증가하는 것은 특히 25℃에서서 접합체의 분해에 기인한 것이다.
표 10. 4℃ 및 25℃에서서 RAC / DMSO 접합체에 대한 안정성 결과
Figure pct00012
wk= 주; M=개월.
또 다른 로트의 RAC/DMSO 접합체의 안정성을 또한, 4℃, 25℃ 및 37℃에서서 연구하였다. 분취액을 폴리프로필렌 튜브 내로 분배하고, % 유리 사카라이드 상의 잠재적 경향을 알아보기 위하여 모니터링하였다. 표 11에 제시된 바와 같이, 4℃에서 저장된 샘플은 2개월 이내에 % 유리 사카라이드가 4.7% 증가한 것으로 나타났다. 유리 사카라이드가 증가하는 것은 25℃ 및 37℃에서서 상당히 더 높았으며, 이는 접합체가 잠재적으로 분해되었다는 것을 표시한다.
표 11. 4℃, 25℃ 및 37℃에서서 RAC / DMSO 접합체에 대한 안정성 결과
Figure pct00013
wk= 주; M=개월.
RAC/DMSO 공정에 의해 생성된 접합체가 O-아세틸 기를 보존하긴 하였지만, 특히 25℃ 및 그 이상에서 관찰된 % 유리 사카라이드 상의 증가는 이러한 경로를 이용한 잠재적 불안정성을 표시하였다. 이러한 RAC/DMSO 접합체의 잠재적 불안정성이 관찰된다는 관점에서, RAC/DMSO는 혈청형 33F 접합에 대해 최적인 것으로 보여지지 않으므로, 보다 안정한 접합체 (eTEC 접합체)를 생성하기 위한 대체 화학 경로를 개발하였다.
실시예 8. 부가의 Pn -33F eTEC 접합체의 제조
실시예 2에 기재된 공정을 이용하여 부가의 Pn-33F eTEC 접합체를 생성하였다. 이들 Pn-33F eTEC 당접합체의 부가 배치에 대한 반응 파라미터 및 특성화 데이터가 표 12에 제시되어 있다.
표 12. 추가의 Pn33F eTEC 접합체의 실험적 파라미터 및 특성화 데이터
Figure pct00014
LOQ=정량화의 한계치.
상기 및 표 12에 제시된 바와 같이, 상기 eTEC 접합을 이용하여 몇 가지 Pn33F 접합체를 수득하였다. eTEC 화학은 고 수율, 낮은 % 유리 사카라이드 및 높은 접합도 (접합된 리신)를 지닌 접합체를 제조할 수 있게 해주었다. 부가적으로, eTEC 접합 공정을 이용하여 80% 초과의 아세틸 관능기를 보존시키는 것이 가능하였다.
실시예 9. Pn -33F eTEC 당접합체 안정성의 평가: % 유리 사카라이드 경향
접합체 배치 33F-2B (표 2 참조)의 분취액을 폴리프로필렌 튜브 내로 분배하고, 4℃, 25℃ 및 37℃에서서 각각 저장한 다음, % 유리 사카라이드 상의 경향을 알아보기 위하여 모니터링하였다. 그 데이터 (% 유리 사카라이드)가 표 13에 제시되어 있다. 이 표에 나타낸 바와 같이, % 유리 사카라이드 상의 상당한 변화가 없었다.
표 13. 4℃, 25℃ 및 37℃에서서 Pn -33F eTEC 당접합체에 대한 % 유리 사카 라이드 안정성
Figure pct00015
wk= 주; M=개월.
또 다른 접합체 로트 (배치 33F-3C)의 가속화된 안정성을 또한, 37℃에서 1개월까지 수행하였다. 표 14에 제시된 바와 같이, 1개월까지 37℃에서 % 유리 사카라이드에 대한 상당한 변화가 전혀 없었다.
표 14. 37℃에서서 Pn -33F eTEC 당접합체에 대한 % 유리 사카라이드 안정성
Figure pct00016
eTEC 접합체의 안정성을 추가로 확증하기 위하여, 4℃에서 저장된 부가의 접합체 배치 (33F-3C 및 33F-5E (표 2 및 표 12 참조))를 대상으로 하여 % 유리 사카라이드 상의 잠재적 경향을 알아보기 위하여 대략 1년까지 모니터링하였다. 표 15에 제시된 바와 같이, 대략 1년까지의 연장된 기간 동안 4℃에서 저장된 접합체에 대한 % 유리 사카라이드 수준 상의 상당한 변화가 전혀 없었다.
표 15. 4℃에서서 Pn -33F eTEC 당접합체에 대한 % 유리 사카라이드 안정성 결과
Figure pct00017
M=개월
RAC/수성 및 RAC/DMSO 접합체와 달리, 33F eTEC 화학에 의해 생성된 혈청형 33F 접합체는 다양한 온도 하에 유리 사카라이드 경향으로 모니터링된 바와 같이 인지할 만한 분해 없이 상당히 더 안정적인 것으로 입증되었다 (실시간 및 가속).
본 명세서에 언급된 모든 공개 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자의 수준을 시사한다. 모든 공개 공보 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고도 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
전술된 발명이 명료하게 이해시킬 목적으로 예시 및 실시예로써 일부 상세히 기재되긴 하였지만, 특정의 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 범위내에서 실시될 수 있다.

Claims (62)

  1. a) 사카라이드를 유기 용매 중에서 1,1'-카르보닐-디-(1,2,4-트리아졸) (CDT) 또는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI)과 반응시켜 활성화 사카라이드를 생성하는 단계;
    b) 상기 활성화 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시켜 티올화 사카라이드를 생성하는 단계;
    c) 상기 티올화 사카라이드를 환원제와 반응시켜 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화 사카라이드를 생성하는 단계;
    d) 상기 활성화된 티올화 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화 운반 단백질과 반응시켜 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및
    e) 상기 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 (i) 상기 활성화 운반 단백질의 접합되지 않은 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약; 및/또는 (ii) 접합되지 않은 유리 술프히드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시킴으로써, eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 단계
    를 포함하는, (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 사카라이드를 포함하는 당접합체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 캡핑 단계 e)가 티올화 사카라이드-운반 단백질 접합체를 (i) 제1 캡핑 시약으로서의 N-아세틸-L-시스테인, 및/또는 (ii) 제2 캡핑 시약으로서의 요오도아세트아미드와 반응시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트리아졸 또는 이미다졸과의 반응에 의해 사카라이드를 화합시켜 화합된 사카라이드를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 화합된 사카라이드는 단계 a) 이전에 쉘 냉동되고, 동결건조되며 유기 용매 중에서 재구성되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 생성된 티올화 폴리사카라이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 정제 단계는 정용여과를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 환원제가 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT) 또는 메르캅토에탄올인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 운반 단백질이 활성화 브로모아세트산 유도체로 활성화되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 브로모아세트산 유도체가 브로모아세트산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (BAANS)인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, eTEC 연결된 당접합체를 정용여과에 의해 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 유기 용매가 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 아세토니트릴, 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2(1H)-피리미디논 (DMPU) 및 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 극성 비양성자성 용매인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)가 0.2 내지 4인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)가 0.4 내지 1.7인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae)로부터 유래된 피막 폴리사카라이드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 폐렴구균성 (Pn) 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 33F 피막 폴리사카라이드인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 22F 피막 폴리사카라이드인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 10A 피막 폴리사카라이드인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 11A 피막 폴리사카라이드인 방법.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)로부터 유래된 피막 폴리사카라이드인 방법.
  19. 제19항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 수막구균성 (Mn)-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 운반 단백질이 CRM197인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 당접합체.
  22. 제21항의 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물.
  23. eTEC 스페이서를 통해 운반 단백질과 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하며, 여기서 상기 폴리사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 연결되고, 상기 운반 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서와 공유 연결되는 것인 당접합체.
  24. 제23항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 에스. 뉴모니아에로부터 유래되는 것인 당접합체.
  25. 제24항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 당접합체.
  26. 제25항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 33F 피막 폴리사카라이드인 당접합체.
  27. 제25항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 22F 피막 폴리사카라이드인 당접합체.
  28. 제25항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 10A 피막 폴리사카라이드인 당접합체.
  29. 제25항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 11A 피막 폴리사카라이드인 당접합체.
  30. 제23항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 엔. 메닌기티디스로부터 유래되는 것인 당접합체.
  31. 제30항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 Mn-혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 당접합체.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 10 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는 것인 당접합체.
  33. 제32항에 있어서, 폴리사카라이드가 50 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는 것인 당접합체.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 50 kDa 내지 20,000 kDa의 분자량을 갖는 당접합체.
  35. 제34항에 있어서, 500 kDa 내지 10,000 kDa의 분자량을 갖는 당접합체.
  36. 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 75 내지 100%의 O-아세틸화도를 갖는 것인 당접합체.
  37. 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 운반 단백질이 CRM197인 당접합체.
  38. 제37항에 있어서, CRM197이 eTEC 스페이서를 통해 폴리사카라이드와 공유 연결된 2 내지 20개 리신 잔기를 포함하는 것인 당접합체.
  39. 제37항에 있어서, CRM197이 eTEC 스페이서를 통해 폴리사카라이드와 공유 연결된 4 내지 16개 리신 잔기를 포함하는 것인 당접합체.
  40. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)가 0.2 내지 4인 당접합체.
  41. 제40항에 있어서, 사카라이드:운반 단백질 비 (w/w)가 0.4 내지 1.7인 당접합체.
  42. 제37항에 있어서, CRM197과 사카라이드 사이의 적어도 하나의 연결이 사카라이드의 25개 사카라이드 반복 단위마다 존재하는 것인 당접합체.
  43. 제37항에 있어서, CRM197과 사카라이드 사이의 적어도 하나의 연결이 사카라이드의 15개 사카라이드 반복 단위마다 존재하는 것인 당접합체.
  44. 제37항에 있어서, CRM197과 사카라이드 사이의 적어도 하나의 연결이 사카라이드의 10개 사카라이드 반복 단위마다 존재하는 것인 당접합체.
  45. 제37항에 있어서, CRM197과 사카라이드 사이의 적어도 하나의 연결이 사카라이드의 4개 사카라이드 반복 단위마다 존재하는 것인 당접합체.
  46. 제23항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 사카라이드의 총량과 비교하여 15% 미만의 유리 사카라이드를 포함하는 당접합체.
  47. 제23항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, ≤0.3에서 ≥35%의 분자 크기 분포도 (Kd)를 갖는 당접합체.
  48. 제23항 내지 제47항 중 어느 한 항의 당접합체 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 부가의 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 부가의 항원이 단백질 항원, 또는 에스. 뉴모니아에로부터 유래된 피막 폴리사카라이드의 당접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 부가의 항원이 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드의 당접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  52. 제49항에 있어서, 부가의 항원이 단백질 항원, 또는 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 피막 폴리사카라이드의 당접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 부가의 항원이 혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드의 당접합체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 아주반트가 알루미늄계 아주반트인 면역원성 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 알루미늄계 아주반트가 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 감염, 질환 또는 상태가 에스. 뉴모니아에 박테리아와 연관되고, 당접합체가 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 감염, 질환 또는 상태가 엔. 메닌기티디스 박테리아와 연관되고, 당접합체가 혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 방법.
  60. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 박테리아 피막 폴리사카라이드가 Pn-혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 박테리아 피막 폴리사카라이드가 혈청형 A, C, W135 및 Y 피막 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 피막 폴리사카라이드인 방법.
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