BR112015003227B1 - método de fabricação de um glicoconjugado compreendendo um sacarídeo conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador (2-((2-oxoetil)tio)etil)carbamato (etec), glicoconjugado e composição imunogênica - Google Patents

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Abstract

PROCESSOS DE GLICOCONJUGAÇÃO E COMPOSIÇÕES. A invenção proporciona glicoconjugados ligados por eTEC que compreendem um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína veículo por meio de um espaçador de (2-((2- oxoetil)tio)etil)carbamato (ETEC), composições imunogênicas compreendendo tais glicoconjugados e métodos para o preparo e uso destes glicoconjugados e composições imunogênicas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A invenção refere-se, de modo geral, a glicoconjugados que compreendem um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador (2-((2- oxoetil)tio)etil)carbamato (eTEC), à composições imunogênicas compreendendo tais glicoconjugados e a métodos para preparo e uso de tais glicoconjugados e composições imunogênicas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A abordagem para aumentar a imunogenicidade de moléculas fracamente imunogênicas por meio de conjugação destas moléculas à moléculas "veículo" tem sido utilizada com sucesso durante décadas (vide, por exemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53). Por exemplo, foram descritas muitas composições imunogênicas nas quais polímeros capsulares purificados foram conjugados à proteínas veículo para criar composições imunogênicas mais eficazes ao explorar este "efeito veículo" (Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591). Também foi mostrado que a supera a fraca resposta de anticorpo normalmente observada em lactentes quando imunizados com um polissacarídeo livre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).
[0003] Conjugados foram gerados com sucesso usando vários reagentes de reticulação ou acoplamento, tais como agentes de reticula- ção homobifuncionais, heterobifuncionais ou de comprimento zero. Vários métodos estão disponíveis para acoplamento de moléculas imu- nogênicas, tais como sacarídeos, proteínas e peptídeos, a veículos peptídicos ou proteicos. A maioria dos métodos criam ligações de ami- na, amida, uretano, isotioureia ou dissulfureto ou, em alguns casos, tioéteres. Uma desvantagem no uso de reagentes de reticulação ou acoplamento os quais introduzem sítios reativos nas cadeias laterais de moléculas de aminoácidos reativas sobre as moléculas veículo e/ou imunogênicas é que os sítios reativos, se não neutralizados, estão livres para reagir com qualquer molécula indesejada, quer in vitro (assim, afetando de modo potencialmente adverso a funcionalidade ou estabilidade dos conjugados) ou in vivo (assim, representando um risco potencial de eventos adversos em pessoas ou animais imunizados com os preparados). Tais sítios reativos em excesso podem ser reagi-dos ou "capped", de modo a inativar estes sítios usando várias reações químicas conhecidas, mas estas reações podem, de outro modo, ser prejudiciais para a funcionalidade dos conjugados. Isto pode ser particularmente problemático quando se tenta criar um conjugado através de introdução de sítios reativos na molécula veículo, uma vez que seu maior tamanho e estrutura mais complexa (em relação à molécula imunogênica) podem torná-la mais vulnerável aos efeitos negativos de tratamento químico. Assim, permanece uma necessidade por novos métodos para preparar conjugados de proteína transportadora com um "cap" apropriado, de modo que a funcionalidade do veículo seja preservada e o conjugado retenha a capacidade de desencadear a resposta imune desejada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] A presente invenção é dirigida a métodos de preparo de glicoconjugados que compreendem um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora através de um ligante hete- robifuncional bivalente dito aqui como um espaçador (2-((2- oxoetil)tio)etil)carbamato (ETEC). O espaçador eTEC inclui sete áto- mos lineares (isto é, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-) e fornece ligações de tioéter e amida estáveis entre a proteína transportadora e o sacarídeo. A invenção proporciona ainda glicoconjugados ligados por eTEC, composições imunogênicas compreendendo os mesmos e métodos para uso de tais glicoconjugados e composições imunogênicas.
[0005] Em um aspecto, a invenção proporciona um glicoconjugado que compreende um sacarídeo conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC, em que o sacarídeo é covalen- temente ligado ao espaçador eTEC através de uma ligação de carbamate e em que a proteína transportadora é covalentemente ligada ao espaçador eTEC através de uma ligação de amida.
[0006] Em algumas modalidades, o sacarídeo é um polissacarí- deo, tal como um polissacarídeo capsular derivado de bactérias, em particular de bactérias patogênicas. Em outras modalidades, o sacarídeo é um oligossacarídeo ou um monossacarídeo. Os glicoconjugados ligados por eTEC da invenção podem ser representados pela fórmula geral (I):
Figure img0001
[0007] em que os átomos que compreendem o espaçador eTEC estão contidos (I),
[0008] em que os átomos que compreendem o espaçador eTEC estão contidos no retângulo central.
[0009] As proteínas veículo incorporadas nos glicoconjugados da invenção são selecionadas do grupo de proteínas veículo geralmente adequadas para tais finalidades, conforme ainda descrito aqui ou conhecido por aqueles versados na técnica. Em modalidades particula- res, a proteína transportadora é CRM197.
[00010] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de fabricação de um glicoconjugado que compreende um sacarídeo conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC compreendendo as etapas de: a) reação de um sacarídeo com um derivado de ácido carbônico em um solvente orgânico para produzir um sacarídeo ativado; b) reação do sacarídeo ativado com cistami- na ou cisteamina ou um sal da mesma para produzir um sacarídeo tio- lado; c) reação do sacarídeo tiolado com um agente redutor para produzir um sacarídeo tiolado ativado compreendendo um ou mais resíduos de sulfidrila livres; d) reação do sacarídeo tiolado ativado com uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a-haloacetamida para produzir um conjugado sacarídeo tiolado- proteína transportadora; e e) reação do conjugado de sacarídeo tiola- do-proteína transportadora com (i) um primeiro reagente de "capping" capaz de "capping" de grupos a-haloacetamida não conjugados da proteína transportadora ativada; e/ou (ii) um segundo reagente de "capping" capaz de "capping" de resíduos de sulfidrila livres não conjugados do sacarídeo tiolado ativado; em que um glicoconjugado ligado por eTEC é produzido.
[00011] Em modalidades frequentes, 0 derivado do ácido carbônico é 1,1'-carbonil-di-(1,2,4-triazola) (CDT) ou 1,T-carbonildi-imidazola (CDI). De preferência, 0 derivado de ácido carbônico é CDT e 0 solvente orgânico é um solvente aprótico polar, tal como sulfóxido de di- metila (DMSO). Em modalidades preferidas, 0 sacarídeo tiolado é produzido por meio de reação do sacarídeo ativado com 0 reagente bifun- cional simétrico tioalquilamina, cistamina ou um sal das mesmas. Alternativamente, 0 sacarídeo tiolado pode ser formado por meio de reação do sacarídeo ativado com cisteamina ou um sal da mesma. Os glicoconjugados ligados por eTEC produzidos pelos métodos da in- venção podem ser representados pela fórmula geral (I).
[00012] Em modalidades frequentes, o primeiro reagente de "capping" é N-acetil-L-cisteína, a qual reage com grupos a-haloacetamida não conjugados dos resíduos de lisina da proteína transportadora para formar um resíduo de S-carboximetilcisteína (CMC) covalentemente ligado ao resíduo de lisina ativado através uma ligação de tioéter. Em outras modalidades, o segundo reagente de "capping" é iodoacetami- da (IAA), a qual reage com grupos sulfidrila livres não conjugados do sacarídeo tiolado ativado para proporcionar uma tioacetamida "cap-ped". Frequentemente, a etapa e) compreende tanto "capping" com um primeiro reagente de "capping" quanto um segundo reagente de "capping". Em determinadas modalidades, a etapa e) compreende "capping" com N-acetil-L-cisteína como o primeiro reagente e "capping" com IAA como o segundo reagente de "capping".
[00013] Em algumas modalidades, a etapa de "capping" e) compreende ainda reação com um agente redutor, por exemplo, DTT, TCEP ou mercaptoetanol, após reação com o primeiro e/ou segundo reagente de "capping".
[00014] Em algumas modalidades, a etapa d) compreende ainda fornecimento de uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a-haloacetamida antes de reação do sacarídeo tiolado ativado com a proteína transportadora ativada. Em modalidades frequentes, a proteína transportadora ativada compreende um ou mais grupos a-bromoacetamida.
[00015] Em outro aspecto, a invenção proporciona um glicoconju- gado que compreende um sacarídeo ligado por eTEC conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC produzido de acordo com qualquer dos métodos descritos aqui.
[00016] Para cada um dos aspectos da invenção, em modalidades particulares dos métodos e composições descritos aqui, o glicoconju- gado ligado por eTEC compreende um sacarídeo o qual é um polissa- carídeo capsular bacteriano, em particular um polissacarídeo capsular derivado de bactérias patogênicas.
[00017] Em algumas de tais modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC compreende um polissacarídeo capsular pneumocócico (Pn) derivado de Streptococcus pneumoniae. Em modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F.
[00018] Em outras modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC compreende um polissacarídeo capsular meningocócica (Mn) derivado de Neisseria meningitidis. Em modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Mn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn-serotipo A, C, W135 e Y.
[00019] Em modalidades particularmente preferidas, o sacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn ou Mn, covalentemente conjugado à CRM197 por meio de um espaçador eTEC.
[00020] As composições e métodos descritos aqui são úteis em uma variedade de aplicações. Por exemplo, os glicoconjugados da invenção podem ser usados na produção de composições imunogênicas compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC. Tais composições imunogênicas podem ser usadas para proteger receptores contra infecções bacterianas, por exemplo, por bactérias patogênicas, tais como S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[00021] Assim, em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que 0 glicoconjugado compreende um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC, conforme descrito aqui.
[00022] Em modalidades frequentes, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular bacteriano.
[00023] Em algumas de tais modalidades, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC o qual compreende um polissacarídeo capsular Pn derivado de S. pneumoniae. Em algumas modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn- serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F.
[00024] Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC que compreende um polissacarídeo capsular Mn derivado de N. meningitidis. Em algumas modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Mn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn-serotipo A, C, W135eY.
[00025] Em modalidades preferenciais, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC que compreende um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn ou Mn, covalentemente conjugado à CRM197 por meio de um espaçador eTEC.
[00026] Em algumas modalidades, as composições imunogênicas compreendem um adjuvante. Em algumas de tais modalidades, 0 adjuvante é um adjuvante com base em alumínio selecionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, as composições imunogênicas descritas aqui compreendem 0 adjuvante fosfato de alumínio.
[00027] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição bacteriana em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da invenção, em que a dita a composição imu- nogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC que com-preende um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano.
[00028] Em uma modalidade, a infecção, doença ou condição está associada à bactérias S. pneumoniae e o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular Pn. Em outra modalidade, a infecção, doença ou condição está associada à bactérias N. meningitidis e o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular Mn.
[00029] Em outros aspectos, a invenção proporciona um método para indução de uma resposta imune contra bactérias patogênicas; um método para prevenção, tratamento ou melhora de uma doença ou condição causada por bactérias patogênicas; e um método para redução da gravidade de pelo menos um sintoma de uma infecção, doença ou condição causada por bactérias patogênicas, em cada caso através de administração, a um indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano derivado de bactérias patogênicas.
[00030] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de indução de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano. Em moda-lidades preferidas, o método envolve a produção de uma resposta imune protetora no indivíduo, conforme adicionalmente descrito aqui.
[00031] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC a um indivíduo para gerar uma resposta imune protetora no indivíduo, conforme adicionalmente descrito aqui.
[00032] Em um outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo gerado em resposta um glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção ou uma composição imunogênica compreendendo tal glicoconjugado. Tais anticorpos podem ser usados em pesquisa e ensaios clínicos laboratoriais, tal como detecção e serotipagem de bactérias, ou podem ser usados para conferir imunidade passiva a um indivíduo.
[00033] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção para uso na prevenção, tratamento ou melhora de infecção bacteriana, por exemplo, infecção por S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[00034] Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção para o preparo de um medicamento para prevenção, tratamento ou melhora de infecção bacteriana, por exemplo, infecção por S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[00035] Em determinadas modalidades preferidas dos métodos terapêuticos e/ou profiláticos e usos descritos acima, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC compreendendo um polissacarídeo capsular bacteriano covalentemente ligado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC. Em modalidades frequentes dos métodos e usos descritos aqui, o polissa- carídeo capsular bacteriano é um polissacarídeo capsular Pn ou um polissacarídeo capsular Mn. Em algumas de tais modalidades, o polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polis- sacarídeos capsulares Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Em outras modalidades, o polissacarídeo capsular Mn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn-serotipo A, C, W135 e Y.
[00036] Em determinadas modalidades preferidas, a proteína transportadora é CRM197. Em modalidades particularmente preferidas, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC que compreende um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn ou Mn, covalentemente conjugado àCRM 197 por meio de um espaçador eTEC.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00037] A Figura 1 mostra um esquema geral para o preparo dos glicoconjugados ligados por eTEC da invenção para um glicoconjuga- do que compreende um polissacarídeo covalentemente conjugado à CRM197.
[00038] A Figura 2 mostra uma estrutura polissacarídica de repetição de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae serotipo 33F (33F- Pn).
[00039] A Figura 3 mostra uma estrutura polissacarídica de repetição de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae serotipo 22F (22F- Pn).
[00040] A Figura 4 mostra uma estrutura polissacarídica de repetição de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae serotipo 10A (10A- Pn).
[00041] A Figura 5 mostra uma estrutura polissacarídica de repetição de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae serotipo 11A (11A- Pn).
[00042] A Figura 6 mostra uma estrutura representativa de um glicoconjugado Pn-33F que incorpora o ligante de eTEC (A) e sítios sulfidrila livres (B) potenciais com "cap" e sem "cap".
[00043] A Figura 7 mostra um fluxograma do processo representativo para os processos de ativação (A) e conjugação (B) usados no preparo do glicoconjugado Pn-33F à CRM197.
[00044] A Figura 8 mostra um nível de tiolação de polissacarídeo capsular Pn-33F como uma função de equivalentes molares de CDT usados na etapa de ativação.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00045] A presente invenção pode ser mais facilmente compreendida por referência à descrição detalhada a seguir das modalidades preferidas da invenção e aos Exemplos incluídos aqui. A menos que definido 0 contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm 0 mesmo significado conforme normalmente entendido por aqueles versados na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, determinados métodos e materiais preferidos são descritos aqui. Na des-crição das modalidades e reivindicação da invenção, determinada terminologia será usada de acordo com as definições fornecidas abaixo.
[00046] Conforme usado aqui, as formas no singular "um", "uma", "0" e "a" incluem as referências no plural, a menos que indicado de outra forma. Assim, por exemplo, referências ao "método" inclui um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e referências a "um espaçador eTEC" refere-se a um ou mais espaçadores eTEC, conforme será evidente para aqueles versados na técnica quando de leitura da descrição.
[00047] Conforme usado aqui, 0 termo "cerca de" significa dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor, tal como uma faixa de concentração, período de tempo, peso molecular, temperatura ou pH fornecidos. Tal faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, tipicamente dentro de 20%, mais tipicamente dentro de 10% e, ainda mais tipicamente, dentro de 5% do valor ou faixa indicada. Algumas vezes, tal faixa pode estar dentro do erro experimental típico de métodos convencionais usados para medição e/ou determinação de um dado valor ou faixa. A variação permitida abrangida pelo termo "cerca de" dependerá do sistema sob estudo em particular e pode ser prontamente apreciada por um aqueles versados na técnica. Sempre que uma faixa é citada no presente pedido, cada número inteiro dentro da faixa também é considerado como uma modalidade da invenção.
[00048] Será notado que, na presente descrição, termos tais como "compreende", "compreendido", "compreendendo", "contém", "contendo" e similares podem ter o significado que lhes é atribuído na lei de patentes dos Estados Unidos; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e assim por diante. Tais termos referem-se à inclusão de ingredientes ou um conjunto de ingredientes particulares sem excluir quaisquer outros ingredientes. Termos tais como "consis-tindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" têm o significado que lhes é atribuído na lei de patentes dos Estados Unidos, por exemplo, eles permitem a inclusão de ingredientes ou etapas adicionais que não prejudicam as características novas ou básicas da invenção, isto é, eles excluem ingredientes adicionais ou etapas não citados que prejudicam as características novas ou básicas da invenção. Os termos "consistindo em" e "consiste em" têm o significado que lhes é atribuído na lei de patentes dos Estados Unidos; isto é, estes termos estão de sentido fechado. Consequentemente, estes termos referem- se à inclusão de um ingrediente ou conjunto de ingredientes em particular e à exclusão de todos os outros ingredientes.
[00049] O termo "sacarídeo", conforme usado aqui, pode referir-se um polissacarídeo, um oligossacarídeo ou um monossacarídeo. Frequentemente, referências a um sacarídeo referem-se a um polissacarídeo capsular bacteriano, em particular polissacarídeos capsulares derivados de bactérias patogênicas, tais como S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[00050] Os termos "conjugado" ou "glicoconjugado" são usados alternadamente aqui para referir-se a um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora. Os glicoconjugados da presente invenção são, algumas vezes, ditos aqui como glicoconjugados "ligados por eTEC", os quais compreendem um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora por meio de pelo menos um espaçador eTEC. Os glicoconjugados ligado por eTEC da in-venção e composições imunogênicas compreendendo os mesmos podem conter uma determinada quantidade de sacarídeo livre.
[00051] O termo "sacarídeo livre", conforme usado aqui, significa um sacarídeo que não está covalentemente conjugado à proteína transportadora ou um sacarídeo que está covalentemente ligado a muito poucas proteínas veículo unidas em uma alta proporção de sa- carídeo/proteína (> 5:1) mas, no entanto, está presente na composição de glicoconjugado. O sacarídeo livre pode não estar covalentemente associado (isto é, não covalentemente ligado, adsorvido a ou encerrado em ou com) o glicoconjugado de sacarídeo-proteína transportadora conjugado. Os termos "polissacarídeo livre" e "polissacarídeo capsular livre" podem ser usados aqui para transmitir o mesmo significado com respeito a glicoconjugados em que o sacarídeo é um polissacarídeo ou um polissacarídeo capsular, respectivamente.
[00052] Conforme usado aqui, "conjugar", "conjugado" e "conjugação" referem-se a um processo pelo qual um sacarídeo, por exemplo, um polissacarídeo capsular bacteriano, é covalentemente ligado a uma molécula veículo ou proteína transportadora. Nos métodos da presente invenção, o sacarídeo é covalentemente conjugado à proteína transportadora através de pelo menos um espaçador eTEC. A conjugação pode ser realizada de acordo com os métodos descritos abaixo ou outros processos conhecidos na técnica. A conjugação a uma proteína transportadora aumenta a imunogenicidade de um polissacarídeo capsular bacteriano. Glicoconjugados
[00053] A presente invenção refere-se a glicoconjugados que compreendem um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora através de um ou mais espaçadores eTEC, em que o sacarídeo é covalentemente conjugado ao espaçador eTEC através de uma ligação de carbamato e em que a proteína transportadora é covalentemente conjugada ao espaçador eTEC através de uma ligação de amida.
[00054] Além da presença de um ou mais espaçadores eTEC, novas características dos glicoconjugados da presente invenção incluem os perfis de peso molecular dos sacarídeos e dos glicoconjugado ligados por eTEC resultantes, a proporção de lisinas conjugadas por proteína transportadora e o número de lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo através do(s) espaçador(es) eTEC, o número de ligações covalentes entre a proteína transportadora e o sacarídeo como uma função de unidades de repetição do sacarídeo e a quantidade relativa de sacarídeo livre comparado com a quantidade total de sacarídeo.
[00055] Os glicoconjugados ligados por eTEC da invenção podem ser representados pela fórmula geral (I):
Figure img0002
[00056] A espaçador eTEC inclui sete átomos lineares (isto é, - C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-) e fornece ligações de tioéter e amida estáveis entre a proteína transportadora e o sacarídeo. Síntese do glicoconjugado ligado por eTEC envolve reação de um grupo hidroxila ativado do sacarídeo com o grupo amino de um reagente de tioalquilami- na, por exemplo, cistamina ou cisteinamina ou um sal das mesmas, formação de uma ligação de carbamato ao sacarídeo para proporcio-nar um sacarídeo tiolado. Geração de um ou mais grupos sulfidrila livres é realizada por meio de reação com um agente redutor para fornecer um sacarídeo tiolado ativado. Reação dos grupos sulfidrila livres do sacarídeo tiolado ativado com uma proteína transportadora ativada tendo um ou mais grupos a-haloacetamida em resíduos contendo ami- na gera uma ligação de tioéter para formar o conjugado, em que a proteína transportadora é ligada ao espaçador eTEC através de uma ligação de amida.
[00057] Em glicoconjugados da invenção, o sacarídeo pode ser um polissacarídeo, um oligossacarídeo ou um monossacarídeo e a proteína transportadora pode ser selecionada de qualquer veículo adequado, conforme adicionalmente descrito aqui ou conhecido por aqueles versados na técnica. Em modalidades frequentes, o sacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano. Em algumas de tais modalidades, a proteína transportadora é CRM197.
[00058] Em algumas de tais modalidades, 0 glicoconjugado ligado por eTEC compreende um polissacarídeo capsular Pn derivada de S. pneumoniae. Em modalidades específicas, 0 polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Em outras modalidades, o polissacarídeo capsular é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn-serotipos 10A, 11 A, 22F e 33F. Em uma de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Pn-33F. Em outra tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Pn-22F. Em outra tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Pn-10A. Em ainda outra de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Pn-11A.
[00059] Em outras modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC compreende um polissacarídeo capsular Mn derivado de /V. meningitidis. Em modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Mn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn- serotipo A, C, W135 e Y. Em uma de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Mn-A. Em outra de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Mn-C. Em outra de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Mn-W135. Em ainda outra de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Mn-Y.
[00060] Em modalidades particularmente preferidas, o glicoconju- gado ligado por eTEC compreende um polissacarídeo capsular bacteriano Pn ou Mn, tal como um polissacarídeo capsular Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F ou um polissacarídeo capsular Mn-serotipo A, C, W135 ou Y, o qual é covalentemente conjugado à CRM197 por meio de um espaçador eTEC.
[00061] Em algumas modalidades, os glicoconjugados ligados por eTEC da presente invenção compreendem um sacarídeo covalente- mente conjugado à proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC, em que o sacarídeo tem um peso molecular entre 10 kDa e 2.000 kDa. Em outras modalidades, o sacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 2.000 kDa. Em outras de tais modalidades, o sacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 1.750 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.250 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Em algumas de tais modalidades, o sacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F ou um polissacarídeo capsular Mn-serotipo A, C, W135 ou Y, em que o polissacarídeo capsular tem um peso molecular que cai dentro de qualquer uma das faixas de peso molecular conforme descrito.
[00062] Em algumas modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção tem um peso molecular entre 50 kDa e 20000 kDa. Em outras modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC tem um peso molecular entre 500 kDa e 10000 kDa. Em outras modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC tem um peso molecular entre 200 kDa e 10000 kDa. Em ainda outras modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC tem um peso molecular entre 1.000 kDa e 3000 kDa.
[00063] Em outras modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção tem um peso molecular entre 200 kDa e 20.000 kDa; entre 200 kDa e 15.000 kDa; entre 200 kDa e 10.000 kDa; entre 200 kDa e 7.500 kDa; entre 200 kDa e 5.000 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 500 kDa e 20.000 kDa; entre 500 kDa e 15.000 kDa; entre 500 kDa e 12.500 kDa; entre 500 kDa e 10.000 kDa; entre 500 kDa e 7.500 kDa; entre 500 kDa e 6.000 kDa; entre 500 kDa e 5.000 kDa; entre 500 kDa e 4000 kDa; entre 500 kDa e 3000 kDa; entre 500 kDa e 2.000 kDa; entre 500 kDa e 1.500 kDa; entre 500 kDa e 1.000 kDa; entre 750 kDa e 20.000 kDa; 750 kDa e 15.000 kDa; entre 750 kDa e 12.500 kDa; entre 750 kDa e 10.000 kDa; entre 750 kDa e 7.500 kDa; entre 750 kDa e 6.000 kDa; entre 750 kDa e 5.000 kDa; entre 750 kDa e 4.000 kDa; entre 750 kDa e 3000 kDa; entre 750 kDa e 2.000 kDa; entre 750 kDa e 1.500 kDa; entre 1.000 kDa e 15.000 kDa; entre 1.000 kDa e 12.500 kDa; entre 1.000 kDa e 10.000 kDa; entre 1.000 kDa e 7.500 kDa; entre 1.000 kDa e 6.000 kDa; entre 1.000 kDa e 5.000 kDa; entre 1.000 kDa e 4.000 kDa; entre 1.000 kDa e 2.500 kDa; entre 2.000 kDa e 15.000 kDa; entre 2.000 kDa e 12.500 kDa; entre 2.000 kDa e 10.000 kDa; entre 2.000 kDa e 7.500 kDa; entre 2.000 kDa e 6.000 kDa; entre 2.000 kDa e 5.000 kDa; entre 2.000 kDa e 4.000 kDa; ou entre 2.000 kDa e 3.000 kDa.
[00064] Outra forma de caracterizar os glicoconjugados ligados por eTEC da invenção é através do número de resíduos de lisina na proteína transportadora que se tornam conjugados ao sacarídeo através de um espaçador eTEC, o qual pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas.
[00065] Em modalidades frequentes, a proteína transportadora é covalentemente conjugada ao espaçador eTEC através de uma ligação de amida a um ou mais grupos a-amino de resíduos de lisina na proteína transportadora. Em algumas de tais modalidades, a proteína transportadora compreende 2 a 20 resíduos de lisina covalentemente conjugados ao sacarídeo. Em outras modalidades, a proteína transportadora compreende 4 a 16 resíduos de lisina covalentemente conjugados ao sacarídeo.
[00066] Em uma modalidade preferida, a proteína transportadora compreende CRM197, a qual contém 39 resíduos de lisina. Em algumas de tais modalidades, a CRM197 pode compreender 4 a 16 resíduos de lisina de 39 covalentemente ligados ao sacarídeo. Outra forma de expressar este parâmetro é que cerca de 10% a cerca de 41% de lisinas na CRM197 são covalentemente ligados ao sacarídeo. Em outra de tais modalidades, a CRM197 pode compreender 2 a 20 resíduos de lisina de 39 covalentemente ligados ao sacarídeo. Outra forma de expressar este parâmetro é que cerca de 5% a cerca de 50% das lisinas da CRM197 são covalentemente ligados ao sacarídeo.
[00067] Os glicoconjugados ligado por eTEC da invenção podem também ser caracterizados pela proporção (p/p) de sacarídeo para proteína transportadora. Em algumas modalidades, a proporção sacarídeo: proteína transportadora (p/p) está entre 0,2 e 4. Em outras modalidades, proporção sacarídeo:proteína transportadora (p/p) está entre 1,0 e 2,5. Em outras modalidades, a proporção sacarídeo:proteína transportadora (p/p) está entre 0,4 e 1,7. Em algumas de tais modalidades, 0 sacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano e/ou a proteína transportadora é CRM197.
[00068] Glicoconjugados podem também ser caracterizados pelo número de ligações covalentes entre a proteína transportadora e 0 sacarídeo como uma função de unidades de repetição do sacarídeo. Em uma modalidade, 0 glicoconjugado da invenção compreende pelo menos uma ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 polissacarídeo para cada 4 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em outra modalidade, a ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 10 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em outra moda- lidade, a ligação covalente entre a proteína transportadora e o polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 15 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em uma outra modalidade, a ligação covalente entre a proteína transportadora e o polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 25 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo.
[00069] Em modalidades frequentes, a proteína transportadora é CRM197 e a ligação covalente através de um espaçador eTEC entre a CRM197 e o polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 4, 10, 15 ou 25 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo.
[00070] Uma consideração importante durante conjugação é o desenvolvimento de condições que permitam a retenção de grupos funcionais substituintes não sacarídicos potencialmente sensíveis dos componentes individuais, tais como cadeias laterais de O-acila, fosfato ou fosfato de glicerol, que possam fazer parte do epítopo sacarídico.
[00071] Em uma modalidade, o glicoconjugado compreende um sacarídeo que tem um grau de O-acetilação entre 10-100%. Em algumas de tais modalidades, o sacarídeo tem um grau de O-acetilação entre 50-100%. Em outras modalidades, o sacarídeo tem um grau de O- acetilação entre 75-100%. Em outras modalidades, o sacarídeo tem um grau de O-acetilação maior do que ou igual a 70% (>70%).
[00072] Os glicoconjugados ligados por eTEC e composições imu- nogênicas da invenção podem conter sacarídeo livre que não está covalentemente conjugado à proteína transportadora mas, no entanto, está presente na composição de glicoconjugado. O sacarídeo livre pode não estar covalentemente associado (isto é, não covalentemente ligado, adsorvido a ou encerrado em ou com) o glicoconjugado.
[00073] Em algumas modalidades, o glicoconjugado ligado por eTEC compreende menos de cerca de 45% de sacarídeo livre, menos de cerca de 40% de sacarídeo livre, menos de cerca de 35% de saca- rídeo livre, menos de cerca de 30% de sacarídeo livre, menos de cerca de 25% de sacarídeo livre, menos de cerca de 20% de sacarídeo livre, menos de cerca de 15% de sacarídeo livre, menos de cerca de 10% de sacarídeo livre ou menos de cerca de 5% de sacarídeo livre em relação à quantidade total de sacarídeo. De preferência, o glicoconjugado compreende menos de 15% de sacarídeo livre, mais preferivelmente menos de 10% de sacarídeo livre e, ainda mais preferivelmente, menos de 5% de sacarídeo livre.
[00074] Em determinadas modalidades preferidas, a invenção fornece um glicoconjugado ligado por eTEC compreendendo um polissacarídeo capsular, de preferência um polissacarídeo capsular Pn ou Mn, covalentemente conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC tendo uma ou mais das características a seguir, isoladamente ou em combinação: o polissacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 2.000 kDa; o glicoconjugado tem um peso molecular entre 500 kDa a 10.000 kDa; a proteína transportadora compreende 2 a 20 resíduos de lisina covalentemente ligados ao sacarídeo; a proporção sacarídeo: proteína transportadora (p/p) está entre 0,2 e 4; o glicoconjugado compreende pelo menos uma ligação cova- lente entre a proteína transportadora e o polissacarídeo para cada 4, 10, 15 ou 25 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo; o sacarídeo tem um grau de O-acetilação entre 75-100%; o conjugado compreende menos de cerca de 15% de polissacarídeo livre em relação ao total de polissacarídeo; a proteína transportadora é CRM197; 0 polissacarídeo capsular é selecionado de polissacarídeos capsulares Pn-sorotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F ou 0 polissacarídeo capsular é selecionado de polissacarídeos capsulares Mn-serotipo A, C, W135 ou Y.
[00075] Os glicoconjugados ligados por eTEC também podem ser caracterizados por sua distribuição de tamanho molecular (Kd). O ta- manho molecular dos conjugados é determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC - Size Exclusion Chromatography) em fase estacionária em meio de Sepharose CL-4B usando um sistema de cromatografia de líquido de alta pressão (High Pressure Liquid Chromatography - HPLC). Para determinação de Kd, a coluna de cromato-grafia é primeiro calibrada para determinar Vo, o qual representa o volume de vazio ou volume de exclusão total, e Vi, o volume no qual as menores moléculas na amostra eluem, o qual também é conhecido como o volume interpartículas. Toda separação por SEC ocorre entre Vo e V. O valor de Kd para cada fração coletada é determinado pela seguinte expressão: Kd = (Ve-Vi)/(Vi-V0), em que Ve representa o volume de retenção do composto. A fração % (pico principal) que elui < 0,3 define a Kd (distribuição de tamanho molecular) do conjugado. Em algumas modalidades, a invenção proporciona glicoconjugados ligados por eTEC tendo uma distribuição de tamanho molecular (Kd) de >35%. Em outras modalidades, a invenção proporciona glicoconjugados ligados por eTEC tendo uma distribuição de tamanho molecular (Kd) de >15%, >20%, >25%, >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >60%, >70%, >80% ou >90%.
[00076] Os glicoconjugados ligados por eTEC e composições imunogênicas da invenção podem conter resíduos de sulfidrila livres. Em alguns casos, os sacarídeos tiolados ativados formados pelos métodos fornecidos aqui conterão múltiplos resíduos de sulfidrila livres, alguns dos quais podem não sofrer conjugação covalente com a proteína transportadora durante a etapa de conjugação. Tais resíduos de sulfidrila livres residuais são "capped" por meio de reação com um reagente de "capping" tiol-reativo, por exemplo, iodoacetamida (IAA), para "capping" da funcionalidade potencialmente reativa. Outros reagentes de "capping" tiol-reativos, por exemplo, reagentes contendo maleimida e assim por diante, também são considerados.
[00077] Além disso, os glicoconjugados ligados por eTEC e composições imunogênicas da invenção podem conter proteína transportadora não conjugada residual, a qual pode incluir proteína transportadora ativada que sofreu modificação durante as etapas do processo de "capping".
[00078] Os glicoconjugados da invenção podem ser usados na produção de composições imunogênicas para proteger os receptores contra infecções bacterianas, por exemplo, por bactérias patogênicas, tais como S. pneumoniae ou N. meningitidis. Assim, em um outro aspecto, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou di- luente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC, conforme descrito aqui.
[00079] Em modalidades frequentes, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular bacteriano.
[00080] Em algumas de tais modalidades, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC o qual compreende um polissacarídeo capsular Pn derivado de S. pneumoniae. Em algumas modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn- serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F.
[00081] Em outras de tais modalidades, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC o qual compreende um polissacarídeo capsular Mn derivado de N. meningitidis. Em algumas modalidades específicas, o polissacarídeo capsular Mn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn- serotipo A, C, W135 e Y.
[00082] Em modalidades particularmente preferidas, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC o qual compreende um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn ou Mn, covalentemente conjugado à CRM197 por meio de um espaçador eTEC.
[00083] Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende um adjuvante. Em algumas de tais modalidades, 0 adjuvante é um adjuvante com base em alumínio selecionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende 0 adjuvante fosfato de alumínio.
[00084] Os glicoconjugados ligados por eTEC da invenção e composições imunogênicas compreendendo os mesmos podem conter uma determinada quantidade de sacarídeo livre. Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende menos de cerca de 45%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de 35%, menos de cerca de 30%, menos de cerca de 25%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10% ou menos de cerca de 5% de polissacarídeo livre comparado com a quantidade total de polis-sacarídeo. De preferência, a composição imunogênica compreende menos de 15% de sacarídeo livre, mais preferivelmente menos de 10% de sacarídeo livre e, ainda mais preferivelmente, menos de 5% de sacarídeo livre.
[00085] Em outro aspecto, os glicoconjugados ou composições imunogênicas da invenção podem ser usados para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia animal ou por meio de um ensaio de morte opsono- fagocítica. Glicoconjugados da invenção compreendendo um polissacarídeo capsular bacteriano podem ser usados na produção de anti- corpos contra tal polissacarídeo capsular bacteriano. Tais anticorpos podem ser subsequentemente usados em pesquisa e ensaios clínicos laboratoriais, tais como detecção e serotipagem bacteriana. Tais anticorpos também podem ser usados para conferir imunidade passiva a um indivíduo. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos contra polissacarídeos bacterianos são funcionais em um modelo de eficácia animal ou em um ensaio de morte opsonofagocítica.
[00086] Os glicoconjugados ligados por eTEC e composições imunogênicas descritos aqui podem também ser usados em vários métodos terapêuticos ou profiláticos para prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição bacteriana em um indivíduo. Em particular, glicoconjugados ligados por eTEC compreendendo um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano de uma bactéria patogênica, podem ser usados para prevenir, tratar ou melhorar uma infecção, doença ou condição bacteriana em um indivíduo causada por bactérias patogênicas.
[00087] Assim, em um aspecto, a invenção proporciona um método de prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição bacteriana em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da invenção, em que a dita composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC compreendendo um polissacarídeo capsular bacteriano.
[00088] Em uma modalidade, a infecção, doença ou condição está associada à bactérias S. pneumoniae e o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular Pn. Em algumas de tais modalidades, a infecção, doença ou condição é selecionada do grupo que consiste em pneumonia, sinusite, otite média, meningite, bacteremia, septicemia, enfisema pleural, conjuntivite, osteomielite, artrite séptica, endocardite, peritonite, pericardite, mastoidite, celulite, infecção de tecidos moles e abscesso cerebral.
[00089] Em outra modalidade, a infecção, doença ou condição está associada à bactérias A/, meningitidis e o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular Mn. Em algumas de tais modalidades, a infecção, doença ou condição é selecionada do grupo que consiste em meningite, meningococcemia, bacteremia e septicemia.
[00090] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de indução de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular bacteriano.
[00091] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para prevenção, tratamento ou melhora de uma doença ou condição causada por bactérias patogênicas em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular bacteriano.
[00092] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para reduzir a gravidade de pelo menos um sintoma de uma doença ou condição causada por uma infecção por bactérias patogênicas compreendendo administração, a um indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular bacteriano, por exemplo, um polissacarídeo capsular Pn ou Mn.
[00093] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC da invenção a um indivíduo para gerar uma resposta imune protetora no indivíduo, conforme adicionalmente descrito aqui.
[00094] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção, conforme descrito aqui, para uso na prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção bacteriana, por exemplo, uma infecção por S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[00095] Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC da presente invenção, conforme descrito aqui, para o preparo de um medicamento para a prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção bacteriana, por exemplo, infecção por S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[00096] Nos métodos terapêuticos e/ou profiláticos e usos descritos acima, a composição imunogênica compreende, frequentemente, um glicoconjugado ligado por eTEC que compreende um polissacarídeo capsular bacteriano covalentemente ligado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC. Em modalidades frequentes dos métodos descritos aqui, o polissacarídeo capsular bacteriano é um polissacarídeo capsular Pn ou um polissacarídeo capsular Mn. Em algumas de tais modalidades, o polissacarídeo capsular é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Em outras modalidades, o polissacarídeo capsular é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn- serotipo A, C, W135 e Y.
[00097] Em determinadas modalidades preferidas, a proteína trans- portadora é CRM197. Em modalidades particularmente preferidas, a composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC que compreende um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn ou Mn, covalentemente conjugado à CRM197 por meio de um espaçador eTEC.
[00098] Além disso, a presente invenção proporciona métodos para indução de uma resposta imune contra bactérias S. pneumoniae ou N. meningitidis em um indivíduo, métodos para prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição causada por bactérias S. pneumoniae ou N. meningitidis em um indivíduo e métodos para redução da gravidade de pelo menos um sintoma de uma infecção, doença ou condição causada por uma infecção por S. pneumoniae ou N. meningitidis em um indivíduo, em cada caso através de administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de um composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que 0 glicoconjugado compreende um polissacarídeo capsular bacteriano derivado de S. pneumoniae ou N. meningitidis, respectivamente.
Sacarídeos
[00099] Sacarídeos podem incluir polissacarídeos, oligossacarídeos e monossacarídeos. Em modalidades frequentes, 0 sacarídeo é um polissacarídeo, em particular um polissacarídeo capsular bacteriano. Polissacarídeos capsulares são preparados por meio de técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica.
[000100] Na presente invenção, polissacarídeos capsulares podem ser preparados, por exemplo, a partir de Pn-serotipos 1,3,4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae. Em uma modalidade, cada serotipo de polissacarídeo pneumocócico pode ser cultivado em um meio com base em soja. Polissacarídeos individuais são purificados através de centrifugação, precipitação, ultrafiltração e/ou cromatografia em coluna. Polissacarídeos purificados podem ser ativados para torná-los capazes de reagir com o espaçador eTEC e, então, incorporados nos glicoconjugados da invenção, conforme adicionalmente descrito aqui.
[000101] O peso molecular do polissacarídeo capsular é uma consideração para uso em composições imunogênicas. Polissacarídeos capsulares de peso molecular elevado são capazes de induzir à determinadas respostas imunes de anticorpo em virtude de uma maior valência dos epítopos presentes sobre a superfície antigênica. O isolamento e purificação de polissacarídeos capsulares de elevado peso molecular são considerados para o uso nos conjugados, composições e métodos da presente invenção.
[000102] Em algumas modalidades, o sacarídeo tem um peso molecular entre 10 kDa e 2.000 kDa. Em outras modalidades, o sacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 2.000 kDa. Em outras de tais modalidades, o sacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 1.750 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.250 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Em algumas de tais modalidades, o sacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F ou um polissacarídeo capsular Mn-serotipo A, C, W135 ou Y, em que o polissacarídeo capsular tem um peso molecular que cai dentro de uma das fai- xas de peso molecular conforme descrito.
[000103] Em algumas modalidades, os sacarídeos da invenção são O-acetilado. Em algumas modalidades, o glicoconjugado compreende um sacarídeo que tem um grau de O acetilação de entre 10-100%, entre 20 a 100%, entre 30-100%, entre 40-100%, entre 50-100%, entre 60-100 %, entre 70-100%, entre 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50- 90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%. Em outras modalidades, o grau de O-acetilação é > 10%, 20% >, > 30%, 40% >, > 50%, 60% >, > 70%, > 80% ou > 90% ou cerca de 100%.
[000104] Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares, glicoconjugados ou composições imunogênicas da invenção são usados para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia animal ou um ensaio de morte opsonofagocítica que demonstra que os anticorpos matam as bactérias.
[000105] Polissacarídeos capsulares podem ser obtidos diretamente a partir de bactérias usando procedimentos de isolamento conhecidos por aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Fournier et al.. (1984), supra; Fournier et al. (1987) Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 138: 561 567; Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2007/0141077; e Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 00/56357; cada um dos quais é aqui incorporado por referência como se apresentado na íntegra). Além disso, eles podem ser produ-zidos usando protocolos de síntese. Além disso, o polissacarídeo capsular pode ser produzido de forma recombinante usando procedimentos de engenharia genética também conhecidos por aqueles versados na técnica (vide Sau et al. (1997) Microbiology 143: 2395 2405; e Patente dos Estados Unidos N° 6.027.925; cada um dos quais é aqui incorporado por referência como se apresentado na íntegra).
[000106] As cepas bacterianas de S. pneumoniae ou N. meningitidis usadas para fazer os respectivos polissacarídeos que são usados nos glicoconjugados da invenção podem ser obtidas de coleções de culturas estabelecidas ou de espécimes clínicos.
Proteínas Veículo
[000107] Outro componente do glicoconjugado da presente invenção é uma proteína transportadora à qual o sacarídeo é conjugado. Os termos "veículo proteico" ou "proteína transportadora" ou "veículo" podem ser usados alternadamente aqui. Proteínas veículo são, de preferência, proteínas que não são tóxicas e não reatogênicas e obtidas em quantidade e pureza suficientes. Proteínas veículo deverão ser passíveis de procedimentos de conjugação convencionais. Nos novos glicoconjugados da invenção, a proteína transportadora é covalentemente ligada a um sacarídeo através de um espaçador eTEC.
[000108] Conjugação a um veículo pode aumentar a imunogenicida- de de um antígeno, por exemplo, antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano. Veículos proteicos preferidos para os antígenos são toxinas, toxoides ou qualquer material de reação cruzada mutante (Cross-Reactive Material - CRM) da toxina do tétano, difteria, pertussis, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus e Streptococcus. Em uma modalidade, um veículo particularmente preferido é o toxoide da difteria CRM197, derivado da cepa C7 (β197) de C. diphthe- riae, a qual produz a proteína CRM197. Esta cepa tem N° de Acesso ATCC 53281. Um método para produção de CRM197 é descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.614.382, a qual é aqui incorporada por referência como se apresentada na íntegra.
[000109] Alternativamente, um fragmento ou epítopo da proteína transportadora ou outra proteína imunogênica pode ser usado. Por exemplo, um antígeno haptênico pode ser acoplado a um epítopo de célula T de uma toxina bacteriana, toxoide ou CRM. Vide Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 150.688, depositado em 01 de Feve- reiro de 1988, intitulado "Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epi-tope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines"; aqui incorporado por referência como se apresentado na íntegra. Outras proteínas veículo adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas, tal como o to- xoide do cólera (por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente Internacional WO 2004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli e exotoxi- na A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas da membrana externa bacteriana, tal como complexo c da membrana externa (OMPC), pori- nas, proteínas de ligação à transferrina, pneumolisina, proteína A da superfície pneumocócica (PspA), proteína de adesão pneumocócica (PsaA) ou proteína D de Haemophilus influenzae, também podem ser usadas. Outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa (Keyhole Limpet Hemocyanin - KLH), albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin - BSA) ou derivado de proteína purificado (Purified Protein Derivative - PPD) de tuberculina, também podem ser usadas como proteínas veículo.
[000110] Consequentemente, em modalidades frequentes, os glicoconjugados ligados por eTEC compreendem CRM197 como proteína transportadora, em que 0 polissacarídeo capsular é covalentemente ligado ao espaçador eTEC através de uma ligação de carbamato e em que a CRM197 é covalentemente ligada ao espaçador eTEC através de uma ligação de amida formada por um resíduo de aminoácido ativado da proteína, tipicamente através do grupo a-amina de um ou mais resíduos de lisina.
[000111] O número de resíduos de lisina na proteína transportadora que se tornam conjugados ao sacarídeo pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas. Por exemplo, em algumas modalidades das composições imunogênicas, a CRM197 pode compreender de 4 a 16 resíduos de lisina de 39 covalentemente ligados ao sacarídeo. Outra forma de expressar este parâmetro é que cerca de 10% a cerca de 41% das lisinas na CRM197 são covalentemente ligados ao sacarídeo. Em outras modalidades, a CRM197 pode compreender 2 a 20 resíduos de lisina de 39 covalentemente ligados ao sacarídeo. Outra forma de expressar este parâmetro é que cerca de 5% a cerca de 50% das lisinas na CRM197 são covalentemente ligados ao sacarídeo.
[000112] A frequência de ligação da cadeia sacarídica a uma lisina na proteína transportadora é outro parâmetro para caracterização dos glicoconjugados da invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, pelo menos uma ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 polissacarídeo ocorre para cada 4 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em uma outra modalidade, a ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 10 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em uma outra modalidade, a ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 15 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em uma outra modalidade, a ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 25 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo.
[000113] Em modalidades frequentes, a proteína transportadora é CRM197 e a ligação covalente através de um espaçador eTEC entre a CRM197 e 0 polissacarídeo ocorre pelo menos uma vez em cada 4, 10, 15 ou 25 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo. Em algumas de tais modalidades, 0 polissacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano derivado de S. pneumoniae ou N. meningitidis.
[000114] Em outras modalidades, 0 conjugado compreende pelo menos uma ligação covalente entre a proteína transportadora e 0 sacarídeo para cada 5 a 10 unidades de repetição sacarídicas; cada 2 a 7 unidades de repetição sacarídicas; cada 3 a 8 unidades de repetição sacarídicas; cada 4 a 9 unidades de repetição sacarídicas; cada 6 a 11 unidades de repetição sacarídicas; cada 7 a 12 unidades de repetição sacarídicas; cada 8 a 13 unidades de repetição sacarídicas; cada 9 a 14 unidades de repetição sacarídicas; cada 10 a 15 unidades de repetição sacarídicas; cada 2 a 6 unidades de repetição sacarídicas, cada 3 a 7 unidades de repetição sacarídicas; cada 4 a 8 unidades de repetição sacarídicas; cada 6 a 10 unidades de repetição sacarídicas; cada 7 a 11 unidades de repetição sacarídicas; cada 8 a 12 unidades de repetição sacarídicas; cada 9 a 13 unidades de repetição sacarídicas; cada 10 a 14 unidades de repetição sacarídicas; cada 10 a 20 unida-des de repetição sacarídicas; ou cada 4 a 25 unidades de repetição sacarídicas.
[000115] Em outra modalidade, pelo menos uma ligação entre a proteína transportadora e o sacarídeo ocorre para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo.
Métodos para Produção dos Glicoconjugados Ligados por eTEC
[000116] A presente invenção proporciona métodos de preparo de glicoconjugados ligados por eTEC que compreendem um sacarídeo covalentemente conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador (2-((2-oxoetil)tio)etil)carbamato (ETEC). O espaçador eTEC contém sete átomos lineares (isto é, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-), compreendendo ligações de tioéter e amida estáveis e serve para ligar covalentemente o sacarídeo e a proteína transportadora. Uma extremidade do espaçador eTEC é covalentemente ligada a um grupo hi- droxila do sacarídeo através de uma ligação de carbamato. A outra extremidade do espaçador eTEC é covalentemente ligada ao resíduo contendo amino da proteína transportadora, tipicamente um resíduo de a-lisina, por meio de uma ligação de amida.
[000117] Uma via representativa para o preparo de glicoconjugados da presente invenção compreendendo um polissacarídeo conjugado à proteína transportadora ativada CRM197 é mostrada na Figura 1. A estrutura química de um polissacarídeo capsular bacteriano representativo, os polissacarídeos pneumocócicos de serotipos 33F, 10A, 11A e 22F derivados de S. pneumoniae tendo sítios potenciais de modificação usando 0 processo com espaçador eTEC são mostrados na Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5, respectivamente.
[000118] A estrutura de um glicoconjugado ligado por eTEC representativo da presente invenção compreendendo 0 polissacarídeo pneumocócico de serotipo 33F covalentemente conjugado à CRM197 usando a química com ligante eTEC é mostrada na Figura 6(A). Sítios de sulfidrila livres potenciais com "cap" e sem "cap" são mostrados na Figura 6(B) para fins ilustrativos. Polissacarídeos normalmente contêm múltiplos grupos hidroxila e 0 sítio de ligação do espaçador eTEC a uma hidroxila específica dentro das unidades de repetição polissacarí- dicas através da ligação de carbamato, portanto, pode variar.
[000119] Em um aspecto, 0 método compreende as etapas de: a) reação de um sacarídeo com um derivado de ácido carbônico, tal como 1,1'-carbonil-di-(1,2,4-triazola) (CDT) ou 1 ,T-carbonildi-imidazola (CDI), em um solvente orgânico para produzir um sacarídeo ativado; b) reação do sacarídeo ativado com cistamina ou cisteamina ou um sal das mesmas para produzir um sacarídeo tiolado; c) reação do sacarídeo tiolado com um agente redutor para produzir um sacarídeo tiolado ativado compreendendo um ou mais resíduos de sulfidrila livres; d) reação do sacarídeo tiolado ativado com uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a-haloacetamida para produzir um conjugado de sacarídeo tiolado-proteína transportadora; e e) reação do conjugado de sacarídeo tiolado-proteína transportadora com (i) um primeiro reagente de "capping" capaz de "capping" de grupos a-haloacetamida não conjugados da proteína transportadora ativada; e/ou (ii) um segundo reagente de "capping" capaz de "capping" de resíduos de sulfidrila livres não conjugados do sacarídeo tiolado ativado; em que um glicoconjugado ligado por eTEC é produzido.
[000120] Em uma modalidade particularmente preferida, o método compreende as etapas de: a) reação de um polissacarídeo capsular Pn-33F com CDI ou CDT em um solvente orgânico para produzir um polissacarídeo Pn 33F ativado; b) reação do polissacarídeo Pn-33F ativado com cistamina ou cisteinamina um sal das mesmas para produzir um polissacarídeo Pn-33F tiolado; c) reação do polissacarídeo Pn-33F tiolado com um agente redutor para produzir um polissacarídeo Pn-33F ativado tiolado compreendendo um ou mais resíduos de sulfidrila livres; d) reação do polissacarídeo Pn-33F ativado tiolado com uma proteína transportadora ativada CRM197 compreendendo um ou mais grupos a-bromoacetamida para produzir um conjugado de polissacarídeo PN-33F tiolado-CRMw?; e e) reação do conjugado de polissacarídeo PN-33F tiolado-CRMi97 com (i) N-acetil-L-cisteína como um primeiro reagente de "capping" capaz de "capping" de grupos o- bromoacetamida não conjugados da proteína transportadora ativada; e (ii) iodoacetamida como um segundo reagente de "capping" capaz de "capping" de resíduos de sulfidrila livres não conjugados do polissacarídeo Pn-33F ativado tiolado; em que um glicoconjugado de polissacarídeo Pn-33F-CRMi97 ligado por eTEC é produzido.
[000121] Em modalidades frequentes, 0 derivado do ácido carbônico é CDT ou CDI. De preferência, 0 derivado de ácido carbônico é CDT e 0 solvente orgânico é um solvente aprótico polar, tal como sulfóxido de dimetila (DMSO). Liofilização do sacarídeo ativado não é necessária antes das etapas de tiolação e/ou conjugação.
[000122] Em uma modalidade preferida, 0 sacarídeo tiolado é produzido por meio de reação do sacarídeo ativado com 0 reagente simétrico bifuncional de tioalquilamina cistamina ou um sal da mesma. Uma vantagem potencial para este reagente é que 0 ligante simétrico cis- tamina pode reagir com duas moléculas de sacarídeo ativado, assim, formando duas moléculas de sacarídeo tiolado por molécula de cista- mina quando de redução da ligação de dissulfureto. Alternativamente, o sacarídeo tiolado pode ser formado por meio de reação do sacarídeo ativado com cisteamina ou um sal da mesma. Os glicoconjugados li-gados por eTEC produzidos pelos métodos da invenção podem ser representados pela fórmula geral (I).
[000123] Será entendido por aqueles versados na técnica que a etapa c) é opcional quando o sacarídeo ativado é reagido com cisteamina ou um sal da mesma que contém os resíduos de sulfidrila livres. Como uma questão prática, sacarídeos tiolados compreendendo cisteamina são rotineiramente reagidos com um agente redutor na etapa c) para reduzir quaisquer subprodutos de dissulfureto oxidados que possam ser formados durante a reação.
[000124] Em algumas modalidades deste aspecto, a etapa d) compreende ainda fornecimento de uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a-haloacetamida, antes de reação do sacarídeo tiolado ativado com a proteína transportadora ativada para produzir um conjugado de sacarídeo tiolado-proteína transportadora. Em modalidades frequentes, a proteína transportadora ativada compreende um ou mais grupos a-bromoacetamida.
[000125] O conjugado de sacarídeo tiolado-proteína transportadora pode ser tratado com um ou mais reagentes de "capping" capazes de reagir com grupos funcionais ativados residuais presentes na mistura de reação. Tais grupos reativos residuais podem estar presentes em componentes não reagidos de sacarídeos ou proteína transportadora em virtude de conjugação incompleta ou da presença de um excesso de um dos componentes na mistura de reação. Nesse caso, "capping" pode auxiliar na purificação ou isolamento do glicoconjugado. Em alguns casos, grupos funcionais ativados residuais podem estar presen- tes no glicoconjugado.
[000126] Por exemplo, grupos α-haloacetamida em excesso na proteína transportadora ativada podem sofrer "capping" por meio de reação com um tiol de baixo peso molecular, tal como N-acetil-L-cisteína, o qual pode ser usado em excesso para garantir "capping" completo. "Capping" com N-acetil-L-cisteína também permite confirmação da eficiência de conjugação pela detecção do aminoácido único S- carboximetilcisteína (CMC) dos resíduos de cisteína nos sítios com "cap", o que pode ser determinado por hidrólise ácida e análise de aminoácidos dos produtos de conjugação. Detecção deste aminoácido confirma "capping" bem sucedido dos grupos bromoacetamida reativos, assim, tornando-os indisponíveis para quaisquer reações químicas indesejáveis. Níveis aceitáveis de covalência e "capping" estão entre cerca de 1-15 para CMCA/Lys e cerca de 0-5 para CMC/Lys. Similarmente, resíduos de sulfidrila livres em excesso podem sofrer "capping" por meio de reação com um reagente eletrofílico de baixo peso molecular, tal como iodacetamida. Uma parte da CMCA pode ser derivada dos tióis de polissacarídeos com "cap" diretamente por iodo- acetamida que não esteve envolvida em conjugação com os grupos haloacila da proteína transportadora. Portanto, amostras de reação pós-conjugação (antes de "capping" por iodoacetamida) precisam ser examinadas por análise de aminoácidos (CMCA) para determinar os níveis exatos de tióis envolvidos diretamente na conjugação. Para um sacarídeo tiolado contendo 10-12 tióis é determinado que, tipicamente, 5-6 tióis estão diretamente envolvidos na conjugação entre o tiol do polissacarídeo e proteína bromoacetilada e 4-5 tióis sofrem "capping" por iodoacetamida.
[000127] Em modalidades preferidas, o primeiro reagente de "capping" é N-acetil-L-cisteína, a qual reage com grupos a-haloacetamida não conjugados na proteína transportadora. Em outras modalidades, o segundo reagente de "capping" é iodoacetamida (IAA), a qual reage com grupos sulfidrila livres não conjugados do sacarídeo tiolado ativado. Frequentemente, a etapa e) compreende "capping" com N-acetil-L- cisteína como o primeiro reagente de "capping" e IAA como o segundo reagente de "capping". Em algumas modalidades, a etapa de "capping" e) compreende ainda reação com um agente redutor, por exemplo, DTT, TCEP ou mercaptoetanol, após reação com o primeiro e/ou segundo reagentes de "capping".
[000128] Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de purificação do glicoconjugado ligado por eTEC, por exemplo, por meio de ultrafiltração/diafiltração.
[000129] Em uma modalidade preferida, o reagente bifuncional simétrico de tioalquilamina é cistamina ou um sal da mesma, a qual é reagida com o sacarídeo ativado para fornecer um sacarídeo tiolado ou um sal dos mesmo o qual contém uma porção dissulfureto.
[000130] Reação de tais derivados de sacarídeo tiolado com um agente redutor produz um polissacarídeo tiolado ativado compreendendo um ou mais resíduos de sulfidrila livres. Tais sacarídeos tiola- dos ativados podem ser isolados e purificados, por exemplo, por meio de ultrafiltração/diafiltração. Alternativamente, os sacarídeos tiolados ativados podem ser isolados e purificados, por exemplo, através de métodos convencionais de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) ou métodos cromatográficos de troca iônica, tal como DEAE, conhecidos na técnica.
[000131] No caso de sacarídeos tiolados derivados de cistamina, reação com um agente redutor cliva a ligação de dissulfureto para proporcionar um sacarídeo tiolado ativado compreendendo um ou mais resíduos de sulfidrila livres. No caso de sacarídeos tiolados derivados de cisteamina, reação com um agente redutor é opcional e pode ser usada para reduzir ligações de dissulfureto formadas por oxidação do reagente ou produto.
[000132] Agentes redutores usados nos métodos da invenção incluem, por exemplo, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT) ou mercaptoetanol. No entanto, qualquer agente redutor de dissulfureto adequado pode ser usado.
[000133] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda fornecimento de uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a-haloacetamida, de preferência um ou mais grupos a-bromoacetamida.
[000134] Reação do sacarídeo tiolado ativado com uma proteína transportadora ativada compreendendo uma ou mais porções a- haloacetamida resulta em deslocamento nucleofílico do grupo a-halo da proteína transportadora ativada pelo um ou mais grupos sulfidrila livres do sacarídeo tiolado ativado, formando a ligação de tioéter do espaçador eTEC.
[000135] Os resíduos de aminoácidos a-haloacetilados da proteína transportadora são, tipicamente, ligados aos grupos a-amino de um ou mais resíduos de lisina da proteína transportadora. Em modalidades frequentes, a proteína transportadora contém um ou mais resíduos de aminoácidos a-bromoacetilados. Em uma modalidade, a proteína transportadora é ativada com um reagente de ácido bromoacético, tal como o éster N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético (BAANS).
[000136] Em uma modalidade, o método inclui a etapa de fornecimento de uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a-haloacetamida e reação do polissacarídeo tiolado ativado com a proteína transportadora ativada para produzir um conjugado de polissacarídeo tiolado-proteína transportadora, pelo que um glicoconjugado que compreende um polissacarídeo conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC é produzido.
[000137] Em algumas modalidades preferidas dos métodos incluídos aqui, o polissacarídeo capsular bacteriano é um polissacarídeo capsular Pn derivado de S. pneumoniae. Em algumas de tais modalidades, o polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Em determi-nadas modalidades preferidas, a proteína transportadora é CRM197 e 0 polissacarídeo capsular Pn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn-serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F.
[000138] Em outras modalidades preferidas dos métodos fornecidos aqui, 0 polissacarídeo capsular bacteriano é um polissacarídeo capsular Mn derivado de N. meningitidis. Em algumas de tais modalidades, 0 polissacarídeo capsular Mn é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn-serotipo A, C, W135 e Y. Em determinadas modalidades preferidas, a proteína transportadora é CRM197 e o polissacarídeo capsular é selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn-serotipo A, C, W135 e Y.
[000139] Em algumas modalidades de cada um dos métodos fornecidos aqui, 0 sacarídeo foi combinado com imidazola ou triazola e, então, reagido com um derivado de ácido carbônico, tal como CDT, em um solvente orgânico (por exemplo, DMSO) contendo cerca de 0,2% peso/v de água para produzir sacarídeos ativados. O uso do sacarídeo combinado na etapa de ativação aumenta a solubilidade do sacarídeo no solvente orgânico. Tipicamente, 0 sacarídeo foi combinado com 10 gramas de excipiente 1,2,4-triazola por grama de polissacarídeo, seguido por mistura em temperatura ambiente para proporcionar um sacarídeo combinado.
[000140] Assim, em determinadas modalidades, os métodos compreendem ainda uma etapa de combinação do sacarídeo com triazola ou imidazola para proporcionar um sacarídeo combinado antes da etapa de ativação a). Em algumas de tais modalidades, o sacarídeo combinado é congelado em um envoltório, liofilizado e reconstituído em um solvente orgânico (tal como DMSO) e cerca de 0,2% peso/v de água são adicionados antes de ativação com o derivado de ácido carbônico, por exemplo, CDT.
[000141] Em uma modalidade, a mistura de reação com o sacarídeo tiolado é opcionalmente tratada com metil éster de N-acetil-lisina para "capping" de qualquer sacarídeo ativado não reagido. Em algumas de tais modalidades, a mistura de sacarídeo tiolado que sofreu "capping" é purificada por meio de ultrafiltração/diafiltração.
[000142] Em modalidades frequentes, o sacarídeo tiolado é reagido com um agente redutor para produzir um sacarídeo tiolado ativado. Em algumas de tais modalidades, o agente redutor é tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT) ou mercaptoetanol. Em algumas de tais modalidades, o sacarídeo tiolado ativado é purificado por meio de ultrafiltração/diafiltração.
[000143] Em uma modalidade, o método de produção de um glico- conjugado ligado por eTEC compreende a etapa de ajuste e manutenção do pH da mistura de reação de sacarídeo tiolado ativado e proteína transportadora em um pH de cerca de 8 a cerca de 9 durante cerca de 20 horas a cerca de 5 °C.
[000144] Em uma modalidade, o método de produção de um glico- conjugado da presente invenção compreende a etapa de isolamento do conjugado de sacarídeo tiolado-proteína transportadora após ele ser produzido. Em modalidades frequentes, o glicoconjugado é isolado por meio de ultrafiltração/diafiltração.
[000145] Em outra modalidade, o método de produção de um glico- conjugado de ligado por eTEC a invenção compreende a etapa de isolar a proteína transportadora sacarídeo isolado conjugado depois de ser produzido. Em modalidades frequentes, o glicoconjugado é isolado por meio de ultrafiltração/diafiltração.
[000146] Em ainda outra modalidade, o método de produção do sacarídeo ativado compreende a etapa de ajuste da concentração de água da mistura de reação compreendendo sacarídeo e CDT em um solvente orgânico para entre cerca de 0,1 e 0,4%. Em uma modalidade, a concentração de água da mistura de reação compreendendo sacarídeo e CDT em um solvente orgânico é ajustada para cerca de 0,2%.
[000147] Em uma modalidade, a etapa de ativação do sacarídeo compreende reação do polissacarídeo com uma quantidade de CDT que é um excesso molar de cerca de 5 à quantidade de polissacarídeo presente na mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular e CDT em um solvente orgânico.
[000148] Em outra modalidade, o método de produção do glicoconjugado da invenção compreende a etapa de determinação da concentração de água da mistura de reação compreendendo sacarídeo. Em uma de tais modalidades, a quantidade de CDT adicionada à mistura de reação para ativar o sacarídeo é fornecida aproximadamente em uma quantidade de CDT que é equimolar à quantidade de água presente na mistura de reação que compreende sacarídeo e CDT em um solvente orgânico.
[000149] Em outra modalidade, a quantidade de CDT adicionada à mistura de reação para ativar o sacarídeo é fornecida aproximadamente em uma quantidade de CDT que está em uma proporção molar de cerca de 0,5:1 comparado com a quantidade de água presente na mistura de reação que compreende sacarídeo e CDT em um solvente orgânico. Em uma modalidade, a quantidade de CDT adicionada à mistura de reação para ativar o sacarídeo é fornecida aproximadamente em uma quantidade de CDT que está em uma proporção molar de 0,75: 1 comparado com a quantidade de água presente na mistura de reação que compreende sacarídeo e CDT em um solvente orgânico.
[000150] Em uma modalidade, o método compreende a etapa de isolamento do polissacarídeo tiolado por meio de diafiltração. Em uma outra modalidade, o método compreende a etapa de isolamento do polissacarídeo tiolado ativado por meio de diafiltração.
[000151] Em uma modalidade, a proteína transportadora usada no método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular Pn- proteína transportadora isolado compreende CRM197. Em uma outra modalidade, a proteína transportadora usada no método de produção de um polissacarídeo capsular Mn-proteína transportadora isolado compreende CRM197.
[000152] Em algumas modalidades, a proporção sacarídeo:proteína transportadora ativada (p/p) está entre 0,2 e 4. Em outras modalidades, a proporção sacarídeo:proteína transportadora ativada (p/p) está entre 1,0 e 2,5. Em outras modalidades, a proporção sacarí- deo:proteína transportadora ativada (p/p) está entre 0,4 e 1,7. Em outras modalidades, a proporção sacarídeo:proteína transportadora ativada (p/p) é cerca de 1:1. Em algumas de tais modalidades, 0 sacarídeo é um polissacarídeo capsular bacteriano e a proteína transportadora ativada é gerada pela ativação (bromoacetilação) de CRM197.
[000153] Em outra modalidade, 0 método de produção do sacarídeo ativado compreende 0 uso de um solvente orgânico. Em modalidades frequentes, 0 solvente orgânico é um solvente aprótico polar. Em algumas de tais modalidades, 0 solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em sulfóxido de dimetila (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA), N-metil-2-pirrolidona (NMP), acetoni- trila, 1,3-Dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU) e he- xametilfosforamida (HMPA) ou uma mistura dos mesmos. Em uma modalidade preferida, 0 solvente orgânico é DMSO.
[000154] Em modalidades frequentes, isolamento do glicoconjugado ligado por eTEC compreende uma etapa de ultrafiltração/diafiltração.
[000155] Em uma modalidade, o sacarídeo usado no método de produção do glicoconjugado da presente invenção tem um peso molecular entre cerca de 10 kDa e cerca de 2.000 kDa. Em uma outra modalidade, o sacarídeo usado no método de produção do glicoconjugado da presente invenção tem um peso molecular entre cerca de 50 kDa e cerca de 2.000 kDa.
[000156] Em uma modalidade, o glicoconjugado produzido no método de produção de glicoconjugado de polissacarídeo capsular-proteína transportadora tem um tamanho entre cerca de 50 kDa e cerca de 20.000 kDa. Em outra modalidade, o glicoconjugado produzido no método de produção de glicoconjugado de polissacarídeo capsular- proteína transportadora tem um tamanho entre cerca de entre 500 kDa e cerca de 10.000 kDa. Em uma modalidade, o glicoconjugado produzido no método de produção de glicoconjugado de polissacarídeo capsular-proteína transportadora tem um tamanho entre cerca de entre 1.000 kDa e cerca de 3.000 kDa.
[000157] Em outro aspecto, a invenção proporciona um glicoconjugado que compreende um sacarídeo ligado por eTEC conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC produzido através de qualquer um dos métodos descritos aqui.
[000158] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um glicoconjugado ligado por eTEC produzido através de qualquer um dos métodos descritos aqui.
[000159] O grau de O-acetilação do sacarídeo pode ser determinado por meio de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, através de NMR de prótons (Lemercinier e Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, documento WO 05/033148 ou documento WO 00/56357). Outro método comumente usado é descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261. Ainda outro método baseia-se em cromatografia de exclusão iônica-HPLC. O grau de O- acetilação é determinado avaliando-se a quantidade de acetato livre presente em uma amostra e comparando esse valor com a quantidade de acetato liberado após uma hidrólise com base suave. O acetato é decomposto a partir de outros componentes da amostra e quantificado com uma detecção por ultravioleta (UV) a 210 nm. Outro método ba- seia-se em cromatografia de exclusão iônica- HPLC. O-acetila é determinada avaliando-se a quantidade de acetato livre presente em uma amostra e comparando esse valor com a quantidade de acetato liberado após uma hidrólise com base suave. O acetato é decomposto a partir de outros componentes da amostra e quantificado com uma detecção por ultravioleta (UV) a 210 nm.
Grau de Conjugação Determinado Por Meio de Análise de Aminoácidos
[000160] Hidrólise ácida de amostras de conjugado "pré-capping com IAA" geradas usando química de ativação com bromoacetila resultou na formação de S-carboximetilcisteamina (CMCA) estável a ácido a partir da cistamina nos sítios conjugados e S-carboximetilcisteína (CMC) estável a ácido a partir das cisteínas nos sítios que sofreram "capping". Hidrólise ácida dos conjugados "pós-capping com IAA" (finais) gerados usando a química de ativação com bromoacetila resultou na formação de S-carboximetilcisteamina (CMCA) estável a ácido a partir da cistamina nos sítios conjugados e sítios com "capping" de IAA e S-carboximetilcisteína (CMC) estável a ácido a partir das cisteínas nos sítios que sofreram "capping". Todas as lisinas não conjugadas e que não sofreram "capping" foram novamente convertidas em lisina e detectadas como tal. Todos os outros aminoácidos foram novamente hidrolisados em aminoácidos livres, exceto quanto ao tripto- fano e cisteína, os quais foram destruídos pelas condições de hidróli- se. Asparagina e glutamina foram convertidas em ácido aspártico e ácido glutâmico, respectivamente.
[000161] Os aminoácidos de cada amostra hidrolisada e de controle foram separados usando cromatografia de troca iônica, seguido por reação com uma solução Beckman Ninhydrin NinRX a 135 °C. Os aminoácidos derivatizados foram, então, detectados na faixa visível a 570 nm e 440 nm (vide Tabela 1). Um conjunto padrão de aminoácidos [Pierce Amino Acid Standard H] contendo 500 picomoles de cada aminoácido foi passado juntamente com as amostras e controles para cada conjunto de análise. S-carboximetilcisteína [Sigma-Aldrich] foi adicionada ao padrão. Tabela 1
[000162] Tempos de Retenção para Aminoácidos Usando Programa 1 de Gradiente no Analisador de Aminoácidos Beckman 6300
Figure img0003
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[000163] Lisina foi escolhida para a avaliação com base em sua ligação covalente à cisteína e cisteamina e na hidrólise similar esperada. Os números resultantes de moles de aminoácidos foram comparados com a composição de aminoácidos da proteína e registrados, juntamente com os valores para CMC e CMCA. O valor para CMCA foi usado diretamente para avaliação do grau de conjugação e o valor de CMC foi usado diretamente para avaliação do grau de "capping".
[000164] Em uma modalidade, o glicoconjugado é caracterizado por sua distribuição de tamanho molecular (Kd). O tamanho molecular dos conjugados é determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC - Size Exclusion Chromatography) em fase estacionária em meio de Sepharose CL-4B usando um sistema de cromatografia de líquido de alta pressão (High Pressure Liquid Chromatography - HPLC). Para determinação de Kd, a coluna de cromatografia é primeiro calibrada para determinar Vo, o qual representa o volume de vazio ou volume de exclusão total, e V, o volume no qual as menores moléculas na amostra eluem, o qual também é conhecido como o volume interpartículas. Toda separação por SEC ocorre entre Vo e V. O valor de Kd para cada fração coletada é determinado pela seguinte expressão: Kd = (Ve- Vi)Z(V-Vo), em que Ve representa o volume de retenção do composto. A fração % (pico principal) que elui 0,3 define a Kd (distribuição de tamanho molecular) do conjugado.
Composições Imunogênicas
[000165] O termo "composição imunogênica" refere-se à qualquer composição farmacêutica contendo um antígeno (por exemplo, um micro-organismo ou um componente do mesmo) que pode ser usado para induzir a uma resposta imune em um indivíduo.
[000166] Conforme usado aqui, "imunogênica" significa a capacidade de um antígeno (ou um epítopo do antígeno), tal como um polissacarídeo capsular bacteriano ou um glicoconjugado ou composição imunogênica compreendendo um polissacarídeo capsular bacteriano, de induzir a uma resposta imune em um indivíduo hospedeiro, tal como um mamífero, quer humoral ou celularmente mediada ou ambos.
[000167] O glicoconjugado pode servir para sensibilizar o hospedeiro pela apresentação do antígeno em associação com moléculas do MHC na superfície de uma célula. Além disso, células T antígeno específicas ou anticorpos podem ser gerados para permitir futura proteção de um hospedeiro imunizado. Glicoconjugados podem, assim, proteger o hospedeiro contra um ou mais sintomas associados à infecção por bactérias ou podem proteger o hospedeiro contra morte em virtude de infecção com a bactéria associada ao polissacarídeo capsular. Gli-coconjugados também podem ser usados para gerar anticorpos poli- clonais ou monoclonais os quais podem ser usados para conferir imunidade passiva a um indivíduo. Glicoconjugados também podem ser usados para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia animal ou por meio de um ensaio de morte opsonofagocítica.
Métodos para Indução de uma Resposta Imune e Proteção Contra Infecção
[000168] A presente invenção também inclui métodos para uso de glicoconjugados ligados por eTEC e composições imunogênicas compreendendo os mesmos, quer profilática ou terapeuticamente. Por exemplo, um aspecto da invenção proporciona um método de indução de uma resposta imune contra bactérias patogênicas, por exemplo, bactérias pneumocócicas ou meningocócicas, compreendendo administração, a um indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui compreendendo um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano derivado de bactérias patogênicas. Uma modalidade da invenção proporciona um método para proteger um indivíduo contra uma infecção por bactérias patogênicas ou um método de prevenção, tratamento ou melhora de uma doença ou condição associada à infecção por bactérias patogênicas ou um método de redução da gravidade ou retardo do início de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada por bactérias patogênicas, em cada caso os métodos compreendendo administração, a um indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui que compreende um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano derivado das bactérias patogênicas.
[000169] Uma modalidade da invenção proporciona um método de prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição bacteriana em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da invenção, em que a dita composição imunogênica compreende um glicoconjugado ligado por eTEC que compreende um antígeno bacteriano, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano.
[000170] Em algumas modalidades, o método de prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição bacteriana compreende tratamento humano, veterinário, animal ou agrícola. Outra modalidade proporciona um método de prevenção, tratamento ou melhora de uma infecção, doença ou condição bacteriana associada à bactérias patogênicas em um indivíduo, o método compreendendo geração de um anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal preparado a partir da composição imunogênica descrita aqui e uso do dito prepara-do de anticorpos para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Uma modalidade da invenção proporciona um método de prevenção de uma infecção bacteriana em um indivíduo submetido a um procedimento cirúrgico, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica descrita aqui ao indivíduo antes do procedimento cirúrgico.
[000171] Em modalidades preferidas de cada um dos processos precedentes, as bactérias patogênicas são bactérias pneumocócicas ou meningocócicas, tais como bactérias S. pneumoniae ou N. meningitidis. Em algumas de tais modalidades, o antígeno bacteriano é um polissacarídeo capsular selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn de serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Em outras modalidades, o antígeno bacteriano é um polissacarídeo capsular selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Mn de serotipo A, C, W135e Y.
[000172] Uma resposta imune a um antígeno ou composição imunogênica é caracterizada pelo desenvolvimento, em um indivíduo, de uma resposta humoral e/ou uma resposta imune mediada por célula às moléculas presentes na composição imunogênica ou antígeno de interesse. Para fins da presente invenção, uma "resposta imune humoral" é uma resposta imune mediada por anticorpo e envolve a indução e produção de anticorpos que reconhecem e se ligam com alguma afinidade ao antígeno na composição imunogênica da invenção, enquanto que uma "resposta imune mediada por célula" é mediada por células T e/ou outros glóbulos brancos. Uma "resposta imune mediada por célu-las" é provocada pela apresentação de epítopos antigênicos em associação com moléculas do principal complexo de histocompatibilidade (Major Histocompatibility - MHC) de Classe I ou Classe II, CD1 ou outras moléculas de tipo MHC não clássicas. Isto ativa as células T CD4+ auxiliares antígeno específicas ou células de linfócitos T citotóxicos CD8+ ("CTLs"). CTLs têm especificidade por antígenos peptídicos que são apresentados em associação com proteínas codificadas por MHCs clássicas ou não clássicas e expressas sobre as superfícies das células. CTLs ajudam a induzir e promover a destruição intracelular de micro-organismos intracelulares ou a lise de células infectadas por tais micro-organismos. Outro aspecto da imunidade celular envolve uma resposta antígeno específica por células T auxiliares. Células T auxiliares atuam ajudando a estimular a função e concentrar a atividade de células efetuadoras não específicas contra células que exibem peptídeo ou outros antígenos em associação com moléculas do MHC clás-sicas ou não clássicas sobre sua superfície. Uma "resposta imune mediada por células" refere-se igualmente à produção de citocinas, qui- miocinas e outras moléculas produzidas pelas células T ativadas e/ou outros glóbulos brancos, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+. A capacidade de um antígeno ou composição particular de estimular uma resposta imune mediada por células pode ser determinada por uma série de ensaios, tal como por ensaios de linfoprolife- ração (ativação de linfócitos), ensaios de células citotóxicas CTL, en-saios de linfócitos T antígeno específicos em uma indivíduo sensibilizado ou medindo-se a produção de citocinas por células T em resposta à nova estimulação com o antígeno. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Erickson etal. (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199; e Doe etal. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376.
[000173] As composições imunogênicas e métodos da invenção podem ser úteis para um ou mais dos seguintes procedimentos: (i) pre-venção de infecção ou reinfecçâo, tal como em uma vacina tradicional, (ii) redução da gravidade de ou eliminação de sintomas e/ou (iii) eliminação substancial ou completa do patógeno ou distúrbio em questão. Consequentemente, tratamento pode ser realizado profilaticamente (antes de infecção) ou terapeuticamente (após infecção). Na presente invenção, tratamento profilático é o modo preferido. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, são fornecidas com-posições e métodos que tratam, incluindo imunizam profilática e/ou terapeuticamente, um indivíduo hospedeiro contra infecção bacteriana, por exemplo, por S. pneumoniae ou N. meningitidis. Os métodos da presente invenção são úteis para conferir imunidade profilática e/ou terapêutica a um indivíduo. Os métodos da presente invenção também podem ser praticados em indivíduos para aplicações de pesquisa bio- médica.
[000174] Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" significa um animal humano ou não humano. Mais particularmente, indivíduo refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de criação, animais de pesquisa, de zoológico, desporto e de companhia, animais de estimação, tal como um animal de estimação doméstico e outros animais domesticados incluindo, porém sem limitações, gado, ovelhas, furões, suínos, cavalos, coelhos, cabras, cães, gatos e similares. Animais de companhia preferidos são cães e gatos. De preferência, o indivíduo é um ser humano.
[000175] A quantidade de um conjugado particular em uma composição é geralmente calculada com base na quantidade total de polissacarídeo, tanto conjugado quanto não conjugado para este conjugado. Por exemplo, um conjugado com 20% de polissacarídeos livres terá cerca de 80 pg de conjugado de polissacarídeo e cerca de 20 pg de polissacarídeo não conjugado em uma dose de polissacarídeo de 100 pg. A contribuição da proteína para o conjugado não é usualmente considerada no cálculo das doses de um conjugado. A quantidade imunogênica de uma composição ou conjugado imunogênico pode variar dependendo do serotipo bacteriano. Geralmente, cada dose compreende 0,1 a 100 pg do polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 mg e, mais particularmente, 1 a 10 pg. A quantidade imunogênica dos diferentes componentes polissacarídicos em uma composição imunogênica pode divergir e cada um pode compreender 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 15 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 90 pg ou cerca de 100 pg de qualquer antígeno polissacarídico particular.
[000176] O termo "doença invasiva" refere-se ao isolamento de bactérias de um local normalmente estéril, em que existem sinto- mas/sinais clínicos associados de doença. Normalmente, partes no corpo estéreis incluem sangue, CSF, líquido pleural, líquido pericárdi- co, líquido peritoneal, líquido articular/sinovial, osso, partes internas do corpo (linfonodo, cérebro, coração, fígado, baço, fluido vítreo, rim, pâncreas, ovário) ou outros locais normalmente estéreis. Condições clínicas que caracterizam doenças invasivas incluem bacteremia, pneumonia, celulite, osteomielite, endocardite, choque séptico e assim por diante.
[000177] A eficácia de um antígeno como imunogênio pode ser medida por ensaios de proliferação, por ensaios citolíticos, tais como ensaios de liberação de cromo para medir a capacidade de uma célula T de submeter a célula alvo específica à lise, ou avaliando os níveis de atividade de células B medindo-se os níveis de anticorpos em circulação no soro específicos para o antígeno. Uma resposta imune pode também ser detectada medindo-se os níveis séricos de anticorpos antígeno específicos induzidos após administração do antígeno e, mais especificamente, medindo-se a capacidade dos anticorpos assim induzidos de aumentar a capacidade opsonofagocítica de glóbulos brancos específicos, conforme descrito aqui. O nível de proteção da resposta imune pode ser medido desafiando o hospedeiro imunizado com o antígeno que foi administrado. Por exemplo, se o antígeno para o qual uma resposta imune é desejada é uma bactéria, o nível de proteção induzido pela quantidade imunogênica do antígeno é medido detectando-se a percentagem de sobrevivência ou a percentagem de mortalidade após o desafio dos animais com as células bacterianas. Em uma modalidade, a quantidade de proteção pode ser avaliada medin- do-se pelo menos um sintoma associado à infecção bacteriana, por exemplo, uma febre associada à infecção. A quantidade de cada um dos antígenos na vacina com múltiplos antígenos ou vacina com múltiplos componentes ou composições imunogênicas variará em relação a cada um dos outros componentes e pode ser determinada por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos incluem procedimentos para medir a imunogenicidade e/ou eficácia in vivo.
[000178] Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos e composições de anticorpos que se ligam específica e seletivamente aos polissacarídeos capsulares ou glicoconjugados da presente invenção. Em algumas de tais modalidades, a invenção proporciona anticorpos e composições de anticorpos que se ligam específica e seletivamente aos polissacarídeos capsulares Pn de serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F ou glicoconjugados compreendendo os mesmos. Em outras modalidades, a invenção proporciona anticorpos e composições de anticorpos que se ligam específica e seletivamente a polissacarídeos capsulares Mn de serotipo A, C, W135 ou Y ou glicoconjugados compreendendo os mesmos. Em algumas modalidades, os anticorpos são gerados por meio de administração, a um indivíduo, dos polissacarídeos capsulares ou glicoconjugados da presente invenção. Em algu-mas modalidades, a invenção proporciona anticorpos purificados ou isolados dirigidos contra um ou mais dos polissacarídeos capsulares ou glicoconjugados da presente invenção. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são funcionais, conforme medido por morte de bactérias em qualquer modelo de eficácia animal ou através de um ensaio de morte opsonofagocítica. Os anticorpos ou composições de anticorpos da invenção podem ser usados em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição bacteriana associada à bactérias patogênicas em um indivíduo, por exemplo, bactérias S. pneumoniae ou N. meningitidis, o método compreendendo geração de um anticorpo policlonal ou preparo de anticorpo monoclonal e uso do dito anticorpo ou composição de anticorpos para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Os anticorpos da invenção também podem ser úteis para métodos diagnósticos, por exemplo, detecção da presença ou quantificação dos níveis de polissacarídeo capsular ou um glicoconjugado do mesmo. Por exemplo, os anticorpos da invenção também podem ser úteis para detecção da presença ou quantificação dos níveis de um polissacarídeo capsular Pn ou Mn ou um glicoconjugado mesmo, em que o glicoconjugado compreende o polissacarídeo capsular bacteriano conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC.
[000179] Vários ensaios e modelos animais conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar a eficácia de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui. Por exemplo, Chiavolini et al. Clin. Microbiol. Rev. (2008), 21(4): 666-685) descrevem modelos animais de doenças por S. pneumoniae. Gorringe et al. METHODS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 66 (2001), Capítulo 17, Pollard and Maiden eds. (Humana Press Inc.) descrevem modelos animais para doenças meningocócicas.
Ensaio de Atividade Opsonofagocítica (OPA)
[000180] Procedimentos de ensaio de OPA foram com base nos métodos previamente descritos por Hu, et al. (Clin. Diaqn. Lab. Immunol. 2005; 12(2): 287-95), com as seguintes modificações. Soros termica- mente inativados foram diluídos em série 2,5 vezes em tampão. Bactérias alvo foram adicionadas às placas de ensaio e foram incubadas durante 30 min a 25°C em um agitador. Complemento de coelho bebê (3 a 4 semanas de idade, Pel-Freez, concentração final de 12,5%) e células HL-60 diferenciadas foram, então, adicionados a cada cavidade a uma proporção aproximada de efetuador para alvo de 200:1. As placas de ensaio foram incubadas durante 45 minutos a 37°C em um agitador. Para terminar a reação, 80 pL de NaCI a 0,9% foram adicionados à todas as cavidades, misturados e uma alíquota de 10 pL foi transferida para cavidades de placas com filtro MultiScreenHTS HV da Millipore contendo 200 pL de água. Líquido foi filtrado através das placas sob vácuo e 150 pL de meio HySoy foram adicionados a cada cavidade e filtrado. As placas com filtro foram, então, incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante a noite e foram, então, fixadas com solução Des- tain (Bio-Rad). As placas foram, então, coradas com azul de Coomas- sie e descoradas uma vez. Colônias foram fotografadas e enumeradas em um Immunospot Analyzer® da Cellular Technology Limited (CTL). A titulação de anticorpos OPA foi interpolada a partir da recíproco das duas diluições de soro abrangendo 0 ponto de redução de 50% no número de colônias bacterianas comparado com as cavidades de controle que não continham soro imune.
[000181] A descrição precedente descreve genericamente a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos exemplos específicos a seguir. Estes exemplos são descritos unicamente para fins de ilustração e não se destinam a limitar 0 âmbito da invenção.
EXEMPLOS
[000182] Exemplo 1. Processo Geral de Preparo de Glicoconjugados Ligados por eTEC
Ativação de Sacarídeo e Tiolação com Dicloridrato de Cistamina
[000183] O sacarídeo é reconstituído em sulfóxido de dimetila (DMSO) anidro. O teor de umidade da solução é determinado por meio de análise de Karl Fischer (KF) e ajustado para alcançar um teor de umidade de 0,1 e 0,4%, tipicamente 0,2%.
[000184] Para iniciar a ativação, uma solução de 1,1-carbonil-di- 1,2,4-triazola (CDT) ou 1 ,T-carbonildi-imidazola (CDI) é preparada fresca em uma concentração de 100 mg/mL em DMSO. O sacarídeo é ativado com várias quantidades de CDT/CDI (1-10 equivalentes molares) e a reação é deixada prosseguir durante 1 hora a 23 ± 2 °C. O nível de ativação pode ser determinado por HPLC. Dicloridrato de cistamina é preparado em DMSO anidro em uma concentração de 50 mg/mL. O sacarídeo ativado é reagido com 1 eq. mol. de dicloridrato de cistamina. Alternativamente, o sacarídeo ativado é reagido com 1 eq. mol.de cloridrato de cisteamina. A reação de tiolação é deixada prosseguir durante 21 ± 2 horas a 23 ± 2 °C para produzir um sacarídeo tiolado. O nível de tiolação é determinado pela quantidade adicionada de CDT/CDI.
[000185] CDT/CDI residuais na solução de reação de ativação são dissipados mediante adição de solução de tetraborato de sódio a 100 mM, pH de 9,0. Cálculos são realizados para determinar a quantidade adicionada de tetraborato e ajustar o teor de umidade final para ser de até 1-2% da solução aquosa total.
Redução e Purificação de Sacarídeo Tiolado Ativado
[000186] A mistura de reação de sacarídeo tiolado é diluída 10 vezes mediante adição a succinato de sódio a 5 mM em soro fisiológico a 0,9% pré-resfriado, pH de 6,0, e filtrada através de um filtro de 5 pm. Dialfiltração do sacarídeo tiolado é realizada contra um diavolume de 40 vezes de WFI. Ao retentado, uma solução de tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP), 1-5 eq. mol., é adicionada após diluição em um volume de 10% de tampão de fosfato de sódio a 0,1 M, pH de 6,0. Esta reação de redução é deixada prosseguir durante 20 ± 2 horas a 5 ± 3 °C. Purificação do sacarídeo tiolado ativado é, de preferência, realizada por meio de ultrafiltração/dialfiltração contra fosfato de sódio monobásico a 10 mM pré-resfriado, pH de 4,3. Alternativamente, o sacarídeo tiolado é purificado por procedimentos de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) convencional ou métodos cromatográficos de permuta iônica. Uma alíquota de retentado de sacarídeo tiolado ativado é extraída para determinar a concentração de sacarídeo e ensaios de teor de tiol (Ellman).
Redução Alternativa e Purificação de Sacarídeo Tiolado Ativado
[000187] Como uma alternativa ao procedimento de purificação descrito acima, sacarídeo tiolado ativado foi também purificado como segue.
[000188] À mistura de reação de sacarídeo tiolado, uma solução de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 5 - 10 eq. mol., é adicionada e deixada prosseguir durante 3 ± 1 horas a 23 ± 2 °C. A mistura de reação foi, então, diluída 5 vezes mediante adição à succinato de sódio a 5 mM em soro fisiológico a 0,9% pré-resfriado, pH de 6,0, e filtrada através de um filtro de 5 pm. Dialfiltração de sacarídeo tiolado foi realizada usando um diavolume de 40 vezes de fosfato de sódio a 10 mM pré- resfriado, pH de 4,3. Uma alíquota de retentado de sacarídeo tiolado ativado foi extraída para determinar a concentração de sacarídeo e ensaios do teor de tiol (Ellman).
Ativação e Purificação de Proteína transportadora Bromoacetilada
[000189] Grupos amino livres da proteína transportadora são bromo- acetilados por meio de reação com um agente de bromoacetilação, tal como éster N-hidroxissuccinimida de ácido bromoacético (BAANS), brometo de bromoacetila ou outro reagente adequado.
[000190] A proteína transportadora (em 0 fosfato de sódio a,1 M, pH de 8,0 ± 0,2) é primeiro mantida a 8 ± 3 °C em um pH de cerca de 7 antes de ativação. À solução de proteína, o éster N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético (BAANS) como uma solução de estoque em sulfóxido de dimetila (DMSO) (20 mg/mL) é adicionado em uma proporção de BAANS:proteína de 0,25:0,5 (p/p). A reação é misturada suavemente a 5 + 3 °C durante 30 - 60 minutos. A proteína bromoace- tilada (ativada) resultante é purificada, por exemplo, por meio de ultra- filtração/diafiltração usando uma membrana com MWCO de 10 kDa usando tampão de fosfato a 10 mM (pH de 7,0). Após purificação, a concentração de proteína da proteína transportadora bromoacetilada é estimada pelo ensaio de proteína de Lowry.
[000191] O grau de ativação é determinado pelo ensaio de brometo total por meio de cromatografia de líquido de permuta iônica acoplada com detecção de condutividade suprimida (cromatografia iônica). O brometo ligado sobre a proteína bromoacetilada ativada é clivado da proteína quando de preparo de amostras de ensaio e quantificado juntamente com qualquer brometo livre que possa estar presente. Qualquer bromo covalentemente ligado restante na proteína é liberado pela conversão de brometo iônico através de aquecimento da amostra em 2-mercaptoetanol alcalino.
Ativação e Purificação de CRM197 Bromoacetilada
[000192] CRM197 foi diluída para 5 mg/mL com fosfato a 10 mM tam- ponado com NaCI a 0,9%, pH de 7 (PBS) e, então, NaHCOs a 0,1 M, pH de 7,0, usando solução de estoque a 1 M. BAANS foi adicionado em uma proporção de CRMw:BAANS de 1:0,35 (p/p) usando uma solução de estoque de BAANS de 20 mg/mL em DMSO. A mistura de reação foi incubada entre 3 °C e 11 °C durante 30 minutos-1 hora, en-tão, purificada por meio de ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana com MWCO de 10K e fosfato de sódio a 10 mM/NaCI a 0,9%, pH de 7,0. A CRM197 ativada purificada foi testada pelo ensaio de Lowry para determinar a concentração de proteína e, então, diluída com PBS para 5 mg/mL. Sacarose foi adicionada a 5% p/v como um crioprotetor e a proteína ativada foi congelada e armazenada a 25 °C até necessária para conjugação.
[000193] Bromoacetilação de resíduos de lisina de CRM197 foi muito consistente, resultando na ativação de 15 a 25 lisinas das 39 lisinas disponíveis. A reação produziu rendimentos elevados de proteína ativada.
Conjugação de Sacarídeo Tiolado Ativado á Proteína transportadora Bromoacetilada
[000194] Antes de iniciar a reação de conjugação, os vasos de reação são pré-resfriados para 5 °C. Proteína transportadora bromoacetilada e sacarídeo tiolado ativado são subsequentemente adicionados e misturados em uma velocidade de agitação de 150-200 rpm. A proporção de entrada de sacarídeo/proteína é de 0,9 ± 0,1. O pH da reação é ajustado para 8,0 ± 0,1 com solução de NaOH a 1 M. A reação de conjugação é deixada prosseguir a 5 °C durante 20 ± 2 horas.
"Capping" de Grupos Funcionais Reativos Residuais
[000195] Os resíduos bromoacetilados não reagidos na proteína transportadora são dissipados por meio de reação com 2 eq. mol. de N-acetil-L-cisteína como um reagente de "capping" durante 3 horas a 5°C. Grupos sulfidrila livres residuais sofram "capping" com 4 eq. mol.de iodoacetamida (IAA) durante 20 horas a 5 °C.
Purificação de Glicoconjugado Ligado por eTEC
[000196] A mistura de reação de conjugação (pós-capping com IAA) é filtrada através de um filtro de 0,45 pm. Ultrafiltração/dialfiltração do glicoconjugado é realizada contra succinato a 5 mM-soro fisiológico a 0,9%, pH de 6,0. O retentado de glicoconjugado é, então, filtrado através de um filtro de 0,2 pm. Uma alíquota de glicoconjugado é extraída para ensaios. O glicoconjugado restante é armazenado a 5°C.
[000197] Exemplo 2. Preparo de Conjugados de Pn-33F eTEC
Processo de Ativação Ativação de Polissacarídeo Pn-33F
[000198] Polissacarídeo Pn-33F foi combinado com 1,2,4-triazola a 500 mM (em WFI) para obter 10 gramas de triazola por grama de polissacarídeo. A mistura foi congelada em envoltório em banho de gelo seco-etanol e, então, liofilizada até secagem. O polissacarídeo 33F liofilizado foi reconstituído em sulfóxido de dimetila (DMSO) anidro. O teor de umidade da solução de 33F/DMSO liofilizada foi determinado por análise de Karl Fischer (KF). O teor de umidade foi ajustado medi-ante adição de WFI à solução de 33F/DMSO para alcançar um teor de umidade de 0,2%.
[000199] Para iniciar a ativação, 1,1 '-carbonil-di-1,2,4-triazola (CDT) foi preparada fresco como 100 mg/mL em solução de DMSO. Polissacarídeo Pn-33F foi ativado com várias quantidades de CDT antes da etapa de tiolação. A ativação com CDT foi realizada a 23 ± 2°C durante 1 hora. O nível de ativação foi determinado por HPLC (A220/A205). Solução de tetraborato de sódio a 100 mM, pH de 9,0, foi adicionada para dissipar qualquer CDT residual na solução de reação de ativação. Cálculos são realizados para determinar a quantidade adicionada de tetraborato e permitir que o teor de umidade final fosse de 1,2% de solução aquosa total. A reação foi deixada prosseguir durante 1 hora a 23 ±2 °C.
Tiolação de Polissacarídeo Pn-33F Ativado
[000200] Dicloridrato de cistamina foi preparado fresco em DMSO anidro e 1 eq. mol. de dicloridrato de cistamina foi adicionado à solução de reação de polissacarídeo ativado. A reação foi deixada prosseguir durante 21 ± 2 horas a 23 ± 2 °C. A solução de sacarídeo tiolado foi diluída 10 vezes mediante adição a succinato de sódio a 5 mM em soro fisiológico a 0,9% pré-resfriado, pH de 6,0. A solução de reação diluída foi filtrada através de um filtro de 5 pm. Dialfiltração de polissacarídeo Pn-33F tiolado foi realizada com cassetes de membrana de ultrafiltração com MWCO de 100K usando água para injeção (Water For Injection - WFI).
[000201] O nível de tiolação dos polissacarídeos Pn-33F ativados como uma função de equivalentes molares de CDT é mostrado na Figura 8.
Redução e Purificação de Polissacarídeo Pn-33F Tiolado Ativado
[000202] Ao retentado, uma solução de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 5 eq. mol., foi adicionada após diluição em um volume de 10% de tampão de fosfato de sódio a 0,1 M, pH de 6,0. Esta reação de redução foi deixada prosseguir durante 2 horas a ± 1 23 ± 2 °C. Dialfiltração de polissacarídeo 33F tiolado foi realizada com cassetes de membrana de ultrafiltração com MWCO de 100K. Diafiltração foi realizada contra fosfato de sódio a 10 mM pré-resfriado, pH de 4,3. O retentado de polissacarídeo 33F tiolado foi extraído para ensaios de concentração de sacarídeo e tiol (Ellman).
Redução Alternativa e Purificação de Polissacarídeo Pn-33F Tiolado Ativado
[000203] Como uma alternativa ao procedimento de purificação descrito acima, sacarídeo 33F ativado tiolado foi também purificado como segue.
[000204] À mistura de reação de sacarídeo tiolado, uma solução de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 5 eq. mol., foi adicionada e deixada prosseguir durante 3 ± 1 horas a 23 ± 2 °C. A mistura de reação foi, então, diluída 5 vezes mediante adição de succinato de sódio a 5 mM em soro fisiológico a 0,9% pré-resfriado, pH de 6,0, e filtrada através de um filtro de 5 pm. Dialfiltração de sacarídeo tiolado foi realizada usando um diavolume de 40 vezes de fosfato de sódio a 10 mM pré- resfriado, pH de 4,3, com cassetes de membrana de ultrafiltração com MWCO de 100K. O retentado de polissacarídeo 33F tiolado foi extraído para ensaios de concentração de sacarídeo e tiol (Ellman). Um flu- xograma do processo de ativação é fornecido na Figura 7(A).
Processo de Conjugação Conjugação de polissacarídeo Pn-33F Tiolado à CRM197 Bromoaceti- lada
[000205] A proteína transportadora CRM197 foi ativada separadamente por meio de bromoacetilação conforme descrito no Exemplo 1 e, então, reagida com 0 polissacarídeo Pn-33F ativado para a reação de conjugação. Antes de iniciar a reação de conjugação, 0 reator foi pré- resfriado para 5 °C. CRM197 bromoacetilada e polissacarídeo 33F tiolado foram misturados juntos em um vaso de reação em uma velocidade de agitação de 150-200 rpm. A proporção de entrada de sacarí- deo/proteína foi de 0,9 ± 0,1. O pH da reação foi ajustado para 8,0-9,0. A reação de conjugação foi deixada prosseguir a 5 °C durante 20 ± 2 horas.
"Capping" de Grupos Reativos em CRM197 Bromoacetilada e polissacarídeo Pn-33F Tiolado
[000206] Os resíduos bromoacetilados não reagidos sobre proteínas CRM197 sofreram "capping" por meio de reação com 2 eq. mol. de N- acetil-L-cisteína durante 3 horas a 5 °C, seguido por "capping" de quaisquer grupos sulfidrila livres residuais do polissacarídeo 33F tiolado com 4 eq. mol. de iodoacetamida (IAA) durante 20 horas a 5°C.
Purificação de Glicoconjugado de Pn-33F Ligado por eTEC
[000207] A solução de conjugação foi filtrada através de um filtro de 0,45 pm ou 5 pm. Dialfiltração do glicoconjugado de 33F foi realizada com cassetes de membrana de ultrafiltração com MWCO de 300K. Di- afiltração foi realizada contra succinato a 5 mM-soro fisiológico a 0,9%, pH de 6,0. O retentado de 300K do glicoconjugado de Pn-33F foi, en- tão, filtrado através de um filtro de 0,22 pm e armazenado a 5°C.
[000208] Um fluxograma do processo de conjugação é fornecido na Figura 7 (B).
Resultados
[000209] Os parâmetros de reação e dados de caracterização para vários lotes de glicoconjugados de Pn-33F eTEC são mostrados na Tabela 2. A ativação-tiolação de CDT com dicloridrato de cistamina gerou glicoconjugados tendo rendimentos de sacarídeo de 63 a 90% e <1% a 13% de sacarídeos livres. Tabela 2. Parâmetros Experimentais e Dados de Caracterização de Conjugados de Pn-33F eTEC
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Titulações de OPA em Glicoconjugados de Pn-33F eTEC á CRM197
[000210] As titulações de OPA em Pn-33F em camundongos foram determinadas sob condições convencionais. As titulações de OPA (GMT com IC de 95%) em quatro e sete semanas são mostradas na Tabela 3, demonstrando que 0 glicoconjugado de serotipo Pn-33F induziu à titulações de OPA em um modelo de imunogenicidade com murinos. Tabela 3. Titulações de OPA em PN-33F (GMT com IC de 95%)
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Exemplo 3. Preparo de Conjugados de Pn-22F eTEC Processo de Ativação Ativação de Polissacarídeo Pn-22F
[000211] Polissacarídeo Pn-22F foi combinado com 1,2,4-triazola a 500 mM (em WFI) para obter 10 gramas de triazola por grama de polissacarídeo. A mistura foi congelada em envoltório em um banho de gelo seco-etanol e, então, liofilizada até secagem. O polissacarídeo 22F liofilizado foi reconstituído em sulfóxido de dimetila (DMSO) anidro. O teor de umidade da solução de 22F/DMSO liofilizada foi deter-minado por análise de Karl Fischer (KF). O teor de umidade foi ajustado mediante adição de WFI à solução de Pn-22F/DMSO para alcançar um teor de umidade de 0,2%.
[000212] Para iniciar a ativação, 1,T-carbonil-di-1,2,4-triazola (CDT) foi preparada fresca como 100 mg/mL em solução de DMSO. Polissacarídeo Pn-22F foi ativado com várias quantidades de CDT, seguido por tiolação com 1 eq. mol. de dicloridrato de cistamina. A ativação com CDT foi realizada a 23 ± 2 °C durante 1 hora. O nível de ativação foi determinado por HPLC (A220/A205). Solução de tetraborato de só-dio, 100 mM, pH de 9,0, foi adicionada para dissipar qualquer CDT residual na solução de reação de ativação. Cálculos são realizados para determinar a quantidade adicionada de tetraborato e permitir que o teor de umidade final seja de 1,2% de solução aquosa total. A reação foi deixada prosseguir durante 1 hora a 23 ± 2 °C.
Tiolação de Polissacarídeo Pn-22F Ativado
[000213] Dicloridrato de cistamina foi preparado fresco em DMSO anidro e adicionado à solução de reação. A reação foi deixada prosseguir durante 21 ± 2 horas a 23 ± 2 °C. A solução de sacarídeo tiolado foi diluída 10 vezes mediante adição a succinato de sódio a 5 mM em soro fisiológico a 0,9% pré-resfriado, pH de 6,0. A solução de reação diluída foi filtrada através de um filtro de 5 pm. Dialfiltração de polissacarídeo Pn-22F tiolado foi realizada com cassetes de membrana de ultrafiltração com MWCO de 100K usando água para injeção (Water For Injection - WFI).
Redução e Purificação de Polissacarídeo Tiolado Ativado Pn-22F
[000214] Ao retentado, uma solução de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 5 - 10 eq. mol., foi adicionada após diluição em um volume de 10% de tampão de fosfato de sódio a 0,1 M, pH de 6,0. Esta reação de redução foi deixada prosseguir durante 2 ± 1 hora a 23 ± 2 °C. Diafil- tração de polissacarídeo 22F tiolado foi realizada com cassetes de membrana de ultrafiltração com MWCO de 100K. Diafiltração foi realizada contra fosfato de sódio a 10 mM pré-resfriado, pH de 4,3. O retentado de polissacarídeo 22F tiolado foi extraído para ensaios de concentração de sacarídeo e tiol (Ellman).
Conjugação, "Capping" e Purificação de Glicoconjugados de PN-22F eTEC
[000215] Conjugação do polissacarídeo Pn22F tiolado ativado à CRMi97 ativada, "capping" e purificação dos glicoconjugados de Pn- 22F eTEC foram realizados de acordo com os processos descritos no Exemplo 2.
Resultados
[000216] Os dados de caracterização e processos representativos para glicoconjugados de Pn 22F-ETEC à CRM197 são fornecidos na Tabela 4. Tabela 4. Parâmetros Experimentais e Dados de Caracterização Para Conjugados de Pn-22F eTEC
Figure img0008
Figure img0009
Exemplo 4. Preparo de Conjugados de Pn-10A eTEC à CRM197 Preparo de Glicoconjugados de PN-10A eTEC
[000217] Glicoconjugados que compreendem 0 polissacarídeo capsular pneumocócico de serotipo 10A (10A-Pn) conjugado à CRM197 por meio do espaçador eTEC foram preparados de acordo com os processos descritos no Exemplo 2.
Caracterização de Glicoconjugados de PN-10A eTEC
[000218] Os dados de caracterização e processos representativos para glicoconjugados de Pn-10A eTEC à CRM197 são fornecidos na Tabela 5. Tabela 5. Parâmetros Experimentais e Dados de Caracterização Para Glicoconjugados de PN-10ª
Figure img0010
Figure img0011
Titulações de OPA em Pn-10A
[000219] As titulações de OPA contra o conjugado de Pn-10A eTEC à CRM197 em camundongos foram determinadas sob condições convencionais. As titulações de OPA como uma função da dose são mostradas na Tabela 6. Os titulações de OPA foram significativamente maiores para 0 conjugado em relação ao polissacarídeo de serotipo 10A não conjugado. Tabela 6. Titulações de OPA em PN-10A (GMT com IC de 95%)
Figure img0012
Exemplo 5. Preparo de Conjugados de Pn-11A eTEC à CRM197
Preparo de Glicoconjugados de PN-11A eTEC
[000220] Glicoconjugados que compreendem 0 polissacarídeo capsular pneumocócico de serotipo 11A (11 A-Pn) conjugado à CRM197 por meio do espaçador eTEC foram preparados de acordo com os processos descritos no Exemplo 2.
Caracterização de Glicoconjugados de PN-11A eTEC
[000221] Os dados de caracterização e processos representativos para glicoconjugados de Pn-11A ETEC à CRM197 são fornecidos na Tabela 7. Tabela 7. Parâmetros Experimentais e Dados de Caracterização para Glicoconjugados de PN-11ª
Figure img0013
Titulações de OPA em Pn-11A
[000222] As titulações de OPA contra o conjugado de Pn-11A eTEC à CRM197 em camundongos foram determinadas sob condições convencionais. As titulações de OPA como uma função da dose são mostradas na Tabela 8. Tabela 8. Titulações de OPA em Pn-11A (GMT com IC de 95%)
Figure img0014
Exemplo 6. Preparo de conjugados de Pn-33F RAC/Aquosa à CRM197
Preparo de Glicoconjugados de Pn-33F RAC/Aquosa
[000223] Glicoconjugados de Pn-33F foram preparados usando ami- nação redutiva em fase aquosa (RAC/aquosa), o qual tem sido aplicado com sucesso para produzir uma vacina de conjugado pneumocócica (vide, por exemplo, documento WO 2006/110381). Esta abordagem compreende duas etapas. A primeira etapa é oxidação de polissacarídeo para gerar a funcionalidade aldeído a partir de dióis vicinais. A segunda etapa é conjugar o polissacarídeo ativado aos resíduos de lisina (Lys) de CRM 197-
[000224] Resumidamente, polissacarídeo congelado foi descongelado e oxidação foi realizada em tampão de fosfato de sódio em um pH de 6,0 mediante adição de diferentes quantidades de periodato de sódio (NalOzi). Concentração e diafiltração do polissacarídeo ativado foram realizadas e o polissacarídeo ativado purificado foi armazenado a 4 °C. Polissacarídeo ativado foi combinado com a proteína CRM197. Mistura completa do polissacarídeo e CRM197 é realizada antes de co-locar 0 frasco em banho de gelo seco/etanol, seguido por liofilização da mistura de polissacarídeo/CRMi97. A mistura liofilizada foi reconstituída em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M. Reação de conjugação foi iniciada mediante adição de 1,5 equivalentes molares de cianoboro- hidreto de sódio e incubação durante 20 horas a 23 °C e mais 44 horas a 37°C. As reações foram diluídas com um volume de 1x soro fisiológico a 0,9% e "capping" realizado com 2 mEq de boro-hidreto de sódio durante 3 horas a 23 °C. A mistura de reação foi diluída com um volume de 1x soro fisiológico a 0,9% e, então, filtrada através de um filtro de 0,45 pm antes de purificação. Concentração e diafiltração do conjugado foram realizadas usando cassetes de membrana de UF com MWCO de 100K.
[000225] Vários conjugados foram obtidos usando o processo descrito acima variando diferentes parâmetros (por exemplo, pH, temperatura das reações e concentração de polissacarídeo).
[000226] O rendimento típico de polissacarídeo foi de aproximadamente 50% para estes conjugados e 15% de sacarídeos livres com um MW do conjugado na faixa de 2000-3500 kDa.
[000227] No entanto, o polissacarídeo de serotipo 33F nativo contém um grupo O-acetila em C2 do resíduo de 5-galactofuranose e desco- briu-se que ~ 80% dos grupos funcionais acetila são removidos ao longo do processo de conjugação usando aminação redutiva em fase aquosa. Observou-se que o grupo O-acetila na estrutura em anel de cinco elementos (5-galactofuranosídeo) pode migrar e ser removido com facilidade usando o química de aminação redutiva no processo em fase aquosa.
Avaliação de Estabilidade de Glicoconjugado de Pn-33F RAC/Aquosa
[000228] Alíquotas de conjugados de RAC/aquosa representativos preparados por meio do processo descrito acima foram colocadas em tubos de polipropileno. Estes tubos foram armazenados a 25 °C ou a 37 °C e a estabilidade foi monitorada até 3,5 meses. Em cada ponto de tempo de estabilidade, os níveis % de sacarídeos livres foram avaliados. Os dados de estabilidade em ambas as temperaturas são re-sumidos na Tabela 9. Conforme mostrado na Tabela 9, os níveis % de sacarídeos livres aumentaram significativamente a 25 °C e 37 °C. Aumento nos níveis % de sacarídeos livre durante armazenamento é um indicador potencial de degradação do polissacarídeo no conjugado. Tabela 9: Dados de Estabilidade Para Conjugado RAC/Aquosa a 25°C e 37 °C
Figure img0015
Figure img0016
wk = semana; M = mês.
[000229] Embora o polissacarídeo de sorotipo 33F tenha sido ativado com sucesso por meio da reação com periodato de sódio e, subsequentemente, conjugado à CRM197 explorando a química de amina- ção redutiva aquosa, os resultados de estabilidade de % de sacarídeos livres sob condições aceleradas combinado com a incapacidade de preservar a funcionalidade acetila (um epítopo polissacarídico chave para imunogenicidade ) durante conjugação sugeriram que o processo de RAC/aquosa não é o processo ideal para conjugação do serotipo 33F. Exemplo 7. Preparo de Conjugados de Pn-33F RAC/DMSO à CRM197
Preparo de Glicoconjugados de Pn-33F RAC/DMSO
[000230] Comparado ao processo de RAC/aquosa, conjugação realizada via aminação redutiva em DMSO (RAC/DMSO) geralmente tem uma chance significativamente menor de de-O-acetilação. Em vista dos desafios associados à preservação da funcionalidade O-acetila usando 0 processo de RAC/aquosa descrito no Exemplo 6, uma abordagem alternativa usando RAC/solvente DMSO, a qual tem sido aplicada com sucesso para produzir uma vacina de conjugado pneumocó- cico (vide, por exemplo, documento WO 2006/110381) foi avaliada.
[000231] Polissacarídeo ativado foi combinado com sacarose (50% peso/v em WFI) usando uma proporção de 25 gramas de sacarose por grama de polissacarídeo ativado. Os componentes foram bem misturados antes de congelamento em envoltório em um banho de gelo se- co/etanol. O frasco com envoltório congelado de mistura combinada foi, então, liofilizado até secagem.
[000232] Polissacarídeo ativado liofilizado foi reconstituído em sulfó- xido de dimetila (DMSO). DMSO foi adicionado à CRM197 liofilizada para reconstituição. Polissacarídeo ativado reconstituído foi combinado com CRM197 reconstituída no vaso de reação. A conjugação foi iniciada mediante adição de NaCNBHs à mistura de reação. A reação foi incubada a 23 °C durante 20 horas. Término da reação de conjugação ("capping") foi obtido mediante adição de NaBH4 e a reação foi conti-nuada durante mais 3 horas. A mistura de reação foi diluída com um volume de 4 vezes de tampão de succinato a 5 mM-soro fisiológico a 0,9%, pH de 6,0 e, então, filtrada através de um filtro de 5 pm antes de purificação. Concentração e diafiltração do conjugado foram realizadas usando membranas com MWCO de 100K. Diafiltração foi realizada contra um diavolume de 40 vezes de tampão de succinato a 5 mM- soro fisiológico a 0,9%, pH de 6,0. O retentado foi filtrado através de filtros de 0,45 e 0,22 pm e analisado.
[000233] Vários conjugados foram obtidos usando 0 processo descrito acima variando diferentes parâmetros (por exemplo, proporção de entrada de sacarídeo-proteína, concentração de reação, mEq de cia- noboro-hidreto de sódio e 0 teor de água). Foi mostrado que os dados globais gerados a partir de conjugados preparados pelo processo de RAC/DMSO são superiores comparado com 0 processo de RAC/aquosa e permitiu preparar conjugados com bom rendimento de conjugação, baixo % de sacarídeos livres (<5%) e maior grau de conjugação (lisinas conjugadas ). Além disso, foi possível manter mais de 80% de toda a funcionalidade acetila através do processo de conjugação com RAC/DMSO.
Avaliação de Estabilidade de Glicoconjugados de Pn-33F RAC/DMSO
[000234] Alíquotas de conjugados de RAC/DMSO representativos preparados pelo processo acima foram colocadas em tubos de polipropileno os quais foram armazenados a 4 °C ou a 25 °C e a estabilidade foi monitorada durante 3 meses quanto ao sacarídeos livres. Conforme mostrado na Tabela 10, as amostras armazenadas a 4 °C mostraram aumento no sacarídeos livres de 4,8% em 3 meses. No entanto, as amostras armazenadas a 25 °C mostraram um aumento de 15,4% no % de sacarídeos livres em três meses. O aumento no % de sacarídeos livres nos conjugados de RAC é atribuído à degradação do conjugado, particularmente a 25 °C. Tabela 10. Resultados de Estabilidade para Conjugados de RAC/DMSO a 4 °C e 25 °C
Figure img0017
wk = semana; M = mês.
[000235] A estabilidade de outro lote de conjugados de RAC/DMSO foi também estudada a 4 °C, 25 °C e 37 °C. Alíquotas foram colocadas em tubos de polipropileno e monitoradas quanto às tendências potenciais no % de sacarídeos livres. Conforme mostrado na Tabela 11, as amostras armazenadas a 4 °C mostraram um aumento de 4,7% no % de sacarídeos livres em 2 meses. O aumento no sacarídeos livres foi significativamente maior a 25 °C e 37 °C, indicando degradação potencial do conjugado. Tabela 11. Resultados de Estabilidade para Conjugados de RAC/DMSO a 4 °C, 25 °C e 37 °C
Figure img0018
wk = semana; M = mês.
[000236] Mesmo embora os conjugados gerados pelo processo de RAC/DMSO tenham preservado o grupo O-acetila, o aumento no % de sacarídeos livres observado, particularmente a 25 °C e acima, indicou instabilidade potencial usando esta via. Em vista desta observação de potencial instabilidade dos conjugados de RAC/DMSO, RAC/DMSO não foi considerado como ideal para conjugação do serotipo 33F e uma via química alternativa foi desenvolvida para gerar conjugados mais estáveis (os conjugados de eTEC). Exemplo 8. Preparo de Conjugados de Pn-33F eTEC Adicionais
[000237] Conjugados de Pn-33F eTEC adicionais foram gerados usando o processo descrito no Exemplo 2. Os parâmetros de reação e os dados de caracterização para estes lotes adicionais de glicoconjugados de Pn-33F eTEC são mostrados na Tabela 12. Tabela 12. Parâmetros experimentais e Dados de Caracterização de Outros Conjugados de Pn33F eTEC
Figure img0019
LOQ = limite de quantificação.
[000238] Conforme mostrado acima e na Tabela 12, vários conjugados de Pn33F foram obtidos usando a conjugação por eTEC acima. A química de eTEC permitiu o preparo de conjugados com alta produtividade, baixo % de sacarídeos livres e alto grau de conjugação (lisinas conjugadas). Além disso, foi possível manter mais de 80% da funcionalidade acetila usando o processo de conjugação por eTEC. Exemplo 9. Avaliação de Estabilidade de Glicoconjugados de Pn-33F eTEC: Tendências de % de Sacarídeos livres
[000239] Alíquotas do lote de conjugados de 33F-2B (vide Tabela 2) foram colocadas em tubos de polipropileno e armazenadas a 4 °C, 25°C e 37 °C, respectivamente, e monitoradas quanto às tendências de % de sacarídeos livres. Os dados (% de sacarídeos livre) são mostrados na Tabela 13. Conforme mostrado nesta Tabela, não houve alterações significativas no sacarídeos livres %. Tabela 13. Estabilidade de % de Sacarídeos livres para Glicoconjugados de Pn-33F eTEC a 4 °C, 25 °C e 37 °C
Figure img0020
wk = semana; M = mês.
[000240] A estabilidade acelerada de um outro lote de conjugado (Lote 33F-3C) também foi avaliada a 37 °C até 1 mês. Conforme mostrado na Tabela 14, não houve alteração significativa no % de sacarídeos livres a 37 °C até 1 mês. Tabela 14. Estabilidade de % de Sacarídeos livres para Glicoconjuga-dos de Pn-33F eTEC a 37 °C
Figure img0021
[000241] Para confirmar ainda mais a estabilidade dos conjugados de eTEC, lotes adicionais de conjugado (33F-3C e 33F-5E (vide Tabela 2 e Tabela 12)) armazenados a 4 °C foram monitorados até aproximadamente um ano quanto à tendências potenciais no % de sacarídeos livres. Conforme mostrado na Tabela 15, não houve alteração significativa nos níveis % de sacarídeos livres para os conjugados armazenados a 4 °C durante um período prolongado de até cerca de um ano. Tabela 15. Resultados de Estabilidade de % de Sacarídeos livres para Glicoconjugados de Pn-33F eTEC a 4 °C
Figure img0022
MN = Mês.
[000242] Em contraste com os conjugados de RAC/aquosas e RAC/DMSO, os conjugados de serotipo 33F gerados pela química com 33F e eTEC demonstraram ser significativamente mais estáveis, sem degradação perceptível, conforme monitorado pelas tendências de sacarídeos livres em várias temperaturas (em tempo real e acelerado).
[000243] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.
[000244] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, determinadas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (21)

1. Método de fabricação de um glicoconjugado compreendendo um sacarídeo conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador (2-((2-oxoetil)tio)etil)carbamato (eTEC), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) reação de um sacarídeo com 1,1 '-carbonil-di-(1,2,4- triazola) (CDT) ou 1 ,T-carbonildi-imidazola (CDI) em um solvente orgânico para produzir um sacarídeo ativado; b) reação do sacarídeo ativado com cistamina ou cisteamina ou um sal das mesmas para produzir um sacarídeo tiolado; c) reação do sacarídeo tiolado com um agente redutor para produzir um sacarídeo tiolado ativado compreendendo um ou mais resíduos de sulfidrila livres; d) reação do sacarídeo tiolado ativado com uma proteína transportadora ativada compreendendo um ou mais grupos a- haloacetamida para produzir um conjugado de sacarídeo tiolado- proteína transportadora; e e) reação do conjugado de sacarídeo tiolado-proteína transportadora com (i) N-acetil-L-cisteína como um primeiro reagente de "capping"; e/ou (ii) iodoacetamida como um segundo reagente de "capping"; em que um glicoconjugado ligado por eTEC é produzido, em que o solvente orgânico na etapa a) é um solvente aprótico polar selecionado do grupo que consiste em sulfóxido de di- metila (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA), N- metil-2-pirrolidona (NMP), acetonitrila, 1,3-Dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro- 2(1H)-pirimidinona (DMPU) e hexametilfosforamida (HMPA) ou uma mistura dos mesmos, em que o sacarídeo é um polissacarídeo capsular derivado de S. pneumoniae selecionado do grupo que consiste em polissacarí- deos capsulares pneumocócicos (Pn) de serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que a proteína transportadora é CRM197, em que 0 agente redutor na etapa c) é tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT) ou mercaptoetanol.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de combinação do sacarídeo por meio de reação com triazola ou imidazola para proporcionar um sacarídeo combinado, em que 0 sacarídeo combinado é congelado em envoltório, liofilizado e reconstituído em um solvente orgânico antes da etapa a).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda purificação do polissacarídeo tiolado produzido na etapa c), em que a etapa de purificação compreende diafiltração
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína transportadora é ativada com um derivado ativado de ácido bromoacético.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido bromoacético é 0 éster N- hidroxissuccinimida de ácido bromoacético (BAANS).
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda purificação do glicoconjugado ligado por eTEC por meio de diafiltração.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a proporção sacarídeo:proteína transportadora (p/p) está entre 0,2 e 4 ou entre 0,4 e 1,7.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que 0 polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Pn de serotipo 11A, 10A, 22F ou 33F.
9. Glicoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um polissacarídeo capsular bacteriano conjugado a uma proteína transportadora por meio de um espaçador eTEC, em que o polissacarídeo está covalentemente ligado ao espaçador eTEC através de uma ligação de carbamato e a proteína transportadora está covalentemente ligada ao espaçador eTEC através de uma ligação de amida, em que o polissacarídeo capsular é derivado de S. pneumoniae e selecionado do grupo que consiste em polissacáridos capsulares Pn de serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F; em que a proteína transportadora é CRM197.
10. Glicoconjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que 0 polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular Pn de serotipo 10A, 11A, 22F ou 33F.
11. Glicoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que 0 polissacarídeo tem um peso molecular entre 10 kDa e 2.000 kDa, entre 50 kDa e 2.000 kDa, entre 50 kDa e 20.000 kDa ou entre 500 kDa e 10.000 kDa.
12. Glicoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que 0 polissacarídeo tem um grau de O-acetilação entre 75-100%.
13. Glicoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a CRM197 compreende 2 a 20 ou 4 a 16 resíduos de lisina covalentemente ligados ao polissacarídeo através de um espaçador eTEC.
14. Glicoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a proporção sacarídeo: proteína transportadora (p/p) está entre 0,2 e 4 ou entre 0,4 e 1,7.
15. Glicoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação entre a CRM197 e 0 sacarídeo ocorre a cada 25, 15, 10 ou 4 unidades de repetição sacarídicas do polissacarídeo.
16. Glicoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que apresenta uma distribuição de peso molecular (Kd) de >35% a < 0,3.
17. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende 0 glicoconjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 16, e um excipiente, veículo ou diluente farma- ceuticamente aceitável.
18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno adicional.
19. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que 0 antígeno adicional compreende um glicoconjugado de um polissacarídeo capsular selecionado do grupo que consiste em polissacarídeos capsulares Pn de serotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F.
20. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
21. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que 0 adjuvante é um adjuvante com base em alumínio selecionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.
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