TW201120212A - Methods of reducing viricidal activity in PCV-2 compositions and PCV-2 compositions with an improved immunogenicity - Google Patents

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201120212 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於降低通常會具有_定程度之殺病毒活 • &的組合物之殺病毒活性的方法及組合物。藉由使用本發 明方法可使該等組合物之殺病毒活性與不包括本發明步驟 ，的組合物之殺病毒活性相比降低。更特定言之，本發明係 關於製備抗原性π型豬環狀病毒（PCV_2)組合物之方法，特 徵在於該等組合物與在此項技術中已知之組合物相比尤 其與並非藉由本發明方法製備之組合物相比不具有或具有 較低殺病毒活性。本發明進一步係關於一種新穎免疫原性 組合物，較佳為根據本專利申請案提供之方法製備的含有 PCV-2之組合物，其較佳特徵在於與此項技術中已知之組 合物相比，具有降低的或不具有殺病毒活性。根據另一態 樣，本發明亦提供包含純化pcv_2抗原（較佳具有改良免疫 原性之純化PCV-2抗原）的免疫原性組合物。 序列表 本申請案包括根據37 C.F.R. 1.821-1.825之序列表。本 申晴案隨附之序列表以引用的方式全部併入本文中。 【先前技術】 , 2型豬環狀病毒（PCV_2)為小型（直徑為17_22 二十面 體無包膜DNA病毒，其含有單股圓形基因組。1>(：¥_2與j 型豬環狀病毒（PCV-1)具有約80q/。序列一致性。然而，與通 常無毒力之PCV-1相比，感染有PCV-2之豬展現通常稱為 離乳後多系統消耗性症候群（PMWS)之症候群。PMWS之 150573.doc 201120212 臨床特徵為消瘦、皮膚蒼白、身體憔悴、呼吸窘迫、腹瀉 及黃癌 (icterus/jaundice)。在一些受感染之豬中，所有症 狀之組合將顯而易見而其他受感染之豬將僅僅具有此等症 狀中之一或兩者。在屍檢期間，顯微鏡可見及肉眼可見之 病灶亦出現於多個組織及器官上，淋巴器官為最常見之病 灶部位。已觀測到PCV-2核酸或抗原之量與顯微鏡可見淋 巴病灶的嚴重性之間密切相關。感染有PCV-2之豬之死亡 率可達80%。除PMWS外，PCV-2與包括以下之若干其他 感染相關：假性狂犬病、豬生殖及呼吸症候群（PRRS)、格 拉氏疾病（Glasser、disease)、鏈球菌性腦膜炎、沙門氏桿 菌病、離乳後大腸桿菌病、飲食性肝障礙及化膿性支氣管 肺炎。 可利用若干疫苗來減少PCV-2感染對豬之影響。美國專 利第6,703,023號提供用於預防豬之PMWS的基於DNA之疫 苗。在WO 03/049703中，描述活嵌合疫苗之製備，該疫苗 包含非病原性PCV1病毒，但其中ORF2蛋白經病原性PCV-2之ORF2蛋白置換。WO 99/18214及WO 99/29717已提供若 干PCV-2菌株及製備PVC2死疫苗之程序。WO 99/18214及 WO 99/2971亦已描述次單位疫苗之製備。WO 06/072065 已報導基於ORF2之有效次單位疫苗。WO 07/28823亦描述 另一基於ORF-2之次單位疫苗。然而，先前技術中所述之 疫苗均不包括非殺病毒及/或純化的PCV-2抗原，較佳高度 純化之PCV-2 0RF2抗原。 針對PCV-2之免疫原性組合物及針對其他病原體之各種 150573.doc 201120212 免疫原性組合物常常對其他抗原具有殺病毒效應。當前管 理標準（9 CFR 113.35)允許多價組合物中有一些殺病毒活 性，但在與免疫原性組合物之其他組份組合時，此殺病毒 活性不能造成超過0.7 log/ml之活病毒或小於0.7 log/ml之 活細菌CFU的損失。殺病毒活性高於所允許者之組合物不 能與其他抗原組合來形成多價疫苗。 PCV-2之開放閱讀框架2(ORF2)蛋白當在SDS-PAGE凝膠 上跑行時具有30 kDa之近似分子量，其在以往用作PCV-2 之疫苗及免疫原性組合物中之抗原組份。獲得適用於該等 疫苗及組合物中的ORF2之典型方法一般由以下步驟組 成：擴增編碼ORF2之PCV-2 DNA、在宿主細胞内表現 ORF2蛋白及經由細胞溶解自宿主細胞提取ORF2蛋白。接 著將回收的ORF2細胞溶解物用作免疫原性組合物或疫苗 之抗原部分。在一些情況下，將含有ORF2之細胞溶解物 與細胞碎片分離。 需要一種降低含有PCV-2之免疫原性組合物及其中之抗 原的殺病毒活性的方法，以便滿足管理要求且投與有效的 多價組合物。另外需要減小或降低含有PCV-2之組合物對 豬生殖及呼吸症候群病毒（PRRSV)之殺病毒活性及效應的 方法。另外需要彼等免疫原性組合物，其已經歷本發明方 法使得其殺病毒活性已降低至可接受標準且可與其他抗原 組合以形成多價免疫原性組合物。 【發明内容】 除非另有所述，否則本發明之實施將採用此項技術技能 150573.doc 201120212 範圍内之習知分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白質 化學及免疫學技術。參見，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 I，II及III 卷，第二版（1989) ; DNA Cloning，第 I及 II 卷（D. N. Glover 編， 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編，1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B· D. Hames & S. J. Higgins編，1984); Animal Cell Culture (R. Κ· Freshney編，1986) ; Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986) ; Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ； the series, Methods In Enzymology (S. Colowick 及 N· Kaplan 編，Academic Press， Inc.) ； Protein purification methods-a practical approach (E.L.V. Harris及 S. Angal編，IRL Press at Oxford University Press);及 Handbook of Experimental Immunology，第 I-IV卷（D. M. Weir及 C. C. Blackwell編，1986, Blackwell Scientific Publications)。 在詳細描述本發明之前，應瞭解本發明不限於特定 DNA、多肽序列或過程參數，其當然可變化。亦應瞭解本 文中所使用之術語僅為了達成描述本發明之特定實施例之 目的且並非意欲限制本發明。應注意，除非文中明確另外 指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍所用之單數形 式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言， 「一抗原」包括兩種或兩種以上抗原之混合物，「一賦形 劑」包括兩種或兩種以上賦形劑之混合物，及其類似情 況。 本發明解決先前技術中所固有之問題且相對於當前技術 150573.doc 201120212 有明顯進步。一般而言’本發明提供一種製備PCV-2抗原 性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得含有PCV-2抗 原之第一液體，ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一 液體。該PCV-2抗原較佳用作PCV-2抗原性組合物或用於 該PCV-2抗原性組合物中。 出於本發明之目的’ 「第一液體」係指通常與細胞、抗 原、免疫原性組合物、疫苗及其類似物組合使用的液體、 水性或流體培養基。第一液體較佳包含抗原性組合物之培 養基’第一液體更佳包含用於在培養宿主細胞中產生重組 蛋白的細胞培養基或較佳由其組成。該等培養宿主細胞可 為細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞及哺乳動物細胞，以 昆蟲及哺乳動物細胞尤佳。因此，第一流體可包含用於培 養細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或哺乳動物細胞之培 養基或由其組成。當使用昆蟲細胞時’細胞培養基較佳為 不含血清之細胞培養基，且該培養基最佳為hall 42〇不 含灰清培養基。 ' ' J 不一狀瓶」你指通常與細胞、抗 原、免疫原性組合物、疫苗及其類似物組合使用的任何液 體’其不同於第-液體。第二液體較佳為水溶液，甚 :為醫藥學上可接受之溶液’且甚至更佳為緩衝液，諸如 理食鹽水或碟酸鹽緩衝液及其類似物。最佳，第二流體 :特徵在於當活病毒或活細菌在該流體中培養或健存時， "不對任何活病毒或活細菌有殺病毒作用。 出於本發明之目的，「部分」係指不包涵所有量之^ 130573.doc 201120212 量。舉例而言，一部分液體將為小於100%液體之體積， 諸如90%液體、80%液體、70%液體之任何量且所有量均 介於超過0%與小於100%之間。 「PCV-2抗原」係指包含至少一種當投與動物（較佳豬） 時可誘導、刺激或增強針對PCV-2感染之免疫反應的抗原 的任何物質組合物。該PCV-2抗原較佳為全PCV-2病毒（較 佳呈滅活形式）、經修飾或減毒之PCV-2活病毒、包含至少 一個PCV-2免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒、包含至少一 個PCV-2免疫原性胺基酸序列（較佳ORF2)的任何其他多肽 或組份。如本文中所用之術語「免疫原性蛋白」、「免疫 原性多肽」或「免疫原性胺基酸序列」係指引發宿主中針 對PCV-2之免疫反應的任何PCV-2胺基酸序列。該PCV-2免 疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性胺基酸較佳為國際 專利申請案WO 2006/072065(其教示内容以引用的方式併 入本文中）中所揭示或提供之任一者，或為在此項技術中 已知之任何其他PCV-2多肽。舉例而言，PCV-2 ORF2 DNA之代表性序列包含核苷酸序列Genbank寄存編號 AF086834(SEQ ID NO: 3)及 SEQ ID NO: 4。 然而，熟習此項技術者應瞭解此序列在序列同源性方面 可變化高達1%-1〇%但仍保持使其適用於免疫原性組合物 中之抗原特徵。免疫組合物之抗原特徵可例如藉由WO 06/072065之實例4所提供之攻毒實驗來評估。此外，當經 修飾抗原與由如WO 06/072065中提供之SEQ ID NO:3或 SEQ ID NO:4之聚核苷酸序列編碼的PCV-2 ORF2蛋白相比 150573.doc 201120212 賦予至少70%，較佳80%，更佳90%之保護性免疫力時， 仍保留經修飾抗原之抗原特徵。其他較佳PCV-2 ORF2抗 原為下文描述者： i) 包含 WO 06/07065 之 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或 SEQ ID NO: 11 序 列的多肽； ii) 與i)之多肽有至少80°/。同源性及/或一致性之任何多 肽； iii) i)及/或ii)之多肽之任何免疫原性部分； iv) iii)之免疫原性部分，包含至少5個，較佳8個，更 佳，甚至更佳10個包括於WO 06/072065之SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11序列中之鄰接胺基酸； v) 由包含 WO 06/072065 之 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4序列之DNA編碼的多肽； vi) 由與v)之聚核苷酸有至少80%同源性及/或一致性的 聚核苷酸編碼之任何多肽； vii) 由v)及/或vi)之聚核苷酸編碼的多肽之任何免疫原性 部分； viii) vii)之免疫原性部分，其中編碼該免疫原性部分之聚 核苷酸包含至少30個包括於WO 06/072065之SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4序列中的鄰接核苷酸。 WO 06/072065之序列表與本申請案隨附之序列表相同。

上述任一免疫原性部分較佳具有由WO 06/07065之SEQ 150573.doc 201120212 .. ID NO·· 3或SEQ ID NO·· 4之序列編碼的PCV-2 ORF2抗原之 抗原特徵。 如此項技術中已知，「序列一致性」係指兩個或兩個以 上多肽序列或兩個或兩個以上聚核皆酸序列（亦即參考序 列與有待與參考序列比較之指定序列）之間的關係。序列 一致性係藉由在指定序列與參考序列經最佳比對以產生最 咼序列相似度後，將其比較而測定，如由此等序列串之間 的匹配度所測定。在此比對後，逐個位置測定序列一致 性’例如’若在一特定位置處核苷酸或胺基酸殘基一致， 則該等序列在彼位置處「一致」。隨後，此等位置—致性 之總數除以參考序列中核苷酸或殘基之總數得到序列一致 性百分比。舉例而言，核苷酸序列與參考核苷酸序列之 「序列一致性」為至少（例如）85%，較佳9〇%，甚至更佳 95%的聚核苷酸意謂除參考核苷酸序列之每個核苷 酸，指定聚核苷酸序列可能包括至多丨5個，較佳至多⑺ 個，甚至更佳至多5個點突變外，指定聚核芽酸之核苦酸 序列與參考序列-致。換言之，在核普酸序列相對於參考 核荅酸序列具有至少85%，較佳9〇%，甚至更佳㈣之一 致性的聚核苦酸中，參考序列中至多15%，較佳ι〇%，甚 至更佳5%之核苷酸可缺失或經另__料酸取代，或可將 參考序列中數量為至多15%，較佳1〇%，甚至更佳州核普 酸總數之核㈣插入參考序列中。參考序列之此等突變可 發生在參考核苦酸序列之5,末端位置或3,末端位置處或彼 4末端位置之間的任何地方，個別地散佈於參考序列中之 150573.doc 201120212 核芽酸間或參考序列内之一或多個鄰接基團中。類似地， 指定胺基酸序列具有與參考胺基酸序列之至少（例 如）85%，較佳90%，甚至更佳95%序列一致性的多肽意謂 除參考胺基酸序列之每1〇〇個胺基酸，指定多肽序列可能 包括至多15個，較佳至多1〇個，甚至更佳至多5個胺基酸 改變外，該多肽之指定胺基酸序列與參考序列一致。換言 之’為獲得具有與參考胺基酸序列之至少85%，較佳 90%，甚至更佳95%序列一致性之指定多肽序列，參考序 列中至多15%，較佳至多1〇%，甚至更佳至多5%之胺基酸 殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或可將參考序列中數量 為至多1 5%，較佳至多丨〇%，甚至更佳至多5%胺基酸殘基 總數之胺基酸插入參考序列中。參考序列之此等改變可發 生於參考胺基酸序列之胺基末端或羧基末端位置處或彼等 末端位置之間的任何地方，個別地散佈於參考序列之殘基 間或參考序列内之一或多個鄰接基團中。較佳地，不一致 的殘基位置的不同之處為保守性胺基酸取代。然而，測定 序列一致性時不包括保守取代作為匹配。 出於本發明之目的’「活」病毒或細菌係指能夠在宿主 中複製之病毒或細菌。本發明之較佳活病毒及較佳活細菌 為 RS病甘及豬肺炎徽漿菌（场处叩邮咖⑽⑷ 細菌。然而，術語活病毒或活細菌分別不限於pRRS及豬 肺炎黴漿菌。 可藉由以第二液體交換部分第一液體自卩匸乂^抗原移除 »玄刀第一液體，其中該第二液體不同於該第一液體（參 150573.doc 201120212 見第二流體之定義）。因此，根據另一態樣，本申請案提 供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步 驟：i)獲得含有PCV-2抗原之第—液體，u)自該pcv_2抗原 移除至少一部分該第一液體，其中藉由以第二液體交換該 部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分該第一液體，且其 中該第二液體不同於該第一液體。較佳地，以該第二液體 交換部分該第一液體之操作包含以下步驟：a)將該第二液 體添加至含有PCV-2抗原之該第—液體中，及b)藉由自 PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液體來濃縮pcv_2抗 原。因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製備PCv_2 抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得含有pCV_ 2抗原之第一液體，ii)藉由以第二液體交換至少一部分第 一液體自s亥PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體，交換 操作包含以下步驟：a)將該第二液體添加至含有pCV_2抗 原之該第一液體中，及b)藉由自PCV_2抗原移除一部分該 第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。

可使用過濾器藉由過濾步驟自PCV-2抗原移除部分第一 液體。然而，可使用熟習此項技術者已知之任何其他方法 自P C V - 2抗原移除部分任何流體，包括第一流體及（當適用 時）一部分第二流體。舉例而言，該方法包括（但不限於）離 心及/或層析。然而，過濾最佳。移除該部分第一流體或 (§適用時）任何其他流體之較佳過滤方法包含超渡及/或透 濾。超濾及透濾為熟習此項技術者已知之標準方法，例如 在以Ύ文觖中有詳細描迤：protein Purification Meth〇ds_A 150573.doc -12- 201120212

Practical Approach -編者：E.L.V. Harris及S. Angel, 〇xf0yd 其内容及教示以引用的方式併入本 文中）。詳言之’在彼教科書之第3章中，描述若干方法及 設備類型’一般技術者可出於本發明之目的以例示性方式 使用所有該等方法及設備。因此，根據另一態樣，本申請 案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下 步驟：1)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ϋ)自該pcv-2抗 原移除至少一部分該第一液體’其中藉由過濾（較佳藉由 透濾或超濾）自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳地， 藉由以第二液體交換至少一部分第一液體自PC v_2抗原移 除該部分該第一液體’該交換操作包含以下步驟：a)將該 第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉 由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮pCV_ 2抗原。 如上所定義，欲用於所述任一方法中之較佳第二液體為 緩衝液’較佳為生理學上可接受之緩衝液且以生理食鹽水 尤佳。因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製備PC V_ 2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：丨）獲得含有 PCV-2抗原之第一液體，π)藉由用緩衝液交換，較佳生理 學上可接文之緩衝液（諸如生理食鹽水或填酸鹽緩衝液或 其類似物）自該PC V-2抗原移除至少一部分該第一液體。較 佳地，藉由過濾，較佳藉由透濾及/或超濾自pcv_2抗原移 除該部分第一液體。更佳地，以緩衝液，較佳生理學上可 接受之緩衝液（諸如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液或其類似 150573.doc 201120212 物）交換至少-部分第—液體之操作包含以下步驟：a)將該 緩衝液，較佳該生理學上可接受之緩衝液(諸如生理食鹽 水或鱗酸鹽緩衝液或其類似物）添加至含有咖_2抗原之該 第-液體中’及b)較佳藉由過漉，甚至更佳藉由透滤及/或 超滤自PCV-2抗原移除一部分該第_液體及該流體來濃縮 PCV-2抗原，該流體為緩衝液，較佳生理學上可接受之缓 衝液，諸如生理食鹽水或磷酸鹽缓衝液或其類似物。 如本文所述之方法之濃縮步驟及該液體添加步驟可實質 上同時執打，或者該濃縮步驟與該液體添加步驟依次執 行因此根據另一態樣，本申請案提供一種製備 抗原性組合物之方法’其包含以下步驟：i)獲得含有PCV_ 2抗原之第-液體’ ϋ)藉由以第二液體交換一部分第一液 體自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體，交換操作 包3以下步驟.a)將s亥第二液體添加至含有pcv_2抗原之 該第-液體中’及b)藉由自PCV#原移除一部分該第一 及第二液體來濃縮㈣他原，#中實質上同時或依次執 行液體添加步驟。較佳地’藉由過濾，較佳藉由透濾及/ 或超;慮自PCν·2 k原移除該部分第—液體且在添加第二液 體之情况下移除第一流體與第二流體之混合物 當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟之順序無 關緊要。舉例而言，在另一態樣中，在該濃縮步驟之前進 行該液體添加步驟且在一替代態樣中，在該液體添加步驟 之前進行該濃縮步驟。可多次執行該液體添加步驟及該濃 縮步驟，不管執行該等步驟之順序如何。舉例而言，此等 150573.doc -14* 201120212 各別步驟之每一者可執行至少兩次，至少三次，至少四 次’至少五次，至少十次，直至所需之多次。在—態樣 中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少兩次。在 另一態樣中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少 三次。因此’根據本申請案之另一態樣，提供一種製備 PCV-2抗原性組合物之方法，其中該方法一般包含以下步 驟：i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ϋ)藉由以第二液 體交換至少一部分該第一液體自該pcv_2抗原移除該部分 第一液體，其中多次執行該交換操作。較佳地，以—部分 第二流體交換部分第一流體之操作包含以下步驟：昀將該 第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉 由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮pcv_ 2抗原’其中多次（例如兩次、三次、五次、十次等）執行液 體添加步驟及濃縮步驟。較佳地，兩次’最佳三次執行液 體添加步驟及濃縮步驟。如上所述，過濾為自PCv_2抗原 移除一部分該第一液體或在如上所述多個移除步驟之情況 下’移除一部分第一與第二流體之混合物的較佳方法。 過濾器可為此項技術中之任何習知過濾器。較佳地，該 過濾器包括半透膜。在另一較佳形式中，該半透膜具有小 於PCV-2抗原之平均孔徑，藉此防止至少90%該pcv_2抗原 通過該半透膜孔且由過濾器截留PCV-2抗原。在另一態樣 中’該過濾器具有防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之 蛋白質通過的平均孔徑’更佳地，該過濾器具有防止至少 90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質通過的平均孔徑，且 150573.doc -15- 201120212 最佳地，該_ιι具有防止至㈣％A小為⑽仙至· 他之蛋白質通過的平均孔徑。當製備呈全病毒或病毒樣 粒子之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。在另一態樣中，該半 透膜包括選自由聚砜、聚醚砜及再生纖維素組成之群的材 料。然而，可使用能夠自PCV_2抗原移除一部分第一流體 且在多個方法步驟之情況下移除第—與第二流體之混合物 的任何其他材料。該㈣器可選自由中空纖維膜超遽筒、 平板或過濾片(cassette)組成之群’以中空纖維膜超濾筒尤 佳》因此，根據本申請案之另一態樣，如上所述提供製備 PCV-2抗原性組合物之方法。該方法—般包含以下步驟： 1)獲彳于含有PCV-2抗原之第一液體，⑴藉由過濾步驟自該 PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體，彡中該過濾器較 佳為半透膜或包含半透膜。較佳地，該半透膜具有小於 PCV-2抗原且防止至少9〇%該！^¥_2抗原通過該半透膜孔之 平均孔徑。較佳地，半透膜之平均孔徑防止至少9〇%大小 為50 kDa至5 00 kDa之蛋白質通過，更佳至少9〇%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質通過，且最佳至少9〇%大小為1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒 子之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。如上所述，移除步驟一 般包括以一部分第二流體交換部分第一流體，該交換操作 包含以下步驟：a)將該第二液體添加至含有pcv-2抗原之 該第一液體中，及b)藉由自1>(：：^_2抗原移除一部分該第一 及第二液體濃縮PCV-2抗原，其中多次（例如兩次、三次、 五次、十次等）執行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳兩 150573.doc • 16 - 201120212 次，最佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。 執行本文中所提供之方法之濃縮步驟，以便使PCv-2抗 原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至5 〇倍。更佳地，進 行該濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比 濃縮4倍至20倍。最佳地，進行濃縮步驟以便使pcv_2抗原 與δ玄第一液體之體積相比濃縮7倍至丨〇倍。因此，根據另 一態樣，本申請案提供一種製備PCV_2抗原性組合物之方 法’其包含以下步驟·· i)獲得含有PCV-2抗原之第一液 體，η)自該PC V-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中 自PCV-2抗原移除部分該第一液體，且其中該pcv_2抗原 ”省第液體之體積相比濃縮了 3倍至50倍，較佳4倍至20 倍，且甚至更佳7倍至1〇倍。較佳地，藉由以第二液體交 換部分第一液體自PCV_2抗原移除該部分第一流體，該交 換in作包3以下步驟a)將該第二液體添加至含有 抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除-部分 忒第一及第二液體，使pcv_2抗原與該第一液體之體積相 比濃縮3倍至5〇倍，較佳4倍至2〇倍，且甚至更佳7倍至10 °較佳地夕-人，杈佳兩次，甚至更佳三次執行液體添 加步驟及濃縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而 多矛、第液體與第二液體之混合物。較佳地，實質上同 夺或依人執仃各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液 體添加步驟時，步驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過 h(其較佳含有半透膜），藉由過遽（較佳透濾及/或超滅） 進仃遭縮步驟。該半透膜較佳具有小於PM抗原且防止 150573.doc 201120212 至少90°/。該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑，較佳 地’半透膜之平均孔徑防止至少9〇%大小為5〇 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋 白質’且最佳至少90%大小為1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質 通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時，此 孔徑較佳。 在另一態樣中’藉由本文之方法製備的PCV-2抗原性組 合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該液體相比降低至少 10 Λ。更佳地’ PCV_2抗原性組合物之殺病毒活性與未經 歷該方法之該第一液體相比降低至少50%。更佳地，PCV- 2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該第一液 體相比降低至少7〇〇/0。 出於本發明之目的，術語「殺病毒活性」意謂當流體、 命液或組合物與活病毒或活細菌混合時，該流體、溶液或 組合物在某種程度上滅活或殺滅該活病毒或活細菌。因 此，流體、溶液或組合物之殺病毒活性降低至少丨〇%意謂 活病毒或活細菌在經歷本文所述之任一方法之流體、溶液 或組合物中之存活率比在未經歷本文所述之任一方法之流 體、溶液或組合物中的存活率高9〇%。根據本發明，pRRS 病毒（較佳具有ATCC寄存編號VR 23322PRRS)為用於測定 殺病毒活性之參考病毒。為測定對於細菌之殺病毒活性， 建議使用豬肺炎黴漿菌，較佳豬肺炎黴漿菌之菌株。 因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製備1>(：¥_2抗 原性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得含有pcv_2 150573.doc 201120212 抗原之第一液體’ Π)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第 一液體，其中在步驟Π)之後獲得的卩^乂一抗原性組合物之 殺病毒活性（較佳對於PRRS病毒）與第一液體之殺病毒活性 相比降低至少10%，較佳至少50%，更佳至少70%，甚至 更佳至少90%。較佳地，藉由以第二液體交換一部分具有 殺病毒活性之第一液體自…乂^抗原移除該部分第一液 體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作：a)將該第 二液體添加至含有PCV_2抗原之該第一液體中，及b)藉由 自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使pcv_2抗 原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍，甚至更 佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至1〇倍。較佳地，多次，較 佳兩次，且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。 在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第 二液體之混合物。較佳地，如上所述，實質上同時或依次 執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步 驟時，步驟之順序無關緊要。此外’較佳使用過濾器（其 較佳含有半透膜）’藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進 打濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於pcV-2抗原且防止至 少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜 或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少 90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少9〇%大小 為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至少9〇%大小為1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒 子之P C V - 2抗肩時’此孔徑較佳。 150573.doc •19· 201120212 在另一態樣中’ 5亥方法進一步包含收集在自該v_2抗 原移除至少一部分該第一液體之後所獲得的pcv_2抗原之 步驟。 如本文中所用，「收集（harvesting/harvest)」係指收集 或回收PCV-2抗原。當製備為本申請案之方法及組合物使 用的抗原時’或當PCV-2抗原經歷本文所述之方法時，可 使用此項技術中已知之任何習知方法來回收pcv_2抗原。 在一尤佳收集方式中’經由過濾步驟自該pCv_2抗原移除 部分該第一液體且自過濾器阻滯物回收或收集pCV_2抗 原。在一更佳形式中’自具有本文所述之孔徑的半透膜之 阻滞物收集或回收PCV-2抗原。因此，根據另一態樣，本 申請案提供一種製備PC V-2抗原性組合物之方法，其包含 以下步驟：i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，H)自該 PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中收集在該步 驟Π)之後獲得的PCV-2抗原。較佳地，藉由以第二液體交 換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較 佳以包含以下步驟之方式進行交換操作：a)將第二液體添 加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自pcv_2 抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV_2抗原與該第 一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至2〇 倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次， 甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況 下，不僅移除第一液體’而且移除第一液體與第二液體之 混合物。較佳地’如上所述，實質上同時或依次執行各液 150573.doc -20· 201120212 體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步 驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過濾器（其較佳含有 半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮步 驟。該半透膜較佳具有小於PCV_2抗原且防止至少卯％該 PCV-2抗原通過該半透膜孔且將pcv_2抗原截留在過濾器 内以便收集或㈣之平均隸。半透膜或本文_所用任何 其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90。/。大小為5〇 kDa至 5〇〇 kDai蛋白質，更佳至少90°/〇大小為75 kDa至400 kDa 之蛋白質’且最佳至少9〇。/。大小為100 kDa至3〇〇 kDa之蛋 白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之pcv_2抗原 時，此孔徑較佳。 將在經歷本文所提供之方法之後（較佳在自過濾器阻滯 物收集之後）剩餘的PCV_2抗原與選自由醫藥學上可接受之 載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組 份混合。較佳地，該另一組份為佐劑，甚至更佳其中該佐 劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為 卡波姆（Carbomer)。 如本文中所用之「醫藥學上可接受之載劑」及「獸醫學 上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗 料、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等 張劑、吸附延遲劑及其類似物。 如本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、例如 Quil A ^ QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) ^ GPI-〇l〇〇(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) 150573.doc -21 · 201120212 之皂素、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。該 乳液可尤其基於輕液體石蠟油（Eur0pean Pharmacopea 里），類異戊一烯油，諸如角鯊烧或角鯊稀；由稀烴（尤其 異丁烯或癸烯）之低聚合產生的油；含有直鏈烷基之酸或 醇之Sa，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二（辛酸酯/癸 西文Sa )甘油二（辛酸S旨/癸酸醋）或丙二醇二油酸酯；支鏈 脂肪酸或醇之酯，尤其異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使 用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子界面活性劑，尤其為 視晴況經乙氧基化之脫水山梨糖醇酯、二縮甘露醇醋（例 如無水甘露糖醇油酸酯）、乙二醇醋’、聚甘油酯、丙二醇 醋及油酸酯、異硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羥基硬脂酸酯，以 及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物（尤其gPlur〇nic產物，特

別為 L121)。參見 Hunter 等人’ The Theory and Practical Application of Adjuvants (Stewart-Tull，D. E. S·編）。 JohnWiley 及 Sons，NY，第 51-94 頁（1995)及 Todd等人， Vaccine 15:564-570 (1997)。舉例而言，可使用由 M

Powell 及 Μ· Newman所編之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第 147 頁所 述之SPT乳液及同一本書中第183頁所述之乳液MF59。其 他合適之佐劑包括（但不限於）RIBI佐劑系統（Ribi Inc.)、嵌 段共聚物（CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、阿夫立定（Avridine)脂質-胺佐劑、 來自大腸桿菌（E. coli)之熱不穩定性腸毒素（重組或其他方 式）、霍礼毒素、IMS 13 14或胞壁酿基二狀等。在順丁歸 •22· 150573.doc 201120212 一陂針興烯基衍生物之Α EMA(Monsant+盆 ^物中，包括共聚物 等聚人物… 酸奸與乙烯之共聚物。此 物在水中溶解產生酸性溶液，將其中和，較佳中和 ^理Ρ·以產生佐劑溶液，將向該㈣㈣巾併入免疫 原性、免疫性或疫苗組合物本身。 佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及 順丁烯二酸肝與稀基衍生物之共聚物的化合物。有利之佐 :化合物為尤其與糖類或多元醇類之聚浠基喊交聯的丙稀 酸或甲基丙稀酸之聚合物。此等化合物以術語卡波姆來指 稱㈣咖卿咖卷，第2期，1996年6月卜熟習此項技術 者亦可參考美國專利第2，_，如號，其描述與具有至少3 個經基，較佳不超過8個經基之多經基化合物交聯之丙婦 酸聚合物，至少三個經基之氫原子經具有至少2個碳原子 之不飽和脂族基團置換。較佳錢為彼等含有…個碳原 子之基團，例如乙婦基、浠丙基及其他稀系不飽和基團。 該等不飽和基團本身可含有諸如甲基之其他取代基。以名 稱卡波莫（Carbopo!)出售之羞品（BF G〇〇drich，〇hi〇,⑽） 特別適合。其與烯丙基蔬糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其 中，可提及卡波莫974P、934P及971P。最佳使用卡波 971P。 / 、 較佳以每劑量約100叫至約1〇 mg之量添加佐劑。更佳 :每劑量約_吨至約10 mg之量添加佐劑。更佳以每劑 量約500叫至約5 mg之量添加佐劍。更佳以每劑量約 pg至約2.5 mg之量添加佐劑。最佳地，以每劑量约！ 150573.doc -23- 10 201120212 量添加佐劑。 「稀釋劑」可包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘 油及其類似物。等張劑可包括氣化納、右旋糠、甘露糖 醇、山梨糖醇及乳糖等。穩定劑包括白蛋白及乙二胺四乙 酸之鹼金屬鹽等。 如本文中所用之「防腐劑」係指抗微生物活性劑，諸如 慶大徽素（Gentamycin)、硫柳果（Merthi〇丨ate)及其類似物。 詳言之，添加防腐劑對於製備多劑量組合物而言最佳。以 有效防止相關組合物受任何微生物污染或抑制相關組合物 内的任何微生物生長之濃度添加彼等抗微生物活性劑。 因此’根據另一態樣’本申請案提供-種製備PCV-2抗 原性組合物之方法，其包含以下步驟：卩獲得含有pcv_2 抗原之第一液體，π)自該Pcv_2抗原移除至少一部分該第 -液體，進-步包含以下步驟：將在步驟⑴之後剩餘的 PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另—組份混合：醫藥 學上可接受之_、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。較 佳地’其中該另-組份為佐劑，甚至更佳其中該佐劑為丙 烯酸或甲基丙烯酸之聚合物’且更佳其中該佐劑為卡波 姆。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自pcv_ 2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式 進行交換操作：a)將該第二液體添加至含有pcv_2抗原之 該第一液體中，及b)藉由自PCV_2抗原移除一部分該第一 及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮 較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至2〇倍，且甚至更佳7倍至 150573.doc •24· 201120212 1 0倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執行纩 體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第—t 體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地如 上所述’實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依文 執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟之順序無關緊要。 此外，較佳使用過濾器（其較佳含有半透膜），藉由過濾（較 佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有 小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜 孔且將PCV-2抗原截留在過濾器内以便收集或回收之平均 孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較 佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至 少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至少9〇% 大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒 或病毒樣粒子之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。 上述方法中所用之PCV-2抗原可為本文中所定義之任何 PCV-2抗原。PCV-2抗原較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更 佳包含PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更佳包含〇rf-2蛋白之 病毒樣粒子，且甚至更佳包含INGELVAC CIRCOFLEX中 所包括之抗原。因此，根據本申請案之另一態樣，本申請 案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下 步驟：i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，Π)自該pcv-2抗 原移除至少一部分該第一液體，其中該PC V-2抗原包含 PCV-2之ORF-2蛋白’更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更 佳蛋白之病毒樣粒子。較佳地’藉由以第二液體交 150573.doc -25- 201120212 換一部分第一液體自PCV_2抗原移除該部分第一液體。較 佳以包含以下步驟之方式進行交換操作：勾將該第二液體 添加至s有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自pcv_ 2抗原移除一部分該第一及第二液體，使pcv_2抗原與該第 一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20 倍’且甚至更佳7倍至1〇倍。 較佳地’執行液體添加步驟及濃縮步驟多次，較佳兩 -人，甚至更佳三次。在該等情況下，不僅移除第一液體， 而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所 述，貫質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行 濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟之順序無關緊要。此 外，較佳使用過濾器（較佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉 由透渡及/或超濾）進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有平均 孔徑小於PCV-2抗原，且防止至少9〇D/。該pcv_2抗原通過該 半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器内以便收集或回 收。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳 防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少 90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，最佳至少90。/。大小 為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備pcv_2抗原呈 全病毒或病毒樣粒子時，此孔徑較佳。 所用含有PCV-2抗原之第一液體可由此項技術中已知之 任何方法獲得。較佳地，含有PCV_2抗原之該第一液體以 及PCV-2抗原可由國際專利申請案w〇 2006/072065中所述 之任何方法（其内容及教示以引用的方式併入本文中）獲 150573.doc -26- 201120212 得。特別地，當PCV-2抗原於宿主細胞中於活體外重組表 現時，PCV-2抗原可經由含有及表現PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體’較佳重組桿狀病毒之病毒載體獲 得。 用於表現PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之載體及製 造及/或使用該等載體（或重組載體）之方法可藉由或類似於 以下所揭示之方法實現：美國專利第4,603,112號；第 4,769,330號；第 5,174,993號；第 5,505,941號；第 5,338,683號； 第 5,494,807號；第 4,722,848號；第 5,942,235號；第 5,364,773 號；第 5,762,938 號；第 5,770,212 號；第 5,942,235 號；第 382,425 號；PCT 公開案 WO 94/16716 ; WO 96/39491 ; WO 95/30018 ； Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」，PNAS USA 93: 11349-11353, 1996年 10 月 ；Moss, 厂 Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」，PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第 4,745,051 號，（recombinant baculovirus) ; Richardson，C.D.(編 者），Methods in Molecular Biology 39，「Baculovirus Expression Protocols」（1995 Humana Press Inc·) ; Smith等人，"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」，Molecular and Cellular Biology, 1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165頁；Pennock等人， 「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」 150573.doc -27- 201120212

Molecular and Cellular Biology 1984年 3 月，第 4卷，第 3期， 第3 99-406頁；ΕΡΑ0 3 70 5 73 ; 1986年10月16日申請之美 國申請案第920,197號；EP專利公開案第265785號；美國 專利第 4,769,331 號（recombinant herpesvirus) ； Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for geneticengineeringofnovelvectors，」PNASUSA 93:1 1307-11312，1996 年 10 月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,」PNAS USA 93: 113 13-113 18，1996 年 10 月；Robertson 等人「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」，PNAS USA 93: 11334-11340, 1996 年 10 月；Frolov 等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,」PNAS USA 93: 11371-11377，1996 年 10月；Kitson等人，J. Virol. 65,3068-3075,1991 ;美國專利第 5,591，439號；第 5,552,143號；WO 98/00166 ;已核准之美國申 請案第08/675,556號及第08/675,566號，均申請於1996年7月3曰 (recombinant adenovirus) ; Grunhaus 等人，1992，「Adenovirus as cloning vectors」，Seminars in Virology (第 3 卷）第 237-52 頁，1993 ; Ballay等人EMBO期刊，第4卷，第3861-65頁， Graham, Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，】.〇611\^1'〇1· 70,42434 ; PCT WO 91/11525 ; Feigner #A(1994)，J.Biol· Chem. 269,2550-2561，Science, 259: 1745-49,1993及McClements 等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective 150573.doc -28- 201120212 immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」， PNAS USA 93: 11414-11420，1996 年 10 月；及美國專利第 5,591，639 號；第 5,589,466 號及第 5,580,859 號；以及 WO 90/1 1092 ； W093/19183 ； W094/21797 ； WO95/1 1307 ； W095/20660 ; Tang 等人，Nature 及 Furth 等人 Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors，等等。 亦參見 WO 98/33510 ; Ju 等人，Diabetologia，41: 736- 739,1998 (lentiviral expression system) ； Sanford 等人，美 國專利第 4,945,050 號；Fischbach 等人（Intracel)，w〇 90/01543 ; Robinson 等人 ’ seminars in 9 卷，第 271-283 頁（1997)，（DNA vector systems); 82〇匕等 人，美國專利第號（method of inserting DNA int。Hving cells) ; McCormick等人’美國專利第 5,677 178號（· 〇f cytopathic viruses);及美國專利第 5,928,913 號（vect〇rs f〇r gene delivery)以及本文中所引用之其他文獻。pcv_2 ORF2抗原在昆蟲細胞中之表現描述於例如w〇 〇6/〇72〇65 中。本發明之純化PCV-2 ORF2抗原可藉由此項技術中已 知之若干方法獲得。較佳方法為本文所述之彼等方法。 PCV-2 ORF2抗原可藉由包含以下步驟之方法活體外重組 製得：i)允許用含有PCV-2 ORF2編碼序列之重組病毒載體 感染於培養物中之易感細胞’其中由重組病毒載體表現 PCV-2 ORF2蛋白，及ii)此後自細皰培養物回收pcv_2 ORF2抗原。藉由收集表現PCV-2 0奸2抗原之全（亦即完 整）SF +細胞來回收PCV-20RF2抗原。 150573.doc -29- 201120212 因此，根據本申請案之另一態樣，本申請案提供一種製 備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得 含有PCV-2抗原之第一液體，ϋ)自該PCV-2抗原移除至少 一部分該第一液體，其中該PCV-2抗原係經由含有及表現 PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體（較佳重組桿狀 病毒病毒載體）獲得，且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之 ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更佳ORF-2 蛋白之病毒樣粒子。當使用含有及表現該PCV_2抗原之病 毒載體（尤其重組桿狀病毒）製備/獲得PCV-2抗原時，上述 方法進一步包含較佳在約1至約2〇 mM二元伸乙基亞胺存 在下以DNA滅活劑滅活該病毒載體（較佳重組桿狀病毒病 毒載體）之步驟。較佳在自PCV_2抗原移除至少一部分該第 一液體之後’更佳在收集PCV-2抗原之後執行滅活步驟。 甚至更佳地，在藉由以第二液體交換一部分第一液體自 PCV-2抗原移除部分第一液體之後執行滅活步驟。當藉由 包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時： a)將該第二液體添加至含有卩〇¥_2抗原之該第一液體中， 及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使 PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍， 甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至1〇倍，在該濃縮之 後進仃滅活步驟。當多次，較佳兩次，甚至更佳三次執行 液體添加步驟及濃縮步驟時’在最後一次液體添加步驟及 濃縮步驟之後執行該滅活步驟。當使用過濾器(其較佳含 有半透膜）’藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮 150573.doc 201120212 述該過濾步驟之後， 小於PCV-2抗原且防 步驟時，在較佳使用半透膜進行的上 執行該滅活步驟。該半透膜較佳具有 通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截 或回收之平均孔徑。半透膜或本文 之平均孔徑較佳防止至少90%大小 止至少90%該PCV-2抗原 留在過遽器内以便收集 中所用任何其他過濾器 為kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少9〇〇/。大小為75 kDa 至400 kDa之蛋白冑，且最佳至少9〇%大小為⑽至则 kDa之蛋白夤通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之 抗原時，此孔徑較佳。 出於本發明之目的，r DNA滅活劑」係指滅活dna(較 佳病原體之DNA)使得病原體不能引起主動感染或具有傳 染性或複製但仍能誘導個體之免疫反應的任何化學試劑。 DNA滅活劑較佳為福馬林（f〇rmalin)。 因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製備PCV 2抗 原性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得含有PCV-2 抗原之第一液體，丨〇自該PCV_2抗原移除至少一部分該第 一液體’其中該PCV-2抗原係經由含有及表現pcv-2抗原 (較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體（較佳重組桿狀病毒病毒載 體）獲得’其中該方法進一步包含較佳在約1至約2〇 mM二 元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該病毒載體（較佳 重組桿狀病毒病毒載體）之步驟，且其中該PCV-2抗原包含 PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重組〇RF_2蛋白，且更 佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳在自pcV-2抗原移除至 少一部分該第一液體之後，更佳在收集PCV-2抗原之後執 150573.doc -31 - 201120212 行滅活步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一 液體自PCV_2抗原移除部>第—液體之後執行$活步驟。 當藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第—液 體時.a)將該第二液體添加至含有1>(：乂_2抗原之該第—液 體中，及b)藉由自PCV_2抗原移除一部分該第一及第二液 體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至 50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至1〇倍，在該濃 縮之後進行滅活步驟。當多次，較佳兩次，甚至更佳三次 執行液體添加步驟及濃縮步驟時，在最後一次液體添加步 驟及濃縮步驟之後執行該滅活步驟。當使用過濾器（其較 佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行 濃縮步驟時，在較佳使用半透膜進行的上述該過濾步驟之 後，執行該滅活步驟。該半透膜較佳具有小於PCV_2抗原 且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將pcv_w^ 原截留在過濾器内以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或 本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少9〇% 大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少9〇%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質’且最佳至少9〇%大小為1〇〇 kDa 至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子 之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。 在本發明方法中使用DNA滅活劑之情況下，該方法進一 步包含添加一定量之中和該DNA滅活劑之試劑的步驟，該 量等於該DNA滅活劑之量’其中中和DNA滅活劑之試劑包 含濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉且其中 150573.doc -32- 201120212 該DNA滅活劑為BEI。較佳地，在自pcv_2抗原移除至少 一部分该第一液體之後執行該滅活步驟。 如本文中所用「中和滅活劑之試劑」或「中和劑」係指 旎中和上列滅活劑使得滅活劑不能滅活DNA之任何試劑。 中和滅活劑之試劑較佳為硫代硫酸鈉。 因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製備pcv_2抗 原性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得在第一液體 中之PCV-2抗原，其中該pcv_2抗原係經由含有及表現 PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體（較佳重組桿狀 病毒病毒載體）獲得，且其中該pCV_2抗原包含pcv_2之 ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更佳〇rF_2 蛋白之病毒樣粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第 一液體；iii)較佳在約1至約2〇 mM二元伸乙基亞胺存在下 以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量 之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量等於滅活劑之量， 其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約2〇 mM之最終濃 度的硫代硫酸鈉溶液’且其中滅活劑較佳包含BEI。較佳 在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後，更佳在 收集PCV-2抗原之後執行滅活及中和步驟。甚至更佳在藉 由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部 分第一液體之後執行滅活及中和步驟。當藉由包含以下步 驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時：a)將該第二 液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自 PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原 150573.doc •33 - 201120212 與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍，甚至更佳4 倍至20倍，且甚至更佳7倍至1〇倍，在該濃縮步驟之後進 行滅活及中和步驟。當多次，較佳兩次，甚至更佳三次執 行液體添加步驟及濃縮步驟時，在最後一次液體添加步驟 及濃縮步驟之後執行該滅活及中和步驟。當使用過滤器 (其較佳含有半透膜），藉由過渡（較佳藉由透攄及/或超滤) 進行濃縮步驟時，在較佳使用半透膜進行的上述該過濾步 驟之後，執行該滅活及中和步驟。該半透膜較佳具有小於 PCV-2抗原且防止至少90%該PCV_2抗原通過該半透膜孔且 將PCV-2抗原截留在過濾器内以便收集或回收之平均孔 徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳 防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少 90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至少9〇%大 小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或 病毒樣粒子之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。 在本申請案之另一態樣中’上述方法進一步包含將在該 滅活及中和步驟之後獲得的PCV_2抗原與選自由以下組成 之群的另一組份混合之步驟：醫藥學上可接受之載劑、佐 劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。因此，根據另一態樣，本 申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含 以下步驟：i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原，其中該 PCV-2才几原係經由含有及表現PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF-2) 之病毒載體（較佳重組桿狀病毒病毒載體）獲得，且其中該 PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV_2之重組 150573.doc •34- 201120212 〇RF~2蛋白’且更佳⑽-2蛋白之病毒樣粒子；u)自pcv_2 抗原移除至少-部分該第—液體；出）較佳在約丄至約mM 二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病 毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和 劑量較佳等於滅活劑之量’纟中中和劑較佳包含較佳濃縮 至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中 滅活劑較佳包含BEI ;及幻將在步驟iv)中獲得的pcv_2抗 原與選自由以下組成之群的另一組份混合··醫藥學上可接 受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。較佳該？^ 2抗原包含PCV_22〇RF_2蛋白，更佳pcv_2之重組 蛋白且更佳〇RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳在步驟η) 中，藉由以第二液體交換一部分第一液體自pcv_2抗原移 除忒部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換 操作· a)將該第二液體添加至含有pcV;^^原之該第一液 體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液 體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至 50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至1〇倍。較佳 地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執行液體添加步驟及 辰縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第 一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實質上 同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及 液體添加步驟時，步驟之順序無關緊要。此外，較佳使用 過濾益（其較佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/ 或超遽）進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV_2抗原 150573.doc -35- 201120212 且防止至少90%該PCV-2机原通過該半透膜孔且將PCV-2机 原截留在過濾器内以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或 本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90°/〇 大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少90〇/〇大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至少90%大小為1〇〇 kDa 至3 00 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子 之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。 根據另一態樣，獲得具有降低殺病毒活性之PCV_2抗原 的上述任何方法可包括進一步純化步驟以獲得純化PCV_2 抗原。意外地發現包含純化PCV-2抗原（較佳與佐劑組合） 之抗原性或免疫原性組合物不僅展示如本文所述之降低殺 病毒活性，而且展不與不包含純化P C V - 2抗原（意§胃其包含 非純化或粗PCV-2抗原）之免疫原性組合物相比’提高的免 疫原性。 術語「純化」PCV-2抗原意謂PCV-2抗原在製劑中純化 至以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過50% (w/w)，較佳超過(w/w) ’較佳超過70°/° (w/w) ’較佳 超過80% (w/w)，較佳超過85% (w/w) ’更佳超過90% (w/w)，甚至更佳超過95% (w/w)之程度。換言之，若製劑 包含具有80%(w/w)純度等級之PCV-2抗原，則該製劑包含 以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計不超過 20%(w/w)之非PCV-2蛋白。較佳地’在製劑中’亦即在與 佐劑或任何其他賦形劑或滅活劑混合之前的免疫原性組合 物中量測純度等級。然而’若用於最終免疫原性組合物中 150573.doc -36- 201120212 之佐劑為非蛋白基佐劑，則添加佐劑對純度值無任何影 響。可藉由熟習此項技術者已知之標準方法評估PCV-2抗 原之純度等級，例如藉由在SDS-PAGE分離之後的Imperial Protein Stain(Pierce)、氣相層析、HPLC分析等。評估製劑 (亦即免疫原性組合物）中的PCV-2抗原之純度或純度等級 的本發明之較佳方法為Imperial Protein Stain(Pierce)染色， 其如下進行：使用NuPAGE MOPS緩衝系統（Invitrogen)， 經由 NuPAGE 1 0% Bis-Tris 凝膠（Invitrogen)分離出包含 PCV-2抗原之製劑。在變性（所有緩衝液中均含有SDS)及還 原條件（載入緩衝液含有2-巯基乙醇）下跑膠。在將樣品載 入凝膠之後，在200伏特恆定電壓下跑膠55分鐘。在跑膠 完成之後，使用Imperial Protein Stain(Pierce)對凝膠進行 染色且根據製造商說明書脫色。 相比而言，術語「非純化」或「粗」PCV-2抗原係指包 含PCV-2抗原之粗製劑。通常在細胞培養物中活體外製備 PCV-2抗原。因此，粗PCV-2抗原係指PCV-2抗原與用於製 備PCV-2抗原之細胞培養物或細胞培養材料之混合物。此 外，非純化PCV-2抗原亦意謂部分純化之PCV-2抗原，其 較佳具有以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計小於 5 0% (w/w)，更佳小於40% (w/w)，甚至更佳小於30% (w/w)，甚至更佳小於20°/。（w/w)之純度等級。 此外，如本文中所用術語「提高免疫原性或改良免疫原 性」意謂與包含不同抗原或不同純度等級之抗原的參考免 疫原性組合物相比，由包含相關抗原之免疫原性組合物所 150573.doc •37· 201120212 引起的免疫反應增強’不管此免疫反應為細胞介導及/或 抗體介導之免疫反應。根據一較佳實施例，術語提高免疫 原性或改良免疫原性意謂與包含不同抗原或不同純度等級 之抗原的參考免疫原性組合物相比，由包含相關抗原之免 疫原性組合物所引發的抗體介導之免疫反應增強。就此而 呂’抗體介導之免疫反應意§胃與由包含不同抗原或不同純 度等級之抗原的參考免疫原性組合物引發之抗體產生相 比，對相關抗原有特異性之抗體產生增加。 術語「增強」意謂與由包含不同抗原或不同純度等級之 抗原的參考免疫原性組合物所引發之細胞及/或抗體介導 之免疫反應相比，細胞及/或抗體介導之免疫反應增強至 少10%，較佳至少20%，更佳至少30%，甚至更佳至少 40%，甚至更佳至少50%，甚至更佳至少75%，最佳至少 100%。 熟習此項技術者一般知曉如何量測細胞及/或抗體介導 之免疫反應。詳言之，熟習此項技術者很清楚要比較相關 免疫原性組合物之細胞介導之免疫反應與參考組合物之細 胞介導之免疫反應，或比較相關免疫原性組合物之抗體介 導之免疫反應與參考組合物之抗體介導之免疫反應’而不 比較相關免疫原性組合物之細胞介導之免疫反應與參考組 合物之抗體介導之免疫反應或相關免疫原性組合物之抗體 介導之免疫反應與參考組合物之細胞介導之免疫反應。此 外，可例如藉由量測相關免疫原性組合物/抗原對細胞毒 性T細胞之活化來量測細胞介導之免疫反應°可例如藉由 150573.doc • 38- 201120212 量測由於向動物投與包含該抗原之免疫原性組合物而產生 的抗原特異性抗體之量來量測抗體介導之免疫反應。可例 如藉由使用小鼠模型來量測細胞及/或抗體介導之免疫反 應。根據本發明，小鼠模型用作參考方法。 術浯免疫原性組合物」意謂（但不限於）包含至少一種 在宿主中引發針對相關抗原之細胞及/或抗體介導之免疫 反應的抗原之物質組合物❶通常，「免疫反應」包括（但 不限於）一或多種以下效應：產生或活化特異性針對在相 關組合物或疫苗中所包括之抗原的抗體、B細胞、輔助τ細 胞 '抑制τ細胞及/或細胞毒性τ細胞及/或γ_δ τ細胞。宿主 較佳將展現治療或保護性免疫反應以便增強對新感染之抵 抗力及/或降低疾病之臨床嚴重性。在該情況下，免疫原 性組合物為「疫苗」。該種保護將由通常受感染宿主所呈 現之症狀減輕或缺失、受感染宿主之恢復時間縮短及/或 病毒力價降低來證明。 可藉由層析程序（較佳兩步層析程序）實現PCν_2抗原之 進一步純化。若PCV_2抗原裝配至病毒樣粒子（ν[ρ)中， 則一步（較佳第一步驟）較佳為大小排阻（凝膠過濾）層析， 其可例如藉由使用86口1^<：718300基質進行。在實驗室規 模下’最佳使用 HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然 而’可使用熟習此項技術者已知之任何其他大小排阻層析 基質’其能夠自培養濾液或上清液中分離出PCV-2 ORF2 VLP。合適之基質描述於例如E.L.V. Harris及S. Angel (編 者），Protein purification methods-a practical approach, 150573.doc -39- 201120212 IRL press 0xford 1995)中。可例如藉由以i 〇 mL/min之流 動速率用包含PCV-2抗原之粗製劑裝載管柱且以15個管柱 體積的包含2〇 mM Tns(pH 6.5)、5 mM DTT之緩衝液溶離 管柱來進行凝膠過濾層析。然而，亦可藉由使用親和性層 析，例如，經由選擇性結合至已固定PCV 2 〇RF2特異性 抗體或熟習此項技術者已知之任何其他方法純化pcv_2 〇RF2抗原。 因此，根據一較佳實施例，本發明提供一種製備PCV_2 杬原性組合物之方法，其包含以下步驟：i)獲得含有pc v_ 2抗原之第一液體，U)自該PCV_2抗原移除至少一部分該第 一液體’及ill)藉由層析程序純化包含PCV_2抗原（較佳 PCV-2 ORF2)之步驟Π)收集物。較佳如本文所述，較佳如 貫例3中所述執行大小排阻層析。較佳地，大小排阻產生 具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白 質總量計超過80% (w/w) ’較佳超過9〇% (w/w)純度等級之 免疫原性組合物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統 (Invitrogen)，經由 NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠（Invitrogen) 進行 SDS PAGE 之後，藉由imperiai protein §tain(pierce)染 色來評估純度等級。 因此’根據一較佳實施例，本發明提供一種製備PC ν-2 抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：丨）獲得含有pcv_ 2抗原之第一液體，π)自該pcv—2抗原移除至少一部分該第 一液體’及iii)藉由大小排阻層析（凝膠過濾）純化包含 PCV-2抗原之步驟丨丨）收集物。 150573.doc •40· 201120212 々為了獲得更高純度等級，可進行不同於第一層析步驟之 第二層析步驟。舉例而t，若第一純化步驟/層析步驟為 大小排阻(凝膠過濾、）’則第二步驟應不同於其，為例如親 和性層析、離子交換層析等。較佳地，若純kPcv_2抗原 (較佳純化PCV-2 〇RF2抗原）之第一步驟為大小排阻（凝膠 過濾）層析，則第二步驟可為離子交換層析，較佳陰離子 交換層析（AIEX)。用於純化PCV_2抗原（較佳pcv_2 〇rf2 抗原）之較佳陰離子交換層析基質為Q瓊脂糖凝膠。在約5〇 Μ 之小規模中，最佳使用5 mi HiTrap Q瓊脂糖凝膠^^管 柱。可例如如實例3中所述進行陰離子交換層析。簡言 之可將來自大小排阻層析步驟之約50 ml空隙體積溶離 份彙集物以3.0 ml/min之流動速率裝載於ΑΙΕχ管柱上。在 使用例如20 mM Tris(PH 6·5)、5 mM DTT移除未結合材料 之洗滌步驟之後，可以8個管柱體積之下列緩衝液（2() mM Tris(PH 6.5)、5 mM DTT、i 〇 M仏卬之單一步驟來溶離 蛋白質可將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q瓊脂糖凝膠 官柱上且如上所述進行溶離以提高產率。此兩步技術（大 小排阻繼之以陰離子交換層析）將pcv_2 〇rf2抗原與培養 收集物之大部分其他蛋白組份有效地分離。 因此，根據一較佳實施例，本發明提供一種製備pcv_2 抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：丨）獲得含有％^ 2抗原之第一液體，⑴自該pcv_2抗原移除至少一部分該第 液體’及ill)藉由兩步層析純化包含PC v_2抗原之步驟π) 收集物。第一層析步驟較佳不同於第二步驟。若第一步驟 150573.doc -41 · 201120212 為大小排阻（凝膠過濾）層析，則第二步驟可為離子交換層 析，較佳陰離子交換層析（AIEX)。較佳地，在包括一或多 個進一步純化步驟以獲得純化Pcv_2抗原（較佳pcv_2 ORF-2蛋白）的上述任何方法中，藉由以第二液體交換一部 分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包 含以下步驟之方式進行交換操作：a)將該第二液體添加至 含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自pcv_2抗原 移除一部分該第一及第二液體，使]?(：¥_2抗原與該第一液 體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍，甚至更佳4倍至2〇倍， 且甚至更佳7倍至1〇倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚 至更佳二次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況 下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之 混合物。較佳地，如上所述，實質上同時或依次執行各液 體添力步驟^依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步 驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過濾器（其較佳含有 半透膜）’藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮步 驟。該半透膜較佳具有小於原且防止至少9〇%該 PCV-2抗原通過該半透膜孔且將pcv_2抗原截留在過濾器 内以便收集或回&之平均孔#。半透膜或本文中所用任何 其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至 500 kDa之蛋白質’更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa 之蛋白質’且最佳至少9〇%大小為1〇〇让1^至3〇〇 kDa之蛋 白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原 時’此孔徑較佳。在較佳形式中，上述製備pcv_2抗原性 150573.doc •42· 201120212 組合物之方法進一步包含以下步驟：i)獲得在第一液體中 之PCV-2抗原，其中該PCV-2抗原係經由含有及表現pcv_2 抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體（較佳重組桿狀病毒病 毒載體）獲得，且其中該PCV-2抗原包含pCV_2之〇1117_2蛋 白，更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更佳〇尺!7_2蛋白之病 毒樣粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體； iii) 較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以以^八滅 活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；i v)添加一定量之中和兮· 滅活劑之中和劑，該中和劑量等於滅活劑之量，其中中和 劑較佳包含較佳濃縮至約i至約20 mM之最終濃度的硫代 硫酸鈉溶液，且其中滅活劑較佳包含BEI ;及v)將在步驟 iv) 中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份 混合：醫藥學上可接受之载劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及 其組合。進一步純化（較佳包括預過濾步驟之兩步純化策 略）產生具有以在與任何佐劑混合之前免疫原性組合物中 所包括的蛋白質總量計超過8〇% (w/w)，較佳超過“% (w/w) ’甚至更佳超過9〇% (w/w)，最佳超過抓（叫之 純度等級的免疫原性組合物。 當活病毒或活細菌與pcv_2抗原性組合物混合且 小時或2小時以上’較佳4小時以上，甚至更佳心時以 上甚至更佳24小時以上，甚至更佳2天以上甚佳 天以上’甚至更佳7天以上，甚至更佳2週以上，甚至 =上’甚至更佳2個月以上，甚至更 = 至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以上，甚至更佳9個月甚 150573.doc -43- 201120212 以上，甚至更佳12個月以上，甚至更佳以個月以上，最佳 2年以上時’藉由本文所述之方法製備的pcv_2抗原性組合 物&，J於1 log TCID50活病毒或小於i 1〇g CFU/毫升活細 菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合 且一起培育2小時或2小時以上，較佳4小時以上甚至更 佳12小時以上，甚至更佳24小時…甚至更佳2天以 上，甚至更佳4天以上’甚至更佳7天以上，甚至更佳2週 以上’甚至更佳4週以上’甚至更佳2個月以上，甚至更佳

3個月以上，甚至更# 4 J 更佳4個月以上，甚至更佳6個月以上， 甚至更佳9個月以上’甚至更佳12個月以上甚至更佳μ 個月以上’最佳2年以上時，藉由本文所述之方法製備的 =CV 2抗原性組合物更佳造成小於q 9 w τ⑽一毫升活病 毋或小於G‘9 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活 菌與PC V-2仏原性組合物混合且一起培育2小時或2小時 以上，較佳4小時以上，甚至更佳12小時以上，甚至更佳 24小時以上’甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至 更佳7天以上’甚至更佳2週以上，甚至更佳4週以上，甚 至更佳2個月以上，甚至更佳3個月以上，甚至更佳4個月 以上’甚至更佳6個月以上，甚至更佳9個月以上，甚至更 +個月以上，甚至更佳18個月以上’最佳2年以上時， 藉由本文所述之方法製備的PCV-2抗原性組合物甚至更佳 w成j於G.7 log TCID5G/毫升活病毒或小於Q 7⑽CFu/毫 升活、’田菌之&《°當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合 物混。起培育2小時或2小時以上，較佳4小時以上， J50573.doc 201120212 甚至更佳12小時以上，甚至更佳24小時以上，I至更佳2 天以上，甚至更佳4天以上’甚至更佳7天以上，甚至更佳 2週以上，甚至更佳4週以上，甚至更佳2個月以上甚至 更佳3個月以上，甚至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以 上，甚至更佳9個月以上，甚至更佳12個月以上甚至 佳_月以上，最佳2年以上時，藉由本文所述之方法按 步驟製備的PCV.2抗原性組合物更佳造成小於q ⑻ TCID:/毫升活病毒或小於〇 5㈣cfu/毫升活細菌之J 失。當活病毒或活細菌與PCV_2抗原性組 二 培育2小時或2小時以上，較佳4小時以上，甚至 時以上’甚至更佳24小時以上，甚至更佳2天以上，甚至 更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2週以上，甚 至更佳4週以上，甚至更佳2個月以上，甚至更佳3個月以 上’甚至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以上甚至更佳 9個月以上’甚至更佳12個月以上，甚至更佳18個月以 上，最佳2年以上時，藉由本文所述之方法製備的PCM抗 原性組合物甚至更佳造成小於〇3 1〇g TciD5〇/毫升活病毒 或小於〇.3 lGg CFU/毫升活細菌之損失。活病毒可為任何 活病毒，但活病毒較佳為PRRS病毒，較佳 編號-加之PRRS病毒。活細菌可為任何”，但= 為豬肺炎黴漿菌’較佳豬肺炎黴漿菌之菌株。可藉由能 夠評估活病毒之4的標转體外滴定檢定評估 升。亦可藉由能夠評估活細菌之量的標準活體外滴定檢定 測定CFU/毫升。術語「每毫升」較佳係指❻升流體。該 150573.doc -45- 201120212 純化PCV-2抗原不僅具有如本文所定義之降低殺病毒活 性，而且亦具有與如本文所定義之非純化PCV-2抗原相比 提高的免疫原性，較佳該純化PCV-2抗原使細胞及/或抗體 介導之免疫反應與由包含非純化PCV-2抗原之參考免疫原 性組合物引發的細胞及/或抗體介導之免疫反應相比增強 至少10%，較佳至少20%，更佳至少3〇%，甚至更佳至少 40%，甚至更佳至少50%，甚至更佳至少75%，最佳至少 100%。 因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製備]?(：¥_2抗 原性組合物之方法，其包含以下步驟：i}獲得含有pcv_2 抗原之第一液體，ii)自該PCV_2抗原移除至少一部分該第 一液體，其中當活病毒（較佳PRRSV)或活細菌（較佳豬肺炎 黴漿菌）與PC V-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小 時以上，較佳4小時以上，甚至更佳丨2小時以上，甚至更 佳24小時以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚 至更佳7天以上，甚至更佳2週以上，甚至更佳々週以上， 甚至更佳2個月以上，甚至更佳3個月以上，甚至更佳4個 月以上，甚至更佳6個月以上，甚至更佳9個月以上，甚至 更佳12個月以上，甚至更佳18個月以上最佳2年以上 時’在步驟ii)之後獲得的^_2抗隸組合物造成小Μ 1〇g TCID5。（較佳7毫升），較佳小於0.9 log TCID50(較佳/毫 升），甚至更佳小於0.7 log TCID5G(較佳/毫升），甚至更佳 小於〇.5⑻TCmw較佳/毫升），最佳小於㈢⑽ TCID5〇(較佳/毫升）活病毒（較佳活PRRS V)或小於i log 150573.doc -46- 201120212 C F U (車交佳/宅升），較伟丨^ 笔开）杈佳小於0.91ogCFU(較佳/毫升 更佳小於0.71〇gCFU(較佳/毫升），甚至更佳小 训(較佳/州，最佳小敎3lGgCFU(龍/毫升）活g (較佳豬肺炎黴發_菌彳$ g生 ±J. 臧漿圍)之知失。較佳地’藉由以第二液體交 換-部分第-液體自PCV_2抗原移除該部分第一液體。較 佳以包含以下步驟之方式進行交換操作：a)將該第二液體 添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV- 2抗原移除-部分該第—及第二液體，使ρ(：ν_2抗原盘該第 一液體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍，甚至更佳4俨至2〇 倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次， 甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況 下，不僅移除第-液體，而且移除第一液體與第二液體之 混合物。較佳地，如上所述，實質上同時或依次執行各液 體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步 驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過渡器（其較佳含有 半透膜）’藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮步 驟。該半透膜較佳具有小於PCVM原且防止至少9〇%該 PCV-2抗原通過該半透膜孔且將pcv_2抗原截留在過濾器 内以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何 其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少9〇%大小為5〇伽至 5〇〇 kDa之蛋白質，更佳至少90%大小為75 kDa至4〇() kDa 之蛋白質，且最佳至少9〇%大小為1〇〇 kDa至3〇〇 kDa之蛋 白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之pcv_2抗原 時，此孔徑較佳。當該PCV_2抗原經由含有及表現pcv_2 150573.doc -47- 201120212 抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體（較佳重組桿狀病毒病 毒載體）獲得時，該方法進一步包含iii)較佳在約1至約20 mM 二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病 毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和 劑量等於滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約 1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中滅活 劑較佳包含BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該 第一液體之後，更佳在收集PCV-2抗原之後執行滅活及中 和步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體 自PCV-2抗原移除該部分第一液體之後執行滅活及中和步 驟。當藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第 一液體時：a)將該第二液體添加至含有pcV_2抗原之該第 一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第 二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3 倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至1〇倍，在 該濃縮步驟之後進行滅活及中和步驟。當多次，較佳兩次 且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟時，在最後 一次液體添加步驟及濃縮步驟之後執行該滅活及中和步 驟。當使用過濾器（其較佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉 由透濾及/或超濾）進行濃縮步驟時，在較佳使用半透膜進 行的上述該過濾步驟之後，執行該滅活及中和步驟。該半 透膜較佳具有小於!^乂_2抗原且防止至少9〇%該pcv_2=原 通過該半透膜孔且將PCV_2抗職留在過濾㈣以便收集 或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過渡器 150573.doc -48- 201120212 之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋 白質，更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且 最佳至少90%大小為1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當 製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時，此孔徑較 佳。較佳地’獲得如本文所定義之純化PCv_2抗原之進一 步純化可藉由執行包含以下步驟之進一步純化步驟來實 現：iii)藉由層析步驟純化在移除一部分第一液體之後獲 得的包含PCV-2抗原之步驟丨丨）收集物。為了獲得更高純度 等級’可進行不同於第一步驟之第二層析步驟。舉例而 言，若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻（凝膠過濾），則 第二步驟應不同於其，為例如親和性層析、離子交換層析 等。較佳地，若純化PCV_2抗原（較佳純化pCV_2 〇11172抗 原）之第一步驟為大小排阻（凝膠過濾）層析，則第二步驟可 為離子交換層析，較佳陰離子交換層析（ΑΙΕχ)。用於純化 PCV-2抗原（較佳PCV_2 〇RF2抗原）之較佳陰離子交換層析 基質為Q瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中，最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。可例如如實例3中所述進 行陰離子交換層析。簡言之，可將來自大小排阻層析步驟 之約50 ml空隙體積溶離份彙集物以3〇 ml/mirl之流動速率 裝載於AIEX管柱上。在使用例如2〇 mM Tris(pH 6 y、5 mM DTT移除未結合材料之洗滌步驟之後，可以8個管柱體 積之下列緩衝液（20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.〇 μ

NaCl)之單一步驟溶離蛋白質β可將來自αιεχ跑柱之流過 物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提$ 150573.doc -49- 201120212 產率。Μ步技術（大小排阻繼之以陰離子交換層析）將 PCV-2 ORF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白8組份有 效地分離。 根據上述方法獲得之PCV-2抗原性組合物或上述方法之 步驟i)中所用之PCV-2抗原可與至少一種另外抗原(較佳病 毒或細菌抗原，且甚至更佳來自豬中至少一種其他致病有 機體的病毒或細菌抗原）組合。另外抗原可為國際專利申 請案WO 2007/094893(其内容及教示以引用的方式併入本 文中）中所揭示之任何彼等抗原。簡言之，該另外抗原可 為豬之任何其他致病有機體的抗原。豬之「另一致病有機 體j較佳選自由以下組成之群：胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumonia)(l);腺病毒（2) ; α病毒， 諸如東方馬腦脊髓炎病毒（3);支氣管敗血性博德氏桿菌 (Bordetella br〇nchiSeptiCa)(4);短螺旋體屬（Brachyspira SPP_)(5);較佳豬痢疾短螺旋體（Β· hy〇dyentheriae)(6);結 腸菌毛樣短螺旋體（B. pi〇sic〇H)(7);豬布氏桿菌（Brucella suis) ’較佳生物變種1、2及3(8);經典豬瘟病毒（9);芽胞 梭菌屬（Clostridium spp.)(10);較佳難養芽胞梭菌（C1 difficile)(ll) ; A型、B型及C型產氣莢膜芽胞梭菌（ci. perfringens)(12);諾維氏芽胞梭菌（C1. N〇vyi)(13);敗血 芽胞梭菌（Cl.septicum)(14);破傷風梭菌（ci. tetani)(15); 冠狀病毒（1 6);較佳豬呼吸道冠狀病毒（17);豬附紅血球 體（Eperythrozoonosis suis)(18);豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhsiopathiae)(19);大腸桿菌（Escherichia coli)(20);豬副 150573.doc •50- 201120212 嗜血桿菌（Haemophilus parasuis);較佳亞型 1、7及 14(21); 血球凝集性腦脊髓炎（Hemagglutinating encephalomyelitis) 病母*(22)，曰本腦炎病毒（23);胞内勞森菌（l awsonia intracellularis)(24);鉤端螺旋體屬（Leptospira spp.)(25)， 較佳澳洲鉤端螺旋體（Leptospira australis)(26);犬鉤端螺 旋體（Leptospira canicola)(27);感冒傷寒性鉤端螺旋體 (Leptospira grippotyphosa)(28);出血性黃疸鉤端螺旋體 (Leptospira icterohaemorrhagicae)(29);及問號鉤端螺旋體 (Leptospira interrogans)(3 0);波莫那鉤端螺旋體 (Leptospira pomona)(31);塔拉索夫鉤端螺旋體（Lept〇spira tarassovi)(32)，分枝桿菌屬（Mycobacterium spp.)(33);較 佳’鳥分枝桿菌（Μ· avium)(34);細胞内分枝桿菌（μ intracellulare)(35)及牛分枝桿菌（M.bovis)(36);豬肺炎黴 漿菌（37);多殺性巴氏桿菌（pasteurei丨a multocida)(38);豬 細胞巨大病毒（39);豬小病毒（40);豬生殖及呼吸症候群 病毒（41);假性狂犬病病毒（42);輪狀病毒（43);沙門桿菌 屬（Salmonella spp_)(44);較佳，鼠傷寒沙門桿菌（s thyhimurium)(45)及豬霍亂沙門桿菌（S· choleraesuis)(46); 豬葡萄球菌（Staph. hyicus)(47);葡萄球菌屬（Staphylococcus SPP.)(48)，較佳’鏈球菌屬（streptococcus spp.)(49);較 佳’豬鏈球菌（50);豬疱疹病毒（51);豬流感病毒（52);豬 痘病毒（53);豬痘病毒（54);水泡性口炎病毒（55);豬水疮 療病毒（56)，哈德焦鉤端螺旋體（Lept〇spira Hardj〇)(57); 及/或豬關節滑膜黴漿菌（58)。 150573.doc 201120212 因此，根據本發明之另一態樣，本發明提供一種製備 PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：丨）獲得在 第一液體中之PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部 分該第一液體·，及將該PCV — 2抗原與至少一種另外抗原（較 佳病毒或細菌抗原，且更佳來自豬中至少一種其他致病有 機體的病毒或細菌抗原）組合。較佳該PCV_2抗原包含 PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PcV-2之重組ORF-2蛋白，且更 佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交 換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較 佳以包含以下步驟之方式進行交換操作：a)將該第二液體 添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自pcv_ 2抗原移除一部分該第一及第二液體，使pcv_2抗原與該第 一液體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍，甚至更佳4倍至2〇 且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次， 且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情 況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體 之混合物。較佳地，如上所述，實質上同時或依次執行各 液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時， 步驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過濾器（其較佳含 有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮 步驟。該半透膜較佳具有小於pCv_w^原且防止至少9〇0/〇 §亥PCV-2抗原通過該半透膜孔且將1>(：¥_2抗原截留在過濾 益内以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任 何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少9〇%大小為5〇 kDa 150573.doc •52- 201120212 至500 kDa之蛋白質，更佳至少9〇%大小為75让以至斗⑼ kDa之蛋白質，且最佳至少9〇%大小為1〇〇 kDa至3〇〇 kDa 之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之pc v_2抗 原時，此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲得純 化PCV-2抗原。 在較佳形式中，上述製備1>(：乂_2抗原性組合物之方法進 一步包含以下步驟：i)獲得在第一液體中之pcv_2抗原， 其中s亥PCV-2抗原係經由含有及表現pcv_2抗原（較佳pcv_ 2 ORF-2)之病#載體(較佳重組桿狀病毒病#載體)獲得， 且其中該PCV-2抗原包含？(^_2之〇1^_2蛋白，更佳pcv_2 之重組ORF-2蛋白，i更佳〇购蛋白之病毒樣粒子；⑴ 自PCV-2抗原移除至少—部分該第—液體；叫較佳在約】 至約20 mM一 το伸乙基亞胺存在下以dna滅活劑滅活重組 桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和 劑，該中和劑量等於滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較 佳濃縮至約1至約2 〇 m Μ夕# ·&·*、# Α 之最〜濃度的硫代硫酸納溶液’ 且其中滅活劑較佳句冬RPT · β ^ 住匕3 ΒΕΙ ,及V)將在步驟iv)中獲得的 PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合：醫藥 學上可接受之载劑、佐劑，稀釋劑、賦形劑及其組合。 ㈣態樣中’該至少—種另外抗原為病毒抗 原，較佳來自豬生殖及呼吸症候群病毒之抗原。該豬生殖 及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳經修 飾之活病母’甚至更佳經修倚之減毒活病毒。該經修飾之 褚生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號 150573.doc •53- 201120212 乂11 23 32之經修飾之活病毒株，且更佳包含1：^(5]£1^^^(^ PRRS MLV。因此，根據另_態樣，*中請案提供—種製 備PCV-2k原性組合物之方法，其包含以下步驟：丨）獲得 含有PCV-2抗原之第一液體，Η)自該pcv_2抗原移除至少 一部分該第一液體，及將該Pcv_2抗原與來自豬生殖及呼 吸症候群病毒之抗原組合。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗 原較佳包含活病毒，更佳經修飾之活病毒，且甚至更佳經 修飾之減毒活病毒《該經修飾之豬生殖及呼吸症候群活病 毒抗原更佳包含ATCC寄存編號¥尺2332之經修飾之活病毒 株，且更佳包含INGELVAC® PRRS MLV。該PCV-2抗原 較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳pCV_2之重組〇RF2蛋 白，且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第 二液體交換一部分第一液體自PCV_2抗原移除該部分第一 液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作：a)將該 第二液體添加至含有PCV_2抗原之該第一液體中，及…藉 由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使pcv_2 抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍，甚至 更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至1〇倍。較佳地，多次， 較佳兩=人，甚至更佳二次執行液體添加步驟及濃縮步驟。 在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第 一液體之混合物。較佳地，如上所述，實質上同時或依次 執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步 驟時，步驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過遽器（其 較佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進 150573.doc • 54- 201120212 行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於pcv-2抗原且防止至 少90°/。該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV_2抗原截留在 過濾器内以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所 用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少90%大小為75 kDa至 400 kDa之蛋白質，且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV_ 2抗原時，此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲 得純化PCV-2抗原。 在本申請案之另一態樣中，該至少一種另外抗原為細菌 抗原，較佳為豬肺炎黴漿菌。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為 菌苗，且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為1NGELVAC® MYCOFLEX。因此，根據另一態樣，本申請案提供一種製 備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟：丨）獲得 含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該PCV·2抗原移除至少 一部分該第一液體，及將該PCV-2抗原與細菌抗原（較佳豬 肺炎黴漿菌）組合。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗’且 該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC® MYCOFLEX。該 PCV-2抗原較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重 組ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳 地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移 除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換 操作：a)將該第二液體添加至含有pCV-2抗原之該第一液 體中，及b)藉由自PC V-2抗原移除一部分該第一及第二液 150573.doc -55- 201120212 體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至 5〇倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至1〇倍。較佳 地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執行液體添加步驟 及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移 除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實 質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步 驟及液體添加步驟時，步驟之順序無關緊要。此外，較佳 使用過濾器（其較佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾 及/或超濾）進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PC v_2 抗原且防止至少90%該PCV_2抗原通過該半透膜孔且將 PCV-2抗原截留在過濾器内以便收集或回收之平均孔徑。 半透膜或本文中所用任何其他過攄器之平均孔徑較佳防止 至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少9〇% 大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至少9〇%大小為 1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒 樣粒子之PCV-2抗原時’此孔徑較佳。可如上所述進行進 一步純化以獲得純化PC V-2抗原。 在本申請案之另一態樣中，該至少一種另外抗原包括病 毒抗原，較佳如上所述之豬生殖及呼吸症候群病毒抗原； 及細菌抗原，較佳如上所述之豬肺炎黴漿菌抗原。該豬生 殖及呼吸症候群病毒抗原較佳包含活病毒，更佳經修飾之 活病毒’且更佳包含ATCC寄存編號VR 23 32之經修飾之活 病毒株’且更佳包含INGELVAC® PRRS MLV。該豬肺炎 黴浆菌抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為 150573.doc -56- 201120212 INGELVAC® MYCOFLEX。因此，根據另一態樣，本申請 案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下 步驟：i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該PCV-2抗 原移除至少一部分該第一液體，及將該PCV-2抗原與病毒 抗原（較佳如上所述之豬生殖及呼吸症候群病毒抗原）及細 菌抗原（較佳如上所述之豬肺炎黴漿菌抗原）組合。該豬生 殖及呼吸症候群病毒抗原較佳包含活病毒，更佳經修飾之 活病毒，且更佳包含ATCC寄存編號VR 23 32之經修飾之活 、 病毒株，且更佳包含INGELVAC® PRRS MLV。該豬肺炎 黴漿菌抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為 INGELVAC® MYCOFLEX。該 PCV-2抗原較佳包含PCV-2 之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更佳 ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換 一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳 以包含以下步驟之方式進行交換操作：a)將該第二液體添 加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2 抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第 一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20 倍，且甚至更佳7倍至1 〇倍。較佳地，多次，較佳兩次， 且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情 況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體 之混合物。較佳地，如上所述，實質上同時或依次執行該 液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時， 步驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過濾器（其較佳含 150573.doc -57- 201120212 有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮 步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90% 該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾 器内以便收集或回收之平均孔徑。.半透膜或本文中所用任 何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa 至500 kDa之蛋白質’更佳至少9〇%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至少9〇〇/0大小為1〇〇 kDa至300 kDa 之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗 原時，此孔徑較佳《可如上所述進行進一步純化以獲得純 化PCV-2抗原。 本申請案不僅提供製備PCV-2抗原性組合物之方法，f 且係關於PCV-2抗原性組合物。因此，根據另一態樣，） 專利申請案進一步提供一種PCV_2抗原性組合物，其特令 在於當活病毒或活細菌與PCV_2抗原性組合物混合且培育 小時或2小時以上’較佳4小時以上’甚至更佳12小時上 上，甚至更佳24小時以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳 天以上’甚至更佳7天以上，甚至更佳2週以上，甚至更《 4週以上’甚至更佳2個月以±，甚至更佳3個月以上，^ 至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以上，甚至更佳9個) 以上’甚至更佳12個月以上’甚至更佳18個月以上且, 佳2年以上時，該pcv_2抗原性組合物造成小於五^ TCID50活病#或小於！ 1〇g CF_升活細菌之損失。」 病毒或活細菌與PCV_2抗原性組合物混合且一起培育J : 或2小時以上’較佳4小時以上’甚至更佳12小時。:上 150573.doc -58· 201120212 至更佳24小時以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以 上’甚至更佳7天以上’甚至更佳2週以上，甚至更周 以上，甚至更佳2個月以上，甚至更佳3個月以上甚至更 佳4個月以上，甚至更佳6個月以上，甚至更佳9個月以 上，甚至更佳12個月以上，甚至更佳18個月以上且最佳 2年以上時’該PCV_2抗原性組合物更佳造成小於一 TCH^/毫升活病毒或小於〇·9 一 cfu/毫升活細菌之損 失二當活病毒或活細菌與pcv_2抗原性組合物混合且一起 培育2小時或2小時以上，較佳4小時以上甚至更佳u小 時以上’甚至更佳24小時以上甚至更佳2天以上，甚至 更佳4天以上’甚至更佳7天以上，甚至更佳2週以上，甚 更佳4週以上，甚至更佳2個月以上，甚至更佳3個月以 上，甚至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以上甚至更佳 9個月以上’甚至更佳12個月以上，甚至更佳18個月以 最佳2年以上時，该pC v_2抗原性組合物甚至更佳造 成小於〇,7 1〇g TCID5〇/毫升活病毒或小於0.7 log CFU/毫升 二菌之知失。當活病毒或活細菌與pcv_2抗原性組合物 混合且—起培育2小時或2小時以上，較佳4小時以上甚 至更佳12小時以上，甚至更佳24小時以上，甚至更佳2天 以上，甚至更佳4天以上’甚至更佳7天以上，甚至更佳2 週以上’甚至更佳4週以上，甚至更佳2個月以上，甚至更 個月以上’甚至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以 甚至更佳9個月以上’甚至更佳12個月以上甚至更 18個月以上’且最佳2年以上時’該PCV-2抗原性組合物 150573.doc •59. 201120212 更佳造成小於0.5 log 丁CID /毫 50宅升/舌病毒或小於0.5 log CFU/毫升活細菌之損失。當主 田舌病母或活細菌與PCv_2抗原 性組合物混合且一起培育2小時 丁 4 z小flf以上，較佳4小時 以上，甚至更佳12小時以上，甚 选主更佳2 4小時以上，甚至 更佳2天以上，甚至更佳4天 选主更佳7天以上，甚 至更佳2週以上，甚至更佳4 旯佳4週以上，甚至更佳2個月以 上，甚至更佳3個月以上，甚至更佳物月以上，甚至更佳 6個月以上，甚至更佳w 更佳9個月以，甚至更佳12個月以上， U ’且最佳2年以上時’該pm抗原性 組合物甚至更佳造成小於〇.31〇§咖5〇/毫升活病毒或小 ^•3 log CFU/毫升活細菌之損失。活病毒可為任何活病 ’但活病毒較佳為PRRS病毒，較佳具有Ατα：寄存編號 VR 2332之PRRS病毒。活細菌可為任何細菌，但較佳為豬 肺炎徽聚菌’較佳豬肺炎黴漿菌之J-菌株。可藉由能夠評 舌病毋之里的標準活體外滴定檢定評估丁以仏〆毫升。 亦可藉由能夠評估活細菌之量的標準活體外滴定檢定測定 CFU/毫升。術語「每毫升」較佳係指1毫升流體。 〜'樣中，上述pcv_2抗原性組合物包含選自由以 下組成之群的另-組份：醫藥學上可接受之載劑、佐劑、 釋Μ賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑，甚至 更佳其中该佐劑為丙婦酸或曱基丙烯酸之聚合物，且更佳 、θ佐诏為卡波姆。較佳以每劑量約丨〇〇吨至約1 〇 旦里添加佐劑。甚至更佳以每劑量約100 pg至約1 〇 mg之 $添加佐杳|丨。Φ 7土、 更佳以母劑量約500 至約5 mg之量添加佐 150573.doc 201120212 劑。更佳以每劑量約750 pg至約2.5 mg之量添加佐劑。最 佳以每劑量約1 mg之量添加佐劑。 本申請案不僅提供製備PCV-2抗原性組合物之方法及/或 如上文所定義之PCV-2抗原性組合物，其亦係關於可藉由 本文所述之任何方法獲得的PCV-2抗原性組合物。因此， 在另一態樣中，本申請案係關於藉由包含以下步驟之方法 獲得的PCV-2抗原性組合物：i)獲得含有pcv-2抗原之第一 液體’ ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。該 PCV-2抗原較佳用作PCV-2抗原性組合物或用於該？匚乂_2抗 原性組合物中。術語「藉由本文所提供之方法獲得的PC v_ 2抗原性組合物」亦意謂該PCV-2抗原性組合物可藉由本文 中所提供之方法獲得。根據另一態樣，本申請案亦係關於 藉由以第二液體交換部分第一液體自PCv_2抗原移除該部 分該第一液體獲得的PCV-2抗原性組合物，其中該第二液 體不同於該第一液體。因此，根據另一態樣，本申請案係 關於藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV_2抗原性組合 物，1)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，⑴自該pcv2抗原 移除至少一部分該第一液體，其中藉由以第二液體交換部 分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體，其中該第 二液體不同於該第一液體。較佳地，以該第二液體交換部 分該第一液體之操作包含以下步驟：a)將該第二液體添加 至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自pcv2抗 原移除一部分該第一及第二液體來濃縮pcv_2抗原。 根據另一態樣，較佳藉由以下方法獲得pcv ;^^原性組 150573.doc -61 - 201120212 合物：其中使用過濾器藉由過濾步驟自PCV_2抗原移除部 分該第一液體。然而，可使用熟習此項技術者已知之任何 其他方法（例如，離心及/或層析）自PCV-2抗原移除部分第 一及第二流體。然而，最佳為過濾·。移除該部分第一流體 之較佳過渡方法包含超遽及/或透濾。如本文所述之方法 之濃縮步驟及該液體添加步驟可實質上同時或另外執行， 依次執行該濃縮步驟與該液體添加步驟。因此，根據另一 態樣’本申請案係關於藉由包含以下步驟之方法獲得的 PCV-2抗原性組合物’丨）獲得含有PcV_2抗原之第一液體， ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中藉由 以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除部分該第 一液體’其中該第二液體不同於該第一液體。較佳地，以 該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟：a) 將該第二液體添加至含有pcv_2抗原之該第一液體中，及 b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮 PCV-2抗原，其中實質上同時或依次執行液體添加步驟。 當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟之順序無關 緊要。舉例而言，在另一態樣中，該液體添加步驟在該濃 縮步驟之前進行且在一替代態樣中，該濃縮步驟在該液體 添加步驟之前進行。 在另一態樣中，本申請案係關於可使用本文所述之方法 獲得的PCV-2抗原性組合物，其中可多次執行該液體添加 步驟及該濃縮步驟，不管執行該等步驟之順序如何。舉例 而言，此等各別步驟之每一者可執行至少兩次，至少= 150573.doc •62· 201120212 次’至少四次’至少五次，至少十次，直至所需之多次。 在一態樣中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少 兩次。在另一態樣中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自 執行至少三次。 在本申請案之另一態樣中’如上所述獲得本發明之 PCV-2抗原性組合物，其中過濾為自pcv_2抗原移除一部 分該第一液體或在如上所述多個移除步驟之情況下，移除 一部分第一流體與第二流體之混合物的較佳方法。過渡器 可為此項技術中之任何習知過濾器。該過濾器較佳包括半 透膜。在另一較佳形式中，該半透膜具有小於PCV_2抗原 之平均孔徑，藉此防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透 膜孔且由過濾器截留PCV_2抗原。在另一態樣中，該過濾 器具有防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質通過 的平均孔徑，更佳地，該過濾器具有防止至少9〇%大小為 75 kDa至400 kDa之蛋白質通過的平均孔徑，且最佳地， 該過濾器具有防止至少90%大小為100 kDa至3〇〇 kDa之蛋 白質通過的平均孔徑。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之 PCV-2抗原時，此孔徑較佳。在另一態樣中，該半透膜包 括選自由聚砜、聚醚砜及再生纖維素組成之群的材料。然 而，可使用能夠自PCV-2抗原移除一部分第一流體且在多 個方法步驟之情況下移除第一流體與第二流體之混合物的 任何其他材料。在另一態樣中，該過濾器係選自由中空纖 維膜超濾濾筒、平板或過濾片組成之群，以中空纖維膜超 遽濾、筒尤佳。 150573.doc -63 - 201120212 因此’根據另一態樣，本申請案係關於使用如上所述之 方法獲得的PCV-2抗原性組合物’其中過濾器較佳為半透 膜或包含半透膜。該半透膜較佳具有小於PCv_2抗原且防 止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半 透膜之平均孔徑較佳防止至少9〇%大小為5〇 kDa至500 kDa 之蛋白質’更佳至少90。/。大小為75 kDa至400 kDa之蛋白 質’且最佳至少90%大小為1〇〇 kDa至30〇 kDa之蛋白質通 過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時，此孔 徑較佳。如上所述，移除步驟一般包括以一部分第二流體 交換部分第一流體，該交換操作包含以下步驟：a)將該第 二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由 自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮pcv_2 抗原，其中多次（例如兩次、三次、五次、十次等）執行液 體添加步驟及濃縮步驟。較佳地，兩次，最佳三次執行液 體添加步驟及濃縮步驟》 執行本文所提供之獲得PCV-2抗原性組合物之方法之濃 縮步驟，以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3 倍至5 0倍。更佳地，進行該濃縮步驟以便使pcv_2抗原與 該第一液體之體積相比濃縮4倍至20倍。最佳地，進行濃 縮步驟以便使PCV-2抗原與第一液體之體積相比濃縮7倍至 1 〇倍。因此，根據另一態樣，本申請案係關於藉由上述方 法獲得的PCV-2抗原性組合物’其中與該第一液體之體積 相比，該PCV-2抗原濃縮了 3倍至50倍，較佳4倍至2〇倍， 且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，藉由以第二液體交換部 150573.doc • 64 · 201120212 /刀第-液體自PCV-2抗原移除該部分第一流體，該交換操 作包含以下步驟：a)將該第二液體添加至含有pcV-2抗原 之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原㈣一部分該第 一及第二液體，使Pcv_2抗原與該第一液體之體積相比濃 縮3倍至50倍，較佳4倍至2〇倍，且甚至更佳7倍至倍。 液體添加步驟較佳與濃縮步驟實質上同時或依次執行。當 依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟之順序無關緊 要。此外，杈佳使用過濾器（其較佳含有半透膜卜藉由過 濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮步驟。該半透膜較佳 具有小於PCV-2抗原且防止至少9〇%該pcv_2抗原通過該半 透膜孔之平均孔徑。半透膜之平均孔徑較佳防止至少9〇% 大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質，更佳至少9〇%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質’且最佳至少9〇%大小為i〇〇 kDa 至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子 之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。 較佳地，獲得包含如本文中所定義之純化pcv_2抗原之 PCV-2抗原性、组合物的進—步純化可藉由執行包含以下步 驟之進一步純化步驟來實現：iH)藉由層析步驟純化在移 除一部分第一液體之後獲得的包含pcv_2抗原的步驟u)收 集物（本文所述任何方法）。為了獲得更高純度等級可進 行不同於第一步驟之第二層析步驟。舉例而言，若第—純 化步驟/層析步驟為大小排阻（凝膠過濾），則第二純化步驟 應不同於其’為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳 地，若純化PCV-2抗原（較佳純化pcv_2 〇RF2抗原）之第— 150573.doc -65· 201120212 步驟為大小排阻（凝膠過濾）層析，則第二步驟可為離子交 換層析，較佳陰離子交換層析（AIEX)。用於純化Pcv_2抗 原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之較佳陰離子交換層析基質為q 瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中，最佳使用5如 HiTrap Q瓊脂糖凝膠Hp管柱。可例如如實例3中所述進行 陰離子交換層析。簡言之，可將來自大小排阻層析步驟之 、勺5〇 ml空隙體積溶離份彙集物以3 ·0 ml/min之流動速率梦 載於AIEX管柱上。在使用例如20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT移除未結合材料之洗滌步驟之後，可以8個管柱體積

之下列緩衝液（20 mM Tris(PH 6.5)、5 mM DTT、ho M

NaCl)之單一步驟溶離蛋白質。可將來自ΑΙΕχ跑柱之流過 物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提高 產率。此兩步技術（大小排阻繼之以陰離子交換層析）將 PCV-2 〇RF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白組份有 效地分離。 在另一態樣中’由本文所述方法製備的PCV—2抗原性組 合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該液體相比降低至少 10%。更佳地，該PCV_2抗原性組合物之殺病毒活性與未 經歷該方法之該第一液體相比降低至少50%。更佳地，該 PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該第 一液體相比降低至少70%。 因此，根據另一態樣，本案係關於藉由一種包含以下步 驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物：i)獲得含有pcv_2抗 原之第一液體，ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一 150573.doc -66- 201120212 液體，其中在步驟u)之後獲得的PCV_2抗原性組合物之殺 病毒活性（較佳針對PRRS病毒）與第一液體之殺病毒活性相 比降低至少1 0°/。’較佳至少5〇%，更佳至少70%，甚至更 佳至少90%。較佳地，藉由第二液體交換第一液體之一部 分而自PCV-2抗原移除第一液體具有殺病毒活性之部分。 較佳以包含以下之步驟進行交換：勾將該第二液體添加至 含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自pcv_2抗原 移除一部分該第一及第二液體，使pcv;^^原與該第一液 體之體積相比濃縮較佳3倍至5〇倍’甚至更佳4倍至20倍， 甚至更佳7倍至1 〇倍。如上所述，液體添加步驟較佳與濃 縮步驟實質上同時或依次執行。當依次執行濃縮步驟及液 體添加步驟時，步驟之順序無關緊要。此外，較佳使用過 濾器（較佳含有半透膜），藉由過濾（較佳藉由透濾及/或超 濾）進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於1)(：¥_2抗原且防 止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半 透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至 少90%大小為50 kDa至5〇〇 kDa之蛋白質，更佳至少9〇%大 小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，最佳至少90%大小為1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備pcv_2抗原呈全病毒 或病毒樣粒子時，此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純 化以獲得純化之PCV-2抗原。 根據另一態樣，本申請案係關於藉由本文所述之方法獲 得的PCV-2k原性組合物，其中當活病毒（較佳pRRSv)或 活細菌（較佳豬肺炎黴漿菌）與PCV_2抗原性組合物混合且 150573.doc -67· 201120212 ，:月2小時或2小時以上，較佳4小時以上 12小時以μ 廿^ π 土又住 ，甚至更佳24小時以上，甚至更佳2天以上， 甚至更佳4天以上，並s s 上甚至更佳7天以上，甚至更佳2週以 至更佳4週以上，甚至更佳2個月以上， 個月以上，其$审杜〇 世芏旯佳3 甚至更佳4個月以上，甚至更佳6個月以上甚 J更個月以上’甚至更佳12個月以上，甚至更佳18個 以，且最佳2年以上日夺，該pcv_2抗原性組合物造成小 吝=】〇g tcid50(較佳/毫升），較佳小於〇 9㈣丁 吏佳丨、於0.7 log TCID5G(較佳/毫升），甚至更 佳小於 0.5 l0g TCID5()(較佳 / 吝 4u土， m权住/毫升），最佳小於〇 3 i〇g ciD5〇(較佳/毫升）活病毒（較佳活prrsv)或小於！ CFU(較佳/毫升），較佳小於Q9 iQg cfu(較佳/毫升），甚至 更佳小於0.7 1 〇g CFU(較佳/奎并、^ K s 、住/宅升），甚至更佳小於0.5 log CFU(較佳/毫升），最佳]、# n 1 1 ；敢佳】、於〇·3 log CFU(較佳/毫升）活細菌 m佳緒肺炎黴漿菌）之損失。活病毒可為任何活病毒，作

活病毒較佳為PRRS病4，較佳具有A取寄存編號VR 2332之PRRS病毒。活細菌可為彳 困』马任何細菌，但較佳為豬肺 炎《菌，較佳豬肺炎黴漿菌之;_菌株。可藉由能夠評估 活病毒之量的標準活體外滴定檢定評估TCiD5〇/毫升。亦 可藉由能夠評估活細菌之量的標準活體外滴定檢定測定 CFU/毫升。術語「每毫升」較佳係^毫升流體。 在另一態樣中，本專利申t奎安# Ba & —, 案係關於措由上述方法獲得 的PCV-2抗原性組合物，上述方法進一步包含收集步驟⑴ 之後剩餘的PCV-2抗原之步驟。可以任何習知方式進行此 150573.doc •68· 201120212 收集操作。在一尤佳收集方式中，經由過濾步驟自該PCV_ 2杬原移除部分該第—液體且自過濾器阻滯物回收或收集 PCV-2抗原。 ’、 在另一態樣中，將藉由本文所述之任何方法獲得的 PCV-2抗原性組合物與選自由以下組成之群的另—組份混 合：醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其 組合。該另一組份較佳為佐劑’甚至更佳其中該佐劑為丙 烯酸或曱基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為卡波 姆0 因此，根據另一態樣，本申請案提供藉由上述方法獲得 的PCV-2抗原性組合物，該方法進一步包含以下步驟：將 藉由本文所述之方法獲得的原與選自由以下組成 之群的另一組份混合：醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀 釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑，甚至更 佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其 中該佐劑為卡波姆。較佳以每劑量約100 至約10 mg之 i添加佐劑。甚至更佳以每劑量約i叫至約1 〇 mg之量 添加佐劑。更佳以每劑量約吨至約5 之量添加佐 劑。更佳以每劑量約75〇吨至約2 5 mg之量添加佐劑。最 佳以每劑量約丨mg之量添加佐劑。 在另一態樣中’上述PCV-2抗原性組合物包含PCV-2之 ORF-2蛋白，更佳pCv_2之重組〇rF2蛋白，且更佳〇rF2 蛋白之病毒樣粒子。因此，根據本申請案之另一態樣，本 申凊案提供藉由上述方法獲得的pcv 2抗原性組合物，其 150573.doc -69- 201120212 中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重 組ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。 如上所述，本文所述之方法中使用的PCV-2抗原可藉由 此項技術中已知之任何方法獲得。較佳地，PCV-2抗原係 經由含有及表現PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體 (較佳重組桿狀病毒病毒載體）獲得。在較佳形式中，該 PCV-2抗原係根據W02006/072065(其教示及内容先前以引 用的方式併入）中所述之程序獲得。因此，根據本申請案 之另一態樣，本申請案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗 原性組合物，其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2 抗原（較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體（較佳重組桿狀病毒病 毒載體）獲得，且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋 白，更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病 毒樣粒子。 在本申請案之另一態樣中，PCV-2抗原性組合物係藉由 上述方法獲得且該方法進一步包含較佳在約1至約20 mM 二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該重組桿狀病毒 病毒載體之步驟。在較佳形式中，該方法進一步包含添加 一定量之中和該DNA滅活劑之試劑，該量等於該DNA滅活 劑之量，其中中和DNA滅活劑之試劑包含濃縮至約1至約 20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中該DNA滅活 劑為BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液 體之後執行該滅活步驟。 在本申請案之另一態樣中，PCV-2抗原性組合物係藉由 150573.doc -70- 201120212 上述方法獲得’該方法進一步包含混合在滅活及中和步驟 之後獲得的PCV-2抗原之步驟。因此，根據另一態樣，本 申凊案提供藉由包含以下步驟之上述方法獲得的1>(：¥_2抗 原性組合物.〇獲得在第一液體中之pcv_2抗原；丨丨）自 PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；iH)較佳在約1至 約20 mM一元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿 狀病毒病毒載體；iv)添加—定量之中和該滅活劑之中和 劑’該中和劑量等於滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較 佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液且 其甲滅活劑較佳包含BEI ;及(較佳)步驟v)，&含將步驟 Μ中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份 混合.醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑 '賦形劑及 其組合。 在本申請案之另—態樣中，較佳藉由上述方法獲得的上 述PCV-2抗原性組合物進一步包含至少—種另外抗原，較 佳病毒或細菌抗原’且更佳來自緒中至少—種其他致病有 機體的病毒或細菌抗原。在另—態樣中，該至少—種另外 抗原為豬生殖及呼吸症料病毒。該豬生殖及呼吸症候群 病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳包含經修飾之活病 毒。該經修飾之緒生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含 ATCC寄存編號VR 2332之經㈣之活病毒株，且更佳包含 臟LVA⑽P順MLV。在本申請案之另_態㈣該 至少一種另外抗原為豬肺炎徵嘮益 ^ 巾人磁漿_。該豬肺炎黴㈣抗原 較佳為菌苗，且該豬肺炎苗更佳為INGELVAC⑧ 150573.doc 201120212 MYCOFLEX »在本申請案之另一態樣中，較佳藉由上述方 法獲得的上述PCV_2抗原性組合物進一步包含豬生殖及呼 吸症候群病毒抗原，較佳經修飾之豬生殖及呼吸症候群活 病毒，更佳具有ATCC寄存編號VR 23 32之豬生殖及呼吸症 候群病毒，或在INGELVAC® PRRS MLV 或INGELVAC® PRRS ATP中所包括的豬生殖及呼吸症候群病毒。在本申 請案之另一態樣中，較佳藉由上述方法獲得的上述PC V-2 抗原性組合物進一步包含豬肺炎黴漿菌，較佳豬肺炎黴漿 菌菌苗，且更佳 INGELVAC® MYCOFLEX 或 INGELVAC® MYCOFLEX中所包括的豬肺炎黴漿菌菌苗。在另一態樣 中，本文所述之PCV-2抗原性組合物包含豬生殖及呼吸症 候群病毒，較佳上述彼等任一者；及豬肺炎黴漿菌’較佳 上述彼等任一者。 當包含至少一種來自如上所述豬中至少一種其他致病有 機體的另外抗原（較佳豬生殖及呼吸症候群病毒及/或猪肺 炎黴漿菌抗原）之PCV-2抗原性組合物藉由本文所述之方法 獲得時，該方法包含以下步驟：i)獲得在第一液體中之 PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液 體；及將該PCV-2抗原與至少一種另外抗原’較佳病毒或 細菌抗原’且更佳來自豬中至少一種其他致病有機體的病 毒或細菌抗原混合。較佳該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2 蛋白’更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白’且更佳0RF-2蛋白之 病毒樣粒子。較佳地’藉由以第·一液體父換一部分第一液 體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步 150573.doc •72- 201120212 驟之方式進行交換操作：a)將該第二液體添加至含有pcv_ 2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PC V-2抗原移除一部分 該第爲结· _ 次第二液體’使PCV_2抗原與該第一液體之體積相 . 農縮較佳3倍至50倍’甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳 七至1 〇倍。較佳地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執 行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第 一液體’而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳 地’如上所述’實質上同時或依次執行各液體添加步驟。 當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟之順序無關 緊要。此外，較佳使用過濾器（其較佳含有半透膜），藉由 過濾（較佳藉由透濾及/或超濾）進行濃縮步驟。該半透膜較 佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90。/。該PCV-2抗原通過該 半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器内以便收集或回收 之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均 孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質， 更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質，且最佳至 少90%大小為1〇〇 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈 全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時，此孔徑較佳。 • 如上文所定義之本發明提供製備PCV-2抗原及包含PCV- ' 2抗原之免疫原性組合物的新方法，其中PCV-2抗原展示降 低殺病毒活性及/或提高免疫原性（各自如本文中所定義）， 其中該方法包含以下步驟：i)獲得含有PCV_2抗原之第一 液體’ Π)自a亥PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。此 外’本發明亦提供PCV-2抗原以及包含該pcv-2抗原之免 150573.doc •73· 201120212 疫原性組合物，該PCV-2抗原展示降低殺病毒活性及/或提 高免疫原性（各自如本文中所定義）。根據另一態樣，pcv_ 2抗原以及包含展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性之 純化PCV-2抗原之免疫原性組合物可另外藉由下列方法（π) 獲得。本發明之純化PCV-2抗原（較佳純化Pcv_2 〇11172抗 原）可藉由純化PCV-2病毒製劑’尤其藉由純化全病毒獲 得。全病毒製劑描述於例如WO 99/18214或WO 03/049703 中。此外’純化PCV-2抗原亦可藉由純化重組表現之pc γ_ 2抗原’較佳藉由純化重組PCV-2 ORF2抗原獲得。製備重 組PCV-2抗原（較佳製備重組PCV-2 ORF2抗原）之表現系統 在此項技術中熟知且包括（但不限於）細菌表現系統、酵母 表現糸統、昆蟲細胞或哺乳動物表現系統。表現PC2抗 原之載體及製造及/或使用該等載體（或重組載體）之方法在 本申請案中別處描述。 較佳細胞為彼等易受含有PCV-2 ORF2 DNA且表現PCV-2 ORF2蛋白的適當重組病毒載體感染之細胞。細胞較佳為 昆蟲細胞’且其更佳包括以商標SF+昆蟲細胞（Pr〇tein

Sciences Corporation，Meriden，CT)出售之昆蟲細胞。較佳 細胞培養物具有介於約0.3 — 2.〇xl〇6個細胞/毫升，更佳約 0.35-1.9X 106個細胞/毫升，更佳約〇 4_18χ1〇6個細胞/毫 升’甚至更佳約0.45-1.7X106個細胞/毫升，且最佳約0.5_ 1 ·5 X 106個細胞/毫升之間的細胞計數。

較佳之病毒載體包括桿狀病毒，諸如Bacul〇G〇ld(BD

Biosciences Pharmingen，San Diego, CA)，尤其只要該等生 150573.doc •74* 201120212 產細胞為昆蟲細胞。雖然桿狀病毒表現系統較佳，但熟習 此項技術者應瞭解其他表現系統（包括上述彼等）將用於本 發明之目的’亦即用於表現PCV-2 ORF2抗原。 適當生長培養基亦將由熟習此項技術者確定，較佳之生 長培養基為不含血清之昆蟲細胞培養基，諸如Excell 420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa, KS)及其類似物。 含有PCV-2 ORF2 DNA序列之重組病毒載體當用於感染 易感細胞時具有介於約0.034.5，更佳約0 05」3，更佳約 0.09-1.1，且最佳約mo之間的較佳感染倍率（MC)I)。上 述MOI較佳係指丨毫升細胞培養流體。本文所述之方法較 佳包含以含有PCV_2 ORF2 DNA且表現PCV_2 〇RF2抗原蛋 白之重組病毒載體感染〇·35-1.9χ106個細胞/毫升，更佳約 0.4-1.8X106個細胞/毫升，甚至更佳約〇 45」7χ1〇6個細胞/ 毫升且最佳約0.5-1.5xl06個細胞/毫升，該重組病毒載體之 ΜΟΙ(感染倍率）介於約0.034.5，更佳約〇 〇51 3，更佳約 0.09-1.1 ’且最佳約〇1-1〇之間。 接著培育受感染細胞至多10天時間，更佳約2天至約1〇 天，更佳約4天至約9天，且最佳約5天至約8天。較佳培育 條件包括約22-32 (：，更佳約24-30。(：，更佳約25-29。(：，甚 至更佳約26-28°C，且最佳約27°C之溫度。較佳地，在接 種之後觀察到SF +細胞之特徵性桿狀病毒誘導之變化。該 觀察可包括監測感染後期間細胞密度趨勢及生存率降低。 發現在感染之後3-5天觀察到病毒力價峰值且在感染後5至 8天及/或當細胞生存率降低至小於丨〇%時細胞中pcv_2 150573.doc -75· 201120212 ORF2抗原產生達到峰值。 可藉由熟習此項技術者已知之標準方法，例如藉由 Protein purification methods-a practical approach(E.L.V. Harris 及 S. Angal，編者，IRL Press at Oxford University press) 中所述之彼等方法由收集物純化PCV-2 ORF2抗原。彼等 方法包括（但不限於）藉由離心及/或過遽進行分離、沈搬、 大小排阻（凝膠過濾）層析、親和性層析、金屬螯合物層 析、離子交換層析、共價層析、疏水性相互作用層析等。 PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之回收方法較佳以經 由分離步驟將細胞碎片與已表現之PCV-2 ORF2抗原分離 開始。較佳分離步驟包括過濾、在至多約20,000xg之速度 下離心、連續流動離心、使用離子交換或凝膠過濾進行層 析分離及習知免疫親和方法。熟習此項技術者由例如 (E.L.V. Harris及S. Angel (編者），Protein purification methods-a practical approach, IRL Press Oxford 1995)已知彼等方法。最 佳分離方法包括在至多約20,000xg之速度下離心及過濾。 較佳過濾方法包括死端型微過濾及切向流動（或交又流動） 過濾，包括中空纖維過濾死端型微過濾。在此等過濾方法 中，死端型微過濾較佳。死端型微過濾之較佳孔徑介於約 0.30-1.35 μιη之間，更佳介於約0.35-1.25 μιη之間，更佳介 於約0.40-1 ·1 μιη之間，且最佳介於約0.45-1 ·0 μιη之間。咸 信任何習知濾膜將用於本發明之目的且聚醚砜膜較佳。在 過濾步驟期間移除任何低分子量核酸物質。 PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之進一步純化可藉由 150573.doc • 76· 201120212 層析程序（較佳兩步層析程序）實現。然而，若裝載材料不 包含細胞碎片，則亦可以層析程序起始。 若PCV-2抗原裝配至病毒樣粒子（VLP)中，則第一步驟 較佳為大小排阻（凝膠過濾）層析，其可例如藉由使用 Sephacryl S300基質進行。在實驗室規模下，最佳使用 HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟習 此項技術者已知之任何其他大小排阻層析基質，其能夠自 培養濾液或上清液中分離出PCV-2 ORF2 VLP。合適之基 質描述於例如E丄·V. Harris及S. Angel (編者），Protein purification methods-a practical approach, IRL Press Oxford 1995)中。可例如藉由以1.0 mL/min之流動速率用包含PCV-2抗原之粗製劑裝載管柱且以1.5個管柱體積的包含20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT之緩衝液溶離管柱來進行凝膠過 濾層析。然而，亦可藉由使用親和性層析’例如’經由選 擇性結合至已固定PCV-2 ORF2特異性抗體或熟習此項技 術者已知之任何其他方法純化PCV-2 0RF2抗原。 因此，根據一較佳實施例，包含純化PCV-2抗原（較佳純 化PCV-2 0RF2抗原）及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含 以下步驟之方法獲得： a) 在宿主細胞中表現PCV-2抗原’較佳PCV-2 0RF2抗 原； b) 收集獲得PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之細胞培 養物； c) 藉由大小排阻層析（凝膠過滤）純化包含pC V-2抗原（較 150573.doc •77- 201120212 佳PCV-2 0RF2抗原）之收集物； d)將純化PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）與佐劑混 合0 根據一較佳實施例，如本文所述，較佳如實例3中所述 執行大小排阻層析《較佳地’大小排阻產生具有以在與佐 劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過 80% (w/w)，較佳超過90% (w/w)純度等級之免疫原性組合 物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統（lnvitrogen)，經由

NuPAGE 10%.Bis-Tris 凝膠（Invitrogen)進行 SDS PAGE 之 後’藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等 級。 為了獲得更高純度等級，可進行不同於第一步驟之第二 層析步驟。舉例而言，若第一純化步驟/層析步驟為大小 排阻（凝膠過濾）’則第二步驟應不同於其，為例如親和性 層析、離子交換層析等。 較佳地’若純化PCV-2抗原（較佳純化PCV-2 ORF2抗原） 之第一步驟為大小排阻（凝膠過濾）層析，則第二步驟可為 離子交換層析’較佳陰離子交換層析（AIEX)。用於純化 PCV-2抗原（較佳PCV_2 ORF2抗原）之較佳陰離子交換層析 基質為Q瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中，最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。可例如如實例3中所述進行 陰離子交換層析。簡言之，可將來自大小排阻層析步驟之 約50 ml空隙體積溶離份彙集物以3.〇 ml/min之流動速率裝

載於AIEX管柱上。在使用例如20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM 150573.doc -78- 201120212 DTT移除未結合材料之洗滌步驟之後，可以8個管柱體積 之下列緩衝液（20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1_0 Μ NaCl)之單一步驟溶離蛋白質。可將來自ΑΙΕΧ跑柱之流過 物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提高 產率。此兩步技術（大小排阻繼之以陰離子交換層析）將 PCV-2 ORF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白組份有 效地分離。 因此，根據一較佳實施例，包含純化pC V-2抗原（較佳 PCV-2 ORF2抗原）及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以 下步驟之方法獲得： a) 在宿主細胞中表現PCV-2抗原’較佳PCV-2 ORF2抗 原； b) 收集獲得PCV-2抗原（較佳pcv-2 0RF2抗原）之細胞培 養物； c) 藉由大小排阻層析（凝膠過濾）’繼之以陰離子交換層 析純化包含PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之收集 物； d) 將純化PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）與佐劑混 合。 根據一較佳實施例，如本文所述’較佳如實例3中所述 執行大小排阻層析及陰離子交換層析。較佳地，兩步純化 策略產生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包 括的蛋白質總量計超過90% (w/w)，較佳超過95% (w/w)純 度等級之免疫原性組合物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝 150573.doc •79- 201120212 系統（Invitrogen)，經由 NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠（Invitrogen) 進行 SDS PAGE之後，藉由 Imperial Protein Stain(Pierce)染 色來評估純度等級。 如上所述，PCV-2抗原（較佳PCV ORF2抗原）之回收方法 以經由分離步驟將細胞碎片與已表現之PCV-2 0RF2抗原 分離開始。較佳分離步驟包括經由具有約0.6 至約2 之孔徑，較佳具有約0.8 mm至約1.2 μηι之孔徑的過濾器進 行微過濾、。 因此，包含純化PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）及佐 劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得： a) 在宿主細胞中表現PCV-2抗原’較佳PCV-2 ORF2抗 原， b) 收集獲得PCV-2抗原（較佳pcv-2 0RF2抗原）之細胞培 養物； c) 經由具有0.6至2.0 μιη之孔徑的過慮器過滤在步驟b) 獲得的收集物； d) 藉由大小排阻層析（凝膠過濾），視情況繼之以陰離子 交換層析純化包含PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原） 且在步驟c)獲得之濾液； e) 將純化PCV-2抗原（較佳PCV_2 0RF2抗原）與佐劑混 合。 根據一較佳實施例，如本文所述’較佳如實例3中所述 執行微過濾、大小排阻層析及陰離子交換層析。較佳地， 包括預過濾步驟的兩步純化策略產生具有以在與佐劑混合 150573.doc • 80- 201120212 之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過90% (w/w)，較佳超過95% (w/w)純度等級之免疫原性組合物。 可在使用NuPAGE MOPS缓衝系統（Invitrogen)，經由 NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠（Invitrogen)進行 SDS PAGE 之 後，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等 級。 包含純化PCV-2抗原（較佳本文所述之純化PCV-2 ORF2 抗原）之免疫原性組合物（較佳可藉由本文所述之方法獲得 者）之特徵在於與不包含該純化PCV-2抗原或純化PCV-2 ORF2抗原之免疫原性組合物相比提高的免疫原性。 若使用諸如重組痘病毒、腺病毒或桿狀病毒之病毒載體 製備PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原），則建議藉由適當 滅活處理來滅活病毒核酸。該滅活可在純化PCV-2抗原（較 佳PCV-2 ORF2抗原）期間的任何時間進行。因此，滅活可 在收集包含PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）之細胞培養 流體之後，或在微過濾PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原） 之後（若進行微過濾），在純化步驟之前或之後，例如在凝 膠過濾之前或之後，且在陰離子交換層析之前或之後（若 進行此操作）進行。 任何習知滅活方法可用於本發明之目的。因此，可藉由 化學及/或物理處理執行滅活。在較佳形式中，測定收集 流體之體積且使溫度介於約32°C -42°C，更佳約34t -40°C，且最佳約35°C -39°C之間。較佳滅活方法包括添加 較佳濃度為約1至約20 mM，較佳約2至約10 mM，更佳約2 150573.doc -81 - 201120212 至約8 mM，更佳約3至約7 mM，最佳約5 mM之環化二元 伸乙基亞胺（BEI)。舉例而言，滅活包括向流體中添加較 佳約0.4 Μ之2-溴乙烯胺氫溴酸鹽（BEA)(其已環化為〇.2 M 二元伸乙基亞胺（ΒΕΙ))於0.3 N NaOH中之溶液以得到約5 mM ΒΕΙ之最終濃度。較佳接著連續攪拌流體2_96小時且可將 滅活收集流體冷凍儲存於-40。(：或-40°C以下或約TC -7。(：之 間。在完成滅活之後’添加較佳1 .〇 Μ之硫代硫酸鈉溶液 以中和任何剩餘ΒΕΙ。較佳添加與在滅活之前添加的βΕ][相 比等量的硫代硫酸鈉》舉例而言，若添加ΒΕΙ至5 mM之最 終濃度’則添加1 ·0 Μ硫代硫酸鈉溶液以得到5 mM之最終 最小濃度，以中和任何剩餘BEI。 在將純化PCV-2抗原（較佳PCV-2 ORF2抗原）與佐劑混合 之前’亦建議使純化PCV-2抗原（較佳PCV_2 〇RF2抗原）相 對於磷酸鹽緩衝生理食鹽水（p Η 7.4 )或任何其他生理緩衝 液透析。 上述方法產生具有如本文中所定義之降低殺病毒活性以 及改良免疫原性之PCV-2抗原’只要該PCV_2抗原具有以 在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量 計超過50% (w/w),較佳超過7〇% (w/w)，甚至更佳超過 80% (w/w)，甚至更佳超過85% (w/w)，甚至更佳超過9〇〇/〇 (w/w)，最佳超過95% (w/w)之純度等級。然而，可根據方 法π獲得的純化PCV_2抗原亦可與佐劑（較佳與本文所述之 任何佐劑）混合且一起使用。較佳佐劑為卡波莫，其較佳 濃度為約〇.1至10 mg/mL，更佳濃度為〇.5至5 mg/mL，最 150573.doc •82· 201120212 佳為約1 mg/mL最終免疫原性組合物。 再者，本發明不僅提供本文所述之任何方法（包括替代 f·生方法II) ’其亦^^供可藉由本文所述之任何方法（包括替 代性方法II)獲得的PCV-2抗原，較佳純化PCV_2抗原，最 佳純化PCV-2 0RF-2蛋白。此外，本發明亦提供可藉由本 文所述之任何方法（包括替代性方法π)獲得的包含PC v_2抗 原（較佳純化PCV-2抗原，最佳純化PCV_2 〇RF_2蛋白）之 PCV-2抗原性組合物。在最終免疫原性組合物中的pcv_2 抗原（詳言之純化PCV_2 〇RF2抗原）之量以最終免疫原性組 合物計應在每劑量約0.25至約400 之範圍内。較佳地， 最終免疫原性組合物應包括含量在每劑量約2至約2〇〇 Pg，甚至更佳每劑量約3至約15〇畔，更佳每劑量約4至約 1〇〇 Mg，更佳每劑量約5至約80㈣，更佳每劑量約6至約60 ，甚至更佳每劑量約7至約50 ，甚至更佳每劑量約8 至約40 pg，更佳每劑量約8至約32叫，甚至更佳每劑量約 8至約24 pg且最佳每劑量約8至約16肫範圍内之pcv_2抗 原’較佳PCV-2 ORF2抗原。 本文所提供之免疫原性組合物（包括彼等可藉由方法11獲 得者）包含一或多種來自另一致病有機體的另外抗原。上 文疋義彼4另—致病有機體」。該另外抗原較佳為緒生 殖及呼吸症候群病毒。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原甚 至更佳包含活病毒，且更佳包含經修飾之活病毒。該經修 飾之豬生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCc寄存編 號VR 2332之經修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC⑧ 150573.doc -83- 201120212 PR^爾。在本申請案之另一態樣中，該另外抗原為豬 肺炎黴漿菌。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗，且該豬肺 炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC⑧MYC〇FLEX。最佳為豬生 殖及呼吸症候群病毒與豬肺炎黴漿菌兩種抗原的組合。 由於包括純化PCV-2抗原（較佳本文所提供之純化pcv_2 ORF2抗原）之免疫原性組合物的免疫原性提高，所以與不 接受該免疫原性組合物之動物相比，該免疫原性組合物可 用於降低或減輕由PCV_2感染所引起或與pcv_2感染相關 的臨床徵象之發生率或嚴重程度。 術語「臨床徵象之發生率降低或嚴重程度減輕」應意謂 接受疫苗投藥之動物與動物「對照組」相比，該等徵象中 之任一者的發生率降低或嚴重程度減輕，兩種動物均已受 產生免疫/舌性組份的病原體感染或攻毒且其中對照組並未 接受疫苗或免疫原性組合物之投藥。在此情況下，術語 「減輕」或「降低」意謂與不接種疫苗之對照組相比，已 接種疫苗組有至少10%，較佳25%，甚至更佳50%，最佳 超過100%的降低。 如本文中所用，「臨床症狀」或「臨床徵象」係指可由 活動物直接觀察到的病原體感染之徵象，諸如症狀。代表 性實例將視所選病原體而定，可包括諸如流涕、嗜睡、咳 漱、發燒、體重增加或減輕、脫水、腹瀉、腫脹、跛行及 其類似物^ PCV-2臨床徵象可包括消痩、皮膚蒼白、身體 憔悴、呼吸窘迫、腹瀉及黃疸。 動物由PCV-2感染引起或與PCV-2感染相關的臨床徵象 150573.doc -84· 201120212 之發生率降低或嚴重程度減輕可藉由向f㈣處理之動物 僅投與單劑量之該免疫原性組合物而實現，本文所 提供之免疫原性組合物亦可以兩個或兩個以上劑量投與， 首次劑量與任何後續劑量之投與間隔時間為2至4週。因 此’根據另-實施例’可向有需要之動物以一個、兩個或 兩個以上劑量投與本文所提供之包括純化pcv_2抗原（較佳 純化PCV-2 ORF2抗原）的免疫原性組合物。 洋吕之，在本申請案之另一態樣中，提供如上所述之包 含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物其中該免疫原 性組合物當向動物投與時使動物之淋巴流失及炎症與不接 乂該免&原性組合物之動物相比減輕至少8〇%。因此，在 本申清案之另一態樣中，提供如上所述之包含PCv_2抗原 性組合物的免疫原性组合物且該免疫原性組合物使已接受 。玄免疫原性組合物投藥之動物的淋巴流失及炎症與不接受 该免疫原性組合物之動物相比減輕至少8〇0/〇。 在本申請案之另一態樣中，提供如上所述之包含PC V-2 抗原性組合物的免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物 當向動物投與時使動物之肺病變與不接受該免疫原性組合 物之動物相比減輕至少8〇〇/0。因此，在本申請案之另一態 樣中’提供如上所述之包含pCV_2抗原性組合物的免疫原 性組合物且該免疫原性組合物使已接受該免疫原性組合物 投藥之動物的肺病變與不接受該免疫原性組合物之動物相 比減輕至少80%。 在本發明之另一態樣中，提供如上所述之包含PCV-2抗原 150573.doc -85- 201120212 性組合物之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之該免 疫原性組合物之後’該免疫原性組合物誘導針對PCv_2之保 漠性免疫反應。包含PCV-2抗原性組合物之免疫原性組合物 可為任何體積’包括1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml及5 ml 以上。在較佳形式中’ 2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量 之該PCV-2抗原。因此，在本發明之另一態樣中，提供如上 所述之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之該免疫原 性組合物之後，包含PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合 物誘導針對PCV-2之保護性免疫反應。在另一態樣中，2 ml 該免疫原性組合物包含一個劑量之該PCV_2抗原。 如本文中所用，「保護性免疫反應」係指相關病原體感 染之臨床、病理學或組織病理學徵象或症狀的發生率降低 或嚴重程度減輕，直至且包括完全預防該等徵象或症狀。 術語「病理學」徵象係指在顯微鏡或分子層面上經由生 物化學試驗，或屍檢時肉眼可觀察之感染徵象。對於PCV-2而言，病理學徵象將包括多個組織及器官上顯微鏡及肉 眼可見的病變，淋巴器官為最常見之病變部位。 術語「病理組織學」徵象係指由感染引起的組織變化之 徵象。 術語「臨床症狀」或「臨床徵象」由上文定義。 在本發明之另一態樣中，提供如上所述之包含pcv_2抗 原性組合物及PRRRS抗原（較佳本文所❿之任一 pRRS抗原） 的免疫原性組合物，其中在投與_個劑量之該錢原性組 合物之後，該免疫原性組合物誘導針對1>尺113病毒之保護 150573.doc •86· 201120212 性免疫反應。再者，可製備任何劑量體積，但在較佳形式 中，2mm免疫原㈣且合物包含一個劑量之該pRRs抗原及 一個劑量之PCV-2抗原。因此，在本發明之另一態樣中， 提供如上所述之包含PRRSV及如本文所述2PCV2抗原性 組合物的免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之該免疫 原丨生組合物之後，忒免疫原性組合物誘導針對pRRS之保 羞性免疫反應。在另一態樣中，2 ml該免疫原性組合物包 3個劑量之該PRRS抗原及一個劑量之該PCV-2抗原。 在本發明之另一態樣中，提供包含如本文所述之pcV_2 抗原性組合物及如上所述之豬肺炎黴漿菌抗原的免疫原性 組合物，其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後， 该免疫原性組合物誘導針對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫反 應。再者，可製備任何劑量體積，但在較佳形式中，2州 錢疫原性組合物包含一個劑量之該緒肺炎黴漿菌抗原及 個劑里之PCV-2抗原。因此，在本發明之另一態樣中， 提供如上所述之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之 包3如本文所述之PCV-2抗原性組合物及豬肺炎黴漿菌抗 原之汶免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對 緒肺炎黴毁菌之保護性免疫反應。在另一態樣中，2 d該 免疫原性組合物包含—個劑量之該豬肺炎黴襞菌抗肩。 在本申請案之另一態樣中，如上所述之免疫原性組合物 製備成每劑量投與2毫升。 申月案之另一癌樣中’提供一種使動物PC V-2感染 之一或多種臨床症狀與不接受該免疫原性組合物之動物相 I50573.doc -87- 201120212 比減輕的方法。一般而言，該方法包含向動物投與任—包 含如上所述之PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物的 步驟。較佳地’在投與單劑量之該免疫原性組合物之後 PCV-2感染之一或多種臨床症狀減輕。因此，根據本申請 案之另一態樣’提供一種使動物PCV_2感染之一或多種臨 床症狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物之 該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。一般而言，該 方法包含向動物投與任一包含上述PCV — 2抗原性組合物之 該免疫原性組合物的步驟’其中較佳在投與單劑量之包含 如本文所述之PCV-2抗原性組合物的該免疫原性組合物之 後PCV-2感染之一或多種臨床症狀減輕。 在本申請案之另一態樣中，提供一種使動物pRRS感染 之一或多種臨床症狀與不接受該免疫原性組合物之動物相 比減輕的方法。一般而言，該方法包含向動物投與任一上 述包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之 PRRS病毒的該免疫原性組合物的步驟。較佳地，在投與 單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文 所述之PRRS病毒的該免疫原性組合物之後prrS感染之一 或多種臨床症狀減輕。因此，根據本申請案之另一態樣， 提供一種使動物PRRS感染之一或多種臨床症狀與不接受 包3如本文所述之P C V - 2抗原性組合物及如本文所述之 PRRS病毒的該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。 諸生殖及呼吸症候群病毒（PRRSV)之臨床徵象包括（但不限 於）食慾不振 '發熱、流產、短暫變色、乏情期延長、咳 150573.doc -88- 201120212 漱、呼吸徵象、乳房炎、無乳、嗜睡、木乃伊化仔豬、死 產、新生仔豬虛弱、母豬產仔率減少、早產、腹瀉、消 痩、打噴嚏、眼分泌物、皮膚蒼白、死亡及其組合。 在本申請案之另一態樣中，提供一種使動物豬肺炎黴漿 菌感染之一或多種臨床症狀與不接受包含如本文所述之 PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎黴漿菌抗原的 該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。一般而言，該 方法包含向動物彳免與任一上述該免疫原性組合物的步驟。 較佳地，在投與單劑量之包含如本文所述之pcv_2抗原性 組合物及如本文所述之豬肺炎黴漿菌抗原之該免疫原性組 合物之後豬肺炎黴漿菌感染之一或多種臨床症狀減輕。因 此，根據本申請案之另一態樣，提供一種使動物豬肺炎黴 漿菌感染之一或多種臨床症狀與不接受包含如本文所述之 PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎黴漿菌抗原的 該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。豬、肺炎黴漿菌 (M. hyo)感染之臨床症狀包括（但不限於）乾咳、行為障礙 (impaired performance)及肺病變。 包含純化PCV-2抗原（較佳如本文所提供之pcv_2 〇RF2 抗原）之免疫原性組合物具有改良免疫原性。因此，本文 - 所提供之免疫原性組合物適用於改良接受該免疫原性組合 物之動物的免疫反應。因此，根據另一實施例，本發明提 供一種改良動物針對PCV-2之免疫反應的方法，其包含以 下步驟.向有需要之動物投與如本文所述具有純化PC v_2 抗原（較佳本文所提供之純化PCV-2 0RF-2蛋白）的免疫原 150573.doc -89- 201120212 性組合物。根據一較佳態樣’將用於該方法中之pcv-2抗 原（較佳PCV-2 ORF2抗原）純化至以免疫原性組合物中所包 括的蛋白質總量計超過60% (w/w)，較佳超過60% (w/w) ’ 甚至更佳超過70°/。（w/w) ’甚至更佳超過80% (w/w) ’甚至 更佳超過90% (w/w)，最佳超過95% (w/w)之程度。可在使 用 NuPAGE MOPS 緩衝系統（Invitrogen)，經由 NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠（Invitrogen)進行 SDS PAGE 之後’藉由 Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等級。可使 用熟習此項技術者所熟知之習知方法純化PC V-2，且較佳 PCV-2 ORF2。 【實施方式】 以下實例闡述根據本發明之較佳材料及程序。然而’應 瞭解僅僅經由說明提供此等實例且不應認為其中之實例限 制本發明之總範疇。 實例1 此實例描述製造具有降低殺病毒活性之濃縮pcv-2 0RF2抗原之實驗室規.模及試驗規模方法與不包括本發明 步驟之製造方法的比較。特定言之，將確定本發明對PCV-2 ORF2抗原對PRRS病毒之殺病毒活性之作用。 材料及方法 生產抗原： 實驗室規模： PCV SUB037 H1-F, 18.94 kg PCV 1025, 20.6 kg 150573.doc -90- 201120212 PCV 180/181, 20.0 kg PCV SUB 504PD, 40 kg 試驗規模： PCV SUB 506PD, 362 kg PCV SUB 507PD, 384 kg PCV SUB512PD, 430 kg PCV SUB 513PD, 405 kg 超滤滤筒：GE Healthcare, Steam-In-Place(SIP)，中空纖維膜渡筒 UFP-100-E-55-STM : 100,000 NMWC，1 mm直徑之小管；用於 X109中之UF-002中，實驗室規模。 UFP-300-E-55-STM : 300,000 NMWC，1 mm直徑之小管；用於 X109中之UF-002中，實驗室規模。 UFP-100-E-65-MSM : 100,000 NMWC，1 mm直徑之小管；用於 APU-1中之UF-B2614中，試驗規模。 UFP-300-E55-SMO : 300,000 NMWC，1 mm直徑之小管；用於 VP-1中之UF-2713中，試驗規模。 下列超濾設備係用於可行性評估及初始方法開發中： 表1.設備 方法步驟 程序 設備 鑑別 Hex-Stand濃縮器 XI09 中之UF-002， 實驗室規模 超濾 抗原濃縮 UF Skid APU-1 中之UF-B2614， 試驗規模 UF Skid VP-1 中之tjF-2713， 試驗規模 製造方法： 超濾（UF)組態：實驗室規模 150573.doc -91 - 201120212

以 GE Healthcare (Amersham) Flex Stand 30 L容量之UF skid #002進行的濃縮方法中使用含有在構築（building)P中 產生的經過濾、滅活、中和之PCV-2 ORF2材料之50公升 籐護罈。 初始濃縮製程使用「成批」透濾流程，藉以將約20 kg 抗原材料轉移至UF skid中且經由100,000 NMWC中空纖維 濾筒（UFP-100-E-55-STM)濃縮。100,000 NMWC濃縮製程 使用分別來自PD及Manufacturing之PCV-2 ORF2批次 SUB037PD 及 PCV1025 材料。 初始兩輪濃縮原始體積約4倍且在進料槽中具體量化 (Q.S.'d，quantity substantiated)回原始轉移體積。以此方 式處理濃縮材料.，每批號總共進行2次濃縮，第三次及最 後一次濃縮收集作為濃縮物且一部分具體量化為1倍原始 體積。在濃縮前、每次濃縮步驟及每次具體量化步驟時抽 取樣品《在每次濃縮步驟期間抽取透過樣品。 接下來的連續兩輪在不用生理食鹽水洗滌之情況下濃縮 PCV_2 ORF2抗原。在約4倍及接著最後一次濃縮時對濃縮 材料取樣。將約20 kg抗原材料轉移至UF skid儲料槽中且 經由 300,000 NMWC 中空纖維濾筒（UFP-300-E-55-STM)濃 縮。將第二個20 L體積添加至含有來自首個20 L之濃縮物 的儲料槽中。將其濃縮至最終體積。300,000 NMWC濃縮 製程使用分別由Manufacturing及PD生產的PC V-2 ORF2批 次PCV 180/181池及SUB504PD。在濃縮前及每次濃縮步驟 時抽取樣品。在每次濃縮步驟期間抽取透過樣品。 150573.doc -92- 201120212 超濾組態：試驗規模 試驗規模方法使用SUB批次506PD、512PD及513PD。濃 縮前之抗原體積在約350 L至430L範圍内。將SUB506PD及 SUB 513PD批次轉移至DSP(下游處理）2602且使用表面積為 4.2 m2之 100,000 NMWC過濾器（UFP-100-65-E-MSM)，在 APU-1中以UF-B2614進行濃縮。將SUB512PD轉移至DSP 2701且使用表面積為2.1 m2之300,000 NMWC過濾器（UFP-300-E-SMO)，以UF-2713進行濃縮。對於每個批次，收集 最終濃縮材料且在4°C下儲存以供分析。 結果及結論 超濾（UF)組態：實驗室規模 以 100,000 NMWC(100 kDa)對比 300,000 NMWC(300 kDa)過濾器進行之過濾在濃縮時間上相當且當考慮到全規 模方法時係可行的。1 〇〇 kDa過濾器之過濾時間在濃縮4倍 時（約18 L至26 L)在14分鐘至32分鐘之範圍内，生理食鹽 水洗滌步驟產生較短時間（表2)。300 kDa過濾器之過濾時 間（在濃縮3.2倍、7倍（對於PCV180/181)及21.5倍（對於 SUB504PD)時）為在25分鐘時得到3.2倍，在23分鐘時得到7 倍且在32分鐘時得到21.5倍，其中約40 L材料以兩個連續 20 L體積濃縮。由於需要時間使濃縮製程達到10.25 psi之 目標跨膜壓力（TMP)，因此預見到有一些時間變化。 製程通量值對於PCV180/181批次而言在27.43 lmh至 32.00 lmh之範圍内，由朝向濃縮製程終點之尖峰（spike)產 生32.00 lmh的值。SUB 504PD材料之通量值在首個20 L濃 150573.doc -93· 201120212 縮期間為28.57 lmh且在第二個20 L濃縮期間為35.71 lmh。 (表3及4) 表2.製程數據 批號 起始濃縮體積 濃縮倍數 濃縮時間 (min) PCV 037 QS-0 (lOOkDa) 18.94 4.17 24 PCV 037 QS-1 (lOOkDa) 18.76 4.75 16 PCV 037 QS-2 (lOOkDa) 19.05 4.70 14 PCV 1025 QS-0 (lOOkDa) 20.59 4.39 28 PCV 1025 QS-1 (lOOkDa) 20.24 4.65 29 PCV 1025 QS-2 (lOOkDa) 18.71 3.6 17 PCV 18(V181 濃縮-1 (300kDa) 20 3.50 25 ?0/180/181濃縮-2(300让〇3) 26.01 7.00 23 SUB 504PD濃縮-2 (300kDa) 24.72 21.50 32 表3.製程數據 PCV 180/181 : 300,000 NMWC過濾器 時間 TMP PERM流動速率 (ml/min) 通量 (lmh) 濃縮-1 9:55 9 N/A N/A 濃縮-2 10:23 12.5 N/A N/A 濃縮-2 10:30 12.5 960 27.43 濃縮-2 10:33 14.5 960 27.43 濃縮-2 10:36 10.5 1120 32.00 濃縮_2 10:39 11 810 23.14 表4.製程數據 SUB504PD: 300,000 NMWC過濾器 時間 TMP PERM流動速率 (ml/min) 通量 (lmh) 濃縮-1 15:29 9.5 1000 28.57 濃縮-2 16:00 10.25 1250 35.71 當濃縮材料具體量化回1倍體積時，發現過濾後無效能 變化，SUB 037復原材料及PCV 1025複原材料亦如此。濃 縮抗原含量值使得檢定之限值超過約64 pg之驗證限值， 150573.doc -94- 201120212 如在表5至8中之值所見，其中抗原含量與預期計算量相 比。來自使用81^ 03 7、卩(：乂180/181及811；8 504?0抗原執 行的濃縮之透過值展示過濾不造成顯著材料損失。所有透 過抗原含量均在檢定之不可偵測範圍内。未收集PCV 1025 抗原之透過抗原含量。 表5. SUB 037之PC V-2抗原含量變化（以pg計） 批號/體積 濃縮前 抗原含量 濃縮後 抗原含量 濃縮因子 計算 抗原含量 與計算抗 原含量相 比之變化 與計算RP 相比之 增加/損失 SUB 037 (18.94 kg)--4.7 倍一100 kDa-PDX 56 137.6 4.7 263.2 -125.6 損失 濃縮且以生理食 鹽水復原·· QS-1 56 61.6 1 56 5.6 增加 濃縮且以生理食 鹽水復原：QS-2 56 62.7 1 56 6.7 增加 濃縮且以生理食 鹽水復原：QS-3 56 55.8 1 56 -0.2 損失 SUB 037 透過物卜2、3 0 崎u ? . · 矜."吻.成C . . . ^ ίί· ' k * ·4 : 無損失 表 6. PCV 1025之PCV-2抗月 Ϊ含量變化（以μί ;計） 批號/體積 濃縮前 抗原含量 濃縮後 抗原含量 濃縮因； 計算 抗原含量 與計算抗 原含量相 比之變化 與計算RP 相比之 增加/損失 1025 (20.46 kg)— 4.5倍-100 kDa-PDX 70.88 288.64 4,5 318 96 -30.32 損失 濃縮且以生理 食鹽水復原-1 N/A(無樣品） N/A 1 N/A N/A 無樣品 濃縮且以生理 食鹽水復原-2 70.88 66.24 1 70 88 -4.64 損失 濃縮且以生理 食鹽水復原-3 70.88 76.00 ______1 70.88 5.12 增加 1025透過物 - N/A 1. κ 哆-¾1 < N/A .,，.^ ...... 150573.doc •95· 201120212 表7. PCV-2抗原含量之變化（以pg計） 批號/體積 濃缩前 抗原含量 濃缩後 抗原含量 濃缩因子 計算 抗原含量 與計算抗 原含量相 比之變化 與計算RP 相比之 增加/損失 180/181 (40.3 kg)-3.5 倍-300 kDa-PDX 43.36 90.8 3.5 151.76 -60.96 損失 180/181 7.2 倍 43.36 247.04 7.2 312.19 -65.15 損失 180/181透過物 — 0 •〆，， /； : > 無損失 Ν/Α 表8. PCV-2抗原含量之變化（以pg計） 批號/體積 濃縮前 抗原含量 濃縮後 抗原含量 濃縮因子 計算 抗原含量 與計算抗 原含量相 比之變化 與計算RP 相比之 增加/損失 SUB504 (40,43 kg) 4.3倍一300 kDa— PDX 22.24 68.16 4.3 95.63 -27.47 損失 SUB504 20倍 22.24 448.48 20 444.8 3.68 增加 SUB504透過物 — 0 < ： …> 無損失 以來自R&D之PCV 180/181及SUB 504PD材料進行SDS-PAGE凝膠跑膠。圖1中位於約27 kDa處之ORF2紋帶與條 帶10處的參考物之帶型一致。早先已確定此紋帶大小為 ORF2。來自SUB 504PD(300 kDa過濾濃縮）之透過材料顯 示缺失在27 kDa位置處之紋帶。在此孔徑過濾器處顯然無 ORF2蛋白損失。在還原條件下進行跑膠。 測試濃縮前抗原、濃縮抗原、復原抗原及過濾透過物針 對PRRS病毒疫苗之殺病毒活性。SUB 037濃縮前及濃縮 (100 kDa過濾器）材料（已用生理食鹽水復原回1倍）之品質 控制（QC)初始結果不符合要求。然而，當將濃縮材料調配 至疫苗中時，疫苗中至多80%内含物之濃度降低此殺病毒 活性至符合要求之水準，恰好在0.7 l〇g/ml PRRS病毒力價 損失之接受限值之下。來自SUB 037之透過材料展示接近 150573.doc •96· 201120212 不符合要求之殺病毒活性水準的界線。參見表9。 發現PCV 1025濃縮前材料對PRRS之殺病毒活性不符合 要求，PRRS力價損失為1.5 log/ml。三種用生理食鹽水復 原之濃縮（100 kDa過濾器）材料具有0.5 log/ml損失及0.6 log/ml損失，一種復原濃縮物因PRRS力價「無變化」而符 合要求。不測試此批次之透過樣品。參見表10。 PCV 180/181濃縮前疫苗材料在所製備的3種疫苗中有2 種對PRRS之殺病毒活性不符合要求。抗原内含物百分比 水準在37.0%至55.5%之範圍内。發現最高内含物％的濃縮 前疫苗符合要求。 發現自1倍（以生理食鹽水復原至1倍之濃縮物）材料製備 之疫苗對PRRS病毒之殺病毒活性符合要求。抗原内含物 百分比水準在44%至66%之範圍内。參見表11。 自濃縮前抗原所製備的具有79.5%疫苗内含物之SUB 504PD疫苗對PRRS病毒之殺病毒活性符合要求。自4.3倍 濃縮抗原製備的具有23.5-35%疫苗内含物之疫苗及自21.5 倍濃縮抗原製備的具有3.5-5.5%疫苗内含物之疫苗亦符合 要求。最後，發現所製備的具有72%内含物水準之過濾器 洗滌液抗原對PRRS病毒之殺病毒活性符合要求。 表9. SUB 037殺病毒活性 樣品ID 效能變化 log/ml 符合要求/ 不符合要求 SUB 037 濃縮前(18.94 kg)-- 4.7倍-100 kDa-PDX 抗原含量56(之前)/137.6(之後） 1.4 不符合要求 濃縮且以生理食鹽水復原-1 0.8 不符合要求 濃縮且以生理食鹽水復原-2 1.3 不符合要求 150573.doc -97- 201120212 濃縮且以生理食鹽水復原-3 1.3 不符合要求 SUB 037透過物-1 0.6 符合要求 SUB 037透過物-2 1.0 不符合要求 SUB 037透過物-3 0.5 符合要求 疫苗：20%内含物Ames** -0.2 符合要求 疫苗：40%内含物Ames** -0.2 符合要求 疫苗：60%内含物Ames** 0.2 符合要求 疫苗：80%内含物Ames** 0.1 符合要求 表10. PCV 1025殺病毒活性 樣品ID 效能變化 log/ml 符合要求/ 不符合要求 PCV1025 濃縮前(20.46 kg)--4.5倍-100 kDa-PDX 抗原含量70.8(之前)/288.64 (之後） 1.5 不符合要求 濃縮且以生理食鹽水復原-1 0.6 符合要求 濃縮且以生理食鹽水復原-2 無變化 符合要求 濃縮且以生理食鹽水復原-3 0.5 符合要求 1025透過物 未提交 n/a 表11. PCV 180/181殺病毒活性 樣品π> 疫苗内含物 % 效能變化 log/ml 符合要求/ 不符合要求 PCV180/181 (49.3 kg)--3.5倍-300kDa--PDX 抗原含量=43.36 pg(之前)/抗原含量(1) 90.88 pg/抗原含量(2) 247.04 pg n/a n/a n/a 濃縮前疫苗 抗原含量=]6 pg/8.8 pg(實際值） 37.0 1.2 log/ml 損失 不符合要求 濃縮前疫苗 抗原含量=19_2 pg/8.8 pg(實際值） 44.5 1.2 log/ml 損失 不符合要求 濃縮前疫苗 抗原含量=24 pg/l5.36 pg(實際值） 55.5 0.8 log/ml 增加 符合要求 7倍復原至1倍之疫苗 抗原含量=16 pg/8.48 pg(實際值） 44.0 0.6 log/ml 增加 符合要求 7倍復原至1倍之疫苗 抗原含量=19_24 μ§/12·32 pg(實際值） 53.0 無變化 符合要求 7倍復原至1倍之疫苗 抗原含量=24 μ§/14.08 pg(實際值） 66.0 0.3 log/ml 增加 符合要求 -98- 150573.doc 201120212 表12. SUB 504PD殺病毒活性 樣品ED 疫苗内含物 % 效能變化 log/ml 符合要求/ 不符合要求 SUB504PD (~40 kg) 4_3倍--300 kDa—PDX 抗原含量=22.24 pg(之前)/抗原含量(1)= 68.16 pg 抗原含量(2) = 448.48 pg n/a n/a n/a 濃縮前疫苗 抗原含量=16 pg/10.24 pg(實際值） 79.5 0.3 log/ml 損失 符合要求 4.3倍疫苗 抗原含量=16 pg/18.56 pg(實際值） 23.5 0.1 log/ml 增加 符合要求 4.3倍疫苗 抗原含量=19.2 μ§/3.04 pg(實際值） 28.0 0.7 log/ml 增加 符合要求 4.3倍疫苗 抗原含量=24 μ§/5·28 pg(實際值） 35.0 0.1 log/ml 增加 符合要求 21.5倍疫苗 抗原含量=16 pg/10_08 (實際值） 3.5 0.1 log/ml 損失 符合要求 21.5倍疫苗 抗原含量=19.2 μβ/15·2 pg(實際值） 4.5 0.1 log/ml 增加 符合要求 21.5倍疫苗 抗原含量=24 μ§/3·36 pg(實際值） 5.5 0.3 log/ml 增加 符合要求 過濾器洗滌液 抗原含量=16 μ§/12·96 pg(實際值） 72.0 0.7 增加 符合要求 表13.製程數據 SUB 506 : 100,000 NMWC過濾器 時間 TMP(psi) PERM流動速率 (ml/min) 通量 (lmh) 13:25 12 800 11.43 13:59 11.5 3300 47.14 15:09 12.5 3800 54.29 15:29 12 2100 30.00 表14.製程數據 SUB 513 : 100,000 NMWC過濾器 時間 TMP(psi) PERM流動速率 通量 (ml/min) (lmh) 6:49 11.5 2600 37.14 8:06 11.5 2700 38.57 -99- 150573.doc 201120212 表15.製程數據 SUB 512 ·· 300,000 NMWC過濾器 時間 TMP(psi) PERM流動速率 (ml/min) 通量 (Imh) 15:25 16 5000 142.86 18:00 13 800 22.86 20:03 17.5 3500 100.00 21:05 17.5 3000 85.71 21:47 18 2500 71.43 21:59 12.5 4000 114.29 討論 2型緒環狀病毒疫苗滅活桿狀病毒載體為由Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.(St. Joseph, Missouri)製造的全 球性產品且用於INGELVAC CIRCOFLEX產品中。在收集 時，將病毒流體以無菌方式經由一或多個2-15 μπι預過濾 器過濾隨後經由0.8-1.0 μηι過濾器進行最終過濾。將 ΒΕΙ(二元伸乙基亞胺）儲備溶液添加至收集流體中至5 mM ΒΕΙ之最終濃度。連續攪拌流體最少72小時且最多96小時 且可在S40°C或在4°C 士3°C下冷凍儲存。添加1.0 Μ硫代硫 酸鈉溶液至5 mM之最終濃度以中和任何剩餘ΒΕΙ。 將中和抗原與0.5%卡波莫溶液摻和至20% v/v，藉由添 加生理食鹽水調整最終產物中之PCV-2 ORF2蛋白含量以 滿足大於或等於1.0之相對效能的最小釋放需要。在混合 在一起之後，可將系列液在4°C下儲存或填充。 在中和後，藉由中空纖維濾筒超濾濃縮PCV-2 ORF2材 料。以兩個透濾體積之生理食鹽水溶液進一步處理濃縮材 料。測定出較佳超濾標稱分子量截斷（NMWC)孔徑包括 100,000 NMWC 及 300,000 NMWC ,其中各者具有 1.0 mm 管 150573.doc -100- 201120212 腔直徑。兩種孔徑均包括在内以便在製造商中斷供應過渡 器渡筒時提供製造靈活性。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酿胺 凝膠電泳（SDS PAGE)凝膠及效能數據指示兩個過據器孔 經之間的抗原蛋白或效能無差異。 實例2 此實例比較使用本發明方法與使用先前技術中已知方法 的ORF2相對產率。應瞭解此實例表示用於獲得為本發明 方法及組合物使用的PCV-2 ORF2之許多可能方法中的一 種。 材料及方法 將四個1000 mL旋轉燒瓶各自以大約1.0 Χίο6個Sf+細胞/ 宅升接種於300 mL無金清昆蟲培養基Excell 420(JRH Biosciences，Inc·，Lenexa, KS)中。將母細胞培養物標識為 SF +(草地黏蟲（办⑽α母細胞儲備物 (Master Cell Stock)，第 19代，批號N1 12-095W。由 protein Sciences Corporation，Inc.，Meriden，CT獲得用於產生 SF + 母細胞儲備物之細胞。將此實例之SF +細胞株限制在第19 代與第59代之間。其他繼代可用於本發明之目的，然而為 了將方法規模擴大至大規模生產，至少丨9代將為必需的且 超過59之繼代可能對表現有影響，但此未作研究。更詳言 之’在值定攪動下，使來自液氮貯槽之初始SF +細胞培養 物懸浮生長於無菌旋轉燒瓶中的Excell 420培養基中。使 培養物生長於含有25 mL至150 mL Excell 42〇無血清培養基 之100 mL至250 mL旋轉燒瓶中。當細胞繁殖至1 〇_8.〇χ 1 〇6 150573.doc -101 - 201120212 個細胞/毫升之細胞密度時，將其以0.5-1.5M06細胞/毫升 之種植密度分至新容器中。使後續擴增培養物於高達36公 升容量之旋轉燒瓶中或高達300公升容量之不鏽鋼生物反 應器中在25°C -29°C下生長2-7天。 接種後’將燒瓶在27°C下培養四小時。隨後，用含有 PCV-2 ORF-2基因（SEQ ID NO: 4)之重組桿狀病毒接種各 燒瓶。如下產生含有PCV-2 ORF2基因之重組桿狀病毒： 將來自PCV-2北美菌株的PCV-2 ORF2基因PCR擴增以含有 5，Kozak序列（SEQ ID NO: 1)及 3，EcoRl 位點（SEQ ID NO: 2)，選殖至pGEM-T-Easy 載體（Promega，Madison，WI)中。隨 後，將其切除且次選殖至轉移載體pVL1392(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)中。次選殖部分在 本文中以SEQ ID NO: 7表示。含有PCV-2 ORF2基因之 pVL13 92質體稱為N47-064Y且隨後將其與BacUloGold®(BD Biosciences Pharmingen)桿狀病毒DN A—起共轉染至Sf+昆 蟲細胞（Protein Sciences，Meriden，CT)中以產生含有 PCV-2 ORF2基因之重組桿狀病毒。新構築體在本文中以SEQ ID NO: 8提供。將含有PCV-2 ORF2基因之重組桿狀病毒空斑 純化且將母種病毒（MSV)在SF+細胞株上增殖，製成等分 試樣且在-7〇°C下儲存。藉由PCR-RFLP使用桿狀病毒特異 性引子將MSV正性鑑別為PCV-2 ORF2桿狀病毒。如在間 接螢光抗體檢定中由多株血清或單株抗體所偵測，感染有 PCV-2 ORF2桿狀病毒以產生MSV或工作病毒種株之昆蟲 細胞表現PCV-2 ORF2抗原。另外’藉由N-末端胺基酸定 150573.doc •102· 201120212 序確證PCV_2 ORF2桿狀病毒之身分。亦根據9 C.F.R. 113.27 (〇)，113.28及113.55測試卩(：¥-2 0灯2桿狀病毒]^乂之纯度。 接種至旋轉燒瓶中之每一重組桿狀病毒具有不同感染倍率 (MOI)°燒瓶1用7.52 mL之·088 MOI種株接種；燒瓶2用 3.01 mL之0.36 MOI種株接種；燒瓶3用1.5 mL之0.18 MOI 種株接種；且燒觀4用0.75 mL之0.09 MOI種株接種。 用桿狀病毒接種後’隨後將燒瓶在27°C ±2°C下培養7天 且在彼時間期間，亦以100 rpm攪動。該等燒瓶使用通風 蓋以允許空氣流動。在接下來之7天，每24小時自每一燒 瓶取樣。取出後，將每一樣品離心且將離心塊及上清液兩 者分離且隨後經由0.4 5 μ m -1 · 0 μ m孔徑之.薄膜微過遽。 結果及結論 隨後’經由ELISA檢定’定量所得樣品中存在之〇rF2之 量。以在0.05 Μ碳酸鹽緩衝液（pH 9.6)中1:6000稀釋之蛋白 G純化（在PBS中1:250稀釋）之捕捉抗體豬抗PCV_2 pab igG 進行ELIS A檢定。接著將loo a抗體置於微量滴定盤之孔 中’密封且在37°C下培育隔夜。接著以包含0 5 mL Tween 20(Sigma, St. Louis, MO) ' 1〇〇 mL l〇X D-PBS(Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA)及899.5 mL蒸餾水之洗滌溶液洗 條該盤三次。隨後’將250 μί阻斷溶液（於l〇 mL D-PBS中 之5 g Carnation 脫脂奶粉（Nestle，Glendale，CA),用蒸餾水 補足至100 mL)添加至每一孔中。下一步為洗條測試盤且 隨後添加預先稀釋之抗原。藉由將2〇〇 μΕ稀釋劑溶液（於 999.5 mL D-PBS中之0.5 mL Tween 20)添加至稀釋盤上之 150573.doc -】03· 201120212 每一孔中產生㈣稀釋之抗原。隨後，將樣品以1:24〇之 比率及1:480之比率稀釋’隨後將1〇〇吣此等稀釋樣品之 每一者添加至稀釋盤上之一個頂部孔中（亦即，一個頂部 孔容納100 #之1:24〇稀釋物且另一者容納_ 彻 稀釋物）。隨後’藉由自每—連續孔移出⑽^且將其轉 移至盤上之下-個孔中來對盤t剩餘者進行連續稀釋。將 每一孔混合，㈣進行下-次_。誠盤之絲包括用 洗滌緩衝液洗滌該盤三次。隨後，將該盤密封且在37χ：下 培養一小時，然後用洗滌緩衝液再洗滌三次。所使用之偵 測抗體為PCV _2之單株抗體。將偵測抗體以稀釋劑溶 液1:300稀釋，隨後將1〇〇吣經稀釋偵測抗體添加至孔 然後用洗 中。隨後，將該盤密封且在37t下培養一小時 務緩衝液洗滌三次。隨後，藉由將正常兔血清（Jacks〇n ImmUn〇research，West Grove，PA)添加至稀釋劑溶液中至 1 /〇濃度來製備結合稀釋劑。將結合抗體山羊抗小鼠（H+1)_ HRP(JackS〇n Immunoresearch)在結合稀釋劑中 1:1〇 〇〇〇稀 釋。接著將100 μί經稀釋結合抗體添加至每—孔中。隨 後，將該盤密封且在37。(：下培養45分鐘，然後用洗滌緩衝 液洗務二次。將與等體積過氧化物酶受質B(KPL)混合之 100 pL焚質（TMB過氧化物酶受質，Kirkgaard及Perry

Laboratories(KPL)，Gaithersberg，MD)添加至每一孔中。 將該盤在室溫下培養15分鐘。隨後，將丨〇〇 μΐ之1 N HCL 溶液添加至所有孔中以終止反應。隨後，使該盤通過 ELISA讀取器。 150573.doc •104· 201120212 結果及結論 此檢定之結果提供於下表丨7中 表17 天數 燒瓿 上清液中之〇RF2(pg) 3 1 4 / S A 12 3 2 ------ 3 3 - ^ f，外0 ---—-— 22 5 s άά 14 3 4 ------- 12 4 1 4Α (ϊ\ - 44 4 2 ^7?---- bb h| 62 4 3 70·% 32 4 4 64 Q7 24 5 1 Λ Λ ------ il.74 100 5 2 34.93 142 5 3 47.84 90 5 4 ---««-__J 86 6 1 1 . -r—---- 14.7 158 6 2 18.13 182 6 3 34.78 ~ 140 6 4 36.88 146 7 1 6.54 176 7 2 12.09 」 190 7 3 15.84 158 7 4 15.19 152 此 '專結果表明當培育時間延長時，表現至離心細胞及培 養基之上清液中的ORF2多於表現至離心細胞及培養基之 離心塊中的ORF2。因此，使〇RF2表現進行至少5天且在上 清液中回收而非使表現進行少於5天且自細胞回收〇RF2提 供ORF2產率之極大提高及優於先前方法之顯著改良。 實例3 藉由微過濾方法繼之以兩步層析流程實現〇rF2之純 化。經由孔徑為1 · 2 μηι之微過渡膜過渡實例1中獲得的收 集物。接著藉由大小排阻（凝膠過濾）使用HiPrep 26/60

Sephacryl S3 00HR管柱純化微過渡物。將20 ml包含PCV-2 150573.doc -105- 201120212 〇RF2之濾液的起始樣品以丨〇 mL/min之流動速率裝載至

HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱上且以15個管柱體積 之緩衝液A(20 mM TriS(pH 6.5)，5 mM DTT)溶離。在溶離 步驟期間收集8毫升溶離份.彙集來自大小排阻層析之第 1 〇-16號溶離份（微量滴定盤（milititer)丨0至丨6溶離液）且將 其用作陰離子交換（AIEX)層析之起始樣品。此等溶離份表 示大小分級管柱（sizing c〇lumn)冬空隙體積，其中 0RF2因PCV-2 ORF2蛋白之較大分子量而溶離出。此項技 術將0RF2與抗原樣品之大部分其他蛋白组份有效地分 離。 使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱執行八圧\。將來 自大小排阻實驗之約48 ml空隙體積溶離份彙集物以3 〇 mL/min之流動速率裝載於ΑΙΕχ HiTrap Q瓊脂糖凝膠Hp管 柱上。在以裝載緩衝液A(2〇 mM Tris(pH 6.5)，5 mM DTT) 進行洗滌步驟移除未結合材料之後，以8個管柱體積之緩 衝液B(20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.0 M NaCl)之單 步驟/谷離蛋白質且收集5 ml溶離份。收集且彙集第8號 及第9號溶離份峰。將來自ΑΙΕχ跑柱之流過物裝載回卩瓊 脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離。將來自第二輪的第 7號、第8號及第9號溶離份與來自第一輪之溶離份彙集在 一起》第三輪流過材料並未在溶離液中產生顯著溶離份 峰’因此此輪未留下溶離份。 在4。(：下使約25 ml之溶離份彙集物相對於2公升之磷酸 鹽緩衝生理食鹽水（pH 7.4，Gibeo)透析隔夜，在透析之 150573.doc -106- 201120212 後，基於SDS-PAGE分析，ORF2之純度>95%。 實例4 製備2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA)、氫氧化鈉（NaOH)及硫代 硫酸鈉（Na2S2〇3)之溶液。藉由稱取U3 g BEA(Sigma, B657〇5，批號05316EE)且溶解於20 ml純水（dH20，蒸餾 水，此處：「水」）中製得BEA溶液。此溶液之最終濃度 為 0.4 Μ BEA。藉由稱取 0.33 g NaOH(JTBaker，3 722_01， 批號E01470)且溶解於20 ml水中製得NaOH溶液。此溶液 之最終濃度為0.41 M NaOH。藉由稱取25 g Na2S203(Sigma S7026 ’批號1.06K0 178)且溶解於100 ml水中製備硫代硫酸 鈉（Na：^2。3)溶液。一旦溶解之後’使溶液經由〇 2 μιη瓶頂 過濾器過濾以殺菌。此溶液之最終濃度為i .〇 M Na2S203。 為了製備二元伸乙基亞胺（ΒΕΙ)，將20 ml 0.4 M BEA溶 液與20 ml 0.41 M NaOH混合且測定初始pH值為約12.5- 14 · 0。在3 7 C下培育混合物1小時且再次核查pH值。培育 之後的pH值為約7.0-7.5 ,且此表明BEA成功地環化反應為 BEI。BEI之最終濃度經計算為約〇 2 μ(於40 ml體積中， 20 ml 0.4 M BEA經過量驗（〇·41 M)環化）。 如下進行滅活反應（每100 ml待滅活材料）：將待滅活材 料與2.5 ml新鮮製備之BEI混合。在37t下且在攪拌（以持 續混合溶液）下培育滅活反應物72小時。72小時之後，藉 由添加〇_5 ml丨.0 “硫代硫酸鈉中和反應物。在使硫代硫 酸鹽充分混合至溶液中（混合約15分鐘）之後在代下儲存 經滅活及中和之材料，之後與佐劑調配。 150573.doc •107· 201120212 實例5 製備測試樣品： 為了評估高度純化之ORF2抗原（純度等級高於9〇%)與未 純化或較低程度純化之ORF2抗原相比之免疫原性：製備 若干批5 ml測試樣品： 表1 :測試樣品 測試樣品編號 描述 #1 咼度純化<ORF2抗原’以Βϋΐ滅活且與〗mp/m丨卡浊莖湛合 #2 高度純化之0RF2抗原，與昆蟲細胞碎片混合，以BE〖滅活且與 1 mg/ml卡波莫混合 ’ #3 昆蟲細胞碎片（模擬對照） #4 未過滤且未純化之PCV-2 0RF2抗原，與lmg/ml卡波莫混合 #5 未過濾且未純化之PCV-2 0RF2抗原，以BEI滅活且與lmg/ml 卡波莫混合 #6 未純化之PCV-2 0RF2抗原，以BEI滅活且與lmg/ml卡波莫混合 如下製備測試樣品1 :如實例1中所述製備PCV-2 ORF2 抗原且如實例3中所述進行高度純化。如實例4中所述以 BEI滅活高度純化之PCV-2 ORF 2抗原。在BEI滅活之後， 將PCV-2 ORF2抗原含量調整為每毫升測試樣品約32至32.5 pg之量且每毫升測試樣品與1 mg卡波莫971 P(BF Goodrich, Ohio, USA)混合。 如下製備測試樣品2 :如實例1中所述製備PCV-2 ORF2 抗原且如實例3中所述進行高度純化。如實例4中所述以 BEI滅活高度純化之PCV-2 ORF 2抗原。在BEI滅活之後， 將PCV-2 ORF2抗原與昆蟲細胞碎片及卡波莫混合。最終 測試樣品包括每毫升測試樣品約2·〇6χ 1〇6個昆蟲細胞、約 32至 32.5 pg及 1 mg卡波莫 971Ρ。 150573.doc -108· 201120212 藉由將每毫升測試樣品約2 06xl06個昆蟲細胞與i mg卡 波莫97 IP混合來製備測試樣品3。在混合之前’如實例3中 所述藉由BEI滅活昆蟲細胞。 如下製備測試樣品4 :如實例1中所述製備PCV-2 ORF2 k原。將上清液中的pcv_2 〇][1172抗原含量調整為每毫升 測„式樣πσ約3 2至3 2 _ 5 pg之量且每毫升測試樣品與1 mg卡波 莫9 7 1P混合β 如下製備測試樣品5 :如實例1中所述製備PCV-2 ORF2 抗原。接著如實例3中所述將上清液用於ΒΕΙ滅活。在βει 滅活之後’將PCV-2 ORF2抗原與昆蟲細胞碎片及卡波莫 混合。最終測試樣品包括每毫升測試樣品約2 〇6χ 1〇6個昆 蟲細胞、約32至3 2.5 pg及1 mg卡波莫971Ρ。 如下製備測試樣品6 :如實例1中所述製備PCV-2 ORF2 抗原。接著使實例1之上清液經由1.2 μιη實驗室規模之過 遽器過濾。此過濾器尺寸先前經測定足以過濾完整及破碎 的昆蟲細胞，同時允許PCV-2 ORF2抗原穿過過濾器。此 後，如實例3中所述以ΒΕΙ滅活濾液。在ΒΕΙ滅活之後，將 PCV-2 ORF2抗原含量調整為每毫升測試樣品約32至32.5 Kg之量且與1 mg卡波莫971Ρ混合。 測試每一測試樣品之免疫原性 臨床期： 由傑克遜實驗室（Jackson Laboratories，美國）獲得150隻 雌性Balb/C小鼠且對其進行馴養7天。每籠任意選擇一隻 小鼠在第0天採集血液，總共有26個樣品。總共1〇隻小鼠 15D573.doc •109- 201120212 各自藉由皮下途徑以Ο.1·0.2 mL達爾伯克磷酸鹽緩衝液 (Dulbecco,s Phosphate Buffer)接種。 總共二十隻小鼠各自藉由皮下途徑以0.1-0.2 mL每—測 忒樣α。（測试樣品丨至6)接種。每一籠含有5隻小鼠且在每一 蘢中之所有小鼠均在同一處理組中。在第21天，對所有小 鼠進行最後一次採血。使每一血樣凝結且藉由離心收集血 /月。將所有樣品保存於單獨的試管中且在_8〇。〇 ±1 〇七下儲 存直至測試。藉由焚化處置小鼠。 樣品測試 藉由使用自建（in-house)PCV-2特異性ELISA量測每—測 試樣品之PCV-2特異性抗體反應來評估每一測試樣品之免 疫原性。每一測試樣品之免疫原性值在表2中以相對免疫 原性（RI)值形式給出。此相對免疫原性值為每標準化量之 用於免疫之ORF2抗原在受免疫動物中獲得的0RF2特異性 抗體力價之量度。 除使用自建ELISA之外，PCV-2特異性抗體之量亦可藉 由使用由Nawagitgul，P.，等人於 circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies ίο PCK Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:33-40 (2002)中所述 之ELISA檢定來量測’該文獻之教示及内容以引用的方式 併入本文中。該檢定中所量測之值亦可用以計算相對免疫 原性值（參見下文）。 對於第21天，總共26個樣品，將每一小鼠之血清的等分 150573.doc -110· 201120212 試樣同籠彙集在一起。將所有第〇天之血清樣品的等分試 樣彙集至一個樣品中。將參考物稀釋兩倍，以1:2開始且 一式三份添加至每一相應孔中。一式三份添加陽性及陰性 對照。將每一樣品連續稀釋兩倍且添加至盤中，以1:200 開始，一式三份。使用每月校正之SoftMax™平板讀取器 讀取在450 nm下之最終吸光度且用電子儀器捕獲所有原始 OD值且用Statlia(Brendan Scientific)分析以計算相對免疫 原性（RI)值。 結果： 免疫之後產生抗體之量的RI計算值展示純化PCV-2 ORF2調配物引起針對高度純化PCV-2 ORF2抗原之最高血 清（抗體）反應。純化PCV-2 ORF2與昆蟲細胞碎片一起調配 導致與單獨的高度純化PCV-2 ORF2相比ORF2之相對免疫 原性（亦即免疫原性）降低。單獨昆蟲細胞根本不產生針對 PCV-2 ORF2抗原之抗體反應。亦不含有高度純化PCV-2 ORF2抗原之測試樣品4至ό亦展示與單獨的高度純化PCV-2 ORF2相比相對免疫原性降低。 【圖式簡單說明】 圖1為展示在本發明之過濾製程之後存在ORF2之SDS-PAGE凝膠照片。 150573.doc -111 - 201120212 序列表 <11〇>美商百靈佳殷格翰家畜藥品公司 <120>降低PCV-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之PCV_2組合物 <130> P10-0121 <140> 099129539 <141> 2010-09-01 <150> 61/239,192; 61/309,408 <151> 2009-09-02 ; 2010-03-01 <160〉 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> DNA 人造 <220> <223>此為經修飾之Kozak序列。 <400> 1 ccgccatg 8 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213>人造 <220> <223>此為重組EcoRl序列。 <400> 2 gaattc 6 <210> 3

<211> 713 <212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 3 cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180 aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcitgact ccacuuga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat 713 <210> 4 <211> 713 <212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 4 ccgccatgac gtalccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180 ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240 itgltccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713 150573·序列表doc 201120212 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213>豬環狀病毒 <400> 5

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15

Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95

Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 110

Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr He Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr He Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213>豬環狀病毒 <400> 6

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15

Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 150573-序列表.doc 201120212 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95

Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro He Thr 100 105 1)0

Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn Π5 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Va) Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> DNA <213>人造 <223>此序列係來自2型豬環狀病毒之開放閱讀框架2，連通來自pGEMT-easy載體之一部分。 <400> 7 gcggccgcgg gaattegate cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60 caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggeatettea acacccgcct ctcccgcacc 180 tteggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg 240 agatttaata ttgaegaett tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc 300 tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattet ggccctgctc ccccatcacc 360 cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattetag atgataaett tgtaacaaag 420 gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa 480 cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgal 540 tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat 600 gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat 660 atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa 720 ccctaagaat tctatcacta gtgaattege ggeege 756 <210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213>人造 <220> <223>此為2型豬環狀病毒之ORF-2構築體， 其包括桿狀病毒及pGEM T-easy編碎序歹】 <400> 8 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60 gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120 ataaaagatt etaatetgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180 gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240 ggagcaataa tcgalttaac caacacgtct aaatattatg aiggtgtgca ututgegg 300 gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360 gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420 150573-序列表.doc 201120212 ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa actcttgtti tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa icaggaccgc tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa aattaacata gttatcatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgc tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa atgtggacca cgiaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa 150573-序列表.doc -4- 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140. 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 201120212 ggtacccggg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagtic tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc atcgatcgtg tcaictggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggtu cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc gtugtgtu tguttgtaa taaaggttcg acgtcgitca aaatattatg cgcttttgta tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgatittaa ttcagacaac acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca gacatcgatg gtgglggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa aaacgtcgtt ggcaagcttt-aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt ttaacgctga cgaaalaaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt acggattgtg caaacacgaa aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgm ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaalc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cclttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacclag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgaiacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 150573-序列表.doc 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 201120212 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt atigtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccaltc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgcc 103S7 <2I0> 9 <211> 20 <212> PRT <213>豬環狀病毒 <400> 9

Ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His Pro Pro Ser 15 10 15

His Leu Gly Gin 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213>豬環狀病毒 <400> 10

Pro Arg His His Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr 15 10 15

Thr Leu Ser <210> 11 <211> 233 <2]2> PR丁 <213>人造 <220> <223>此為2型豬環狀病毒之開放閱讀框架2的胺基酸序列。 <400> 11

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15

Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr 5〇 55 60

Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys He Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 6- 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 150573-序列表.doc 201120212 85 90 95

Arg lie Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 110

Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 . 135 140

Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn \80 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser lie Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 150573-序列表.doc

Claims (1)

1. 201120212 七、申請專利範園： !· 一種製備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步 驟： i) 獲得含有PCV-2抗原之第一液體；及 ii) 自戎PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。 2. 如请求項1之方法，其中藉由第二液體交換該第一液體 之§亥部分而自該PCV-2抗原移除該第—液體之該部分， 其中該第二液體不同於該第一液體。 3. 如請求項2之方法’其中以該第二液體交換該第一液體 之該部分包含以下步驟： a) 包含將該第二液體添加至含有該PCV_2抗原之該第一 液體中的液體添加；及 b) 藉由移除一部分該第一及第二液體濃縮該pcV 2抗 原。 4. 如清求項1至3中任一項之方法，其中使用過濾器，藉由 過渡步驟自該PCV-2抗原移除該第一液體之該部分。 5. 如請求項3之方法，其中實質上同時執行該濃縮步驟及 該液體添加步驟。 6. 如凊求項3之方法，其中至少兩次執行該濃縮步驟及該 液體添加步驟。 7. 如請求項4之方法，其中該過濾器包括半透膜。 8·如請求項7之方法，其中該半透膜具有小於該PCV-2抗原 之平均孔徑’藉此防止至少90%該PCV-2抗原通過該半 透膜孔且將該PCV-2抗原截留在該過濾器内。 150573.doc 201120212 9.如請求項4之方法’其中該過濾器具有防止至少9〇%大小 為50 kDa至500 kDa之蛋白質通過的平均孔徑。 1 〇·如請求項3之方法’其令該濃縮步驟使該抗原與該第一 液體之體積相比濃縮3倍至50倍。 11. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該1>(：¥_2抗原性組 合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該液體相比降低至 少 10%。 12. 如請求項1至3中任一項之方法，其中當活病毒或活細菌 與β玄PC V-2抗原性組合物混合2小時或2小時以上時，由 步驟i)至ii)製備的PCv_2抗原性組合物造成小於1 i〇g TCID5〇/ml該活病毒或小於Γ log CFU/ml該活細菌之損 失。 13 _如請求項1至3中任一項之方法，其中當活病毒或活細菌 與该PCV-2抗原性組合物混合2小時或2小時以上時，由 步驟i)至ii)製備的PCV-2抗原性組合物造成小於〇.7 l〇g TCID5〇/m丨該活病毒或小於0.7 log CFU/ml該活細菌之損 失。 14.如請求項！至3中任一項之方法，其中該方法進一步包含 收集在步驟Π)之後剩餘PCV-2抗原之步驟。 1 5 ·如請求項14之方法’其中該方法進一步包含藉由層析程 序純化包含該PCV-2抗原之步驟丨丨）收集物的步驟。 16. 如請求項15之方法，其中該pcv-2抗原經純化至以蛋白 質總量計超過50% (w/w)之該pcv-2抗原之純度等級。 17. 如請求項1至3中任一項之方法，進一步包含將步驟丨丨）後 150573.doc 201120212 剩餘的PCV-2抗原與選自由 人今止 田U下組成之群的另一組份混 合之步驟：醫藥學上可 又之載劑、佐劑、稀釋劑、賦 形劑及其組合。 18. 如請求項17之方法，其中 Y该另—組份為佐劑。 19. 如請求項i 8之方法，其中 °亥佐劑為卡波姆（Carbomer)。 20. 如請求項i至3中任—項 α <•万法，其中該PCV_2抗原包含 PCV-2之 ORF-2蛋白。 21. 如請求項1至3中任一項之古、、土 J«疋方法’其中該PCV-2抗原包含 ORF-2蛋白之病毒樣粒子。 22·如請求項a中任一項之方法其中該方法進一步包含 將該PCV-2抗原性組合物與至少一種其他抗原組合之步 驟。 23. 如請求項22之方法，其中該至少一種其他抗原包括豬生 殖及呼吸症候群病毒抗原及/或豬肺炎黴漿菌 (Mycoplasma hyopneumoniae)^ ^ 。 24. —種PCV-2抗原性組合物，其可藉由如請求項}至23中任 一項之方法獲得。 25. —種PCV-2抗原性組合物，其中當活病毒或活細菌與該 PCV-2抗原性組合物混合至少2小時，該PCV-2抗原性組 合物造成小於1 log TCID5G/ml該活病毒或小於1 log CFU/ml該活細菌之損失。 26. 如請求項25之PCV-2抗原性組合物，其中當活病毒或活 細菌與該PCV-2抗原性組合物混合至少2小時，該PCV-2 抗原性組合物造成小於0.7 log TCID5G/ml該活病毒或小 150573.doc 201120212 於0.7 log CFU/ml該活細菌之損失。 27. 如請求項25或26之PCV-2抗原性組合物，其中該活病毒 為豬生殖及呼吸症候群（PRRS)病毒。 28. —種免疫原性組合物，其包含可由如請求項1至23中任 一項之方法獲得的PCV-2抗原性組合物。 29. —種免疫原性組合物，其包含如請求項24至26中任一項 之PCV-2抗原性組合物。 30·如請求項29之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物 進一步包含豬之至少一種其他致病有機體的減毒活病毒 或減毒活細菌。 3 1.如請求項30之免疫原性組合物，其中該減毒活病毒為豬 生殖及呼吸症候群（PRRS)病毒。 3 2.如請求項2 9至3 1中任一項之免疫原性組合物，其中該免 疫原性組合物進一步包含豬肺炎黴漿菌菌苗（bacterin)。 33.如請求項29至3 1中任一項之免疫原性組合物，其中該免 疫原性組合物進一步包含佐劑。 34·如請求項33之免疫原性組合物，其中該佐劑為卡波姆。 35. —種免疫原性組合物，其包含純化pcV-2抗原及佐劑。 36. 如請求項35之免疫原性組合物，其中該pcv-2抗原之純 度等級以該免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計高 於 50% (w/w)。 37·如請求項3 5或36之免疫原性組合物，其中該pc抗原 為動物細胞或細菌中表現的重組豬環狀病毒〇RF2蛋白。 3 8.如請求項35或36之免疫原性組合物，其中該豬環狀病毒 150573.doc 201120212 ORF2蛋白可由包含以下步驟之方法獲得： a.在宿主細胞中表現該PCV-2抗原； b_收集獲得該PCV-2抗原之細胞培養物； c. 藉由凝膠過濾純化包含該PCV-2抗原之收集物； d. .將該純化之PCV-2抗原與佐劑混合。 39.如請求項28至31、35及36之免疫原性組合物，其中在投 與一劑該免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導 針對PCV-2之保護性免疫反應。 40·請求項28至31、35及36之免疫原性組合物，其中投與該 免疫原性組合物之動物之淋巴流失（lymphoid depletion；) 及發炎與未接受該免疫原性組合物之動物相比減輕至少 80%。 4 1 ·如請求項3 1、3 5及3 6之免疫原性組合物，其中在投與一 劑該免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對 PRRS病毒之保護性免疫反應。 42. 如請求項32、35及36之免疫原性組合物，其中在投與— 劑該免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對 豬肺炎黴漿菌之保護性免疫反應。 43. 如請求項28至31、35及36之免疫原性組合物，其中2 ml 該免疫原性組合物包含1個劑量之該PCV-2抗原。 44. 一種如請求項28至38中任一項之免疫原性組合物之用 途’其係用於製造用於使動物PCV-2感染之一或多種臨 床症狀與未接受該免疫原性組合物之動物相比減輕的藥 劑0 150573.doc 201120212 45. 如請求項28至31、35及36中任—項之免疫原性組合物， 其係用於使動物PCV-2感染之一或多種臨床症狀與未接 受該免疫原性組合物之動物相比減輕。 46. —種改良免疫原性組合物對豬環狀病毒之免疫原性的方 法，其包含以下步驟： a.在宿主細胞中表現PCV-2抗原； b·收集該PCV-2抗原； c. 純化該PCV-2抗原至以該免疫原性組合物中所包括的 蛋白質總量計高於50°/° (w/w)之純度等級； d. 將該純化PCV-2抗原與佐劑混合。 150573.doc