TW201030341A - Method for identifying allergenic proteins and peptides - Google Patents

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Description

201030341 六、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於鑑定過敏原性蛋白質和肽之方法。更具體 地說，本發明關於鑑別過敏原性蛋白質和肽之方法。更具 體地說，本發明提供鑑別過敏原性乳蛋白質及/或肽之方 法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現 庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA ;表現至少 〇 —種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋 白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合 之能力；使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一 種蛋白質或狀與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸； 及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與步驟d)之至 少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至 少一種蛋白質或肽係過敏原性。 在此說明書中，一些文件包括專利申請案及廠商手冊 Φ 被引述。該些文件之揭示雖然被認爲與本發明之專利性無 關，但以參照方式被整體納入此處。更具體地說，所有參 照之文件以參照方式被納入如同各個別文件所具體及個別 明示而以參照方式納入之相同範圍。該些文件無一被公認 爲本發明之習知技藝。 【先前技術】 食物過敏（food hypersensitivity)在3歲以下嬰兒之發 生率大約是2至8%，在成年人約2%。在兒童的過敏反應 201030341 中，大約80%係爲對牛乳（CM)、雞蛋及豆類（例如花生及 黃豆）過敏之結果。然而在成年族群中，對水果、花生及 木本堅果（tree nuts)之過敏代表盛行率最高之過敏症。 牛乳係最早被導入嬰兒飲食的食物之一 ’因此是造成 幼兒食物過敏最常見的一個原因。大約2·5%的新生兒在 出生的第一年內對牛乳顯示不良反應。 牛乳過敏（CMA)之徵候可分成立即型或延遲型’從輕 微到嚴重的皮膚、呼吸道、胃腸道反應不等’最嚴重的是 危及生命之全身性反應（過敏性反應（anaphylaxis))。與細 胞媒介性延遲型反應不同的是，立即型反應係由原本無害 之抗原所引起的免疫球蛋白E (IgE)抗體產生所造成（第一 型過敏反應）。IgE抗體與過敏原性分子之交互作用導致特 異性活化效應細胞（肥胖細胞、嗜鹼顆粒細胞）及隨後釋放 可引起立即型過敏反應之發炎介質如組織胺、前列腺素及 白三烯。 牛乳包含超過25種蛋白質，有些已知爲具過敏原 性。藉由凝乳酶之作用或藉由將乳酸化至pH 4.6，可獲得 兩個組分：包含20%之蛋白質的乳清組分及包含80%之蛋 白質的酪蛋白組分。過敏原性分子係於兩個組分中得到， 且依照在CMA族群中有紀錄之過敏反應的發生率被認爲 是主要或次要過敏原。 存在牛乳中之主要過敏原係α乳白蛋白（alpha-1汪以&11)1111^11)、/3乳球蛋白（匕613-1&(^〇§1〇13111111)、〇：81酪 蛋白（alphaSl-casein)、沒酪蛋白（beta-casein)及 /c 酪蛋白 201030341 (kappa-casein)。存在牛乳中之次要過敏原係aS2酪蛋白 (alphaS2-casein)、乳鐵蛋白（lactoferrin)、牛血清白蛋白 及免疫球蛋白。 α乳白蛋白（Bos d 4)、冷乳球蛋白（Bos d 5)、免疫球 蛋白（Bos d 7)、BSA及乳鐵蛋白係乳清中廣爲週知之IgE 活性成分。aSl酪蛋白、aS2酪蛋白、万酪蛋白及/c酪 蛋白係酪蛋白組分（Bos d 8)中之強效過敏原（Wal, 2004)。 φ 在乳清組分中，/3乳球蛋白（BLG)及α乳白蛋白（ALA) 被認爲是主要過敏原。yS乳球蛋白是一種球狀且非常安定 之蛋白質，其屬於與疏水性配位體結合之疏水性分子結合 蛋白（lip ocal ins)的蛋白質超家族。其它過敏原如主要犬過 敏原Can f 1及Can f 2與其他有毛動物（馬、貓及天竺鼠） 之過敏原亦屬於此蛋白質超家族。天然之；8乳球蛋白以二 聚體形式存在，分子量爲36千道爾頓。；S乳球蛋白有兩 種主要的同型體，基因變異體A (BLGA)及B (BLGB)，它 φ 們的胺基酸64及1 1 8不同（BLG A中爲天冬胺酸及纈胺 酸，BLGB中爲甘胺酸及丙胺酸）。由安定性及Θ乳球蛋白 屬於疏水性分子結合蛋白家族之事實，可能解釋此分子之 高度過敏原性潛力。 α乳白蛋白係由四個雙硫鍵所穩定之14千道爾頓酸 性鈣離子結合單體。其爲合成乳糖之半乳糖基轉移酶系統 中之調節成分。序列分析顯示，其與人α乳白蛋白（hALA) 及源自雞蛋之溶菌酶（雞蛋之主要過敏原）具有高度胺基酸 序列同源性。α乳白蛋白之過敏原性可由彼之安定性解 201030341 釋。 在懸浮液中，酪蛋白組分之蛋白質與固定比例之個體 分子形成有序聚集體（微胞（micelles))，例如各37%之a S1 酪蛋白及aS2酪蛋白，各13 %之/3酪蛋白及/C酪蛋白。 這四種酪蛋白分子之一級結構同源性低、功能特性不同， 但全部都是可被若干蛋白酶輕易分解之具有流變性、高度 水合性三級結構之磷酸化蛋白質。對蛋白水解消化之敏感 性係重要過敏原相當不尋常之特徵。牛乳酪蛋白與其他哺 _ 乳動物如山羊及綿羊之酪蛋白具有最高90%之胺基酸序列 同源性。此序列同源性可能是牛乳與源自其他動物的乳之 間經常被觀察到跨種反應性的原因。 本發明提出提供方法的需要，該些方法允許鑑定存在 於生物性來源中之過敏原性蛋白質和肽。本發明藉此亦提 出提供方法的需要，該些方法允許鑑定存在於生物性來源 特別是牛乳及包含牛乳之營養調製劑中之非過敏原性蛋白 質和肽。另外，本發明提供用於診斷及治療個體之過敏的 @ 裝置及方法。 【發明內容】 發明摘要 本發明之態樣關於一種鑑別過敏原性乳蛋白質及肽之 方法’該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表 現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA ;表現至 少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種 -8 - 201030341 蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清 合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋 與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及’當 胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或 釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或 原性。因此，本發明之另一態樣提供鑑別至少一 性乳蛋白質或肽之方法，該方法包含下列步驟： φ 一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳I DNA或cDNA;表現至少一種由該表現庫所編碼 或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感 至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結 該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或 接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞 一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑 一種蛋白質或肽係過敏原性。換句話說，本發 • [0012]段所描述之方法，其中該過敏原性蛋白質 過敏原性蛋白質和肽，該至少一個表現庫包含源 的乳腺組織之DNA或cDNA，且對該過敏原性來 個體係對牛乳敏感的個體。 根據本發明之其他態樣，如上所述之本發明 另包含測定該至少一種蛋白質或肽之胺基酸序列 該至少一種蛋白質或肽係由該方法識別。 本發明亦提供一種鑑別由DNA或cDNA表 碼之過敏原性蛋白質及/或肽之方法，該方法包 型IgE結 白質或肽 該嗜鹼細 肽接觸以 肽係過敏 種過敏原 提供至少 康組織之 之蛋白質 的個體之 合能力之 肥胖細胞 與該至少 別該至少 明關於如 和肽係乳 自泌乳牛 源敏感的 之方法可 之步驟， 現庫所編 含下列步 -9 - 201030341 驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個過 敏原來源之DNA或cDNA ;表現至少一種由該表現庫所編 碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對該至少 一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之 能力，該至少一個過敏原來源特別是牛乳及包含牛乳之營 養調製劑；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽 與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細 胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以 @ 釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏 原性。因此，本發明提供鑑別由DNA或cDNA表現庫所 編碼之至少一種過敏原性蛋白質或肽之方法，該方法包含 下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少 一個過敏原來源之DNA或cDNA ;表現至少一種由該表現 庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對 該至少一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE 結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或 肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼 細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸 以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過 敏原性。 本發明之另一態樣關於一種測定包含樣本之牛乳中的 過敏原性蛋白質和肽之方法，該方法包含測定圖1 A、1 B 及 1C (SEQ ID NO:22-84)及表 ΙΑ、1B 及表 2 (SEQ ID ΝΟ:1-21)中之至少一種蛋白質或肽存在之步驟。 -10- 201030341 根據本發明之此態樣，該牛乳可爲水解牛乳。另外， 該至少一種蛋白質及肽之存在可由質譜分析測定。較佳的 是’存在於樣本中之蛋白質及肽在質譜分析之前係經分 離。蛋白質及肽可藉由電泳法或藉由高效液相層析法分 離。較佳的是，該電泳法可爲二維電泳法。 本發明之另一態樣關於一種由本發明之方法所鑑定之 蛋白質或肽。本發明之其他態樣關於一種選自圖1A、 . IB、1C (SEQ ID NO:22-84)、表 ΙΑ、1B 或表 2 (SEQ ID ΝΟ:1-21)中之蛋白質或肽。 本發明之其他態樣關於本發明之至少一種蛋白質或 肽’其係用於診斷個體之過敏或過敏傾向。較佳的是，該 過敏係乳過敏。 本發明之不同態樣關於一種診斷個體之過敏或過敏傾 向之方法，該方法包含對疑似過敏或變成過敏之個體投予 如此處所述之至少一種蛋白質或肽，及檢測該個體是否出 φ 現對抗該蛋白質或肽之過敏反應。 根據本發明之此態樣，較佳的是該過敏或過敏傾向係 乳過敏或乳過敏傾向。此態樣之方法較佳的是額外包含皮 膚測試及/或血液測試。該皮膚測試較佳係選自：（i)皮膚 針剌測試、（i i)皮內測試、（i i i)皮膚貼布測試、或（丨v) (i) 至（i i i)之測試之任何組合，其中測試⑴至（i v)之陽性結果 表示個體爲過敏或具過敏傾向。該血液測試較佳地包含下 列步驟：（i)使本發明之至少一種蛋白質或肽與源自該個體 之血液樣本、血清樣本或血漿樣本接觸，及（ii)測定該至 -11 - 201030341 少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、血清樣本或血漿樣 本中之IgE抗體結合，其中該至少一種蛋白質或肽與1SE 抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾向：及/或（丨’）使本 發明之至少一種蛋白質或肽與該個體之嗜鹼細胞 '嗜酸細 胞或肥胖細胞接觸，及（Π’）測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或 肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一 種介質，或與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒， 其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質 或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過 敏或具過敏傾向。 本發明之另一態樣關於本發明之至少一種蛋白質或 肽，其係用於個體過敏之過敏原免疫治療。較佳的是，該 過敏係乳過敏。 在其他態樣中，本發明關於一種用於個體過敏之過敏 原免疫治療之方法，該方法包含投予本發明之至少一種蛋 白質或肽。較佳的是，該過敏係乳過敏。 在另一態樣中，本發明關於一種測定個體之過敏或過 敏傾向之方法，該方法包含：a)使本發明之至少一種蛋白 質或肽與血液樣本、血清樣本或血漿樣本接觸，其中該血 液樣本、血清樣本或血漿樣本係自該個體分離，及b)測 定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、血清樣本或 血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至少一種蛋白質或肽 與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾向；及/或 a’）使本發明之至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細 201030341 胞或肥胖細胞接觸，其中該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細 胞係自該個體分離，及b’）測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或 肥胖細胞（i)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至 少一種介質，或（Π)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是 否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至 少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示 該個體係過敏或具過敏傾向。 φ 根據本發明之此態樣，較佳的是該過敏或過敏傾向係 乳過敏或乳過敏傾向。較佳的是，此態樣之方法另包含區 別嚴重過敏之個體與敏感但無症狀之個體，及/或區別長 大後不再過敏之個體與長大後仍過敏之個體。 在其他態樣中，本發明關於一種鑑別IgE反應性非過 敏原性乳蛋白或肽之方法，該乳蛋白或肽係由至少一個表 現庫之DNA或cDNA所編碼，該方法包含下列步驟：a) 提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組 φ 織之DNA或cDNA ; b)表現至少一種由該表現庫所編碼之 蛋白質或肽；c)測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感 的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；d)使步驟c)所 測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼 細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及e)測定該嗜鹼細胞、 嗜酸細胞或肥胖細胞（i)當與該至少一種蛋白質或狀接觸時 是否釋放至少一種介質，或（ii)當與該至少一種蛋白質或 肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸 時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時 -13- 201030341 去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。 根據本發明之此態樣，該至少一種由該方法所鑑別或 此處具體揭示之蛋白質或肽係用於治療過敏。本發明亦提 供一種治療個體之過敏之方法，該方法包含投予至少一種 由該方法所鑑別或此處具體揭示之蛋白質或肽。 在本發明之所有可施行實施態樣中，該個體或病患較 佳係人。該嗜酸細胞、肥胖細胞或嗜鹼細胞原則上係哺乳 動物來源且可能是人來源。 本發明之詳細說明 本發明之目的係提供一種鑑定過敏原性乳蛋白質及/ 或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現 庫’該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之 DNA或 cDNA ;表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽； 測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一 種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少 一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸； 及’當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋 白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋 白質或肽係過敏原性。本發明亦提供一種包含下列步驟之 方法：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個 過敏原來源之DNA或cDNA ;表現至少一種由該表現庫所 編碼之蛋白質或肽；測定該至少—種蛋白質或狀與對該至 少一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合 201030341 之能力；使展現IgE結合能力之該至少一 嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；. 胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋 釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋 原性。 本發明之方法特別適用於鑑定展現過 白質和狀。要鑑定蛋白質和狀之過敏原性 φ 微克或奈克範圍內之量。這些蛋白質和 cDNA庫編碼，該DNA或cDNA庫係得自 質及/或肽的來源，而該蛋白質及/或肽引 性反應。該過敏原來源可能包含不同種類 之生合成的組織及細胞。如果這些細胞和 則可自該細胞和組織特異性產生DNA骂 DNA或cDNA庫可被用於本發明之方法。 哺乳動物特別是源自牛之乳過敏原可藉由 φ 的乳腺組織分離DNA或cDNA而被鑑定。 該DNA或cDNA表現庫之表現蛋白 至少一個過敏原來源敏感之至少一個個體 型IgE接觸。在此第一步中，識別該些蛋 能與IgE結合，此爲過敏反應之一項先決 中，「IgE反應性」之用語係指胺基酸序; 能力。在下一步中，與IgE結合之肽及蛋 鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，該些 載源自已知對該過敏原來源之至少一種過 種蛋白質或肽與 及，當該嗜鹼細 白質或肽接觸以 白質或肽係過敏 敏原性特性之蛋 特性，只需要在 肽係由 DNA或 已知可合成蛋白 起個體之過敏原 之負責該過敏原 組織係爲已知， ξ cDNA庫，該 舉例來說，源自 自泌乳哺乳動物 質及肽係與對該 的至少一種血清 白質及肽之哪些 條件。在本發明 列與IgE結合之 白質進一步與嗜 細胞先前已經搭 敏原過敏的至少 -15- 201030341 一個個體之IgE。當攜帶過敏原特異性lgE分子之嗜鹼細 胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與個別之過敏原接觸時釋放介質 諸如組織胺及/或其他由嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞 所釋放之過敏性介質，這表示該能與IgE結合之肽及蛋白 質在與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸後亦可誘發該 些細胞之去顆粒。適當之過敏原性介質較佳爲組織胺、肝 素、前列腺素、白三烯 '化學介質（chemokines)、細胞介 質（cytokines)。其他可被用於本發明中之過敏原性介質包 括Θ己糖胺酶、嗜酸細胞過氧化酶、核糖核酸酶 (RNase)、去氧核糖核酸酶、脂酶、胞漿素原及主要鹼性 蛋白。該領域之技藝人士對於該些細胞所釋放之介質相當 熟悉，其可由普通教科書知識鑑別（參見例如Janeway et a 1. 2 0 02: Immunology, Spektrum Akademischer Verlag;
Auflage: 5. Auflage; Paul et al. 1 9 8 9: Fundamental
Immunology, Raven Press Ltd.; Second edition)。 該些與過敏個體之IgE結合且能誘發嗜鹼細胞去顆粒 之DNA或cDNA庫之成員可被分離，且它們的DNA或 cDNA插入物可利用該領域已知之方法定序。可選擇的 是，由個別庫成員所表現之蛋白質及肽可利用該領域已知 之方法分離，且舉例來說利用質譜法或胺基酸定序分析。 該DNA或cDNA庫之成員可源自任何攜帶生物性物 質之來源，該生物性物質當與個體接觸時已知或未知會引 發過敏原性反應。因此，此處所使用之用語「過敏原來 源」係指能合成過敏原之任何種類的生物性物質。 201030341 用語「肽」或「蛋白質」意圖指由肽鍵所連接之胺基 酸序列。此處所使用之「肽」係指實質上包含最多250個 胺基酸之含胺基酸分子，諸如最多200個胺基酸，諸如最 多150個胺基酸，諸如最多1〇〇個胺基酸，諸如最多50 個胺基酸，諸如最多45個胺基酸，特別是諸如最多40個 胺基酸，諸如最多30個胺基酸，諸如最多20個胺基酸， 及較佳超過2個胺基酸殘基。此處所使用之「蛋白質」係 φ 指實質上包含超過250個胺基酸之含胺基酸分子。在上方 之範圍中，本發明可使用蛋白質及肽之用語以表示相同類 型之分子。 過敏原（能引起個體之過敏原性反應的物質）係由多種 生物體合成，包括植物及動物。根據本發明之較佳實施態 樣，該至少一個過敏原來源係動物，更具體地說爲哺乳動 物。已知動物係過敏原之來源。這些過敏原通常存在於動 物（例如貓及狗）毛屑或皮屑中，以及動物之唾液及尿液 φ 中。舉例來說，哺乳動物亦分泌過敏原至乳中。因此，哺 乳動物如牛、馬及水牛可能包含高量之過敏原。用於鑑定 該過敏原之cDNA及DNA可能自泌乳哺乳動物分離，因 此該DNA或cDNA較佳係得自乳腺組織。 過敏原之另一來源係螨如家塵塵蟎、魚、蛋等。這些 動物已知產生造成個體過敏反應之物質。 其他過敏原來源係植物。特別是雜草及豆類已知產生 過敏原。當然樹木如灌木亦爲過敏原之來源。 該DNA (諸如基因組DNA及其他種類之DNA除了 -17- 201030341 cDNA以外）或cdNA可得自該過敏原來源諸如牛乳或以該 領域已知之方法包含牛乳之營養調製劑。這些核酸分子較 佳係得自已知或疑似產生過敏原之細胞及組織。然而，爲 了減少要被篩選以鑑別過敏原之株的量，較佳係將CDN A 分子（cDNA分子係源自mRNA)插入表現庫，因爲這些分 子反應在個別細胞及組織中所表現之蛋白質及肽池。根據 本發明’任何方法可被使用以自（可能）表現該過敏原之細 胞製備cDNA。該方法係該領域之技藝人士所熟知（參見例 _ 如 Sambrook et al.，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 2nd ED. (1989)及 Ausubel，F.M. et al.，“Current Protocols in Molecular Biology,” (Current Protocol, 1 994))。亦有數種用於獲得雙股cDNA之商用可得套組， 例如Superscript II或Superscript III套組（美國英維特公 司（Invitrogen)，目錄編號 18580008)、Great Lengths cDNA合成套組（美國克隆特公司（Clontech)，目錄編號K-1048-1) 、 cDNA 合成套組（美國思特托基公司 © (Stratagene)，目錄編號20030 1 )及該類似物。 該cDNA及DNA分子可與包含適當限制酶辨識位之 連接子DNA序列連接。該連接子DNA亦爲該領域所知且 爲商業可得自例如美國普美加公司（Promega Corporation) 及美國新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs)。該 cDNA及DNA分子可另外進行限制酶消化、管柱或膠體粒 度分級或任何其他該領域之一般技藝人士所知之適當方 法。 -18- 201030341 該cDNA及DNA庫接著被插入表現載體中，該表現 載體可能包含編碼標籤之核苷酸序列、在細菌細胞中指導 DNA複製之序列、在真核細胞中指導DNA轉錄及mRNA 轉譯之序列及該類似物。包含該所述之調節元件之適當表 現載體係該領域所知。如上所述之cDNA或DNA分子可 被設計以直接導入或經脂質體、噬菌體載體或病毒載體 (例如腺病毒、反轉錄病毒）導入細胞中。典型哺乳動物表 φ 現載體包含啓動子元件（其媒介mRNA轉錄之起始）、蛋白 質編碼序列及終止轉錄及該轉錄物聚腺苷酸化所需之信 號。另外，亦可包括諸如複製起點、藥物抗藥性基因、調 節因子（爲誘導性啓動子之部分）之元件。Lac啓動子係可 用於原核細胞之典型誘導性啓動子，其可利用乳糖類似物 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導。爲了重組表現及 分泌，感興趣之 cDNA或 DNA分子可被連接（描述於 Ghahroudi et al, 1 997，FEBS Letters 41 4:52 1 -526)。其它 φ 元件可能包括增強子、科薩克（Kozak)序列及兩側爲RNA 剪接供位及受位之介入序列。高效率轉錄可藉由來自 SV40之早期及晚期啓動子、來自反轉錄病毒之長末端重 複（LTR)例如RSV、HTLVI、HIVI及巨細胞病毒（CMV)之 早期啓動子達成。然而，細胞性元件亦可被使用（例如人 肌動蛋白啓動子）。可選擇的是，重組蛋白質或肽可於包 含整合至染色體之基因建構物之安定細胞系中表現。以選 擇性標記諸如 dhfr、gpt、新黴素（neomycin)、潮黴素 (hygromycin)共轉染允許鑑別及分離該轉染細胞。表現載 -19- 201030341 體將較佳地包括至少一種選擇性標記。適當宿主之代表性 實例包括但不限於細菌細胞，諸如大腸桿菌（E. coli)、鏈 黴菌（Streptomyces)及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)細胞；真菌細胞諸如酵母菌細胞；昆蟲細胞 諸如果蠅S2及夜蛾 Sf9細胞；動物細胞諸如CHO、 COS、293及鮑伊斯（Bowes)黑色素瘤細胞；及植物細胞。 上述宿主細胞之適當培養基及培養條件係該領域所知。將 cDNA及DNA庫（特定細胞或組織之cDNA或DNA池）分 子插入表現載體中導致表現庫。 用於表現該過敏原來源之cDNA及DNA分子之表現 庫較佳係噬菌體展示庫或細菌表現庫。這些庫之成員 (「建構物」）接著被導入能表現由該cDNA或DNA所編 碼之蛋白質及肽之細胞中。較佳之細胞係根據用於產生該 cDNA及DNA庫之載體種類選擇。若該載體係經設計以供 細菌表現，該細胞係細菌細胞。該cDNA及DNA庫係利 用該領域之一般技藝人士所熟知及描述於例如Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y., 1 989) 中之方法（例如轉形）導入細胞中。培養細菌細胞以選擇轉 形株及產生個別細菌菌株（選殖株）之下一步驟係該領域所 廣爲週知。在洋菜板上選擇轉形株之後，該經培養之細菌 菌株可被個別挑選及用於接種以格狀模式陣列排列之液態 培養基’以於例如96孔微滴定盤形成格狀細菌菌液。此 安排允許各細菌選殖株在獨立孔槽中代表性生長且有助於 201030341 後續陽性選殖株池之次選擇。 特別較佳的是使用能分泌該所產生之蛋白質及肽至細 胞外部之表現庫載體。該經分泌之蛋白質及肽可能進一步 包含膜錨定結構域，該膜錨定結構域允許將該經表現之分 子固定在細胞表面上。產生該表現庫之方法及裝置係該領 域之技藝人士所知。 爲了測定過敏原特異性IgE分子與由該cDNA及DNA φ 表現庫所編碼之肽及/或蛋白質之結合，該至少一種蛋白 質或肽係經固定於固態支持物上。該固態支持物之後與源 自過敏個體之IgE分子接觸，且該IgE分子於該固態支持 物上之結合係經測定。
IgE與固定於固態支持物上之蛋白質及肽之結合可利 用能與IgE結合之抗體或彼之片段達成。該等抗體係該領 域所廣爲週知。 本發明所使用之固態支持物可爲膜，較佳爲硝酸纖維 φ 素膜。在特別較佳之實施態樣中，這些膜係與存在洋菜板 上之攜帶cDNA或DNA表現庫之細菌選殖株接觸以形成 這些選殖株之複製物。此複製物可被用於偵測過敏原特異 性IgE與特定選殖株之結合。 已經搭載源自過敏個體之過敏原特異性IgE之嗜鹼細 胞、嗜酸細胞或肥胖細胞可被用於測定由該DNA或cDNA 表現庫所編碼之蛋白質或肽的過敏原性潛力。該嗜鹼細 胞、嗜酸細胞或肥胖細胞可爲任何哺乳動物來源，因此較 佳的是使用人化大鼠嗜鹼白血病（RBL)細胞（例如RBL- -21 - 201030341 703/21細胞株）。細胞可藉由導入及表現編碼所有或部分 人Fc受體之DN A而被人化，較佳爲編碼所有或部分人 IgE受體I之DNA。用於產製人化細胞之方法係該領域所 知。較佳的是使用如Hoffmann et al.(同上）所描述之方法 以產製人化細胞培養。用於產製裸嗜鹼細胞之方法係描述 於 Kleine Budde et al. (Int Arch Allergy Immunol, 126(4))。 在鑑別能與過敏原特異性IgE結合之蛋白質/肽之 後，由步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋 白質或肽的胺基酸序列係經較佳地測定，及該能與過敏原 特異性IgE結合之至少一種蛋白質或肽係於步驟d)之前經 化學合成或重組產製且可被用於步驟d)。 根據本發明之較佳實施態樣，本發明之方法另包含測 定該於步驟e)所鑑別之至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列 之步驟。 由該DNA或cDNA庫所編碼及表現之蛋白質或肽的 胺基酸序列可由質譜法或艾德曼（Edman)降解法測定。若 使用該方法，必須在胺基酸定序前分離由該DN A或cDN A 庫所表現之蛋白質及/或狀。該分離可利用該領域所知之 方法完成。爲了促進蛋白質及肽之分離，彼等可能與標籤 融合（例如組胺酸標籤）。可選擇的是，亦可能分離該個別 DNA或cDNA株及定序該DNA或cDNA插入序列。 測定蛋白質及狀的胺基酸序列之適當方法包括但不限 於艾德曼降解法、（串聯式）質譜法及該類似方法（參見例 -22- 201030341 如 Edman， P. Mol· Biol. Biochem. Biophys.， （1970)， 8:211 -2 55;美國專利6,799,121)。該蛋白質及肽之胺基酸 序列可與已知蛋白質之胺基酸序列比較。 此處所使用之用語「質譜法」包括多種方法諸如串聯 式質譜法、介質輔助雷射脫附離子化（MALDI)飛行時間 (TOF)質譜法、MALDI-TOF-TOF質譜法、MALDI四極柱-飛行時間（Q-TOF)質譜法、電噴灑離子化（ESI)-TOF質譜 • 法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-離子陷阱質譜法、 ESI三段四極柱質譜法、ESI傅立葉轉換質譜法（FTMS)、 MALDI-FTMS、MALDI-離子陷阱-TOF及 ESI-離子陷阱-TOF。這些質譜分析法係該領域所廣爲週知（參見例如 Gary Siuzdak, “Mass Spectrometry for Biotechnology”， Academic Press，NY, (1996))。以最基本的質譜法來說， 其關於將分子離子化，接著測量該形成離子之質量。由於 分子離子化之方式係廣爲週知，因此通常可自該離子之質 φ 量正確地測定分子之分子量。舉例來說，串聯式質譜法可 被用於鑑定蛋白質因爲其可提供除了親代離子分子量以外 之資訊。串聯式質譜法關於先取得感興趣離子之質譜，接 著將該離子分成片段，並取得該些片段之質譜。因此串聯 式質譜法提供分子量資訊及可與該分子量資訊組合使用之 分段模式，以鑑別肽或蛋白質之確切序列（參見例如Hunt et al. (1 9 8 6) PNAS USA 83:6233-6237; Shevchenko et a 1. (1 996) PNAS USA 93:1 4440-1 4445; Figeys et al. (1 996) Anal. Chem. 68:1822-1828 及 Wilm et al. ( 1 9 9 6) Nature -23- 201030341 379:466-469) ° 如前所述，本發明之另一態樣關於一種鑑定過敏原性 乳蛋白質及/或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至 少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之 DNA或CDNA ;表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質 或狀；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之 至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之 該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞 n 接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少 一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少 一種蛋白質或肽係過敏原性。在本發明之另一態樣中，該 方法另包含測定由前述方法所鑑別之該至少一種蛋白質或 肽之胺基酸序列之步驟。因此，本發明如上述之鑑定過敏 性蛋白質及/或肽之方法較佳係應用於鑑定過敏性乳蛋白 質及/或肽。因此，所有上述定義及較佳態樣亦適用於本 發明之此態樣。 Θ 本發明之其他態樣關於一種測定包含樣本之牛乳的過 敏原性之方法，該方法包含測定圖ΙΑ、1B及1C (SEQ ID NO :22-84)及表 ΙΑ、1B 及表 2 (SEQ ID NO :1-21)中之蛋白 質及肽的至少一者存在之步驟。在本申請案中，用語「包 含樣本之牛乳」係指包含牛乳之食物樣本或營養樣本。非 限制性實例係牛乳、凝乳（curd)、奶油（cream)、黃油 (butter)、酸奶酪（yoghourt)及包含這些任一者之食物。'在 該包含樣本之牛乳中’該蛋白質及肽之至少一者係以允許 -24- 201030341 測定包含樣本之牛乳的過敏原性之量存在。通常在微克或 奈克範圍內之量的蛋白質或肽係足以測定過敏原性。 圖 ΙΑ、1B 及 1C (SEQ ID NO:22-84)及表 ΙΑ、1B 及 表2 (SEQ ID NO: 1-21)中所鑑別之蛋白質及肽可被用於測 定包含牛乳之樣本是否包含過敏原性分子。若該蛋白質或 肽中只有一者係存在於包含牛乳之樣本中，該樣本被視爲 具過敏原性。 φ 本發明之方法特別適用於測定水解牛乳之過敏原性。 該至少一種蛋白質及肽較佳係由免疫分析法測定，該 免疫分析法涉及與圖ΙΑ、1B及1C (SEQ ID NO:22-84)及 表ΙΑ、1B及表2 (SEQ ID ΝΟ:1-21)中所鑑別之蛋白質及 肽結合之抗體或彼之片段。 該至少一種蛋白質及/或肽較佳係由質譜法測定。爲 了鑑定存在於包含牛乳之樣本中的牛乳成分，可使用質譜 法。質譜法允許鑑定如圖ΙΑ、1B及1C (SEQ ID NO:22-φ 8 4)及表ΙΑ、1B及表2 (SEQ ID ΝΟ:1-2 1)中所鑑別之該乳 成分。比較存在於樣本中之片段與圖ΙΑ、1B及1C (SEQ ID NO:22-84)及表 ΙΑ、1B 及表 2 (SEQ ID ΝΟ:1-21)中之 蛋白質及肽’允許測定該樣本是否包含源自牛乳之過敏原 性物質。 爲了達到較佳之結果，存在於樣本中之蛋白質及肽在 質譜分析之前較佳地係經分離。此分離可藉由電泳方法 (較佳爲二維電泳法）或高效液相層析法進行。 在IgE結合試驗（步驟c))中篩選產物/蛋白質/肽及嗜 -25- 201030341 鹼細胞（人化肥胖細胞）去顆粒事實上提供潛在過敏原性之 資料，這些方法係用於臨床診療。然而，cDNA表現庫資 料將加入特定過敏原（例如牛乳）之潛在過敏原性肽序列的 完整清單。本發明組合這些方法（增進潛在過敏原性結構 之偵測），使得能夠利用質譜法證實這些潛在過敏原性結 構存在於產品介質中。由IgE反應性及去顆粒作用（生物 活性）所組合建立之過敏原性乳蛋白質及肽的序列資料庫 之組合應作爲發展更可靠、敏感及可再現方法之基礎，以 評估及預測包含乳之產品的過敏原性。雖然類似方法已被 用於鑑別牧草花粉過敏原（Ball et al. 1 994, Journal of Biological Chemistry, V o 1. 2 6 9; Issue of Nov 11， p. 2 8323 -283 28)，但是本發明之發現令人驚訝，因爲技藝人 士不曾想過根據Ball et al. 1 994所揭示之方法或類似方 法可被成功地應用於乳過敏原。進一步解釋，IgE與牧草 花粉過敏原之結合以及IgE與其他呼吸道過敏原之結合主 要依賴遍佈該過敏原之胺基酸殘基。因此，牧草花粉過敏 原及呼吸道過敏原通常裝配成構型（不連續性）IgE表位。 維塔拉等人之硏究（Vrtatla et al.)(J. Clin. Invest, Vol 99, No 7, p.1 673 - 1 68 1 )顯示在例如源自構型過敏原之重組片 段中喪失此構型導致大幅減低與IgE結合及自病患之嗜鹼 細胞釋放組胺酸之能力。與牧草花粉過敏原及呼吸道過敏 原不同的是，乳過敏原及食物過敏原通常具有非構型但未 經摺疊之表位（J^irvinen et al., Int Arch Allergy Immunol, Vol 12 6, p. 111-118 及 Jarvinen et al., Allergy, Vol 6 2, p. -26- 201030341 758-765)。因此先前技術僅辨識IgE與源自例如乳及蛋的 未經摺疊過敏原之結合。自嗜鹼細胞、肥胖細胞或嗜酸細 胞釋放介質尙未被顯示或建議爲本發明人所知。就維塔拉 等人（同上）之揭示而言，技藝人士將認爲不具IgE反應性 之乳的過敏原片段及重組產製之過敏原亦不具有誘發病患 之嗜鹼細胞釋放組胺酸之能力。同樣的，就維塔拉等人 (同上）之揭示而言，技藝人士將認爲具有IgE反應性之乳 φ 的過敏原片段及重組產製之過敏原亦具有誘發病患之嗜鹼 細胞釋放組胺酸之能力。因此，根據先前技術，進一步測 試IgE反應性乳蛋白質及肽之組胺酸釋放之步驟似乎沒有 必要。相反的，本發明人意外發現只有包括IgE反應性及 自嗜鹼細胞、肥胖細胞或嗜酸細胞釋放介質之步驟的方法 才能可靠地鑑定過敏原性乳蛋白質及肽。進一步注意到的 是，只有組合測試IgE反應性及介質之釋放允許可靠地評 估源自乳之蛋白質或肽之過敏原性。依被測試之個體而 φ 定，蛋白質及肽可能誘發介質之釋放或不釋放。因此，僅 展現IgE反應性而不媒介嗜鹼細胞、肥胖細胞或嗜酸細胞 釋放介質之非過敏原性蛋白質及肽可與過敏原性蛋白質或 肽（過敏原）區別。因此，只有本發明之方法能可靠地評估 本發明之蛋白質或肽對特定個體之過敏原性’也就是特異 性區別非過敏原性IgE。特別意外的是’本發明之方法導 致鑑別表ΙΑ、1B及表2 (SEQ ID ΝΟ:1-22)所示之肽’因 爲這些肽全部都是未經摺疊之肽，因此不具有構型表位。 一種偵測潛在過敏原之改進方法’藉由使用cDNA表 -27- 201030341 現庫及接著的噬菌體肽表現系統與利用IgE結合及IgE媒 介性嗜鹼細胞去顆粒、嗜酸細胞去顆粒或肥胖細胞去顆粒 之功能性篩選。爲了發展及製造營養調製劑之目的，此方 法使得能夠監測/篩選及預測原料、成分及完成品中潛在 食物過敏原之存在。 此處特別揭示或由本發明描述之方法所鑑定之過敏原 性蛋白質或肽可被用於診斷個體之過敏或過敏傾向，較佳 係乳過敏或乳過敏傾向。因此，在一實施態樣中，本發明 _ 關於一種診斷個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法包含 對疑似過敏或變成過敏之個體投予如此處特別揭示或由此 處描述之方法所鑑定之至少一種過敏原性蛋白質或肽，及 檢測該個體是否出現對抗該蛋白質或肽之過敏反應。投予 之裝置及方式係如下所述。 過敏之診斷通常涉及進行皮膚或血液測試以找出何種 物質或過敏原可能引起個體之過敏反應。一般偏好皮膚測 試，因爲它們快速、可靠，且相較於血液測試通常比較便 © 宜，但是任一種測試皆可被使用。以皮膚測試而言，適當 量之此處特別揭示或由此處描述之方法所鑑定之至少一種 過敏原性蛋白質或狀被放置於皮膚之上或之下以測定過敏 反應是否發生。有三種較佳之皮膚測試：（υ皮膚針刺測 試係藉由在皮膚上放置一滴包含該至少一種過敏原性蛋白 質或狀之溶液（過敏原溶液）及一連串搔刮或針刺以使該溶 液進入皮膚。若皮膚出現紅色、突起之發癢區域（稱爲風 疹塊），通常表示該人對該過敏原過敏。此稱爲陽性反 -28- 201030341 應。（2)在皮內測試中，小量之過敏原溶液被注入皮膚 中。當物質在皮膚針刺測試中不引起反應但仍被懷疑是對 該人之過敏原時，可進行皮內過敏測試。（3)在皮膚貼布 測試中，過敏原溶液被放置於墊上，該墊被黏貼至皮膚約 24至72小時。此測試係用於偵測稱爲接觸性皮膚炎之皮 膚過敏。在血液測試中，個體之過敏可由下列步驟測定： (i)使由本發明之方法所鑑定或於此處特別揭示之至少一種 φ 蛋白質或肽與源自該個體之血液樣本、血清樣本或血漿樣 本接觸，及（ii)測定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液 樣本、血清樣本或血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至 少一種蛋白質或肽與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具 過敏傾向；及/或（Γ)使由本發明之方法所鑑定或於此處特 別揭示之至少一種蛋白質或肽與該個體之嗜鹼細胞、嗜酸 細胞或肥胖細胞接觸，及（ii’）測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞 或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少 φ —種介質，或與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆 粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種 介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體 係過敏或具過敏傾向。 除此之外，根據本發明之另一實施態樣，此處特別揭 示或由本發明描述之方法所鑑定之過敏原性蛋白質或肽可 被用於個體過敏之過敏原免疫治療。因此，本發明之實施 態樣關於一種用於個體過敏之過敏原免疫治療之方法，該 方法包含投予此處特別揭示或由本發明描述之方法所鑑定 -29- 201030341 之至少一種過敏原性蛋白質或狀。較佳的是，該過敏係乳 過敏。 本發明之過敏原免疫治療（亦稱爲減敏治療、免疫減 敏或過敏原特異性免疫治療）是一種過敏病症之免疫治 療，其中該病患接受逐漸增加劑量之過敏原的免疫接種， 以誘發免疫耐受性。過敏原免疫治療是唯一治療過敏病症 之潛在原因的治療策略。其爲具高度成本效益之治療策 略，導致生活品質之改善及減低過敏性及過敏原相關症 狀。免疫治療已被證實能產生過敏性症狀之長期緩解、減 低相關過敏反應之嚴重性以及降低對過敏原發生新敏感之 機會。此係藉由調節對過敏原之免疫系統反應的免疫治療 達成。過敏原免疫治療可降低對藥物之需求、減輕症狀之 嚴重性或同時消除過敏。另外，過敏原特異性免疫治療係 已知能調節過敏疾病過程（具有治癒疾病之可能機會）之唯 一治療選擇，其他治療僅能抑制症狀。 較佳的是，用於此處所述之任何方法或診斷用途或過 敏原免疫治療之方法及用途之本發明之至少一種蛋白質或 狀係存在於醫藥組成物。根據本發明，用語「醫藥組成 物」關於對病患投予之組成物，較佳爲人病患。本發明之 醫藥組成物包含上述列舉之化合物。其可隨意選擇地包含 其他能改變本發明之化合物之特徵的分子，以藉此舉例來 說穩定、調整及/或活化彼等之功能。該組成物可能呈固 態、液態或氣態形式，且可能特別呈粉末、錠劑、溶液或 氣霧劑。本發明之醫藥組成物可隨意選擇及另外包含醫藥 -30- 201030341 上可接受之載劑。適當醫藥載劑之實例係該領域所廣爲週 知且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳化劑諸如油/水乳 化劑、各種潤濕劑、無菌溶液、有機溶劑包括DMSO等。 包含該載劑之組成物可藉由廣爲週知之習知方法調製。這 些醫藥組成物可以適當劑量對個體投予。投藥計畫將由主 治醫師及臨床因素決定。如醫學領域所熟知的，對任何病 患之劑量將視許多因素決定，包括病患體重、體表面積、 φ 年齡、所欲投予之特定化合物、性別、投予之時間及途 徑、整體健康及其他一起投予之藥物。在給定狀況下之治 療有效量將輕易地由例行實驗決定，且係屬於一般臨床醫 師或門診醫師之技藝及判斷範疇內。本發明所使用之醫藥 組成物可根據該領域之方法利用習知方式，使用一或多種 生理載劑或賦形劑調製，參見例如 Ansel et al., “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”，7 th edition，Lippincott Williams & Wilkins φ Publishers, 1999。因此，該醫藥組成物可能以劑量單位調 製劑經口、非經腸諸如經皮下、經靜脈內、經肌肉內、經 腹腔內、經鞘內、經皮、經黏膜、經硬膜下、經離子電滲 之地方性或局部性、經舌下、經呼吸噴霧、氣霧或經直腸 及該類似途徑投予，該劑量單位調製劑可隨意選擇地包含 醫藥上可接受之習知賦形劑。本發明之醫藥組成物可以單 獨活性劑投予或可與其他劑組合投予。 本發明之另一實施態樣關於一種測定個體之過敏或過 敏傾向之方法，該方法包含使此處所揭示或由此處描述之 -31 - 201030341 方法所鑑定之至少一種蛋白質或肽與自該個體分離之嗜鹼 細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，及當該嗜鹼細胞、嗜酸 細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放至少 一種介質，或當與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒， 鑑定該至少一種蛋白質或肽對該個體係過敏原性。在本發 明之較佳實施態樣中，該過敏或傾向係乳過敏或乳過敏傾 向。在本發明之其他較佳實施態樣中，這些診斷過敏或過 敏傾向之方法另包含區別嚴重過敏之個體與敏感但無症狀 之個體，及/或區別長大後不再過敏之個體與長大後仍過 敏之個體。在這方面，用語「長大後不再過敏」係指該過 敏不是持續存在而是當該過敏個體年紀增長後將減輕或較 佳爲消失。在這方面較佳的是，該個體在兒童時期過敏， 長大爲成年個體後不再過敏。 用於測定個體過敏或過敏傾向之方法中的該至少一種 蛋白質或肽可被固定於固態支持物上（例如硝酸纖維素）。 該固態支持物之後係與自該個體分離之嗜鹼細胞、嗜酸細 胞或肥胖細胞接觸，並測定介質之釋放或去顆粒。可選擇 的是，該細胞被固定在固態支持物上且與至少一種蛋白質 或肽接觸。另外，該至少一種蛋白質或肽可爲自其天然來 源分離之蛋白質或狀或爲上述方法所產製之重組蛋白質或 肽。 本發明之另一態樣關於一種鑑別IgE反應性非過敏原 性乳蛋白或肽之方法，該乳蛋白或肽係由至少一個表現庫 之DNA或cDNA所編碼，該方法包含下列步驟：提供至 201030341 少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之 DNA或cDNA ;表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質 或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之 至少一種血清型IgE結合之能力；使步驟c)所測定之展現 IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸 細胞或肥胖細胞接觸；及，測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或 肥胖細胞（i)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至 0 少一種介質，或（Π)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是 否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至 少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示 該個體係過敏或具過敏傾向。在這方面注意到的是，非過 敏原性乳蛋白質或肽通常具IgE反應性但當與嗜鹼細胞、 嗜酸細胞或肥胖細胞接觸時不引發該些細胞之介質釋放或 不引發該些細胞之去顆粒。因此，乳蛋白質或肽係爲過敏 原性或非過敏原性可由本發明之方法測定》非過敏原性乳 φ 蛋白質或肽被定義爲彼等具IgE反應性但缺乏對該些細胞 之過敏原性活性。 由本發明之方法所鑑別之IgE反應性非過敏原性乳蛋 白質或肽可被用於使肥胖細胞結合IgE在過敏原暴露之前 飽和且可作爲過敏疾病之安全免疫治療的有效候選物。因 此，本發明之另一實施態樣關於一種治療個體過敏之方 法，該方法包含對該個體投予至少一種IgE反應性非過敏 原性乳蛋白質或肽。較佳的是，該至少一種IgE反應性非 過敏原性蛋白質或肽被調製成如上所述之醫藥組成物。 -33- 201030341 【實施方式】 以下實施例說明本發明。本發明之廣泛範圍藉由參照 下列實施例可被最佳地了解，但該些實施例並不意圖限制 本發明爲特定實施態樣。 實施例1 :鑑別編碼IgE反應性乳成分及彼之片段之 cDNA序列 爲了鑑別牛乳中所包含之IgE反應性蛋白質及IgE反 應性蛋白質片段，首先利用泌乳牛的乳腺組織以建構 cDNA表現庫。此表現庫係以牛乳過敏病患之血清篩選。 編碼IgE反應性全長aSl、aS2、/3、/c酪蛋白及石乳球 蛋白之cDNA以及彼之IgE反應性片段係經鑑別。此爲相 當意外之結果，因爲哺乳動物蛋白質係於不添加真核細胞 轉譯後修飾之細菌系統中產製，該轉譯後修飾有時會影響 IgE結合之作用如主要家塵塵蟎過敏原所報告（JaCqUet et al., 2002)。該推演之胺基酸序列係顯示於圖ία至 C (SEQ ID NO:22-84)。所得到之IgE反應性過敏原片段允 許作出有關IgE表位位置之結論。 實驗程序 自牛（「菲納克韋（Fleckvieh)」種）取得牛乳腺，將新 鮮組織立即冷凍並儲存於-8 0 °C直到使用。自該組織分離 總RNA ’使用cDNA合成系統以得到cDNA。該經純化之 201030341 cDNA 利用 Agtll/EcoR I/CIAP-Treated/Gigapack III 選殖 套組（加州拉喬拉思特托基公司（Stratagene))被導入λ噬菌 體中。大腸桿菌Υ 1 090細胞係經噬菌體庫感染，並被種 於LB Amp培養板上（145毫米直徑）。細菌蛋白質表現係 藉由應用硝酸纖維素膜（德國達瑟爾魏特曼施萊舒爾公司 (Whatman Schleicher & Schuell))誘導。該被吸附之蛋白 質與來自CMA病患之血清一起培養，結合IgE抗體係以 125I-標記之抗IgE抗體偵測（德國漢堡IBL公司）。膜經曝 光至X光片上（紐約州羅徹斯特柯達公司（Kodak))。彼之 蛋白質能與人IgE結合之陽性菌株在X光片上顯示爲黑點 (該膜之放射自顯影圖之實例係顯示於圖2)。
陽性菌株之噬菌體DNA係利用λ gtll正向引子 (55CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC
GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA
TTC 3’）及 λ gtl 1 反向引子（5，GAA TTC CAG CTG AGC
GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3’）擴增，該經擴增之PCR產物係 經定序。所得到之核苷酸序列藉由與序列資料庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比較以進行分析。 實施例2 :乳成分之過敏原性活性與IgE反應性間之 差異 爲了評估分子是否具有過敏原潛力，不光是彼之IgE 反應性還有彼之生物活性需要被證實。測試分子之生物反 -35- 201030341 應性的科學證明模型係誘導人嗜鹼顆粒細胞釋放組胺酸 (Purohit 2005)。爲了此一目的，使用表現人FceRI受體 之α鏈的大鼠嗜驗白血病細胞系（Hoffmann et al.，Int Arch Allergy I mm uno 1，V o 1 1 2 6 (4)，p · 2 7 7 - 2 8 5)。不同的 乳成分（n = 3 3)包括來自不同物種之全乳萃取物、乳組分、 經純化之天然及重組牛乳蛋白質及重組蛋白質片段係經測 試。測定78位病患之血清IgE抗體與個別乳成分反應時 引起人化RBL細胞釋放石己糖胺酶之百分比（圖3)。 _ 最強效之細胞活化成分係牛乳，刺激率達47.4% (圖 3中「乳樣本」之圖）。但山羊乳及綿羊乳亦分別造成 35.9及28.2 %之數値，證實來自不同物種之乳蛋白質具有 跨種反應性。就單一成分而百’經純化之蛋白質酪蛋白 (AC、BC、KC)以及召乳球蛋白A (BLGA)顯示最高活性且 在25至3 4.6%之病患血清中引起釋放。有趣的是，該重 組形式之α乳白蛋白（r ALA)相較於其天然對應物引起更高 之釋放。各個合成肽具有相當低之細胞活化潛力，因爲僅 〇 達到2 · 6至7 · 7 %之刺激率。該生物活性係與I gE反應性比 較（表2)。 -36- 201030341 表2 :乳成分之IgE結合能力與生物活性；乳成分之 IgE及過敏活性間之差異。相較於在人RBL試驗中之過敏 原性活性，乳成分顯示較高之IgE反應性。 生物活性(病患％) IgE結合(病患％) 乳樣本 GM 35.9 69.2 CM 47.4 85.9 SM 28.2 82.1 HM 9.0 17.9 MM 9.0 29.5 酪蛋白組分 GC 24.4 46.2 CC 41.0 52.6 SC 28.2 46.2 天然純化蛋白質 AC 25.6 50.0 BC 34.6 44.9 KC 25.6 30.8 ALA 11.5 65.4 BLGA 28.2 50.0 BLGB 19.2 51.3 BSA 2.1 6.4 SSA 2.6 1.3 hALA 6.4 30.8 Lf 2.6 5.1 重組蛋白質 rASIC 19.2 48.7 rAS2C 5.1 9.0 rBC 10.3 55.1 rKC 6.4 21.8 rBLG 12.8 23.1 rALA 21.8 25.6 重組BSA片段 BSA FI 4.3 2.1 BSA F2 4.3 8.5 BSA F3 8.5 8.5 合成AS1C肽 Casl 6.4 43.6 Cas2 3.8 15.4 Cas3 2.6 46.2 Cas4 3.8 35.9 Cas5 5.1 41.0 Cas6 7.7 37.2 -37- 201030341 大部分受測之乳成分如牛乳、山羊乳、經純化之天然 冷乳球蛋白變異體A及B (BLGA及BLGB)及重組a S1酪 蛋白（rASIC)及重組o:S2酪蛋白（rAS2C)顯示IgE反應性 之百分比約高於生物活性之二倍。該些發現可由IgE結合 表位之存在解釋，該表位可與IgE結合，但無法交聯受體 結合之IgE及引起介質之釋放。只有在5個成分之例中 (重組BSA片段3 (F3)、重組乳白蛋白（rALA)、牛酪蛋 白組分（CC)、天然純化/c酪蛋白（KC)及沒酪蛋白（BC))， _
IgE反應性與生物活性之百分比達到類似數値。合成性α S1酪蛋白衍生肽之去顆粒程度相當低，大約是完整蛋白 質活性之 1/1〇 (Cas3、Cas4、Cas5)至 1/4 (Cas2、Cas6)。 我們發現許多IgE反應性a SI酪蛋白肽無法在嗜鹼 細胞釋放試驗中誘發去顆粒，因此代表IgE反應性半抗 原。因此，這些肽（半抗原）係非過敏原性。此結果暗示僅 進行IgE測試將導致過敏原性評估之僞陽性結論。另一方 面，IgE反應性半抗原可被用來作爲治療劑以使肥胖細胞 ◎ 結合IgE在過敏原暴露之前飽和且可作爲過敏疾病之安全 免疫治療的有效候選物。與IgE結合且誘發嗜鹼細胞釋放 之ctSl酪蛋白衍生肽已被進一步鑑定，少數病患之血清 被鑑定爲對若干肽不顯示IgE反應性但由這些肽誘發嗜鹼 細胞之去顆粒。後者之結果可由嗜鹼細胞釋放試驗之較高 敏感性解釋。 總結來說，IgE反應性與生物活性測量値之間的比較 顯示，相較於誘發嗜鹼細胞去顆粒之能力，病患血清具有 -38 - 201030341 較高之IgE結合能力。過敏原性試驗反應分子造成過敏症 狀之可能性的事實，暗示單獨的IgE反應性測量値無法被 用來鑑別確定過敏原性成分，還需要由生物試驗補足。 評估IgE結合能力與生物反應性這兩種試驗之組合允 許產生一資料庫，該資料庫包含可由質譜法偵測之過敏原 性蛋白質/片段/肽。圖4顯示過敏原性乳肽及蛋白質之序 列清單，其代表該資料庫之原型。測試血清IgE反應性及 φ 過敏原性活性之乳成分被列出。有關過敏原名稱、千道爾 頓（kD a)之分子量（MW)、過敏原之功能及製劑與參考文獻 之資訊被列出。 實驗程序 使用來自78位病患之血清，病患之選擇係根據陽性 病史、陽性皮膚針刺反應及利用CAP-FEIA系統（瑞典烏 普薩拉法迪亞公司（Phadia))測定對牛乳萃取物之特異性 φ IgE。血清係得自奧地利、德國、義大利、西班牙及法國 之5名成人及73名兒童（30名女童及43名男童）。 純化蛋白質及酪蛋白組分係購自西格瑪奧德里奇公司 (Sigma Aldrich)(美國聖路易斯）。重組蛋白質及重組BSA 片段係於大腸桿菌中表現（如Vrtala et al·，1 997所述）。 aSl酪蛋白肽係於應用生物系統（Applied Biosystems)肽 合成儀型號433A上合成（如Focke et al.，2001所述）。 人化大鼠嗜鹼白血病（RBL)細胞（RBL-703/21株）係於 微滴定板上與50微升之1:1〇稀釋之人血清於37 °C (7 %二 -39- 201030341 氧化碳，95%溼度）隔夜培養。之後細胞經過清洗，並於 37°C (7%二氧化碳，95%溼度）暴露於乳成分1小時，該乳 成分以包含50% D20及〇· 1 % BSA/HAS之Tyrodes緩衝液 稀釋成0.3微克/毫升蛋白質。細胞之自發性釋放亦被評 估。最後，將細胞上清液與50微升測試溶液（0.1M檸檬 酸或檸檬酸鈉，pH 4.5，160μΜ 4-甲基傘型酮-N-乙醯基-召-D-胺基葡糖苷）置於新的微滴定板上於37°C(7%二氧化 碳，95 %溼度）培養1小時。每孔加入100微升甘胺酸緩衝 液以停止反應，利用螢光微量板讀取儀測量在激發波長 3 60及發射波長465下之螢光。各樣本之特定己糖胺酶釋 放係利用下式計算：[(F1s-F1sp):(F1z-F1sp)]x100 (其中 Fls 係該樣本之螢光、F1SP係自發性釋放之螢光及Flz係總釋 放之螢光）。 實施例3 :以質譜法鑑定乳樣本及乳衍生產品中具有 或不具過敏原性活性之蛋白質及/或肽 由IgE反應性及過敏原性活性之組合所建立之過敏原 性乳蛋白質及肽的序列資料庫可作爲發展可靠、可再現之 分析方法的基礎以評估及預測乳樣本及乳衍生產品的過敏 原性。質譜法被用於偵測複合乳樣本中可能的過敏原性成 分。舉例來說，質譜法與上游高效液相層析法（HP LC)之 組合被應用於分析商業可得之完全水解低過敏原性乳配 方。分析圖5顯示之層析圖及經萃取之質譜圖證實所有蛋 白質已被水解成最長14個胺基酸之小型肽。 201030341 具體地說，圖5顯示利用奈米液相層析法及隨後的電 噴灑離子化質譜法分離水解乳配方。該圖爲1微克水解乳 樣本之總離子層析圖。留滯時間係顯示於X軸，以cpS (每秒計數）表示之信號強度顯示於Y軸。 利用MASCOT搜尋演算法所進行之資料庫搜尋導致 鑑別數個小型肽，其中的三個被鑑別爲乳衍生性過敏原， 也就是yS酪蛋白（Bos d 8 beta，圖6)。圖6描述Mascot φ 搜尋及鑑定水解牛乳中之点酪蛋白衍生肽。在最上方，質 譜法所唯一鑑別之乳過敏原；5酪蛋白被提及其分子量及計 算pi。底下說明石酪蛋白之捜尋參數及所獲得之序列涵 蓋率。最底下顯示沒酪蛋白序列，匹配肽以粗體字母印 刷。該/3酪蛋白過敏原係以匹配肽鑑定：HQPHQPLPPT (計算質量爲1.25 kDa，對應石酪蛋白之胺基酸160-170)、VYPFPGPIPN (計算質量爲 1.19 kDa，對應/3酪蛋 白之胺基酸74-84)、SSSEE (計算質量爲0.65 kDa，對應 φ 沒酪蛋白之胺基酸31-36)及PVVVPP (計算質量爲0.87 kDa，對應/3酪蛋白之胺基酸96- 1 03)。圖7顯示這些肽 之IgE反應性（表1 : cas b-Ι、2、3及4 ;圖7)。在水解 牛乳中所鑑定之Θ酪蛋白衍生肽不具IgE反應性。經硝酸 纖維素印漬之牛乳（CM)、重組召酪蛋白（rBC)、合成冷酪 蛋白衍生肽（cas b-1、cas b-2、cas b-3、cas b-4)及重組 α SI酪蛋白（rAS 1C)之IgE反應性係由點漬測定法分析。硝 酸纖維素結合之乳成分係與來自三個牛乳過敏病患（第 1、2及3行）及非過敏個體（C行）之血清一起培養。經結 -41 - 201030341 合之IgE抗體係以〃”―標記之抗IgE抗體偵測。此圖及這 些結果顯示它們代表非過敏原性肽，也就是它們太短以致 無法與IgE抗體結合，因此可與igE反應性及過敏原性牛 乳衍生肽/蛋白質資料庫中定義之過敏原性及IgE反應性 肽區別。另外，它們與々酪蛋白已公開之主要IgE結合區 (aa 1-16，a a 83 -92，aa 1 3 5- 1 44; Chatchatee 200 1)不同。 在水解乳樣本中無法偵測到藉由篩選cDNA表現庫所得到 之其他IgE反應性乳過敏原及過敏原片段（圖1 )，因此該 水解乳樣本可被鑑定爲非過敏原性製劑。因此可以證明， 利用完全水解乳，LC-MS分析可被用於鑑定非過敏原性 製劑/樣本。 -42- 201030341 表1. A)aSl酪蛋白及BSA片段之合成肽。肽之名 稱、彼等之胺基酸序列、長度、pi及以kDa表示之分子 量被列出。
肽 序列 長度 服基酸) pi 分子量 (kDa) Cas1 RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPF PEVC 32 8.22 3.75 Cas2 FGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIK QMEAES 33 4.18 3.70 Cas3 ISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYL GYEQLLRC 36 4.80 4.21 Cas4 CLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGI HAQQKE 34 8.14 3.96 Cas5 CPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAY PSGAWYW 35 4.14 4.24 Cas6 PLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTT MPLWC 33 3.92 3.60 BSAF1 MRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFK GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTE FAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELC KVASLRETYGDMADCCEKQEPERNEC FLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKA DEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLY YANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIE TMREKVLTSSHHHHHH 190 5.95 23.9 BSAF2 MARQRLRCASIQKFGERALKAWSVAR LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKEC 189 5.94 22.6 -43- 201030341 肽 序列 長度 (胺基酸) pi 分子量 (kDa) CHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTIS SKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPE NLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL GSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYE ATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLV DEHHHHHH BSAF3 MPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIV RYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTR CCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLH EKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSAL TPDETWPKAFDEKLFTFHADICTLPDT EKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTV MENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGP KLWSTQTALAHHHHHH 200 7.54 23.4 B)万酪蛋白之合成肽。肽之名稱、彼等之胺基酸序 列、長度、pi及以kDa表示之分子量被列出。 肽 序列 長度 (胺基酸) pi 分子量 (kDa) cas b-1 HQPHQPLPPTV 11 6.92 1.25 cas b-2 VYPFPGPIPNS 11 5.49 1.19 cas b-3 LSSSEE 6 4.24 0.65 cas b-4 PVWPPFL 8 5.96 0.87 實驗程序 水解乳配方係利用與HCT-Ultra質譜儀（德國布魯克 公司（Bruker Daltonik))之奈米噴灑介面連接之奈米液相層 析系統（荷蘭LC Packings Dionex公司Ultimate系統）藉由 逆相HP LC分析。利用MASCOT (英國倫敦矩陣科技公司 (Matrix Science))軟體搜尋演算法對SwissProt蛋白質資 -44- 201030341 料庫搜尋所得到之質譜圖。在點漬分析中，將1微克之蛋 白質點印至硝酸纖維素膜上，並與來自乳過敏病患之1:20 PBST (PBS，0.5%體積/體積Tween 20)稀釋血清一起培 養。經結合之IgE抗體係以1:15稀釋之I25I-標記抗人 IgE抗體（德國IBL公司）偵測。 實施例4:牛α乳白蛋白（ALA)之表位定位以鑑別IgE φ 反應性ALA衍生肽 方法 ALA衍生肽之合成：表1所展示之 ALA衍生肽 (Lacl-Lac8)係利用Fmoc(9葬基甲氧基羰基）策略及HBTU [(2-/1H-苯并三唑-1-基）1，1，3,3,四甲基脲六氟磷酸鹽]活化 (0.1毫莫耳小量循環）以於應用生物系統（Applied Biosystems)肽合成儀型號433A(加州福斯特市）上合成及 參 如 Focke et al., Faseb J 15:2042-2044 戶斤述純化 ° 對 ALA衍生肽之IgE反應性測試：ALA衍生肽之 IgE 反應性係利用如文獻（Schulmeister et al·，J Immunol. 1 82( 1 1 ):70 1 9-29)所述之微陣列分析測定。簡言之，乳成 分被印漬至普通顯微鏡玻片上之毛細流膜上，並與25微 升之病患血清一起培養。經結合之IgE抗體係以螢光共軛 抗I g E抗體於6 7 0奈米波長處偵測。每位病患之最低檢測 値被設定爲人血清白蛋白所獲得之個別數値的二倍値。 -45- 201030341 結果 鑑別與IgE抗體具反應性之ALA表位 爲了鑑別ALA之IgE反應性表位，我們合成8個橫 跨ALA序列之肽（表2)。該8個肽之長度爲19至20個胺 基酸，有5個胺基酸重疊。該8個重疊肽之IgE反應性係 藉由微陣列分析，使用來自對rALA具IgE反應性之36 位病患的血清評估。我們發現30.6%之病患對Lacl有反 應，33.3% 對 Lac2、5.6% 對 Lac4、2.8% 對 Lac5、Lac6 及 Lac7及1 1 .1%對Lac8有反應（表3)。在36位對rALA具 IgE反應性的病患中，總共有1 9位與至少一種ALA衍生 性合成肽有反應。 表2。合成性ALA衍生肽 狀 序列 長度(胺基酸〉 Pi 分子量(kDa) Lacl EQLTKCEVFRELKDLKGYG 19 6.34 2.26 Lac2 LKGYGGVSLPEWVCTTFHTS 20 6.74 2.18 Lac3 TFHTSGYDTQAIVQNNDSTE 20 4.31 2.23 Lac4 NDSTEYGLFQINNKIWCKDD 20 4.42 2.40 Lac5 WCKDDQNPHSSNICNISCDK 20 5.30 2.31 Lac6 ISCDKFLDDDLTDDIMCVKK 20 4.11 2.32 Lac7 MCVKKILDKVGINYWLAHKA 20 9.52 2.33 Lac8 LAHKALCSEKLDQWLCEKL 19 6.74 2.23
a表中使用之縮寫：Lacl-Lac8，ALA衍生肽1-8 ; aa，胺基酸；pi，等電點；MW，分子量；kDa，千道爾 頓。 -46- 201030341 表3。以對rALA具IgE反應性之36名病患的血清測 試α乳白蛋白衍生肽之IgE結合能力。_ n=36 IgE結合(病患％) 重組ALA rALA 100.0 合成ALA肽 Lacl 30.6 Lac2 33.3 Lac3 0 Lac4 5.6 Lac5 2.8 Lac6 2.8 Lac7 2.8 Lac8 11.1 本發明另包含下列項目： 1. 鑑別由DN A或cDNA表現庫所編碼之過敏原性蛋 白質及肽之方法，該方法包含下列步驟： a)提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個過敏 原來源之DNA或cDNA ; b)表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽； Φ c)測定該至少一種蛋白質或肽與對該至少一個過敏原 來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力； d) 使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種 蛋白質或肽與嗜鹼細胞或肥胖細胞接觸；及 e) 當該嗜鹼細胞與步驟d)之至少一種蛋白質或肽接觸 以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過 敏原性。 2. 如項目1之方法，其中該至少一個過敏原來源係 動物。 -47- 201030341 3. 如項目2之方法’其中該動物係哺乳動物。 4. 如項目3之方法’其中該哺乳動物係牛。 5·如項目3之方法，其中該哺乳動物係貓。 6. 如項目3之方法，其中該哺乳動物係狗。 7. 如項目2之方法，其中該哺乳動物係泌乳哺乳動 物且該DNA或cDNA係得自乳腺組織。 8 ·如項目2之方法’其中該動物係塵蟎。 9.如項目1之方法，其中該動物係魚。 0 1 〇·如項目2之方法’其中該過敏原來源係蛋。 11. 如項目1之方法，其中該至少一個過敏原來源係 植物。 12. 如項目11之方法，其中該植物係雜草。 13. 如項目11之方法，其中該植物係豆類。 14. 如項目11之方法，其中該植物係樹木。 15. 如項目1之方法’其中該表現庫係噬菌體展示庫 或細菌表現庫。 Θ 16. 如項目1之方法，其中該igE結合能力係藉由將 至少一種蛋白質或肽固定於固態支持物上，使該固態支持 物與IgE接觸及偵測IgE與該固態支持物之結合以測定。 17. 如項目1之方法，其中該嗜鹼細胞係人化大鼠嗜 鹼白血病（RBL)細胞（RBL-703/21株）。 18. 如項目1之方法，其中步驟c)所測定之展現IgE 結合能力之該至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列係經測定 且該至少一種蛋白質或肽係於步驟d)之前經化學合成或 -48 - 201030341 重組產製。 19.如項目1之方法’其中該方法另包含測定步驟e) 所鑑定之至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列之步驟。 20·如項目19之方法’其中該胺基酸序列係由質譜 法測定。 2 1 .如項目1 9之方法’其中該胺基酸序列係由艾德 曼（Edman)降解法測定。 ❹ 【圖式簡單說明】 圖1A顯示編碼IgE反應性全長aSi&aS2酪蛋白 及IgE反應性a S1及α S2酪蛋白片段之cDNA的推演胺 基酸序列。全長aSl及〇：S2酪蛋白之胺基酸序列係顯示 於頂端。IgE反應性α si及α S2酪蛋白片段（選殖株號碼 右側）之序列係以線條顯示。數目表示各選殖株之第一及 最後一個胺基酸。 φ 圖1Β顯示編碼IgE反應性全長召、/€酪蛋白及冷乳 球蛋白及該些蛋白質之IgE反應性片段之cDNA的推演胺 基酸序列。 全長yS、/c酪蛋白及yS乳球蛋白之胺基酸序列係顯示 於頂端。IgE反應性片段（選殖株號碼右側）之序列係以線 條顯示。數目表示各選殖株之第一及最後一個胺基酸。在 /3酪蛋白序列（頂端）中劃底線之序列對應由質譜分析完全 水解之低過敏原性乳配方所鑑別之非過敏原性肽。 圖1C顯示α乳白蛋白、牛血清白蛋白及乳鐵蛋白之 -49- 201030341 胺基酸序列。 圖2顯示IgE篩選源自牛乳腺組織之cDNA表現庫。 經攜帶cDNA庫之噬菌體感染之大腸桿菌細胞Y1 〇9〇被誘 導以合成重組蛋白質。這些蛋白質被轉移至硝酸纖維素膜 及暴露至乳過敏病患之血清UE’隨後與1251_標記之抗 人IgE抗體一起培養。此膜之放射自顯影圖中’ IgE反應 性菌株顯示爲黑點。 圖3顯示乳樣本及成分之過敏原性活性。生物活性係 _ 於人RBL試驗中測定。在人RBL試驗中產生陽性反應之 病患血清（n = 78)百分比係以黑色條狀顯示（y軸）。被分析 的是下列乳成分：來自不同物種之乳樣本（GM山羊乳、 CM牛乳、SM綿羊乳、HM人乳、MM馬乳）；不同物種之 酪蛋白組分（GC山羊酪蛋白、CC牛酪蛋白、SC綿羊酪蛋 白）；天然純化蛋白質（ACa酪蛋白、8(：/3酪蛋白、KC/c 酪蛋白、ALA α乳白蛋白、BLGB召乳球蛋白變異體Β、 BLGA^S乳球蛋白變異體A、BSA牛血清白蛋白、SSA綿 @ 羊血清白蛋白、hALA人〇:乳白蛋白、Lf乳鐵蛋白）；重 組蛋白質（rASIC重組aSl酪蛋白、rAS2C重組aS2酪蛋 白、rBC重組；8酪蛋白、rKC重組/c酪蛋白、rALA重組 α乳白蛋白、rBLG重組/3乳球蛋白）；BSA之重組片段 (FI，BSA之重組片段1 ; F2 ’ BSA之重組片段2 ; F3， BSA之重組片段3)及Q：S1酪蛋白之合成肽（Casl至 Cas6)。 圖4顯示在乳中發現之過敏原序列清單。 -50- 201030341 圖5顯示利用奈米液相層析法及隨後的電噴灑離子化 質譜法分離水解乳配方。該圖爲1微克水解乳樣本之總離 子層析圖。留滯時間係顯示於x軸’以CPS (每秒計數）表 示之信號強度顯示於Y軸。 圖6顯示Mascot搜尋及鑑定水解牛乳中之Θ酪蛋白 衍生肽。 圖7顯示在水解牛乳中所鑑定之々酷蛋白衍生狀係爲 非IgE反應性。
-51 - 201030341 序列表 860555 <110>魯鉄維列塔 瑞克維多 烏麵茲 馬嘉列福克泰克爾 亨綱軸 鼸鶸『 <12〇>鑑定過敏原性蛋白質和肽之方法 <130> R2869 PCT <150> US 61/196,417 <151> 2008-10-17 <160> 84 <170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 32 <212> PRT <213〉家牛 <400> 1
Arg Pro Lys His Pro lie Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15
Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Cys 20 25 30 <210〉 2 <211> 33 <212> PRT <213〉家牛 <400> 2
Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu 15 10 15
Ser Thr Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu
20 25 30
Ser <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213>家牛 <400> 3 lie Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His 15 10 15 lie Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Glu Gin 20 25 30
Leu Leu Arg Cys 35 <210〉 4 201030341
Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 50 55 60
Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu 65 70 75 80
Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala Asp 85 90 95
Cys Cys Glu Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser His 100 105 110
Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn Thr 115 120 125
Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys Tyr 130 135 140
Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 145 150 155 160
Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gin Glu Cys Cys Gin 165 170 175
Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys lie Glu Thr Met Arg 180 185 190
Glu Lys Val Leu Thr Ser Ser His His His His His His 195 200 205 <210〉 8 <211> 197 <212> PRT <213>家牛 <400> 8
Met Ala Arg Gin Arg Leu Arg Cys Ala Ser lie Gin Lys Phe Gly Glu 15 10 15
Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gin Lys Phe Pro 20 25 30
Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 35 40 45
Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 50 55 60
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys Asp Asn Gin Asp Thr lie Ser 65 70 75 80
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 85 90 95
Cys lie Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala lie Pro Glu Asn Leu Pro Pro 100 105 110 -2- 201030341
Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 50 55 60
Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu 65 70 75 80
Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala Asp 85 90 95
Cys Cys Glu Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser His 100 105 110
Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn Thr 115 120 125
Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys Tyr 130 135 140 參 ❿
Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 145 150 155 160
Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gin Glu Cys Cys Gin 165 170 175
Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys lie Glu Thr Met Arg 180 185 190
Glu Lys Val Leu Thr Ser Ser His His His His His His 195 200 205 <210> 8 <211> 197 <212> PRT <213>家牛 <400> 8
Met Ala Arg Gin Arg Leu Arg Cys Ala Ser He Gin Lys Phe Gly Glu 15 10 15
Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gin Lys Phe Pro 20 25 30
Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 35 40 45
Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 50 55 60
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys Asp Asn Gin Asp Thr lie Ser 65 70 75 80
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 85 90 95
Cys lie Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala lie Pro Glu Asn Leu Pro Pro 100 105 110 -3- 201030341
Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Gin 115 120 125
Glu Ala Lys Asp Ala Phe Leu Gly Ser Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg 130 135 140
Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu 145 150 155 160
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Glu Cys Cys Ala Lys Asp Asp Pro His Ala 165 170 175
Cys Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys Leu Lys His Leu Val Asp Glu His 180 185 190
His His His His His 195 <210> 9 <211> 208 <212> PRT <213〉家牛 <400> 9
Met Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys Asp Gin Phe Glu Lys Leu 15 10 15
Gly Glu Tyr Gly Phe Gin Asn Ala Leu lie Val Arg Tyr Thr Arg Lys 20 25 30
Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Ser Leu 35 40 45
Gly Lys Val Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro Glu Ser Glu Arg Met 50 55 60
Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu lie Leu Asn Arg Leu Cys Val 65 70 75 80
Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Thr 85 90 95
Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Pro Asp 100 105 110
Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys Leu Phe Thr Phe His 115 120 125
Ala Asp lie Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys Gin lie Lys Lys Gin 130 135 140
Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu 145 150 155 160
Gin Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala Phe Val Asp Lys Cys 165 170 175 -4- 201030341 A πα s cy A e ph s 5 y8 cl a u 5 s Ly p s po s 8 A 1
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His Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val 1 5 10 參 參 <210> 11 <211> 11 <212〉 PRT <213>家牛 <400> 11
Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lie Pro Asn Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213>家牛 <400> 12
Leu Ser Ser Ser Glu Glu <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213>家牛 <400〉 13
Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213>家牛 <400> 14
Glu Gin Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Arg Glu Leu Lys Asp Leu Lys 15 10 15
Gly Tyr Gly T牛 1520PR家 (>> > > 012 3 1Λ 1i 1x li 2 2 2 2 <400> 15
Leu Lys Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr Thr -5- 201030341 15 10 15
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Thr Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gin Ala lie Val Gin Asn Asn 15 10 15
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Asn Asp Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gin lie Asn Asn Lys lie Trp 15 10 15
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Met Cys Val Lys Lys lie Leu Asp Lys Val Gly lie Asn Tyr Trp Leu -6- 201030341 15 10 15
Ala His Lys Ala 20 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213>家牛 <400> 21
Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Ser Glu Lys Leu Asp Gin Trp Leu Cys 15 10 15
Glu Lys Leu
<210〉 22 <211> 214 <212> PRT <213>家牛 <400> 22
Met Lys Leu Leu lie Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Pro Lys His Pro lie Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn 20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly 35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60
Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie 65 70 75 80
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Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu Asp Ala Tyr Pro Ser 165 170 175
Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro 180 185 190 201030341
Ser Phe Ser Asp lie Pro Asn Pro lie Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys 195 200 205
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Met Lys Leu Leu lie Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Pro Lys His Pro lie Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn 20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly 35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60
Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie 65 70 75 80
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Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg Pro Lys His Pro lie Lys 15 10 15
His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe 20 25 30
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Gin Phe Tyr Gin Leu Asp Ala Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val 165 170 175 ❹
Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser Asp lie Pro 180 185 190
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Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin 100 105 110
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Glu Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu 145 150 155 160
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Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly lie His Ala Gin Gin 115 120 125
Lys Glu Pro Met He Gly Val Asn Gin Glu Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro 130 135 140
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Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe 165 170 175
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Pro lie Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu 15 10 15
Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys 20 25 30
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Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg 85 90 95
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Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser 165 170 175
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Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro 35 40 45
Asn Ser Val Glu Gin Lys His lie Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu 50 55 60
Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys 65 70 75 80
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Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu Ser 15 10 15
Thr Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser
20 25 30 lie Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His 35 40 45 lie Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu 50 55 60
Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin Leu Glu lie Val 65 70 75 80
Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly lie His 85 90 95
Ala Gin Gin Lys Glu Pro Met lie Gly Val Asn Gin Glu Leu Ala Tyr 100 105 110
Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu Asp Ala Tyr Pro 115 120 125 -12- 201030341
Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala 130 135 140
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Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro 15 10 15
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Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin 35 40 45
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<210> 32 <211> 137 <212> PRT <213>家牛 <400〉 32
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Glu lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His lie Gin Lys Glu Asp 15 10 15 -14- 201030341
Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg Leu 20 25 30
Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin Leu Glu lie Val Pro Asn Ser Ala Glu 35 40 45
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Phe Tyr Gin Leu 50
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Pro lie Gly Ser <210> 39 <211> 83 <212> PRT <213>家牛 <400> 39 Glu Glu Arg Leu
Glu Pro Met lie 20
Met Pro Leu Trp
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Glu Gly lie His
Glu Leu Ala Tyr 40
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Glu Asn Ser Glu 85
His Ser Met Lys
Gly Val Asn Gin
Pro Ala 25 Phe Ser Pro Lys Glu Glu 25
Asn Ser Ala Glu 10
Gin Gin Lys Glu
Tyr Pro Glu Leu 45
Gly Ala Trp Tyr 60
Ser Phe Ser Asp 75
Thr Thr Met Pro 90
Gly lie His Ala 10
Leu Ala Tyr Phe
Glu Pro 30 Phe Tyr lie Leu Gin Tyr 30
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Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu Asp Ala Tyr Pro Ser Gly Ala Trp 201030341 35 40 45
Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser 50 55 60
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His Ser Met Lys Glu Gly lie His Ala Gin Gin Lys Glu Pro Met lie 15 10 15
Gly Val Asn Gin Glu Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin 20 25 30
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Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser 35 40 45
Asp lie Pro Asn Pro lie Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met 50 55 60
Pro Leu Trp 65 <210> 44 <211> 58 <212〉 PRT <213>家牛 <400> 44
Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu Asp 15 10 15
Ala Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr 20 25 30
Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser Asp lie Pro Asn Pro He Gly Ser Glu 35 40 45
Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp 50 55 <210> 45 <211> 44 <212> PRT <213>家牛 -19- 201030341 <400> 45
Leu Asp Ala Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr 15 10 15
Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser Asp lie Pro Asn Pro lie Gly 20 25 30
Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp 35 40 <210> 46 <211> 31 <212> PRT <213>家牛 <400〉 46
Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser Asp lie Pro Asn 15 10 15
Pro lie Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp 20 25 30 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213>家牛 <400> 47
Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp 1 5 10 <210> 48 <211> 97 <212> PRT <213>家牛 <400> 48
Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg Pro Lys His Pro lie 15 10 15
Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg 20 25 30
Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn 35 40 45
Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gin Ala Met 50 55 60
Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie Ser Ser Ser Glu Glu 65 70 75 80 lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His lie Gin Lys Glu Asp Val 85 90 95
Pro -20- 201030341 <210> 49 <211> 84 <212> PRT <213>家牛 <400> 49
Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met 15 10 15
Glu Ala Glu Ser He Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn Ser Val 20 25 30
Glu Gin Lys His lie Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu 35 40 45
Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin 50 55 60
Leu Glu lie Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys 65 70 75 80
Glu Gly lie His <210> 50 <211> 60 <212> PRT <213>家牛 <400> 50
Thr Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser 15 10 15 lie Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His 20 25 30 lie Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu
Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin 50 55 60 <210> 51 <211> 45 <212> PRT <213>家牛 <400> 51
Gin Met Glu Ala Glu Ser lie Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn 15 10 15
Ser Val Glu Gin Lys His lie Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg 20 25 30
Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin Leu Leu Arg Leu Lys Lys 35 40 45 <210> 52 -21 - 201030341 <211> 171 <212> PRT <213>家牛 <400> 52
Met Lys Leu Leu lie Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Pro Lys His Pro lie Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn 20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly 35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60
Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp lie Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie 65 70 75 80
Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His lie 85 90 95
Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin 100 105 110
Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin Leu Glu lie Val Pro 115 120 125
Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly lie His Ala 130 135 140
Gin Gin Lys Glu Pro Met lie Gly Val Asn Gin Glu Leu Ala Tyr Phe 145 150 155 160
Tyr Pro Glu Leu Phe Thr Thr Met Pro Leu Trp 165 170 <210> 53 <211> 200 <212> PRT <213>家牛 <400> 53
Met Lys Leu Leu lie Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Pro Lys His Pro lie Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn 20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly 35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp lie Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60
Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp He Lys Gin Met Glu Ala Glu Ser lie 65 70 75 80 -22- 201030341
Ser Ser Ser Glu Glu lie Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His He 85 90 95
Gin Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin 100 105 110
Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Ser Met Lys Glu Gly lie 115 120 125
His Ala Gin Gin Lys Glu Pro Met lie Gly Val Asn Gin Glu Leu Ala 130 135 140
Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu Asp Ala Tyr 145 150 155 160
Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gin Tyr Thr Asp
165 170 175
Ala Pro Ser Phe Ser Asp lie Pro Asn Pro lie Gly Ser Glu Asn Ser 180 185 190
Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp 195 200 <210> 54 <211> 222 <212> PRT <213>家牛 <400> 54
Met Lys Phe Phe lie Phe Thr Cys Leu Leu Ala Val Ala Leu Ala Lys 15 10 15
Asn Thr Met Glu His Val Ser Ser Ser Glu Glu Ser lie lie Ser Gin 20 25 30
Glu Thr Tyr Lys Gin Glu Lys Asn Met Ala lie Asn Pro Ser Lys Glu 35 40 45
Asn Leu Cys Ser Thr Phe Cys Lys Glu Val Val Arg Asn Ala Asn Glu 50 55 60
Glu Glu Tyr Ser lie Gly Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ala Glu Val Ala 65 70 75 80
Thr Glu Glu Val Lys lie Thr Val Asp Asp Lys His Tyr Gin Lys Ala 85 90 95
Leu Asn Glu lie Asn Gin Phe Tyr Gin Lys Phe Pro Gin Tyr Leu Gin 100 105 110
Tyr Leu Tyr Gin Gly Pro lie Val Leu Asn Pro Trp Asp Gin Val Lys 115 120 125
Arg Asn Ala Val Pro lie Thr Pro Thr Leu Asn Arg Glu Gin Leu Set 130 135 140 -23- 201030341
Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val Asp Met Glu Ser Thr Glu 145 150 155 160
Val Phe Thr Lys Lys Thr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Lys Asn Arg Leu 165 170 175
Asn Phe Leu Lys Lys He Ser Gin Arg Tyr Gin Lys Phe Ala Leu Pro 180 185 190
Gin Tyr Leu Lys Thr Val Tyr Gin His Gin Lys Ala Met Lys Pro Trp 195 200 205 lie Gin Pro Lys Thr Lys Val lie Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 210 215 220 <210〉 55 <211> 199 <212〉 PRT <213>家牛 <400> 55
Ser Ser Glu Glu Ser He lie Ser Gin Glu Thr Tyr Lys Gin Glu Lys 15 10 15
Asn Met Ala lie Asn Pro Ser Lys Glu Asn Leu Cys Ser Ήιγ Phe Cys 20 25 30
Lys Glu Val Val Arg Asn Ala Asn Glu Glu Glu Tyr Ser lie Gly Ser 35 40 45
Ser Ser Glu Glu Ser Ala Glu Val Ala Thr Glu Glu Val Lys lie Thr 50 55 60
Val Asp Asp Lys His Tyr Gin Lys Ala Leu Asn Glu lie Asn Gin Phe 65 70 75 80
Tyr Gin Lys Phe Pro Gin Tyr Leu Gin Tyr Leu Tyr Gin Gly Pro lie 85 90 95
Val Leu Asn Pro Trp Asp Gin Val Lys Arg Asn Ala Val Pro lie Thr 100 105 110
Pro Thr Leu Asn Arg Glu Gin Leu Ser Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys 115 120 125
Lys Thr Val Asp Met Glu Ser Thr Glu Val Phe Thr Lys Lys Thr Lys 130 135 140
Leu Thr Glu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Asn Phe Leu Lys Lys He Ser 145 150 155 160
Gin Arg Tyr Gin Lys Phe Ala Leu Pro Gin Tyr Leu Lys Thr Val Tyr 165 170 175
Gin His Gin Lys Ala Met Lys Pro Trp lie Gin Pro Lys Thr Lys Val 180 185 190 -24- 201030341 lie Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 195 <210> 56 <211> 224 <212> PRT <213>家牛 <400〉 56
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30 參
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro 85 90 95
Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys 100 105 110
Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys 115 120 125
Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp 130 135 140 #Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met Hi 145 isn iss 150 155 160
Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gin Ser 165 170 175
Val Leu Ser Leu Ser Gin Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gin Lys Ala 180 185 190
Val Pro Tyr Pro Gin Arg Asp Met Pro lie Gin Ala Phe Leu Leu Tyr 195 200 205
Gin Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro lie lie Val 210 215 220 ITΛι 5718s (>>>> 0 12 3 1* lx 11 2 222 <400> 57 -25- 201030341
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser He Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro 85 90 95
Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys 100 105 110
Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys 115 120 125
Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp 130 135 140
Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His 145 150 155 160
Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gin Ser 165 170 175
Val Leu Ser Leu Ser 180 <210> 58 <211> 90 <212> PRT <213>家牛 <400> 58
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 -26- 201030341 lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro 85 90 <210> 59 <211> 88 <212> PRT <213〉家牛 <400> 59
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn 85 <210〉 60 <211> 85 <212> PRT <213>家牛 <400> 60
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 lie Pro Asn Ser Leu 85 <210> 61 <211> 84 <212> PRT <213>家牛 <400〉 61
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg -27- 201030341 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phc Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 lie Pro Asn Ser <210> 62 <211> 80 <212〉PRT <213>家牛 <400> 62
Met Lys Val Leu lie Leu A]a Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 75 80 <210〉 63 <211> 74 <212> PRT <213>家牛 <400> 63
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys He 50 55 60
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val 65 70 -28- 201030341 <210> 64 <211> 66 <212> PRT <213>家牛 <400> 64
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His Pro 65 <210〉 65 <211> 65 <212〉 PRT <213〉家牛 <400> 65
Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie 50 55 60
His 65 <210> 66 <211> 223 <212> PRT <213>家牛 <400> 66
Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu 15 10 15
Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser Ser 20 25 30
Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe Gin 35 40 45 -29- 201030341
Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie His 50 55 60
Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lie 65 70 75 80
Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro Val 85 90 95
Val Val Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val 100 105 110
Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr 115 120 125
Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val 130 135 140
Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His Gin 145 150 155 160
Pro His Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gin Ser Val 165 170 175
Leu Ser Leu Ser Gin Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gin Lys Ala Val 180 185 190
Pro Tyr Pro Gin Arg Asp Met Pro lie Gin Ala Phe Leu Leu Tyr Gin 195 200 205
Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro lie lie Val 210 215 220 <210> 67 <211> 83 <212> PRT <213>家牛 <400> 67
Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu 15 10 15
Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser Ser 20 25 30
Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe Gin 35 40 45
Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie His 50 55 60
Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lie 65 70 75 80
Pro Asn Ser -30- 201030341 <210> 68 <211> 96 <212> PRT <213>家牛 <400> 68
Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu 15 10 15
Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser Ser 20 25 30
Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe Gin 35 40 45
Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie His 50 55 60
Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lie 65 70 75 80
Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro Val 85 90 95 <210> 69 <211> 50 <212> PRT <213>家牛 <400> 69
Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu 15 10 15
Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe Gin Ser Glu 20 25 30
Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie His Pro Phe 35 40 45
Ala Gin 50 <210〉 70 <211> 116 <212〉 PRT <213>家牛 <400> 70
Pro Gly Glu lie Val Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr 15 10 15
Arg lie Asn Lys Lys lie Glu Lys Phe Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin 20 25 30
Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp Lys lie His Pro Phe Ala Gin Thr Gin 35 40 45
Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin 50 55 60 -31 - 201030341
Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro 85 90 95
Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr 100 105 110
Glu Ser Gin Ser 115 <210> 71 <211〉 50 <212> PRT <213>家牛 <400> 71
Leu Ser Ser Ser Glu Glu Ser lie Thr Arg lie Asn Lys Lys lie Glu 15 10 15
Lys Phe Gin Ser Glu Glu Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Gin Asp 20 25 30
Lys lie His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro 35 40 45
Gly Pro 50 <210> 72 <211> 37 <212> PRT <213>家牛 <400> 72
Lys lie His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro 15 10 15
Gly Pro lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin 20 25 30
Thr Pro Val Val Val 35 <210〉 73 <211> 110 <212> PRT <213>家牛 <400> 73
His Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 15 10 15 lie Pro Asn Ser Leu Pro Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro 20 25 30 -32· 201030341
Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys 35 40 45
Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys 50 55 60
Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp 65 70 75 80
Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His 85 90 95
Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro 100 105 110
<210> 74 <211> 99 <212> PRT 參 <213>家牛 <400> 74
Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lie Pro Asn Ser Leu Pro 15 10 15
Gin Asn lie Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe 20 25 30
Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala 35 40 45
Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe 50 55 60
Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu 65 70 75 80
Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His Gin Pro His Gin Pro Leu 85 90 95
Pro Pro Thr <210> 75 <211> 77 <212> PRT <213>家牛 <400〉 75
Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu 15 10 15
Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val 20 25 30
Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn 35 40 45
Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His Gin Pro His -33- 201030341 50 55 60
Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gin Ser 65 70 75 <210> 76 <211> 64 <212> PRT <213>家牛 <400> 76
Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu 15 10 15
Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val 20 25 30
Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn 35 40 45
Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His Gin Pro His 50 55 60 <210〉 77 <211> 190 <212> PRT <213>家牛 <400> 77
Met Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr lie Leu Ala Leu Thr Leu 15 10 15
Pro Phe Leu Gly Ala Gin Glu Gin Asn Gin Glu Gin Pro lie Arg Cys 20 25 30
Giu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys lie Ala Lys Tyr lie Pro 35 40 45 lie Gin Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr 50 55 60
Gin Gin Lys Pro Val Ala Leu lie Asn Asn Gin Phe Leu Pro Tyr Pro 65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gin lie Leu Gin 85 90 95
Trp Gin Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys Ser Cys Gin Ala Gin 100 105 110
Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro His Pro His Leu Ser Phe Met Ala 115 120 125 lie Pro Pro Lys Lys Asn Gin Asp Lys Thr Glu lie Pro Thr lie Asn 130 135 140
Thr lie Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr lie Glu Ala Val 145 150 155 160 -34- 201030341
Glu Ser Thr Val Ser Thr Leu Glu Ala Ser Pro Glu Val lie Glu Ser 165 170 175
Pro Pro Glu lie Asn Thr Val Gin Val Thr Ser Thr Ala Val 180 185 190 <210> 78 <211> 120 <212> PRT <213>家牛 <400> 78
Met Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr lie Leu Ala Leu Thr Leu 15 10 15
Pro Phe Leu Gly Ala Gin Glu Gin Asn Gin Glu Gin Pro He Arg Cys 20 25 30
Glu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys lie Ala Lys Tyr lie Pro 35 40 45 lie Gin Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr 50 55 60
Gin Gin Lys Pro Val Ala Leu lie Asn Asn Gin Phe Leu Pro Tyr Pro 65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gin He Leu Gin 85 90 95
Trp Gin Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys Ser Cys Gin Ala Gin 100 105 110
Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro 115 120 <210> 79 <211> 93 <212> PRT <213>家牛 <400> 79
Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr lie Leu Ala Leu Thr Leu Pro 15 10 15
Phe Leu Gly Ala Gin Glu Gin Asn Gin Glu Gin Pro lie Arg Cys Glu 20 25 30
Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys lie Ala Lys Tyr lie Pro lie 35 40 45
Gin Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Gin 50 55 60
Gin Lys Pro Val Ala Leu lie Asn Asn Gin Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr 65 70 75 80 -35- 201030341
Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gin lie 85 90 <210〉 80 <211> 60 <212> PRT <213>家牛 <400> 80
Pro Lys Lys Asn Gin Asp Lys Thr Glu lie Pro Thr lie Asn Thr lie 15 10 15
Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr lie Glu Ala Val Glu Ser 20 25 30
Thr Val Ser Thr Leu Glu Ala Ser Pro Glu Val lie Glu Ser Pro Pro 35 40 45
Glu He Asn Thr Val Gin Val Thr Ser Thr Ala Val 50 55 60 <210> 81 <211> 38 <212> PRT <213>家牛 <400> 81
Ser Thr Pro Thr lie Glu Ala Val Glu Ser Thr Val Ser Thr Leu Glu 15 10 15
Ala Ser Pro Glu Val lie Glu Ser Pro Pro Glu lie Asn Thr Val Gin 20 25 30
Val Thr Ser Thr Ala Val 35 <210> 82 <211> 141 <212> PRT <213>家牛 <400> 82
Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly lie Leu Phe His Ala Thr 15 10 15
Gin Ala Glu Gin Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Arg Glu Leu Lys Asp 20 25 30
Leu Lys Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr Thr 35 40 45
Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gin Ala lie Val Gin Asn Asn Asp 50 55 60
Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gin lie Asn Asn Lys lie Trp Cys Lys 65 70 75 80
Asp Asp Gin Asn Pro His Ser Ser Asn He Cys Asn lie Ser Cys Asp -36- 201030341 85 90 95
Lys Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp lie Met Cys Val Lys Lys 100 105 110 lie Leu Asp Lys Val Gly lie Asn Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu 115 120 125
Cys Ser Glu Lys Leu Asp Gin Trp Leu Cys Glu Lys Leu 130 135 140 <210> 83 <211> 606 <212> PRT <213>家牛 <400> 83 參
Met Lys Trp Val Thr Phe lie Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu lie Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu 35 40 45 lie Ala Phe Ser Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Asp Glu His Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Leu Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 65 70 75 80
Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu 85 90 95
Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala Asp 100 105 110
Cys Cys Glu Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser His 115 120 125
Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn Thr 130 135 140
Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys Tyr 145 150 155 160
Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 165 170 175
Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gin Glu Cys Cys Gin 180 185 190
Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys lie Glu Thr Met Arg 195 200 205
Glu Lys Val Leu Thr Ser Ser Ala Arg Gin Arg Leu Arg Cys Ala Ser 37- 201030341 210 215 220 lie Gin Lys Phe Gly Glu 225 230
Arg Ala Leu Lys Ala Trp 235
Ser Val Ala Arg 240
Leu Ser Gin Lys Phe Pro 245
Lys Ala Glu Phe Val Glu 250
Val Thr Lys Leu 255
Val Thr Asp Leu Thr Lys 260
Val His Lys Glu Cys Cys 265
His Gly Asp Leu 270
Leu Glu Cys Ala Asp Asp 275
Arg Ala Asp Leu Ala Lys 280
Tyr lie Cys Asp 285
Asn Gin Asp Thr lie Ser 290
Ser Lys Leu Lys Glu Cys 295 300
Cys Asp Lys Pro
Leu Leu Glu Lys Ser His 305 310
Cys lie Ala Glu Val Glu 315
Lys Asp Ala lie 320
Pro Glu Asn Leu Pro Pro 325
Leu Thr Ala Asp Phe Ala 330
Glu Asp Lys Asp 335
Val Cys Lys Asn Tyr Gin 340
Glu Ala Lys Asp Ala Phe 345
Leu Gly Ser Phe 350
Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg 355
Arg His Pro Glu Tyr Ala 360
Val Ser Val Leu 365
Leu Arg Leu Ala Lys Glu 370
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu 375 380
Glu Cys Cys Ala
Lys Asp Asp Pro His Ala 385 390
Cys Tyr Ser Thr Val Phe 395
Asp Leu Leu Lys 400
His Leu Val Asp Glu Pro 405
Gin Asn Leu lie Lys Gin 410
Asn Cys Asp Gin 415
Phe Glu Lys Leu Gly Glu 420
Tyr Gly Phe Gin Asn Ala 425
Leu lie Val Arg 430
Tyr Thr Arg Lys Val Pro 435
Gin Val Ser Thr Pro Thr 440
Leu Val Glu Val 445
Ser Arg Ser Leu Gly Lys 450
Val Gly Thr Arg Cys Cys 455 460
Thr Lys Pro Glu
Ser Glu Arg Met Pro Cys 465 470
Thr Glu Asp Tyr Leu Ser 475
Leu lie Leu Asn 480
Arg Leu Cys Val Leu His 485
Glu Lys Thr Pro Val Ser 490
Glu Lys Val Thr 495
Lys Cys Cys Thr Glu Ser 500
Leu Val Asn Arg Arg Pro 505
Cys Phe Ser Ala 510 -38- 201030341
Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys Leu 515 520 525
Phe Thr Phe His Ala Asp lie Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys Gin 530 535 540
He Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro Lys 545 550 555 560
Ala Thr Glu Glu Gin Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala Phe 565 570 575
Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Val 580 585 590
Glu Gly Pro Lys Leu Val Val Ser Thr Gin Thr Ala Leu Ala 595 600 605 參 參 <210> 84 <211> 709 <212> PRT <213>家牛 <400> 84
Met Lys Leu Phe Val Pro Ala Leu Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gly Leu 15 10 15
Cys Leu Ala Ala Pro Arg Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr lie Ser Gin 20 25 30
Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gin Trp Arg Met Lys Lys Leu 35 40 45
Gly Ala Pro Ser lie Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala Leu Glu Cys 50 55 60 lie Arg Ala lie Ala Glu Lys Lys Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly 65 70 75 80
Gly Met Val Phe Glu Ala Gly Arg Asp Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val 85 90 95
Ala Ala Glu lie Tyr Gly Thr Lys Glu Ser Pro Gin Thr His Tyr Tyr 100 105 110
Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gin Leu Asp Gin Leu 115 120 125
Gin Gly Arg Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp 130 135 140 lie lie Pro Met Gly lie Leu Arg Pro Tyr Leu Ser Trp Thr Glu Ser 145 150 155 160
Leu Glu Pro Leu Gin Gly Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys 165 170 175 -39 - 201030341
Val Pro Cys lie Asp Arg Gin Ala Tyr Pro Asn Leu Cys Gin Leu Cys 180 185 190
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Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Gin Asp Gly Ala Gly Asp 210 215 220
Val Ala Phe Val Lys Glu Thr Thr Val Phe Glu Asn Leu Pro Glu Lys 225 230 235 240
Ala Asp Arg Asp Gin Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asn Asn Ser Arg Ala 245 250 255
Pro Val Asp Ala Phe Lys Glu Cys His Leu Ala Gin Val Pro Ser His 260 265 270
Ala Val Val Ala Arg Ser Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu lie Trp 275 280 285
Lys Leu Leu Ser Lys Ala Gin Glu Lys Phe Gly Lys Asn Lys Ser Arg 290 295 300
Ser Phe Gin Leu Phe Gly Ser Pro Pro Gly Gin Arg Asp Leu Leu Phe 305 310 315 320
Lys Asp Ser Ala Leu Gly Phe Leu Arg lie Pro Ser Lys Val Asp Ser 325 330 335
Ala Leu Tyr Leu Gly Ser Arg Tyr Leu Thr Thr Leu Lys Asn Leu Arg 340 345 350
Glu Thr Ala Glu Glu Vai Lys Ala Arg Tyr Thr Arg Val Val Trp Cys 355 360 365
Ala Val Gly Pro Glu Glu Gin Lys Lys Cys Gin Gin Trp Ser Gin Gin 370 375 380
Ser Gly Gin Asn Val Thr Cys Ala Thr Ala Ser Thr Thr Asp Asp Cys 385 390 395 400
He Val Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Leu Asn Leu Asp Gly 405 410 415
Gly Tyr lie Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 420 425 430
Glu Asn Arg Lys Ser Ser Lys His Ser Ser Leu Asp Cys Val Leu Arg 435 440 445
Pro Thr Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ala Asn Glu 450 455 460
Gly Leu Thr Trp Asn Ser Leu Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala 465 470 475 480 -40- 201030341
Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn lie Pro Met Gly Leu lie Val Asn 485 490 495
Gin Thr Gly Ser Cys Ala Phe Asp Glu Phe Phe Ser Gin Ser Cys Ala 500 505 510
Pro Gly Ala Asp Pro Lys Ser Arg Leu Cys Ala Leu Cys Ala Gly Asp 515 520 525
Asp Gin Gly Leu Asp Lys Cys Val Pro Asn Ser Lys Glu Lys Tyr Tyr 530 535 540
Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asp Val Gly Asp Val 545 550 555 560
Ala Phe Val Lys Asn Asp Thr Val Trp Glu Asn Thr Asn Gly Glu Ser 565 570 575 參
Thr Ala Asp Trp Ala Lys Asn Leu Asn Arg Glu Asp Phe Arg Leu Leu 580 585 590
Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Gin Ser Cys His 595 600 605
Leu Ala Val Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Ser Asp Arg Ala 610 615 620
Ala His Val Lys Gin Val Leu Leu His Gin Gin Ala Leu Phe Gly Lys 625 630 635 640
Asn Gly Lys Asn Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Lys Ser Glu Thr 645 650 655
Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Lys Leu Gly 660 665 670
Gly Arg Pro Thr Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Thr Glu Tyr Val Thr Ala 675 680 685 lie Ala Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys 690 695 700
Ala Phe Leu Thr Arg 705 -41 -

Claims (1)

  1. 201030341 七、申請專利範園 1 · 一種鑑別過敏原性乳蛋白質及/或肽之方法，該方 法包含下列步驟： a)提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺 組織之DNA或cDNA; 現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽； 〇沏1定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之 φ 至少—種血清型IgE結合之能力； d) 使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種 蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及 e) 當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與步驟d)之至 少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至 少一種蛋白質或肽係過敏原性。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法另包 含測定步驟e)所鑑別之該至少一種蛋白質或肽之胺基酸序 0 列之步驟。 3. —種測定包含牛乳之樣本的過敏原性之方法，該 方法包含測定任何SEQ ID NO 1至84中之蛋白質及肽的 至少一者存在之步驟。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該牛乳係水 解牛乳。 5. 如申請專利範圍第3或4項之方法，其中該至少 一種蛋白質及肽之存在係由質譜分析測定。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中存在於樣本 201030341 中之蛋白質及肽在質譜分析之前係經分離。 7.如申請專利範圍第6項之方法，其中該蛋白質及 肽係藉由電泳法或藉由高效液相層析法分離。 8 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該電泳法係 二維電泳法。 9. 一種由如申請專利範圍第1或2項之方法所鑑定 之蛋白質或肽。 10. —種選自SEQ ID NO: 1至84中任一者之蛋白質 或肽。 11. 如申請專利範圍第9或10項之至少一種蛋白質 或肽，其係用於診斷個體之過敏或過敏傾向。 1 2.如申請專利範圍第1 1項之至少一種蛋白質或 肽’其係用於診斷個體之乳過敏或乳過敏傾向。 13. —種診斷個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法 包含對疑似過敏或變成過敏之個體投予如申請專利範圍第 9或1〇項之至少一種蛋白質或肽，及檢測該個體是否出 現對抗該蛋白質或肽之過敏反應。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該過敏或 過敏傾向係乳過敏或乳過敏傾向。 15. 如申請專利範圍第13或14項之方法，其中該方 法額外包含： a) 皮膚測試；及/或 b) 血液測試。 1 6.如申請專利範圍第I 5項之方法， -2- 201030341 a) 其中該皮膚測試係選自： (i)皮膚針刺測試 (Π)皮內測試 (iii) 皮膚貼布測試，或 (iv) (i)至（iii)之測試之任何組合， 其中測試（i)至（iv)之陽性結果表示個體爲過敏或具過 敏傾向； 及/或 b) 其中該血液測試包含下列步驟·· (i)使如申請專利範圍第9或1 0項之至少一種蛋白質 或肽與源自該個體之血液樣本、血清樣本或血漿樣本接 觸，及 (Π)測定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、 血清樣本或血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至少一種 蛋白質或肽與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾 ❹ 向； 及/或 (ίυ使如申請專利範圍第9或ίο項之至少一種蛋白質 或肽與該個體之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，及 (ii’）測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少 一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或與該至 少一種蛋白質或狀接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種 蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋 白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。 -3- 201030341 17. 如申請專利範圍第9或10項之至少一種蛋白質 或肽’其係用於個體過敏之過敏原免疫治療。 18. —種用於個體過敏之過敏原免疫治療之方法，該 方法包含投予如申請專利範圍第9或10項之至少一種蛋 白質或肽。 1 9 · 一種測定個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法 包含： a) 使如申請專利範圍第9或1 0項之至少一種蛋白質 或肽與血液樣本、血清樣本或血漿樣本接觸，其中該血液 樣本、血清樣本或血漿樣本係自該個體分離，及 b) 測定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、血 清樣本或血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至少一種蛋 白質或肽與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾 向； 及/或 a ’）使如申請專利範圍第9或1 0項之至少一種蛋白質 或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，其中該嗜鹼 細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞係自該個體分離’及 b ’）測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞 (i) 當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一 種介質，或 (ii) 當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒’ 其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質 或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過 -4- 201030341 敏或具過敏傾向。 20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該過敏或 過敏傾向係乳過敏或乳過敏傾向。 21. 如申請專利範圍第19或20項之方法’該方法另 包含 a) 區別嚴重過敏之個體與敏感但無症狀之個體’及/ 或 b) 區別長大後不再過敏之個體與長大後仍過敏之個 體。 22 . —種鑑別IgE反應性非過敏原性乳蛋白或肽之方 法，該乳蛋白或肽係由至少一個表現庫之DNA或cDNA 所編碼，該方法包含下列步驟： a) 提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的 乳腺組織之DNA或cDNA ; b) 表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽； c) 測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之 至少一種血清型IgE結合之能力； d) 使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種 蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細睥或肥胖細胞接觸；及 e) 測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞 (i) 當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一 種介質，或 (ii) 當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒， 其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質 -5- 201030341 或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過 敏或具過敏傾向。 23. 至少一種由如申請專利範圍第22項之方法所鑑 別或如申請專利範圍第10項之蛋白質或肽，其係用於治 療過敏。 24. —種治療個體之過敏之方法，該方法包含投予至 少一種由如申請專利範圍第22項之方法所鑑別或如申請 專利範圍第10項之蛋白質或肽。
    -6-
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