CN102187226B - 鉴定变应原性蛋白质和肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定变应原性蛋白质和肽的方法。更具体地,本发明提供了鉴定变应原性奶蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将如步骤c)中测定的展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与步骤d)中至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。

Description

鉴定变应原性蛋白质和肽的方法
技术领域
本发明涉及鉴定变应原性蛋白质和肽的方法。更具体地,本发明提供了鉴定变应原性奶蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将如步骤c) 中测定的展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与步骤d)中至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
在此说明书中,引用了许多文件,包括专利申请和制造商的手册。尽管不认为这些文件与此发明的专利性相关,但是将这些文件的公开在此以其整体引入作为参考。更具体地,引入所有参考文件作为参考,就如同每一单个文件被明确和单独地说明被引用作为参考一样。不承认这些文件是本发明的现有技术。
背景技术
约2-8%的小于3岁婴儿和约2%的成人群体患有食物超敏。在儿童中约80%的变态反应为对牛奶(CM)、鸡蛋和豆类作物(例如花生和大豆)超敏的结果。然而在成人群体中,对水果、花生和树生坚果的变态反应代表了最普遍的超敏。
牛奶是引入婴儿饮食的最早食物之一,因此是在幼儿食物变态反应中最常见的原因之一。约2.5%的新生儿在他们生命的第一年中显示了对牛奶的不良反应。
牛奶变态反应(CMA)的症状为速发型或缓发型,其范围涉及皮肤、呼吸道、胃肠道的轻度到严重反应,在最严重的情况下表现为威胁生命的全身反应(过敏反应,anaphylaxis)。与细胞介导的缓发型反应相反,速发型反应由原本无害的抗原引发的免疫球蛋白E(IgE)抗体的产生(I型超敏)引起。IgE抗体和变应原性分子的相互作用导致效应细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞)的特异性激活和随后的炎症介质例如组胺、前列腺素和白三烯的释放,所述介质是引起速发型变态反应的原因。
牛奶含有超过25种蛋白质,其中一些已知是变应原性的。通过凝乳酶(chymosin)(rennin)作用或酸化牛奶至pH4.6可得到2种组分:在乳清组分中发现20%的蛋白质,80%的蛋白质构成酪蛋白组分。在两种组分中都含有变应原性分子;取决于在CMA群体中记录的变态反应发生率,将这些变态反应性分子视为主要或次要变应原。
牛奶中存在的主要变应原为α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、αS1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。牛奶中存在的次要变应原为αS2-酪蛋白、乳铁蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白。
α-乳清蛋白(Bos d 4)、β-乳球蛋白(Bos d 5)、免疫球蛋白(Bos d 7)、BSA和乳铁蛋白是在乳清中熟知的IgE反应性成分。αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白是在酪蛋白成分(Bos d 8)中潜在的变应原(Wal, 2004)。
在乳清成分中β-乳球蛋白(BLG)和α-乳清蛋白(ALA)被视为主要变应原。β-乳球蛋白是球状的非常稳定的蛋白质,属于结合疏水配体的蛋白质超家族脂钙蛋白。其他变应原,例如主要的狗变应原Can f 1和Can f 2和其他有毛动物(马、猫和豚鼠)的变应原也都属于此蛋白质超家族。β-乳球蛋白以二聚体形式天然存在,具有36 kDa的分子量。β-乳球蛋白具有2种主要的同种型,遗传性变体A(BLGA)和B(BLGB),二者在第64和118位氨基酸上有差异(BLGA中为天冬氨酸和缬氨酸,BLGB中为甘氨酸和丙氨酸)。β-乳球蛋白的稳定性和其属于脂钙蛋白家族的事实可解释此分子的高变应原性潜能。
α-乳清蛋白为14 kDa的酸性Ca2+结合单体,通过4个二硫键稳定。在合成乳糖的半乳糖基转移酶系统中为调节成分。序列分析显示其与人α-乳清蛋白(hALA)和鸡蛋中的溶菌酶(鸡蛋的主要变应原)具有高氨基酸序列同源性。α-乳清蛋白的变应原性可能是由于其稳定性。
在悬浮液中酪蛋白组分的蛋白质形成有序的聚集物(微团),其具有恒定比例的各个分子:αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白各37%,β-和κ-酪蛋白各13%。4种酪蛋白分子具有很低的一级结构同源性和不同的功能特性,但均为磷酸化的蛋白质,具有流变(rheomorph)的高度水合的四级结构,容易被一些蛋白酶降解。此对蛋白水解消化的敏感性对重要变应原来说是很不常见的特征。牛奶酪蛋白与其他动物例如山羊和绵羊的酪蛋白具有高达90%的氨基酸序列同源性。此序列同源性可能是牛奶和其他动物奶之间的常见交叉反应的原因。
本发明满足了以下需求,即提供鉴定生物源中存在的变应原性蛋白质和肽的方法。本发明由此也满足了以下需求,即提供鉴定生物源中存在的非变应原性蛋白质和肽的方法,所述生物源具体为哺乳动物的奶,特别是牛奶和包含这类奶的营养制剂。此外,本发明提供了诊断和治疗个体中变态反应的方式和方法。
发明内容
本发明的一个方面涉及鉴定变应原性奶蛋白质和肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。本发明在另一个方面提供了鉴定至少一种变应原性奶蛋白质或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。本发明因此涉及如上文描述的方法,其中变应原性蛋白质和肽为奶变应原性蛋白质和肽,至少一种表达文库包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA,对变应原来源敏感的个体为对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体。
根据本发明的另一个方面,上述本发明的方法可还包括以下步骤,即测定由所述方法鉴定的至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列。
本发明还提供了鉴定由DNA或cDNA表达文库编码的变应原性蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自至少一种变应原来源的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对至少一种变应原来源(特别是哺乳动物奶,优选牛奶和含有哺乳动物奶优选牛奶的营养制品)敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。因此,本发明提供了鉴定至少一种由DNA或cDNA表达文库编码的变应原性蛋白质或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自至少一种变应原来源的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对至少一种变应原来源敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
本发明的另一个方面涉及检测牛奶中的变应原性蛋白质和肽的方法,其包括以下步骤,即测定图1A, 1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中的至少一种蛋白质或肽的存在。
根据本发明的此方面,哺乳动物奶,优选牛奶可为水解哺乳动物奶,优选水解牛奶。此外,所述至少一种蛋白质或肽的存在可通过质谱测定。优选的,在质谱前分离样品中存在的蛋白质和肽。可通过电泳方法或通过高效液相色谱分离蛋白质和肽。优选的,电泳方法可为双向电泳。
本发明的另一个方面涉及由本发明方法鉴定的蛋白质或肽。本发明的另一个方面涉及选自图1A、1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中的蛋白质或肽。
本发明的另一个方面涉及本发明的至少一种蛋白质或肽在诊断个体中的变态反应或变态反应倾向中的用途。优选的变态反应为奶变态反应。
本发明的另一个方面涉及诊断个体中的变态反应或变态反应倾向的方法,其包括对疑为变态反应或可能变成变态反应的个体施用如本文提及的至少一种蛋白质或肽,并评估个体是否对所述蛋白质和肽产生变态反应。
根据本发明的此方面,优选的变态反应或变态反应倾向为奶变态反应或奶变态反应倾向。此方面的方法优选地另外包含进行皮肤试验和/或血液试验。皮肤试验优选地选自(i)皮肤针刺试验,(ii)皮内试验,(iii)皮肤斑贴试验或(iv)试验(i)至(iii)的任意组合,其中试验(i)至(iv)的阳性结果指示个体中的变态反应或变态反应倾向。血液试验优选地包括以下步骤:(i)将本发明的至少一种蛋白质或肽与所述个体的血液样品、血清样品或血浆样品接触,和(ii)测定所述至少一种蛋白质或肽是否与所述血液样品、血清样品或血浆样品中的IgE抗体结合,其中所述至少一种蛋白质或肽与IgE抗体的结合指示在所述个体中的变态反应或变态反应倾向;和/或(i')将本发明的至少一种蛋白质或肽与所述个体的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,和(ii'')测定所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞在与至少一种蛋白质或肽接触后是否释放了至少一种介质,或在与至少一种蛋白质或肽接触后是否去颗粒化,其中在与所述至少一种蛋白质或肽接触后所述至少一种介质的释放或在与所述至少一种蛋白质或肽接触后的去颗粒化指示在所述个体中的变态反应或变态反应倾向。
本发明的另一个方面涉及本发明的至少一种蛋白质或肽在个体变态反应的变应原免疫疗法中的用途。优选的变态反应为奶变态反应。
在另一个方面本发明涉及用于个体变态反应的变应原免疫疗法的方法,其包括施用本发明的至少一种蛋白质或肽。优选的变态反应为奶变态反应。
在另一个方面本发明涉及测定个体中变态反应或变态反应倾向的方法,所述方法包括a)将本发明的至少一种蛋白质或肽与血液样品、血清样品或血浆样品接触,其中所述血液样品、血清样品或血浆样品从所述个体中分离或已分离,和b)测定所述至少一种蛋白质或肽是否与所述血液样品、血清样品或血浆样品中的IgE抗体结合,其中所述至少一种蛋白质或肽与IgE抗体的结合指示在所述个体中的变态反应或变态反应倾向;和/或a')将本发明的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,其中所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞从所述个体中分离或已分离,和b')测定所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞(i)在与至少一种蛋白质或肽接触后是否释放了至少一种介质,或(ii)在与至少一种蛋白质或肽接触后是否去颗粒化,其中在与所述至少一种蛋白质或肽接触后所述至少一种介质的释放或在与所述至少一种蛋白质或肽接触后的去颗粒化指示在所述个体中的变态反应或变态反应倾向。
根据本发明的此方面,优选的变态反应或变态反应倾向为奶变态反应或奶变态反应倾向。根据此方面的优选方法还包括区分具有严重变态反应的个体和致敏但无症状的个体,和/或区分随年龄增长不再具有变态反应的个体和随年龄增长仍具有变态反应的个体。
在另一个方面本发明涉及鉴定由至少一种表达文库的DNA或cDNA编码的IgE反应性非变应原性奶蛋白质或肽的方法,其包括以下步骤:a)提供至少一种表达文库,所述文库包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA和cDNA,b)表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,c)测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,d)将如步骤c)中测定的所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,e)测定所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞(i)在与至少一种蛋白质或肽接触后是否释放了至少一种介质,或(ii)在与至少一种蛋白质或肽接触后是否去颗粒化,和f)当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞(i')在与至少一种蛋白质或肽接触后未释放至少一种介质,或(ii'')在与至少一种蛋白质或肽接触后未去颗粒化时,将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为非变应原性的。
根据本发明的此方面,通过所述方法鉴定的或本文具体公开的至少一种蛋白质或肽用于治疗变态反应。根据本发明还提供了治疗个体中变态反应的方法,其包括施用通过所述方法鉴定的或本文具体公开的至少一种蛋白质或肽。
在本发明的所有适用实施方案中,优选的所述个体或患者为人。嗜酸性粒细胞、肥大细胞或嗜碱性粒细胞一般来说为哺乳动物来源的,可为人来源的。大体上,术语“泌乳哺乳动物”包括哺乳动物物种山羊、绵羊、马、水牛、骆驼,但不局限于这些。母牛为特别优选的物种。
附图说明
图1A显示了编码IgE-反应性全长αS1-和αS2-酪蛋白和IgE-反应性αS1-和αS2-酪蛋白片段的cDNA推导的氨基酸序列。全长αS1-和αS2-酪蛋白的氨基酸序列在顶部显示。IgE-反应性αS1-和αS2-酪蛋白片段(克隆编号右边)的序列显示为线条。数字指示各克隆的第一个和最后一个氨基酸。
图1B显示了编码IgE-反应性全长β-、κ-酪蛋白和β-乳球蛋白和这些蛋白质的IgE-反应性片段的cDNA推导的氨基酸序列。
全长β-、κ-酪蛋白和β-乳球蛋白的氨基酸序列在顶部显示。IgE-反应性片段(克隆编号右边)的序列显示为线条。数字指示各克隆的第一个和最后一个氨基酸。在β-酪蛋白序列(顶部)中的下划线序列对应通过质谱分析高度水解的低变应原性奶配方鉴定的非变应原性肽。
图1C显示了α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和乳铁蛋白的氨基酸序列。
图2显示了牛乳腺表达cDNA文库的IgE筛选。诱导用携带cDNA文库的噬菌体感染的大肠杆菌(E. coli)细胞Y1090以合成重组蛋白质。将这些蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜并暴露于来自奶变态反应患者的血清IgE,之后与125I标记的抗人IgE抗体孵育。在滤膜的此放射自显影中,IgE反应性克隆显示为黑点。
图3显示了奶样品和组分的变应原活性。在人RBL试验中测定了生物学活性。在人RBL试验中给出阳性反应的患者血清(n = 78)百分比显示为黑色柱(y-轴)。分析了以下奶组分:不同物种的奶样品(GM,山羊奶;CM,牛奶;SM,绵羊奶;HM,人奶;MM,马奶),不同物种的酪蛋白组分(GC,山羊酪蛋白;CC,母牛酪蛋白;SC,绵羊酪蛋白),天然纯化的蛋白质(AC,α-酪蛋白;BC,β-酪蛋白;KC,κ-酪蛋白;ALA,α-乳清蛋白;BLGB,β-乳球蛋白变体B;BLGA,β-乳球蛋白变体A;BSA,牛血清白蛋白;SSA,绵羊血清白蛋白;hALA,人α-乳清蛋白;Lf,乳铁蛋白),重组蛋白(rAS1C,重组αS1-酪蛋白;rAS2C,重组aS2-酪蛋白;rBC,重组β-酪蛋白;rKC,重组κ-酪蛋白;rALA,重组α-乳清蛋白;rBLG,重组β-乳球蛋白),重组BSA片段(F1,BSA重组片段1;F2,BSA重组片段2;F3,BSA重组片段3)和aS1酪蛋白的合成肽(Cas1 – Cas6)。
图4显示了在奶中发现的变应原序列列表。
图5显示了水解奶配方的分离,使用纳米液相色谱和之后的电喷射离子化MS。展示了1µg水解奶样品的总离子色谱。x-轴显示了保留时间,y-轴显示了以cps(每秒计数)为单位的信号强度。
图6显示了在水解牛奶中β-酪蛋白来源肽的Mascot搜索和鉴定。
图7显示了在水解牛奶中鉴定的β-酪蛋白来源肽不是IgE反应性的。
具体实施方式
本发明的一个目的是提供鉴定变应原性奶蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
本发明还提供包括以下步骤的方法:提供包含来自至少一种变应原来源的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对至少一种变应原来源敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
根据本发明的方法特别适于鉴定展示变应原特性的蛋白质和肽。为了鉴定蛋白质或肽的变应原特性仅需要微克或纳克范围的量。这些蛋白质和肽由DNA或cDNA文库编码,所述文库从已知含有或合成激发个体中变应原性反应的蛋白质和/或肽的来源中得到。变应原来源可包含不同种类的可负责变应原生物合成的组织和细胞。如果这些细胞和组织是已知的,有可能从所述细胞或组织中特别制备DNA或cDNA文库,其可用于根据本发明的方法。例如,通过从泌乳哺乳动物乳腺组织中分离DNA或cDNA可鉴定哺乳动物特别是母牛的奶变应原。
将DNA和cDNA表达文库表达的蛋白质和肽与对至少一种变应原来源敏感的个体的至少一种血清的IgE接触。在此第一步中鉴定能够与IgE结合的蛋白质和肽,这是变态反应的一个先决条件。术语“IgE-反应性”依照本发明指氨基酸序列与IgE结合的能力。在下一步中与IgE结合的肽和蛋白质进一步与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,所述细胞已负载了已知对变应原来源的至少一种变应原具有变应性的至少一个个体的IgE。携带变应原特异性IgE分子的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与各自的变应原接触后释放介质例如组胺和/或其他由嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞释放的变应性介质,这指示能够结合IgE的肽和蛋白质在与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触后也能够诱导这些细胞的去颗粒化。合适的变应原性介质优选地为组胺、肝素、前列腺素、白三烯、趋化因子、细胞因子。在本发明上下文中可用的其他变应原性介质包括ß-己糖胺酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶、核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶、脂酶、纤溶酶原和主要碱性蛋白。本领域技术人员熟知由这些细胞释放的介质,其可通过普通教科书的知识(见例如Janeway等人 2002: Immunology, Spektrum Akademischer Verlag; Auflage: 5. Auflage; Paul等人 1989: Fundamental Immunology, Raven Press Ltd.; 第二版)鉴定。
可分离与变应性个体IgE结合并能够诱导嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞的去颗粒化的DNA或cDNA文库成员,通过本领域已知的方法可测序它们的DNA或cDNA插入物。可选地,可通过本领域已知方法分离各自的文库成员表达的蛋白质和肽,并通过例如质谱或氨基酸测序分析。
DNA或cDNA文库成员可来自携带已知或未知生物物质的任意来源,所述生物物质当与个体接触时能够激发变应原性反应。因此,如本文使用的术语“变应原来源”指能够合成变应原的任意种类生物物质。
术语“肽”或“蛋白质”旨在表示由肽键连接在一起的氨基酸序列。如本文使用的“肽”指包含氨基酸的分子基本上含有最多250个氨基酸,例如最多200个氨基酸,例如最多150个氨基酸,例如最多100个氨基酸,例如最多50个氨基酸,例如最多45个氨基酸,特别是例如最多40个氨基酸,例如最多30个氨基酸,例如最多20个氨基酸,和优选地多于2个氨基酸残基。如本文使用的“蛋白质”指包含氨基酸的分子基本上含有大于250个的氨基酸。在上限以内(即约250个氨基酸),本发明可使用术语蛋白质和肽表示相同种类的分子。
变应原(能够激发个体中变应原性反应的物质)由包括植物和动物的多种生物合成。根据本发明优选的实施方案,至少一种变应原来源为动物,更具体地为哺乳动物。已知动物为变应原来源。这些变应原通常存在于动物(例如猫和狗)头垢或皮肤脱落物,以及它们的唾液和尿。例如,哺乳动物也在奶中分泌变应原。因此,哺乳动物例如母牛、马、山羊、绵羊、骆驼和水牛可包含大量变应原。用于鉴定这些变应原的cDNA或DNA可从泌乳哺乳动物中分离,其中DNA或cDNA优选地从乳腺组织中得到。
变应原的另一种来源为螨例如房尘螨、鱼、蛋(egg)等等。已知这些动物产生引发个体中变态反应的物质。
变应原的另一种来源为植物。具体来说,已知杂草和坚果产生变应原。当然树例如桦树也是变应原的来源。
DNA(例如基因组DNA和除了cDNA以外的其他种类DNA)或cDNA可通过本领域已知方法从变应原来源(例如哺乳动物奶优选牛奶或含有哺乳动物奶优选牛奶的营养制剂)得到。这些核酸分子优选地从已知或疑为产生变应原的细胞和组织中得到。然而,为了降低为鉴定变应原而有待筛选的克隆量,优选地将cDNA(cDNA分子源自mRNA)分子插入表达文库,因为这些分子反映了在各自的细胞和组织中表达的蛋白质和肽库。依照本发明,可使用任意方法从(潜在地)表达变应原的细胞中制备cDNA。这些方法对本领域技术人员来说是熟知的(参见例如Sambrook等人, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 第二版. (1989)和Ausubel, F. M.等人, "Current Protocols in Molecular Biology," (Current Protocol, 1994))。也有很多市售的获得双链cDNA的试剂盒,例如Superscript II或Superscript III试剂盒(Invitrogen, USA, 货号# 18580008), Great Lengths cDNA合成试剂盒(Clontech, USA, 货号# K-1048-1), cDNA合成试剂盒(Stratagene, USA, 货号 #200301)等等。
cDNA和DNA分子可与含有合适限制性酶识别位点的接头DNA序列连接。这些接头DNA也是本领域已知和市售的,例如,从Promega公司,USA和New England Biolabs, USA购买。cDNA和DNA分子可进一步用限制性酶消化、在柱或凝胶上按大小进行分级分离,或任意其他本领域普通技术人员已知的合适方法。
之后将cDNA和DNA文库插入表达载体,所述载体可包含编码标签的核苷酸序列,在细菌细胞中引导DNA复制的序列,在真核细胞中引导DNA转录和mRNA翻译的序列,等等。包含所述调节元件的合适表达载体为本领域已知的。如本文上述的cDNA或DNA分子可设计为直接引入或经脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒,逆转录病毒)引入细胞。一般的哺乳动物表达载体包含介导mRNA转录起始的启动子元件,蛋白质编码序列,以及转录终止和转录物多聚腺苷酸化所需的信号。此外,也可包含例如复制起点,药物抗性基因,调节子(作为诱导型启动子的一部分)的元件。lac启动子是一般的用于原核细胞的诱导型启动子,其可使用乳糖类似物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷("IPTG")诱导。用于重组表达和分泌,可连接目的cDNA或DNA分子(描述于Ghahroudi等人, 1997, FEBS Letters 414:521-526)。其他元件可包含增强子,Kozak序列和两侧为用于RNA剪接的供体和接受体位点的间插序列。可使用SV40早期和晚期启动子,逆转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复(LTR)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子实现高效转录。然而,也可使用细胞的元件(例如人肌动蛋白启动子)。可选地,重组蛋白质或肽可在含有整合至染色体的基因构建体的稳定细胞系中表达。与选择性标记例如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素的共转染允许鉴定和分离转染的细胞。表达载体优选地包括至少一种选择性标记。合适宿主的代表性实例包括但不局限于细菌细胞,例如大肠杆菌(E. coli)、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞;真菌细胞,例如酵母细胞;昆虫细胞,例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞;动物细胞,例如CHO、COS、293和黑色素瘤细胞;和植物细胞。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。将cDNA和DNA文库(特定细胞或组织的cDNA或DNA库)分子插入表达载体得到表达文库。
用于表达变应原来源的cDNA和DNA分子的表达文库优选地为噬菌体展示文库或细菌表达文库。之后将这些文库的成员(“构建体”)插入能够表达由cDNA和DNA编码的蛋白质和肽的细胞。根据用于产生cDNA和DNA文库的载体种类选择优选地细胞。如果载体设计用于细菌表达,则细胞为细菌细胞。使用本领域普通技术人员熟知的并描述于例如Sambrook等人, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)的方法(例如转化),将cDNA和DNA文库引入细胞。下一步培养细菌细胞以选择转化体和产生单个细菌菌落(克隆)是本领域所熟知的。在琼脂板上选择转化体之后,可挑出单个培养的细菌菌落并用于接种至以网格形式阵列排列的液体培养基中以形成分格的细菌原种,例如在96孔微滴定板中。此排列允许各个细菌克隆在独立的孔中典型性生长,并便于克隆的阳性得分库的后续亚选择。
特别优选使用能够将生产的蛋白质和肽分泌至细胞外部的表达文库的载体。分泌的蛋白质和肽可进一步包含使得表达的分子固定在细胞表面上的膜锚定结构域。生产这些文库的方法和方式是本领域技术人员已知的。
为了测定变应原特异性IgE分子与由cDNA和DNA文库编码的蛋白质和/或肽的结合,将至少一种蛋白质或肽固定在固体支持物上。固体支持物之后与来自患有变态反应的个体的IgE分子接触,测定所述IgE分子在所述固体支持物上的结合。
IgE与固定在固体支持物上的蛋白质和肽的结合可通过使用能够与IgE结合的抗体或其片段实现。这些抗体是本领域熟知的。
根据本发明可使用的固体支持物可为膜,优选硝酸纤维素膜。在一个特别优选地实施方案中,这些膜与琼脂板上存在的携带cDNA或DNA文库的细菌菌落接触以形成这些菌落的复制物。此复制物可用于检测变应原特异性IgE与特定菌落的结合。
负载了患有变态反应的个体的变应原特异性IgE分子的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞可用于测定由DNA或cDNA文库编码的蛋白质或肽的变应原性潜能。嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞可为任意哺乳动物来源的,其中优选使用人源化大鼠嗜碱性粒细胞白血病(RBL)细胞(例如克隆RBL-703/21)。细胞可通过引入和表达编码所有或部分的人Fc-受体的DNA,优选编码所有或部分的人IgE-受体I的DNA进行人源化。生产人源化细胞的方法是本领域已知的。优选地使用如Hoffmann等人 (在上述引文中(loc. lit.))描述的方法生产人源化细胞培养物。生产剥离的(stripped)嗜碱性粒细胞的方法描述于Kleine Budde等人 (Int Arch Allergy Immunol, 126(4))。
在鉴定了能够与变应原特异性IgE结合的蛋白质/肽之后,优选地测定如在步骤c)中测定的展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列,在步骤d)之前化学合成或重组生产至少一种能够与变应原特异性IgE结合的蛋白质或肽并可用于步骤d)。
根据本发明的一个优选地实施方案,根据本发明的方法进一步包括以下步骤,即测定在步骤e)中鉴定的至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列。
例如,可通过质谱或通过Edman降解测定由DNA或cDNA文库编码和表达的蛋白质或肽的氨基酸序列。如果使用这类方法,在氨基酸测序前必需分离由DNA或cDNA文库表达的蛋白质和/或肽。可通过本领域已知的方法实现分离。为了便于蛋白质和肽的分离,可将它们与标签(例如组氨酸标签)融合。可选地,也可能的是分离各自的DNA或cDNA克隆并测序DNA或cDNA插入物。
测定蛋白质和肽的氨基酸序列的合适方法包括但不局限于Edman降解、(串联)质谱等等(参见例如 Edman, P. Mol. Biol. Biochem. Biophys., (1970), 8: 211-255; US 6,799,121)。蛋白质和肽的氨基酸序列可与已知蛋白质的氨基酸序列比较。
如本文使用的,术语“质谱”包括多种方法,例如串联质谱、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)飞行时间(TOF)质谱、MALDI-TOF-TOF质谱、MALDI 四级杆-飞行时间(Q-TOF)质谱、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱、ESI三重四级杆质谱、ESI傅立叶变换质谱(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-离子阱-TOF,和ESI-离子阱TOF。这些质谱方法是本领域熟知的(参见例如Gary Siuzdak, “Mass Spectrometry for Biotechnology”, Academic Press, NY, (1996))。在其最基础的水平上,质谱涉及离子化分子和之后测量所得离子的质量。因为分子以熟知的方式电离,通过离子的质量一般可精确测定分子的分子量。例如,串联质谱可用于鉴定蛋白质,因为其还可提供亲本离子分子量以外的信息。串联质谱涉及首先得到目的离子的质谱,之后将那种离子片断化并得到碎片的质谱。因此串联质谱同时提供了分子量信息和裂解谱,所述裂解谱可与分子量信息组合使用以鉴定肽或蛋白质的精确序列(参见例如Hunt等人 (1986) PNAS USA 83:6233-6237; Shevchenko等人 (1996) PNAS USA 93:14440-14445; Figeys等人 (1996) Anal. Chem. 68:1822-1828和Wilm等人 (1996) Nature 379:466-469)。
如上所述,本发明的另一个方面涉及鉴定变应原性蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:提供包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,测定所述至少一种蛋白质或肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,将所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与所述至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
在本发明的另一个方面,所述方法进一步包括以下步骤,即测定由上述方法鉴定的至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列。因此,上述的鉴定变态反应性蛋白质和/或肽的本发明方法优选地应用于鉴定变态反应性奶蛋白质和/或肽。因此,所有上述定义和优选地方面也应用于本发明的此方面。
本发明的另一个方面涉及测定含有牛奶的样品的变应原性的方法,其包括以下步骤,即测定图1A、1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中的至少一种蛋白质或肽的存在。根据本申请,术语“包含哺乳动物奶优选牛奶的样品”指包含哺乳动物奶优选牛奶的食物样品或营养样品。非局限性实例为(牛)奶、凝乳、奶油、黄油、酸奶和包含任意这些的食物。在包含所述奶优选牛奶的样品中,所述至少一种蛋白质或肽以允许测定包含奶优选牛奶的样品的变应原性的量存在。通常在微克或纳克范围量的蛋白质或肽足以测定变应原性。
图1A、1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中鉴定的蛋白质或肽可用于测定含有牛奶的样品是否含有变应原性分子。如果在含有牛奶的样品中仅存在一种所述蛋白质或肽,认为样品是变应原性的。
本发明的方法特别适用于测定水解的哺乳动物奶优选牛奶的变应原性。
通过涉及抗体或其片段与图1A、1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中鉴定的蛋白质或肽的结合的免疫试验,优选地测定至少一种蛋白质或肽。
通过质谱优选地测定至少一种蛋白质和/或肽。为了鉴定含有哺乳动物奶优选牛奶的样品中存在的哺乳动物奶优选牛奶组分,可应用质谱。质谱允许鉴定如图1A、1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中鉴定的奶组分。比较样品中存在的片段与图1A、1B和1C (SEQ ID No. 22-84)以及表1A、1B和表2(SEQ ID No. 1-21)中的蛋白质和肽,可测定所述样品是否包含来自牛奶的变应原性物质。
为了得到更好的结果,在质谱前优选地分离样品中存在的蛋白质和肽。可通过电泳方法,优选双向电泳或高效液相色谱进行该分离。
在IgE结合试验(步骤c)和嗜碱性粒细胞(人源化肥大细胞)去颗粒化中筛选产物/蛋白质/肽的确提供了潜在变应原性的数据,这些方法在临床实践中使用。然而,cDNA表达文库数据为特定变应原(例如牛奶)添加了潜在变应原性肽/肽序列的完整列表。本发明组合了这些方法(对潜在变应原性结构的改进检测),实现了使用质谱验证这些潜在变应原性结构在产物矩阵(matrice)中的存在。建立的变应原性奶蛋白质和肽序列数据库与IgE反应性和去颗粒化(生物活性)的此组合应作为发展用于评估和预测含有奶的产品的变应原性的更可信、敏感和可重现方法的基础。尽管类似的方法曾用于鉴定花粉变应原(Ball等人 1994, Journal of Biological Chemistry, Vol. 269; Issue of Nov 11, p. 28323-28328),本发明的发现仍然是令人惊讶的,因为技术人员不能预料到根据Ball等人 1994教导的方法或类似的方法能够成功地应用于奶变应原。进一步来说,花粉变应原的IgE结合和其他呼吸性变应原的IgE结合关键取决于变应原中散布的氨基酸残基。因此,花粉变应原和呼吸性变应原一般组装为构象(不连续的)IgE表位。Vrtatla等人 (J. Clin. Invest, Vol 99, No 7, p. 1673-1681)显示此构象的丢失(例如在源自构象变应原的重组片段中)导致显著降低的IgE结合能力和患者嗜碱性粒细胞的组胺释放。与花粉变应原和呼吸性变应原相反,奶变应原和食物变应原一般具有非构象的未折叠表位(Järvinen等人, Int Arch Allergy Immunol, Vol 126, p. 111-118和Järvinen等人, Allergy, Vol 62, p. 758-765)。因此现有技术仅识别了来自例如奶和蛋的未折叠变应原的IgE结合。就发明者所知,没有研究显示或提示嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞的介质释放。考虑Vrtatla等人 (在上述引文中loc. lit.)的教导,技术人员应推测不具有IgE反应性的奶变应原和重组生产的变应原的片段应不具有诱导患者嗜碱性粒细胞释放组胺的能力。类似地,考虑Vrtatla等人 (在上述引文中)的教导,技术人员应推测具有IgE反应性的奶变应原和重组生产的变应原的片段应具有诱导患者嗜碱性粒细胞释放组胺的能力。因此,根据现有技术进一步检测IgE反应性奶蛋白质和肽的组胺释放不是必需的。相反地,发明者惊讶地发现只有包含IgE反应性和嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞的介质释放步骤的方法能够可信地鉴定变应原性奶蛋白质和肽。进一步注意到只有组合检测IgE反应性和介质释放能够可信地评估来自奶的蛋白质和肽的变应原性。取决于待测个体,蛋白质和肽可以诱导介质释放,或不可以诱导介质释放。因此,可区分仅展示了IgE反应性而不介导嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞的介质释放的非变应原性蛋白质和肽与变应原性蛋白质或肽(变应原)。因此,只有根据本发明的方法能够可信地评估本发明蛋白质或肽对特定个体的变应原性,即特异性区分非变应原性IgE结合。特别令人惊讶地是本发明的方法导致表1A、1B和表2 (SEQ ID No. 1-22)中指示的肽的鉴定,因为这些肽全部为非折叠肽,因此不具有构象表位。
检测潜在变应原的改进方法使用cDNA表达文库和随后的噬菌体肽表达系统,以及使用IgE结合和IgE介导的嗜碱性粒细胞去颗粒化、嗜酸性粒细胞去颗粒化或肥大细胞去颗粒化的功能性筛选来进行。此方法为开发和制造营养制剂中实现了在原材料、配料和成品中监控/筛选和预测潜在食物变应原的存在。
本文具体公开的或通过本发明描述的方法鉴定的变应原性蛋白质或肽可用于诊断个体中的变态反应或变态反应倾向,优选奶变态反应或奶变态反应倾向。因此,在本发明的一个实施方案中涉及诊断个体中的变态反应或变态反应倾向的方法,其包括对疑为变态反应或可能变成变态反应的个体施用本文具体公开的或通过本文描述的方法鉴定的至少一种变应原性蛋白质或肽,并评估个体是否对所述蛋白质或肽产生变态反应。以下描述了施用的方式和途径。
变态反应的诊断一般涉及进行皮肤或血液试验以找出什么物质或变应原可触发个体中的变态反应。通常优选皮肤试验因为它们快速,可信,一般比血液试验价格低廉,但可使用两种试验之一。用于皮肤试验,将适合量的本文具体公开的或通过本文描述的方法鉴定的至少一种变应原性蛋白质或肽置于皮上或皮下以测定是否产生了变态反应。优选3种皮肤试验:(1)皮肤针刺试验,按如下进行:将一滴含有所述至少一种变应原性蛋白质或肽的溶液(变应原溶液)置于皮肤上,通过一系列刮擦和针刺使溶液进入皮肤。如果皮肤产生红色凸起的发痒区域(称为风团),通常表示个体对变应原变态反应。这称为阳性反应。(2)在皮内试验中,将少量变应原溶液注射进皮肤。当一种物质没有在皮肤针刺试验中引起反应但仍疑为对该个体是变应原时,可进行皮内变态反应试验。(3)对于皮肤斑贴试验,将变应原溶液置于垫(pad)上并贴在皮肤上约24至72小时。此试验用于检测称为接触性皮炎的皮肤变态反应。在血液试验中,个体的变态反应可通过以下步骤测定:(i)将通过本发明方法鉴定的或本文具体公开的至少一种蛋白质或肽与来自所述个体的血液样品、血清样品或血浆样品接触,和(ii)测定所述至少一种蛋白质或肽是否与所述血液样品、血清样品或血浆样品中的IgE抗体结合,其中所述至少一种蛋白质或肽与IgE抗体的结合指示在所述个体中的变态反应或变态反应倾向;和/或(i')将通过本发明方法鉴定的或本文具体公开的至少一种蛋白质或肽与所述个体的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,和(ii'')测定所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞在与至少一种蛋白质或肽接触后是否释放了至少一种介质,或在与至少一种蛋白质或肽接触后是否去颗粒化,其中在与所述至少一种蛋白质或肽接触后所述至少一种介质的释放或在与所述至少一种蛋白质或肽接触后的去颗粒化指示在所述个体中的变态反应或变态反应倾向。
此外根据本发明的另一个实施方案,本文具体公开的或通过本发明描述的方法鉴定的变应原性蛋白质或肽可用于个体中变态反应的变应原免疫疗法。由此,本发明的一个实施方案涉及用于个体中变态反应的变应原免疫疗法的方法,其包括施用本文具体公开的或通过本文描述的方法鉴定的至少一种变应原性蛋白质或肽。优选变态反应为奶变态反应。
根据本发明,变应原免疫疗法(又称超敏疗法、免疫脱敏或变应原特异性免疫疗法)是用于变应性疾病的一种免疫疗法形式,其中患者接种递增剂量的变应原以诱导免疫耐受。变应原免疫疗法是治疗变态反应疾病根本原因的唯一治疗策略。这是高成本的有效治疗策略,引起改善的生活质量和变应性和变应原相关症状的减少。已显示免疫疗法可产生变应性症状的长期缓解,降低相关变态反应的严重性以及降低对变应原产生新的敏化的机会。这是通过调节对变应原的免疫系统响应的免疫疗法实现的。变应原免疫疗法可降低对药物的需求,症状的严重性或完全消除超敏。此外,变应原特异性免疫疗法是已知修饰变态反应疾病过程(有可能治愈疾病)的唯一治疗方案,而其他疗法仅仅抑制症状。
优选地,用于任意本文描述的用于诊断的方法或用途或用于变应原免疫疗法的方法和用途的本发明的至少一种蛋白质或肽以药物组合物存在。根据本发明,术语“药物组合物”涉及对患者优选人患者施用的组合物。本发明的药物组合物包含上述化合物。其可任选地另外包含能够改变本发明化合物特征的分子,从而例如稳定、调节和/或激活它们的功能。组合物可为固体、液体或气体形式,尤其可为粉末、片剂、溶液或气溶胶的形式。本发明的药物组合物可任选地另外包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域熟知的,包括磷酸盐缓冲液,水,乳剂例如油/水乳剂,各种湿润剂,无菌溶液,有机溶剂包括DMSO等等。包含这些载体的组合物可通过熟知的传统方法配制。这些药物组合物可对受试者以合适剂量施用。通过主治医师和临床因素决定给药方案。如在医学领域所熟知的,对任何一个患者的剂量取决于许多因素,包括患者的尺寸(patient’s size)、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。在给定情况下的治疗有效量可通过常规实验容易地测定,这是普通临床医生或医师的技能和判断力以内的。根据本发明的供使用的药物组合物可根据本领域已知方法以传统方式配制,使用一种或多种生理学载体或赋形剂,见例如Ansel等人, “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”,第7版, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999。相应地,药物组合物可经口服,胃肠外,例如皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、鞘内、经皮、经粘膜、硬膜下、经离子电渗局部地(locally or topically)、舌下、通过吸入喷雾、气溶胶或直肠等途径施用,所述药物组合物为任选地包含传统的药学上可接受赋形剂的剂量单位制剂。本发明的药物组合物可作为单独活性剂施用,或与其他试剂组合施用。
在另一个实施方案中,本发明涉及在个体中测定变态反应或变态反应倾向的方法,其包括将本文公开的或通过本文描述的方法鉴定的至少一种蛋白质或肽与从所述个体分离的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,以及当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞与至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质,或与至少一种蛋白质或肽接触后去颗粒化,则将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为在所述个体中是变应原性的。在本发明的一个优选的实施方案中,变态反应或变态反应倾向为牛奶变态反应或牛奶变态反应倾向。在本发明的另一个优选的实施方案中,这些诊断变态反应或变态反应倾向的方法还包括区分具有严重变态反应的个体和致敏但无症状的个体,和/或区分随年龄增长不再具有变态反应的个体和随年龄增长仍具有变态反应的个体。在此方面,术语“随年龄增长不再具有变态反应”指变态反应不是持续的,而是当具有变态反应的个体长大后变态反应将降低或优选地消失。在此方面,优选地,个体在儿童期随年龄增长不再具有变态反应和作为成年对象不具有变态反应。
在个体中测定变态反应或变态反应倾向的方法中的至少一种蛋白质或肽可在固体支持物(例如硝酸纤维素)上固定。固体支持物之后与从所述个体分离的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触并测定介质的释放或去颗粒化。可选地,细胞可在固体支持物上固定并与至少一种蛋白质或肽接触。此外,至少一种蛋白质或肽可为从其天然来源分离的蛋白质或肽,或由本文描述的方法制备的重组蛋白质或肽。
在另一个实施方案中,本发明涉及鉴定由至少一种表达文库的DNA或cDNA编码的IgE反应性非变应原性奶蛋白质或肽的方法,其包括以下步骤:a)提供至少一种表达文库,所述文库包含来自泌乳哺乳动物优选泌乳母牛的乳腺组织的DNA和cDNA,b)表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,c)测定所述至少一种蛋白质和肽与对哺乳动物奶优选牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,d)将如步骤c)中测定的所述展示IgE结合能力的至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触,e)测定所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞(i)在与至少一种蛋白质或肽接触后是否释放了至少一种介质,或(ii)在与至少一种蛋白质或肽接触后是否去颗粒化,和f)当所述嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞(i')在与至少一种蛋白质或肽接触后未释放至少一种介质,或(ii')在与至少一种蛋白质或肽接触后未去颗粒化时,将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为非变应原性的。在此方面,值得注意的是非变应原性奶蛋白质或肽一般可为IgE反应性的,但在与嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞接触后不触发所述细胞的介质释放或不触发所述细胞的去颗粒化。因此,可通过本发明的方法测定奶蛋白质或肽是否是变应原性的或非变应原性的。通过其IgE反应性但缺少了对这些细胞的变应原活性来确定非变应原性奶蛋白质或肽。
由根据本发明的方法鉴定的IgE反应性非变应原性奶蛋白质或肽可用于在暴露变应原之前饱和与肥大细胞结合的IgE,并可作为有用的候选物用于变态反应疾病的安全的免疫疗法。因此,本发明在另一个实施方案中涉及治疗个体中变态反应的方法,其包括对所述个体施用至少一种IgE反应性非变应原性奶蛋白质或肽。优选地至少一种IgE反应性非变应原性奶蛋白质或肽在如本文上述的药物组合物中配制。
实施例说明了本发明。参考以下实施例可最好地理解本发明的广泛范围,所述实施例无意将本发明限制在特定实施方案中。
实施例
实施例1:编码IgE反应性奶组分及其片段的cDNA序列的鉴定
为了鉴定牛奶中包含的IgE反应性蛋白质和IgE反应性蛋白质片段,首先使用泌乳母牛的乳腺组织构建了表达cDNA文库。用牛奶变应性患者的血清筛选该文库。鉴定了编码IgE反应性全长αS1-、αS2-、β-、κ-酪蛋白和β-乳球蛋白及其IgE反应性片段的cDNA。结果相当令人惊讶,在细菌系统中产生的哺乳动物蛋白质没有添加真核翻译后修饰,所述修饰有时在IgE结合中起作用,如在主要室内尘埃螨变应原中报导的(Jacquet等人, 2002)。推导的氨基酸序列显示于图1A-C(SEQ ID No. 22-84)。从得到的IgE反应性变应原片段可以得到有关IgE表位位置的结论。
试验方案
从母牛(“Fleckvieh”种)中获得牛乳腺,将新鲜的组织立即冷冻并贮存于-80℃直至使用。从组织中分离总RNA并使用cDNA合成系统获得cDNA。使用Lambda gt11/EcoR I/CIAP-Treated/Gigapack III克隆试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)将纯化的cDNA插入Lambda噬菌体。用噬菌体文库感染大肠杆菌Y1090细胞,在LB Amp板(直径145 mm)上涂板。通过应用硝酸纤维素膜 (Whatman Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)诱导细菌的蛋白质表达。吸附的蛋白质与来自CMA患者的血清孵育,用125I-标记的抗IgE抗体(IBL, Hamburg, Germany)检测结合的IgE抗体。膜在X-光胶片 (Kodak, Rochester, NY)上曝光。其中的蛋白质能够结合人IgE的阳性克隆在X-光胶片上显示为黑点(这种膜的放射自显影的实例显示于图2)。
阳性克隆的噬菌体DNA使用Lambda gt11正向引物(5’ CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA TTC 3’)和Lambda gt11反向引物(5’ GAA TTC CAG CTG AGC GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3’)扩增,将扩增的PCR产物测序。将得到的核苷酸序列与序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比较分析。
实施例2:奶组分的变应原活性和IgE反应性的差异
为了评估分子是否具有变应原潜能,不仅需要证明其IgE反应性,还需要证明其生物学活性。检测分子生物学活性的科学上认可的模型是诱导人嗜碱性粒细胞的组胺释放(Purohit 2005)。为此,使用表达人FcεRI受体α-链的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞系(Hoffmann等人, Int Arch Allergy Immunol, Vol 126(4), p. 277-285)。检测了包括不同物种的全奶提取物、奶组分(fraction)、纯化的天然和重组牛奶蛋白质和重组蛋白质片段的不同奶成分(component)(n=33)。测定了在78名患者中血清IgE抗体响应各个奶成分触发人源化RBL细胞释放β-己糖胺酶的百分比(图3)。
最有效的细胞活化成分是牛奶,具有47.4%的刺激率(图3,“奶样品”图)。但是山羊和绵羊奶的值也分别为35.9和28.2%,证明了不同物种奶蛋白质的交叉反应。在单一成分中,纯化的蛋白质酪蛋白(AC、BC、KC)和β-乳球蛋白A(BLGA)显示了最高的活性,并在25至34.6%的患者血清中触发了释放。有趣地是,重组形式的α-乳清蛋白(rALA)比其天然对应物触发了更高的释放。各个合成肽具有很低的细胞活化潜能,刺激率仅达到2.6至7.7%。比较了生物学活性与IgE反应性(表2)。
表2:奶成分的IgE结合能力和生物学活性;奶成分的IgE和变态反应活性的差异。奶成分在人RBL试验中显示了高于变应原活性的IgE反应性。
Figure 110481DEST_PATH_IMAGE001
检测的奶成分的绝大多数例如牛奶和山羊奶、纯化的天然β-乳球蛋白变体A和B(BLGA和BLGB)和重组αS1-(rAS1C)和αS2-酪蛋白(rAS2C)显示了比高至生物学活性2倍的IgE反应性百分比。所述发现可通过IgE结合表位的存在来解释,所述表位可结合IgE,但不能够交叉结合已与IgE结合的受体并触发介质的释放。仅在5种成分(重组BSA片段3(F3)、重组α-乳清蛋白(rALA)、牛酪蛋白组分(CC)、天然纯化的κ-(KC)和β-酪蛋白(BC))中,IgE反应性和生物学活性的百分比达到相似的值。合成αS1-酪蛋白衍生肽的去颗粒化程度很低,为完整蛋白质活性的1/10(Cas 3, Cas 4, Cas 5)至1/4(Cas 2, Cas 6)。
发现许多IgE反应性αS1-酪蛋白肽在嗜碱性粒细胞释放试验中不能诱导去颗粒化,因此代表了IgE反应性半抗原。因此,这些肽(半抗原)是非变应原性的。此结果暗示单独的IgE检测可能导致有关变应原性评估的假阳性结论。另一方面,IgE反应性半抗原可作为治疗剂用于在变应原暴露前饱和结合IgE的肥大细胞,并可作为有用的候选物用于变态反应疾病的安全免疫疗法。进一步鉴定了结合IgE并触发嗜碱性粒细胞释放的αS1-酪蛋白衍生肽,鉴定了少量对一些肽不显示IgE反应性但被这些肽诱导了嗜碱性粒细胞去颗粒化的患者血清。后一结果可解释为嗜碱性粒细胞释放试验的更高敏感性。
总之,IgE反应性和生物学活性的测量比较表明患者血清在IgE结合中显示比诱导嗜碱性粒细胞去颗粒化中更高的能力。变应原性试验反映了分子引起变态反应症状的潜能的这一事实暗示单独测量IgE反应性不能用于确定地鉴定变应原性组分,还需要通过生物学试验补充。
2种试验(IgE结合能力和生物学反应性的评估)的组合允许建立含有可通过质谱检测的变应原性蛋白质/片段/肽的数据库。图4显示了代表这种数据库原型的变应原性奶肽和蛋白质序列的列表。列出了在血清IgE反应性和变应原活性中检测的奶成分。列出了有关变应原名称、以千道尔顿(kDa)为单位的分子量(MW)、变应原功能和制备以及参考的信息。
试验方案
使用了78位患者的血清,根据阳性病历、阳性皮肤针刺反应和使用CAP-FEIA系统(Phadia, Uppsala, Sweden)对牛奶提取物的特异性IgE测定挑选患者。从奥地利、德国、意大利、西班牙和法国的5位成人和73位儿童(30位女性和43位男性)处得到血清。
纯化的蛋白质和酪蛋白组分购自Sigma Aldrich (St. Louis, US)。重组蛋白质和重组BSA片段在大肠杆菌中如(Vrtala等人, 1997)所述表达。αS1-酪蛋白肽在Applied Biosystems肽合成仪433A型号上如 (Focke等人, 2001)所述合成。
人源化大鼠嗜碱性粒细胞白血病(RBL)细胞(克隆RBL-703/21)与50 µl人血清(1:10稀释)在微滴定板中于37℃ (7% CO2, 95%湿度)孵育过夜。之后清洗细胞并暴露于在含有50% D2O 和0.1 % BSA/HAS的Tyrodes缓冲液中稀释至0.3 µg/ml蛋白质的奶组分,37℃ (7% CO2, 95%湿度)1小时。也评估了细胞的自发释放。最后,将细胞上清与50 µl测定溶液(0.1 M柠檬酸或柠檬酸钠,pH 4.5, 160 µM 4-甲基伞形酮酰-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷)在新的微滴定板中于37 ℃ (7 % CO2, 95 %湿度)孵育1 h。每孔加入100 µl甘氨酸缓冲液终止反应,使用荧光微板读数仪在λex: 360和λem: 465处测量荧光。各样品的具体己糖胺酶释放使用以下公式计算:[(FlS – FlSp) : (FlZ – FlSp)] x 100(其中 Fls为样品的荧光;FlSp为自发释放的荧光,FlZ是总释放的荧光)。
实施例3:质谱鉴定奶样品和奶衍生产品中具有或不具有变应原活性的蛋白质和/或肽
通过IgE反应性和变应原活性的组合建立的变应原性奶蛋白质和肽的序列数据库可作为基础用于建立评估和预测奶样品和奶衍生产品的变应原性的可信的、可重现的分析方法。使用质谱检测复合奶样品中的潜在变应原性成分。作为实例,应用质谱和上游高效液相色谱(HPLC)的组合分析市售的高度水解的低变应原性奶配制品。图5显示了色谱分析,提取的质谱证明所有蛋白质已被水解为最大长度为14个氨基酸的小肽。
具体来说,图5显示了水解奶配制品的分离,其使用纳米液相色谱和之后的电喷射离子化MS来进行。展示了1µg水解奶样品的总离子色谱。x-轴显示了保留时间,y-轴显示了以cps(每秒计数)为单位的信号强度。
使用MASCOT搜索算法的数据库搜索结果鉴定出一些小肽,其中3种被鉴定为奶衍生变应原,称为β-酪蛋白(Bos d 8 β,图6)。在图6中描述了MASCOT搜索和在水解牛奶中的β-酪蛋白衍生肽的鉴定。顶部描述了在质谱中唯一鉴定的奶变应原β-酪蛋白及其分子量和计算的pI。下面给出了搜索参数和得到的β-酪蛋白序列覆盖率。底部展示了β-酪蛋白序列,匹配的肽打印为加粗字母。鉴定的β-酪蛋白变应原具有以下肽匹配:HQPHQPLPPT (计算的质量为1.25 kDa, 对应β-酪蛋白的aa160-170), VYPFPGPIPN (计算的质量为1.19 kDa, 对应β-酪蛋白的aa74-84), SSSEE (计算的质量为0.65 kDa, 对应β-酪蛋白的aa31-36), 和PVVVPP (计算的质量为0.87 kDa, 对应β-酪蛋白的aa96-103)。在图7中显示了这些肽的IgE反应性检测(表1:cas b-1, 2, 3和4;图7)。在水解牛奶中鉴定的β-酪蛋白衍生肽不是IgE反应性的。通过点印迹试验分析了在硝酸纤维素上点样的牛奶(CM)、重组β-酪蛋白(rBC)、合成的β-酪蛋白衍生肽(cas b-1, cas b-2, cas b-3, cas b-4)和重组αS1-酪蛋白(rAS1C)的IgE反应性。结合在硝酸纤维素上的奶组分与来自3个牛奶变应性患者(1,2和3道)和非变应性个体(C道)的血清孵育。结合的IgE抗体使用125I-标记的抗IgE抗体检测。此图和这些结果显示它们代表非变应原性肽,即它们太短了而无法结合IgE抗体,可以与如IgE反应性和变应原性牛奶衍生肽/蛋白质数据库中定义的变应原性和IgE反应性肽区分。此外,它们与公开的β-酪蛋白的主要IgE结合区(aa 1-16, aa 83-92, aa 135-144; Chatchatee 2001)不同。在水解奶样品中没有检测到通过cDNA表达文库筛选得到的其他IgE反应性奶变应原和变应原片段(图1),因此可将其鉴定为非变应原性制剂。因此证明了使用高度水解奶可使用LC-MS分析鉴定非变应原性奶制剂/样品。
表1. A)αS1-酪蛋白和BSA片段的合成肽。列出了肽的名称、其氨基酸序列、长度、pI和以kDa为单位的分子量。
序列 长度 (aa) pI MW (kDa)
Cas1 RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVC 32 8.22 3.75
Cas2 FGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAES 33 4.18 3.70
Cas3 ISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYEQLLRC 36 4.80 4.21
Cas4 CLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKE 34 8.14 3.96
Cas5 CPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYV 35 4.14 4.24
Cas6 PLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLWC 33 3.92 3.60
BSA F1 MRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLTSSHHHHHH 190 5.95 23.9
BSA F2 MARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEHHHHHH 189 5.94 22.6
BSA F3 MPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALAHHHHHH 200 7.54 23.4
B)β-酪蛋白的合成肽。列出了肽的名称、其氨基酸序列、长度、pI和以kDa为单位的分子量。
序列 长度 (aa) pI MW (kDa)
cas b-1 HQPHQPLPPTV 11 6.92 1.25
cas b-2 VYPFPGPIPNS 11 5.49 1.19
cas b-3 LSSSEE 6 4.24 0.65
cas b-4 PVVVPPFL 8 5.96 0.87
试验方案:
使用连接至HCT-Ultra质谱仪(Bruker Daltonik, Germany)的纳米喷雾界面(nanospray interface)的纳米液相色谱系统(Ultimate, LC Packings Dionex, The Netherlands)通过反相HPLC分析水解的奶配制品。得到的质谱在SwissProt蛋白质数据库上使用MASCOT (Matrix Science, London, United Kingdom)软件搜索算法搜索。在点印迹分析中,将1 µg蛋白质点样至硝酸纤维素上,并与以1:20稀释在PBST(PBS, 0.5% v/v Tween 20)中的奶变应性患者血清孵育。使用1:15稀释的125I-标记的抗人IgE抗体 (IBL, Germany)检测结合的IgE抗体。
实施例4:牛α-乳清蛋白(ALA)的表位作图以鉴定IgE反应性ALA衍生肽
方法
ALA衍生肽的合成:表1中展示的ALA衍生肽(Lac1-Lac8)使用Fmoc(9芴甲氧羰基)策略和HBTU[(2-/1H-苯并三唑-1-基)1,1,3,3四甲基脲六氟磷酸酯]活化(0.1 mmol小规模循环)在Applied Biosystems肽合成仪433A型号 (Foster City, CA)上合成,如(Focke等人, Faseb J 15:2042-2044)所述纯化。
ALA衍生肽的IgE反应性检测:ALA衍生肽的IgE反应性通过如(Schulmeister等人, J Immunol. 182(11):7019-29)所述的微阵列分析来测定。简言之,将奶成分点样在置于普通显微镜载玻片上的毛细流动膜上,与25µl患者血清孵育。结合的IgE抗体使用荧光缀合的抗IgE抗体在670nm波长下检测。各患者的临界水平设定为用人血清白蛋白得到的个体值的2倍值。
结果
具有IgE抗体反应性的ALA表位的鉴定
为了鉴定ALA的IgE反应性表位,我们合成了覆盖ALA序列的8个肽(表2)。这8个肽具有19-20个氨基酸的长度和5个氨基酸的重叠。通过微阵列分析使用36位显示对rALAc具有IgE反应性的患者的血清评估了8个重叠肽的IgE反应性。我们发现30.6%的患者对Lac1有反应,33.3%对Lac2有反应,5.6%对Lac4有反应,2.8%对Lac5、Lac6和Lac7有反应,以及11.1%对Lac8有反应(表3)。总之,在36位对rALAc具有IgE反应性的患者中,共有19位与至少一种ALA衍生的合成肽有反应。
表2. 合成的ALA衍生肽a
序列 长度 (aa) pI MW (kDa)
Lac1 EQLTKCEVFRELKDLKGYG 19 6.34 2.26
Lac2 LKGYGGVSLPEWVCTTFHTS 20 6.74 2.18
Lac3 TFHTSGYDTQAIVQNNDSTE 20 4.31 2.23
Lac4 NDSTEYGLFQINNKIWCKDD 20 4.42 2.40
Lac5 WCKDDQNPHSSNICNISCDK 20 5.30 2.31
Lac6 ISCDKFLDDDLTDDIMCVKK 20 4.11 2.32
Lac7 MCVKKILDKVGINYWLAHKA 20 9.52 2.33
Lac8 LAHKALCSEKLDQWLCEKL 19 6.74 2.23
a表中使用的缩写:Lac1-Lac8,ALA衍生肽1-8;aa,氨基酸;pI,等电点;MW,分子量;kDa,千道尔顿。
表3. α-乳清蛋白衍生肽的IgE结合能力,使用36位对rALAc具有IgE反应性的患者的血清测试。
n=36 IgE结合 (患者的%)
重组ALA rALA 100.0
合成的ALA 肽 Lac1 30.6
Lac2 33.3
Lac3 0
Lac4 5.6
Lac5 2.8
Lac6 2.8
Lac7 2.8
Lac8 11.1
本发明还包含以下项(item):
1. 鉴定由DNA或cDNA表达文库编码的变应原性蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:
a) 提供包含来自至少一种变应原来源的DNA或cDNA的至少一种表达文库,
b) 表达由所述表达文库编码的至少一种蛋白质或肽,
c) 测定所述至少一种蛋白质或肽与对所述至少一种变应原来源敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,
d) 将如步骤c)中测定的展示IgE结合能力的所述至少一种蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞或肥大细胞接触,以及
e) 当所述嗜碱性粒细胞与步骤d)的至少一种蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将所述至少一种蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
2. 根据第1项的方法,其中所述至少一种变应原来源为动物。
3. 根据第2项的方法,其中所述动物为哺乳动物。
4. 根据第3项的方法,其中所述哺乳动物为母牛。
5. 根据第3项的方法,其中所述哺乳动物为猫。
6. 根据第3项的方法,其中所述哺乳动物为狗。
7. 根据第2项的方法,其中所述哺乳动物为泌乳哺乳动物,且所述DNA或cDNA从乳腺组织中得到。
8. 根据第2项的方法,其中所述动物为螨。
9. 根据第1项的方法,其中所述动物为鱼。
10. 根据第2项的方法,其中所述变应原来源为蛋。
11. 根据第1项的方法,其中所述至少一种变应原来源为植物。
12. 根据第11项的方法,其中所述植物为杂草。
13. 根据第11项的方法,其中所述植物为坚果。
14. 根据第11项的方法,其中所述植物为树。
15. 根据第1项的方法,其中所述表达文库为噬菌体展示文库或细菌表达文库。
16. 根据第1项的方法,其中所述IgE结合能力通过下述测定:将所述至少一种蛋白质或肽固定在固体支持物上,将所述固体支持物与IgE接触并在所述固体支持物上检测IgE的结合。
17. 根据第1项的方法,其中所述嗜碱性粒细胞为人源化大鼠嗜碱性粒细胞白血病(RBL)细胞 (克隆RBL-703/21)。
18. 根据第1项的方法,其中在步骤d)之前测定如步骤c)中测定的展示IgE结合能力的所述至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列,并化学合成或重组生产所述至少一种蛋白质或肽。
19. 根据第1项的方法,其中所述方法还包括下述步骤:测定在步骤e)中鉴定的所述至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列。
20. 根据第19项的方法,其中所述氨基酸序列通过质谱测定。
21. 根据第19项的方法,其中所述氨基酸序列通过Edman降解测定。
序列表
<110> Valenta, Rudolph
Van Tol, Ric
Herz, Udo
Focke-Tejkl, Margarete
Hochwallner, Heidrun
Schulmeister, Ulrike
Swoboda, Ines
<120> 鉴定变应原性蛋白质和肽的方法
<130> R2869 PCT
<150> US 61/196,417
<151> 2008-10-17
<160> 84
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 牛(Bos taurus)
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<213> 牛
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Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
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Cys
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<211> 205
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Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile
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35 40 45
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50 55 60
Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu
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100 105 110
Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn Thr
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Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys Gln
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Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro
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Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Asp Asn Gln Asp Thr Ile Ser
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Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
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Leu Lys Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr Thr
1 5 10 15
Phe His Thr Ser
20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛
<400> 16
Thr Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Gln Asn Asn
1 5 10 15
Asp Ser Thr Glu
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛
<400> 17
Asn Asp Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp
1 5 10 15
Cys Lys Asp Asp
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛
<400> 18
Trp Cys Lys Asp Asp Gln Asn Pro His Ser Ser Asn Ile Cys Asn Ile
1 5 10 15
Ser Cys Asp Lys
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛
<400> 19
Ile Ser Cys Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met
1 5 10 15
Cys Val Lys Lys
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛
<400> 20
Met Cys Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Val Gly Ile Asn Tyr Trp Leu
1 5 10 15
Ala His Lys Ala
20
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 牛
<400> 21
Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Ser Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys
1 5 10 15
Glu Lys Leu
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 牛
<400> 22
Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg
1 5 10 15
Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn
20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly
35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr
50 55 60
Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile
65 70 75 80
Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile
85 90 95
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Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala
130 135 140
Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe
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Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro Ser
165 170 175
Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys
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Thr Thr Met Pro Leu Trp
210
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<212> PRT
<213> 牛
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Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg
1 5 10 15
Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn
20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln
100 105 110
Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val
115 120
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<213> 牛
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Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg Pro Lys His Pro Ile Lys
1 5 10 15
His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe
20 25 30
Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu
35 40 45
Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro
85 90 95
Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys
100 105 110
Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg
115 120 125
Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met
130 135 140
Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg
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Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val
165 170 175
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180 185 190
Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
195 200 205
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<213> 牛
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Val Ala Leu Ala Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro
1 5 10 15
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20 25 30
Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile
35 40 45
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65 70 75 80
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Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln
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Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys
115 120 125
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<213> 牛
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1 5 10 15
Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu
20 25 30
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35 40 45
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Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys
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Pro Leu Trp
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<213> 牛
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
165
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<213> 牛
<400> 30
Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
<210> 31
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 31
Glu Ala Glu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val
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20 25 30
Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln
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100 105 110
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<213> 牛
<400> 32
Glu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln
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<212> PRT
<213> 牛
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115 120 125
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<213> 牛
<400> 34
Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu
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<213> 牛
<400> 35
Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr
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Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu
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<213> 牛
<400> 36
Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro
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<213> 牛
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Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile
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<212> PRT
<213> 牛
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Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu
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<213> 牛
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<213> 牛
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His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile
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<213> 牛
<400> 41
Met Lys Glu Gly Ile His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val
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<213> 牛
<400> 42
Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe
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<213> 牛
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65
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<213> 牛
<400> 44
Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp
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<213> 牛
<400> 45
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<213> 牛
<400> 46
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 47
Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 48
Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg Pro Lys His Pro Ile
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Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg
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Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln Lys Glu Asp Val
85 90 95
Pro
<210> 49
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 49
Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val
20 25 30
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Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln
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Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys
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Glu Gly Ile His
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 50
Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His
20 25 30
Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu
35 40 45
Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln
50 55 60
<210> 51
<211> 45
<212> PRT
<213> 牛
<400> 51
Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn
1 5 10 15
Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg
20 25 30
Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys
35 40 45
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 52
Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg
1 5 10 15
Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn
20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly
35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr
50 55 60
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Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile
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<212> PRT
<213> 牛
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Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly
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50 55 60
Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Ser Met Lys Glu Gly Ile
115 120 125
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130 135 140
Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr
145 150 155 160
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<213> 牛
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50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Gln Lys Phe Pro Gln Tyr Leu Gln Tyr Leu Tyr Gln Gly Pro Ile
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<213> 牛
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Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg
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<213> 牛
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Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg
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<213> 牛
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Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg
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<213> 牛
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Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg
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65
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<213> 牛
<400> 65
Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg
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65
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 66
Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu
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Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser Leu Ser Ser
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<400> 67
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<213> 牛
<400> 68
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<213> 牛
<400> 69
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50
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<213> 牛
<400> 70
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<213> 牛
<400> 71
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<213> 牛
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50 55 60
Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys Lys
65 70 75 80
Asp Asp Gln Asn Pro His Ser Ser Asn Ile Cys Asn Ile Ser Cys Asp
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Lys Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met Cys Val Lys Lys
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Ile Leu Asp Lys Val Gly Ile Asn Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu
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Cys Ser Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
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<210> 83
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 83
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Leu Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu
65 70 75 80
Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu
85 90 95
Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala Asp
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Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser His
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Ile Ala Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys
690 695 700
Ala Phe Leu Thr Arg
705

Claims (7)

1.一种鉴定变应原性母牛奶αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质和/或肽的方法,其包括以下步骤:
a) 提供包含来自泌乳母牛乳腺组织的DNA或cDNA的至少一种表达文库,
b) 表达由所述表达文库编码的至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质或肽,
c) 测定所述至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质或肽与对牛奶敏感的个体的至少一种血清的IgE的结合能力,
d) 将如步骤c)测定的展示IgE结合能力的所述至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质或肽与嗜碱性粒细胞或肥大细胞接触,以及
e) 当所述嗜碱性粒细胞或肥大细胞与步骤d)的至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质或肽接触后释放至少一种介质时,将所述至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质或肽鉴定为变应原性的。
2.根据权利要求1的方法,其中所述方法还包括下述步骤:测定在步骤e)中鉴定的所述至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质或肽的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的方法,其中所述至少一种αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质和/或肽的存在通过质谱测定。
4.根据权利要求1的方法,其中在质谱前分离所述样品中存在的αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质和/或肽。
5.根据权利要求4的方法,其中所述样品中的存在的αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质和/或肽通过电泳方法分离。
6.根据权利要求5的方法,其中所述电泳方法为双向电泳。
7.根据权利要求4的方法,其中所述样品中的存在的αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白蛋白质和/或肽通过高效液相色谱分离。
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