CZ2011223A3 - Zpusob detekce alergenních proteinu a peptidu - Google Patents

Abstract

Predložené rešení se týká zpusobu detekce alergenních proteinu a peptidu. Presneji rešení poskytuje zpusob detekce alergenních mlécných proteinu a/nebo peptidu a zahrnuje kroky opatrení nejméne jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozené z tkáne mlécné žlázy kojícího savce, výhodne kojící krávy, exprimující nejméne jeden protein nebo peptid kódovaný uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméne jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméne jednoho séra jedince citlivého na savcí mléko, výhodne kravské mléko, kontakt nejméne jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu, jak je uvedeno v kroku c) u bazofilu, eozinofilu nebo mastocytu a detekci nejméne jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v prípade, že bazifily, eozinofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméne jedním proteinem z kroku d) uvolní nejméne jeden mediátor.

Description

[0001] Vynález se týká způsobu detekce alergenních proteinů a peptidů. Přesněji, vynález poskytuje způsob detekce alergenních mléčných proteinů a/nebo peptidů zahrnující kroky: opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozené z tkáně mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, exprimující nejméně jeden protein nebo peptid kódovaný uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidů k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidů vykazujícího IgE vazebnou kapacitu, jak je uvedeno v kroku c) u bazofílů, eozinofilů nebo mastocytů a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidů jako alergenního v případě, že bazofily, eozinofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem v kroku d) uvolní nejméně jeden mediátor.

V popisu je uvedeno mnoho odkazů na dokumenty včetně patentových přihlášek a výrobních popisů. Tyto dokumenty, které nejsou považovány za relevantní z hlediska patentovatelnosti vynálezu, jsou zde v celé šíři zahrnuty odkazem. Přesněji, všechny dokumenty uváděné v odkazech jsou zahrnuté odkazem ve stejném rozsahu, jako by byl uveden v odkazech každý jednotlivě. Žádný z těchto dokumentů se nepovažuje za stav techniky vzhledem k vynálezu.

PODSTATA VYNÁLEZU

[0002] Přibližně 2-8 % dětí mladších 3 let a přibližně 2 % dospělé populace jsou postižena potravinovými alergiemi. Přibližně 80 % alergických reakcí u dětí je výsledkem alergie na kravské mléko (CM), na slepičí vejce a luštěniny (např. arašídy a sojové boby). U dospělé populace však alergie na ovoce, arašídy a ořechy stromů představují nejčastěji se vyskytující alergii.

[0003] Kravské mléko patří mezi jednu z prvních potravin dětské stravy, a proto je jednou z nejčastějších příčin potravinové alergie u dětí. Přibližně 2,5 % novorozenců má nežádoucí reakce na kravské mléko v prvním roce života.

[0004] Symptomy alergie na kravské mléko (CMA) jsou akutního nebo opožděného typu a v rozsahu od mírných po závažné reakce zahrnující kůži, respirační aparát, gastrointestinální trakt a v nej horším případě se projevují jako život ohrožující systémové reakce (anaíylaxe). Na rozdíl od buňkami zprostředkovaného opožděného typu reakcí jsou akutní reakce způsobené tvorbou protilátek imunoglobulinu E (IgE) jako reakce na jinak neškodné antigeny (hypersenzitivita typu I). Interakce protilátek IgE s alergenní molekulou vede ke specifické aktivaci elektorových buněk (mastocytů, bazofilů, granulocytů) a následnému uvolnění zánětlivých mediátorů, jako například histaminu, prostaglandinu a leukotrienu, které jsou zodpovědné za akutní typ alergických reakcí.

[0005] Kravské mléko obsahuje 25 proteinů a některé z nich jsou známé jako alergenní. Působením chymozinu (renin) nebo okyselením mléka na pH 4,6 se získají dvě frakce: dvacet procent proteinů se nachází v syrovátkové frakci a 80 % proteinů obsahuje kaseinová frakce. Alergenní molekuly jsou obsaženy u obou frakcí a považují se za významné nebo méně významné alergeny v závislosti na výskytu uváděných alergických reakcí v populaci CMA.

[0006] Významnými alergeny přítomnými v kravském mléku jsou alfa-laktalbumin, betalaktoglobulin, alfaSl-kasein, beta-kasein a kapa-kasein. Méně významnými alergeny přítomnými v kravském mléku jsou alfaS2-kasein, laktoferin, hovězí sérový albumin a imunoglobulin.

[0007] Alfa-laktalbumin (Bos d4), beta-laktoglobulin (Bos d5), imunoglobuliny (Bos d7), BSA a laktoferin jsou dobře známé IgE-reaktivní složky syrovátky. AlfaSl-kasein, alfaS2kasein, beta-kasein a kapa-kasein jsou silné alergeny v kaseinové frakci (Bos d8), (Wal, 2004).

[0008] Beta-laktoglobulinová (BLG) a alfa-laktalbuminová (ALA) frakce syrovátky se považují za hlavní alergeny. Beta-laktoglobulin globulámí a velmi stabilní protein, který patří k lipokalinům, proteinové superrodině. která váže hydrofobní ligandy. Jiné alergeny, jako hlavní psí alergeny Can fl a Can f2 a alergeny jiné srstnaté zvěře (kůň, kočka a morče) patří také k této superrodině. Beta-laktoglobulin se přirozeně vyskytuje v dimemí formě o molekulové hmotnosti 36 kDa. Existují dvě hlavní izoformy beta-laktoglobulinu, genetické varianty A (BLGA) a B (BLGB), které se liší v aminokyselinách 64 a 118 (kyselina asparágová a valin u BLGA, glycin a alanin u BLGB). Stabilita a skutečnost, že betalaktoglobulin patří k rodině lipokalinů může vysvětlovat vysoký alergenní potenciál této molekuly.

2+

[0009] Alfa-laktalbumin je 14 kDa kyselý monomer vážící Ca stabilizovaný čtyřmi disulfidickými můstky, jde o regulátorovou složku v galaktosyltransferázovém systému, který syntetizuje laktózu. Sekvenční analýza prokázala vysokou sekvenční homologii aminokyselin s lidským alfa-laktalbuminem (hALA) a lysozymem slepičího vejce; hlavním alergenem slepičího vejce. Alergenicitu alfa-laktalbuminu je možné vysvětlit jeho stabilitou.

[00010] V suspenzi proteinů kaseinové frakce tvoří uspořádané agregáty (micely) s konstantním rozměrem jednotlivých molekul: alfaSl- a alfaS2-kasein každá 37 %, beta a kapa-kaselin každá 13 %. Čtyři kaseinové molekuly mají nízkou primární strukturní homologii, mají různé funkční vlastnosti, ale všechny jsou fosforylované proteiny s reomorfní, vysoce hydratovanou terciární strukturou, které mohou být snadno degradovány některými proteázami. l ato senzitivita k protcolytickému štěpení je poněkud nezvyklou charakteristikou důležitého alergenu. Kaseiny kravského mléka sdílejí až 90% sekvenční homologii aminokyselin s kaseiny savců, jako například kozy a ovce. Tato sekvenční homologie může být důvodem často se vyskytující křížové reaktivity mezi kravským mlékem a mlékem jiných zvířat.

|00011] Vynález vychází z potřeby nalezení metody umožňující detekovat alergenní proteiny a peptidy přítomné v biologickém zdroji. Vynález proto také vychází z potřeby poskytnutí metody umožňující detekovat nealergenní proteiny a peptidy přítomné v biologickém zdroji, přesněji v mléku savce a zejména kravském mléku a nutričních formulacích obsahujících toto mléko. Vynález také poskytuje prostředky a způsoby diagnostiky a léčby alergie u jedince.

PODSTATA VYNÁLEZU

[000121 Předmět vynálezu se týká způsobu detekce alergenních mléčných proteinů a peptidů zahrnující kroky opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou z mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peplidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou , stanovení vazebné kapacity uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu k bazofilům, eozinofilům nebo mastocytům a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Jiným předmětem vynálezu je způsob detekce nejméně jednoho alergenního mléčného proteinu nebo peptidu, který zahrnuje krok opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou z mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, expresi alespoň jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu k bazofilům, eozinofilům nebo mastocytům a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Vynález se tak týká výše uvedeného způsobu, kde alergenní proteiny a peptidy jsou mléčné alergenní proteiny a peptidy, nejméně jedna expresní knihovna obsahuje DNA nebo cDNA odvozenou od prsní tkáně kojícího savce, výhodně kojící krávy a jedinec citlivý k alergennímu zdroji je jedinec, který je citlivý na savčí mléko, výhodně kravské mléko.

[00013] Podle dalšího předmětu podle vynálezu může způsob podle vynálezu dále zahrnovat krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného podle tohoto způsobu.

[00014] Vynález také uvádí způsob detekce alergenních proteinů a/nebo peptidů kódovaných DNA nebo cDNA expresní knihovnou zahrnující krok opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od nejméně jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj, zejména savčí mléko, výhodně kravské mléko, a nutriční formule obsahující savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Vynález tak poskytuje způsob detekce alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidu kódovaného DNA nebo cDNA expresní knihovnou zahrnující krok opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od alespoň jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo pcptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj, kontakt alespoň jednoho proteinu nebo pcptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofíly, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofíly, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem.

[00015] Další předmět vynálezu se týká způsobu detekce alergenních proteinů a peptidů ve vzorku obsahujícím kravské mléko zahrnující krok detekce přítomnosti nejméně jednoho proteinu nebo pcptidu podle obrázků 1Λ, IB a 1C (SEQ ID č. 22-84) a tabulek 1A, IB a tabulky 2 (SEQ ID č. 1-21).

[00016] Savčím mlékem, výhodně kravským mlékem, může být hydrolyzované savčí mléko, výhodně hydrolyzované kravské mléko. Přítomnost nejméně jednoho proteinu nebo peptidu je dále možné stanovit hmotnostní spektrometrií. Výhodně, proteiny a peptidy přítomné ve vzorku se izolují před hmotnostní spektrometrií. Proteiny a peptidy je možné izolovat elektroforetickou metodou nebo vysoko účinnou kapalinovou chromatografií. Výhodně, elektroforetickou metodou může být dvojdimenzionální elektroforéza.

]00017| Jiný předmět vynálezu se týká proteinu nebo peptidu detekovaného způsobem podle vynálezu. Další předmět vynálezu se týká proteinu nebo peptidu vybraného z obrázků 1A, IB, 1C (SEQ ID č. 22-84), tabulek 1 A, 1B nebo tabulky 2 (SEQ ID č. 1 -21 ).

[00018] Jiný předmět vynálezu se týká nejméně jednoho proteinu nebo peptidu pro použití v diagnostice alergie nebo predispozice k alergii u jedince. Alergií je výhodně alergie na mléko.

[00019] Jiný předmět podle vynálezu se týká způsobu diagnostiky alergie nebo predispozice k alergii u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho uvedeného proteinu nebo peptidu jedinci s předpokladem alergie nebo vývinem alergie a stanovení, zda jedinec rozvine alergickou reakci proti tomuto proteinu nebo peptidu.

[00020] Podle předmětu podle vynálezu je výhodné, když v případě alergie nebo predispozice k alergii se jedná o alergii na mléko nebo predispozici k alergii na mléko. Způsob podle tohoto předmětu výhodně zahrnuje navíc provedení kožního testu a/nebo krevního testu. Kožní test výhodně zahrnuje (i) kožní prick test, (ii) intradermální test, (iii) kožní náplasťový test nebo (iv) jakoukoli kombinaci testů (i) až (iii), kde pozitivní výsledek testů (i) až (iv) je indikací alergie nebo predispozice k alergii u jedince. Krevní test výhodně zahrnuje kroky (i) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo pcptidu podle vynálezu se vzorkem krve, vzorkem séra nebo plazmy uvedeného jedince a (ii) stanovení zda uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se váže k protilátce IgE v uvedeném vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k protilátce IgE indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince; a/nebo (i') kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle vynálezu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty u jedince a (ii') stanoveni, zda bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nejméně jeden mediátor nebo degranulují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem, kde uvolnění nejméně jednoho uvedeného mediátoru po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo dcgranulacc po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince.

|00021| Další předmět podle vynálezu se týká nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle vynálezu pro použití u alergenové imunoterapie alergie u jedince. Alergií jc výhodně alergie na mléko.

[00022] Ještě další předmět vynálezu se týká způsobu alergenové imunoterapie alergie u jedince s alergií zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle vynálezu. Alergií je výhodně alergie na mléko.

[00023] Ještě jiný předmět podle vynálezu se týká způsobu detekce alergie nebo predispozice k alergii u jedince, kde způsob zahrnuje a) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle vynálezu se vzorkem krve, vzorkem sera nebo plazmy, kde vzorek krve, vzorek séra nebo plazmy je nebo byl izolován z uvedeného jedince a b) stanovení, zda uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se váže k protilátce IgE v uvedeném vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k protilátce IgE indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince; a/nebo a ) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle vynálezu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty, kde uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty jsou nebo byly izolovány z uvedeného jedince a b) stanovení, zda bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i) uvolňují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nejméně jeden mediátor nebo (ii) degranulují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem, kdy uvolnění nejméně jednoho uvedeného mediátoru po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince.

[00024] Podle tohoto předmětu podle vynálezu je výhodné, pokud alergií nebo predispozicí k alergii je alergie na mléko nebo predispozice k alergii na mléko. Výhodně způsob podle vynálezu dále zahrnuje odlišení jedinců se závažnou alergií od jedinců, kteří jsou citliví, ale asymptomatičtí, a/nebo odlišení jedinců, u kterých alergie s věkem pominula, od jedinců, u kterých alergie s věkem nepominula.

[00025] Další předmět podle vynálezu se týká způsobu detekce IgE-reaktivního nealergenního mléčného proteinu nebo peptidu kódovaného DNA nebo cDNA nejméně jedné expresní knihovny zahrnující krok a) opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, b) expresi alespoň jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, nejlépe kravské mléko, d) kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE s vazebnou kapacitou jak je uvedeno v kroku c) s bazofily, eozinofily nebo mastocyty, e) stanovení, zda s bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem uvolňují alespoň jeden mediátor nebo (ii) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují a f) detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako nealergenního, pokud bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i') po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem neuvolňují alespoň jeden mediátor nebo (ii¹) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nedegranulují.

|00026] Podle tohoto předmětu podle vynálezu nejméně jeden protein nebo peptid detekovaný způsobem podle vynálezu nebo uvedený ve vynálezu se použije k léčbě alergie. Vynález uvádí také způsob léčby alergie u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu stanoveného způsobem podle vynálezu nebo uvedeného ve vynálezu.

[00027] U všech uvedených provedení podle vynálezu je výhodné, pokud uvedeným jedincem nebo pacientem je člověk. Eozinofily, mastocyty nebo bazofily jsou vždy savčí a mohou být lidského původu. Obecně, pojem „kojící savec“ zahrnuje savce druhu kozy, ovce, koně, buvola, velblouda, ale neomezující se na ně. Kráva je zvláště výhodným druhem.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

[00028] Obrázek 1A ukazuje předpokládanou aminokyselinovou sekvenci cDNA kódující IgE-reaktivní alfaSl- a alfaS2-kasein celé délky a [gE-reaktivní alfaSl- a alfáS2-kaseinové fragmenty. Aminokyselinové sekvence alfaSl- a alfaS2- kaseinu jsou uvedeny nahoře. Sekvence IgF.-reaktivních alfaSl- a alfaS2-kaseinových fragmentů (čísla klonů na pravém okraji) jsou uvedeny na řádcích. Čísla uvádějí první a poslední aminokyselinu každého klonu.

[00029] Obrázek 1B ukazuje předpokládané aminokyselinové sekvence cDNA kódujících IgE reaktivní kapa-kasein a beta-laktoglobulin celé délky a IgE-reaktivní fragmenty těchto proteinů.

[00030] Aminokyselinové sekvence beta-, kapa-kaseinu a beta-laktoglobulinu celé délky jsou uvedeny nahoře. Sekvence IgE-reaktivních fragmentů (čísla klonů na pravém okraji) jsou uvedeny na řádcích. Čísla uvádějí první a poslední aminokyselinu každého klonu. Podtržené sekvence v beta-kaseinové sekvenci (nahoře) odpovídají nealergenním peptidům detekovaným hmotnostní spektrometrií formulace značně hydrolyzovaného hypoalergenního mléka.

[00031] Obrázek 1C uvádí aminokyselinovou sekvenci alfa-laktalbuminu, albuminu hovězího sérového séra a laktoferinu.

[00032] Obrázek 2 ukazuje screening IgE expresní knihovny cDNA získané z hovězí mléčné žlázy. Buňky E.coli Y1090 infikované fágem nesoucím cDNA knihovnu byly vyprovokovány k syntéze rekombinantních proteinů. Tyto proteiny byly přeneseny na nitrocelulózový filtr a vystaveny sérovému IgE pacientů s alergií na mléko s následnou inkubací s 1251-značenou anti-protilátkou IgE člověka, v tomto autoradiogramu filtru se IgE reaktivní klony jeví jako černé skvrny.

|00033] Obrázek 3 uvádí alergenní aktivitu vzorků mléka a složek. Biologická aktivita se stanovila měřením lidského RBL. Procenta séra pacienta (n=78) vykazující pozitivní reakci u měření lidského RBL jsou uvedena jako černé čáry (osa y). Analyzovaly se následující mléčné složky: vzorky mléka různých druhů (GM, kozí mléko; CM, kravské mléko; SM ovčí mléko; HM, lidské mléko; MM, kobylí micko), kascinová frakce různých druhů (GC, kozí kasein; CC, kravský kasein; SC, ovčí kasein), přírodní přečištěné proteiny (ACalfa-kasein; BC, beta-kasein; KC, kapa- kasein; ALA, alfa-laktalbumin, BLGB, bcta-laktoglobulinová varianta B; BLGA, bcta-laktalbuminová varianta A; BSA, hovězí sérový albumin; SSA, ovčí sérový albumin; hALA, lidský alfa-laktalbumin; Lf, laktoferin), rekombinatní proteiny (rASIC, rekombinantní alfaSl-kasein; rAS2C, rekombinantní aS2-kascin; rBC, rekombinantní beta-kasein; rKC, rekombinantní kapa-kascin; rALA, rekombinantní alfalaktalbumin; rBLG, rekombinantní beta-laktoglobulin), rekombinantní fragmenty BSA (Fl, rekombinantní fragment 1 z BSA; F2, rekombinantní fragment 2 z BSA; F3, rekombinantní fragment 3 BSA) a syntetické peptidy aSl -kaseinu (Casl - Casó).

|00034] Obrázek 4 uvádí seznam alergenních sekvencí nalezených v mléce.

|00035] Obrázek 5 uvádí separaci hydrolyzované mléčné formulace s použitím nano kapalinové chromatografie s následnou MS (electrospray ionization). Prezentace celého iontového chromatogramu Ipg hydrolyzovaného vzorku mléka. Retenční časy jsou uvedeny na ose x a intenzita signálu v eps (počet impulsů za sekundu) je uvedena na ose y.

[00036] Obrázek 6 uvádí výpis výsledků hledání pomocí algoritmu Mascot search a detekci peptidů odvozených od beta-kaseinu v hydrolyzovaném kravském mléku.

[00037] Obrázek 7 uvádí beta-kasein-odvozené peptidy v hydrolyzovaném kravském mléku detekované jako IgE nereaktivní.

PODROBNÝ POPIS

[00038| Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu detekce alergenních mléčných proteinů a/nebo peptidů zahrnujících kroky opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidů kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidů k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého k savčímu mléku, výhodně kravskému mléku, kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidů vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního pokud uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují alespoň jeden mediátor po kontaktu s alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Vynález poskytuje také způsob, který zahrnuje následující kroky: opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od nejméně jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na alespoň jeden alergenní zdroj, kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního pokud uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují alespoň jeden mediátor po kontaktu s alespoň jedním proteinem nebo peptidem.

[00039] Způsob podle vynálezu je vhodný zejména k identifikaci proteinů a peptidů vykazujících alergenní vlastnosti, za účelem identifikace alergenních vlastností proteinů nebo peptidů se jejich požadované množství pohybuje v rozmezí pouze mikrogramů nebo nanogramů. Tyto proteiny nebo peptidy jsou kódovány DNA nebo cDNA knihovnou, získanou ze zdroje, o kterém je známo, že obsahuje nebo syntetizuje proteiny a/nebo peptidy vyvolávající alergickou reakci u jedince. Alergenní zdroj může obsahovat různé typy tkání a buněk, které mohou být zodpovědné za biosyntézu alergenů. Pokud jsou tyto buňky a tkáně známé, je možné specificky vytvořit knihovny DNA nebo cDNA z uvedených buněk nebo tkání, které je možné použít způsobem podle vynálezu. Například, mléčné alergeny savce, například krávy, je možné detekovat izolací DNA nebo cDNA z tkáně mléčné žlázy kojícího savce.

|00040| Exprimované proteiny a peptidy expresní knihovny DNA a cDNA se kontaktují s IgE nejméně jednoho séra nejméně jednoho jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj. V prvním kroku se zjistí, které z těchto proteinů a peptidů jsou schopné vazby s IgE a tím mají předpoklad k alergickým reakcím. Pojem „IgE-reaktivní“ podle vynálezu znamená kapacitu aminokyselinové sekvence vázat IgE. V dalším kroku se peptidy a proteiny vázající se k IgE dále kontaktují z bazofily, eozinofily nebo mastocyty, které byly dříve v kontaktu s IgE nejméně jednoho jedince, o kterém je známo, že je alergický na nejméně jeden alergen alergenního zdroje. Bazofily, eozinofily nebo mastocyty, nesoucí alergen specifické IgE molekuly uvolňují po kontaktu s příslušným alergenem mediátory, jako například histamin a/nebo jiné mediátory alergie uvolňované bazofily, eozinofily nebo mastocyty, které značí, že proteiny a peptidy schopné vazby IgE jsou také schopné vyvolat degranulaci bazofilů, eozinofilů nebo mastocytů po kontaktu s těmito buňkami. Vhodnými alergenními mediátory jsou výhodně histamin, heparin, prostaglandin, leukotrien, chemokiny, cytokiny. Jiné alergenní mediátory, které mohou být použitelné v souvislosti s vynálezem, zahrnují βhexosaminidázu, eozinofilperoxidázu, ribonukleázu (RNáza), deoxyribonukleázu, lipázu, plazminogen a hlavní bazický protein. Odborníkovi v oboru jsou známy mediátory uvolňované těmito buňkami, které jsou obecně známé (viz například Janeway a kol. 2002: Immunology, Spektrum Akademischer Verlag; Auflage: 5. Auflage; Paul a kol. 1989: Fundamental Immunology, Raven Press Ltd.; druhé vydání).

[00041] Cleny knihovny DNA a cDNA, kteří se vážou k IgE alergického jedince a jsou schopné vyvolat degranulaci bazofilů, eozinofilů nebo mastocytů, je možné izolovat a jejich DNA nebo cDNA inzert je možné sekvenovat metodami známými ze stavu techniky. Proteiny a peptidy exprimované příslušnými členy knihovny je možné případně izolovat metodami známými ze stavu techniky a analyzovat hmotnostní spektrometrií nebo například aminokyselinovým sekvenováním.

[00042] Členy DNA nebo cDNA knihovny je možné odvodit ze zdroje nesoucího biologický materiál, který je známý nebo neznámý z hlediska vyvolání alergické reakce po kontaktu s jedincem. Pojem „alergenní zdroj“, jak se zde užívá, se týká jakéhokoli druhu biologického materiálu schopného syntetizovat alergeny.

[00043] Pojem „peptid“ nebo “protein“ představuje sekvenci aminokyselin spojenou vzájemně peptidickými vazbami. „Peptid“, jak se zde užívá, znamená, že molekula obsahuje nezbytně až 250 aminokyselin, jako například až 200 aminokyselin, jako například až 150 aminokyselin, jako například až 100 aminokyselin, jako například až 50 aminokyselin, jako například až 45 aminokyselin, jako například až 40 aminokyselin, jako například až 30 aminokyselin, jako například až 20 aminokyselin a výhodně více než 2 aminokyselinové zbytky. „Protein“, jak se zde užívá, znamená, že molekula obsahuje nezbytně více než 250 aminokyselin. Blízko horní hranice (to znamená kolem 250 aminokyselin) ve vynálezu může být použit pojem protein a peptid pro stejný typ molekuly.

|00044] Alergeny (látky, které jsou schopné vyvolat alergickou reakci u jedince) se syntetizují různými organismy, včetně rostlin a zvířat. Ve výhodném provedení podle vynálezu je nejméně jeden alergenní zdroj zvířecího původu, přesněji savčího. Zvířata jsou známé zdroje alergenů. Tyto alergeny jsou většinou přítomny u zvířat (například kočky nebo psa) s nebezpečím kožního kontaktu, stejně jako kontaktu s jejich slinami a močí. Savci, například, vylučují alergeny také do mléka. Savci, jako kráva, kůň, koza, ovce, velbloud, buvol, tak mohou obsahovat vysoké množství alergenů. cDNA a DNA používané k detekci těchto alergenů mohou být izolované z kojících savců, kde DNA nebo cDNA se výhodně získá z mléčné žlázy kojícího savce.

[00045] Jiným zdrojem alergenů jsou roztoči, jako například roztoči domácího prachu, ryby, vejce apod. Tato zvířata jsou známá tvorbou látek, které vyvolávají alergické reakce u jedinců.

[00046] Dalším zdrojem alergenů jsou rostliny. Zejména plevele a ořechy jsou známým zdrojem alergenů. Samozřejmě také stromy, jako například bříza, jsou zdrojem alergenů.

|00047J DNA (jako například genomovou DNA a jiné typy DNA kromě cDNA) nebo cDNA je možné získat z alergenního zdroje, jako například savčího mléka, výhodně kravského mléka nebo nutričních formulací obsahujících savčí mléko, výhodně kravské mléko, metodami známými ze stavu techniky. Tyto molekuly nukleových kyselin se výhodně získávají z buněk a tkání, které jsou známy nebo u kterých se předpokládá tvorba alergenů. Za účelem snížení množství screenovaných klonů pro detekci alergenů je však výhodná inzerce cDNA molekul (cDNA molekuly jsou odvozené od mRNA) do expresních knihoven, protože tyto molekuly odrážejí zásobárnu proteinů a peptidů exprimovaných v příslušných buňkách a tkáni. Podle vynálezu, k přípravě cDNA z buněk, které exprimují (potenciálně) alergen, je možné použít jakoukoli metodu. Tyto metody jsou odborníkovi v oboru dobře známé ze stavu techniky (viz například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. (1989) a Ausubel, F. M. a koL, Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol, 1994)). Existuje také mnoho komerčně dostupných souprav pro izolaci dvouvláknové DNA například Superscript II nebo souprava Superscript III (Invitrogen, USA, katalogové č. 18580008), souprava Great Lengths cDNA Synthesis Kit (Clontech, USA, katalogové č. K-1048-1), souprava cDNA Synthesis Kit (Stratagene, USA, katalogové č. 200301)a podobně.

[00048] Molekuly cDNA a DNA je možné ligovat se spojovníkovými DNA sekvencemi obsahujícími vhodná místa rozeznatelná restrikčními enzymy. Tyto DNA spojovníky jsou známy ve stavu techniky a jsou komerčně dostupné, například od Promega Corporation, USA a od New England Biolabs, USA. Molekuly cDNA a DNA je možné dále štěpit restrikěními enzymy, jednotlivé délkové fragmenty oddělit na kolonách nebo gelech nebo jakoukoli jinou vhodnou známou metodou ze stavu techniky pro odborníka v oboru.

[00049] Knihovny cDNA a DNA se pak inzertují do expresních vektorů, které mohou obsahovat nuklcotidovc sekvence kódující tágy, sekvence, které řídí replikaci DNA v bakteriálních buňkách, sekvence, které řídí transkripci DNA a mRNA translaci v eukaryotických buňkách a podobně. Vhodné expresní vektory, které obsahují popsané regulátorové prvky jsou známé ze stavu techniky. Molekuly cDNA nebo DNA popsány výše mohou být navrženy pro přímé zavedení nebo zavedení pomocí lipozomů, fágových vektorů nebo virových vektorů (například adenovirových, retrovirových) do buňky. Typické savčí expresní vektory obsahují promotorový prvek, který zprostředkovává transkripci mRNA, proteinu kódujícího sekvenci a signály požadované pro zakončení transkripce a polyadenylace transkriptu. Je možné zahrnout také prvky, jako například počátek replikace, gen lékové rezistence, regulátory (součást indukovatelného promotoru). Typickým indukovatelným promotorem je lac promotor, užitečný u eukyryotických buněk, který může být indukovaný s použitím laktózového analogu izopropylthiol-b-D-galaklosidu. (IPTG). U rckombinantní exprese a sekrece se může molekula požadovné cDNA nebo DNA ligovat (popsáno v Ghahroudi a kol., 1997, FEBS Letters 414:521-526). Další prvky mohou zahrnovat zesilovače transkripce, Kozákovu sekvenci a intervenující sekvence lemované donorovými a akceptorovými místy pro sestřih RNA. Velmi efektivní transkripce je možné dosáhnout časnými a pozdními promotory z SV40, dlouhými terminálními repeticemi (LTRs) z retrovirů, například RSV, HTLV, HIV a časného promotoru cytomegaloviru (CMV). Buněčné prvky je však možné také použít (například lidský aktinový promotor). Rckombinantní protein nebo peptid může být případně exprimován ve stabilní buněčné linii, která obsahuje genový konstrukt integrovaný do chromozomu. Kotransfekce s volitelným markérem, jako například dhfr, gpt, neomycincm, hygromycinem umožňuje identifikaci a izolaci transferovaných buněk. Expresní vektory vhodně zahrnují nejméně jeden volitelný ukazatel. Reprezentativní příklady příslušných hostitelů výhodně zahrnují, ale neomezují se na bakteriální buňky, jako například E.coli, Streptomyces a Salmonella tyfimurium; buňky hub, jako například kvasnic; buňky hmyzu, jako například Drozofila S2 a Spodoptera Sf9; zvířecí buňky, jako například CHO, COS,293 a buňky Bowesova melanomu; a rostlinné buňky. Příslušné živné půdy kultury a podmínky výše popsaných hostitelských buněk jsou známé ze stavu techniky. Inzerce knihovny cDNA a DNA (cDNA nebo DNA zásoba specifických buněk nebo tkáně) do expresních vektorů vede k expresním knihovnám.

[00050] Expresní knihovna používaná k expresi molekul cDNA a DNA alergenního zdroje je výhodně fágová knihovna nebo bakteriální expresní knihovna. Členové („konstrukty“) těchto knihoven se pak inzertují do buněk schopných exprimovat proteiny a peptidy kódované cDNA a DNA. Výhodné buňky se vyberou podle typu použitého vektoru k vytvoření cDNA a DNA knihoven. V případě, že jsou vektory určeny pro bakteriální expresi, buňky jsou bakteriální buňky. Knihovny cDNA a DNA se zavedou do buněk metodami dobře známými odborníkovi v oboru a popsanými (například transformací), například v Sambrook a kol., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2.vyd„ Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor. N. Y.. 1989). Další kroky kultivace bakteriálních buněk k výběru transformátů a tvorbě jednotlivých bakteriálních kolonií (klonů) jsou dobře známy ze stavu techniky. Po selekci transformantů na agarových plotnách se kultivované bakteriální kolonie mohou jednotlivě odebrat a použít k inokulaci tekuté kultury navržené ve stanovení v podobě vzoru mřížky pro vytvoření bakteriálních mřížkových zásobáren, jako například v 96 jamkových mikrotitračních destičkách. Toto provedení umožňuje reprezentativní růst každého bakteriálního klonu v nezávislé jamce a usnadňují následnou subselekci pozitivně hodnocených zásobáren klonů.

[00051] Zvláště výhodné je použití vektorů pro expresní knihovnu, které jsou schopné vylučovat vytvořené proteiny a peptidy do vnější oblasti buňky. Uvolněné proteiny a peptidy mohou dále obsahovat membránovou kotvicí doménu, která umožňuje imobilizaci exprimovaných molekul na povrchu buněk. Metody a prostředky potřebné k vytvoření těchto knihoven jsou známy odborníkovi v oboru.

[00052| Za účelem detekce vazby alergen specifických IgE molekul k peptidům a/nebo proteinům kódovaných knihovnami cDNA nebo DNA se nejméně jeden protein nebo peptid imobilizuje na pevném podkladu. Pevný podklad se následně kontaktuje s molekulami IgE odvozenými od jedinců trpících alergií a hodnotí se vazba uvedených molekul IgE na pevném podkladu.

|00053| Vazby IgE k proteinům a peptidům imobilizovaných na pevném podkladu je možné dosáhnout použitím protilátek nebo jejich fragmentů schopných vazby k IgE. Tyto protilátky jsou dobře známy ve stavu techniky.

·* ·· ·· ««· c * · · · · · · · »» • ••••«a *9 * ··· ·♦··» ·· * · · * ♦ · · · ·♦·· »ť ·· ·· ······

100054] Pevným podkladem pro použití podle vynálezu může být membrána, výhodně nitrocclulózová membrána. Ve zvláště výhodném provedení se tyto membrány kontaktují s bakteriálními koloniemi nesoucími knihovny cDNA nebo DNA přítomné na agarové plotně za účelem vytvoření repliky těchto kolonií. Tuto repliku je možné použít k detekci vazby alergen specifického IgE k specifické kolonii.

[00055] Bazofily, cozinofily nebo mastocyty, které byly v kontaktu s alergen specifickým IgE jedinců trpících alergií, je možné použít ke stanovení alergického potenciálu proteinů nebo peptidů kódovaných knihovnou DNA nebo cDNA. Bazofily, eozinofily nebo mastocyty mohou být savčího původu, kdy výhodné je použití humanizované krysí buňky bazofilové leukemie (RBL) (například klon RBL-703/21). Buňky je možné humanizovat zavedením a expresí DNA, která kóduje všechny nebo část lidského Fc-receptoru, s výhodou DNA, která kóduje všechny nebo část lidského IgE-receptoru I. Metody přípravy humanizovaných buněk jsou známy ze stavu techniky. Pro přípravu kultur humanizovaných buněk se výhodně použije metoda popsaná v Hoffmann a kol. (lok. lit.). Metody přípravy nahých bazofilů jsou popsány v Kieine Budde a kol. (Int Arch Allergy Immunol, 126(4)).

[00056] Po identifikaci proteinů/peptidů, které jsou schopné vazby alergen specifického IgE se výhodně detekuje aminokyselinová sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu, jak je uvedeno v kroku c), a před krokem d) se chemicky syntetizuje nebo rekombinantně vytvoří nejméně jeden protein nebo peptid, který je schopný vazby k alergen specifickému IgE a může se použít v kroku d).

[00057] Způsob podle vynálezu podle výhodného provedení dále zahrnuje krok detekce aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu uvedeného v kroku e),

[00058] Aminokyselinová sekvence proteinů nebo peptidů kódovaných a exprimovaných knihovnou DNA nebo cDNA se může stanovit například hmotnostní spektrometrií nebo Edmanovým odbouráváním. Pokud se použije taková metoda, proteiny a/nebo peptidy exprimované knihovnou DNA nebo cDNA musí být před aminokyselinovým sekvenováním izolovány. Izolaci je možné provést metodami známými ze stavu techniky. K usnadnění izolace proteinů a peptidů se mohou spojit s tágem (například histidinovým tágem). Případně je možné izolovat příslušný DNA nebo cDNA klon a sekvenovat DNA nebo cDNA inzert.

[00059] Vhodné metody stanovení aminokyselinové sekvence peptidů a proteinů zahrnují, ale neomezují se na, Edmanovo odbourávání, (tandem) hmotnostní spektrometrii a podobně (viz například Edman, P. Mol. Biol. Biochem. Biophys., (1970), 8: 211 -255; US 6,799,121). Aminokyselinovou sekvenci proteinů a peptidů je možné porovnat s aminokyselinovou sekvencí známých proteinů.

[00060| Pojem „hmotnostní spektrometrie“, jak se zde užívá, zahrnuje různé metody, jako například tandemovou hmotnostní spektrometrii, MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) TOF (time-of-flight) hmotnostní spektrometrii, MALDI-TOF-TOF hmotnostní spektrometrii, hmotnostní spektrometrii MALDI Quadrupolc-timc-of-flight (Q-TOF), ESI (electrospray ionizationNTOF hmotnostní spektrometrii, ESI-Q-TOF, „ESI-ion trap“ hmotnostní spektrometrii, „ESI Triple quadrupole“ hmotnostní spektrometrii, hmotnostní spektrometrii FTMS (ESI Fourier Transform), MALDI-FTMS, MALDI-Ion Trap-TOF a ESIlon Trap TOF. Tyto metody hmotnostní spektrometrie jsou dobře známy ve stavu techniky (viz např. Gary Siuzdak, Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press, NY, (1996)). Na své základní úrovni hmotnostní spektrometrie zahrnuje ionizaci molekuly a následně měření hmoty výsledného iontu. Vzhledem k tomu, že molekuly ionizují dobře známým způsobem, molekulovou hmotnost molekuly je možné obecné přesně stanovit z hmoty iontu. Tandemovou hmotnostní spektrometrii je například možné použít k detekci proteinů, protože může poskytnout informaci navíc k rodičovské molekulové hmotnosti iontu. Tandemová hmotnostní spektrometrie zahrnuje nejprve získání hmotnostního spektra příslušného iontu, pak fragmentaci tohoto iontu a získání hmotnostního spektra fragmentů, tandemová hmotnostní spektrometrie tak poskytuje informaci o molekulové hmotnosti i fragmentační vzor, který je možné použít v kombinaci s informací o molekulové hmotnosti k detekci přesné sekvence peptidů nebo proteinu (viz např. Hunt a kol. (1986) PNAS USA 83:6233-6237; Shevchenko a koL, (1996) PNAS USA 93:14440-14445; Figeys a kol. (1996) Anal. Chem. 68:1822-1828 a Wilm a kol. (1996) Nature 379:466-469.

[00061] Jiný předmět podle vynálezu, jak se zde uvádí, se týká způsobu detekce alergenních mléčných proteinů a/nebo peptidů zahrnující krok opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou z tkáně žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, expresi alespoň jednoho proteinu nebo peptidů kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidů k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. V jiném předmětu podle vynálezu způsob zahrnuje krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného způsobem dříve uvedeným. Způsob detekce alergenních proteinů a/nebo peptidů podle vynálezu popsaný výše se výhodně použije při detekci mléčných proteinů a/nebo peptidů. Všechny výše uvedené definice a výhodné předměty platí také pro tento předmět vynálezu.

[00062] Další předmět podle vynálezu se týká způsobu detekce alergenicity vzorku obsahujícího kravské mléko zahrnující krok stanovení přítomnosti nejméně jednoho proteinu a peptidu na obrázcích 1A, IB a IC (SEQ ID č. 22-84) a v tabulkách 1A, IB a tabulce 2 (SEQ ID č. 1-21). Pojem „savčí mléko, výhodně vzorek obsahující kravské mléko“ v souvislosti s přihláškou se týká vzorku potraviny nebo nutričního vzorku obsahujícího savčí mléko, výhodně kravské mléko. Neomezujícím vzorkem je (kravské) mléko, tvaroh, smetana, máslo, jogurt a potravina obsahující jednu z uvedených složek. V mléku, výhodně vzorku obsahujícím kravské mléko je přítomen alespoň jeden protein nebo peptid v množství, které umožňuje stanovení alergenicity mléka, výhodně vzorku obsahujícího kravské mléko. Obvyklé požadované množství proteinu nebo peptidu dostatečného k detekci alergenicity je v řádu mikrogramů nebo nanogramů.

[00063] Proteiny a peptidy uvedené na obrázcích 1A, IB a IC (SEQ ID č. 22-84) a v tabulkách 1A, IB a tabulce 2 (SEQ ID č. 1-21) je možné použít ke stanovení, zda vzorek obsahující kravské mléko obsahuje alergenní molekuly. Pokud je jen jeden z uvedených proteinů nebo peptidů přítomen ve vzorku obsahujícím kravské mléko, vzorek se považuje za alergenní.

[00064] Způsob podle vynálezu je zejména výhodný ke stanovení alergenicity hydrolyzovaného savčího mlčka, výhodně kravského mlčka.

[00065] Uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se výhodně detekuje imunostanovením zahrnujícím protilátky nebo jejich fragmenty vážící se k proteinům a peptidům, uvedeným na obrázcích 1 A, IB a IC (SEQ ID č. 22-84) a tabulkách 1A, IB a tabulce 2 (SEQ ID č. 1-21).

[00066] Uvedený nejméně jeden protein a/nebo peptid se výhodně stanoví hmotnostní spektrometrií. Za účelem detekce složek savčího mléka, výhodně kravského mléka, přítomných ve vzorku obsahujícím savčí mléko, výhodně kravské mléko, je možné použít hmotnostní spektrometrii. Hmotnostní spektrometrie umožňuje detekovat mléčné složky uvedené na obrázcích 1A, IB a 1C (SEQ ID č. 22-84) a v tabulkách 1A, IB a v tabulce 2 (SEQ ID č. 1-21). Srovnání fragmentů přítomných ve vzorku s proteiny a peptidy uvedenými na obrázcích 1 A, 1B a 1C (SEQ ID č. 22-84) a v tabulkách 1 A, IB a v tabulce 2 (SEQ ID č. 1-21) umožňuje stanovit, zda vzorek obsahuje alergenní složky odvozené od kravského mléka.

[00067| Za účelem dosažení lepších výsledků se proteiny a peptidy přítomné ve vzorku výhodně před provedením hmotnostní spektrometrie izolují. Izolaci je možné provést elektroforeticky, výhodně dvojdimenzionální elektroforézou nebo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Screening produktu/proteinů/peptidů ve stanoveni vazby IgE (krok c) a degranulace bazofilů (humanizovaných mastocytů) skutečně poskytuje data o potenciální alergenicitě a tyto metody se používají v klinické praxi. Údaje expresní knihovny cDNA však přidají kompletní seznam potenciálních alergenních peptidů/peptídových sekvencí určitých alergenů (například kravského mléka). Vynález kombinuje tyto metody (zlepšená detekce potenciálních alergenních struktur), umožňujíc použití hmotnostní spektrometrie k ověření přítomnosti těchto potenciálních alergenních struktur v matricích produktu. Tato kombinace sekvenční databáze alergenních mléčných proteinů a peptidů vytvořená v kombinaci s reaktivitou IgE a degranulací (bioaktivita) poskytne základ pro vývoj spolehlivější, citlivější a rcprodukovatelnější metody stanovení a předpovědi alergenicity produktů obsahujících mléko. Ačkoli byly k identifikaci alergenů použity alergeny travního pylu (Ball et al. 1994, Journal of Biological Chemistry,269; Issue of Nov 11 , p. 2832328328), výsledky podle vynálezu jsou nicméně překvapující, protože odborník v oboru by nepředpokládal, že metoda podle Ball et al. 1994 nebo podobná metoda by mohla být úspěšně aplikována na mléčné alergeny. Pro další vysvětlení, IgE vazba alergenů travního pylu, stejně jako IgE vazba k jiným respiračním alergenům, zásadně závisí na aminokyselinových zbytcích v okolí alergenu. Alergeny travního pylu a respirační alergeny se obecně seskupují do konformačních (diskontinuálních) IgE epitopů. Vrtatla a kol. (J. Clin. Invest, ročník 99, No 7, strany 1673-1681) prokazuje, že ztráta konformace, například u rekombinantních fragmentů odvozených od konformačních alergenů, vede k zásadnímu snížení kapacity IgE vazby a uvolnění histaminu z bazofilů pacienta. Naopak, alergeny travního pylu a respirační alergeny, mléčné alergeny a potravinové alergeny mají obecně epitopy, které nejsou konformační, ale rozevřené (Jarvinen a kok, Int Arch Allergy Immunol, ročník 126, strany. 11 1-1 18 a Jarvinen a kol., Allergy, ročník 62, strany 758-765). Stav techniky popisuje pouze IgE vazbu rozevřených alergenů odvozených například z mléka a vejce. Uvolnění mediátoru z bazofilů, mastocytů nebo eozinofílů nebylo uvedeno, ani vynálezcům známo. Vezmou-li se v úvahu výsledky Vrtatla a kol. (lok. lit.), odborník v oboru by předpokládal, že fragmenty alergenů a rekombinantně vytvořené alergeny mléka, které nemají IgE reaktivitu, by ani nebyly schopné vyvolat uvolnění histaminu z bazofilů pacienta. Podobně, vezmou-li se v úvahu výsledky Vrtatla a kol. (lok. lit.), odborník v oboru by předpokládal, že fragmenty alergenů a rekombinantně vytvořené alergeny mléka, které mají IgE reaktivitu, by také byly schopné vyvolat uvolnění histaminu z bazofilů pacienta. Krok dalšího testování uvolňování histaminu u IgE reaktivních mléčných proteinů a peptidů by se podle stavu techniky jevilo jako zbytečné. Naopak, vynálezci překvapivě zjistili, že pouze způsob zahrnující kroky reaktivity IgE a uvolnění mediátoru z bazofilů, mastocytů a eozinofílů může spolehlivě detekovat alergenní mléčné proteiny a peptidy. Dále je třeba zmínit, že pouze kombinované testováni reaktivity IgE a uvolňování mediátoru umožňuje spolehlivé stanovení alergenicity proteinu nebo peptidů odvozeného z mléka. V závislosti na testovaném jedinci mohou peptidy a proteiny případně vyvolat uvolnění mediátoru. Nealergenní proteiny a peptidy, které pouze vykazují IgE reaktivitu bez zprostředkování uvolnění mediátoru z bazofilů, mastocytů nebo eozinofílů, je proto možné odlišit od alergenních proteinů nebo peptidů (alergenů). Proto pouze způsob podle vynálezu může spolehlivě stanovit alergenicitu proteinu nebo peptidů podle vynálezu pro daného jedince, to znamená specificky odlišit od nealergenní IgE vazby. Zvláště překvapivé bylo zjištění, že způsob podle vynálezu vedl k detekci peptidů uvedených v tabulkách 1 A, IB a tabulce 2 (SEQ ID č. 1-22), protože tyto peptidy jsou všechny rozložené peptidy a proto nemají konformační epitopy.

|00068| Zlepšený způsob detekce potenciálních alergenů použitím expresní knihovny cDNA probíhal podle expresního systému fágového peptidů a funkčního sereeningu s použitím IgE vazby a IgE zprostředkované degranulace bazofílních buněk, degranulace eozinofílů nebo mastocytů. Tento výsledek umožňuje monitorování/sereening a předpověď přítomnosti potenciálních potravinových alergenů v surových materiálech, složkách a výsledném produktu za účelem vývoje výroby nutričních formulí.

[00069] Alergenní proteiny nebo peptidy zde uvedené nebo detekované popsanými způsoby podle vynálezu je možné použít k diagnostice alergie nebo predispozice k alergii u jedince, výhodně alergie na mléko nebo predispozice k alergii na mléko. V jednom provedení podle vynálezu se vynález týká způsobu diagnostiky alergie nebo predispozice k alergii u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho alergenního proteinu nebo peptidu specificky uvedeného ve vynálezu nebo detekovaného způsoby popsanými ve vynálezu u jedince s predispozicí k alergii nebo u kterého se alergie projevila a stanovení, zda se u jedince vyvine alergická reakce na protein nebo peptid. Prostředky a způsoby aplikace jsou popsány níže.

[00070| Diagnostika alergie zahrnuje obecně kožní nebo krevní test k nalezení látky nebo alergenu, který může vyvolat alergickou reakci u jedince. Kožní testy jsou většinou výhodnější, protože jsou rychlejší, spolehlivější a obecné levnější než krevní testy, ale může se použít jakýkoli typ testu. U kožního testu se na kůži nebo pod kůži aplikuje vhodné množství alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidu zde uvedeného nebo detekovaného způsoby zde popsanými a sleduje se, zda se vyvine alergická reakce. Existují tři typy vhodných kožních tesů: (1) Kožní prick test se provádí umístěním kapky roztoku obsahujícího uvedený nejméně jeden alergenní protein nebo peptid (alergenní roztok) na pokožku a série rýh nebo bodnutí jehlou umožní roztoku vstoupit do kůže. V případě, že kůže zčervená, objeví se svědící oblasti (pupeny ve tvaru kola), většinou to znamená, že osoba je alergická na daný alergen. Tato reakce je označovaná jako pozitivní. (2) Během intradermálního testu se malé množství alergenního roztoku injekčně aplikuje do kůže. Intradermální alergický test je možné provést v případě, že látka nevyvolává reakci v kožním prickově testu, aleje stále považována u jedince za alergen. (3) U kožního náplasťového testu, se roztok alergenu umístí na podušku, která se přiloží na kůži na dobu 24 až 72 hodin. Tento test se používá k detekci kožní alergie zvané kontaktní dermatitida. U krevního testuje možné stanovit alergii u jedince krokem (i) kontaktu nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného způsoby podle vynálezu nebo specificky uvedeného ve vynálezu se vzorkem krve, séra nebo plazmy jedince, a (ii) stanovení, zda uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se váže k IgE protilátce u uvedeného vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu k IgE protilátce je projevem alergie nebo predispozice k alergii u jedince; a/nebo (i ) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného způsoby podle vynálezu nebo specificky uvedeného s bazofily, eozinofily nebo mastocyty jedince a (ii¹) stanovení, zda bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem alespoň jeden mediátor nebo po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují, kde uvolnění uvedeného alespoň jednoho mediátoru po kontaktu s uvedeným s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem jc příznakem alergie nebo predispozice k alergii u uvedeného jedince.

[00071] Podle jiného provedení podle vynálezu navíc alergenní proteiny nebo peptidy zde specificky uvedené nebo detekované popsanými způsoby podle vynálezu je možné použít u alergenové imunoterapie alergie u jedince. Provedení podle vynálezu se tak týká způsobu alergenové imunoterapie alergie u jedince zahrnující aplikaci alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidů zde specifikovaného nebo detekovaného způsoby zde popsanými. Vhodnou alergií je alergie na mléko.

[00072] Alergenová imunoterapie (také označovaná jako hyposenzitizačni terapie, imunologická desenzitizace nebo alergen specifická imunoterapie) podle vynálezu je formou imunoterapie u alergických onemocnění, kdy je pacient očkován zvyšujícím se množstvím alergenu za účelem vyvolání imunologické tolerance. Alergenová imunoterapie je pouze léčebná strategie, která léčí stávající následek alergického onemocnění. Jedná se o nákladnou a velmi účinnou léčebnou metodu, jejímž výsledkem je lepší kvalita života a potlačení symptomů spojených s alergií a alergenem. Imunoterapie prokázala dlouhodobou remisi alergických symptomů, zmírnění souvisejících alergických reakcí a snížila počet změn ve vývoji nových senzitizací proti alergenům. Toho se dosahuje pomocí imunoterapie zprostředkující reakci imunitního systému na alergeny. Alergenová imunoterapie může snížit spotřebu léků, míru symptomů nebo celkově eliminovat hypersenzitivitu. Alergen specifická imunoterapie je pouze druhem léčby, u níž je známé, že ovlivňuje proces alergického onemocnění (s možností léčby onemocnění), zatímco jiné druh léčby více potlačují symptomy.

[00073] Je výhodné, pokud nejméně jeden protein nebo peptid podle vynálezu pro použití podle jakéhokoli zde popsaného způsobu nebo použití pro diagnostiku nebo způsob a použití u alergenní imunoterapie je přítomen ve farmaceutické kompozici. Pojem „farmaceutická kompozice“ podle vynálezu se týká kompozice pro aplikaci pacientovi, výhodně člověku. Farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje sloučeniny popsané výše. Může volitelně obsahovat další molekuly schopné zesílit vlastnosti sloučenin podle vynálezu, například stabilizací, zprostředkováním a/nebo aktivací jejich funkce. Kompozice může být pevná, kapalná nebo plynná a může být mimo jiné ve formě (a) prášku (prášků), tablety (tablet), roztoku (roztoků) nebo aerosolu (aerosolů). Farmaceutická kompozice podle vynálezu může volitelně a navíc obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič. Příklady vhodných farmaceuticky přijatelných nosičů jsou známé ze stavu techniky a zahrnují fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, vodu, emulze, jako například olejové/vodní emulze, různé typy zvlhčovačích látek, sterilních roztoků, organických roztoků včetně DMSO atd. Kompozice obsahující tyto nosiče může být formulována běžnými metodami. Tyto farmaceutické kompozice je možné podávat jedinci ve vhodné dávce. Dávkování určí lékař podle klinických faktorů. Jak je známo v lékařské praxi, dávkování u pacienta závisí na mnoha faktorech včetně jeho hmotnosti, povrchu těla, věku, druhu aplikované sloučeniny, pohlaví, době a způsobu aplikace, celkovému zdravotním stavu a dalších současně užívaných léčivech. Terapeuticky účinné množství v určité situaci je třeba stanovit rutinními experimenty a s určitou lékařskou zkušeností a posouzení běžného klinického praktika nebo lékaře. Farmaceutická kompozice pro použití podle nálezu může být formulována běžným způsobem pomocí metod známých ze stavu techniky s použitím fyziologických nosičů nebo excipientů, viz například Ansel a kol., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7.vydání, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Farmaceutická kompozice se může aplikovat orálně, parenterálně, subkutánně, intravenózně, intramuskulámě, intraperitoneálně, intratekálně, transdermálně, transmukulámě, subdurálně, lokálně nebo lokálně pomocí iontoforézy, sublinguálně, inhalací spreje, aerosolu nebo rektálně a podobně v dávkách jednotkových formulací volitelně obsahujících běžné farmaceuticky přijatelné excipienty. Farmaceutickou kompozici podle vynálezu je možné aplikovat jako roztok aktivní látky nebo se může aplikovat v kombinaci s jinými látkami.

|00074| Jiné provedení podle vynálezu se týká způsobu stanovení alergie nebo predispozice k alergii u jedince zahrnující kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu zde uvedeného nebo detekci způsoby zde popsanými s bazofíly, eozinofily nebo mastocyty izolovanými z jedince a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního pro jedince, kdy bazofíly, eozinofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem uvolňují alespoň jeden mediátor nebo po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují. Ve výhodném provedení podle vynálezu je alergií nebo predispozicí alergie na mléko nebo predispozice k alergii na mléko. V dalším výhodném provedení podle vynálezu tyto způsoby diagnostiky alergie nebo predispozice k alergii dále zahrnují odlišení jedinců se závažnou alergii od jedinců, kteří jsou senzitizováni, ale asymptomatičtí a/nebo vyčlenění jedinců, u kterých s věkem alergie pominula od jedinců, u kterých alergie s věkem nepominula. Z tohoto hlediska pojem „alergie s věkem pominula“ znamená, že alergie nepretrvává, ale zmírňuje se nebo nejlépe se vytratí s narůstajícím věkem jedince. Z tohoto hlediska je výhodné, když se alergie u jedince vytratí během dětství a jako dospělý je již bez projevů alergie.

[00075] Nejméně jeden protein nebo peptid ve způsobu stanovení alergie nebo predispozice k alergii u jedince muže být imobilizován na pevném podkladu (například nitrocclulóze). Pevný podklad se pak kontaktuje s bazofily, eozinofily nebo mastocyty izolovanými z jedince a sleduje se uvolňování mediátoru nebo degranulace. Buňky mohou být případně imobilizovány na pevném pokladu a kontaktovány s nejméně jedním proteinem nebo peptidem. Nejméně jeden protein nebo peptid může být navíc nejméně jeden protein nebo peptid izolovaný z přírodního zdroje nebo rekombinantní protein nebo peptid připravený způsoby zde popsanými.

[00076] Jiné provedení podle vynálezu se týká způsobu detece IgE-reaktivního nealergenního mléčného proteinu nebo peptidu kódovaného DNA nebo cDNA nejméně jedné expresní knihovny zahrnující kroky: a) opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou z tkáně mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, b) expresi nejméně jednoho peptidu nebo proteinu kódovaného expresní knihovnou, c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho peptidu nebo proteinu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, výhodně kravské mléko, d) kontakt nejméně jednoho peptidu nebo proteinu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu stanovenou v kroku c) s bazofily, eozinofily nebo mastocyty, e) stanovení, zda uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i) po kontaktu s nejméně jedním peptidem nebo proteinem uvolňují alespoň jeden mediátor nebo (ii) po kontaktu s nejméně jedním peptidem nebo proteinem degranulují a f) stanovení nejméně jednoho peptidu nebo proteinu jako nealergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i ) po kontaktu s nejméně jedním peptidem nebo proteinem neuvolňují ani jeden mediátor, nebo (ii') po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nedegranulují. V tomto ohledu se zjistilo, že nealergenní mléčný protein nebo peptid může být obecně IgE reaktivní, ale nevyvolává uvolnění mediátoru z bazofílů, eozinofilů nebo mastocytů, ani nevyvolává degranulaci bazofílů, eozinofilů nebo mastocytů po kontaktu s uvedenými buňkami. Zda je mléčný protein nebo peptid alergenní nebo nealergenní je možné následně stanovit způsoby podle vynálezu. Nealergenní mléčné proteiny nebo peptidy jsou definované svojí IgE reaktivitou, ale nedostatkem alergenní aktivity těchto buněk.

[00077] IgE reaktivní nealergenní mléčné proteiny nebo peptidy detekované způsobem podle vynálezu je možné použít k saturaci vazby mastocytů s IgE před vystaveni alergenu a mohou být úspěšnými kandidáty pro bezpečnou imunoterapii alergických onemocnění. Vynález se tak týká v jiném provedeni způsobu léčby alergie u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho IgE reaktivního nealergenního mléčného proteinu uvedenému jedinci. Výhodné je, že nejméně jeden IgE reaktivní nealergenní protein nebo peptid je formulován ve farmaceutické kompozici, jak je popsáno výše.

Příklady blíže vysvětlují vynález. Šířku rozsahu vynálezu je možné lépe pochopit s odkazem na následující příklady, které však neomezují vynález na specifická provedení.

PŘÍKLADY:

Příklad 1: Detekce sekvencí cDNA kódujících IgE-reaktivní mléčné složky a jejich fragmenty.

[00078] Pro detekci IgE-reaktivních proteinů a IgE-reaktivních proteinových fragmentů obsažených v kravském mléce se nejprve vytvořila cDNA expresní knihovna s použitím tkáně mléčné žlázy kojící krávy. Tato knihovna se sereenovala pomocí sér pacientů alergických na kravské mléko. Detekovaly se cDNA kódující IgE-reaktivní alfaSl-, alfaS2-, beta-, kapakasein a beta-laktoglobulin celé délky, stejně jako jejich IgE-reaktivní fragmenty. Poněkud překvapivým výsledkem bylo, že savčí proteiny se tvořily v bakteriálním systému, který nepřidává eukaryotické posttranslační modifikace, které by někdy mohly hrát roli v IgE vazbě jako je popsáno pro hlavní alergeny roztočů domácího prachu (Jacquet a koL, 2002). Předpokládané aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obrázcích 1A-C (SEQ ID č. 2284). Získané IgE-reaktivní alergenové fragmenty umožňují vytvořit závěr o umístění epitopů IgE.

Experimentální protokol

[00079] Získaly se hovězí mléčné žlázy krávy (plemeno Fleckvieh) a čerstvá tkáň se ihned zmrazila a skladovala do použití při -80 °C. Z tkáně se izolovala celková RNA a získala se cDNA s použitím soupravy cDNA Synthesis System. Přečištěná cDNA se inzertovala do fágů lambda s použitím soupravy Lambda gtll/EcoR 1/CJAP-Treated/Gigapack III Cloning Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Buňky E.coli se infikovaly fágovou knihovnou, umístily na destičky LB Amp (průměr 145 mm). Exprese bakteriálního proteinu se vyvolala použitím nitrocelulózové membrány (Whatman Schleicher & Schueli, Dassel, Germany). Adsorbované proteiny se inkubovaly se sérem od CMA pacientů a detekovala se vazba IgE protilátek (IBL, Hamburg, Germany) pomoci anti-IgE protilátek značených ¹²⁵I. Membrány se vystavily rentgenografickému filmu (Kodak. Rochester, NY). Pozitivní klony, jejichž proteiny byly schopné vazby lidského IgE se projevily jako tmavé skvrny na rentgenografíckém filmu (příklad autoradiogramu takovéto membrány je uveden na obrázku 2).

[00080| Fágová DNA pozitivních klonů se amplifikovala s použitím lambda gt 11 původního primeru (5' CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA TTC 3') a lambda gtll zpětného primeru (5’ GAA TTC CAG CTG AGC GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3') a naamplifikované PCR produkty se sekvenovaly. Získané nukleotidové sekvence se analyzovaly srovnáním sc sekvenční databází (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/).

Příklad 2: Neshoda v alergenní aktivitě a IgE-reaktivita mléčných složek

[00081] Za účelem vyhodnocení, zda má molekula alergenní potenciál je třeba prokázat nejen její IgE-reaktivitu, ale také biologickou aktivitu. Vědecky ověřeným modelem pro testování biologické reaktivity molekul je vyvolání uvolnění histaminu z lidských bazofilových granulocytů (Purohit 2005). K tomuto účelu se použila buněčná linie žírných buněk exprimující α-řetězec lidského FceRI receptorů (Hoffmann a kol., Int Arch Allergy Immunol, ročník 126(4), p. 277-285). Testovaly se různé mléčné složky (n=33) včetně celých mléčných extraktů různých druhů, mléčných frakcí, přečištěných přírodních a rekombinantních kravských mléčných proteinů a fragmentů rekombinantních proteinů. Stanovila se procenta ze 78 pacientů, jejichž sérové IgE protilátky vyvolaly uvolnění β-hexosaminidázy z humanizovaných buněk RBL jako reakce na jednotlivé složky mléka, (obrázek 3).

[00082] Nejpotentnější buňku aktivující složkou bylo kravské mléko s rychlostí stimulace 47,4% (obrázek 3, panel vzorky mléka). Ale také kozí a ovčí mléko vykazovalo hodnoty 35,9 a případně 28,2 %, potvrzující křížovou reaktivitu mléčných proteinů z různých zdrojů. U jedné složky přečištěné proteiny, kaseiny (AC, BC, KC), stejné jako beta-laktoglobulin A (BLGA) vykazovaly nej vyšší aktivitu a vyvolávaly uvolnění 25 až 34,6 % pacientova séra.

Zajímavé je, že rekombinantní forma alfa-laktalbuminu (rALA) vyvolala mnohem větší uvolnění než přírodní forma. Každý ze syntetických peptidů měl poněkud nižší buněčný aktivační potenciál, přičemž bylo dosaženo stimulační rychlosti 2,6 až 7,7%. Biologická aktivita se srovnala s aktivitou IgE (tabulka 2).

[00083| Tabulka 2: Vazebná kapacita IgE a biologická aktivita mléčných složek; rozdíl mezi IgE a alcrgenní aktivitou mléčných složek. Mléčné složky vykazovaly větší IgE reaktivitu než alergenní aktivitu ve stanovení s lidskými RBL.

Biologická aktivita Vazba IgE

	(% pacientů)	(% pacientů)
Vzorky mléka	GM	35.9	69.2
	CM	47.4	B5,9
	SM	28.2	82.1
	HM	9 0	17,9
_______ . .................	MM	9,0	........29 5...............
-	GC	24.4	46.2
Kaseinové frakce	’ CG..................	4Ϊ0...................................	52.6
	SG ......	28 2	46.2
	AC	25'6........................	530
Přírodní přečištěné
BQ	34.6	44,9
proteiny	KC	25.6	3D, 8
	ALA...............	11.5	......55.4
	•BLGÁ	28 2	50.0
	ELGB	13.2	51,3
	BSA	2,1	64
		................
	SSA	2.6	: 1.3
	^hALA	6.4	30,8
	Lf	2.6	5 1
Rekombinantní	fA3l C	i 132	46.7
proteiny	rAS2C	5,1	i 9.0
	rBC	10 3	:55,1
	íKC	6,4	21,8................
	rBLG	12,8	23.1
	rÁLA	21 8	' 25,6

í

	Biologická aktivita (% pacientů)	Vazba IgE {% pacientů) |
Rekombinantní fragmenty	BSA_F	....................... ......................—	; i .........f.............—
BSA	1	4,3	2,1
	BSA_F	--------------------------'
	2	4,3	8,5 ’
	BSA_F		i
___________________	3 i.......—	8,5	8.5 I i ........
Syntetické peptidy AS1C	1 Cas 1	6,4	43 6 ......
	: Cas 2	3.8	..... 15,4
	। Cas 3	' 2,6	I 46,2
— — ................. ............	Cas 4	3,8	' 35,9
	Cas 5	'5J	41,0
-----------------·-·..........................................................	Cas 6	7.7	37,2

[00084] Největší množství testovaných složek mléka, jako například kravského a kozího mléka, přečištěné A a B varianty přírodního beta-globulinu (BLGA a BLGB) a rekombinantní alfaSl- a (rASIC) alfaS2-kasein (rAS2C) prokázali přibližně dvakrát větší procento IgEreaktivity než biologické aktivity. Tyto výsledky je možné vysvětlit přítomností IgE vazebných epitopů, které jsou schopné vazby IgE, ale nejsou schopné zesítovat receptor, vázat IgE a vyvolat uvolnění mediátorů. Pouze v případě pěti složek (rekombinantního BSA fragmentu 3 (F3), rekombinantního alta-laktalbumin (rALA), frakce kravského kaseinu (CC), přírodního přečištěného kapa- (KC) a beta-kaseinu (BC)) dosahovala procenta IgE-reaktivity a biologické aktivity podobných hodnot. Míra degranulace u syntetických peptidů odvozených od alfaSl-kaseinu byla poněkud nižší v rozsahu od přibližně od desetiny (Cas 3, Cas 4, Cas 5) až čtvrtiny (Cas 2, Cas 6) aktivity celého proteinu.

[00085] Bylo zjištěno, že mnoho IgE-reaktivních alfa-Sl-kaseinových peptidů nemůže vyvolat degranulaci ve stanovení uvolňování bazofily a reprezentovat tak IgE-reaktivní hapteny. Tyto peptidy (hapteny) jsou proto nealergenní. Z tohoto výsledku vyplývá, že samotné testování IgE by vedlo k falešně pozitivním závěrům s ohledem na stanovení alergenicity. Na druhé straně IgE-reaktivní hapteny mohou být využitelné jako terapeutické látky k nasycení mastocytů vážících se k IgE před vystavením alergenu a mohou být užitečnými kandidáty pro bezpečnou imunoterapii alergických onemocnění. Dále byly nalezeny peptidy odvozené od AlfaSl-kaseinu, které se váží k IgE a vyvolávají uvolnění bazofily, a u sér některých pacientů bylo zjištěno, že nevykazují IgE-rcaktivitu k některým peptidům, ale při kontaktu s těmito peptidy byla vyvolána degranulace bazofilů. Pozdější výsledek může být vysvětlen vyšší citlivostí stanovení uvolňování bazofily.

[00086] V souhrnu, srovnání měření reaktivity IgE a biologické aktivity odhalilo, že séra pacienta vykazovala vyšší kapacitu ve vazbě IgE než ve vyvolání degranulace bazofilů. Skutečnost, že stanovení alergenicity odráží potenciál molekuly vyvolat alergické symptomy, vede k závěru, že měření reaktivity IgE samo o sobě není možné použít k detekci určitých alergenních složek, ale je třeba jej doplnit biologickým stanovením.

[00087] Kombinace obou měření, stanovení IgE vazebné kapacity a biologické reaktivity umožňuje vytvořit databázi obsahující alergenní proteiny/fragmenty/peptidy, které je možné detekovat hmotnostní spektrometrií. Obrázek 4 ukazuje seznam sekvencí alergenních mléčných peptidů a proteinů, které představují prototyp této databáze. Uvedeny jsou mléčné složky testované na reaktivitu IgE séra z hlediska alergenní aktivity. Uvedeny jsou také informace vztahující se k názvům alergenů, molekulové hmotnosti (MW) v kilo Daltonech (kDa), funkce a příprava alergenů stejně jako odkazy.

Experimentální protokol

[00088] Použila se séra 78 pacientů, kteří byli vybráni podle pozitivní anamnézy, pozitivní reakce kožního prick testu a stanovení specifického IgE k extraktu kravského mléka s použitím zařízení CAP-FEIA System (Phadia, Uppsala, Sweden). Séra se získala od pěti dospělých a 73 dětí (30 žen a 43 mužů) z Rakouska, Německa, Itálie, Španělska a Francie.

[00089| Od Sigma Aidrich (St. Louis, US) se získaly přečištěné proteiny a kaseinové frakce. Rekombinantní proteiny a rekombinantní fragmenty BSA se exprimovaly v E.coli, jak je popsáno (Vrtala a kol., 1997). AI faSl-kaseinové peptidy se syntetizovaly na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems Model 433Λ jak je popsáno (Focke et al., 2001).

[00090| Humanizované krysí buňky bazofilové leukemie (RBL) (klon RBL-703/21) se inkubovaly v mikrolitračních destičkách přes noc při 37 °C (7% CO₂, 95% vlhkost) s 50 μΐ lidského séra, zředěného 1:10. Poté se buňky promyly a vystavily se mléčným složkám, se zředěním na 0,3 pg/ml proteinu v Tyrodovém pufru obsahujícím 50% D₂O a 0,1% BSA/HAS po dobu I hodiny při 37 °C (7% CO₂, 95% vlhkost). Sledovalo se také spontánní uvolňování z buněk. Nakonec se supemalanty buněk inkubovaly s 50 μΐ reakčního roztoku (0,1 M kyseliny citrónové nebo citrátu sodného, pil 4,5, 160 μΜ 4-methylumbeliferyl-N-acetyl-p-Dglukosaminidu) v nových mikrotitračních destičkách při 37°C (7% CO₂, 95% vlhkost) po dobu 1 h. Reakce se zastavila přídavkem 100 μΐ glycinového pufru na jamku a měřila se fluorescence při X_ex: 360 a Z_em: 465 s použitím fluorescenční čtečky mikrodestiček. Specifické uvolnění hcxosaminidázy u každého vzorku se vypočetlo s použitím vzorce: [(FI_S - FIs_p) : (FI_Z - FIsp)] x 100 (kde FI_S je fluorescence vzorku; Fl_Sp je fluorescence spontánního uvolnění a Flz je fluorescence celkového uvolnění).

Příklad 3: Detekce proteinů a/nebo peptidů s alergenní aktivitou nebo bez alergenni aktivity ve vzorku mléka a mléčných produktech hmotnostní spektrometrií.

[000911 Sekvenční databáze alergenních mléčných proteinů a peptidů vytvořená kombinací reaktivity IgE a alergenní aktivity může poskytnout základ pro vývoj spolehlivé, reprodukovatelné analytické metody pro stanovení a předpovědi alergenicity vzorků mléka a mléčných produktů. K detekci potenciálně alergenních složek v komplexu mléčných vzorků se použila hmotnostní spektrometrie. Jako příklad se pro analýzu komerčně dostupné, do značné míry hydrolyzované hypoalergenní mléčné formulace použila hmotnostní spektrometrie v kombinaci s protisměrnou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Analýza chromatogramu uvedená na obrázku 5 a extrahované hmotnostní spektrum prokázalo, že všechny proteiny byly hydrolyzovány na malé peptidy s maximální délkou 14 aminokyselin.

[00092] Přesněji, obrázek 5 ukazuje separaci hydrolyzované mléčné formulace s použitím nano kapalinové chromatografie s následnou MS (electrosprej ionizace). Prezentace celkového iontového chromatogramu 1 pg hydrolyzovaného vzorku s mlékem. Retenční časy jsou uvedeny na ose x a intenzita signálu v eps (počet za sekundu) je uvedena na ose y.

|00093| Vyhledávání v databázi s použitím algoritmu MASCOT Search vedla k detekci několika malých peptidů, z nichž tří byly detekovány jako alergeny odvozené od mléka, přesněji beta-kasein (Bos d 8 beta, obrázek 6). Na obrázku 6 je uvedeno vyhledávání pomocí algoritmu Mascot a detekce peptidů odvozeného od beta-kaseinu u hydrolyzovaného kravského mléka. Beta-kasein nahoře, jediný detekovaný mléčný alergen hmotnostní spektrometrií, je uveden s molekulovou hmotností a vypočteným pí. Níže jsou uvedeny vyhledávací parametry a získané sekvenční pokrytí beta-kascinu. Dole je uvedena sekvence beta-kaseinu s odpovídajícími peptidy vytištěna tučně. Alergen beta-kaseinu se detekoval podle odpovídajících peptidů: IIQP1IQPLPPT (vypočtená hmotnost 1,25 kDa, odpovídající aa 160-170 beta-kaseinu), VYPFPGPIPN (vypočtená hmotnost 1,19 kDa, odpovídající aa 74-84 beta-kaseinu), SSSEE (vypočtená hmotnost 0,65 kDa, odpovídající aa 31 -36 beta-kaseinu), a PVVVPP (vypočtená hmotnost 0,87 kDa, odpovídající aa 96-103 beta-kaseinu). Na obrázku 7 je uvedena reaktivita IgE při testování těchto peptidů (tabulka 1 : cas b-1 , 2, 3 a 4; obrázek 7). Detekované peptidy v hydrolyzovaném kravském mléce odvozené od beta-kaseinu nejsou IgE-reaktivní. IgE-reaktivita skvrn kravského mléka (CM) na nitrocelulóze, rekombinantního beta-kaseinu (rBC), syntetických peptidů odvozených od beta-kaseinu (cas b-1, cas b-2, cas b-3, cas b-4) a rekombinantního alfaSl-kasein (rASIC) byla analyzována stanovením dot blot. Mléčné složky navázané na nitrocelulózu se inkubovaly se sérem tří pacientů alergických na kravské mléko (linie 1, 2 a 3) a nealergického jedince (linka C). Detekovala se vazba protilátek IgE pomocí anti-IgE protilátek značených ^l25I. Tento obrázek a výsledky ukazují, že představují nealergenní peptidy, to znamená, že jsou příliš krátké pro vazbu protilátek IgE a mohou být proto odlišeny od alergenních a IgE-reaktivních peptidů podle definice v databázi IgE reaktivních a alergeních peptidů/proteinů odvozených od kravského mléka. Navíc se liší od publikovaných hlavních IgE vazebných oblastí beta-kaseinu (aa 1-16, aa 83-92, aa 135-144; Chatchatee 2001). Žádný z jiných IgE-reaktivních mléčných alergenů a alergenových fragmentů získaných sereeningem expresní knihovny cDNA (obrázek 1) nebyl detekován v hydrolyzovaném vzorku mléka, proto mohl být vyhodnocen jako nealergenní výrobek. Jak bylo prokázáno - s použ.itím značně hydrolyzovaného mléka - analýzu LC-MS je možné použít k detekci nealergenních mléčných připravků/vzorků.

[00094] Tabulka 1. A) Syntetické peptidy aS1-kaseinu a fragmentů BSA. Uvádí se názvy peptidů, jejich aminokyselinová sekvence, délka, pí a molekulová hmotnost v kDa.

peptid	sekvence	délka , 1 P1 (aa)	MW (kDa)
; Casl :...................................... Cas2	rpkhpikhqglpqevlňěňllrffvapf PEVC	32	8.22	3.75
FGKE.KVNELSKDIGSESTEDQAMEDIK QMEAES	33	4.18	3.70
: Cas3	ISSSEEIVPNSVEQKHiQKEOVPSERYL GYEQLLRC	36	4.80	4.21
Cas4	CLKkÝkvPOLElVPNSÁEERLHSMKEGi HAQQKE	34	8 14	3.96
Cas5	C PM 1GVNQ E LA YFYPE L FRQFYQl DAY PSGAWYYV	35	4,14	4.24
Cas6	PLGTQYTDAPSFSDiPNPIGSENSE^...... MPLWC mrgvfrrdthkseiahrfkdlgeehfk	33	3.92	3.50
’ BSA Fl	GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTE	190	5.95	23 9
	faktcvadeshagcekslhtlfgdelc
Í	K VASLR E f YGDMADCCEKQ E P E RNEC
peptid	sekvence	délka (aa)	pi	MW (kDa)
!	...........
1	FLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKA DEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLY YANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIE TMREKVLTSSHHHHHH
	UARQRLRCASIQKFGERALKAWSVAR
	LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKEC
	CHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTfS
1 BSA F2	SKLKECCDKPLLEKSHC1AEVEKDAIPE	1Θ9	5.94	22.6
	NLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKOAFL
	gsflyeysrrhpeyavsvllrlakeyf
	ATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLV
:DEHHHHHH
	MPQN LIKQ NCDQ FEKLGEYGFQNAL1V R YT R KVPQ VSTPTLVE VS RSLG KVGTR CCTKPESERMPCTEDYLSLÍLNRLCVLH
j BSA F3	EKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSAL TPDE LYVPKAFOEKLFTFHADlCTLPDT ekqikkqtalvellkhkpkateeqlktv MENFVAFVDKCCAA DDKEACFAVEGP K LWS T QTALAHH Η Η Η H	200	7.54	23 4

[00095] B) Syntetické peptidy β-kaseinu. Uvádí se názvy peptidů, jejich aminokyselinová sekvence, délka, pí a molekulová hmotnost v kDa.

peptid	sekvence	délka pi ί (aai	MW (kDaJ
cas D-1	HQPHOPlPPP/	11 : S 92	1.25
ca s b-2	WPFPGPPNS	11 : 5.49	1.19
cas 6 3	LSSSEE	! 6 4.24 .	0 65
cas b-4	PWVPPFL	5 ‘ 5.96 i	0.87

Experimentální protokol:

Hydrolyzovaná mléčná formule sc analyzovala HPLC s reverzní fází s použitím nano kapalinové chromatografie (Ultimate, LC Packings Dionex, The Netherlands) spojené s nanosprejovým rozhraním hmotnostního spektrometru HCT-Ultra (Bruker Daltontk, Germany). Získaná hmotnostní spektra se vyhledávala v proteinové databance SwissProts použitím softwarového vyhledávajícího algoritmu MASCOT (Matrix Science, London, United Kingdom). Pro dot blot analýzu se 1 pg proteinu umístil na nitrocelulózu a inkuboval se se sérem pacienta alergického na mléko zředěním 1:20 v PBST (PBS, 0,5% v/v Tween 20). Vazba IgE protilátek se detekovala pomocí lidských anti-IgE protilátek značených I (IBL, Germany) ve zředění 1:15.

Příklad 4: Mapování epitopu hovězího alfa-laktalbuminu (ALA) k identifikaci IgE-reaktivních ALA-odvozených peptidů

Metody

[00096] Syntéza peptidů odvozených od ALA: peptidy odvozené od ALA (Lacl-Lac8) uvedené v tabulce I se syntetizovaly s použitím metody Fmoc (9 fluorenylmethoxykarbonyl) aktivací pomocí HBTU [(2-/lH-Benzotriazol-l-yl)l,L3,3, tetramethyluronium hexafluorphosfát] (0,1 mmol, cykly malého měřítka) na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems, Model 433A (Foster City, CA) a přečistili se, jak je popsáno (Focke a kol., Faseb J 15:2042-2044).

[00097] Testování IgE-reaktivity na ALA-odvozcné peptidy: reaktivita IgE ALA-odvozených peptidů se stanovila mikroanalýzou, jak je popsáno (Schulmeister et af., J.Immunol. 182(1

1):7019-29). Stručně, složky mléka se nakapaly na membránu s kapilárním tokem běžného mikroskopického sklíčka a inkubovaly se s 25μ1 pacientova séra.

Vazba IgE protilátek se detekovala fluorescenčně-konjugovanou IgE protilátkou při vlnové délce 670 nm. Konečné množství se nastavilo u každého pacienta jako dvojnásobná hodnota hodnoty získané s lidským sérovým albuminem jedince.

[00098] Výsledky

Detekce ALA epitopů, které jsou reaktivní s IgE protilátkami.

Za účelem detekce IgE reaktivních epitopů ALA bylo syntetizováno 8 peptidu s klíčovou ALA sekvencí (tabulka 2). 8 peptidů mělo délku 19-20 aminokyselin s překryvem 5 aminokyselin. IgE-reaktivita 8 překrývajících se peptidů se vyhodnotila mikroanalýzou s použitím séra od 36 pacientů vykazujících IgE-reaktivitu k ALA; Bylo zjištěno, že 30,6% pacientů reagovalo na Lacl, 33,3 % na Lac2, 5,6 % na Lac4, 2,8% na Lac5, Lac6 a Lac7, a 11,1 % na Lac 8 (tabulka 3). Celkem 19 z 36 pacientů s IgE-reaktivitou na rALA reagovalo nejméně s jedním syntetickým peptidem odvozeným od ALA.

Tabulka 2. Syntetické ALA-odvozené peptidy^a.

peptid	sekvence	délka	(aa) pl	MW (kDa)
í Lad	I EQLTKCEVFRELKDLKGYG	: is	634	2 26
lLac2	Tlkgy^v^pěw^	20 '	~ 6 74’	2Ϊ8
Lac3	TfFHTŠGYDTQAÍVQNNOSTĚ	20	4 31	2 23
i Lac4	NDSTÉÝGLFQÍNŇKIWCKDD	20	i 4 42	2.40
Lac5	wckďdqnphs^hcniscdk		4--------------- 5 30	2 31
Lac6	ISCDKFIODDLTDDIMCVKK	i 20	!4 11	n 1
lac?	; MCVKKWKVGlNYWLAHKA	2D	.9.52	2 33
Lac8	í LAHKALCSEKLDQWLCEKL	19	i 6.74	2 23

^aZkratky použité v tabulce: Lacl-Lac8, peptidy 1-8 odvozené od ALA; aa, aminokyseliny; pl, izoelektrický bod; MW molekulová hmotnost; kDa, kiloDalton.

Tabulka 3. IgE vazebná kapacita peptidů odvozených od alfa-laktalbuminu testovaných pomocí sér 36 pacientů s IgE-reaktivitou k rALA.

n“3fi Rekombinantni ALA	rÁLA	Vazba
100 3
synthetic ALA peptides	Láci	30-6
	Lac?	33 3
	Lac3	0
..........-......................................	LaM	5 A......
: Lac5	2 8
	Láce	28
	Lac7	2.8
	Lac8	111

IgE (% pacientů)

Vynález dále zahrnuje následující předměty:

1. Způsob detekce alergenních proteinů a peptidů kódovaných expresní knihovnou DNA nebo cDNA zahrnující kroky:

a) opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od nejméně jednoho alergenního zdroje,

b) expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou,

c) stanovení vazebné kapacity nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého k nejméně jednomu alergennímu zdroji,

d) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu jak je uvedeno v kroku c) s bazofílními buňkami nebo mastocyty a

e) detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem v kroku d) uvolňují nejméně jeden mediátor.

2. Způsob podle bodu 1, kdy nejméně jeden alergenní zdroj je zvířecího původu.

3. Způsob podle bodu 2, kdy zvířetem je savec.

4. Způsob podle bodu 3, kdy savcem je kráva.

5. Způsob podle bodu 3, kdy savcem je kočka.

6. Způsob podle bodu 3, kde savcem je pes.

7. Způsob podle bodu 2, kdy uvedeným savcem je kojící savec a DNA nebo cDNA se získá z tkáně mléčné žlázy.

8. Způsob podle bodu 2, kdy zvířetem je roztoč.

9. Způsob podle bodu 1, kdy zvířetem je ryba.

10. Způsob podle bodu 2, kdy alergenním zdrojem je vejce.

11. Způsob podle bodu 1, kdy nejméně jedním alergenním zdrojem je rostlina.

12. Způsob podle bodu 11, kdy rostlinou je plevel.

13. Způsob podle bodu 11, kdy rostlinou je ořech.

14. Způsob podle bodu 11, kdy rostlinou je strom.

15. Způsob podle bodu 1, kdy expresní knihovnou jc fágová expresní knihovna nebo bakteriální expresní knihovna.

16. Způsob podle bodu 1, kdy vazebná kapacita IgE se stanoví imobilizací nejméně jednoho proteinu nebo peptidů na pevném podkladu, kontakt podkladu s IgE a stanovení vazby IgE na uvedeném pevném podkladu.

17. Způsob podle bodu 1, kdy bazofily jsou humanizované krysí buňky bazofilové leukemie (RBL) (klon RBL-703/21 ).

18. Způsob podle bodu 1, kdy je stanovena aminokyselinová sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidů vykazující IgE vazebnou kapacitu stanovenou v kroku c), a nejméně jeden protein nebo peptid chemicky syntetizovaný nebo rekombinantně vytvořený před krokem d).

19. Způsob podle bodu 1, kdy způsob dále zahrnuje krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidů detekovaného v kroku e).

20. Způsob podle bodu 19, kdy aminokyselinová sekvence se stanoví hmotnostní spektrometrií.

21. Způsob podle bodu 19, kde aminokyselinová sekvence sc stanoví Edmanovým odbouráváním.

2^ilPATENTOVÉ NÁROKY

Claims (24)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob detekce alergenních mléčných proteinů a/nebo peptidů zahrnujících kroky:

a) opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojící krávy,

b) expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidů kódovaného uvedenou expresní knihovnou,

c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidů k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na kravské mléko,

d) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidů vykazujícího IgE vazebnou kapacitu podle stanovení v kroku c) s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a

e) detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidů jako alergenního, pokud uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem z kroku d) uvolňují nejméně jeden mediátor.

2. Způsob podle nároku 1, kde způsob dále zahrnuje krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidů detekovaného v kroku e).

3. Způsob stanovení alergenicity vzorku obsahující kravské mléko, zahrnující krok stanovení přítomnosti nejméně jednoho proteinu a peptidů jakékoli SEQID1-84.

4, Způsob podle nároku 3, kde kravské mléko je hydrolyzované kravské mléko.

5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, kde přítomnost nejméně jednoho proteinu a peptidů se stanoví hmotnostní spektrometrií.

6. Způsob podle nároku 5, kdy proteiny a peptidy přítomné ve vzorku se před hmotnostní spektrometrií izolují.

Γ ο

7. Způsob podle nároku 6, kdy proteiny a peptidy se izolují elektroforetickou metodou nebo vysoko účinnou kapalinovou chromatografn.

8. Způsob podle nároku 7, kdy elektroforetickou metodou je dvojdimenzionální elektroforéza.

9. Protein nebo peptid detekovaný způsobem podle nároku 1 nebo 2.

10. Protein nebo peptid vybraný z kterékoli SEQ ID č. 1-84.

11. Alespoň jeden protein nebo peptid podle nároků 9 nebo 10 pro použití v diagnostice alergie nebo predispozice k alergii u jedince.

12. Alespoň jeden protein nebo peptid podle nároku 11 pro použití v diagnostice alergie na mléko nebo predispozice k alergii na mléko u jedince.

13. Způsob diagnostiky alergie nebo predispozice k alergii u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle nároků 9 nebo 10 jedinci, u kterého se předpokládá alergie nebo vývin alergie a stanovení, zda jedinec vyvinul alergickou reakci proti proteinu nebo peptidu.

14. Způsob podle nároku 13, kde alergie nebo predispozice k alergii představuje alergii na mléko nebo predispozici k alergii na mléko.

15, Způsob podle nároků 13 nebo 14, kde způsob dále zahrnuje:

a) kožní test a/nebo

b) krevní test.

16. Způsob podle nároku 15, a) kde kožní test je vybrán z (i) kožního prick testu, (ii) intradermálního testu, (iii) kožního náplasťového testu nebo (iv) jakékoli kombinace testů (i) až (iii),

kde pozitivní výsledek testů (i) až (iv) indikuje alergii nebo predispozici k alergii u jedince a/nebo

b) kde krevní test zahrnuje kroky (i) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle nároků 9 nebo 10 se vzorkem krve, séra nebo plazmy jedince a (ii) detekci uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu vážícího se k protilátce IgE ve vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE protilátce indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince; a/nebo (i ) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle nároků 9 nebo 10 s bazofily, eozinofíly nebo mastocyty jedince a (ii ) stanovení, zda bazofily, eozinofíly nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem uvolňují nejméně jeden mediator nebo po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují, kdy uvolnění uvedeného nejméně jednoho mediátoru po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem indikuje alergii nebo predispozice k alergii u daného jedince.

17. Nejméně jeden protein nebo peptid podle nároků 9 nebo 10 pro použití v alergenové imunoterapii alergie u jedince.

18. Způsob alergenové imunoterapie alergie u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle nároků 9 nebo 10.

19. Způsob detekce alergie nebo predispozice k alergii u jedince, kde způsob zahrnuje:

a) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle nároků 9 nebo 10 se vzorkem krve, vzorkem séra nebo vzorkem plazmy, kde vzorek krve, séra nebo plazmy se izoluje od daného jedince a

b) stanovení, zda nejméně jeden protein nebo peptid se váže k IgE protilátce v daném vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo or · * Γ> η 0 ««CÍ © Γ * ο 0 λ ο 9«

Ο ο Μ ·1 C Ο ι <> I ·* r ere t o ·η ιό t* »-e 0 0 err e o e peptidů k IgE protilátce indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince; a/nebo a') kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidů podle nároků 9 nebo 10 s bazofily, eozinofily nebo mastocyty, kde uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty byly izolovány od daného jedince a b ) detekci zda uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i) uvolňují nejméně jeden mediator po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo (ii) degranulují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem, kde uvolnění uvedeného nejméně jednoho mediátoru po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince.

20. Způsob podle nároku 19, kde alergie nebo predispozice k alergii představuje alergii na mléko nebo predispozici k alergii na mléko.

21. Způsob podle nároků 19 nebo 20 dále zahrnující

a) odlišení jedinců se závažnou alergií od jedinců, kteří jsou citliví, ale asymptomatičtí a/nebo

b) odlišení jedinců, u kterých se alergie s věkem vytratila od jedinců, u kterých se alergie s věkem nevytratila.

22. Způsob detekce IgE-reaktivního nealergenního mléčného proteinu nebo peptidů kódovaného DNA nebo cDNA nejméně jedné expresní knihovny zahrnující kroky:

a) opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojící krávy,

b) expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidů kódovaného uvedenou expresní knihovnou

Τ’© PO ¢/1 CG ft o

U O C » Π Γ. O O A o· o r c o < co ·« ť G C « -Ϊ ft C Λ hr A>

π r η r. <' ρ fj0 ·’ ο Γ Ο Ο β Γ C Γ γ. ·· η ο t? ο φ

c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidů k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na kravské mléko,

d) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidů vykazujícího vazebnou IgE kapacitu, jak je uvedeno v kroku c) s bazofily, eozinofily nebo mastocyty, e) stanovení, zda uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem uvolňují nejméně jeden mediátor nebo (ii) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují a

f) detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidů jako nealergenního, pokud uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty (i ) po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem neuvolňují alespoň jeden mediátor nebo (ii ) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nedegranuíují.

23. Nejméně jeden protein nebo peptid detekovaný způsobem podle nároku 22 nebo nároku 10 pro použití při léčbě alergie.

24. Způsob léčby alergie u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidů detekovaného způsobem podle nároku 22 nebo nároku 10.