ES2445869T3 - Método para identificar proteínas y péptidos alergénicos - Google Patents

Abstract

Un método para identificar proteínas y péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína de leche de vacaalergénicos que comprende los pasos de: a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado del tejido de laglándula mamaria de una vaca lactante, b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína codificado por dichagenoteca de expresión, c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- okappa- caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca, d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína quemuestra capacidad de unión a IgE como se ha determinad en el paso c) con basófilos o células cebadas,e e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína como que esalergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto conal menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína del paso d).

Description

Método para identificar proteínas y péptidos alergénicos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para identificar proteínas y péptidos alergénicos según se define en las reivindicaciones. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para identificar proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína de leche de vaca alergénicos que comprende los pasos de a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de una vaca lactante, b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína codificada por dicha genoteca de expresión, c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca, d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína que muestra capacidad de unión a IgE como se determina en el paso c) con basófilos o células cebadas y e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína como alergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína del paso d).

Antecedentes de la invención

Aproximadamente el 2-8% de los lactantes menores de 3 años y aproximadamente el 2% de la población adulta están afectados por hipersensibilidades alimentarias. Aproximadamente el 80% de las reacciones alérgicas en niños son el resultado de la hipersensibilidad a la leche de vaca (LV), huevos de gallina y legumbres (por ejemplo, cacahuetes y soja). En la población adulta, sin embargo, la alergia a frutas, cacahuetes y frutos secos de árbol representan las hipersensibilidades con la mayor prevalencia.

La leche de vaca está entre los primeros alimentos introducidos en la dieta de un lactante y por tanto es una de las causas más comunes de alergia alimentaria en niños pequeños. Aproximadamente el 2,5% de los neonatos muestran reacciones adversas a la leche de vaca en el primer año de su vida.

Los síntomas de la alergia a la leche de vaca (ALV) son de tipo inmediato o retrasado y varían de reacciones moderadas a graves que afectan a la piel, el aparato respiratorio, el aparato digestivo y en el peor caso aparece como reacciones sistémicas potencialmente mortales (anafilaxia). En contraste a las reacciones de tipo retrasado celulares, las reacciones inmediatas están causadas por la producción de anticuerpos inmunoglobulina E (IgE) en respuesta a antígenos de otro modo inocuos (hipersensibilidad de tipo I). La interacción de los anticuerpos IgE con la molécula alergénica produce la activación específica de células efectoras (células cebadas, granulocitos basófilos) y una liberación posterior de mediadores inflamatorios como histamina, prostaglandina y leucotrieno que son responsables para las reacciones alérgicas de tipo inmediato.

La leche de vaca contiene más de 25 proteínas y se sabe que algunas de ellas son alergénicas. Mediante la acción de la quimosina (renina) o por acidificación de la leche a pH 4,6 se obtienen dos fracciones: El veinte por ciento de las proteínas se encuentran en la fracción del suero y el 80% de las proteínas comprenden la fracción de caseína. Las moléculas alergénicas están contenidas en ambas fracciones y se consideran alergenos principales o secundarios dependiendo de la incidencia de las respuestas alérgicas documentadas en la población ALV.

Los alergenos principales presentes en la leche de vaca son al alfa-lactoalbúmina, beta-lactoglobulina, alfaS1caseína, beta-caseína y kappa-caseína. Los alergenos secundarios presentes en la leche de vaca son alfaS2caseína, lactoferrina, seroalbúmina bovina e inmunoglobulina.

Alfa-lactoalbúmina (Bos d 4), beta-lactoglobulina (Bos d 5), inmunoglobulinas (Bos d 7), BSA y lactoferrina son los componentes reactivos con IgE bien conocidos en suero. AlfaS1-caseína, alfaS2-caseína, beta-caseína y kappacaseína con los alergenos potentes en la fracción de caseína (Bos d 8) (Wal, 2004).

En la fracción de suero la beta-lactoglobulina (BLG) y la alfa-lactoalbúmina (ALA) se consideran como los alergenos principales. La beta-lactoglobulina es una proteína globular y muy estable que pertenece a las lipocalinas, una superfamilia de proteínas, que se une a ligandos hidrofóbicos. Otros alergenos como los alergenos principales de los perros Can f 1 y Can f 2 y alergenos de otros animales con piel (caballo, gato y cobaya) también pertenecen a esta superfamilia de proteínas. La beta-lactoglobulina se produce de forma natural en una forma dimérica con un peso molecular de 36 kDa. Hay dos isoformas principales de beta-lactoglobulina, las variantes genéticas A (BLGA) y B (BLGB), que se diferencian en los aminoácidos 64 y 118 (ácido aspártico y valina en BLGA, glicina y alanina en BLGB). La estabilidad y el hecho de la beta-lactoglobulina pertenezca a la familia de las lipocalinas puede explicar el alto potencial alergénico de esta molécula.

La alfa-lactoalbúmina es un monómero ácido que se une a Ca2+ de 14 kDa estabilizado por cuatro puentes disulfuro. Es un componente regulador en el sistema galactosiltransferasa que sintetiza lactosa. El análisis de secuencia

mostró alta homología de secuencia de aminoácidos a la alfa-lactoalbúmina humana (hALA) y lisozima de huevo de gallina; un alergeno principal del huevo de gallina. La alergenicidad de la alfa-lactoalbúmina se puede explicar por su estabilidad.

En suspensión las proteínas de la fracción de caseína forman agregados ordenados (micelas) con una proporción constante de moléculas individuales: alfaS1 y alfaS2-caseína el 37% de cada una, beta-y kappa-caseína el 13% cada una. Las cuatro moléculas de caseína tienen poco homología en la estructura primaria, tienen diferentes propiedades funcionales, pero todas son proteínas fosforiladas con estructuras terciarias muy hidratadas, reomórficas que pueden ser degradadas fácilmente por algunas proteasas. Esta sensibilidad a la digestión proteolítica es una característica bastante inusual para un alergeno importante. Las caseínas de leche de vaca comparten homologías de secuencia de aminoácidos de hasta el 90% con caseínas de otros mamíferos, como cabra y oveja. Esta homología de secuencia podría ser la razón para la reactividad cruzada frecuentemente observada entre la leche de vaca y la leche de otros animales.

La presente invención aborda la necesidad de proporcionar métodos que permitan identificar proteínas y péptidos alergénicos presentes en una fuente biológica.

Compendio de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. Según esto, la presente invención se refiere a un método para identificar proteínas y/o péptidos alergénicos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína de leche de vaca que comprende los pasos de a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de una vaca lactante, b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína codificada por dicha genoteca de expresión, c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca, d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína que muestra capacidad de unión a IgE como se determina en el paso c) con basófilos

o células cebadas y e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína como alergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína del paso d).

Según una forma de realización preferida el método de la invención comprende además un paso de determinar la secuencia de aminoácidos de al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína identificado en el paso e).

Según otra forma de realización del método de la invención, la presencia de una proteína y/o péptido alfaS1-, alfaS2, beta o kappa-caseína se determina por espectrometría de masas.

Según una forma de realización preferida adicional del método de la invención, las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan antes de la espectrometría de masas.

Según una forma de realización más preferida del método de la invención, las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2, beta o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan por un método electroforético.

Según una forma de realización incluso más preferida del método de la invención, el método electroforético es electroforesis bidimensional.

Según otra forma de realización más preferida del método de la invención, las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2, beta o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan por cromatografía líquida de alta resolución.

Aspectos adicionales descritos en el presente documento

En el presente documento también se describe un método para identificar proteínas y péptidos alergénicos de la leche, que comprende los pasos de proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de una mamífero lactante, por ejemplo, una vaca lactante, que expresa al menos una proteína o péptido codificado por dicha genoteca de expresión, determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de mamífero, por ejemplo, leche de vaca, poner en contacto la dicha al menos una proteína o péptido que muestra una capacidad de unión a IgE con basófilos, eosinófilos o células cebadas, e identificar la dicha al menos una proteína o péptido como que es alergénico cuando dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido. Además en el presente documento se describe un método para identificar al menos una proteína o péptido alergénica de leche, que comprende los pasos de proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de una mamífero lactante, por ejemplo, una vaca lactante, que expresa al menos una proteína o péptido codificado por dicha genoteca de expresión, determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de mamífero, por ejemplo, leche de vaca, poner en contacto dicha al menos una proteína o péptido que muestra una capacidad de unión a IgE con basófilos, eosinófilos o células cebadas, e identificar la dicha al menos una proteína o péptido como que es alergénico cuando dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido. Por tanto también se describe en el presente documento el método como se

5 ha descrito en el presente documento anteriormente, en donde las proteínas y péptidos alergénicos son proteínas y péptidos alergénicos de leche, la al menos una genoteca de expresión comprende ADN o ADNc derivado del tejido de glándula mamaria de un animal lactante, por ejemplo, una vaca lactante, y el individuo que es sensible a la fuente alergénica es un individuo que es sensible a la leche de mamífero, por ejemplo, leche de vaca.

Según un aspecto adicional que también se describe en el presente documento los métodos descritos anteriormente pueden comprender además un paso de determinar la secuencia de aminoácidos de la al menos una proteína o péptido identificados por los métodos.

En el presente documento también se proporciona un método para identificar proteínas y/o péptidos alergénicos

15 codificados por una genoteca de expresión de ADN o ADNc, que comprende los pasos de proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de al menos una fuente de alergenos, expresar al menos una proteína o péptido codificado por dicha genoteca de expresión, determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la al menos una fuente de alergenos, en particular, leche de mamífero, por ejemplo, leche de vaca y formulaciones nutricionales que contienen leche de mamífero, por ejemplo, leche de vaca, poner en contacto dicha al menos una proteína o péptido que muestra una capacidad de unión a IgE con basófilos, eosinófilos o células cebadas, e identificar la dicha al menos una proteína o péptido como que es alergénico cuando dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido. Por tanto, en el presente documento también se describe un método para identificar al menos una proteína o péptido alergénico codificado

25 por una genoteca de expresión de ADN o ADNc, que comprende los pasos de proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de al menos una fuente de alergenos, expresar al menos una proteína o péptido codificado por dicha genoteca de expresión, determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la al menos una fuente de alergenos, poner en contacto dicha al menos una proteína o péptido que muestra una capacidad de unión a IgE con basófilos, eosinófilos o células cebadas, e identificar la dicha al menos una proteína o péptido como que es alergénico cuando dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido.

Un aspecto adicional que también se describe en el presente documento se refiere a un método para detectar

35 proteínas y péptidos alergénicos en una muestra que comprende leche de vaca que comprende el paso de determinar la presencia de al menos una proteína o péptido de las figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO: 22-84) y la tabla 1A, 1B y la tabla 2 (SEQ ID NO: 1-21).

Según este aspecto la leche de mamífero, por ejemplo, leche de vaca, puede ser una leche de mamífero hidrolizada, por ejemplo leche de vaca hidrolizada. Además, dicha presencia de al menos una proteína o péptido se puede determinar por espectrometría de masas. Las proteínas y péptidos presentes en la muestra se pueden aislar antes de la espectrometría de masas. Las proteínas y péptidos se pueden aislar por un método electroforético o por cromatografía líquida de alta resolución. El método electroforético puede ser electroforesis bidimensional.

45 También se describe en el presente documento una proteína o péptido identificado por el método descrito en el presente documento. Un aspecto adicional descrito en el presente documento se refiere a una proteína o péptido seleccionado de las figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO: 22-84) y la tablas 1A, 1B y la tabla 2 (SEQ ID NO: 1-21).

Otro aspecto que también se describe en el presente documento se refiere a al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento para su uso en el diagnóstico de una alergia o una predisposición para una alergia en un individuo. La alergia puede ser una alergia a la leche.

También se describe en el presente documento un método de diagnosticar una alergia o una predisposición para una alergia en un individuo que comprende administrar al menos una proteína o péptido como se ha mencionado en

55 el presente documento a un individuo que se sospecha que es alérgico o de volverse alérgico y evaluar si el individuo desarrolla una reacción alérgica contra la proteína o péptido.

Según este método la alergia o la predisposición para una alergia puede ser una alergia a la leche o una predisposición para una alergia a la leche. El método puede comprender además realizar una prueba cutánea y/o un análisis de sangre. La prueba cutánea se puede seleccionar de (i) una prueba de punción, (ii) una prueba intradérmica; (iii) una prueba del parche, o (iv) cualquier combinación de pruebas de (i) a (iii), en donde un resultado positivo de las pruebas (i) a (iv) es indicativo de una alergia o una predisposición para una alergia en un individuo. El análisis de sangre puede comprender los pasos de (i) poner en contacto al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento con una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma de dicho individuo, y (ii) 65 determinar si dicha al menos una proteína o péptido se une a un anticuerpo IgE en dicha muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma, en donde la unión de dicha al menos una proteína o péptido a un anticuerpo

IgE es indicativa de una alergia o una predisposición de una alergia en dicho individuo; y/o (i’) poner en contacto al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento con basófilos, eosinófilos o células cebadas de dicho individuo, y (ii’) determinar si dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas liberan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido al menos un mediador, o se desgranulan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido, en donde la liberación de dicho al menos un mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido o la desgranulación tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido es indicativa de una alergia o una predisposición para una alergia en dicho individuo.

También se describe en el presente documento al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento para su uso en una inmunoterapia de alergeno de una alergia en un individuo. La alergia puede ser una alergia a la leche.

Además en el presente documento se describe un método de inmunoterapia de alergeno para una alergia en un individuo que comprende administrar al menos una proteína o péptido descritos en el presente documento. La alergia puede ser una alergia a la leche.

También se describe en el presente documento un método para determinar una alergia o una predisposición para una alergia en un individuo, el método comprende a) poner en contacto al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento con una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma, en donde dicha muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma es o se ha aislado de dicho individuo, y b) determinar si dicha al menos una proteína o péptido se une a un anticuerpo IgE en dicha muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma, en donde la unión de dicha al menos una proteína o péptido a un anticuerpo IgE es indicativa de una alergia o una predisposición para una alergia en dicho individuo; y/o a’) poner en contacto al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento con basófilos, eosinófilos o células cebadas en donde dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas son o se han aislado de dicho individuo, y b’) determinar si dichos basófilos, eosinófilos

o células cebadas (i) liberan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido al menos un mediador, o (ii) se desgranulan tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido, en donde la liberación de al menos dicho mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido o la desgranulación tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido es indicativa de una alergia o una predisposición para una alergia en dicho individuo.

Según este método la alergia o la predisposición para una alergia puede ser una alergia a la leche o la predisposición para una alergia a la leche. Este método puede comprender además distinguir a individuos con una alergia grave de individuos que están sensibilizados pero son asintomáticos, y/o distinguir a individuos que se curan de una alergia de individuos que no se curan de una alergia.

Además, en el presente documento se describe un método para identificar una proteína o péptido de la leche no alergénico reactivo con IgE codificado por un ADN o ADNc de al menos una genoteca de expresión que comprende los pasos de: a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de un mamífero lactante, por ejemplo, una vaca lactante, b) expresar al menos una proteína o péptido codificado por dicha genoteca de expresión, c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de mamífero, por ejemplo, la leche de vaca, d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido que muestra una capacidad de unión a IgE como se ha determinado en el paso c) con basófilos, eosinófilos o células cebadas, e) determinar si dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas (i) liberan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido al menos un mediador, o (ii) se desgranulan tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido, y f) identificar la al menos una proteína o péptido como que es no alergénica cuando dichos basófilos, eosinófilos o células cebadas (i’) no liberan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido al menos un mediador, o (ii’) no se desgranulan tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido.

Según este método, la al menos una proteína o péptido identificado por el método o específicamente descrita en el presente documento es para uso en el tratamiento de una alergia. También se proporciona según este método un método de tratamiento de una alergia en un individuo que comprende administrar al menos una proteína o péptido identificado por el método o específicamente descrito en el presente documento.

El individuo o paciente descrito en el presente documento puede ser un ser humano. Los eosinófilos, células cebadas o basófilos son como regla de mamífero y pueden ser de origen humano. En general, el término “mamífero lactante” incluye mamíferos de las especies vaca, cabra, oveja, caballo, búfalo, camello pero no está limitada a las mismas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra la secuencia de aminoácidos deducida de los ADNc que codifican alfaS1-, y alfaS2-caseína de longitud completa reactivas con IgE y fragmentos de alfaS1-, y alfaS2-caseína reactivos con IgE. La secuencia de aminoácidos de alfaS1-, y alfaS2-caseína de longitud completa se muestran en la parte superior. La secuencia de los fragmentos de alfaS1-, y alfaS2-caseína reactivos con IgE (números de clon en el margen derecho) se muestran como líneas. Los números indican el primer y último aminoácido de cada clon.

La figura 1B muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de los ADNc que codifican beta-, kappa-caseína y 5 beta-lactoglobulina de longitud completa reactivas con IgE y fragmentos reactivos con IgE de estas proteínas.

La secuencia de aminoácidos de beta-, kappa-caseína y beta-lactoglobulina de longitud completa se muestran en la parte superior. La secuencia de los fragmentos reactivos con IgE (números de clones en el margen derecho) se muestran como líneas. Los números indican el primer y último aminoácido de cada clon. Las secuencias subrayadas en la secuencia de beta-caseína (superior) corresponden a péptidos no alergénicos identificados por análisis de espectrometría de masas de una leche maternizada hipoalergénica extensamente hidrolizada.

La figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos de alfa-lactoalbúmina, seroalbúmina bovina y lactoferrina.

15 La figura 2 muestra un cribado de IgE de una genoteca de ADNc de expresión de glándulas mamarias bovinas. Se indujo que células de E. coli Y1090 infectadas con fagos que portan la genoteca de ADNc sintetizaran las proteínas recombinantes. Estas proteínas se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa y se expusieron a IgE de suero de pacientes alérgicos a la leche seguido por incubación con anticuerpos anti-IgE humana marcados con 125I. En esta autorradiografía del filtro los clones reactivos con IgE aparecen como puntos negros.

La figura 3 muestra la actividad alergénica de las muestras y componentes de leche. La actividad biológica se determinó en ensayos RBL humanos. Los porcentajes de los sueros de los pacientes (n = 78) que dan una reacción positiva en ensayos RBL humanos se muestran como barras negras (eje y). Se analizaron los siguientes componentes de la leche: muestras de leche de diferentes especies (LC, leche de cabra; LV, leche de vaca; LO,

25 leche de oveja; LH, leche humana; LY, leche de yegua), la fracción de caseína de diferentes especies (CC, caseína de cabra; CV, caseína de vaca; CO, caseína de oveja), proteínas purificadas naturales (AC, alfa-caseína, BC, betacaseína; KC, kappa-caseína; ALA, alfa-lactoalbúmina, BLGB beta-lactoglobulina variante B; BLGA betalactoglobulina variante A; BSA, seroalbúmina bovina; SSA seroalbúmina de oveja, hALA, alfa-lactoalbúmina humana; Lf, lactoferrina), proteínas recombinantes (rAS1C, alfaS1-caseína recombinante; rAS2C, aS2-caseína recombinante; rBC, beta-caseína recombinante, rKC, kappa-caseína recombinante; rALA, alfa-lactoalbúmina recombinante; rBLG, beta-lactoglobulina recombinante), fragmentos recombinantes de BSA (F1, fragmento recombinante 1 de BSA; F2, fragmento recombinante 2 de BSA; F3, fragmento recombinante 3 de BSA) y péptidos sintéticos de aS1-caseína (Cas1-Cas6).

35 La figura 4 muestra una lista de secuencias de alergenos encontrados en la leche.

La figura 5 muestra la separación de una leche maternizada hidrolizada usando cromatografía nanolíquida seguida por MS de ionización de electroespray. Presentación del cromatograma iónico total de 1 μg de muestra de leche hidrolizada. Los tiempos de retención se muestran en el eje x y las intensidades de señal en cps (cuentas por segundo) se muestran en el eje y.

La figura 6 muestra una búsqueda Mascot y la identificación de péptidos derivados de beta-caseína en leche de vaca hidrolizada.

45 La figura 7 muestra péptidos derivados de beta-caseína identificados en leche de vaca hidrolizada como que no son reactivos a IgE.

Descripción detallada

Es el objeto de la presente invención proporcionar un método para identificar proteínas y/o péptidos alergénicos de la leche como se define por las reivindicaciones.

El método según la presente invención es particularmente adecuado para identificar proteínas y péptidos que muestran propiedades alergénicas. Para identificar las propiedades alergénicas de proteínas o péptidos solo se

55 requieren cantidades en la escala de microgramos o nanogramos. Estas proteínas y péptidos están codificados por una genoteca de ADN o ADNc que se obtiene de una fuente que se sabe que contiene o sintetiza proteínas y/o péptidos que provocan una reacción alérgica en un individuo. La fuente de alergeno puede comprender diferentes tipos de tejidos y células que pueden ser responsables para la biosíntesis de los alergenos. Si estas células y tejidos son conocidos es posible crear específicamente genotecas de ADN o ADNc de dichas células y tejidos, que se pueden usar en el método según la presente invención. Por ejemplo, se pueden identificar los alergenos de la leche de un mamífero, en particular de una vaca, aislando el ADN o ADNc del tejido de la glándula mamaria de mamíferos lactantes.

Las proteínas y péptidos expresados de la genoteca de expresión de ADN o ADNc se ponen en contacto con IgE de

65 al menos un suero de al menos un individuo que es sensible a la al menos una fuente de alergeno. En este primer paso se identifican esas proteínas y péptidos que son capaces de unirse a IgE, que es un prerrequisito para

reacciones alérgicas. El término “reactivo con IgE” según la presente invención significa la capacidad de una secuencia de aminoácidos de unirse a IgE. En un paso adicional los péptidos y proteínas que se unen a IgE se ponen en contacto además con basófilos o células cebadas, que se han cargado previamente con IgE de al menos un individuo que se sabe que es alérgico contra al menos un alergeno de la fuente de alergenos. Los basófilos o células cebadas que tienen moléculas de IgE específicas de alergeno liberan tras el contacto con un alergeno respectivo mediadores tales como histamina y/o otros mediadores alérgicos liberados por basófilos o células cebadas, lo que indica que los péptidos y proteínas capaces de unirse a IgE también son capaces de inducir la desgranulación de basófilos o células cebadas después de entrar en contacto con estas células. Los mediadores alergénicos adecuados preferiblemente son histamina, heparina, prostaglandina, leucotrieno, quimioquinas, citoquinas. Otros mediadores alergénicos que pueden ser útiles en el contexto de la presente invención incluyen βhexosaminidasa, peroxidasa de eosinófilos, ribonucleasa (RNasa), desoxirribonucleasa, lipasa, plasminógeno y proteína básica principal. El experto en la materia sabe bien de mediadores liberados por estas células que se pueden identificar por conocimiento de libro de texto común (véase, por ejemplo, Janeway at al. 2002: Immunology, Spektrum Akademischer Verlag; Edición: 5ª edición; Paul et al. 1989: Fundamental Immunology, Raven Press Ltd.; Segunda edición).

Esos miembros de la genoteca de ADN o ADNc que se unen a la IgE de un individuo alérgico y son capaces de inducir la desgranulación de basófilos o células cebadas se pueden aislar y su inserto de ADN o ADNc se puede secuenciar por métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, las proteínas y péptidos expresados por los respectivos miembros de la genoteca se pueden aislar por métodos conocidos en la técnica y analizar por espectrometría de masas o secuenciación de aminoácidos, por ejemplo.

Los miembros de la genoteca de ADN o ADNc pueden derivar de cualquier fuente que tenga material biológico que es conocido o desconocido que provoca reacciones alérgicas cuando se pone en contacto con un individuo. Por tanto, el término “fuente de alergenos” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier tipo de material biológico capaz de sintetizar alergenos.

El término “péptido” o “proteína” se pretende que signifique una secuencia de aminoácidos mantenida unida por enlaces peptídicos. “Péptido” como se usa en el presente documento significa que la moléculas que contiene aminoácidos contiene esencialmente hasta 250 aminoácidos, tal como hasta 200 aminoácidos, tal como hasta 150 aminoácidos, tal como hasta 100 aminoácidos, tal como hasta 50 aminoácidos, tal como hasta 45 aminoácidos, especialmente hasta 40 aminoácidos, tal como hasta 30 aminoácidos, tal como hasta 20 aminoácidos, y preferiblemente más de 2 residuos de aminoácidos. “Proteína”, como se usa en el presente documento, significa que la molécula que contiene aminoácidos contiene esencialmente más de 250 aminoácidos. En el límite superior (es decir, aproximadamente 250 aminoácidos), la presente invención puede usar el término proteína y péptido para el mismo tipo de molécula.

Los alergenos (sustancias que son capaces de provocar una reacción alérgica en un individuo) pueden ser sintetizados por varios organismos, incluyendo plantas y animales. La al menos una fuente de alergenos puede ser un animal, más particularmente un mamífero. Se sabe que los animales son una fuente de alergenos. Estos alergenos habitualmente están presentes en la caspa de los animales (por ejemplo, gato y perro) o escamas de la piel, así como en su saliva y orina. Los mamíferos, por ejemplo, secretan alergenos también en la leche. Por consiguiente, los mamíferos como la vaca, caballo, cabra, oveja, camello y búfalo pueden comprender una alta cantidad de alergenos. El ADNc y ADN usado para identificar tales alergenos se puede aislar de mamíferos lactantes, según lo cual el ADN o ADNc preferiblemente se obtiene del tejido de la glándula mamaria.

Otra fuente de alergenos son los ácaros como ácaros del polvo de las casas, pescado, huevo, etc. Se sabe que estos animales producen sustancias que causan una reacción alérgica en individuos.

Una fuente de alergenos adicional son plantas. En particular se sabe que las hierbas y los frutos secos producen alergenos. Por supuesto también los árboles, como el abedul, son una fuente de alergenos.

El ADN (tal como ADN genómico u otros tipos de ADN con la excepción de ADNc) o ADNc se puede obtener de la fuente de alergeno tal como leche de mamífero, preferiblemente leche de vaca o formulaciones nutricionales que contienen leche de mamífero, preferiblemente leche de vaca, por métodos conocidos en la técnica. Estas moléculas de ácido nucleico preferiblemente se obtienen de células y tejidos que se sabe o se sospecha que producen alergenos. Sin embargo, para reducir la cantidad de clones que se van a cribar para identificar alergenos se prefiere insertar moléculas de ADNc (las moléculas de ADNc derivan de ARNm) en genotecas de expresión, porque estas moléculas reflejan el conjunto de proteínas y péptidos expresados en las respectivas células y tejido. Según la presente invención, se puede usar cualquier método para preparar un ADNc de una célula que expresa (potencialmente) el alergeno. Tales métodos los conoce bien un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2ª ED. (1989) y Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology," (Current Protocol, 1994)). También hay números kits comercialmente disponibles para obtener ADNc bicatenario, por ejemplo el kit Superscript II o Superscript III (Invitrogen, EE UU, nº de catálogo 18580008), el kit de síntesis de ADNc de gran longitud (Clontech, EE UU, nº de catálogo K1048-1), el kit de síntesis de ADNc (Stratagene, EE UU, nº de catálogo 200301), y similares.

Las moléculas de ADNc o ADN se pueden ligar a secuencias de ADN enlazadoras que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados. Tales ADN enlazadores también se conocen en la técnica y están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Promega Corporation, EE UU y de New England Biolabs, EE UU.

5 Las moléculas de ADNc y ADN se pueden someter además a digestión con enzimas de restricción, fraccionamiento por tamaño en columnas o geles, o cualquier otro método adecuado que conoce el experto en la materia.

La genoteca de ADNc o ADN se inserta después en vectores de expresión que pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una etiqueta, secuencias que dirigen la replicación del ADN en células bacterianas, 10 secuencias que dirigen la transcripción del ADN y la traducción del ARNm en células eucariotas y similares. Los vectores de expresión adecuados que comprenden los elementos reguladores descritos se conocen en la técnica. La molécula de ADNc o ADN como se describe en el presente documento anteriormente se puede diseñar para la introducción directa o para la introducción a través de liposomas, vectores fagos o vectores víricos (por ejemplo, adenovírico, retrovírico) en una célula. Un vector de expresión en mamíferos típico contiene el elemento promotor, 15 que media el inicio de la transcripción del ARNm, la secuencia codificante de la proteína, y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y poliadenilación del transcrito. Además, también se pueden incluir elementos tales como origen de replicación, gen de resistencia a fármacos, reguladores (como parte de un promotor inducible). El promotor lac es un promotor inducible típico, útil para célula procariotas que se puede inducir usando el análogo de lactosa isopropiltiol-b-D-galactósido (“IPTG”). Para la expresión recombinante y secreción, la molécula de ADNc o 20 ADN de interés puede estar ligada (descrito en Ghahroudi et al, 1997, FEBS Letters 414:521-526). Los elementos adicionales podrían incluir potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para ayuste de ARN. Se puede alcanzar transcripción altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI, y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se pueden usar elementos celulares (por 25 ejemplo, el promotor de actina humano). Alternativamente, la proteína o péptido recombinante se puede expresar en líneas celulares estables que contienen la construcción génica integrada en un cromosoma. La cotransfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas. Los vectores de expresión preferiblemente incluirán al menos un marcador seleccionable. Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no están limitados a, células bacterianas, tales 30 como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto tales como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales, tales como células CHO, COS, 293 y de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios y condiciones de cultivo adecuados para las células huéspedes anteriormente descritas se conocen en la técnica. La inserción de las moléculas de la genoteca de ADNc o ADN (conjunto de ADNc o ADN de una célula o tejido específico) en vectores de expresión

35 produce genotecas de expresión.

La genoteca de expresión usada para expresar las moléculas de ADNc y ADN de la fuente de alergenos es preferiblemente una genoteca de presentación en fagos o una genoteca de expresión bacteriana. Los miembros (“construcciones”) de estas genotecas se insertan después en células capaces de expresar las proteínas y péptidos 40 codificados por el ADNc y ADN. Las células preferidas se seleccionan del tipo de vectores usados para crear las genotecas de ADNc y ADN. Si los vectores están diseñados para la expresión bacteriana, las células son células bacterianas. Las genotecas de ADNc y ADN se introducen en las células usando métodos (por ejemplo, transformación), que conoce bien el experto en la materia y descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Los pasos 45 siguientes de cultivo de células bacterianas para seleccionar los transformantes y para producir colonias bacterianas individuales (clones) se conocen bien en la técnica. Después de la selección de transformantes en placas de agar, las colonias bacterias cultivadas se pueden recoger individualmente y usar para inocular medios de cultivo líquidos organizados en matrices en un patrón en cuadrícula para formar soluciones madre bacterianas en cuadrícula, por ejemplo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Esta ordenación permite el crecimiento representativo de cada

50 clon bacteriano en un pocillo independiente y facilita la posterior subselección de conjuntos de clones de puntuación positiva.

Es particularmente preferido usar vectores para la genoteca de expresión que puedan secretar las proteínas y péptidos producidos al exterior de la célula. Las proteínas y péptidos secretados pueden comprender además un

55 dominio de anclaje a la membrana que permita inmovilizar las moléculas expresadas en la superficie de las células. El experto en la materia conoce métodos y medios para producir tales genotecas.

Para determinar la unión de moléculas de IgE específicas de alergenos a los péptidos y/o proteínas codificadas por las genotecas de ADNc o ADN la al menos una proteína o péptido se inmoviliza en un soporte sólido. El soporte

60 sólido posteriormente se pone en contacto con las moléculas de IgE derivadas de individuos que padecen una alergia y se determina la unión de dichas moléculas de IgE en dicho soporte sólido.

La unión de IgE a las proteínas y péptidos inmovilizados en un soporte sólido se puede lograr usando anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a IgE. Tales anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

El soporte sólido que se va a usar según la presente invención puede ser una membrana, preferiblemente una membrana de nitrocelulosa. Es particularmente preferido que estas membranas se pongan en contacto con las colonias bacterianas que portan la genoteca de ADNc o ADN presentes en una placa de agar para formar una réplica de estas colonias. Esta réplica se puede usar para detectar la unión de IgE específicas de alergeno a colonias específicas.

Se pueden usar basófilos o células cebadas que se han cargado con IgE específicas de alergeno de individuos que padecen una alergia para determinar el potencial alergénico de las proteínas o péptidos codificados por la genoteca de ADN o ADNc. Los basófilos o células cebadas pueden ser de cualquier origen mamífero, por lo cual se prefiere usar células de leucemia basófila de rata (RBL) humanizadas (por ejemplo, el clon RBL-703/21). Las células se pueden humanizar introduciendo y expresando ADN que codifica todo o una parte de un receptor de Fc humano, preferiblemente el ADN que codifica todo o una parte de un receptor I de IgE humano. Los métodos para la producción de células humanizadas se conocen en la técnica. Preferiblemente se usa el método como se describe en Hoffmann et al. (loc. lit.) para la producción de cultivos celulares humanizados. Los métodos para la producción de basófilos desgranulados se describen en Kleine Budde et al. (Int Arch Allergy Immunol, 126(4)).

Después de la identificación de las proteínas/péptidos que se pueden unir a IgE específicas de alergeno la secuencia de aminoácidos de la al menos una proteína o péptido que muestra una capacidad de unión a IgE como se determina en el paso c) preferiblemente se determina y la al menos una proteína o péptido que se puede unir a IgE específicas de alergeno se sintetiza químicamente o se produce de forma recombinante antes del paso d) y se puede usar en el paso d).

Según una forma de realización preferida de la presente invención el método según la presente invención comprende además un paso de determinar la secuencia de aminoácidos de la al menos una proteína o péptido identificado en el paso e).

La secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos codificados y expresados por la genoteca de ADN o ADNc se puede, por ejemplo, determinar por espectrometría de masas o por degradación de Edman. Si se usa tal método, las proteínas y/o péptidos expresados por la genoteca de ADN o ADNc se tiene que aislar antes de la secuenciación de aminoácidos. El aislamiento se puede lograr por métodos conocidos en la técnica. Para facilitar el aislamiento de las proteínas y péptidos se pueden fusionar a una etiqueta (por ejemplo, etiqueta de histidina). De forma alternativa, también es posible aislar el respectivo clon de ADN o ADNc y secuenciar el inserto de ADN o ADNc.

Los métodos adecuados para determinar una secuencia de aminoácidos de las proteínas y péptidos incluyen, pero no están limitados a, degradación de Edman, espectrometría de masas (en tándem) y similares (véase, por ejemplo, Edman, P. Mol. Biol. Biochem. Biophys., (1970), 8: 211-255; documento US 6.799.121). La secuencia de aminoácidos de las proteínas y péptidos se pueden comparar con secuencias de aminoácidos conocidas.

El término “espectrometría de masas” como se usa en el presente documento incluye varios métodos tales como espectrometría de masas en tándem, espectrometría de masas por desorción ionización laser asistida por matriz (MALDI) tiempo de vuelo (TOF), espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF, espectrometría de masas MALDI cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF), espectrometría de masas por ionización de electroespray (ESI)-TOF, ESI-Q-TOF, ESI-TOF-TOF, espectrometría de masas ESI-trampa de iones, espectrometría de masas ESI triple cuadrupolo, ESI espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS), MALDI-FTMS, MALDI-trampa de iones-TOF, y ESI-trampa de iones TOF. Estos métodos de espectrometría de masas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Gary Siuzdak, "Mass Spectrometry for Biotechnology", Academic Press, NY, (1996)). A su nivel más básico, la espectrometría de masas implica ionizar una molécula y después medir la masa de ion resultante. Puesto que las moléculas se ionizan de una manera que es bien conocida, el peso molecular de la molécula en general se puede determinar con precisión a partir de la masa del ion. La espectrometría de masas en tándem, por ejemplo, se puede usar para identificar proteínas porque puede proporcionar información además del peso molecular del ion parental. La espectrometría de masas en tándem implica obtener primero un espectro de masa del ion de interés, después fragmentar ese ion y obtener un espectro de masa de los fragmentos. Por tanto, la espectrometría de masas en tándem proporciona tanto información sobre el peso molecular como un patrón de fragmentación que se puede usar en combinación junto con la información de peso molecular para identificar la secuencia exacta de un péptido o proteína (véase, por ejemplo, Hunt et al. (1986) PNAS USA 83:6233-6237; Shevchenko et al. (1996) PNAS USA 93:14440-14445; Figeys et al. (1996) Anal. Chem. 68:1822-1828 y Wilm et al. (1996) Nature 379:466-469.

El término “muestra que comprende leche de mamífero, preferiblemente leche de vaca” según la presente solicitud se refiere a una muestra de alimentos o una muestra nutricional que contiene leche de mamífero, preferiblemente leche de vaca. Los ejemplos no limitantes son leche (de vaca), cuajada, nata, mantequilla, yogur y alimentos que contienen cualquiera de estos. Dentro de dicha muestra que contiene leche, preferiblemente leche de vaca, dicha al menos una de las proteínas o péptidos está presente en una cantidad que permite la determinación de la alergenicidad de una muestra que contiene leche, preferiblemente leche de vaca. Habitualmente una cantidad en la escala de microgramos o nanogramos de una proteína o péptido es suficiente para determinar la alergenicidad.

Las proteínas y péptidos identificados en las figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO: 22-84) y la tabla 1A, 1B y la tabla 2 (SEQ ID NO: 1-21) se pueden usar para determinar si una muestra que comprende leche de vaca comprende moléculas alergénicas. Si solo una de dichas proteínas o péptidos está presente en un muestra que comprende leche de vaca, se considera que la muestra es alergénica.

La al menos una proteína y péptido preferiblemente se determina mediante un inmunoensayo que implica anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a las proteínas y péptidos identificados en las figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO: 22-84) y la tabla 1A, 1B y la tabla 2 (SEQ ID NO: 1-21).

La al menos una proteína y/o péptido preferiblemente se determina mediante espectrometría de masas. Para identificar los componentes de la leche de mamífero, preferiblemente leche de vaca, presentes en una muestra que comprende leche de mamífero, preferiblemente leche de vaca, se puede aplicar espectrometría de masas. La espectrometría de masas permite identificar los componentes de la leche como se identifican en las figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO: 22-84) y la tabla 1A, 1B y la tabla 2 (SEQ ID NO: 1-21). Una comparación entre los fragmentos presentes en la muestra con las proteínas y péptidos de las figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO: 22-84) y la tabla 1A, 1B y la tabla 2 (SEQ ID NO: 1-21) permite determinar si dicha muestra comprende sustancias alergénicas derivadas de la leche de vaca.

Para alcanzar mejores resultados las proteínas y péptidos presentes en la muestra preferiblemente se aíslan antes de la espectrometría de masas. Este aislamiento se puede hacer por un método electroforético, preferiblemente electroforesis bidimensional, o cromatografía líquida de alta resolución.

El cribado de producto/proteínas/péptidos en el ensayo de unión a IgE (paso c)) y desgranulación de basófilos (células cebadas humanizadas) proporciona en efecto datos sobre al alergenicidad potencial, y estos métodos se usan en la práctica clínica. Sin embargo, los datos de la genoteca de expresión de ADNc añadirán una lista completa de péptidos/secuencias peptídicas alergénicos potenciales para alergenos particulares (por ejemplo, leche de vaca). La presente invención combina estos métodos (detección mejorada de estructuras alergénicas potenciales), lo que permite el uso de espectrometría de masas para verificar la presencia de estas estructuras alergénicas potenciales en matrices de producto. Esta combinación de una base de datos de secuencias de proteínas y péptidos de la leche alergénicos establecida en combinación con reactividad con IgE y desgranulación (bioactividad) debe servir como base para el desarrollo de un método más fiable, sensible y reproducible para la evaluación y predicción de la alergenicidad de productos que contienen leche. Aunque se ha usado un método similar para la identificación de alergenos del polen de gramíneas (Ball et al. 1994, Journal of Biological Chemistry, Vol. 269; Número del 11 de Nov., p. 28323-28328) los descubrimientos de la presente invención son sin embargo sorprendentes, ya que el experto en la materia no habría considerado que el método según las enseñanzas de Ball y col. 1994 o un método similar se podría aplicar con éxito a los alergenos de la leche. Para explicar adicionalmente, la unión a IgE de los alergenos del polen de las gramíneas así como la unión de IgE a otros alergenos respiratorios depende críticamente de los residuos de aminoácidos que están diseminados sobre el alergeno. Por tanto, los alergenos del polen de las gramíneas y alergenos respiratorios en general se ensamblan en epítopos de IgE conformacionales (discontinuos). Vrtatla et al. (J. Clin. Invest, Vol. 99, No 7, p. 1673-1681) muestran que la pérdida de esta conformación, por ejemplo, en fragmentos recombinantes derivados de alergenos conformacionales, produce una capacidad drásticamente reducida de unión a IgE y liberación de histamina de los basófilos de los pacientes. En contraste con los alergenos del polen de las gramíneas y alergenos respiratorios, los alergenos de la leche y los alergenos de los alimentos en general tienen epítopos que son no conformacionales sino sin plegar (Järvinen at al., Int Arch Allergy Immunol, Vol. 126, p. 111-118 y Järvinen et al., Allergy, Vol. 62, p. 758-765). Por tanto, el estado de la técnica solo reconoce la unión a IgE de alergenos sin plegar derivados de, por ejemplo, leche y huevo. La liberación de un mediador de basófilos o células cebadas no ha sido mostrada o sugerida al conocimiento de los inventores. Considerando las enseñanzas de Vrtatla y col. (loc. lit.) el experto en la materia asumiría que los fragmentos de alergenos y alergenos producidos de forma recombinante de la leche que no tienen reactividad con IgE tampoco tendrían la capacidad de inducir liberación de histamina de los basófilos de los pacientes. De forma similar, considerando las enseñanzas de Vrtatla y col. (loc. lit.) el experto en la materia asumiría que los fragmentos de alergenos y alergenos producidos de forma recombinante de la leche que tienen reactividad con IgE también tendrían la capacidad de inducir liberación de histamina de los basófilos de los pacientes. Por tanto, el paso de probar adicionalmente la liberación de histamina de proteínas y péptidos de la leche reactivos con IgE parecía, según el estado de la técnica, prescindible. Por el contrario, los inventores han encontrado sorprendentemente que solo un método que incluye los pasos de reactividad con IgE y liberación de un mediador de basófilos o células cebadas puede identificar de formar fiable proteínas y péptidos alergénicos de la leche. Se indica además que solo el ensayo combinado de reactividad de IgE y liberación de un mediador permite la evaluación fiable de la alergenicidad de una proteína o péptido derivado de la leche. Dependiendo del individuo que se va a probar, las proteínas y péptidos pueden inducir la liberación de un mediador o no. Por tanto, las proteínas y péptidos no alergénicos que solo muestran reactividad con IgE sin mediar la liberación de un mediador de basófilos o células cebadas se pueden distinguir de proteínas o péptidos alergénicos (alergenos). Por tanto, solo el método según la invención puede evaluar de forma fiable la alergenicidad de una proteína o péptido de la invención para un individuo particular, es decir, distinguir específicamente de unión a IgE no alergénica. En particular fue sorprendente que los métodos de la invención llevaran a la identificación de los péptidos indicados en las tablas 1A, 1B y tabla 2 (SEQ ID NO: 1-22), ya que todos estos péptidos son péptidos sin plegar y por tanto no tienen epítopos conformacionales.

Un método mejorado para detectar alergenos potenciales usando la genoteca de expresión de ADNc seguido por un sistema de expresión de péptidos en fagos y cribado funcional usando unión a IgE y desgranulación de basófilos o desgranulación de células cebadas mediada por IgE. Este planteamiento permite el seguimiento/cribado y el pronóstico de la presencia de potenciales alergenos de alimentos en materias primas, ingredientes y productos acabados con el fin de desarrollar y fabricar formulaciones nutricionales.

Las proteínas o péptidos alergénicos específicamente divulgados en el presente documento o identificados por los métodos descritos de la invención se pueden usar para diagnosticar una alergia o una predisposición a una alergia en un individuo, preferiblemente una alergia a la leche o una predisposición para una alergia a la leche.

El diagnóstico de una alergia implica en general realizar una prueba cutánea o análisis de sangre para determinar qué sustancia, o alergeno, puede desencadenar una respuesta alérgica en un individuo. Las pruebas cutáneas son habitualmente preferidas porque son rápidas, fiables y generalmente menos caras que los análisis de sangre, pero se puede usar cualquier tipo de prueba. Para una prueba cutánea una cantidad adecuada de al menos una proteína

o péptido alergénico específicamente divulgado en el presente documento o identificado por los métodos descritos en el presente documento se coloca sobre o debajo de la piel para determinar si se desarrolla una reacción alérgica. Hay varios tipos de pruebas cutáneas preferidas: (1) La prueba de la punción se hace colocando una gota de una solución que contiene dicha al menos una proteína o péptido alergénico (solución de alergeno) sobre la piel, y una serie de arañazos o punciones de aguja permite que la solución entre en la piel. Si la piel desarrolla un área roja, con picor aumentado (llamada una roncha), habitualmente significa que la persona es alérgica a ese alergeno. Esto se llama una reacción positiva. (2) Durante la prueba intradérmica, una pequeña de solución de alergeno se inyecta en la piel. Una prueba de alergia intradérmica se puede hacer cuando una sustancia no produce una reacción en la prueba de la punción pero aún se sospecha como alergeno para esa persona. (3) Para una prueba cutánea de parche, la solución de alergeno se coloca en una almohadilla que se ata con una cinta a la piel durante aproximadamente 24 a 72 horas. Esta prueba se usa para detectar una alergia en la piel llamada dermatitis de contacto. En un análisis de sangre una alergia en un individuo se puede determinar mediante los pasos de (i) poner en contacto al menos una proteína o péptido identificado por los métodos de la invención o específicamente divulgado en el presente documento con una muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma de dicho individuo, y (ii) determinar si dicha al menos una proteína o péptido se une a un anticuerpo IgE en dicha muestra de sangre, muestra de suero o muestra de plasma, en donde la unión de dicha al menos una proteína o péptido a un anticuerpo IgE es indicativa de una alergia o una predisposición a una alergia en dicho individuo; y/o (i’) poner en contacto al menos una proteína o péptido identificado por los métodos de la invención o específicamente divulgado en el presente documento con basófilos o células cebadas de dicho individuo, y (ii’) determinar si dichos basófilos o células cebadas liberan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido un mediador, o se desgranulan tras el contacto con la al menos una proteína o péptido, en donde la liberación de dicho al menos un mediador tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido o la desgranulación tras el contacto con dicha al menos una proteína o péptido es indicativa de una alergia o predisposición para una alergia en dicho individuo.

Además, las proteínas o péptidos alergénicos específicamente divulgados en el presente documento o identificados por los métodos descritos de la invención se pueden usar en una inmunoterapia de alergeno de una alergia en un individuo.

La inmunoterapia de alergeno (también denominada terapia de hiposensibilización, desensibilización inmunológica o inmunoterapia específica de alergeno) como se usa en el presente documento es una forma de inmunoterapia para trastornos alérgicos en la que el paciente se vacuna con dosis crecientemente mayores de un alergeno con el fin de inducir tolerancia inmunológica. La inmunoterapia de alergeno es la única estrategia de tratamiento que trata la causa subyacente del trastorno alérgico. Es una estrategia de tratamiento altamente beneficiosa que produce una calidad de vida mejorada y una reducción en los síntomas alérgicos y relacionados con alergenos. Se ha mostrado que la inmunoterapia produce remisión a largo plazo de los síntomas alérgicos, reduce la gravedad de las reacciones alérgicas asociadas así como reduce las posibilidades de desarrollar nuevas sensibilizaciones a alergenos. Esto se alcanza a través de inmunoterapia que modula la respuesta del sistema inmunitario a alergenos. La inmunoterapia de alergenos puede reducir la necesidad de medicación, la gravedad de los síntomas o eliminar la hipersensibilidad del todo. Además, la inmunoterapia específica de alergeno es la única opción de tratamiento que se sabe que modifica el proceso de enfermedad alérgica (con una probabilidad posible de curar la enfermedad), mientras que otras terapias solamente suprimen los síntomas.

Se prefiere que la al menos una proteína o péptido descrito en el presente documento para su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento o usos para diagnosticar o métodos y usos de inmunoterapia de alergenos está presente en una composición farmacéutica. El término “composición farmacéutica” como se usa en el presente documento se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica comprende los compuestos enumerados anteriormente. Opcionalmente, puede comprender además moléculas capaces de alterar las características de los compuestos descritos en el presente documento, por ejemplo, estabilizando, modulando y/o activando su función. La composición puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otros en forma de (un) polvo(s), (un) comprimido(s), (una) solución(es) o (un) aerosol(es). La composición farmacéutica puede, opcionalmente y además, comprender un

soporte farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite en agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, solventes orgánicos incluyendo DMSO, etc. Las composiciones que comprenden tales soportes se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. La pauta de dosis estará determinada por el médico y factores clínicos. Como es bien sabido en la artes médicas, las dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la ruta de administración, salud general y otros fármacos que se estén administrando al mismo tiempo. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación determinada se determinará mediante experimentación rutinaria y están dentro de las habilidades y juicio del médico habitual. Las composiciones farmacéuticas para uso como se han definido en el presente documento se pueden formular de una manera convencional según los métodos encontrados en la técnica, usando uno o más soportes o excipientes fisiológicos, véase, por ejemplo, Ansel et al., "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7ª edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. La composición farmacéutica se puede, según esto, administrar por vía oral, parenteral, tal como por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, transdérmica, transmucosa, subdural, local o tópica a través de iontoforesis, sublingual, mediante espray de inhalación, aerosol o por vía rectal y similares en formulaciones farmacéuticas que comprenden opcionalmente excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales. La composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar como único principio activo o se puede administrar en combinación con otros agentes.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de las secuencias de ADNc que codifican componentes de la leche reactivos con IgE y fragmentos de los mismos.

Para la identificación de proteínas reactivas con IgE y fragmentos de proteínas reactivos con IgE contenidos en la leche de vaca primero se construyó una genoteca de ADNc usando tejido de glándula mamaria de una vaca lactante. Esta genoteca se cribó con el suero de pacientes alérgicos a la leche de vaca. Se identificaron los ADNc que codifican alfaS1-, alfaS2-, beta-, kappa-caseína y beta-lactoglobulina de longitud completa reactivas con IgE así como fragmentos reactivos con IgE de las mismas. Este es un resultado bastante sorprendente ya que las proteínas de mamífero se produjeron en un sistema bacteriano que no añade modificaciones postraduccionales eucariotas que algunas veces pueden desempeñar un papel en la unión a IgE como se ha descrito para los alergenos principales de los ácaros del polvo (Jacquet et al., 2002). Las secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en la figura 1A-C (SEQ ID NO: 22-84). Los fragmentos de alergenos reactivos con IgE obtenidos permiten sacar conclusiones sobre la localización de los epítopos de IgE.

Protocolo experimental

Se obtuvieron la glándulas mamarias bovinas de una vaca (raza “Fleckvieh”) y el tejido fresco se congeló inmediatamente y se almacenó a -80ºC hasta su uso. Se aisló el ARN total del tejido y se obtuvo el ADNc usando un sistema de síntesis de ADNc. El ADNc purificado se insertó en fagos lambda usando el kit de clonación Lambda gt11/EcoR I/CIAP-Treated/Gigapack III (Stratagene, La Jolla, CA). Se infectaron células de E. coli Y1090 con la genoteca de fagos, se sembraron en placas de LB Amp (145 mm de diámetro). La expresión de proteínas bacterianas se indujo aplicando una membrana de nitrocelulosa (Whatman Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Las proteínas adsorbidas se incubaron con suero de pacientes de ALV y los anticuerpos IgE unidos se detectaron con un anticuerpo anti-IgE marcado con 125I (IBL, Hamburgo, Alemania). Las membranas se expusieron a películas de rayos X (Kodak, Rochester, NY). Los clones positivos cuyas proteínas podían unirse a IgE humana aparecían como puntos negros en las películas de rayos X (un ejemplo de una autorradiografía de tal membrana se muestra en la figura 2).

El ADN de fago de los clones positivos se amplificó usando el cebador directo de lambda gt11 (5' CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA TTC 3') y el cebador inverso de lambda gt11 (5' GAA TTC CAG CTG AGC GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3') y los productos amplificados por PCR se secuenciaron. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizaron comparándolas con una base de datos de secuencias (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Ejemplo 2: Discrepancia de actividad alergénica y reactividad con IgE de componentes de la leche.

Para evaluar si una molécula tiene potencial alergénico, se necesita demostrar no solo su reactividad con IgE sino también su actividad biológica. Un modelo científicamente aprobado para probar la reactividad biológica de moléculas es su inducción de la liberación de histamina de granulocitos basófilos humanos (Purohit 2005). Para este fin se usó una línea de células de leucemia basófila de rata que expresa la cadena α del receptor FcεRI humano (Hoffmann et al., Int Arch Allergy Immunol, Vol. 126(4), p. 277-285). Se probaron diferentes componentes de la leche (n = 33) incluyendo extractos de leche entera de diferentes especies, fracciones de leche, proteínas de leche de vaca naturales y recombinantes purificadas, y fragmentos de proteínas recombinantes. Se determinaron los porcentajes de 78 pacientes cuyos anticuerpos IgE en suero desencadenan la liberación de β-hexosaminidasa de

5 células RBL humanizadas en respuesta a los componentes individuales de la leche (figura 3).

El componente activador de células más potente fue la leche de vaca con un índice de estimulación del 47,4% (figura 3, panel “muestras de leche”). Pero también la leche de cabra y la de oveja dieron valores del 35,9 y 28,2%, respectivamente, lo que confirma la reactividad cruzada de las proteínas de la leche de diferentes especies. De los 10 componentes individuales, las proteínas purificadas, las caseínas (AC, BC, KC) así como beta-lactoglobulina A (BLGA) mostraron las actividades más altas y desencadenaron una liberación en caso del 25 al 34,6% de los sueros de los pacientes. De forma interesante, la forma recombinante de alfa-lactoalbúmina (rALA) desencadenó una liberación mucho mayor que su equivalente natural. Cada uno de los péptidos sintéticos tuvo un potencial activador de células bastante bajo ya que se alcanzaron índices de estimulación del 2,6 al 7,7%. La actividad biológica se

15 comparó a la reactividad con IgE (tabla 2).

Tabla 2: Capacidad de unión a IgE y actividad biológica de los componentes de la leche; discrepancia entre IgE y actividad alérgica de los componentes de la leche. Los componentes de la leche muestran mayor reactividad con IgE que actividad alergénica en ensayos de RBL humanos.

20 La gran mayoría de los componentes de la leche probados como leche de vaca y cabra, beta-lactoglobulina natural purificada variante A y B (BLGA y BLGB) y la alfaS1-(rAS1C) y alfaS2-caseína (rAS2C) recombinantes mostraron porcentajes aproximadamente dos veces mayores de reactividad con IgE que actividad biológica. Tales descubrimientos se pueden explicar por la presencia de epítopos de unión a IgE, que se pueden unir a IgE, pero que

Actividad biológica (% de pacientes)

Unión a IgE (% de pacientes)

muestras de leche

LC 35,9 69,2

LV

47,4 85,9

LO

28,2 82,1

LH

9,0 17,9

LY

9,0 29,5

fracciones de caseína

CC 24,4 46,2

CV

41,0 52,6

CO

28,2 46,2

Proteínas naturales purificadas

AC 25,6 50,0

BC

34,6 44,9

KC

25,6 30,8

ALA

11,5 65,4

BLGA

28,2 50,0

BLGB

19,2 51,3

BSA

2,1 6,4

SSA

2,6 1,3

hALA

6,4 30,8

Lf

2,6 5,1

proteínas recombinantes

rAS1C 19,2 48,7

rAS2C

5,1 9,0

rBC

10,3 55,1

rKC

6,4 21,8

rBLG

12,8 23,1

rALA

21,8 25,6

Fragmentos de BSA recombinantes

BSA_F 1 4,3 2,1

BSA_F 2

4,3 8,5

BSA_F 3

8,5 8,5

péptidos sintéticos de AS1C

Cas 1 6,4 43,6

Cas 2

3,8 15,4

Cas 3

2,6 46,2

Cas 4

3,8 35,9

Cas 5

5,1 41,0

Cas 6

7,7 37,2

5 no pueden entrecruzar IgE unida al receptor y desencadenar la liberación de mediadores. Solo en el caso de cinco componentes (fragmento recombinante 3 de BSA (F3), alfa-lactoalbúmina recombinante (rALA), fracción de caseína de vaca (CV), kappa-(KC) y beta-caseína (BC) purificadas naturales) los porcentajes de reactividad con IgE y la actividad biológica alcanzaron valores similares. El grado de desgranulación con los péptidos sintéticos derivados de alfaS1-caseína fue de extensión bastante baja desde aproximadamente un décimo (Cas 3, Cas 4, Cas 5) a un cuarto (Cas 2, Cas 6) de la actividad de la proteína completa.

Se encontró que muchos de los péptidos de alfaS1-caseína reactivos con IgE no podían inducir desgranulación en el ensayo de liberación de basófilos y por tanto representan haptenos reactivos con IgE. Por tanto, estos péptidos (haptenos) son no alergénicos. Este resultado implica que probar IgE exclusivamente produciría conclusiones falsas

15 positivas respecto a la evaluación de la alergenicidad. Por otra parte, los haptenos reactivos con IgE pueden ser útiles como agentes terapéuticos para saturar IgE unido a células cebadas antes de la exposición al alergeno y pueden ser candidatos útiles para una inmunoterapia segura de enfermedades alérgicas. Los péptidos derivados de alfaS1-caseína que se unen a IgE y desencadenan la liberación de basófilos se han identificado adicionalmente y se identificaron los sueros de unos pocos pacientes que no mostraron reactividad con IgE a algunos péptidos pero indujeron desgranulación de basófilos con estos péptidos. El último resultado se puede explicar por la mayor sensibilidad del ensayo de liberación de basófilos.

En resumen, la comparación entre medidas de reactividad con IgE y actividad biológica revela que los sueros de los pacientes muestran mayor capacidad en la unión a IgE que en la inducción de la desgranulación de basófilos. El

25 hecho de que los ensayos de alergenicidad reflejan el potencial de una molécula de producir síntomas alérgicos implica que la medida de la reactividad con IgE sola no se puede usar para identificar con certeza los componentes alergénicos, sino que se necesita complementar por un ensayo biológico.

La combinación de ambos ensayos, evaluación de la capacidad de unión a IgE y reactividad biológica, permite generar una base de datos que contiene proteínas/fragmentos/péptidos alergénicos que se pueden detectar por espectrometría de masas. La figura 4 muestra una lista de secuencias de péptidos y proteínas alergénicas de la leche que representa un prototipo de tal base de datos. Se enumeran componentes de la leche probados para la reactividad con IgE de suero así como para reactividad alergénica. Se enumera la información respecto a los nombres de los alergenos, los pesos moleculares (MW) en kilodalton (kDa), la función y la preparación de los

35 alergenos así como las referencias.

Protocolo experimental

Se usaron sueros de 78 pacientes que se seleccionaron según una historia clínica positiva, reacciones de punción positivas y determinación de IgE específicas a extracto de leche de vaca usando el sistema CAP-FEIA (Phadia, Upsala, Suecia). Los sueros se obtuvieron de cinco adultos y 73 niños (30 chicas y 43 chicos) de Austria, Alemania, Italia, España y Francia.

Las proteínas purificadas y las fracciones de caseína se compraron de Sigma Aldrich (St. Louis, EE UU). Las

45 proteínas recombinantes y los fragmentos de BSA recombinantes se expresaron en E. coli como se describe por (Vrtala et al., 1997). Los péptidos de alfaS1-caseína se sintetizaron en un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems modelo 433A como se describe (Focke et al., 2001).

Las células de leucemia basófila de rata (RBL) humanizadas (clon RBL-703/21) se incubaron en placas de microtitulación durante la noche a 37ºC (CO2 al 7%, humedad del 95%) con 50 μl de suero humano, diluido 1:10. Después de ello las células se lavaron y expusieron a componentes de la leche, diluidos a 0,3 μg/ml de proteína en tampón Tyrodes que contenía D2O al 50% y BSA/HAS al 0,1% durante 1 hora a 37ºC (CO2 al 7%, humedad del 95%). También se evaluó la liberación espontánea de las células. Por último, los sobrenadantes de las células se incubaron con 50 μl de solución de ensayo (ácido cítrico o citrato de sodio 0,1 M, p H 4,5, 4-metil umbeliferil-N-acetil

55 β-D-glucosaminida) en placas de microtitulación nuevas a 37ºC (CO2 al 7%, humedad del 95%) durante 1 hora. Las reacciones se pararon mediante la adición de 100 μl de tampón glicina por pocillo y se midió la fluorescencia a λex: 360 y λem: 465 usando un lector de microplacas fluorescente. Se calculó la liberación específica de hexosaminidasa de cada muestra usando la fórmula: [(Fls -FlSp) : (Flz -FlSp)] x 100 (donde Fls es la fluorescencia de la muestra; FlSp es la fluorescencia de la liberación espontánea y Flz es la fluorescencia de la liberación total).

Ejemplo 3: Identificación de proteínas y/o péptidos con y sin actividad alergénica en muestras de leche y en productos derivados de leche por espectrometría de masas.

Una base de datos de secuencias de proteínas y péptidos alergénicos de la leche establecida por la combinación de

65 reactividad con IgE y actividad alergénica puede servir como base para el desarrollo de un método fiable, reproducible, analítico para la evaluación y predicción de la alergenicidad de muestras de leche y productos

derivados de leche. Se usó espectrometría de masas para detectar componentes potencialmente alergénicos en muestras de leche complejas. Como ejemplo, se aplicó espectrometría de masas en combinación con cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) anterior para el análisis de una leche maternizada hipoalergénica extensamente hidrolizada, comercialmente disponible. El análisis del cromatograma mostrado en la figura 5 y los espectros de masas extraídos demostró que todas las proteínas se habían hidrolizado a péptidos pequeños de una longitud máxima de 14 aminoácidos.

En particular, la figura 5 muestra la separación de una leche maternizada hidrolizada usando cromatografía nanolíquida seguida por MS de ionización de electroespray. Presentación del cromatograma de ión total de 1 μg de muestra de leche hidrolizada. Los tiempos de retención se muestran en el eje x y las intensidades de señal en cps (cuentas por segundo) se muestran en el eje y.

Una búsqueda en bases de datos usando los algoritmos de búsqueda MASCOT produjo la identificación de varios péptidos pequeños de los cuales tres se identificaron como alergeno derivado de la leche, es decir, beta-caseína (Bos d beta, figura 6). En la figura 6 se representan una búsqueda Mascot y la identificación de péptidos derivados de beta-caseína en leche de vaca hidrolizada. En la parte superior se menciona beta caseína, el único alergeno de la leche identificado en espectrometría de masas, con su masa molecular y pI calculado. Debajo se dan los parámetros de búsqueda y la cobertura de secuencia obtenida de beta-caseína. La parte inferior muestra la secuencia de beta-caseína con los péptidos coincidentes impresos en negrita. El alergeno beta-caseína se identificó con coincidencias de péptidos: HQPHQPLPPT (masa calculada de 1,25 kDa, correspondiente a los aa 160-170 de beta-caseína), VYPFPGPIPN (masa calculada de 1,19 kDa, correspondiente a los aa 74-84 de beta-caseína), SSSEE (masa calculada de 0,65 kDa, correspondiente a los aa 31-36 de beta-caseína), y PVVVPP (masa calculada de 0,87 kDa, correspondiente a los aa 96-103 de beta-caseína). En la figura 7 se muestra el ensayo de la reactividad con IgE de estos péptidos (Tabla 1: cas b-1, 2, 3 y 4; figura 7). Los péptidos derivados de beta-caseína identificados en leche de vaca hidrolizada no son reactivos con IgE. La reactividad con IgE de la leche vaca (LV) transferida en mancha a nitrocelulosa, beta-caseína recombinante (rBC), péptidos sintéticos derivados de beta-caseína (cas b-1, cas b-2, cas b-3, cas b-4) y alfaS1-caseína recombinante (rAS1C) se analizaron mediante ensayo de inmunotransferencia en mancha. Los componentes de la leche unidos a nitrocelulosa se incubaron con los sueros de tres pacientes alérgicos a la leche de vaca (carriles 1, 2 y 3) y un individuo no alérgico (carril C). Los anticuerpos IgE unidos se detectaron con anticuerpos anti-IgE marcados con 125I. Esta figura y estos resultados muestran que representan péptidos no alergénicos, es decir, son demasiado cortos para unirse a anticuerpos IgE y se podrían distinguir de péptidos alergénicos y reactivos con IgE como se define en la base de datos de péptidos/proteínas de leche de vaca reactivos con IgE y alergénicos. Además, son diferentes de las principales regiones de unión a IgE publicadas de beta-caseína (aa 1-16, aa 83-92, aa 135-144; Chatchatee 2001). Ninguno de los otros alergenos de la leche reactivos con IgE y fragmentos de alergenos obtenidos por cribado de la genoteca de expresión de ADNc (figura 1) se detectaron en la muestra de leche hidrolizada que por tanto se pudo identificar como una preparación no alergénica. Por tanto, se demostró -usando leche extensamente hidrolizada-que el análisis por LC-MS se puede usar para la identificación de preparaciones/muestras de leche no alergénicas.

Tabla 1. A) Péptidos sintéticos de αS1-caseína y fragmentos de BSA. Se enumeran el nombre de los péptidos, su secuencia de aminoácidos, longitud, pI y peso molecular en kDa.

Péptido

Secuencia Longitud (aa) pI MW (kDa)

Cas 1

RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVC 32 8,22 3,75

Cas 2

FGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAES 33 4,18 3,70

Cas 3

ISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYEQLLRC 36 4,80 4,21

Cas 4

CLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKE 34 8,14 3,96

Cas 5

CPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYV 35 4,14 4,24

Cas 6

PLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLWC 33 3,92 3,60

BSA F1

MRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKL VNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADC CEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYL VEIARRHPYFYAPELLYVANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREK VLTSSHHHHHH 190 5,95 23,9

BSA F2

MARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTK VHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHC IAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRH PEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEHHHH HH 189 5,94 22,6

BSA F3

MPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLG KVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTES LVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALV ELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLWST QTALAHHHHHH 200 7,54 23,4

B) Péptidos sintéticos de β-caseína. Se enumeran el nombre de los péptidos, su secuencia de aminoácidos, longitud, pI y peso molecular en kDa.

Péptido

Secuencia Longitud (aa) pI MW (kDa)

cas b-1

HQPHQPLPPTV 11 6,92 1,25

cas b-2

VYPFPGPIPNS 11 5,49 1,19

cas b-3

LSSSEE 6 4,24 0,65

cas b-4

PVVVPPFL 8 5,96 0,87

Protocolo experimental:

Se analizó leche maternizada hidrolizada por HPLC de fase reversa usando un sistema de cromatografía nanolíquida (Ultimate, LC Packings Dionex, Los Países Bajos) conectado a la interfase de nanoespray de un 10 espectrómetro de masas (Brucker Daltonik, Alemania). Se hizo una búsqueda de los espectros de masa obtenidos contra la base de datos de proteínas SwissProt usando algoritmos de búsqueda de software MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido). Para el análisis de transferencia en mancha, 1 μg de proteína se transfirió en manchas a nitrocelulosa, y se incubó con sueros de pacientes alérgicos a la leche diluidos 1:20 en PBST (PBS, Tween 20 al 0,5% v/v). Los anticuerpos IgE unidos se detectaron con anticuerpos anti-IgE humanos marcados con

15 125I (IBL, Alemania) diluidos 1:15.

Ejemplo 4: Mapeo de epítopos de alfa-lactoalbúmina (ALA) bovina para identificar péptidos derivados de ALA reactivos con IgE.

20 Métodos:

Síntesis de péptidos derivados de ALA: Los péptidos derivados de ALA (Lac1-Lac8) mostrados en la tabla I se sintetizaron usando la estrategia de Fmoc (9 fluorofenilmetoxicarbonilo) con activación con HBTU [hexfluorofosfato de (2-/1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) (ciclos a pequeña escala de 0,1 mmoles) en un sintetizador de

25 péptidos de Applied Biosystems modelo 433A (Foster City, CA) y se purificaron como se ha descrito (Focke et al., Faseb J 15:2042-2044).

Ensayo de reactividad de IgE a péptidos derivados de ALA: Las reactividades a IgE de los péptidos derivados de ALA se determinaron por análisis de micromatrices como se ha descrito (Schulmeister et al., J lmmunol. 30 182(11):7019-29). Brevemente, los componentes de la leche se diseminaron en una membrana de flujo capilar en un cubreobjetos de vidrio de microscopio normal y se incubaron con 25 μl de sueros de pacientes. Los anticuerpos IgE unidos se detectaron con un anticuerpo anti-IgE conjugado con fluorescencia a una longitud de onda de 670 nm. El nivel umbral se ajustó para cada paciente como el valor doble del valor individual ganado con seroalbúmina humana.

35 Resultados

Identificación de epítopos de ALA que son reactivos con anticuerpos IgE

Para identificar los epítopos de ALA reactivos con IgE se sintetizaron 8 péptidos que abarcan la secuencia de ALA

40 (tabla 2). Los 8 péptidos tenían una longitud de 19-20 aminoácidos con solapamientos de 5 aminoácidos. La reactividad con IgE de los 8 péptidos solapantes se evaluó por análisis de micromatrices usando sueros de 36 pacientes que muestran reactividad de IgE hacia rALA. Se encontró que el 30,6% de los pacientes reaccionaron a Lac1, el 33,3% a Lac2, el 5,6% a Lac4, el 2,8% a Lac5, Lac6, y Lac7, y el 11,1% a Lac8 (tabla 3). En total 19 de los 36 pacientes con reactividad de IgE hacia rALA reaccionaron con al menos un péptido sintético derivado de ALA.

45 Tabla 2. Péptidos sintéticos derivados de ALAª

Péptido

Secuencia Longitud (aa) pI MW (kDa)

Lac1

EQLTKCEVFRELKDLKGYG 19 6,34 2,26

Lac2

LKGYGGVSLPEWVCTTFHTS 20 6,74 2,18

Lac3

TFHTSGYDTQAIVQNNDSTE 20 4,31 2,23

Lac4

NDSTEYGLFQINNKIWCKDD 20 4,42 2,40

Lac5

WCKDDQNPHSSNICNISCDK 20 5,30 2,31

Lac6

ISCDKFLDDDLTDDIMCVKK 20 4,11 2,32

Lac7

MCVKKILDKVGINYWLAHKA 20 9,52 2,33

Lac8

LAHKALCSEKLDQWLCEKL 19 6,74 2,23

ª Abreviaturas usadas en la tabla: Lac1-Lac8, péptidos derivados de ALA 1-8; aa, aminoácidos; pI, punto isoeléctrico; MW, peso molecular; kDa, kilodalton.

Tabla 3. Capacidad de unión a IgE de péptidos derivados de alfa-lactoalbúmina probados con sueros de los 36 pacientes con reactividad hacia rALA

n = 36

Unión a IgE (% de pacientes)

ALA recombinante

rALA 100,0

péptidos sintéticos de ALA

Lac1 30,6

Lac2

33,3

Lac3

0

Lac4

5,6

Lac5

2,8

Lac6

2,8

Lac7

2,8

Lac8

11,1

Lista de secuencias

<110> Valenta, Rudolph Van Tol, Ric

10 Herz, Udo Focke-Tejkl, Margarete Hochwallner, Heidrun Schulmeister, Ulrike Swoboda, Ines

<120> MÉTODO PARA IDENTIFICAR PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS ALERGÉNICOS

<130> R2869 PCT

20 <150> US 61/196.417

<151>

<160> 84

25 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> PRT 30 <213> Bos taurus

<400> 1

35 <210> 2

<211> 33

<212> PRT

<213> Bos taurus

40 <400> 2

<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 3

<210> 4 10 <211> 34

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 5

<211> 35

<212> PRT 20 <213> Bos taurus

<400> 5

25 <210> 6

<211> 33

<212> PRT

<213> Bos taurus

30 <400> 6

<210> 7

<211> 205

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 7

10

<210> 8

<211> 197

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 8

<210> 9

<211> 208

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 10

10 <210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Bos taurus

15 <400> 11

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 13

<211> 8

<212> PRT 10 <213> Bos taurus

<400> 13

<210> 14 15 <211> 19

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 15

<211> 20

<212> PRT 25 <213> Bos taurus

<400> 15

30 <210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

35 <400> 16

<210> 17

<211> 20 40 <212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 18

10

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 19

<210> 20 20 <211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 21

<211> 19

<212> PRT 30 <213> Bos taurus

<400> 21

35 <210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 22 <210> 24

5

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> Bos taurus

10

<400> 23

<211> 208

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 25

<211> 203

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 25 <210> 26

<211> 196

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 26 <210> 27

<211> 195

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 27 <210> 28

<211> 174

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 29

<211> 167

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 29

10 <210> 30

<211> 142

<212> PRT

<213> Bos taurus

15 <400> 30

<210> 31

<211> 139

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 31 <210> 32

<211> 137

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 33

<211> 130 <212> PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 33

<210> 34

<211> 117

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 35

<211> 111

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 35 <210> 37

10

<210> 36

<211> 108

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 36

<211> 104

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 38

<211> 95

<212> PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 38

<210> 39

<211> 83

<212> PRT

<213> Bos taurus

<211> 79

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 40 <210> 41

<211> 77

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 41 <210> 43

10

<210> 42

<211> 70

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 42

<211> 67

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 43

10

<210> 44

<211> 58

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 44

<210> 45 20 <211> 44

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 45

<210> 46

<211> 31

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 46

10

<210> 47

<211> 13

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 47

<210> 48

<211> 97 20 <212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 48

<210> 49

<211> 84

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 49

10

<210> 50

<211> 60

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 50

<210> 51 20 <211> 45

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 51

<210> 52

<211> 171

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 53

<211> 200 <212> PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 53 <210> 55

5

<210> 54

<211> 222

<212> PRT

<213> Bos taurus

10

<400> 54

<211> 199

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 55 <210> 56

<211> 224

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 56 <210> 57

<211> 181

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 57 <210> 58

<211> 90

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 58 <210> 59

<211> 88

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 60

<211> 85

<212>

PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 60

<210> 61

<211> 84

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 62

<211> 80

<212>

PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 62

<210> 63

<211> 74

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 63 <210> 65

10

<210> 64

<211> 66

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 64

<211> 65

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 65 <210> 67

10

<210> 66

<211> 223

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 66

<211> 83

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 67 <210> 68

<211> 96

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 68

10 <210> 69

<211> 50

<212> PRT

<213> Bos taurus

15 <400> 69

<210> 70

<211> 116

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 71

<211> 50

<212> PRT 15 <213> Bos taurus

<400> 71

<210> 72

<211> 37

<212> PRT

<213> Bos taurus

<211> 110

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 73 <210> 74

<211> 99

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 74

10 <210> 75

<211> 77

<212> PRT

<213> Bos taurus

15 <400> 75

<210> 76

<211> 64 20 <212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 76

<210> 77

<211> 190

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 78

<211> 120

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 78 <210> 80

10

<210> 79

<211> 93

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 79

<211> 60

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 80

10

<210> 81

<211> 38

<212> PRT

<213> Bos taurus

15

<400> 81

<210> 82 20 <211> 141

<212> PRT

<213> Bos taurus

<210> 83

<211> 606

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 83

<210> 84

<211> 709

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 84

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para identificar proteínas y péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína de leche de vaca alergénicos que comprende los pasos de:

   a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado del tejido de la glándula mamaria de una vaca lactante,

   b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína codificado por dicha genoteca de expresión,

   c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca,

   d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína que muestra capacidad de unión a IgE como se ha determinad en el paso c) con basófilos o células cebadas, e

   e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína como que es alergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína del paso d).

2. 2.

   El método según la reivindicación 1, en donde el método comprende además un paso de determinar la secuencia de aminoácidos de la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína identificada en el paso e).

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de al menos una proteína y/o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína se determina por espectrometría de masas.

4. 4.

   El método de la reivindicación 3, en donde las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan antes la espectrometría de masas.

5. 5.

   El método de la reivindicación 4, en donde las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan por un método electroforético.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5, en donde el método electroforético es electroforesis bidimensional.

7. 7.

   El método de la reivindicación 4, en donde las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan por cromatografía líquida de alta resolución.

   Componente de la leche

   Nombre MW (kDa)

   proteínas purificadas

   α-caseína β-caseína κ-caseína α-lactoalbúmina β-lactoglobulina, variante A β-lactoglobulina, variante B lactoferrina seroalbúmina bovina seroalbúmina de oveja α-lactoalbúmina humana fracciones de leche

   Bos d 8 alfa Bos d 8 beta Bos d 8 kappa Bos d 4 Bos d 5 A Bos d 5 B Bos d lactoferrina Bos d 6 Ovi SSA Hom s lactoalbúmina 25,5 (αS1) 26 (αS2) 24,0 19,0 14,2 18,3 18,3 80 66,3 24,3 16,2

   caseína de vaca caseína de oveja caseína de cabra proteínas recombinantes

   Bos d 8 Ovi a caseína Cap b caseína 19-26 24,3 24,3

   ταS1-caseína ταS2-caseína τβ-caseína τκ-caseína τα-lactoalbúmina τβ-lactoglobulina fragmentos recombinantes

   Bos d 8 alfaS1 Bos d 8 alfaS2 Bos d 8 beta Bos d 8 kappa Bos d 4 Bos d 5 B 23,9 25,3 24,3 19,9 19,2 15,1

   fragmento 1 de BSA, AA 1-190 fragmento 2 de BSA, AA 200-389 fragmento 3 de BSA, AA 390-590 péptidos de α-caseína

   23,9 22,6 23,4

   Cas1, AA 1-31 Cas2, AA 32-64 Cas3, AA 65-100 Cas4, AA 101-133 Cas5, AA134-167 Cas6, AA 168-199 péptidos de α-lactoalbúmina

   3,8 3,8 4,3 3,9 4,2 3,6

   Lac1, AA 1-19 Lac2, AA 15-34 Lac3, AA 30-49 Lac4, AA 45-64 Lac5, AA 60-79 Lac6, AA 75-94 Lac7, AA 90-109 Lac8, AA 105-123 muestras de leche entera

   2,3 2,2 2,2 2,4 2,3 2,3 2,3 2,2

   leche de vaca leche de oveja leche de cabra leche de yegua leche humana

   Bos d Ovi a Cap h Equ c Hom s

   Fig. 4a

   Línea coincidente con la Figura 6b

   Línea coincidente con la figura 6a

   Función

   Preparación Referencia

   transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio subunidad reguladora de lactosa sintasa lipocalina, se une a retinol lipocalina, se une a retinol transferrina, proteínas transportadoras de unión a hierro regulación de la presión osmótica de la sangre regulación de la presión osmótica de la sangre subunidad reguladora de lactosa sintasa

   natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada Stewart A.F. et al., 1984, X00564 Stewart A.F. et al., 1987, M16644 Boev A.A. et al.,1987, M16645 Alexander L.J. et al., 1988, X14907 Vilotte J.-L.,1987,18780 Oliviera K.M. et al, 2001, I065 A Brauntzer G. et al., 1973, X14712 Pierce A. et al.,1991 X57084 sin publicar, M73993 Brown W.M. et al., 1989 CAA34903 Hall L. et al.,1982, J00270

   transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio

   natural purificada natural purificada natural purificada Stewart A.F. et al., 1984, X00564 Stewart A.F. et al., 1987, M16644 Boev A.A. et al.,1987, M16645 Alexander L.J. et al., 1988, X14907 Boev A.A. et al.,1987, M16645 Alexander L.J. et al., 1988, X14907

   transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio subunidad reguladora de lactosa sintasa lipocalina, se une a retinol

   recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His

   recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His

   sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado

   sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado

   Fig. 4b

   Resultados de la búsqueda Mascot Vista de proteína Coincidencia con: CASB_BOVINA puntuación: 144 Precursor de beta-caseína -Bos taurus (Bovino)

   Encontrada en la búsqueda de D:\Data\milk 0.3171.07mgf Masa nominal (Mr): 25149; Valor de pI calculado: 5,26 Búsqueda en BLAST NCBI de CASB_BOVIN contra nr Cadena de secuencia sin formular para pegar en otras aplicaciones Taxonomía: Bos taurus Modificaciones fijas: Carboximetilo (C) Modificaciones variables: Oxidación (M) Sin especificidad de corte enzimático Cobertura de secuencia 11%

   Fig. 6