TWI471565B - 鑑定過敏原性蛋白質和肽之方法 - Google Patents

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Description

鑑定過敏原性蛋白質和肽之方法
本發明關於鑑定過敏原性蛋白質和肽之方法。更具體地說，本發明關於鑑別過敏原性蛋白質和肽之方法。更具體地說，本發明提供鑑別過敏原性乳蛋白質及/或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與步驟d)之至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。
在此說明書中，一些文件包括專利申請案及廠商手冊被引述。該些文件之揭示雖然被認為與本發明之專利性無關，但以參照方式被整體納入此處。更具體地說，所有參照之文件以參照方式被納入如同各個別文件所具體及個別明示而以參照方式納入之相同範圍。該些文件無一被公認為本發明之習知技藝。
食物過敏(food hypersensitivity)在3歲以下嬰兒之發生率大約是2至8%，在成年人約2%。在兒童的過敏反應中，大約80%係為對牛乳(CM)、雞蛋及豆類(例如花生及黃豆)過敏之結果。然而在成年族群中，對水果、花生及木本堅果(tree nuts)之過敏代表盛行率最高之過敏症。
牛乳係最早被導入嬰兒飲食的食物之一，因此是造成幼兒食物過敏最常見的一個原因。大約2.5%的新生兒在出生的第一年內對牛乳顯示不良反應。
牛乳過敏(CMA)之徵候可分成立即型或延遲型，從輕微到嚴重的皮膚、呼吸道、胃腸道反應不等，最嚴重的是危及生命之全身性反應(過敏性反應(anaphylaxis))。與細胞媒介性延遲型反應不同的是，立即型反應係由原本無害之抗原所引起的免疫球蛋白E(IgE)抗體產生所造成(第一型過敏反應)。IgE抗體與過敏原性分子之交互作用導致特異性活化效應細胞(肥胖細胞、嗜鹼顆粒細胞)及隨後釋放可引起立即型過敏反應之發炎介質如組織胺、前列腺素及白三烯。
牛乳包含超過25種蛋白質，有些已知為具過敏原性。藉由凝乳酶之作用或藉由將乳酸化至pH 4.6，可獲得兩個組分：包含20%之蛋白質的乳清組分及包含80%之蛋白質的酪蛋白組分。過敏原性分子係於兩個組分中得到，且依照在CMA族群中有紀錄之過敏反應的發生率被認為是主要或次要過敏原。
存在牛乳中之主要過敏原係α乳白蛋白(alpha-lactalbumin)、β乳球蛋白(beta-lactoglobulin)、αS1酪蛋白(alphaS1-casein)、β酪蛋白(beta-casein)及κ酪蛋白(kappa-casein)。存在牛乳中之次要過敏原係αS2酪蛋白(alphaS2-casein)、乳鐵蛋白(lactoferrin)、牛血清白蛋白及免疫球蛋白。
α乳白蛋白(Bos d 4)、β乳球蛋白(Bos d 5)、免疫球蛋白(Bos d 7)、BSA及乳鐵蛋白係乳清中廣為週知之IgE活性成分。αS1酪蛋白、αS2酪蛋白、β酪蛋白及κ酪蛋白係酪蛋白組分(Bos d 8)中之強效過敏原(Wal,2004)。
在乳清組分中，β乳球蛋白(BLG)及α乳白蛋白(ALA)被認為是主要過敏原。β乳球蛋白是一種球狀且非常安定之蛋白質，其屬於與疏水性配位體結合之疏水性分子結合蛋白(lipocalins)的蛋白質超家族。其它過敏原如主要犬過敏原Can f 1及Can f 2與其他有毛動物(馬、貓及天竺鼠)之過敏原亦屬於此蛋白質超家族。天然之β乳球蛋白以二聚體形式存在，分子量為36千道爾頓。β乳球蛋白有兩種主要的同型體，基因變異體A(BLGA)及B(BLGB)，它們的胺基酸64及118不同(BLGA中為天冬胺酸及纈胺酸，BLGB中為甘胺酸及丙胺酸)。由安定性及β乳球蛋白屬於疏水性分子結合蛋白家族之事實，可能解釋此分子之高度過敏原性潛力。
α乳白蛋白係由四個雙硫鍵所穩定之14千道爾頓酸性鈣離子結合單體。其為合成乳糖之半乳糖基轉移酶系統中之調節成分。序列分析顯示，其與人α乳白蛋白(hALA)及源自雞蛋之溶菌酶(雞蛋之主要過敏原)具有高度胺基酸序列同源性。α乳白蛋白之過敏原性可由彼之安定性解釋。
在懸浮液中，酪蛋白組分之蛋白質與固定比例之個體分子形成有序聚集體(微胞(micelles))，例如各37%之αS1酪蛋白及αS2酪蛋白，各13%之β酪蛋白及κ酪蛋白。這四種酪蛋白分子之一級結構同源性低、功能特性不同，但全部都是可被若干蛋白酶輕易分解之具有流變性、高度水合性三級結構之磷酸化蛋白質。對蛋白水解消化之敏感性係重要過敏原相當不尋常之特徵。牛乳酪蛋白與其他哺乳動物如山羊及綿羊之酪蛋白具有最高90%之胺基酸序列同源性。此序列同源性可能是牛乳與源自其他動物的乳之間經常被觀察到跨種反應性的原因。
本發明提出提供方法的需要，該些方法允許鑑定存在於生物性來源中之過敏原性蛋白質和肽。本發明藉此亦提出提供方法的需要，該些方法允許鑑定存在於生物性來源特別是牛乳及包含牛乳之營養調製劑中之非過敏原性蛋白質和肽。另外，本發明提供用於診斷及治療個體之過敏的裝置及方法。
發明摘要
本發明之態樣關於一種鑑別過敏原性乳蛋白質及肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。因此，本發明之另一態樣提供鑑別至少一種過敏原性乳蛋白質或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。換句話說，本發明關於如[0012]段所描述之方法，其中該過敏原性蛋白質和肽係乳過敏原性蛋白質和肽，該至少一個表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA，且對該過敏原性來源敏感的個體係對牛乳敏感的個體。
根據本發明之其他態樣，如上所述之本發明之方法可另包含測定該至少一種蛋白質或肽之胺基酸序列之步驟，該至少一種蛋白質或肽係由該方法識別。
本發明亦提供一種鑑別由DNA或cDNA表現庫所編碼之過敏原性蛋白質及/或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個過敏原來源之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對該至少一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力，該至少一個過敏原來源特別是牛乳及包含牛乳之營養調製劑；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。因此，本發明提供鑑別由DNA或cDNA表現庫所編碼之至少一種過敏原性蛋白質或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個過敏原來源之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對該至少一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。
本發明之另一態樣關於一種測定包含樣本之牛乳中的過敏原性蛋白質和肽之方法，該方法包含測定圖1A、1B及1C(SEQ ID NO:22-84)及表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-21)中之至少一種蛋白質或肽存在之步驟。
根據本發明之此態樣，該牛乳可為水解牛乳。另外，該至少一種蛋白質及肽之存在可由質譜分析測定。較佳的是，存在於樣本中之蛋白質及肽在質譜分析之前係經分離。蛋白質及肽可藉由電泳法或藉由高效液相層析法分離。較佳的是，該電泳法可為二維電泳法。
本發明之另一態樣關於一種由本發明之方法所鑑定之蛋白質或肽。本發明之其他態樣關於一種選自圖1A、1B、1C(SEQ ID NO:22-84)、表1A、1B或表2(SEQ ID NO:1-21)中之蛋白質或肽。
本發明之其他態樣關於本發明之至少一種蛋白質或肽，其係用於診斷個體之過敏或過敏傾向。較佳的是，該過敏係乳過敏。
本發明之不同態樣關於一種診斷個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法包含對疑似過敏或變成過敏之個體投予如此處所述之至少一種蛋白質或肽，及檢測該個體是否出現對抗該蛋白質或肽之過敏反應。
根據本發明之此態樣，較佳的是該過敏或過敏傾向係乳過敏或乳過敏傾向。此態樣之方法較佳的是額外包含皮膚測試及/或血液測試。該皮膚測試較佳係選自：(i)皮膚針刺測試、(ii)皮內測試、(iii)皮膚貼布測試、或(iv)(i)至(iii)之測試之任何組合，其中測試(i)至(iv)之陽性結果表示個體為過敏或具過敏傾向。該血液測試較佳地包含下列步驟：(i)使本發明之至少一種蛋白質或肽與源自該個體之血液樣本、血清樣本或血漿樣本接觸，及(ii)測定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、血清樣本或血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至少一種蛋白質或肽與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾向；及/或(i’)使本發明之至少一種蛋白質或肽與該個體之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，及(ii’)測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。
本發明之另一態樣關於本發明之至少一種蛋白質或肽，其係用於個體過敏之過敏原免疫治療。較佳的是，該過敏係乳過敏。
在其他態樣中，本發明關於一種用於個體過敏之過敏原免疫治療之方法，該方法包含投予本發明之至少一種蛋白質或肽。較佳的是，該過敏係乳過敏。
在另一態樣中，本發明關於一種測定個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法包含：a)使本發明之至少一種蛋白質或肽與血液樣本、血清樣本或血漿樣本接觸，其中該血液樣本、血清樣本或血漿樣本係自該個體分離，及b)測定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、血清樣本或血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至少一種蛋白質或肽與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾向；及/或a’)使本發明之至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，其中該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞係自該個體分離，及b’)測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞(i)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或(ii)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。
根據本發明之此態樣，較佳的是該過敏或過敏傾向係乳過敏或乳過敏傾向。較佳的是，此態樣之方法另包含區別嚴重過敏之個體與敏感但無症狀之個體，及/或區別長大後不再過敏之個體與長大後仍過敏之個體。
在其他態樣中，本發明關於一種鑑別IgE反應性非過敏原性乳蛋白或肽之方法，該乳蛋白或肽係由至少一個表現庫之DNA或cDNA所編碼，該方法包含下列步驟：a)提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；b)表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；c)測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；d)使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及e)測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞(i)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或(ii)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。
根據本發明之此態樣，該至少一種由該方法所鑑別或此處具體揭示之蛋白質或肽係用於治療過敏。本發明亦提供一種治療個體之過敏之方法，該方法包含投予至少一種由該方法所鑑別或此處具體揭示之蛋白質或肽。
在本發明之所有可施行實施態樣中，該個體或病患較佳係人。該嗜酸細胞、肥胖細胞或嗜鹼細胞原則上係哺乳動物來源且可能是人來源。
本發明之詳細說明
本發明之目的係提供一種鑑定過敏原性乳蛋白質及/或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。本發明亦提供一種包含下列步驟之方法：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個過敏原來源之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對該至少一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。
本發明之方法特別適用於鑑定展現過敏原性特性之蛋白質和肽。要鑑定蛋白質和肽之過敏原性特性，只需要在微克或奈克範圍內之量。這些蛋白質和肽係由DNA或cDNA庫編碼，該DNA或cDNA庫係得自已知可合成蛋白質及/或肽的來源，而該蛋白質及/或肽引起個體之過敏原性反應。該過敏原來源可能包含不同種類之負責該過敏原之生合成的組織及細胞。如果這些細胞和組織係為已知，則可自該細胞和組織特異性產生DNA或cDNA庫，該DNA或cDNA庫可被用於本發明之方法。舉例來說，源自哺乳動物特別是源自牛之乳過敏原可藉由自泌乳哺乳動物的乳腺組織分離DNA或cDNA而被鑑定。
該DNA或cDNA表現庫之表現蛋白質及肽係與對該至少一個過敏原來源敏感之至少一個個體的至少一種血清型IgE接觸。在此第一步中，識別該些蛋白質及肽之哪些能與IgE結合，此為過敏反應之一項先決條件。在本發明中，「IgE反應性」之用語係指胺基酸序列與IgE結合之能力。在下一步中，與IgE結合之肽及蛋白質進一步與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，該些細胞先前已經搭載源自已知對該過敏原來源之至少一種過敏原過敏的至少一個個體之IgE。當攜帶過敏原特異性IgE分子之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與個別之過敏原接觸時釋放介質諸如組織胺及/或其他由嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞所釋放之過敏性介質，這表示該能與IgE結合之肽及蛋白質在與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸後亦可誘發該些細胞之去顆粒。適當之過敏原性介質較佳為組織胺、肝素、前列腺素、白三烯、化學介質(chemokines)、細胞介質(cytokines)。其他可被用於本發明中之過敏原性介質包括β己糖胺酶、嗜酸細胞過氧化酶、核糖核酸酶(RNase)、去氧核糖核酸酶、脂酶、胞漿素原及主要鹼性蛋白。該領域之技藝人士對於該些細胞所釋放之介質相當熟悉，其可由普通教科書知識鑑別(參見例如Janeway et al. 2002: Immunology,Spektrum Akademischer Verlag;Auflage: 5. Auflage;Paul et al. 1989: Fundamental Immunology,Raven Press Ltd.;Second edition)。
該些與過敏個體之IgE結合且能誘發嗜鹼細胞去顆粒之DNA或cDNA庫之成員可被分離，且它們的DNA或cDNA插入物可利用該領域已知之方法定序。可選擇的是，由個別庫成員所表現之蛋白質及肽可利用該領域已知之方法分離，且舉例來說利用質譜法或胺基酸定序分析。
該DNA或cDNA庫之成員可源自任何攜帶生物性物質之來源，該生物性物質當與個體接觸時已知或未知會引發過敏原性反應。因此，此處所使用之用語「過敏原來源」係指能合成過敏原之任何種類的生物性物質。
用語「肽」或「蛋白質」意圖指由肽鍵所連接之胺基酸序列。此處所使用之「肽」係指實質上包含最多250個胺基酸之含胺基酸分子，諸如最多200個胺基酸，諸如最多150個胺基酸，諸如最多100個胺基酸，諸如最多50個胺基酸，諸如最多45個胺基酸，特別是諸如最多40個胺基酸，諸如最多30個胺基酸，諸如最多20個胺基酸，及較佳超過2個胺基酸殘基。此處所使用之「蛋白質」係指實質上包含超過250個胺基酸之含胺基酸分子。在上方之範圍中，本發明可使用蛋白質及肽之用語以表示相同類型之分子。
過敏原(能引起個體之過敏原性反應的物質)係由多種生物體合成，包括植物及動物。根據本發明之較佳實施態樣，該至少一個過敏原來源係動物，更具體地說為哺乳動物。已知動物係過敏原之來源。這些過敏原通常存在於動物(例如貓及狗)毛屑或皮屑中，以及動物之唾液及尿液中。舉例來說，哺乳動物亦分泌過敏原至乳中。因此，哺乳動物如牛、馬及水牛可能包含高量之過敏原。用於鑑定該過敏原之cDNA及DNA可能自泌乳哺乳動物分離，因此該DNA或cDNA較佳係得自乳腺組織。
過敏原之另一來源係蟎如家塵塵蟎、魚、蛋等。這些動物已知產生造成個體過敏反應之物質。
其他過敏原來源係植物。特別是雜草及豆類已知產生過敏原。當然樹木如灌木亦為過敏原之來源。
該DNA(諸如基因組DNA及其他種類之DNA除了cDNA以外)或cDNA可得自該過敏原來源諸如牛乳或以該領域已知之方法包含牛乳之營養調製劑。這些核酸分子較佳係得自已知或疑似產生過敏原之細胞及組織。然而，為了減少要被篩選以鑑別過敏原之株的量，較佳係將cDNA分子(cDNA分子係源自mRNA)插入表現庫，因為這些分子反應在個別細胞及組織中所表現之蛋白質及肽池。根據本發明，任何方法可被使用以自(可能)表現該過敏原之細胞製備cDNA。該方法係該領域之技藝人士所熟知(參見例如Sambrook et al.,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,”2nd ED.(1989)及Ausubel,F.M. et al.,“Current Protocols in Molecular Biology,”(Current Protocol,1994))。亦有數種用於獲得雙股cDNA之商用可得套組，例如Superscript II或Superscript III套組(美國英維特公司(Invitrogen)，目錄編號18580008)、Great Lengths cDNA合成套組(美國克隆特公司(Clontech)，目錄編號K-1048-1)、cDNA合成套組(美國思特托基公司(Stratagene)，目錄編號200301)及該類似物。
該cDNA及DNA分子可與包含適當限制酶辨識位之連接子DNA序列連接。該連接子DNA亦為該領域所知且為商業可得自例如美國普美加公司(Promega Corporation)及美國新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)。該cDNA及DNA分子可另外進行限制酶消化、管柱或膠體粒度分級或任何其他該領域之一般技藝人士所知之適當方法。
該cDNA及DNA庫接著被插入表現載體中，該表現載體可能包含編碼標籤之核苷酸序列、在細菌細胞中指導DNA複製之序列、在真核細胞中指導DNA轉錄及mRNA轉譯之序列及該類似物。包含該所述之調節元件之適當表現載體係該領域所知。如上所述之cDNA或DNA分子可被設計以直接導入或經脂質體、噬菌體載體或病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒)導入細胞中。典型哺乳動物表現載體包含啟動子元件(其媒介mRNA轉錄之起始)、蛋白質編碼序列及終止轉錄及該轉錄物聚腺苷酸化所需之信號。另外，亦可包括諸如複製起點、藥物抗藥性基因、調節因子(為誘導性啟動子之部分)之元件。Lac啟動子係可用於原核細胞之典型誘導性啟動子，其可利用乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導。為了重組表現及分泌，感興趣之cDNA或DNA分子可被連接(描述於Ghahroudi et al,1997,FEBS Letters 414:521-526)。其它元件可能包括增強子、科薩克(Kozak)序列及兩側為RNA剪接供位及受位之介入序列。高效率轉錄可藉由來自SV40之早期及晚期啟動子、來自反轉錄病毒之長末端重複(LTR)例如RSV、HTLVI、HIVI及巨細胞病毒(CMV)之早期啟動子達成。然而，細胞性元件亦可被使用(例如人肌動蛋白啟動子)。可選擇的是，重組蛋白質或肽可於包含整合至染色體之基因建構物之安定細胞系中表現。以選擇性標記諸如dhfr、gpt、新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)共轉染允許鑑別及分離該轉染細胞。表現載體將較佳地包括至少一種選擇性標記。適當宿主之代表性實例包括但不限於細菌細胞，諸如大腸桿菌(E. coli)、鏈黴菌(Streptomyces)及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細胞；真菌細胞諸如酵母菌細胞；昆蟲細胞諸如果蠅S2及夜蛾Sf9細胞；動物細胞諸如CHO、COS、293及鮑伊斯(Bowes)黑色素瘤細胞；及植物細胞。上述宿主細胞之適當培養基及培養條件係該領域所知。將cDNA及DNA庫(特定細胞或組織之cDNA或DNA池)分子插入表現載體中導致表現庫。
用於表現該過敏原來源之cDNA及DNA分子之表現庫較佳係噬菌體展示庫或細菌表現庫。這些庫之成員(「建構物」)接著被導入能表現由該cDNA或DNA所編碼之蛋白質及肽之細胞中。較佳之細胞係根據用於產生該cDNA及DNA庫之載體種類選擇。若該載體係經設計以供細菌表現，該細胞係細菌細胞。該cDNA及DNA庫係利用該領域之一般技藝人士所熟知及描述於例如Sambrook et al.,Molecular Cloning: a Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)中之方法(例如轉形)導入細胞中。培養細菌細胞以選擇轉形株及產生個別細菌菌株(選殖株)之下一步驟係該領域所廣為週知。在洋菜板上選擇轉形株之後，該經培養之細菌菌株可被個別挑選及用於接種以格狀模式陣列排列之液態培養基，以於例如96孔微滴定盤形成格狀細菌菌液。此安排允許各細菌選殖株在獨立孔槽中代表性生長且有助於後續陽性選殖株池之次選擇。
特別較佳的是使用能分泌該所產生之蛋白質及肽至細胞外部之表現庫載體。該經分泌之蛋白質及肽可能進一步包含膜錨定結構域，該膜錨定結構域允許將該經表現之分子固定在細胞表面上。產生該表現庫之方法及裝置係該領域之技藝人士所知。
為了測定過敏原特異性IgE分子與由該cDNA及DNA表現庫所編碼之肽及/或蛋白質之結合，該至少一種蛋白質或肽係經固定於固態支持物上。該固態支持物之後與源自過敏個體之IgE分子接觸，且該IgE分子於該固態支持物上之結合係經測定。
IgE與固定於固態支持物上之蛋白質及肽之結合可利用能與IgE結合之抗體或彼之片段達成。該等抗體係該領域所廣為週知。
本發明所使用之固態支持物可為膜，較佳為硝酸纖維素膜。在特別較佳之實施態樣中，這些膜係與存在洋菜板上之攜帶cDNA或DNA表現庫之細菌選殖株接觸以形成這些選殖株之複製物。此複製物可被用於偵測過敏原特異性IgE與特定選殖株之結合。
已經搭載源自過敏個體之過敏原特異性IgE之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞可被用於測定由該DNA或cDNA表現庫所編碼之蛋白質或肽的過敏原性潛力。該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞可為任何哺乳動物來源，因此較佳的是使用人化大鼠嗜鹼白血病(RBL)細胞(例如RBL-703/21細胞株)。細胞可藉由導入及表現編碼所有或部分人Fc受體之DNA而被人化，較佳為編碼所有或部分人IgE受體I之DNA。用於產製人化細胞之方法係該領域所知。較佳的是使用如Hoffmann et al.(同上)所描述之方法以產製人化細胞培養。用於產製裸嗜鹼細胞之方法係描述於Kleine Budde et al.(Int Arch Allergy Immunol,126(4))。
在鑑別能與過敏原特異性IgE結合之蛋白質/肽之後，由步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列係經較佳地測定，及該能與過敏原特異性IgE結合之至少一種蛋白質或肽係於步驟d)之前經化學合成或重組產製且可被用於步驟d)。
根據本發明之較佳實施態樣，本發明之方法另包含測定該於步驟e)所鑑別之至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列之步驟。
由該DNA或cDNA庫所編碼及表現之蛋白質或肽的胺基酸序列可由質譜法或艾德曼(Edman)降解法測定。若使用該方法，必須在胺基酸定序前分離由該DNA或cDNA庫所表現之蛋白質及/或肽。該分離可利用該領域所知之方法完成。為了促進蛋白質及肽之分離，彼等可能與標籤融合(例如組胺酸標籤)。可選擇的是，亦可能分離該個別DNA或cDNA株及定序該DNA或cDNA插入序列。
測定蛋白質及肽的胺基酸序列之適當方法包括但不限於艾德曼降解法、(串聯式)質譜法及該類似方法(參見例如Edman,P. Mol. Biol. Biochem. Biophys.,(1970),8:211-255；美國專利6,799,121)。該蛋白質及肽之胺基酸序列可與已知蛋白質之胺基酸序列比較。
此處所使用之用語「質譜法」包括多種方法諸如串聯式質譜法、介質輔助雷射脫附離子化(MALDI)飛行時間(TOF)質譜法、MALDI-TOF-TOF質譜法、MALDI四極柱-飛行時間(Q-TOF)質譜法、電噴灑離子化(ESI)-TOF質譜法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-離子陷阱質譜法、ESI三段四極柱質譜法、ESI傅立葉轉換質譜法(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-離子陷阱-TOF及ESI-離子陷阱-TOF。這些質譜分析法係該領域所廣為週知(參見例如Gary Siuzdak,“Mass Spectrometry for Biotechnology”,Academic Press,NY,(1996))。以最基本的質譜法來說，其關於將分子離子化，接著測量該形成離子之質量。由於分子離子化之方式係廣為週知，因此通常可自該離子之質量正確地測定分子之分子量。舉例來說，串聯式質譜法可被用於鑑定蛋白質因為其可提供除了親代離子分子量以外之資訊。串聯式質譜法關於先取得感興趣離子之質譜，接著將該離子分成片段，並取得該些片段之質譜。因此串聯式質譜法提供分子量資訊及可與該分子量資訊組合使用之分段模式，以鑑別肽或蛋白質之確切序列(參見例如Hunt et al.(1986) PNAS USA 83:6233-6237;Shevchenko et al.(1996) PNAS USA 93:14440-14445;Figeys et al.(1996)Anal. Chem. 68:1822-1828及Wilm et al.(1996) Nature 379:466-469)。
如前所述，本發明之另一態樣關於一種鑑定過敏原性乳蛋白質及/或肽之方法，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。在本發明之另一態樣中，該方法另包含測定由前述方法所鑑別之該至少一種蛋白質或肽之胺基酸序列之步驟。因此，本發明如上述之鑑定過敏性蛋白質及/或肽之方法較佳係應用於鑑定過敏性乳蛋白質及/或肽。因此，所有上述定義及較佳態樣亦適用於本發明之此態樣。
本發明之其他態樣關於一種測定包含樣本之牛乳的過敏原性之方法，該方法包含測定圖1A、1B及1C(SEQ ID NO:22-84)及表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-21)中之蛋白質及肽的至少一者存在之步驟。在本申請案中，用語「包含樣本之牛乳」係指包含牛乳之食物樣本或營養樣本。非限制性實例係牛乳、凝乳(curd)、奶油(cream)、黃油(butter)、酸奶酪(yoghourt)及包含這些任一者之食物。在該包含樣本之牛乳中，該蛋白質及肽之至少一者係以允許測定包含樣本之牛乳的過敏原性之量存在。通常在微克或奈克範圍內之量的蛋白質或肽係足以測定過敏原性。
圖1A、1B及1C(SEQ ID NO:22-84)及表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-21)中所鑑別之蛋白質及肽可被用於測定包含牛乳之樣本是否包含過敏原性分子。若該蛋白質或肽中只有一者係存在於包含牛乳之樣本中，該樣本被視為具過敏原性。
本發明之方法特別適用於測定水解牛乳之過敏原性。
該至少一種蛋白質及肽較佳係由免疫分析法測定，該免疫分析法涉及與圖1A、1B及1C(SEQ ID NO:22-84)及表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-21)中所鑑別之蛋白質及肽結合之抗體或彼之片段。
該至少一種蛋白質及/或肽較佳係由質譜法測定。為了鑑定存在於包含牛乳之樣本中的牛乳成分，可使用質譜法。質譜法允許鑑定如圖1A、1B及1C(SEQ ID NO:22-84)及表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-21)中所鑑別之該乳成分。比較存在於樣本中之片段與圖1A、1B及1C(SEQ ID NO:22-84)及表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-21)中之蛋白質及肽，允許測定該樣本是否包含源自牛乳之過敏原性物質。
為了達到較佳之結果，存在於樣本中之蛋白質及肽在質譜分析之前較佳地係經分離。此分離可藉由電泳方法(較佳為二維電泳法)或高效液相層析法進行。
在IgE結合試驗(步驟c))中篩選產物/蛋白質/肽及嗜鹼細胞(人化肥胖細胞)去顆粒事實上提供潛在過敏原性之資料，這些方法係用於臨床診療。然而，cDNA表現庫資料將加入特定過敏原(例如牛乳)之潛在過敏原性肽序列的完整清單。本發明組合這些方法(增進潛在過敏原性結構之偵測)，使得能夠利用質譜法證實這些潛在過敏原性結構存在於產品介質中。由IgE反應性及去顆粒作用(生物活性)所組合建立之過敏原性乳蛋白質及肽的序列資料庫之組合應作為發展更可靠、敏感及可再現方法之基礎，以評估及預測包含乳之產品的過敏原性。雖然類似方法已被用於鑑別牧草花粉過敏原(Ball et al. 1994,Journal of Biological Chemistry,Vol. 269;Issue of Nov 11,p. 28323-28328)，但是本發明之發現令人驚訝，因為技藝人士不曾想過根據Ball et al. 1994所揭示之方法或類似方法可被成功地應用於乳過敏原。進一步解釋，IgE與牧草花粉過敏原之結合以及IgE與其他呼吸道過敏原之結合主要依賴遍佈該過敏原之胺基酸殘基。因此，牧草花粉過敏原及呼吸道過敏原通常裝配成構型(不連續性)IgE表位。維塔拉等人之研究(Vrtatla et al.)(J. Clin. Invest,Vol 99,No 7,p. 1673-1681)顯示在例如源自構型過敏原之重組片段中喪失此構型導致大幅減低與IgE結合及自病患之嗜鹼細胞釋放組胺酸之能力。與牧草花粉過敏原及呼吸道過敏原不同的是，乳過敏原及食物過敏原通常具有非構型但未經摺疊之表位(Jrvinen et al.,Int Arch Allergy Immunol,Vol 126,p. 111-118及Jrvinen et al.,Allergy,Vol 62,p. 758-765)。因此先前技術僅辨識IgE與源自例如乳及蛋的未經摺疊過敏原之結合。自嗜鹼細胞、肥胖細胞或嗜酸細胞釋放介質尚未被顯示或建議為本發明人所知。就維塔拉等人(同上)之揭示而言，技藝人士將認為不具IgE反應性之乳的過敏原片段及重組產製之過敏原亦不具有誘發病患之嗜鹼細胞釋放組胺酸之能力。同樣的，就維塔拉等人(同上)之揭示而言，技藝人士將認為具有IgE反應性之乳的過敏原片段及重組產製之過敏原亦具有誘發病患之嗜鹼細胞釋放組胺酸之能力。因此，根據先前技術，進一步測試IgE反應性乳蛋白質及肽之組胺酸釋放之步驟似乎沒有必要。相反的，本發明人意外發現只有包括IgE反應性及自嗜鹼細胞、肥胖細胞或嗜酸細胞釋放介質之步驟的方法才能可靠地鑑定過敏原性乳蛋白質及肽。進一步注意到的是，只有組合測試IgE反應性及介質之釋放允許可靠地評估源自乳之蛋白質或肽之過敏原性。依被測試之個體而定，蛋白質及肽可能誘發介質之釋放或不釋放。因此，僅展現IgE反應性而不媒介嗜鹼細胞、肥胖細胞或嗜酸細胞釋放介質之非過敏原性蛋白質及肽可與過敏原性蛋白質或肽(過敏原)區別。因此，只有本發明之方法能可靠地評估本發明之蛋白質或肽對特定個體之過敏原性，也就是特異性區別非過敏原性IgE。特別意外的是，本發明之方法導致鑑別表1A、1B及表2(SEQ ID NO:1-22)所示之肽，因為這些肽全部都是未經摺疊之肽，因此不具有構型表位。
一種偵測潛在過敏原之改進方法，藉由使用cDNA表現庫及接著的噬菌體肽表現系統與利用IgE結合及IgE媒介性嗜鹼細胞去顆粒、嗜酸細胞去顆粒或肥胖細胞去顆粒之功能性篩選。為了發展及製造營養調製劑之目的，此方法使得能夠監測/篩選及預測原料、成分及完成品中潛在食物過敏原之存在。
此處特別揭示或由本發明描述之方法所鑑定之過敏原性蛋白質或肽可被用於診斷個體之過敏或過敏傾向，較佳係乳過敏或乳過敏傾向。因此，在一實施態樣中，本發明關於一種診斷個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法包含對疑似過敏或變成過敏之個體投予如此處特別揭示或由此處描述之方法所鑑定之至少一種過敏原性蛋白質或肽，及檢測該個體是否出現對抗該蛋白質或肽之過敏反應。投予之裝置及方式係如下所述。
過敏之診斷通常涉及進行皮膚或血液測試以找出何種物質或過敏原可能引起個體之過敏反應。一般偏好皮膚測試，因為它們快速、可靠，且相較於血液測試通常比較便宜，但是任一種測試皆可被使用。以皮膚測試而言，適當量之此處特別揭示或由此處描述之方法所鑑定之至少一種過敏原性蛋白質或肽被放置於皮膚之上或之下以測定過敏反應是否發生。有三種較佳之皮膚測試：(1)皮膚針刺測試係藉由在皮膚上放置一滴包含該至少一種過敏原性蛋白質或肽之溶液(過敏原溶液)及一連串搔刮或針刺以使該溶液進入皮膚。若皮膚出現紅色、突起之發癢區域(稱為風疹塊)，通常表示該人對該過敏原過敏。此稱為陽性反應。(2)在皮內測試中，小量之過敏原溶液被注入皮膚中。當物質在皮膚針刺測試中不引起反應但仍被懷疑是對該人之過敏原時，可進行皮內過敏測試。(3)在皮膚貼布測試中，過敏原溶液被放置於墊上，該墊被黏貼至皮膚約24至72小時。此測試係用於偵測稱為接觸性皮膚炎之皮膚過敏。在血液測試中，個體之過敏可由下列步驟測定：(i)使由本發明之方法所鑑定或於此處特別揭示之至少一種蛋白質或肽與源自該個體之血液樣本、血清樣本或血漿樣本接觸，及(ii)測定該至少一種蛋白質或肽是否與該血液樣本、血清樣本或血漿樣本中之IgE抗體結合，其中該至少一種蛋白質或肽與IgE抗體結合表示該個體係過敏或具過敏傾向；及/或(i’)使由本發明之方法所鑑定或於此處特別揭示之至少一種蛋白質或肽與該個體之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，及(ii’)測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。
除此之外，根據本發明之另一實施態樣，此處特別揭示或由本發明描述之方法所鑑定之過敏原性蛋白質或肽可被用於個體過敏之過敏原免疫治療。因此，本發明之實施態樣關於一種用於個體過敏之過敏原免疫治療之方法，該方法包含投予此處特別揭示或由本發明描述之方法所鑑定之至少一種過敏原性蛋白質或肽。較佳的是，該過敏係乳過敏。
本發明之過敏原免疫治療(亦稱為減敏治療、免疫減敏或過敏原特異性免疫治療)是一種過敏病症之免疫治療，其中該病患接受逐漸增加劑量之過敏原的免疫接種，以誘發免疫耐受性。過敏原免疫治療是唯一治療過敏病症之潛在原因的治療策略。其為具高度成本效益之治療策略，導致生活品質之改善及減低過敏性及過敏原相關症狀。免疫治療已被證實能產生過敏性症狀之長期緩解、減低相關過敏反應之嚴重性以及降低對過敏原發生新敏感之機會。此係藉由調節對過敏原之免疫系統反應的免疫治療達成。過敏原免疫治療可降低對藥物之需求、減輕症狀之嚴重性或同時消除過敏。另外，過敏原特異性免疫治療係已知能調節過敏疾病過程(具有治癒疾病之可能機會)之唯一治療選擇，其他治療僅能抑制症狀。
較佳的是，用於此處所述之任何方法或診斷用途或過敏原免疫治療之方法及用途之本發明之至少一種蛋白質或肽係存在於醫藥組成物。根據本發明，用語「醫藥組成物」關於對病患投予之組成物，較佳為人病患。本發明之醫藥組成物包含上述列舉之化合物。其可隨意選擇地包含其他能改變本發明之化合物之特徵的分子，以藉此舉例來說穩定、調整及/或活化彼等之功能。該組成物可能呈固態、液態或氣態形式，且可能特別呈粉末、錠劑、溶液或氣霧劑。本發明之醫藥組成物可隨意選擇及另外包含醫藥上可接受之載劑。適當醫藥載劑之實例係該領域所廣為週知且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳化劑諸如油/水乳化劑、各種潤濕劑、無菌溶液、有機溶劑包括DMSO等。包含該載劑之組成物可藉由廣為週知之習知方法調製。這些醫藥組成物可以適當劑量對個體投予。投藥計畫將由主治醫師及臨床因素決定。如醫學領域所熟知的，對任何病患之劑量將視許多因素決定，包括病患體重、體表面積、年齡、所欲投予之特定化合物、性別、投予之時間及途徑、整體健康及其他一起投予之藥物。在給定狀況下之治療有效量將輕易地由例行實驗決定，且係屬於一般臨床醫師或門診醫師之技藝及判斷範疇內。本發明所使用之醫藥組成物可根據該領域之方法利用習知方式，使用一或多種生理載劑或賦形劑調製，參見例如Ansel et al.,“Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”,7th edition,Lippincott Williams & Wilkins Publishers,1999。因此，該醫藥組成物可能以劑量單位調製劑經口、非經腸諸如經皮下、經靜脈內、經肌肉內、經腹腔內、經鞘內、經皮、經黏膜、經硬膜下、經離子電滲之地方性或局部性、經舌下、經呼吸噴霧、氣霧或經直腸及該類似途徑投予，該劑量單位調製劑可隨意選擇地包含醫藥上可接受之習知賦形劑。本發明之醫藥組成物可以單獨活性劑投予或可與其他劑組合投予。
本發明之另一實施態樣關於一種測定個體之過敏或過敏傾向之方法，該方法包含使此處所揭示或由此處描述之方法所鑑定之至少一種蛋白質或肽與自該個體分離之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，及當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放至少一種介質，或當與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒，鑑定該至少一種蛋白質或肽對該個體係過敏原性。在本發明之較佳實施態樣中，該過敏或傾向係乳過敏或乳過敏傾向。在本發明之其他較佳實施態樣中，這些診斷過敏或過敏傾向之方法另包含區別嚴重過敏之個體與敏感但無症狀之個體，及/或區別長大後不再過敏之個體與長大後仍過敏之個體。在這方面，用語「長大後不再過敏」係指該過敏不是持續存在而是當該過敏個體年紀增長後將減輕或較佳為消失。在這方面較佳的是，該個體在兒童時期過敏，長大為成年個體後不再過敏。
用於測定個體過敏或過敏傾向之方法中的該至少一種蛋白質或肽可被固定於固態支持物上(例如硝酸纖維素)。該固態支持物之後係與自該個體分離之嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸，並測定介質之釋放或去顆粒。可選擇的是，該細胞被固定在固態支持物上且與至少一種蛋白質或肽接觸。另外，該至少一種蛋白質或肽可為自其天然來源分離之蛋白質或肽或為上述方法所產製之重組蛋白質或肽。
本發明之另一態樣關於一種鑑別IgE反應性非過敏原性乳蛋白或肽之方法，該乳蛋白或肽係由至少一個表現庫之DNA或cDNA所編碼，該方法包含下列步驟：提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；測定該至少一種蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及，測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞(i)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或(ii)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。在這方面注意到的是，非過敏原性乳蛋白質或肽通常具IgE反應性但當與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸時不引發該些細胞之介質釋放或不引發該些細胞之去顆粒。因此，乳蛋白質或肽係為過敏原性或非過敏原性可由本發明之方法測定。非過敏原性乳蛋白質或肽被定義為彼等具IgE反應性但缺乏對該些細胞之過敏原性活性。
由本發明之方法所鑑別之IgE反應性非過敏原性乳蛋白質或肽可被用於使肥胖細胞結合IgE在過敏原暴露之前飽和且可作為過敏疾病之安全免疫治療的有效候選物。因此，本發明之另一實施態樣關於一種治療個體過敏之方法，該方法包含對該個體投予至少一種IgE反應性非過敏原性乳蛋白質或肽。較佳的是，該至少一種IgE反應性非過敏原性蛋白質或肽被調製成如上所述之醫藥組成物。
以下實施例說明本發明。本發明之廣泛範圍藉由參照下列實施例可被最佳地了解，但該些實施例並不意圖限制本發明為特定實施態樣。
實施例1：鑑別編碼IgE反應性乳成分及彼之片段之cDNA序列
為了鑑別牛乳中所包含之IgE反應性蛋白質及IgE反應性蛋白質片段，首先利用泌乳牛的乳腺組織以建構cDNA表現庫。此表現庫係以牛乳過敏病患之血清篩選。編碼IgE反應性全長αS1、αS2、β、κ酪蛋白及β乳球蛋白之cDNA以及彼之IgE反應性片段係經鑑別。此為相當意外之結果，因為哺乳動物蛋白質係於不添加真核細胞轉譯後修飾之細菌系統中產製，該轉譯後修飾有時會影響IgE結合之作用如主要家塵塵蟎過敏原所報告(Jacquet et al.,2002)。該推演之胺基酸序列係顯示於圖1A至C(SEQ ID NO:22-84)。所得到之IgE反應性過敏原片段允許作出有關IgE表位位置之結論。
實驗程序
自牛(「菲納克韋(Fleckvieh)」種)取得牛乳腺，將新鮮組織立即冷凍並儲存於-80℃直到使用。自該組織分離總RNA，使用cDNA合成系統以得到cDNA。該經純化之cDNA利用λgt11/EcoR I/CIAP-Treated/Gigapack III選殖套組(加州拉喬拉思特托基公司(Stratagene))被導入λ噬菌體中。大腸桿菌Y1090細胞係經噬菌體庫感染，並被種於LB Amp培養板上(145毫米直徑)。細菌蛋白質表現係藉由應用硝酸纖維素膜(德國達瑟爾魏特曼施萊舒爾公司(Whatman Schleicher ＆ Schuell))誘導。該被吸附之蛋白質與來自CMA病患之血清一起培養，結合IgE抗體係以125 I-標記之抗IgE抗體偵測(德國漢堡IBL公司)。膜經曝光至X光片上(紐約州羅徹斯特柯達公司(Kodak))。彼之蛋白質能與人IgE結合之陽性菌株在X光片上顯示為黑點(該膜之放射自顯影圖之實例係顯示於圖2)。
陽性菌株之噬菌體DNA係利用λgt11正向引子(5’CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA TTC 3’)及λgt11反向引子(5’ GAA TTC CAG CTG AGC GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3’)擴增，該經擴增之PCR產物係經定序。所得到之核苷酸序列藉由與序列資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比較以進行分析。
實施例2：乳成分之過敏原性活性與IgE反應性間之差異
為了評估分子是否具有過敏原潛力，不光是彼之IgE反應性還有彼之生物活性需要被證實。測試分子之生物反應性的科學證明模型係誘導人嗜鹼顆粒細胞釋放組胺酸(Purohit 2005)。為了此一目的，使用表現人FcεRI受體之α鏈的大鼠嗜鹼白血病細胞系(Hoffmann et al.,Int Arch Allergy Immunol，Vol 126(4),p. 277-285)。不同的乳成分(n=33)包括來自不同物種之全乳萃取物、乳組分、經純化之天然及重組牛乳蛋白質及重組蛋白質片段係經測試。測定78位病患之血清IgE抗體與個別乳成分反應時引起人化RBL細胞釋放β己糖胺酶之百分比(圖3)。
最強效之細胞活化成分係牛乳，刺激率達47.4%(圖3中「乳樣本」之圖)。但山羊乳及綿羊乳亦分別造成35.9及28.2%之數值，證實來自不同物種之乳蛋白質具有跨種反應性。就單一成分而言，經純化之蛋白質酪蛋白(AC、BC、KC)以及β乳球蛋白A(BLGA)顯示最高活性且在25至34.6%之病患血清中引起釋放。有趣的是，該重組形式之α乳白蛋白(rALA)相較於其天然對應物引起更高之釋放。各個合成肽具有相當低之細胞活化潛力，因為僅達到2.6至7.7%之刺激率。該生物活性係與IgE反應性比較(表2)。
大部分受測之乳成分如牛乳、山羊乳、經純化之天然β乳球蛋白變異體A及B(BLGA及BLGB)及重組αS1酪蛋白(rAS1C)及重組αS2酪蛋白(rAS2C)顯示IgE反應性之百分比約高於生物活性之二倍。該些發現可由IgE結合表位之存在解釋，該表位可與IgE結合，但無法交聯受體結合之IgE及引起介質之釋放。只有在5個成分之例中(重組BSA片段3(F3)、重組α乳白蛋白(rALA)、牛酪蛋白組分(CC)、天然純化κ酪蛋白(KC)及β酪蛋白(BC))，IgE反應性與生物活性之百分比達到類似數值。合成性αS1酪蛋白衍生肽之去顆粒程度相當低，大約是完整蛋白質活性之1/10(Cas3、Cas4、Cas5)至1/4(Cas2、Cas6)。
我們發現許多IgE反應性αS1酪蛋白肽無法在嗜鹼細胞釋放試驗中誘發去顆粒，因此代表IgE反應性半抗原。因此，這些肽(半抗原)係非過敏原性。此結果暗示僅進行IgE測試將導致過敏原性評估之偽陽性結論。另一方面，IgE反應性半抗原可被用來作為治療劑以使肥胖細胞結合IgE在過敏原暴露之前飽和且可作為過敏疾病之安全免疫治療的有效候選物。與IgE結合且誘發嗜鹼細胞釋放之αS1酪蛋白衍生肽已被進一步鑑定，少數病患之血清被鑑定為對若干肽不顯示IgE反應性但由這些肽誘發嗜鹼細胞之去顆粒。後者之結果可由嗜鹼細胞釋放試驗之較高敏感性解釋。
總結來說，IgE反應性與生物活性測量值之間的比較顯示，相較於誘發嗜鹼細胞去顆粒之能力，病患血清具有較高之IgE結合能力。過敏原性試驗反應分子造成過敏症狀之可能性的事實，暗示單獨的IgE反應性測量值無法被用來鑑別確定過敏原性成分，還需要由生物試驗補足。
評估IgE結合能力與生物反應性這兩種試驗之組合允許產生一資料庫，該資料庫包含可由質譜法偵測之過敏原性蛋白質/片段/肽。圖4顯示過敏原性乳肽及蛋白質之序列清單，其代表該資料庫之原型。測試血清IgE反應性及過敏原性活性之乳成分被列出。有關過敏原名稱、千道爾頓(kDa)之分子量(MW)、過敏原之功能及製劑與參考文獻之資訊被列出。
實驗程序
使用來自78位病患之血清，病患之選擇係根據陽性病史、陽性皮膚針刺反應及利用CAP-FEIA系統(瑞典烏普薩拉法迪亞公司(Phadia))測定對牛乳萃取物之特異性IgE。血清係得自奧地利、德國、義大利、西班牙及法國之5名成人及73名兒童(30名女童及43名男童)。
純化蛋白質及酪蛋白組分係購自西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich)(美國聖路易斯)。重組蛋白質及重組BSA片段係於大腸桿菌中表現(如Vrtala et al.,1997所述)。αS1酪蛋白肽係於應用生物系統(Applied Biosystems)肽合成儀型號433A上合成(如Focke et al.,2001所述)。
人化大鼠嗜鹼白血病(RBL)細胞(RBL-703/21株)係於微滴定板上與50微升之1:10稀釋之人血清於37℃(7%二氧化碳，95%溼度)隔夜培養。之後細胞經過清洗，並於37℃(7%二氧化碳，95%溼度)暴露於乳成分1小時，該乳成分以包含50% D2 O及0.1% BSA/HAS之Tyrodes緩衝液稀釋成0.3微克/毫升蛋白質。細胞之自發性釋放亦被評估。最後，將細胞上清液與50微升測試溶液(0.1M檸檬酸或檸檬酸鈉，pH 4.5，160μM 4-甲基傘型酮-N-乙醯基-β-D-胺基葡糖苷)置於新的微滴定板上於37℃(7%二氧化碳，95%溼度)培養1小時。每孔加入100微升甘胺酸緩衝液以停止反應，利用螢光微量板讀取儀測量在激發波長360及發射波長465下之螢光。各樣本之特定己糖胺酶釋放係利用下式計算：[(FlS -FlSP ):(FlZ -FlSP )]x100(其中FlS 係該樣本之螢光、FlSP 係自發性釋放之螢光及FlZ 係總釋放之螢光)。
實施例3：以質譜法鑑定乳樣本及乳衍生產品中具有或不具過敏原性活性之蛋白質及/或肽
由IgE反應性及過敏原性活性之組合所建立之過敏原性乳蛋白質及肽的序列資料庫可作為發展可靠、可再現之分析方法的基礎以評估及預測乳樣本及乳衍生產品的過敏原性。質譜法被用於偵測複合乳樣本中可能的過敏原性成分。舉例來說，質譜法與上游高效液相層析法(HPLC)之組合被應用於分析商業可得之完全水解低過敏原性乳配方。分析圖5顯示之層析圖及經萃取之質譜圖證實所有蛋白質已被水解成最長14個胺基酸之小型肽。
具體地說，圖5顯示利用奈米液相層析法及隨後的電噴灑離子化質譜法分離水解乳配方。該圖為1微克水解乳樣本之總離子層析圖。留滯時間係顯示於X軸，以cps(每秒計數)表示之信號強度顯示於Y軸。
利用MASCOT搜尋演算法所進行之資料庫搜尋導致鑑別數個小型肽，其中的三個被鑑別為乳衍生性過敏原，也就是β酪蛋白(Bos d 8 beta，圖6)。圖6描述Mascot搜尋及鑑定水解牛乳中之β酪蛋白衍生肽。在最上方，質譜法所唯一鑑別之乳過敏原β酪蛋白被提及其分子量及計算pI。底下說明β酪蛋白之搜尋參數及所獲得之序列涵蓋率。最底下顯示β酪蛋白序列，匹配肽以粗體字母印刷。該β酪蛋白過敏原係以匹配肽鑑定：HQPHQPLPPT(計算質量為1.25kDa，對應β酪蛋白之胺基酸160-170)、VYPFPGPIPN(計算質量為1.19kDa，對應β酪蛋白之胺基酸74-84)、SSSEE(計算質量為0.65kDa，對應β酪蛋白之胺基酸31-36)及PVVVPP(計算質量為0.87kDa，對應β酪蛋白之胺基酸96-103)。圖7顯示這些肽之IgE反應性(表1：cas b-1、2、3及4；圖7)。在水解牛乳中所鑑定之β酪蛋白衍生肽不具IgE反應性。經硝酸纖維素印漬之牛乳(CM)、重組β酪蛋白(rBC)、合成β酪蛋白衍生肽(cas b-1、cas b-2、cas b-3、cas b-4)及重組αS1酪蛋白(rAS1C)之IgE反應性係由點漬測定法分析。硝酸纖維素結合之乳成分係與來自三個牛乳過敏病患(第1、2及3行)及非過敏個體(C行)之血清一起培養。經結合之IgE抗體係以125I-標記之抗IgE抗體偵測。此圖及這些結果顯示它們代表非過敏原性肽，也就是它們太短以致無法與IgE抗體結合，因此可與IgE反應性及過敏原性牛乳衍生肽/蛋白質資料庫中定義之過敏原性及IgE反應性肽區別。另外，它們與β酪蛋白已公開之主要IgE結合區(aa 1-16,aa 83-92,aa 135-144;Chatchatee 2001)不同。在水解乳樣本中無法偵測到藉由篩選cDNA表現庫所得到之其他IgE反應性乳過敏原及過敏原片段(圖1)，因此該水解乳樣本可被鑑定為非過敏原性製劑。因此可以證明，利用完全水解乳，LC-MS分析可被用於鑑定非過敏原性製劑/樣本。
B)β酪蛋白之合成肽。肽之名稱、彼等之胺基酸序列、長度、pI及以kDa表示之分子量被列出。
實驗程序
水解乳配方係利用與HCT-Ultra質譜儀(德國布魯克公司(Bruker Daltonik))之奈米噴灑介面連接之奈米液相層析系統(荷蘭LC Packings Dionex公司Ultimate系統)藉由逆相HPLC分析。利用MASCOT(英國倫敦矩陣科技公司(Matrix Science))軟體搜尋演算法對SwissProt蛋白質資料庫搜尋所得到之質譜圖。在點漬分析中，將1微克之蛋白質點印至硝酸纖維素膜上，並與來自乳過敏病患之1:20PBST(PBS,0.5%體積/體積Tween 20)稀釋血清一起培養。經結合之IgE抗體係以1:15稀釋之125 I-標記抗人IgE抗體(德國IBL公司)偵測。
實施例4：牛α乳白蛋白(ALA)之表位定位以鑑別IgE反應性ALA衍生肽
方法
ALA衍生肽之合成：表1所展示之ALA衍生肽(Lac1-Lac8)係利用Fmoc(9茀基甲氧基羰基)策略及HBTU[(2-/1H-苯并三唑-1-基)1,1,3,3,四甲基脲六氟磷酸鹽]活化(0.1毫莫耳小量循環)以於應用生物系統(Applied Biosystems)肽合成儀型號433A(加州福斯特市)上合成及如Focke et al.,Faseb J 15:2042-2044所述純化。
對ALA衍生肽之IgE反應性測試：ALA衍生肽之IgE反應性係利用如文獻(Schulmeister et al.,J Immunol. 182(11):7019-29)所述之微陣列分析測定。簡言之，乳成分被印漬至普通顯微鏡玻片上之毛細流膜上，並與25微升之病患血清一起培養。經結合之IgE抗體係以螢光共軛抗IgE抗體於670奈米波長處偵測。每位病患之最低檢測值被設定為人血清白蛋白所獲得之個別數值的二倍值。
結果
鑑別與IgE抗體具反應性之ALA表位
為了鑑別ALA之IgE反應性表位，我們合成8個橫跨ALA序列之肽(表2)。該8個肽之長度為19至20個胺基酸，有5個胺基酸重疊。該8個重疊肽之IgE反應性係藉由微陣列分析，使用來自對rALA具IgE反應性之36位病患的血清評估。我們發現30.6%之病患對Lac1有反應，33.3%對Lac2、5.6%對Lac4、2.8%對Lac5、Lac6及Lac7及11.1%對Lac8有反應(表3)。在36位對rALA具IgE反應性的病患中，總共有19位與至少一種ALA衍生性合成肽有反應。
a 表中使用之縮寫：Lac1-Lac8，ALA衍生肽1-8；aa，胺基酸；pI，等電點；MW，分子量；kDa，千道爾頓。
本發明另包含下列項目：
1.　鑑別由DNA或cDNA表現庫所編碼之過敏原性蛋白質及肽之方法，該方法包含下列步驟：
a)提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自至少一個過敏原來源之DNA或cDNA；
b)表現至少一種由該表現庫所編碼之蛋白質或肽；
c)測定該至少一種蛋白質或肽與對該至少一個過敏原來源敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；
d)使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽與嗜鹼細胞或肥胖細胞接觸；及
e)當該嗜鹼細胞與步驟d)之至少一種蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種蛋白質或肽係過敏原性。
2.　如項目1之方法，其中該至少一個過敏原來源係動物。
3.　如項目2之方法，其中該動物係哺乳動物。
4.　如項目3之方法，其中該哺乳動物係牛。
5.　如項目3之方法，其中該哺乳動物係貓。
6.　如項目3之方法，其中該哺乳動物係狗。
7.　如項目2之方法，其中該哺乳動物係泌乳哺乳動物且該DNA或cDNA係得自乳腺組織。
8.　如項目2之方法，其中該動物係塵蟎。
9.　如項目1之方法，其中該動物係魚。
10.　如項目2之方法，其中該過敏原來源係蛋。
11.　如項目1之方法，其中該至少一個過敏原來源係植物。
12.　如項目11之方法，其中該植物係雜草。
13.　如項目11之方法，其中該植物係豆類。
14.　如項目11之方法，其中該植物係樹木。
15.　如項目1之方法，其中該表現庫係噬菌體展示庫或細菌表現庫。
16.　如項目1之方法，其中該IgE結合能力係藉由將至少一種蛋白質或肽固定於固態支持物上，使該固態支持物與IgE接觸及偵測IgE與該固態支持物之結合以測定。
17.　如項目1之方法，其中該嗜鹼細胞係人化大鼠嗜鹼白血病(RBL)細胞(RBL-703/21株)。
18.　如項目1之方法，其中步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列係經測定且該至少一種蛋白質或肽係於步驟d)之前經化學合成或重組產製。
19.如項目1之方法，其中該方法另包含測定步驟e)所鑑定之至少一種蛋白質或肽的胺基酸序列之步驟。
20.如項目19之方法，其中該胺基酸序列係由質譜法測定。
21.如項目19之方法，其中該胺基酸序列係由艾德曼(Edman)降解法測定。
圖1A顯示編碼IgE反應性全長αS1及αS2酪蛋白及IgE反應性αS1及αS2酪蛋白片段之cDNA的推演胺基酸序列。全長αS1及αS2酪蛋白之胺基酸序列係顯示於頂端。IgE反應性αS1及αS2酪蛋白片段(選殖株號碼右側)之序列係以線條顯示。數目表示各選殖株之第一及最後一個胺基酸。
圖1B顯示編碼IgE反應性全長β、κ酪蛋白及β乳球蛋白及該些蛋白質之IgE反應性片段之cDNA的推演胺基酸序列。
全長β、κ酪蛋白及β乳球蛋白之胺基酸序列係顯示於頂端。IgE反應性片段(選殖株號碼右側)之序列係以線條顯示。數目表示各選殖株之第一及最後一個胺基酸。在β酪蛋白序列(頂端)中劃底線之序列對應由質譜分析完全水解之低過敏原性乳配方所鑑別之非過敏原性肽。
圖1C顯示α乳白蛋白、牛血清白蛋白及乳鐵蛋白之胺基酸序列。
圖2顯示IgE篩選源自牛乳腺組織之cDNA表現庫。經攜帶cDNA庫之噬菌體感染之大腸桿菌細胞Y1090被誘導以合成重組蛋白質。這些蛋白質被轉移至硝酸纖維素膜及暴露至乳過敏病患之血清IgE，隨後與125I-標記之抗人IgE抗體一起培養。此膜之放射自顯影圖中，IgE反應性菌株顯示為黑點。
圖3顯示乳樣本及成分之過敏原性活性。生物活性係於人RBL試驗中測定。在人RBL試驗中產生陽性反應之病患血清(n=78)百分比係以黑色條狀顯示(y軸)。被分析的是下列乳成分：來自不同物種之乳樣本(GM山羊乳、CM牛乳、SM綿羊乳、HM人乳、MM馬乳)；不同物種之酪蛋白組分(GC山羊酪蛋白、CC牛酪蛋白、SC綿羊酪蛋白)；天然純化蛋白質(ACα酪蛋白、BCβ酪蛋白、KCκ酪蛋白、ALAα乳白蛋白、BLGBβ乳球蛋白變異體B、BLGAβ乳球蛋白變異體A、BSA牛血清白蛋白、SSA綿羊血清白蛋白、hALA人α乳白蛋白、Lf乳鐵蛋白)；重組蛋白質(rAS1C重組αS1酪蛋白、rAS2C重組αS2酪蛋白、rBC重組β酪蛋白、rKC重組κ酪蛋白、rALA重組α乳白蛋白、rBLG重組β乳球蛋白)；BSA之重組片段(F1，BSA之重組片段1；F2，BSA之重組片段2；F3，BSA之重組片段3)及αS1酪蛋白之合成肽(Cas1至Cas6)。
圖4顯示在乳中發現之過敏原序列清單。
圖5顯示利用奈米液相層析法及隨後的電噴灑離子化質譜法分離水解乳配方。該圖為1微克水解乳樣本之總離子層析圖。留滯時間係顯示於X軸，以cps(每秒計數)表示之信號強度顯示於Y軸。
圖6顯示Mascot搜尋及鑑定水解牛乳中之β酪蛋白衍生肽。
圖7顯示在水解牛乳中所鑑定之β酪蛋白衍生肽係為非IgE反應性。

Claims (9)

  1. 一種鑑別過敏原性牛乳α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質及/或肽之方法，該方法包含下列步驟：a)提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；b)表現至少一種由該表現庫所編碼之α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽；c)測定該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；d)使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及e)當該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞與步驟d)之至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽接觸以釋放至少一種介質時，鑑別該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽係過敏原性。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法另包含測定步驟e)所鑑別之該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽之胺基酸序列之步驟。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該α S1酪蛋 白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽中至少一者具有選自SEQ ID NO：1至84中任一者之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該牛乳係水解牛乳。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽之存在係由質譜分析測定。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中存在於樣本中之該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽在質譜分析之前係經分離。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽係藉由電泳法或藉由高效液相層析法分離。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該電泳法係二維電泳法。
  9. 一種鑑別IgE反應性非過敏原性乳α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽之方法，該蛋白質或肽係由至少一個表現庫之DNA或cDNA所編碼，該方法包含下列步驟：a)提供至少一個表現庫，該表現庫包含源自泌乳牛的乳腺組織之DNA或cDNA；b)表現至少一種由該表現庫所編碼之α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽； c)測定該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽與對牛乳敏感的個體之至少一種血清型IgE結合之能力；d)使步驟c)所測定之展現IgE結合能力之該至少一種α S1酪蛋白、α S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白蛋白質或肽與嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞接觸；及e)測定該嗜鹼細胞、嗜酸細胞或肥胖細胞(i)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否釋放至少一種介質，或(ii)當與該至少一種蛋白質或肽接觸時是否去顆粒，其中與該至少一種蛋白質或肽接觸時釋放該至少一種介質或與該至少一種蛋白質或肽接觸時去顆粒表示該個體係過敏或具過敏傾向。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8859210B2 (en) * 2008-10-17 2014-10-14 Mead Johnson Nutrition Company Method for identifying allergenic proteins and peptides
PL2332428T3 (pl) * 2009-12-04 2015-02-27 Mjn Us Holdings Llc Formulacja odżywcza zawierająca hydrolizat zawierający peptydy mleka krowiego i/lub pochodzące z niego peptydy do indukowania tolerancji
US9289461B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Mead Johnson Nutrition Company Reducing the risk of autoimmune disease
US8889633B2 (en) 2013-03-15 2014-11-18 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof
US9345727B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof
US9138455B2 (en) 2013-03-15 2015-09-22 Mead Johnson Nutrition Company Activating adiponectin by casein hydrolysate
US9352020B2 (en) 2013-03-15 2016-05-31 Mead Johnson Nutrition Company Reducing proinflammatory response
US9345741B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof
US11215615B2 (en) 2014-04-03 2022-01-04 AllerGenis LLC Peptides, reagents and methods for detecting food allergy
CA2982213C (en) * 2015-04-09 2022-10-18 Cornell University Gene therapy to prevent reactions to allergens
CN104807988B (zh) * 2015-04-29 2017-02-01 何韶衡 一种嗜碱性粒细胞的特异性免疫识别方法
CN104777303B (zh) * 2015-04-29 2017-02-01 何韶衡 一种嗜碱性粒细胞激活、脱颗粒的鉴定方法
RU2666254C1 (ru) * 2017-05-11 2018-09-06 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) Способ диагностики пищевой аллергии у детей
CN107817311B (zh) * 2017-09-27 2019-08-23 绿城农科检测技术有限公司 一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法
US11408895B1 (en) 2018-04-09 2022-08-09 Hob Biotech Group Corp., Ltd. Allergen characterization, potent allergen product formulation, comprehensive allergen reagent, and allergy assay
CN111766324B (zh) * 2020-07-10 2022-12-06 中国检验检疫科学研究院 一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法
WO2022015934A2 (en) * 2020-07-15 2022-01-20 The Johns Hopkins Universtiy Comprehensive analysis of anti-allergen antibodies using phage display
JP2022157411A (ja) * 2021-03-31 2022-10-14 学校法人藤田学園 牛乳アレルギーの新規抗原
CN114437238B (zh) * 2022-01-26 2024-03-26 浙江工业大学 胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6849427B1 (en) * 1993-03-12 2005-02-01 Immulogic Pharmaceutical Corp. Nucleic acids encoding a house dust mite allergen, Der p VII, and uses therefor
US6238925B1 (en) * 1998-01-30 2001-05-29 Panacea Pharmaceuticals, Llc Method for determining likelihood of developing clinical tolerance
US6799121B2 (en) * 2000-03-30 2004-09-28 York University Sequencing of peptides by mass spectrometry
RU2187817C2 (ru) * 2000-05-15 2002-08-20 Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Способ прогнозирования развития аллергических реакций у детей раннего возраста
CN101178406A (zh) * 2007-12-05 2008-05-14 杭州浙大生物基因工程有限公司 过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒及其制备方法
US8859210B2 (en) * 2008-10-17 2014-10-14 Mead Johnson Nutrition Company Method for identifying allergenic proteins and peptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chatel JM, Bernard H, Clement G, Frobert Y, Batt CA, Gavalchin J, Peltres G, Wal JM., "Expression, purification and immunochemical characterization of recombinant bovine beta-lactoglobulin, a major cow milk allergen" Molecular Immunology, 1996, vol. 33, no. 14, pages 1113-1118 Blanc F, Bernard H, Alessandri S, Bublin M, Paty E, Leung SA, Patient KA, Wal JM., "Update on optimized purification and characterization of natural milk allergens" Molecular Nutrition & Food Research, 2008, vol. 52,Suppl., pages S166-S175 *
Natale M, Bisson C, Monti G, Peltran A, Garoffo LP, Valentini S, Fabris C, Bertino E, Coscia A, Conti A., "Cow's milk allergens identification by two-dimensional immunoblotting and mass spectrometry" Molecular Nutrition & Food Research, 2004, vol. 48, pages 363-369 *

Also Published As

Publication number Publication date
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