TW200930818A - Method and kits for multiplex amplification of short tandem repeat loci - Google Patents

Method and kits for multiplex amplification of short tandem repeat loci Download PDF

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Robert Green
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Description

200930818 六、發明說明： 【引言】 、本發明意旨係大體上關於基因體系統中遺傳標記的摘 測’在麵具體實施例，多個不同多態性基因座係同時在 一個多工反應放大以決定每一個基座的等位基因。所分析 多態性基因座可為短串聯重複序列(STR)基因座，其亦可包 含小型-STRs其產生約200個驗基對或更少的複製子。 【圖式】 熟知該技藝者可了解下文所敘述圖式，係僅用於說明 目的，這些圖式不意欲以任何方式限制本發明意旨範圍。 第1圖為一種說明由十五個STR基因座（十個 S GMplus基因座加五個基因座)及Amelogenin性別鑑定基 因座(Amel)的多工放大所產生的複製子(於鹼基對)的相對 尺寸範圍的圖，如在實例中所敘述。 第2圖為一種得自SGMplus® STR基座VWA (vWA)、 D16S539 (D16)、D2S1338、D8S1179 (D8)、D21S11 (D21)、 D18S51 (D18)、D19S433 (D19)、TH01、FGA、D3S1358 (D3)、性別鑑定基因座Amelogenin (Amel)、及五種新的STR 基座(圓圈狀）D10S1248 (D10)、D22S1045 (022)、D2S441、 D1S1656 (D1)及D12S391 (D12)的同時放大的產物之五色 螢光偵測之輸出的圖。基因座係由人類遺傳DNA的樣品放 大及使用ABIPRISM®3130x1基因分析儀偵測，如在實例 中所敘述。四個板，自頂部至底部，係對應於6-FAM™， VIC®、NED™及PET®染料標示的尖峰（第五個染料， 4 200930818 LIZtm，係用於標示尺寸標準品，及未示出）。每一個板的 X-軸量度鹼基對中放大產品的尺寸。 第3圖為一種當用於實例(6_FAMtm、VIC®、视以肘、 PET及LIZTM)五種螢光染料’加上可用於一種六個染料多 工反應的額外第六個染料(SID)的發射光譜的圖（波長以奈 米表示）。 【各種具體實施例敘述】 ❹ 在此專利說明書中所使用的大多數字眼具熟知該技藝 者所使用字眼的意義’在此專利說明書所特別定義的字眼 具整體本意旨内文所提供的意義，及係典型上為熟知該技 f者所了解。在字眼賴語的技藝所了解定義與在此專利 忒明書所特定引用字眼或詞語的定義之間存在衝突時，應 依循此專利說明書。此處所使用標題僅為方便目的，及不 以任何方式建構做為限制。 當用於此處時’ "DNA”係表示以其在該技藝中所了解 Ο #各種形式的去氧核糖核酸，例如基因體DNA、、 ^體核酸分子、紐DNA、及染色體DNA。”核酸”係表示 、任何形式的DNA或RNA (核糖核酸）。當用於此處時， 離體核酸分子”係表示一種已自其自然環境移出的核 、子(DNA或RNA)，離體核酸分子的一些實例為包含於 ，體的重組DNA分？，縣在外來餘細胞的重組DNA 广子部份或基本上經純化核酸分子，及合成DNA分子。 ^體”核酸分子可為無序列的，其在得到核酸的生物體的基 A中自然自側邊接於核酸(亦即，位於核酸5,及3' 5 200930818 端的序列）。而且，”離體"核酸分子，例如cDNA分子，當 由重组，術產生時可基本上不含其他細胞物質或是培養介 質，或疋當化學合成時不含化學前軀體或其他化學物質。 _ ”短串聯重複”或” STR ”基因座係表示包含短的、重複序 列疋素的基因體DNA區域，重複的序列元素不限於但是一 般為三至七條基對的長度，在STR縣-鹏列元素重 複至少-次及於此處係稱為1複單元，，。名稱STR亦包含 ❹ —種基因體DNA的區域，射超過-個單-重複單元串聯 重複或是具插入驗，只要至少一次序列於串聯中重複至少 —。 ’’多態性短串聯域細座”係表示—種孤基因座， 其中在基因體DNA的特定區域重複序列元素的數目(及序 列淨長度)隨等位基因，及隨個體變化。 當用於此處時，"等位基因分型，，係表示一種包含來自基 因座的經放大等位基因的標準尺寸標記。”等位基因·,係表= Ο -種伴隨DNA區段的基因變化；亦即佔據相同等位基因的 二或更多交替形式的DNA區段的其中一個。 ”生物化學命名”絲示祕此處的鮮生物化學么 名，其中核雛基係命名為腺料(A)、胸腺錢(τ)、 糞驗(G)、及胞魏(C)。相對應核皆酸係為，例如，脫： 苷-5，-三磷酸(dGTP)。 乳馬 ”祖多態性”係表示DNA序列中二或更多不同的枝 苷酸序列共存於相同遠交群體的情況。 Λ ”基因座”或”基因體基因座”係表示—種在染色體上的 200930818 特定物理位置，基因座的等位基因係放置於同系物染色體 上的相同位置' 基因座-特定性引子”係表示一種特定地與一部分所敛 述基因座或是其互補股，至少基因座的一個等位基因，雜 父的引子’及在放大方法所使用條件下不會與其他dna序 列有效率地雜交。 ”聚合酶連鎖反應”或” PCR"係表示一種技術，其中與弓I ❹ 子結合，及使用DNA聚合酶酵素延伸的重複變性循環係用 於放大標的DNA序列的拷貝數目約1〇6倍或更多。放大 核酸的PCR方法係涵蓋於美國專利第4,683，195號及第 4,683,2G2號，其係以其綠敘述併人本文做為方法叙述參 考。任何PCR的反應條件包含反應的化學成分及其濃度， 用於反應循環的溫度，反應循環數目，及反應循環階^時 間。 當用於此處時，”放大”係表示酵素地增加特定核苷酸序 ❹ 列的罝之方法，此放大不限於但一般是由PCR完成。當用 於此處時，’’變性’’係絲兩種互補核普酸股自結合狀態的分 離’變性可由數種因子誘發’例如，緩衝劑的離子強度、 溫度、或是中斷鹼配對交互作用的化學物。當用於此處時， "結合"係表示核苷酸股之間的特定交互作用其中這些股基 於由Watson-Crick鹼配對所決定的股之間的互補性而實& 上連接至另一個，互補性不需要為1〇〇%進行結合。當用於 此處時，”延伸”係表示引子募核甘酸及標的核酸結合之後的 放大循環，其中聚合酶酵素作用係使用標的核酸為重複串 7 200930818 聯而延伸引子為適當尺寸的片段。 ，'引子”絲示-種單縣核倾或DNA咏，立與某 因座的DNA贱-種方式敏使刺子的㈠可做為^ 用DNA聚合酶酵素的聚合及延伸部位。，，引子對，，係表示包 含與在要放大的DNA序列的一端的單一股雜交的引子工， 及與在要放大的DNA序顺互補股的另—端雜交的引子2
的兩個引子。”肝部位”絲示肝躲交的標的舰區 域0 ”基因標記"一般係為具所欲分析特徵，例如dna分 型，的基因體DNA的等位基因，其中個體係基於在其dna 的變化而_，大部分DNA分型方絲設計⑽測及分析 已知以至少兩種不哪式，或等位基因出現於族群的一或 更多DNA標記區域的長度及/或序列的差異。此種變化係 稱為”多態性”’及此種變化發生的任何DNA區域係稱為" 多態性基因座”。執行DNA分型的一個可能方法涉及加入 具長度變化多態性分析的PCR放大技術(KB Mullis，美國 專利第4,683,202號）。傳統上pCR僅可用於可靠地放大相 當小的DNA區段；亦即，僅放大長度為3,〇〇〇個鹼基以下 的 DNA 區段(M. Ponce 及 L. Micol (1992)，NAR 20(3):623; R. Decorte 等(1990)，DNA Cell Biol. 9(6):461 469)。短串聯重 複序列(STRs)、小衛星序列及可變數目的串聯重複序列 (VNTRs)為一些長度變化多樣性的實例。包含小衛星序列或 VNTRs的DNA區段一般為太長而無法由PCr可靠地放 大。相反地STRs，其包含約三至七個核苷酸的重複單元， 8 200930818 為足夠短而有用於做為PCR應用中的基因標記，因為可設 計放大流程以產生較由DNA的其他可變長度區域可得到 的為小的產品。 常希望在單一放大反應及分離方法中同時放大及偵測 多個基因座’同時標的數個基因座以進行分析的此種系統 係稱為"多工•’系統。已敘述包含多個STR基因座的許多此 種系統。參考例如，AmpFISTR® SGMplus™ PCR Amplification Kit User's Manual, Applied Biosystems, pn i-x
及 1-1 至 1-16 (2001) ; AmpFISTR® Identifiler® PCR
Amplification Kit User's Manual, Applied Biosystems, pp, i-x 及1-1至1-10 (2001) ; JW Schumm等，美國專利第 7,〇〇8,7Ή 號。 許多國家的政府維護DNA分型資料的資料庫，英國的 國豕DNA資料庫(NDNAD)為最大的此種資料庫，其具約 2.7 百萬人的 DNA 資料，H. Wallace (2006)，EMBO reports
❹ 7.S26-S30 Home Office，2006)。自從 1999，在 NDNAD 的DNA資料已基於由Applied Biosystems. /<i所發展的 SGMplus®系統。在DNA資料系統反覆出現的問題為當 DNA樣品降解時如何辨認個體，在歐洲及美國已在實驗室 執行數個研究以比較習知STRs(範圍在自約1〇〇至約45〇 鹼基對的複製子)與微-STRs(200鹼基對或更少的複製子)做 ，分析已降解DNA樣品的基因標記，參考例如la Dixon 等(2006)，Forensic Sci. Int 164(1):33_44。結果顯示使用較 小尺寸的複製子，例如得自微-STR基因座，改善了自已降 9 200930818 解DNA樣品的分析得到成功結果的機會，M; MD Coble 及 JM Butler (2005)，J. Forensic Sci. 50(1):43-53。The European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI)及 European DNA Profiling (EDNAP)集團同意 DNA 分型的多 工PCR系統應再造以使得小複製子偵測可進行，及在歐洲 内的資料敘述系統的標準化應考慮微-STRs. R Gill等 (2006)，Forensic Sci. Int. 156(2-3):242-244。本發明意旨係關 & 於在單一反應中多重長度變化多態性的同時分析，本發明 意旨各種具體實施例併入微-STR基因座於多工放大系統。 這些系統對各種應用’包含其於DNA分型的使用，為經得 起檢驗的。 本發明意旨的方法意欲選擇適當組的基因座、引子、 及放大流程以自多個共放大的基因座產生經放大的等位基 因(複製子）’可設計此複製子使得在尺寸上不會重疊，及/ 或可以一種方式標記使得可區別等位基因與在尺寸上重疊 ❹ 的不同基因座。此外，這些方法思考選擇與使用單一放大 流程相容的多個STR基因座。此處所敘述基因座的特定組 合在此應用為獨一的。在本發明意旨各種具體實施例敘述 十五個STR基因座的共放大，其包含至少八個具最大複製 子尺寸為小於約2〇〇鹼基對的微名丁尺基因座。 除了此處所揭示，成功組合可由，例如藉由引子對序 列的選擇’及藉由引子濃度的調整所進行的基因座組合的 y式誤法產生以辨識分析用所有基因座可被放大的一種平 衡。一旦這些意旨的方法及資料被揭示，用於這些意旨的 200930818 方法及套組的選擇基因座、引子對、及放大技術的各種方 法很可能由熟知該技藝者建議。所有此種方法係包含於所 附申請專利範圍的範圍内。 本發明忍旨方法的實務可以選擇一組至少十一個8丁反 基因座(其包含 D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、 D2S1338、D3S1358、D8S1179、FGA、TH01、VWA、及 至少一個 D10S1248、D12S39卜 D1S1656、D22S1045、及 ❹ D2S441)開始’所有這些基因座可在單一多工放大反應共放 大。此外或是除了這些15個所列出的基因座的其他基因座 可包含於多工放大反應。選擇基因座及寡核甘酸引子以在 本發明意旨的多工放大反應放大基因座的可能方法係敛述 於此處及說明於下列實例。 ^數種不同技術的任何一個可用於選擇要根據本發明意 旨使用的基因座組，下列實例說明發展用於此分析方法的 有用基因座組的一種技術。一旦包含該至少十-個STR基 © 因座的多工已發展，其可用做產生包含超過這些十一個基 因座，及包含STR基因座以外的基因座(例如性別鑑定基^ 座）的多工之核心。於是可產生超過十一個基因座的新組 合，其包含該第一組•一個STR基因座。 無論使用何種方法選擇要由本發明意旨方法分析的基 因座’在各種具體實施例所選擇用於多工分析的基因座共 有一或更多下列特徵：⑴它們產生足夠的放大產品以允^ DNA的等位基因評估；（2)在多工放大步驟期間因為在有效 標的基因座的延伸或是非特定性·子製造_因為併入 11 200930818 額外鹼基它們產生較少，若有，加工品；及(3)因為由聚合 酶的提前終止放大反應它們產生較少，若有，它們產生較 少，若有，加工品。參考’例如，jW Schumm等(1993)，F〇urth International Symposium on Human Identification, pp. 177-187, Promega Corp。 當用於此處時特別STR基因座的名稱係表示指定至這 些基因座的名稱因為它們為該技藝中所已知，基因座係 在’例如，各種文獻辨識及藉由在下文清單中的各種登錄 號辨識，所有這些參考文獻以其全文併入做為參考。下文 參考清單僅意欲為基因座資料來源的示例。關於DNA區域 的資料(其包含這些基因座及意欲用做標的放大)係為公開 提供及可由參考下列及其他參考及/或登錄號而容易發現。 適當時’以歸檔時間的目前登錄號實現，由GenBank® (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD)所提供。參考，對基因座D3S1358, H. Li等.（1993)、 Hum. Mol· Genet. 2:1327;對 D12S391，MV Lareu 等(1996)， Gene 182:151-153;對 D18S51，RE Staub 等(1993)，Genomics 15:48_56;對 D21S11，V. Sharma 及 M. Litt (1992)，Hum. Mol. Genet. 1:67;對 FGA (FIBRA)，KA Mills 等（1992)，Hum. Mol. Genet. 1:779 ;對 TH01，A_ Edwards (1991)，Am. J. Hum. Genet. 49:746-756 及 MHPolymeropoulos 等（1991)’Nucleic Acids Res. 19:3753 ;對 VWA (vWF)，CP Kimpton 等(1992)， Hum. Mol. Genet. 1:287 ;對 D10S1248，MD Coble 及 JM Butler (2005)，J. Forensic Sci. 50⑴:43-53 ;對 D16S539, J. 12 200930818
Murray 等（1995)，未公開，Cooperative Human Linkage Center，登錄號 G07925;對 D2S1338，J. Murray 等（1995)， 未公開，Cooperative Human Linkage Center，登錄號 G08202 及 Watson 等，於 Progress in Forensic Genetics 7: Proceedings of the 17th Int’l ISFH Congress，Oslo, 2-6 September 1997， B· Olaisen 等，eds.，pp. 192-194 (Elsevier，Amsterdam);對 D8S1179，J. Murray 等(1995)，未公開，Cooperative Human Linkage Center，登錄號 G08710，及 NJ Oldroyd 等(1995)， Electrophoresis 16:334-337 ;對 D22S1045，J. Murray 等 (1995)，未公開，Cooperative Human Linkage Center， 登錄 號 G08085 ;對 D19S433，J. Murray 等(1995)，未公開， Cooperative Human Linkage Center，登錄號 G08036，及 MV Lareu 等（1997)，於 Progress in Forensic Genetics 7:
Proceedings of the 17th Int'l ISFH Congress, Oslo, 2-6
September 1997, B. Olaisen 等 ’ eds.，pp. 192-200，Elsevier， Amsterdam ;對 D2S441，J. Murray 等（1995)，未公開， Cooperative Human Linkage Center，登錄號 〇〇8184 ;對 D1S1656, J· Murray 專(1995) ’ 未公開，Cooperative Human Linkage Center，登錄號 G07820。 微-STRs (小於約200個驗基對的基因座)的放大允許高 降解 DNA 的輪廓分析，如在 c〇ble (2005)，J. Forensic Sci. 50(1) : 43-53所說明，其係併入本文做為參考。第1圖 說明上文所敘述所有十五健因座，加上AmdQgenin基因 座的基因座尺寸範圍以進行尺寸決定。如在第丨圖所見， 13 200930818 在先則清單所辨識的基因座中的八個包含此種微-STR基因 座.D10S1248、VWA、D8S1179、D22S1045、D19S433、 D2S441、D3S1358 及 D1S1656。 根據這些思曰所述擇用於共_放大及分析的基因座組除 了 S亥至少十一個STR基因座之外可包含至少一個基因座， 该額外基因座可包含一種STR或是其他序列多態性，或是 任何其他特徵，例如，其辨識特別特徵以在族群中分別一 個個體的DNA與其他個體的DNA。該額外基因座亦可為 辨識所分析DNA樣品來源的性別之基因座。當DNA樣品 為人類基因體DNA時，根據本方法可選擇一種性別-辨識 基因座例如Amdogenin基因座以進行共_放大及分析。 Amelogemn基因座係由GenBank辨識為(當用 於辨識在γ染色體上的基因座當存在於雄性DNA)或是為 HUMAMELX(當用於辨識在X染色體上的基因座當存在於 雄性或雌性DNA)。 一旦在單一多工中反應共放大的基因座組被辨識，我 們可决疋適合用於共放大該組的每一個基因座的引子，可 將券核甘酸引子加至s亥反應混合物及用於區分經放大Dna 片I又的5及3 ί%，一個寡核甘酸引子結合至變性模版dna 的同義(+)股，及另一個募核甘酸引子結合至變性模版dna 的反義(-)股。典型&之，寡核甘酸引子可為約12_25個核甘 酸長度，但其尺寸會依據此種參數，例如，要放大模版序 列的鹼組合、放大反應條件等，而顯著變化。引子的特定 條件並不必要為這些意旨的運作，寡核甘酸引子可設計以 200930818 結合至從側面相接所欲基因座的DNA特定部分，以特定地 放大引子-互補部位之間的DNA部分。 寡核甘酸引子可包含腺嘌呤、胸腺嘧π定、鳥嗓呤核、 及胞0密π定核苷’與尿。密咬、核甘酸類似物(例如，但不限於， 肌苷、鎖核酸(LNA)、非-核甘酸連接物、肽核酸(ρΝΑ)及亞 球核甘酸)及包含化學基團或是與之共軛的核甘酸，這些化 學基團例如放射性核素(例如，32ρ及35S)、營光分子、小溝 結合物(MGBs)，或是在該技藝中為已知的任何其他核甘酸 共輛物。 一般而言，可化學地合成寡核甘酸引子，在pCR最適 化引子設計及選擇為例行步驟，熟知該技藝者可容易地設 計特定引子以放大所欲標的基因座，或是自此處所列出參 考文獻得到引子組。所有這些引子係在本發明意旨範圍内。 要小心選擇用於該多工反應的引子序列，不適當的引 子選擇會產生不欲作用例如放大不足、在所欲標的基因座 ❹ 旁的一個部位或多個部位的放大、引子-二聚體形成、不同 基因座的引子之間的不欲交互作用、自一個基因座的等位 基因(其與另-個基因座的等位基因重叠(例如，於尺寸)的 複製子之製造、或是特別適合用於不同基因座的每一個的 放大條件或程之需求，此條件如呈在單一多工系統為不 相容的。藉由，例如，使用熟知該技藝者所熟悉的多工最 適化重複方法可選擇及發展引子以用於此意旨的多工系 統·選擇引子相，混合胁所麵基因座的共·放大的引 子，共··放大基因座，接著分離及偵測經放大產品以決定引 15 200930818 子於放大反應的有效性。 做為引子選擇的實例，可選擇在此處所引用參考文獻 所辨識或是在其他參考文獻所敘述有用於放大任何上文所 列出基因座的個別引子及引子對以根據本發明放大及分析 STR基因座。做為另一實例，引子可由使用在該技藝中可 提供及已知發展放大及/或多工系統的各種軟體程式的任一 禋而選擇，參考例如 /…^ “山似以Press釈體(Applied
❹
Bu)SyStems，Foster City, Calif·)。在使用軟體程式的實例中， 可將自所欲基因座區域的序列資料載入至軟體， 使用各種演算法以選擇最符合使用者規格的引子。 起初，此引子選擇方法會產生上文所敘述放大中的不 欲影響中的任—個，献放大產物的不平衡，且因為在一 些引子及其職標的之_結合強度較其刻子為大使得 一些基因觸產品產輪其他翻座為大，例如造成-些 基因座的較偏好結合及放大。或者，引子會產生—些不代 表^的基因座等位基因本身的放大產物，·亦即，會產生非_ 1定放大產物彳$自減引子設計的無關產物可能因為， 2，引子與樣品職的非侧區域之結合，或是甚至 …、他！丨子的結合，接著聽合之後敝大。 子選擇期間不平衡或是非.蚊放大產物存在於 立其门T個別引子可自總多工組取出及用於自相同或 平銜Ϊ 使Τ丨子的放大以辨識哪—個引子造成放大不 絲σ工°σ ’ —旦辨識出產生—或更多加玉品或不平 衡的兩烟子，-或兩個促成因素可單獨成對，或是於多 16 200930818 工綠(或是的子㈣改性及重制試。可重覆此方 法直到產品評储生不具任何或是具可接受程度的放大加 工品於多工系統中的放大等位基因。 _料濃賴最魏可在最料子糾蚊前或後執 打，但大多數常在引子選擇之後執行。一般言之，增加任 7特定基因座的引子濃度會增加對該基因座所產生的產物 量。然而，引子濃度最適化亦為—種重複方法因為，例如， ❹ 自—個基13座增加產品產率會減少自^-個或是其他基因 座的產率。而且’弓丨子會彼此交互作用，其會直接影響自 各種基因座的放大產物之產率。簡言之，在特定引子組濃 度的線性增加並不必然等於相對應基因座的放大產物產率 之線性增加。可參考文獻MJ Sim〇ns，美國專利第^1659 號，以得到基因座-特定引子的更詳細敘述，其意旨係以其 全文併入此處做為參考。 多工反應中基因座-至-基因座放大產物平衡亦受數個 ❹ 放大流程參數影響，例如，模版(樣品DNA)輸入數量、所 使用放大循環數目、熱循環流程結合溫度、及在循環方法 結束時額外延伸步驟的加入或排除。在所有等位基因及基 因座的放大產物產率的絕對均勻平衡，在實務上一般無法 達到，雖然理論上為希望的。 決定基因座的方法包含多工系統及該系統反應條件的 發展亦可為重複方法，亦即’我們可先發展用於小數目基 因座的多工系統，此系統不含或是幾乎不含放大加工品及 產品不平衡。此系統的引子可接著與另一個基因座或是分 17 200930818 析所欲的數個額外基因座的引子組合，此擴充引子組合可 或可不產生放大加工品或不平衡的產品產率。依次，一些 基因座可自s亥系統移除，及/或可引入新的基因座及評估之。 可重覆一或更多上文所敘述該重複選擇方法直到整組 引子皆已辨識，其可用於共_放大上文所敘述選擇用於共_ 放大的該十一個基因座，其包含STR基因座VWA、 D16S539、D2S1338、D8S1179、D21Sn、D18S51、D19S433、 ❹ TH〇l、FGA、D3S1358，及一或更多的 D1〇sl248、 D22S1045、D2S441、D1S1656、及 D12S391。要暸解可發 展許多不同組的引子以放大特別組的基因座。用於本意旨 的引子之合成可使用在該技藝中已知及/或商業可提供寡核 甘酸合成的任何標準步驟進行。在本發明各種具體實施 例，所有十五種這些STR基因座可在一個多工放大系統共_ 放大：VWA、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21SU、 D18S5 卜 D19S433、麵、FGA、D3S1358、D10S1248、 ❹ D22S1045、D2S441、D1S1656、及 D12S391。在本意旨其 他具體實施例，所有十五種這些STR基因座可在一個多工 放大系統共-放大，及包含DNA樣品來源的性別決定的 Amelogenin 基因座。 可使用與後續DNA放大相容的任何樣品製備步驟來 製備基因體DNA的樣品以用於本意旨的方法，許多此種步 驟為熟知該技藝者所已知。一些實例為藉由酚萃取純化
DNA(J. Sambrook 等（1989)，於 Molecular acrning: A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor 18 200930818
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·, pp. 9.14-9.19)，及 藉由鹽沉澱(S. Miller 等(1988)，Nucl. Acids Res. 16:1215)或 是螯合(PS Walsh 等(1991)，BioTechniques 10:506-513; CT Comey 等（1994)，J. Forensic Sci. 39:1254)的部份純化及使 用未處理血液的未純化物質的釋出(J. Burckhardt (1994)， PCR Methods and Applications 3:239-243 ； RBE McCabe (1991) »PCR Methods and Applications 1:99-106 ； BY Nordvag (1992) , BioTechniques 12:4 pp. 490-492) ° 豸要使用本意旨方法分析的該至少一個dna樣品為 人類基因體DNA時，DNA可由組織樣品例如’一或更多 血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、骨、口腔樣 品、包含胎盤細胞或是胎兒細胞的羊水、絨毛膜細胞、及/ 或任何這些或其他組織的混合物製備。 選擇性地，DNA濃度可在用於本意旨方法之前測量， 其係使用熟知該技藝者所已知的任何標準DNA定量方 ❹ 法’此種定量方法包含，例如’分光光度測量，如由J.
Sambrook 等(1989)所敘述，辦^α，Appendix E.5 ;或是使用 測$技術的螢光方法例如由CF Bnmk等（1979)，Anal. Biochem. 92: 497-500所敘述。DNA濃度可由比較DNA標 準物的雜交量與人類特定探針而測量例如由JS Waye等 (1991) J. Forensic Sci. 36:1198-1203 (1991)所敘述。使用過多 模版DNA於放大反應會產生放大加工品，其不會代表純等 位基因。 一旦基因體DNA樣品已製備’標的基因座可在本意旨 19 200930818 的多工放大步驟共-放大，可使用數種不同放大方法甲的任 一個放大基因座，例如，PCR (RK Saiki 等(1985)，Science 230: 135(M354) ’基於轉錄的放大(DY Kw〇h及Tj Kwoh (1990) 5 American Biotechnology Laboratory, October, 1990) 及單股置換放大技術(SDA) (GT Walker 等(1992), Proc. Natl. Acad. Sci” U.S.A. 89: 392-396)。在本發明一些具體實施例， 多工放大可經由PCR做動，其中DNA樣品係使用特定於 φ 該多工中每一個基因座的引子對進行放大。 標準PCR的化學成分一般包含溶劑、dnA聚合酶、去 氧核糖核三磷酸("dNTPs”)、寡核甘酸引子、二價金屬離子、 及期望包含PCR放大的標的之DNA樣品，水可用做pc的 溶劑R ’其典型上包含緩衝劑及非緩衝鹽類例如κα，緩衝 劑可為在該技藝中已知的任何緩衝劑，例如，但不限於， 二羥甲基氨基甲烷-HC1，及可由日常實驗變化以最適化 PCR結果，普通知曉該技藝者可容易地決定最適緩衝條 Ο 件’可依據用於放大的特定酶最適化PCR緩衝。 二價金屬離子常有利於使聚合酶有效作用，例如，鎮 離子為一種使得某些DNA聚合酶有效作用的二價金屬離 子。典型上可將MgCL或MgS〇4加至反應緩衝劑以供應 最適鎂離子濃度’最適PCR放大所需的鎂離子濃度係依據 所使用特定引子及模版組而定’於是’添加以達到最適放 大的鎂鹽的量常常為實驗決定，及在該技藝中為—種日常 工作。一般而言，最適PCR的鎂離子濃度可在約丨及= 10毫莫耳濃度之睛化’ PCR中纖子濃度典型範圍可在 200930818 約1.0及約4.0毫莫耳濃度之間，在約2 5毫莫耳濃度的中 值變化，或者是’可使用二價猛，例如以二氧化猛 的形式，滴定至適合於最適聚合酶活性的濃度，此濃度可 由熟知該技藝者使用標準實驗室步驟而容易地決定。 dNTPs ’其為用於放大核酸分子的建構組件，可典型地 以例如每一個濃度為約40-200微莫耳濃度的去氧腺苷三磷 酸酯("dATP”）、脫氧烏苷三磷酸酯(”dGTp，，）、去氧胞普三填 ❹ H( dCTP )及去氧胸皆三碌酸酯("dTTp”)供應於標準 PCR，亦可使用其他dNTPs，例如去氧尿苷三磷酸酯 (dUTP )、dNTP類似物(例如’肌苷），及共輛dNTps，及 這些係包含於此處所使用的名稱"dNTPs"。當使用每一個在 濃度約40-200微莫耳濃度的dNTPs時，其相符於本意旨方 法，每一個高於約200 μΜ微莫耳濃度的dNTPs濃度可為 有利的，於是在本意旨方法的一些具體實施例，每一個 射ΓΡ的濃度一般至少為約500微莫耳濃度及可高至約2微 Ο 莫耳濃度，在一些進一步具體實施例，每一個dNTP的濃 度可範圍自約0.5毫莫耳濃度至約！毫莫耳濃度。用於任 何多工放大的特定dNTP濃度可依據多工條件而變化，及 可由熟知該技藝者使用標準實驗室步驟而實驗地決定。 在PCR中聚合核苷酸三磷酸酯為放大產物的酶可為任 何DNA聚合酶，該DNA聚合酶可為，例如，在該技藝中 為已^的任何耐熱聚合酶，一些可用於此意旨的聚合^實 + J為彳于自生物的DNA聚合酶例如水生棲熱菌、極端嗜熱 菌、嗜熱水生菌、脂肪嗜熱芽孢桿菌、海棲熱袍菌及唁熱 21 200930818 妒。酶可由許多可能方法中的任一個得到；例如，自細菌 源隔離，由重組DNA技術產生或是購自商業來源。一些此 種商業可Φς：供DNA聚合的貫例包含AmpliTaq Gold® DNA 聚合酶；AmpliTaq® DNA 聚合酶；AmpliTaq® DNA 聚 合酶 Stoffel Fragment ; rTth DNA 聚合酶；及 rTth DNA 聚 合酶 ’ XL (所有皆由 Applied Biosystems，Foster City，Calif. 所製造）。合適聚合酶的其他實例包含Tne、自脂肪嗜熱芽 ❹ 抱才干囷的Bst DNA聚合酶大片段、Vent and Vent Exo-得自 嗜熱水生囷、付自脂肪嗜熱芽孢桿菌的Tma，得自嗜熱职 的Deep Vent及DeepVentExo-及PfU，及前文的突變體、 變異體及衍生物。 PCR的其他已知成分可在本發明意旨範圍内使用，此 種成分的一些實例包含山梨糖醇、表面活性劑(例如，Trit〇n X-100、Nonidet P-40 (NP_4〇)、吐溫_2〇)及分裂核苷酸對的 不相配之試劑，例如，二甲亞砜(DMS〇)、及氯化四曱銨 ❹ （TMAC)、及尿嘧啶N-糖基化酶或是作用以在PCR培養或 製備期間，PCR步驟開始之前防止pCR的複製子污染及/ 或產品的不欲生成之其他試劑。 可改變PCR循環溫度、循環數目及其期間以最適化特 定反應’作為曰常實驗，普通知曉該技藝者可認知下列為 決定PCR各齡數的指引，及亦認知一或更多條件的變化 係在本發明意旨範m内。蚊PCR巾三瓣段：變性、結 合及延伸的溫度及循環時間，一輪的變性、結合及延伸係 私為-個’循壤’’’瓶一般可在足夠高以允許DNA股分 22 200930818 離，但不足以高至破壞聚合酶活性的溫度進行。一般而古， 耐熱型聚麵可祕該錢，耐熱縣麵在高溫不會^ 性而是保有某-程度的活性’細’若在每_次微變性 步驟之後重新更新，射使用熱不穩定聚合酶，*型而+， 變性可在高於約90。c及低於約刚。c執行。在一些且體 實施例，變性可在約94_95。C的溫度執行，DNA的變性 一般進行至少約i至約30秒。在i具體實關，變性可 進行約1至約15秒。在其他具體實施例，變性可進行多至 約1分鐘或更多。除了 DNA變性之外，對—些聚合酶， 例如AmpliTaq Gold® ’在變性溫度触養_.於活化酶， 所以，當朗這絲合酶峡得PCR的第—步驟較後 續變性步驟為長是有利的。
在結合階段期間，寡核甘酸引子在其互補區域結合至 標的DNA及實質上由聚合酶延伸，一旦聚合酶結合至引子 -模版雙工。在習知PCR，結合溫度可典型上在或低於最不 穩定引子•模版雙工的熔點(Tm)，於此Tm可由熟知該技藝者 所或知的許多理論方法中的任一個估計。例如，丁m可由式 子決定：
Tm = (4°C X G及C驗基的數目）+ (2°C X A及T驗基 的數目）。 典型而言’在標準PCR，結合溫度可為約5-1〇。(：低於 所估計最不穩定引子··模版雙工的熔點Tm。結合時間可在約 30秒及約2分鐘之間，結合階段典型上係在延伸階段之後， 延伸可進行足夠量的時間以允許聚合酶完成成為適當尺寸 23 200930818 的放大產品的引子延伸。 於PCR的循環數目（一個循環包含變性、結合及延伸) 決定放大程度及_放大產品量。pcR產生dna分子的指 數式放大於疋’理論上，在每一個pCR《盾環之後存在出 現在先祕環的兩倍量的產物，直到pCR試雜盡及達到 平頂(於此沒有進—步放大產品赵）。典型上，會執行約 20 30個PCR循環以達到此平頂，更典型而言，會執行約 φ 25-30個循環，雖然並未特別限制循環數目。 對-些具體實施例，在PCR的最後循環的最後階段之 後於某-溫度培養反應為有利的。在一些具體實施例，可 遠擇加長的延伸階段。在其他具體實施例，可選擇於低溫(例 如，約4。〇培養。 可使用各種方法以評估由多工反應所得到的放大產品 混合物中經放大等位基因的產品，例如，螢光標示產品的 偵測，放射性同位素標示產品的偵測，放大產品的銀染色 ❹ 或疋使用DNA嵌入劑染料例如溴化乙錠(EtBr)及sybr綠 色菁染料以顯現雙-股放大產品。適合用於接附至引子以用 於本發明的螢光標示為數目繁多的，商業可提供的，及該 技藝中所熟知。使用螢光分析，至少一種經螢光標示引子 可用於每一個基因座的放大。螢光偵測在標示及產品偵測 的放射性方法為所欲的，例如，因為螢光偵測不需要使用 放射性物質’及於是避免伴隨放射性物質的使用之法規及 安全問題。使用經標示引子的螢光偵測亦可選擇用於其他 偵測的非放射性方法’例如銀染色及DNA嵌入劑，因為偵 24 200930818 ❹ ❹ 測的螢光方法-般較銀染色及DNA嵌人劑顯現出較少的 放大人工品。此—部分是因為僅具標示接附於其上的DNA 放大股在螢光麵被侧出的事實，於是每—個放大產品 的兩個股皆使祕染色及嵌人劑侧方輯色及偵測，其 產生許多麵枝大人工品的視覺建立，此外，存在伴隨 使用EtBr及SYBR的潛在健康風險，已知驗為—種致 突變原；SYBR，雖然具較舰為少的致突變原，係一般 懸浮於DMSO，其可快速地通過皮膚。 一當引子的螢光標示用於多工反應時，一般可使用至少 一種不π‘示以標示不同引子，當使用尺寸標諸評估多工 反應產品時，用於製備尺寸標誌、的引子可使用得自放大該 反應中所欲基因座的引子的不同標諸標示，隨著自動化螢 光成像及分析，可制彡工放大反赫品陳快速債測及 分析。 西在本意旨的一些具體實施例，螢光可用於，例如藉由 共^鍵結至5丨子’來標示多工放大的至少-種引子，由此 ^生故螢光標示的引子。在—些具體實關’多工中不同 “的基因座㈣子可使用不同榮光聽示，依據瑩光體放 射f長而定，每—個榮級產生不醜色的產品。這些各 ，心示的引子可用於相同多工反應，及它們的各自放大產 °α接著—起分析。可標示放大特定基因座的前置或反置引 子對’雖然前置引子較常被標示。 J為些在s亥技藝中熟知及適合用於本意旨的可台 勞#辦堵w , m -貫例’該清單意欲為實例及不欲為排外性的。一此 25 200930818 可能勞光體包含：螢光素(FL)，其最大在492奈米吸收及最 大在520奈米發射；N，N，N，，N，-四曱基-6·羧基若丹明 (TAMRAtm) ’其最大在5分奈米吸收及最大在58〇奈米發 射；5-叛基螢光素(5_FAMTM)，其最大在495奈米吸收及最 大在525奈米發射；2，，7，-二曱氧基_4，，5，_二氯-6-羧基螢光素 (JOETM) ’其最大在525奈米吸收及最大在555奈米發射）； 6-叛基-X-若丹明(R〇xtm) ’其最大在585奈米吸收及最大 0 在605奈米發射；CY3TM，其最大在552奈米吸收及最大在 570奈求發射；CY5TM’其最大在643奈米吸收及最大在667 奈米發射；四氯-螢光素(TETtm)，其最大在521奈米吸收及 最大在536奈米發射；及六氯_螢光素(ΗΕχτΜ)，其最大在 535奈米吸收及最大在556奈米發射；NED™，其最大在 546奈米吸收及最大在575奈米發射；6_FAMTM，其最大在 約520奈米發射；VIC®其最大在約550奈米發射；PET®其 最大在約590奈米發射；及Liz™，其最大在約65〇奈米發 ❹ 射。參考SR Coticone等，美國專利第6,780,588號；
AmpFISTR® IdentifilerTM PCR Amplification Kit User's
Manual, pp. 1 -3，Applied Biosystems (2001)。注意上文所列出 發射及/或吸收波長為典型的及僅可用於一般指引目的；對 不同應用及在不同條件下實際尖峰波長會變化。 本意旨各種具體實施例可包括含有至少四種不同染料 的單一多工系統，這些至少四種染料可包含上文所列出染 料的任何四種，或是該技藝中已知的任何其他四種染料， 或是6-FAM™、VIC®、nedtm及pET®。本意旨其他具體 26 200930818 實細可包括含有至少五種不同染料的單—多卫系統，這 些至少五種染料可包含上文所列出染料的任何五種，或是 該技藝中已知的任何其他五種染料，或是6_famtm、vic®、 NED™、PET⑧及LIZ™。參考第2圖DNA數據之實例， 其係由使用五種染料6-FAMTM、VIC®、NEDTM、PET®及 LIZTM的十六個基因座的多工放大所得到，如在實例所敘述 (LIZ™的放大鱗未利’目為UZTM係標示尺寸標 e 準物）。本意旨其他具體實施例可包括含有至少六種不同染 料的單一多工系統，這些至少六種染料可包含上文所列出 染料的任何六種，或是該技藝中已知的任何其他六種染 料’或疋 6-FAMTM、VIC®、NEDTM、PET®、LIZTM及且 在約620奈米的最大發射之第六種染料(SID)。參考第3圖。 PCR產品可於篩分或無篩分介質分析。在這些意旨一 些具體實施例，例如，PCR產品可由電泳分析；例如，毛 細管電泳’如在 H. Wenz 等(1998) ’ Genome Res. 8:69-80 0 ( ### E. Buel 等（1998)，J. Forensic Sci. 43:(1 )，pp. 164-170))所钦述’或是平板凝膠電泳，如在m. Christensen 等(1999)，Scand. J. Clin. Lab. Invest. 59(3): 167-177 所敘述， 或疋變性聚丙稀酿胺减膠電泳(參考，例如j. SambiOok等 (1989) ’ 於 Molecular Cloning: A Laboratory Manual,.second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y.，pp. 13.45-13.57)。電泳中 DNA 片段的分離係 主要基於不同片段大小，放大產品亦可由層析法分析；例 如，藉由尺寸排除色譜(SEC)。 27 200930818 一旦該經放大等位基因被分離，在例如，凝膠或毛細 管的這些等位基因及任何其他dna(例如，DNA尺寸標鍵 或是等位基因分型)可接著視覺化及分析，DNA的視覺ϋ 使用在該技藝中已知的數種技術的任何一種完成，例如， 銀染色或是藉由使用報告基因例如放射性同位素及螢光染 料，如此處所敘述，或是化學發光劑及酶與可偵測基質: 常常，偵測多工基因座的方法可藉由螢光，參考，例如， ❾ JW Schumm 等.in Proceedings from the Eighth Intemati〇nal
Symposium on Human Identification, pub. 1998 by Promega Corporation，PP. 78-84; E. Bud 等(1·)，似押。當使用螢光 •標示引子偵測在多工反應的每一個引子，放大後可使用螢 光偵測劑偵測經標示產品，參考螢光染料敘述，〃叩似。 存在於DNA樣品中的每一個基因座的等位基因尺寸 可由比較在電泳的尺寸標準品，例如已知尺寸的DNa標言志 而決定，評估包含二或更多多態性STR基因座的多工放大 ❹ 之標諸亦包含基因座-特異性等位基因分型或是所評估每一 個基因座的等位基因分型之組合，參考例如，c. puers等 (1993)，Am. J. Hum· Genet. 53:953-958 ; C. Puers 等（1994)，
Genomics 23:260-264。亦參考，美國專利第 5,599,666 ; 5,674,686;及5,783,406號的適合用於STR基因座偵測的一 些等位基因分型之敘述，及所揭示一些分型結構的方法。 個別基因座的等位基因分型結構之後，分型可與放大產品 同時電泳’每一個等位基因分型與等位基因自相對應基因 座共遷移。 28 200930818 本意旨多工反應的產品亦可使用内泳道標準物評估； 亦即使用，構型為要在例如，與放大產品相同的毛細管電 泳的特定形式的尺寸標誌。該内泳道標準物包含一系列已 知長度的片段，該内泳道標準物亦可使用螢光染料標示， 其可與在放大反應的其他染料區別。該泳道標準物可與經 放大樣品或尺寸標準物/等位基因分型混合及與彼此電泳， 以比較在凝膠電泳的不同泳道或是毛細管電泳的不同毛細 〇 管的遷移。在該内泳道標準物遷移的差異可用於顯示於分 離介質性能的差異，此差異的定量及與等位基因分型相關 性可提供用於在不同泳道或是毛細管電泳的放大產品之 校正’及於未知樣品中等位基因的尺寸決定之關連。 當使用螢光染料標示放大產品時，經電泳及分離產品 可使用螢光偵測裝置分析，例如，ABI PRISM® 310或3130x1 基因分析儀，或是ABI PRISM® 377 DNA序列儀(Applied Biosystems，Foster City，Calif.);或是 Hitachi FMBIO™ II 螢 ❿ 光掃描器(Hitachi Software Engineering America，Ltd.，South
San Francisco, Calif.)。在本意旨各種具體實施例，PCR產品 可由毛細管凝膠電泳流程與此種電泳儀錶裝置如ABI PRISM® 3130x1 基因分析儀(Applied Biosystems)分析，及經 電泳放大產品的等位基因分析可使用例如Applied Biosystems 的 GeneMapper®//) Software v3.2 執行。在其他 具體實施例’放大產品可由在’例如，約4.5%，29:1丙烯 醯胺：雙丙烯醯胺，8莫耳濃度凝膠電泳(如為ABI PRISM® 377自動化螢光DNA序列儀所製備)中電泳而分離。 29 200930818 本意旨亦相關於使用上文所敘述方法的試劑盒。在一 些具體實施例，基本試劑盒可包含具—或更多基因座特定 引子的容器。試劑盒亦可選擇性地包含使用指南，試劑盒 亦可包含其他選擇性試劑盒組件，例如，與每一個該特定 基因座相關的一或更多等位基因分型，足夠量的放大用 酶，促進放大的放大缓衝液，促進酶活性的二價陽離子溶 液，在放大期間用於股延伸的dNTPs，製備電泳用放大產 ❿ 〇口的負何’谷液’基因體DNA做為模版控制組，尺寸標誌、以 確保物質於分離介質中如所預期遷移，及流程與手冊以教 育使用者及限制於使用時的錯誤。在試劑盒中各種試劑量 亦可依據數種因素而變化，例如最適方法敏感性。提供測 試試劑盒以在手動應用使用或是試劑盒以隨自動偵測器或 分析儀使用亦在本意旨範圍内。 個人辨識測試，或是DNA分型，可在包含核酸，例如 骨、頭髮、血液、組織及其類似物的任何樣品上執行，DNA Φ 可自該樣品及一組所使用引子萃取以放大多工中DNA的 所欲STR基因座組以產生一組放大產品，如此處所敘述。 在親子鑑定，特定樣品的放大模式，或是DNA數據，可與 得自推定受害者(推定匹配源)的已知樣品比較，或是可與得 自推疋又害者的家族成員（例如，母親及/或父親)的經放大 基因座的模式比較’其中相同組的STR基因座被放大。STR 基因座放大的模式可用於確認或排除受害者的辨識。在親 子鑑定，測試樣品一般可為得自小孩及可進行與來自推定 父親的STR基因座模式之比較，及/或可與得自小孩母親的 30 200930818
STR基因座模式匹配。STR基因座放大的模式可用於確認 或排除父親的辨識’特定基因座的放大及比較亦可用於育 種的親子鑑定；例如，牛、狗、馬及其他哺乳動物。CR
Primmer 等(1995)，Mol. EcoL 4:493-498。 在臨床處理，可使用此種STR標誌、，例如，以監控骨 髓移植中供體植入的程度，在醫院中，這些標諸亦有用於 樣品匹配及追蹤。這些標誌亦已進入其他科學領域，例如 ❹ 於人類種族及族群差異的種群生物研究(DB Goldstein等 (1995)，Proc. Natl. Acad. Sci. U，S.A. 92:6723-6727)，進化及 物種差異性，及於動物與植物的變化(MW Brnford等 (1993)，Curr. Biol· 3:939-943)。 參考文獻、專利、專利申請案、科學文獻及其他出版 品’與此處所參考GenBank資料庫序列的登錄號，係皆以 其全文併入做為參考。 【實例】 n 本意旨方面可參考下列實例而進一步了解，此實例在 任何方面不應建構為限制本意旨範圍。 在某些具體實施例，將要分析的DNA樣品與STR-及 Amelogenin-特定引子組合併於PCR混合物中以放大基因 座 D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、 D3S1358、D8S1179、FGA、TH01、VWA、Amelogenin， 及五種新的 STR 基因座 D10S1248、D12S391、D1S1656、 D22S1045、及D2S441。這些基因座的引子組係根據此處所 提供方法設計，放大 D10S1248、VWA、D16S539 及 D2S1338 31 200930818 的每一個引子組的一個引子係以6-FAMTM螢光標誌標 示，放大 Amelogenin、D8S1179、D21S11 及 D18S51 的每 一個引子組的一個引子係以VIC®螢光標誌標示，放大 D22S1045、D19S433、TH01 及 FGA 的每一個引子組的一 個引子係以NED™螢光標誌標示，放大D2S441、 D3S1358、D1S1656及D12S391的每一個引子組的一個引 子係以PET®螢光標誌標示，第五種螢光標誌，LIZ™，係 ^ 用於標示尺寸標準物。 反應混合物接著進行聚合酶連鎖反應，放大產品係由 STR及Amelogenin基因座產生，且經標示引子併入放大產 品。放大產品於是以6-FAM™、VIC®、NEDTM或PET®榮 光標誌標示，所有或一部分反應混合物於單一毛細管通道 在放大反應後進行毛細管電泳。亦電泳該1^12；1^_標示尺寸 標準物。自螢光標誌的放射在單一輸出偵測及顯示。第2 圖為使用五種染料放大16個基因座的DNA資料(LIZTM-標 ❹ 示尺寸標準物未示出），STR及Amelogenin基因座遷移通 過該通道的速率係為其尺寸的函數，STR及八㈣卿血 放大產品的尺寸及其標諸的顏色辨識每一個基因座的等位 基因。 如熟知該技藝者所了解’可對各種本意旨各種具體實 施例進行數種變化及修改而不偏離本意旨精神，意欲 .所有此種變化於本意旨範圍内。 32 200930818 【主要元件符號說明】 D10、D22、D2S441、D1、 STR 基座 D12、VWA、D16、D2S1338、 D8-D21 Ό18Ό19'ΤΗ01 ' FGA、D3、D10S1248、 D16S539、D2S1338、 D8S1179、D21S11、D18S5 卜 D22S1045、FGA、D3S1358 ' 短串聯重複序列 Amelogenin、性別鑑定基 因座 染料 D1S1656、D12S391 STR Amel 6-FAM、VIC、NED、PET、
LIZ、SID ❹ 33

Claims (1)

  1. 200930818 七、申請專利範圍： 1. 一種方法，其包含： (a) 於多工之放大的反應中共放大要分析的至少一 DNA樣品的一組基因座，其中該反應的產物係為該組 中來自共放大基因座的經放大等位基因的一混合物， 其中該組基因座係包含10個STR基因座D16S539、 D18S51 ' D19S433 > D21S11 > D2S1338 > D3S1358 > D8S1179、FGA、TH01、VWA ;及由 STR 基因座 D10S1248、D12S391、D1S1656、D22S1045、及 D2S441 所組成的族群的其中之一或更多； (b) 評估該混合物的該經放大等位基因，以決定在該 至少一個DNA樣品内的該組基因座中存在於所分析 的每一個基因座的等位基因。 2. 如申請專利範圍第1項的方法，其中在步驟(a)的該組 基因座係進一步包含可用於辨識該至少一個DNA樣 品的來源之性別的一基因座。 3·如申請專利範圍帛2項的方法，其中該測八樣品的該 來源係為人類，及用於辨識人類性別的該基因座係為 一 Amelogenin 基因座。 4. 如申請專利範圍第i項的方法，其進一步包含在該評 估的步驟之前分離該經放大等位基因之步驟。 5. 如申請專利範圍第4項的方法，其中該經放大等位基 因係由毛細管凝膠電泳分離。 6. 如申請專利範圍第i項的方法，其中該共放大的步驟 34 200930818 係包含使用一對寡核甘酸引子於該組基因座的每一個 基因座，在該多工的反應中該對的引子的每一個位於 5亥組基因座的一個基因座兩侧。 7·如申請專利範圍第6項的方法，其中每一對寡核甘酸 引子的至少一個引子係為一經標示引子。 8·如申請專利範圍第7項的方法，其中該經標示引子的 標籤係為一螢光標諸。 ❹ ❹ 9. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該共放大的步驟 係包含使用至少五螢光標示的寡核甘酸引子，其中該 至少五標示引子由至少五不同螢光標示分別共價接 附。 10. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該共放大的步驟 係包含使用至少六螢光標示的寡核甘酸引子，其中該 至少六標示引子由至少六不同螢光標示分別共價接 附。 η·如申請專利範圍第10項的方法，其中該至少六種不同 螢光標示係包含 於520奈米發射自己的最大螢光之一第一螢光標示、 於550奈米發射自己的最大螢光之一第二螢光標示、 於575奈米發射自己的最大螢光之一第三螢光標示、 於590奈米發射自己的最大螢光之一第四螢光標示、 於650奈米發射自己的最大螢光之一第五螢光標示、 及於620奈米發射自己的最大螢光之一第六螢光標示。 12.如申請專利範圍第1項的方法，其中在所選擇該組基 35 200930818 因座的每一個基因座係使用一聚合酶連鎖反應而被共 放大。 13·如申請專利範圍第1項的方法，其中要分析的該至少 一個DNA樣品係由人類組織製備。 14. 如申3月專利範圍第13項的方法，其中該人類組織係由 血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、骨、口 月i樣包3胎盤細胞的羊水，及包含胎兒細胞的羊 ❹水所組成族群的其中之一或更多選出。 15. ―種試劑盒，其包含用於共放大要分析的至少-個要 分析DNA樣品的一組基因座的募核甘酸引子；其中該 組基因座可被共放大;其中剌子係在-或更多容器 中’及其中5亥組基因座係包含Amei〇genin基因座，該 10 個 STR 基因座 D16S539、D18S51、D19S433、 D21S1 卜 D2S1338、D3S1358、D8S1179、FGA、TH01、 VWA、及由 STR 基因座 D10S1248、D12S391、 ❹ D1S1656、D22S1045、及D2S441所組成的族群的其中 之一或更多。 16·如申，專利範圍帛15項的試劑盒，其中在該試劑盒的 所有券核甘酸引子係在一容器中。 17. 如申請專利範圍第15項的試劑盒，其進一步包含用於 至少一多工放大反應的試劑。 18. 如申请專利範圍第15項的試劑盒，其進一步包含具至 少一尺寸標準物的一容器。 9’如申明專利範圍第18項的試劑盒，其中該尺寸標準物 36 200930818 係為一 DNA標誌、。 20. 如申請專利範圍第18項的試劑盒，其中該尺寸標準物 係為一基因座-特定等位基因分型。 ❹
    21. 如申請專利範圍第2〇項的試劑盒，其中每一該基因座 -特定等位基因分型及在該組基因座的每一基因座的至 少一券核甘酸引子係由一螢光標諸共價地接附，及該 寡核甘酸引子的至少兩個係由一與該容器中其他引子 不同的螢光標誌所共價地接附。 22. 如申請專利範圍第21項的試劑盒，其中該經標示引子 中的至少五個係由至少五不同螢光標誌分別共價地接 附0 23. 如申請專利範圍第22項的試劑盒，其中該至少五不同 螢光標誌、係包含 於520奈米發射自己的最大螢光之一第一螢光標示、 於550奈米發射自己的最大螢光之一第二瑩光標示、 於575奈米發射自己的最大螢光之一第三螢光標示、 於590奈米發射自己的最大螢光之一第四榮光標示、 及於650奈米發射自己的最大螢光之一第五螢光標示。 24如申請專利範圍第21項的試劑盒，其中該經標示引子 中的至少六個係由至少六不同螢光標誌分別共價地接 附。 25如申請專利範圍第24項的試劑盒，其中該至少六不同 螢光標誌係包含 於520奈米發射自己的最大螢光之一第一螢光標示、 37 200930818 〇
    於550奈米發射自己的最大螢光之一第二螢光標示、 於575奈米發射自己的最大螢光之一第三螢光標示、 於590奈米發射自己的最大螢光之一第四螢光標示、 於650奈米發射自己的最大螢光之一第五螢光標示、 及於620奈米發射自己的最大螢光之一第六螢光標示。 38
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