KR101996837B1 - 프라이머를 이용한 래더 제작방법 - Google Patents

Abstract

VNTR(Variable Number of Tandem Repeats) 및 STR(Short Tandem Repeat) 증폭 산물의 반복 단위가 소정 단위씩 차이가 나타나도록 프라이머(Primer) 서열을 조절하여 복수의 증폭 산물을 획득하고, 획득한 복수의 증폭 산물을 혼합함으로써 간단하게 ladder를 제작하도록 한 프라이머를 이용한 래더 제작방법에 관한 것으로서, 검사 시료인 주형 DNA의 비반복부위 프라이머 서열을 획득하는 단계, 상기 획득한 프라이머 서열을 조절하여 주형 DNA를 증폭시켜 복수의 증폭 산물을 획득하는 단계, 획득한 복수의 증폭 산물을 혼합하여 DNA 분석을 위한 ladder를 제작하는 단계를 포함하여, 프라이머를 이용한 래더 제작방법을 구현한다.

Description

프라이머를 이용한 래더 제작방법{DNA ladder make method using primer}

본 발명은 프라이머(primer)를 이용한 래더(ladder) 제작에 관한 것으로, 특히 VNTR(Variable Number of Tandem Repeats) 및 STR(Short Tandem Repeat) 증폭 산물의 반복 단위가 소정 단위씩 차이가 나타나도록 프라이머(Primer) 서열을 조절하여 복수의 증폭 산물을 획득하고, 획득한 복수의 증폭 산물을 혼합함으로써 간단하게 ladder를 제작하도록 한 프라이머를 이용한 래더 제작방법에 관한 것이다.

여기서 ladder는 DNA를 전기영동시켜 추출한 결과물로서 DNA Marker이다.

일반적인 DNA 증폭 산물의 크기를 분석함에 있어서, ladder는 크기를 산출하는 비교 마커(Marker)로서 실험의 정확성을 높인다.

VNTR(Variable Number of Tandem Repeats) 및 STR(Short Tandem Repeat) 분석은 좌위(위치) 내에 존재하는 직렬염기 반복에 대한 분석으로, 사람마다 반복단위가 다르고, 확률적인 계산이 가능하기 때문에 현장증거물 분석, 신원확인, 친자확인 등 유용한 법과학 도구로 이용된다(비특허문헌 1 및 2 참조).

VNTR 및 STR의 분석은 겔 전기영동이나 모세관 전기영동을 통해 크기를 분석하는 데, 겔 전기영동은 육안으로 밴드가 관찰되어야 하기 때문에 비교적 많은 양의 DNA를 필요로 하고, 2 ~ 5bp 단위로 반복되는 STR 증폭 산물을 관찰하기에는 정확성이 떨어져 2000년대 이후로는 모세관 전기영동을 통해 대부분 분석되고 있다. 특히, 모세관 전기영동은 감도가 뛰어나고 다양한 파장의 형광을 동시에 검출할 수 있기 때문에 20좌위(위치)가 넘는 STR도 한 번에 분석할 수 있다(비특허문헌 3 참조). 모세관 전기영동은 장비의 모세관, 폴리머, 전압, 저항 등으로 이동성(mobility)의 차이가 있을 수 있기 때문에 증폭 산물의 크기는 반드시 기준 마커 혹은 ladder를 통해 이동성을 고려하여 산출해야 하고, 이는 겔 전기영동에서도 마찬가지이다(비특허문헌 3 및 4 참조).

ladder를 제작하는 방법은 염기의 반복단위를 알고 있는 대조시료(known reference sample)를 이용하여 다양한 반복단위가 포함되도록 복수의 시료들의 증폭 산물을 혼합하는 방식, 증폭된 대조시료를 겔 전기영동으로 관찰하여 원하는 밴드를 선별하여 DNA 정제 후 이를 클로닝(cloning)하거나 정제된 DNA를 모두 혼합하여 재증폭하는 방법 등을 이용한다(비특허문헌 5 참조). 인구 집단 내에서 검출된 다양한 대립유전자를 혼합하여 ladder를 만들거나 기존의 ladder를 희석하여 동일한 프라이머로 재증폭하여 만드는 방법도 알려졌다(비특허문헌 4 및 5 참조).

J M. Butler, Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR Markers, 2th edition, Elsevier Academic Press, (2005) UK. K. Kasai, Y. Nakamura and R. White, Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. J. Forensic Sci., 35 (1990) 1196-1200. B. Glock, D.W.M. Schwartz, E.M. Schwartz-Jungl and W.R. Mayr, Sequence determination of an allelic ladder for the STR polymorphism at the CD4 locus and application of the ladder in testing an Austrian Caucasian population sample, Forensic Sci. Int., 78 (1996) 125-130. 4.J M. Butler, Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology, Elsevier Academic Press, (2012) USA. F.S. Baechtel, J.B. Smerick, K.W. Presely and B. Budowle, Multigenerational Amplification of a Reference Ladder for Alleles at Locus D1S80. J. Forensic Sci., 38 (1993) 1176-1182. J.W. Schumm, Profiles in DNA: Why use a size marker and allelic ladder in STR Analysis GenePrintTM (1997) 11-13.

그러나 상기와 같은 일반적인 DNA ladder 제작 방법 및 종래기술로 언급된 ladder 제작 방법은 ladder 제작 과정이 복잡하고, 원하는 프로필을 갖고 있는 시료를 얻기 위해서는 여러 명의 시료를 분석하여 조합하여야 하므로 많은 노동력과 긴 제작 시간이 요구되는 단점이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 일반적인 DNA ladder 제작 방법 및 종래기술에서 발생하는 제반 문제점을 해결하기 위해서 제안된 것으로서, VNTR(Variable Number of Tandem Repeats) 및 STR(Short Tandem Repeat) 증폭 산물의 반복 단위(검출 피크)가 소정 단위씩 차이가 나타나도록 프라이머(Primer) 서열을 조절하여 복수의 증폭 산물을 획득하고, 획득한 복수의 증폭 산물을 혼합함으로써 간단하게 ladder를 제작하도록 한 프라이머를 이용한 래더 제작방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 하나의 DNA만으로도 ladder를 손쉽게 제작할 수 있도록 한 프라이머를 이용한 래더 제작방법을 제공하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 래더 제작방법은 (a) 주형 DNA의 비반복부위 프라이머 서열을 획득하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 획득한 프라이머 서열을 조절하여 상기 주형 DNA를 증폭시켜 복수의 증폭 산물을 획득하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 획득한 복수의 증폭 산물을 혼합하여 DNA 분석을 위한 ladder를 제작하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 (a)단계는 이미 알려진 프라이머 서열과 In-silco PCR(중합 효소 연쇄반응)을 이용하여 D1S80의 비반복부위 프라이머 서열을 획득하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 (b)단계는 증폭 산물이 소정 단위씩 적거나 많아지도록 프라이머 서열을 조절하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 (b)단계는 상기 프라이머 서열을 조절하여 상기 비반복부위의 크기를 소정 단위로 감소 또는 증가시켜 최종 증폭 산물의 길이를 감소 또는 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기에서 (b)단계는 획득한 프라이머 서열에서 시작 서열의 1단위 뒤, 또는 2단위 뒤에서 프라이머를 디자인하고, reverse 프라이머는 한 가지만 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 (b)단계의 프라이머 디자인시 원하는 파장의 형광을 부착하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 (c)단계는 하나의 DNA로 복수의 대립유전자 조합을 갖는 ladder를 제작하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 DNA 분석을 위한 ladder 제작 시, 프라이머를 단순히 기존 프라이머보다 1단위 뒤 혹은 앞에서 제작하는 방법으로 증폭 산물의 길이가 조절되도록 ladder를 제작함으로써, 반복단위를 늘이거나 줄이는 과정이 간단하기 때문에 프라이머 디자인이 번거롭지 않고, ladder 제작 시간도 단축할 수 있으며, 증폭 Tm 값만 맞춰서 제작하면 원하는 대로 다양한 조합도 만들 수 있는 다양한 장점이 있다.

특히, 본 발명에 따르면 모든 VNTR 및 STR 좌위, 혹은 일정한 반복단위를 갖는 다른 용도의 ladder 제작 등 폭넓은 범위에서 활용 가능한 ladder 제작방법을 제공해주는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 D1S80 ladder 제작 과정의 모식도,
도 2는 D1S80 ladder를 모세관 전기영동하여 획득한 결과도,
도 3은 본 발명에 의해 제작된 ladder를 이용하여 분석된 미지시료의 D1S80 결과도.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 프라이머를 이용한 래더 제작방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 프라이머를 이용한 D1S80 ladder 제작 과정의 모식도이다.

본 발명은 VNTR 및 STR 증폭 산물의 반복단위가 1단위씩 차이가 나도록 프라이머 위치를 변경하여 간단하게 ladder를 제작할 수 있는 방법을 제안한 것이다.

이는 실제 반복서열 부위에서 단위가 증가하거나 감소하는 것이 아니라 프라이머가 결합하는 비반복부위(flanking region)의 크기를 인위적으로 감소 혹은 증가시켜 최종 증폭 산물의 길이를 감소 혹은 증가시키는 방법이다. 이로써 하나의 DNA로 다양한 대립유전자 조합을 갖는 ladder를 제작할 수 있다. 예컨대, ladder는 크기 기반(size base)이기 때문에 프라이머를 단순히 기존 프라이머 보다 1단위 뒤 혹은 앞에서 제작함으로써 1단위씩 적거나 많은 증폭 산물을 만들 수 있다. 이는 반복단위를 늘이거나 줄이는 과정이 간단하기 때문에 프라이머 디자인이 번거롭지 않고, 증폭 Tm 값만 맞춰서 제작하면 원하는 대로 다양한 조합을 만들 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따른 ladder 제작 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 실시 예로 VNTR 중 하나인 D1S80 좌위의 ladder를 프라이머를 통해 제작한다.

먼저, 대상시료인 주형 DNA의 비반복부위 프라이머 서열을 획득한다.

주형 DNA는 이미 많은 문헌에서 보고되어 직렬 염기 반복단위가 알려진 표준 DNA 시료 K562를 사용한다. K562 표준 DNA의 D1S80 VNTR의 좌위(위치)는 18, 29로 보고되었으며, 이에 사용된 프라이머 서열(F1, R1)도 이미 논문에 보고되어 있다(비특허문헌 2 참조). 여기서 주형 DNA는 증폭의 대상이 되는 DNA를 의미한다. 보고된 프라이머 서열과 UCSC 사이트의 In-silco PCR (중합효소 연쇄반응)(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)을 이용하여 D1S80의 비반복부위 프라이머 서열을 획득한다. 여기서 D1S80은 좌위 내에 존재하는 16bp 염기의 직렬반복에 대한 분석을 의미한다. 참고로 상기 프라이머 서열은 염기서열의 전체 정보를 토대로 증폭을 원하는 부위가 포함되도록 인위적으로 합성하여 만든 프라이어 위치를 의미한다.

다음으로, 상기 획득한 프라이머 서열을 조절하여 상기 주형 DNA를 증폭시켜 복수의 증폭 산물을 획득한다. 여기서 프라이머 서열을 조절한다는 것은 어떤 염기 내에 프라이머의 위치를 달리하여 서열이 달라지게 한다는 것을 의미한다.

증폭 산물의 단위를 1단위(16bp), 2단위(32bp) 씩 줄이도록 프라이머를 제작하면 하나의 디엔에이로 6개의 단위를 갖는 디엔에이 증폭 산물이 생산된다. 즉, D1S80의 반복단위가 16bp이므로 보고된 프라이머 시작서열(F1)의 1단위 뒤인 16bp 뒤(F-16), 2단위 뒤인 32bp 뒤(F-32)에서 프라이머를 디자인하고, reverse 프라이머는 그대로 한 가지만 사용하여 증폭하고, 각각의 증폭 산물을 혼합하면 도 1과 같은 조합을 만들 수 있다. 여기서 본 발명은 보고된 프라이머 시작서열의 1단위 뒤에서 프라이머를 디자인하는 것으로 설명하였으나, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니고, 반복단위의 2단위 뒤 또는 몇 단위 뒤에서 프라이머를 디자인할 수도 있으며, 반복단위의 1단위 및 2단위 앞 또는 몇 단위 앞에서 프라이머를 디자인할 수 있음도 당해 분야에 통상의 지식을 가진자라면 자명하다 할 것이다. 상기 증폭산물을 혼합한다는 것은 프라이머의 다양성으로 얻어진 다양한 크기의 증폭 산물을 혼합한다는 의미이다.

도 1에서 R1(reverse1)과 F1(primer1)의 조합으로부터 본래의 크기인 433bp(18), 609bp(29)가 얻어지고, R1과 F-16의 조합으로 417bp(17), 593bp(28)를 얻을 수 있으며, R1과 F-32의 조합으로 401bp(16), 577bp(27)가 생산되는데, 이를 반복단위로 환산하면 433bp(18), 609bp(29)가 18, 29로 알려졌으며, 16bp가 1단위이므로 17, 28 및 16, 27의 조합이 추가로 생성되는 것이다.

다시 말해, 증폭 산물이 소정 단위씩 적거나 많아지도록 프라이머 위치를 변경하여 상기 비반복부위의 크기를 소정 단위로 감소 또는 증가시켜 최종 증폭 산물의 길이를 감소 또는 증가시키게 된다.

다음으로, 획득한 복수의 증폭 산물을 혼합하여 DNA 분석을 위한 ladder를 제작한다.

예컨대, 1단위씩 감소되어 증폭된 K562 시료의 D1S80 VNTR 증폭 산물과 이를 혼합하여 16, 17, 18, 27, 28, 29 조합의 ladder를 제작한다. 여기서 프라이머를 디자인할 때 원하는 파장의 형광을 부착하여 제작하면 도 2와 같은 가상의 전기영동 결과 분석이 가능하다. 이는 하나의 표준 DNA만을 사용하여 6단위의 조합을 만든 예시이고, 프라이머를 2단위뿐 아니라 원하는 단위로 얼마든지 다양한 조합을 만들 수 있다. 여기에 DNA를 몇 가지 더 사용한다면 더욱더 다양한 조합의 ladder 제작이 가능하다. D1S80의 경우 논문에서 보고된 프라이머를 통해 증폭 산물의 서열을 확인했을 때 비반복부위의 5' 방향의 서열의 길이가 길었기 때문에 Forward 프라이머(F)를 이용하여 증폭 산물의 크기를 줄인 것이며, 이는 최초에 선택하는 프라이머 서열에 의해 ladder 제작을 위한 프라이머 디자인이 달라지게된다.

전기영동의 이동성(mobility)은 서열의 길이뿐만 아니라 서열도 동일해야 ladder로서 정확성이 높아지나(비특허문헌 6 참조), 서열의 작은 차이는 이동성에 영향을 미치지 않을 수 있다(비특허문헌 4 참조).

이를 검증하고자 본 발명자는 생산된 ladder를 bin으로 설정하여 실제 미지시료가 설정된 ladder를 기준으로 읽히는지(allele call)를 확인하였으며, 이는 도 3과 같다. 도 3에 도시한 바와 같이, 실제 제작된 ladder를 이용하여 분석된 미지시료(N=4)의 D1S80 결과, 미지시료가 설정된 ladder를 기준으로 정확히 읽혀지는 것을 알 수 있다.

본 발명에서 ladder 제작과정은 STR에서도 가능하고, 이외, 일정한 반복 단위에 대한 증폭 실험에서 모두 적용이 가능하다. 특히 ladder를 제작해야만 하는 실험에서 다양한 시료가 존재하지 않을 때 매우 유용할 것이다.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

본 발명은 DNA 분석을 위한 ladder 제작 기술에 적용된다.

Claims (8)

1. D1S80의 비반복부위를 증폭할 수 있도록 프라이머가 결합하는 상기 비반복부위의 서열을 결정하는 단계;
   상기 결정된 비반복부위의 서열의 특정 기준점을 시작점으로 하는 프라이머를 설계하는 단계;
   상기 결정된 비반복부위의 서열의 특정 기준점에서 16bp 또는 32bp의 앞 또는 뒤에 결합하는 복수의 프라이머를 설계하는 단계;
   상기 설계된 프라이머를 이용하여 D1S80의 비반복부위를 복수 회 증폭하여 크기가 상이한 증폭 산물을 획득하는 단계;
   획득된 크기가 상이한 증폭 산물을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머를 이용한 래더 제작방법.
   
   
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