TW200902069A - DsRNA compositions and methods for treating HPV infections - Google Patents

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200902069 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於雙鏈核糖核酸（dsRNA)、及其在介導瓢 干擾以治療由人類乳頭狀瘤病毒（HPV)感染所介導之病理 過程(例如子宮頸癌、肛門癌、HPV相關癌前病變及生殖 器疣）中的用途。 【先前技術】 乳頭狀瘤病毒（PV)係誘導上皮過度增殖性病變之無包被 DNA病毒。乳頭狀瘤病毒在自然界中分布廣泛且已在高等 脊椎動物中識別出來。其中，已對來自人類、牛、兔子、 馬及狗之病毒進行表徵。第一種乳頭狀瘤病毒在1933年被 闡述為棉尾兔乳頭狀瘤病毒（CRPV)。其後，棉尾兔以及牛 1型乳頭狀瘤病毒（BPV-丨）即作為研究乳頭狀瘤病毒之實驗 原型。大多數動物乳頭狀瘤病毒與純粹上皮增殖性病變有 關，且動物之大多數病變係皮膚性的。在人類中已鑑別出 100多種類型之乳頭狀瘤病毒（HPV)並藉由感染部位：皮膚 上皮及黏臈上皮（口腔黏膜及生殖器黏臈）將其分類。皮膚 相關疾病包括扁平疣、跖疣等。黏膜相關疾病包括喉乳頭 狀瘤及包含子宮頸癌之肛門生殖性疾病（Fields，1996, Virology ,第三版，Lippinc〇tt_Raven pub，philadelphia， N.Y. ; Bernard，H-U·, 2005. J. Clin. Virol. 328: S1-S6)。 人類乳頭狀瘤病毒（HPV)係世界上最為流行之性傳播感 染之一。大多數HPV感染係無害的。一些類型之HPV會引 起生殖器疣’其以單個或多個腫塊出現於包括陰道、子宮 129698.doc 200902069 頌、外陰（陰道之外部區域）、陰莖及直腸之男性及女性之 生殖區。許多人感染HPV並無症狀。 士雖然大多數HPV亞型導致良性病變，但某些亞型被視為 阿風險且可肊導致更嚴重之病變，例如子宮頸及肛門發育 異常。最近已將十五種HPV類型列為高風險類型（Mun〇z， N.等人 2003. N. Eng 丨· J· Med. 348⑹:518_27)。該等高風險

亞型在遺傳上係不同的，其在L1基因（主要之病毒衣殼蛋 白）處展示大於10%之序列差異。（Bernard, Η_υ，2〇〇5 J

Clin. Virol· 328: S1-S6)。 患有HPV感染之女性通常係無症狀的且僅可在子宮頸篩 檢後發現其病變。廣泛利用巴氏試驗（Pap test)來實施子宮 頸篩檢。巴氏試驗係用以鑑別異常子宮頸細胞之子宮頸組 織之組織學評價。作為巴氏試驗之一部分，HP v感染及特 異性亞型之存在可利用諸如PCR或商業雜交捕獲„技術 (HCII)等基於核酸之分析法來確定（Digene，Gaithersburg， Maryland, U.S.A)。 異常子宮頸細胞（若鑑別出）分為具有發展成癌症之低風 險之LSIL(低度鱗狀上皮内病變）（包括CIN-1指定細胞（”子 宮頸上皮内贅瘤-1"));或HSIL(高度鱗狀上皮内病變），包 括CIN-2及CIN-3指定細胞，其具有發展成癌症之較高可能 性。 約85%之低度病變會自發逆轉，且其餘的保持不變或發 展成高度病變。若不實施治療，則預計約10°/。之高度病變 會轉化成癌性組織。最常見地，HPV-16及HPV-18與發育 129698.doc 200902069 :常有關，儘管數種其他轉化HPV亞型亦與發育異常有 、最近之研究表明，高達89%之HIV陽性同性戀男性可能 感染該等高風險HPV亞型。HIV陽性患者亦更加可能同日; 感染多種HPV亞型，此伴隨較高風險之發育異常進展。 過去二十年之證據已達成廣泛共識，即HPV感染係子宮 頸癌發病之必要但不充分條件。估計㈣在子宮頸癌中之 存在率為99.7〇/〇。吾人認為’與子宮頸癌之情形—樣，肛 門癌具有類似之HPV感染與發生肛門發育異常及肛門癌間 之聯繫。在一項患有肛門癌之HIV陰性患者之研究中，在 88%之肛門癌中發現HPV感染。在2〇〇3年之美國，預洌子 宮頸癌新增例且4，1GG例子宮頸癌死亡，連同肛門癌 新增4,000例且500例肛門癌死亡。雖然在過去四十年十由 於廣泛預防性篩查子宮頸癌之發病率已降低，但肛門癌之 發病率升高。肛門癌發病率之升高可部分歸因於卿感 染，因為HIV陽性患者比一般群體具有較高之肛門癌發病 率。㈣肛門癌在—般群體中發病率狀9例/⑽，刪人， 但在同性戀男性群體中肛門癌之發病率為％例η 〇μ〇〇人 且在HIV陽性同性戀男性群體中為7(Μ⑻例/⑽，綱人。事 實上，由於在感染mv之患者中肛門發育異常高度流行及 肛門癌之趨勢增長’因此針對治療贈陽性患者之機會主

義感染（Treatment of 〇pportunistic 地⑷刪比 HIV

Positive Patients)之 2003 Uspha/IDsa 方針將包括經診斷 患有肛門發育異常之患者之治療方針。 I29698.doc 200902069 對於HPV感染沒有已知的治愈方法。可以治療生殖器 疣’雖然其通常即使未經治療亦消失。治療方法端視諸如 生殖器疣之大小及位置等因素而定。所用治療包括咪喹莫 特（Imiquimod)乳膏、2〇%之鬼白樹脂（p〇d〇phylHn)抗有絲 刀裂浴液、0.5%之鬼臼毒素（p〇d〇fil〇x)溶液、5%之5_氟尿 嘧啶（5-fluorouracii)乳膏及三氣乙酸。對於妊娠女性不推 薦使用鬼臼樹脂或鬼臼毒素，因為其被皮膚吸收並可能引 起出生缺陷。妊娠女性亦不推薦使用5_氟尿嘧啶乳膏。小 的生殖器疲可藉由冷凍（冷凍外科手術）、燃燒（電烙法）或 雷射治療物理移除。對其他治療無反應之大疣可能不得不 藉由外科手術移除。已知生殖器疣在物理移除後可能復 發’在該等情形下，可向該等疣中直接注射α_干擾素。然 而，α -干擾素較為昂貴’且其使用不會降低生殖器疣之復 發率。 因此’有效治療HPV之需要未得到滿足。令人驚奇地， 吾人已發現可滿足該需要且亦可提供其他益處之化合物。 最近，已顯示雙鏈RNA分子（dsRNA)可以稱為RNA干擾 (RNAi)之高度保守之調節機制阻斷基因表現。w〇 99/32619(Fire專人）揭示使用長度為至少25個核苦酸之 dsRNA來抑制秀麗隱桿綫蟲（C. eiegans)中之基因表現。亦 已顯示dsRNA可使其他生物體中之靶RNA退化，包括植物 (參見’例如 ’ WO 99/53050，Waterhouse 等人；及 w〇 99/61631 ’ Heifetz等人）、果繩(參見，例如， Yang，D.，等人，Cwrr βζ·ο/. (2000) 1〇:1 191-1200) ' 及哺乳 129698.doc 200902069 動物（參見 WO 00/44895，Limmer ;及 DE ΙΟΙ 〇〇 586 5 ,

Kreutzer等人）。該自然機制現已成為研發用於治療由異常 或不期望之基因調節所引起之病症之新類型藥劑之焦點。 PCT公開案W0 03/_573揭示研發用於治療由刪感染 所引起之疾病之基於核酸之藥物的先前成就。該公 導使用針對HPV mRNA之兩種siRNA來抑制基於細胞^系 統t之HPV複製；相關公開案可參見了㈣，m.等人2紙 N. A· R. 33(18): el51 。 儘管RNAi領域已取得顯著進展且在治療藉由Hpv感㈣ "導之病ί!過程方面f已取得進I，但仍需要能夠抑制 HPV感染進展且能夠治療Hpv感染伴隨疾病之藥劑。該挑 戰由於》亥等藥劑必須經設計以抑制所有高風險V亞型 (其共同展示寬範圍之遺傳型多樣性）而加劇。 【發明内容】 本卷明藉由使用雙鏈核糖核酸（dsRNA)來沈默Hpv繁殖 所必需之基因表現來提供治療Hpv感染伴隨疾病中之問題 的解决方案。E6AP係Hpv增殖所f要之人類宿主物種之保 守基因。 本發明提供雙鏈核糖核酸（dsRNA)、以及使用該dsRNA 來抑制細胞或哺乳動物中E6Ap基因表現之組合物及方 法本發明亦提供用於治療由E6AP基因表現連同HPV感染 所引起之病理病狀及疾病（例如子宮頸癌及生殖器疣）之組 α物及方法。本發明dsRNA包含具有長度小於则固核苦酸 (I <而。長度為} 9_24個核苷酸）且與至少一部分E6Ap基 129698.doc -10- 200902069 因之mRNA轉錄物基本上互補之區域之RNA鏈（反義鏈）。 在一個實施例中，本發明提供用於抑制E6AP基因表現 之雙鏈核糖核酸（dsRNA)分子。該dsRNA包含至少兩條彼 此互補之序列。該dsRNA包含有義鏈（包含第一序列）及反 義鏈（包含第二序列）。該反義鏈包含與至少一部分編碼 E6AP之mRNA基本上互補之核苷酸序列，且互補性區域之 長度小於30個核苷酸，通常而言長度為19-24個核苷酸。 該dsRNA在與表現E6AP之細胞接觸時對該E6AP基因之表 現之抑制量至少為40〇/〇。 例如，本發明之dsRNA分子可包含選自由表1之有義序 列組成之群之dsRNA之第一序列及選自由表i之反義序列 組成之群之第二序列。本發明之dsRNA分子可包含天然存 在之核苷酸或可包含至少一種經修飾之核苷酸，例如經2，_ 〇甲基修飾之核皆酸、包含5’_硫代攝酸醋（phosphorothioate) 基團之核苦酸、及與膽固醇基衍生物連結之末端核苷酸。 或者，該經修飾之核苷酸可選自以下之群組：經2，_去氧_ 2 -齓修飾之核苦酸、經2，_去氧-修飾之核苦酸、鎖定核苷 酉文無驗基核普酸 '經2'-胺基-修飾之核苷酸、經2，_烷基_ 修飾之核苷酸、嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、及包含非天 ’、、;、驗基之核:g：酸^通常而言，該經修飾之序列將基於選自 由表1之有義序列組成之群之該dsRNA之第一序列及選自 由表1之反義序列組成之群之第二序列。 另實把例中，本發明提供包含一種本發明dsRNA之 匕該細胞通常為哺乳動物細胞，例如人類細胞。 129698.doc 200902069 在另一實施例中，本發明提供用於抑制生物體（通常為 人類個體）中E6AP基因表現之醫藥組合物，其包含一或多 種本發明dsRNA及醫藥上可接受之載劑或遞送媒劑。 在另一實施例中，本發明提供用於抑制細胞中E6AP基 因表現之方法，其包含以下步驟： (a) 向該細胞中引入雙鏈核糖核酸（dsRNA)，其中該 dsRNA包含至少兩條彼此互補之序列。該dsRNA包 含有義鏈（包含第一序列）及反義鏈（包含第二序 列）。該反義鏈包含與至少一部分編碼E6Ap之 mRNA基本上互補之互補性區域，且其中該互補性 區域之長度小於30個核苷酸，通常而言長度為19_ 24個核苷酸，且其中該dsRNA在與表現E6AP之細 胞接觸時對該E6AP基因之表現之抑制量至少為 40% ;及 (b) 將步驟（a)中所產生之細胞保持足以使該E6AP基因 之mRNA轉錄物降解之時間，由此抑制細胞中該 E6AP基因之表現。 在另一實施例中’本發明提供用於治療、預防或控制藉 由HpV感染所介導之病理過程（例如癌症或生殖器庞）之方 法，其包含向需要該治療、預防（preventi〇n)或控制之串者 投與治療或預防（prophylacticall幻有效量之—或多種本發 明 dsRNA。 在另—實施例中，本發明提供用於抑制細胞中E6ap基 因表現之载體’其包含可操作地連接至編碼本發明一種 129698.doc -12· 200902069 dsRNA之至少—欣 條鏈之核苷酸序列的調節序列。

在另—實施例中，本發明提供包含用於抑制細胞中 Ε6ΑΡ基因表規夕# raA ^現之载體的細胞。該載體包含可操作地連接 至編碼本發明—種dsRNA之至少一條鏈之核苷酸序列的調 節序列。 【實施方式】 本毛明藉由使用雙鏈核糖核酸（dsRNA)來沈默V增殖 所必需之基因表現來提供治療HPV感染伴隨疾病中之問題 的解决方牵。目, /、’、體而吕，本發明dsRNA沈默人類E6AP基 因，该人類E6AP基因係HPV增殖所需要之人類宿主物種之 保守基因。本文中，有時將該等基因總稱為HPV靶基因。 本發明提供雙鏈核糖核酸（dsRNA)、以及使用該dsRNA 來抑制細胞或哺乳動物中E6Ap基因表現之組合物及方 法。本發明亦提供使用dsRNA來治療*E6Ap基因表現連同 HPV感染所引起之哺乳動物病理病狀及疾病之組合物及方 法。dsRNA通過稱為RNA干擾（RNAi)之過程引導mRNA之 序列特異性退化。 本發明dsRNA包含具有長度小於3〇個核苦酸（通常而言 長度為19-24個核苷酸）且與至少一部分^〇5¥靶爪尺]^八轉錄 物基本上互補之區域之RNA鏈（反義鏈）。使用該等心1〇^八 使得能夠定向退化與哺乳動物中HPV複製及/或維持有關之 基因之mRNA。利用基於細胞及基於動物之分析，本發明 之發明者已證實極低劑量之該等dsRNA可特異性地且有效 地介導RNAi，達成E6AP基因表現之顯著抑制。因此，本 129698.doc 200902069 方法及包含該專dsRNA之組合物可用於藉由乾向與 HPV生命週期有關之宿主因子基因來治療藉由Hpv感染所 介導之病理過程。 HPV乾之闡述：HPV E1及E6及人類E6AP 人類佰主之細胞泛素連接酶E6AP藉助其與HPV病毒之 E6蛋白之複合物與該病毒之複製有關，尤其Hp v之完整 (非附加型）形式。E 6與調節細胞增殖途徑之許多蛋白質結 合且通常激起其退化（Chakrabarti, 0,及 Krishna，S. 2003. J. Biosci· 28:337-348)。E6與E6AP複合以革巴向腫瘤壓制基因 P53 使其退化（Scheffner，M.等人，1990.Cell. 63:1 129-1 136 ;及 Scheffner，Μ.等人，1993. Cell 75:495-505)。藉 由滅活p53，該病毒不僅阻止了 p53介導之受感染細胞之雕 亡（Chakrabarti及Krishna，2003)並促進原本將被p53阻斷 之其 DNA 複製（Lepik，D·等人 1998. J. Virol. 72:6822-683 1)，且亦藉由降低P53介導之對基因組完整性之控制而 有利於癌發生（Thomas, M.等人 1999. Oncogene. 1 8:7690-7700)° E1及E6二者均在Peter M. Howley所著之 ."Papillomaviridae: The Viruses and Their Replication”，第 947-978 頁，Fundamental Virology，第三版，Bernard N. Fields，David M. Knipe，及 Peter M，Howley 編輯， Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996 中有相當 詳細之闡述。E1 01117編碼質粒DNA複製所必需之68-76 kD 蛋白質。該全長El產物係與BPVI之LCR中之複製起點相 129698.doc - <4- 200902069 、、=口之經磷酸化之核蛋白質。亦已顯示E丨與Ατρ結合及與 稱為Ε2轉錄反式作用子（Ε2ΤΑ)之全長Ε2蛋白質活體外結 °由此增强病毒轉錄。與Ε2結合亦加强了 Ε1對DNA複製 起點之親和力。在ΗΡλΜ6中’ £1對無限增殖化具有間接 影響。 Ε6係疋位於核基質及非核膜片段上之小的驗性細胞轉化 蛋白（例如，HPV 16 Ε6包含151個胺基酸），約16_19 kD。 該E6基因產物含有四個Cys_x_x_Cys基序，表明具有與鋅 結合之潛力；其亦可作為核酸結合蛋白。在諸如Hpv_i6 等高風險HPV中，E6及E7蛋白係必需的且足以使其宿主_ 鱗狀上皮細胞無限增殖。已顯示高風險Hpv之恥基因產物 與p53複合並促進其退化。 以下s羊細闡述揭示如何製備並使用抑制ΗΡν靶基因表現 之dsRNA及含有dsRNA之組合物、以及用於治療由Hpv感 染所引起之疾病及病症（例如子宮頸癌及生殖器疣）之組合 物及方法。本發明之醫藥組合物包含dsRNA與醫藥上可接 文之載劑’該dsRNA具有包含長度小於3 〇個核苷酸（通常 而S長度為19-24個核苷酸）且與至少一部分Hpv革巴基因之 RNA轉錄物基本上互補之互補性區域之反義鏈。本發明實 施例係組合於醫藥調配物中之多於一種dsRNA(視情况靶 向不同HP V革巴基因）的使用。 因此’本發明之某些態樣提供包含本發明dsRNA與醫藥 上可接受之載劑之醫藥組合物、使用該等組合物來抑制一 或多種HPV靶基因表現之方法、及使用該等醫藥組合物來 129698.doc 15 200902069 /α療由HP V感染所引起之疾病之方法。 I.定義 實例及隨附申請專利 。若本說明書其他部 義間有明顯矛盾，則 為方便起見’下文提供本說明書、 範圍中所用之某些術語及短語之含義 分之術語使用與該部分所提供之其定 該部分之定義佔優勢。 通*而言，•丨G"、”C"、"Α，ι及各分別代表含有鳥兩 呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶作為驗基之核苷酸。然而： 應瞭解，術語”核糖核苷酸”或，，核芽酸，，亦可係指如下文進 一步詳述之經修飾之核苷酸或替代者代替部分。熟習此項 技術者熟諳，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可藉由其 他部分代替而基本上不改變包含具有該替代部分之核苷酸 之募核苷酸之鹼基配對特性。例如（但不限於），包含肌苷 作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之 核苷酸進行鹼基配對。因此，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌 呤之核苷酸可在本發明之核苷酸序列中藉由含有（例如）肌 苷之核苷酸代替。包含該等代替部分之序列係本發明之實 施例。 本文所用"E6AP"係指泛素蛋白連接酶E3A(ube3A，亦稱 為E6有關蛋白或E6AP)基因或蛋白。代表不同同型異構體 之E6AP之人類mRNA序列以GenBank登錄號 NM_130838，1、NM—130839.1 及ΝΜ_000462·2提供。 本文所用”Ε 1”係指人類乳頭狀瘤病毒丨6型（Ηρν丨6) E i基 因（GenBank登錄號NC_001526，核苷酸865至2813)。本文 129698.doc •16- 200902069 所用E6”係指人類乳頭狀瘤病毒16型（HPV16) E6基因 (GenBank登錄號NC_〇〇1526，核苷酸65至559)。以及以基 因之》午夕變體亦已公開揭示。該等及今後公布之E丨及別基 因變體欲藉由使用”E1 ”及”E6，’涵蓋於本文中，除非上下文 明確將其排除在外。

I 本文所用”靶序列"係指該等HPV靶基因之一轉錄期間所 形成之mRNA分子之核苷酸序列的鄰接部分，包括為初級 轉錄產物之RNA處理產物之mRNA。 f 本文所用術語"包含序列之鏈”係指包含由利用標準核苷 酸命名所指稱序列描述之核苷酸鏈之寡核苷酸。 如熟習此項技術者所瞭解，本文所用（且除非另有說明） 術語"互補”（當肖以閣述第__核芽酸序列與第二核苦酸序列 之關係時）係指包含第一核苦酸序列之寡核苦酸或聚核苦 酸與包含第二核苦酸序列之募核苦酸或聚核苦酸在某些條 件下雜交並形成雙鏈結構之能力。該等條件可為（例如）嚴 可條件’其中嚴苛條件可包括：400 mM NaCl、40 mM PIPES pH 6.4、1 mM EDTA、贼或⑽達匕叫時繼 之洗滌。可採用諸如可能在生物體内部遇到之生理學相關 條件等其他條件。根據經雜交核苷酸之最終應用，熟習此 項技術者將旎夠確定最適於測試兩條序列互補性之一組 件。 、 此包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸與包 含第二核苦酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在第一及第二核 苷S文序列全部長度内之鹼基配對。本文中該等序列可相對 129698.doc 200902069 於彼此稱為”完全互補"。 相對於第二序列"基本上互補"之::;中==稱為 完全互補，或其在雜交時可能形成二：=可能 a夕個（但通常而言

不夕於4個、3個或2個）錯配驗基對，.同時保留在與直最坟 應用最相關之條件下雜交的能力。然巾，在兩個寡核苦酸 、_以在雜交時形成—或多個單鏈懸突之情形下，該等 單鏈懸突在確定互補性時不被視為錯配。對本發明而言， 例如，包含—個長度為21個核«之寡核«及另-:度 為23個核*酸之寡核苦酸之綱A(其中較長之寡核苦： 包含與較短之寡核苷酸完全互補之21個核苷酸之序列)可 仍然被稱為”完全互補，，。 只要上述關於其雜交能力之要求能夠得到滿足，本文所 用互補序列亦可包括非Watson-Crick鹼基對及/或自非天 然及經修飾之核苷酸所形成之鹼基對或完全由其形成。 自術語”互補，’、"完全互補”及"基本上互補"使用之上下 文可瞭解到，本文中之該等術語可用於dsRNA之有義鏈與 反義鏈間、或dsRNA之反義鏈與靶序列間之鹼基匹配。 本文所用”與至少一部分信使RNA (mRNA)基本上互補" 之聚核苷酸係指與所關注mRNA(例如，編碼E6AP)之鄰接 部分基本上互補之聚核苷酸。例如，若該序列與編碼 E6APimRNA之非中斷部分基本上互補，則聚核苷酸與至 少一部分E6APmRNA互補。 本文所用術語”雙鏈RNA”或”dsRNA”係指具有包含兩條 反平行且基本上互補（如上文所定義）之核酸鏈之雙鏈結構 129698.doc •18· 200902069 之核糖核酸分子之複合物。形成雙鏈結構之該兩條鏈可為 一個較大RNA分子之不同部分，或其可為獨立之RNA分 子。在獨立之RNA分子情形下，該文獻中通常稱 為siRNA("短干擾RNA")。在該兩條鏈係_個較大分子之 部分，且因此藉由未中斷核苷酸鏈在該形成雙鏈結構之一 條鏈之3’-端與相應另一條鏈之5，端間連接之情形下，該連 接RNA鏈稱為"髮夾環，，、，，短髮夾RNA”或”shRNA”。在該 兩條鏈係藉由未中斷核苷酸鏈之外的結構在該形成雙鏈結 構之條鏈之3’_端與相應另一條鏈之5'端間共價連接之情 形下，該連接結構稱為"連結體”。該等rna鏈可能具有相 同或不同數ϊ之核苷酸。鹼基對之最大數目係dsRNA之最 短鏈中核苷酸的數目减去雙鏈體中所存在之任何懸突。除 該雙鏈結構外，dsRNA可包含一或多個核苦酸懸突。另 外，本說明書中所用之”dsRNA，,可包括對核糖核苷酸之化 學修飾mi鍵、端基、帽及接合部分，包括多個核苦 酸之實質修飾並包括本文中所揭示或熟習此項技術者所習 知之所有修飾類型^對本說明書及巾請專利關而言， "dsRNA”涵蓋siRNA類型分子中所用之任何該等修飾。 本文所用，，核*酸懸突，，係指未成對核誓酸或當七驗之 條鏈之3 -端延伸超出另一條鏈之&端（或反之亦然）時自 dsRNA又鏈結構大出之核芽酸。”鈍的"或"純端”意指在 dsRNA之彼端無未成對核苷酸，即無核苷酸懸突。”具有 純端之dsRNA係在dsRNA全部長度上均為雙鏈之dsRNA， P在β亥刀子之任一端皆無核苷酸懸突。為簡明起見，在確 129698.doc -19- 200902069 否具有懸突或是否具有鈍端時不考慮與侧八 碥或5端接合之非核苷酸化學部分或化學帽。 術語"反義鏈”係指包括與料列基本上互目補之區域之 献NA鏈。本文所用術語••互補性區域，，係指反義鏈上愈序 列(例如本文所定義之_)基本上互補之區域。當互補 性區域與乾序列係非完全互補時，錯配在末端區域最容易 接文且（若存在）通常在末端區域，例如，在5,及/或3,末端 之6個、5個、4個、3個或2個核苷酸内。 、，本文所用術語”有義鍵"係指包括與反義鏈區域基本上互 補之區域之dsRNA鏈。 如彼等熟習此項技術者所瞭解，當提時，，，引 入至細胞中”意指促進攝取或吸收至細胞中。dsRNA之吸 收或攝取可藉助無助擴散或活性細胞過程、或藉由輔助試 诏或裝置來發生。該術語之含義並不限於活體外細胞；亦 可將dsRNA"引人至細胞中，，’其中該細胞為活生物體之一 部分。在該情形下，引入至細胞中將包括向生物體之遞 送。例如，對於活體内遞送，可將dsRNA3射至組織部位 中或以王身方式投與。活體外引入至細胞中包括諸如電穿 孔及脂轉染等業内習知方法。 術5吾沈默”及”抑制…表現"（就其係指HPV靶基因而言） 在本文中係指至少部分壓制Hpv靶基因之表現，其藉由自 分離自第一個細胞或細胞群之Ηρν靶基因轉錄之mRNA的 量與第二個細胞或細胞群（對照細胞）比較之减少來顯現， 該HP V無基因在該第一個細胞或細胞群中轉錄且該第一個 129698.doc •20- 200902069 細胞或細胞群已經處理以抑制HPV靶基因表現，該第二個 細胞或細胞群（對照細胞）基本上與第一個細胞或細胞群相 同但未經如此處理。抑制程度通常表示為： (對照細胞中之mRNA)-(經處理細胞中之mRNA) , ΛΛ0/ -· lUU/o

對照細胞中之mRNA ' 或者，抑制程度可以與HPV靶基因轉錄功能上相關之參 數的减少給出，例如藉由細胞分泌之HPV|a基因所編碼之 蛋白質的量、或展示某一表型（例如，凋亡）之細胞的數 f 量。原則上，可以組成方式或藉由基因工程、及藉由任何 適當分析法在表現該靶基因之任何細胞中測定HPV靶基因 沈默。然而，當需要參考以測定給定dsRNA是否一定程度 地抑制HPV靶基因表現且因此該參考涵蓋於本發明中時， 下文實例中所提供之分析法將起該參考之作用。 例如，在某些情形下，藉由投與本發明之雙鏈寡核苷酸 可將E6AP基因之表現壓制至少約20%、25%、35%或 5 0%。在一些實施例中，藉由投與本發明之雙鏈寡核苷酸 (可將E6AP基因壓制至少約60%、70%或80%。在一些實施 例中，藉由投與本發明之雙鏈寡核苷酸可將E6AP基因壓 . 制至少約85%、90%或95%。表2提供在使用多種濃度之多 種E6AP dsRNA分子之活體外分析中所獲得之大量轉錄抑 制值。 本文HPV感染之上下文中所用之術語”治療（treat或 treatment)”及諸如此類係指緩和或减輕藉由HPV感染所介 導之病理過程。該闡述包括使用本發明治療劑來預防或防 129698.doc •21 - 200902069 止HPV感染、及緩和由HPV感染所引起之症狀或病狀。在 本發明之上下文（在其與下文所陳述之任何其他病狀（除藉 由HPV感染所介導之病理過程外）相關之範圍内）中，術語 "治療（treat或treatment)”及諸如此類意指緩和或減輕至少 一種伴Ik s亥病狀之症狀或减緩或逆轉該病狀之進展。 本文所用紐語”治療有效量”及”預防有效量"係指可在治 療、預防或控制藉由HPV感染所介導之病理過程或藉由° HPV感染所介導之病理過程之明顯症狀中提供治療益^的 里。治療有效之具體量可由普通從業醫師容易地確定，且 可端視諸如藉由HPV感染所介導之病理過程之類型、患者 病史及年齡、藉由HPV感染所介導之病理過程之階段及其 他抗病藥劑之投與等業内習知因素而定。 ^ “本文所用”醫藥組合物"包含藥王里學有效量之㈣财及醫 藥上可接受之載劑。本文所用藥理學有效量”、”治療有 效量”或簡單的”有效量，，係指可有交文產生預期藥理學、治 性結果之細A的量。例如，若當與疾病或病症 擇之可1測參數减少至少25%時給定臨床治療視為有效 二:：用於治療彼疾病或病症之藥物之治療有效量係使彼 參數减少至少25%所需要之量。 術語"醫藥上可接受截 劑。該等紅 載d係私用於投與治療劑之載 “栽4包括(但不限於)鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、 1外甘^、乙醇及其組合。該術語明確將細胞培養基排除 在卜。對於經口投與之藥物而言，醫 括但不限於諸如惰性稀釋劑't之載劑包 枰朋解劑、結合劑、潤滑劑、 129698.doc -22- 200902069 甜味劑、矯味劑、著色劑及防腐劑等醫藥上可接受之賦形 劑。適且惰性稀釋劑包括鈉及鈣碳酸鹽、鈉及鈣磷酸鹽及 乳糖，同時玉米澱粉及海藻酸係適宜之崩解劑。結合劑可 包括澱粉及明膠，同時潤滑劑（若存在）通常會為硬脂酸 鎂、硬脂酸或滑石粉。若需要，可將錠劑塗覆以諸如甘油 單硬月曰酸s曰或甘油二硬脂酸酯等物質以延遲在胃腸道中之 吸收。 本文所用”經轉化之細胞”係將載體引入至其中且可表現 dsRNA分子之細胞。 II.雙鏈核糖核酸（dsRNA) 在一個實施例中，本發明提供用於抑制細胞或哺乳動物 中HP V靶基因表現之雙鏈核糖核酸（dsRNA)分子，其中該 dsRNA包含反義鏈，該反義鏈包含與至少一部分在Hpv靶 基因表現中所形成之mRNA互補之互補性區域，且其中該 互補性區域之長度小於30個核苷酸（通常而言長度為19_24 個核苷酸）’且其中該dsRNA在與表現該HP V靶基因之細胞 接觸時對該HPV靶基因之表現之抑制量至少為1〇%、25% 或 40%。 該dsRNA包含充分互補以雜交形成雙鏈結構之兩條RNA 鏈。該dsRNA之一條鏈（反義鏈）包含與源自hpv靶基因表 現期間所形成之mRNA序列之靶序列基本上互補（且通常而 言完全互補）之互補性區域，另一條鏈（有義鏈）包含與該反 義鍵互補之區域’因此當在適宜條件下組合時該兩條鏈雜 交並形成雙鏈結構。通常而言，該雙鏈結構之長度介於15 129698.doc -23· 200902069 與30、更通常而言介於18與25、仍更通常而言介於19與 24、且最通常而言介於19與21個鹼基對之間。類似地，無 序列之互補性區域之長度介於15與30、更通常而言介於18 與25、仍更通常而言介於19與24、且最通常而言介於19與 21個核苷酸之間。本發明dsRNA可進一步包含一或多個單 鏈核苷酸懸突。該dsRNA可藉由如下文進一步論述之業内 習知標準方法合成，例如，藉由使用自動DNA合成儀，例 如可自（例如）Bi〇search，Applied Bi〇systems公司購得。在 較佳實施例中，該HPV靶基因係人類E6AP基因。在具體實 施例中，該dsRNA之反義鏈包含選自表！之有義序列之鏈 及選自由表1之反義序列組成之群之第二序列。靶向表1中 所提供靶序列其他地方之替代反義劑可容易地使用靶序列 及側翼E6AP序列確定。 在另一些實施例中，該dsRNA包含至少一條選自表1中 所提供序列群組之核苷酸序列。在其他實施例中，該 dsRNA包含至少兩條選自該群組之序列，其中該至少兩條 序列之-條與該至少兩條序列之另—條互補，且該至少兩 條序列之-條與E6AP基因表現中所產生之抓财序列基本 上互補。通常而言’該dsRNA包含兩個寡核_酸，宜中— 個寡核《闡述為表i中之有義鏈且第二個寡核㈣閣述 為表1中之反義鏈。表i提供每一較佳dsRNA之雙 序列ID號。 熟習此項技術者熟諳，包含介於2〇與23之間個驗基對 (但尤其21個驗基對）之雙鏈結構已認為可特财效地誘導 129698.doc -24- 200902069 RNA 干擾（Elbashir等人，EMB〇 2〇〇1，2〇:6877-6888)。然 而，其他人發現較短或較長之dsRNA同樣係有效的。在上 文所述實施例中，鑒於表丨中所提供寡核苷酸序列之性 質，本發明dsRNA可包含至少一條長度最短為21個核苷酸 之鏈。吾人可合理地預期，與上述dsRNA相比，包含一條 表1之序列之較短dsRNA(在一端或兩端上减去僅少數個核 苷酸）可同樣有效。因此，本發明涵蓋如下之dsRNA :包 含至少15個、16個、17個、1 8個、19個、20個或更多個來 自條表1序列之鄰接核苷酸之部分序列且在下文所述 FACS分析或其他分析中抑制Hpv靶基因表現之能力與包 含全序列之dsRNA相差不多於5%、10%、15〇/。、2〇%、25〇/〇 或30%抑制量。在表！中所提供靶序列内裂解之其 可容易地使用所提供之參考序列及靶序列製備。 另外’表1中所提供之RNAi劑可識別各自ΗΡν靶mRNA 中易於發生基於RNAi之裂解的位點。因此本發明進一步 包括靶向本發明一種RNAi劑所靶向序列内之RNAi劑。據 認為，若本文所用第二RNAi劑裂解與第一 RNAi劑之反義 鏈互補之mRNA内任何地方之信使，則該第二RNAi劑靶向 第一 RNAi劑之序列内。該第二RNAi劑將通常由至少15個 來自表1中所提供之一條序列之鄰接核苷酸組成，該序列 與取自HPV靶基因中之經選擇序列鄰接區域之其他核苷酸 序列偶合。例如，SEQ ID NO: 1之最後15個核苷酸（减去 所添加之AA序列）與來自靶E6AP基因之緊鄰6個核苷酸組 合產生基於表1中所提供之一條序列之含有21個核苷酸之 129698.doc -25- 200902069 單鏈RNAi劑。 本發明dsRNA可含有一或多個相對於⑽列之錯配。在 較佳實施例中，本發明細A含有至多3個錯配。若該 dsRNA之反義*含有相對於革巴序列之錯配，則肖配區域較 佳不位於互補性區域之中心。若該敝财之反義鏈含有相 對於靶序列之錯配，則該錯配較佳侷限於任一端之5個核 苷酸，例如互補性區域之5,或3,端之5個、4個、3個、2個 或1個核苷酸。例如，對於與HPV靶基因區域互補之23個 核苷酸dsRNA鏈，該dsRNA通常在中心13個核苷酸内不含 有任何錯配。本發明所述方法可用以測定含有相對於靶序 列之錯配之dsRNA是否能有效抑制HPV靶基因之表現。考 慮具有錯配之dsRNA在抑制HPV靶基因表現方面之功效甚 為重要，尤其若已知HPV靶基因中之特定互補性區域在病 毒（若為E1或E6)中或在人類群體（對於E6Ap)内具有多形態 序列差異。 在一個實施例中，該dsRNA之至少一端具有丄個至4個 (通常而言1個或2個）核苷酸之單鏈核苷酸懸突。具有至少 一個核苷酸懸突之dsRNA比其具有鈍端之對應物具有出人 意料優越之抑制特性。而且，本發明之發明者發現存在僅 一個核苷酸懸突加强了 dsRNA之干擾活性而不影響其總體 穩定性。已證明具有僅一個懸突之dsRNA在活體内以及各 種細胞、細胞培養基、血液及血清中特別穩定且有效。通 常而言’該單鏈懸突位於反義鏈之3’_末端或（另一選擇為） 位於有義鏈之3’-末端。該dsRNA亦可具有通常位於反義鍵 129698.doc -26· 200902069 之5 -端之鈍端。該等dsRNA具有改良之穩定性及抑制活 I"生，因此容許以低劑量（即小於5 mg/kg接受者體重/天）投 與。通常而言，該dsRNA之反義鏈在3，_端具有核苷酸懸突 且端為鈍端。在另一實施例中，懸突中之一或多個核苷 酸經核甘硫代碟酸S旨（thiophosphate)代替。 在又一實施例中，該dsRNA經化學修飾以增强穩定性。 本發明核酸可藉由業内非常確實之方法合成及/或修飾， 例如彼等闡述於”Current prot〇c〇ls in nucleic chemistry” ’ Beaucage，s.L·等人（編輯），J〇hn 职㈣ & Sons公司，New York，NY，USA中者，其以引用方式併 入本文中。化學修飾可包括但不限於2’位修飾、在寡核苦 酸之糖或鹼基之其他位點之修飾、引入非天然鹼基至募核 苷酸鏈中、與配體或化學部分共價附接及用替代鍵（例如 硫代磷酸酯）代替核苷酸間磷酸酯鍵。可採用多於一種該 修飾。 兩條獨立d s R N A鏈之化學連結可藉由多種熟知技術之任 何一種達成，例如藉由引入共價鍵、離子鍵或氫鍵；疏水 作用、范德華（van der Waals)力或堆積作用；藉助金屬_離 子配位，或藉由使用嘌呤類似物。通常而言，可用以修飾 s亥dsRNA之化學基團包括（但不限於）亞甲基藍；雙官能 團’通节為雙-(2 -氯乙基）胺；N-乙酿基(對乙醒:醯基苯 曱醯基）胱胺；4-硫尿嘧啶；及補骨脂素。在一個實施例 中’該連結體係六聚乙二醇連結體。在該情形下，該 dsRNA係藉由固相合成產生且該六聚乙二醇連結體係按照 129698.doc •27- 200902069 標準方法納入（例如，wniiams，DJ及kb咖，細咖阶 〇996)沒测^侧）。在一特定實施例中反義鏈之5，_ 端及有義鏈之3，·端係經由六聚乙二料結體化學連結。在 另一實施例中，該dsRNA之至少—個核脊酸包含硫代礙酸 酯或二硫代磷酸酯基團，位於端上之化學鍵通常 藉由三螺旋鍵形成。表1提供本發明經修飾RNAi劑之實 例0 在又-實施例中’可對該兩條單鏈之—條或兩條上之核 苷酸進行修飾以防止或抑制細胞酶（例如但不限於某些核 酸酶）之活性退化。用於抑制細胞酶對核酸之活性退化之 技術已為業内所習知，包括（但不限於）2,_胺基修飾、2,_胺 基糖修飾、2i-F糖修飾、2i-F修飾、烷基糖修飾、不帶 電荷之骨架修飾、嗎啉基修飾、2·_〇_甲基修飾及胺基磷酸 酯（參見，例如，Wagner，MW. (1995) 1:1 1 16-8)。因 此’ dsRNA上之核苷酸之至少一個2，_羥基藉由化學基團代 替’通常而言藉由2，-胺基或21-甲基代替。而且，至少一個 核普酸可經修飾以形成鎖定核苷酸。該鎖定核苦酸含有使 核糖之2'-氧與核糖之4'-碳連接之亞曱基橋。含有該鎖定核 普酸之寡核苦酸闡述於Koshkin，A.A.，等人，办㈣ (1998)，54: 3607-3630)及 Obika，S.等人， (1998)，39: 5401-5404)中。向募核苷酸中引入鎖定核苷酸 可改良互補序列之親和力並使解鏈溫度提高數度（Braasch， D.A.及 D.R. Corey，C/zem. 5ζ·ο/· (2001)，8:1-7)。 將配體接合至dsRNA可增强其細胞吸收以及把向特定組 129698.doc •28· 200902069 織或藉由具體類型細胞（例如陰道上皮細胞）攝取。在某些 情形下，將疏水性配體接合至該dsRNA以促進直接透過細 胞膜。或者，與忒dsRNA接合之配體係用於受體介導 吞作用之受質。該等途徑已用以促進反義寡核苷酸以及 dsRNA劑透過細胞。例如，已將膽固醇接合至多種反義募 核苷1上，產生了與其非經接合類似物相比具有明顯較大 活f生之化合物。參見M. Manoharan de則e & 1W 幻叩㈣价2〇〇2, α丨〇3。已接合至寡核苷酸 上之其他親脂性化合物包括^芘丁酸、-雙_〇_(十六烷 基）甘油及薄荷醇。用於受體介導之胞吞作用之配體的一 個實例係葉酸。葉酸藉由葉酸醋受體卩導之胞吞作用進入 ”、田胞I由葉酸酯文體介導之胞吞作用可有效地將帶有葉 西文之dsRNA化合物運輸至細胞中。Li及同事們報導，將葉 酸附接至寡核苷酸之3，__末端可使寡核苷酸之細胞攝取提高 » Li, S, Deshmukh, Η. M, Huang, L. Pharm. Res. 1998, /5, 1540。已接合至寡核苷酸之其他配體包括聚乙二 %、奴水化合物簇、交聯劑、卟啉接合物及遞送肽。 在某些情形下’使陽離子配體接合至寡核苷酸上使得對 核酸酶之抗性得以改良。陽離子配體之代表性實例係丙基 叙及一甲基丙基銨。有趣的是’據報導，當陽離子配體分 散：：個寡核苷酸中時’反義寡核苷酸保留其對域财之 门、口 口親和力。參見M Man〇haran 3 印_价2〇〇2, 72, 1〇3及其中之參考文獻。 本發明經配體接合之dsRNA可藉由使用具有懸垂反應性 I29698.doc -29- 200902069 官能團之dsRNA來合成，例如自連結分子附接至該献na 所獲得者。該反應性寡核普酸可直接與市售配體、經合成 之具有多種保護基團之任何一種之配體、或具有附接至其 之連結部分之配體反應。本發明方法藉由使用（在一些較 佳實施例中）與配體適當接合且可進一步附接至固態載體 物質之核普單體促進經配體接合之dsRNA的合成。該等配 體:核苦接合物(視情况附接至固態载體物質)係按照本發明 方法之一些較佳實施例經由使經選擇血清結合配體與位於 核苦或寡核苦酸5,位上之連結部分反應來製備。在某些情

形:，具有附接至dsRNA之3，-末端之芳烷基配體之dsRNA 係藉由首先將單體結構單元經由長鏈胺基烷基共價附接至 可控孔度玻璃上製備。隨後，經由標準固相合成技術將核 苷酸結合至已與固態载體連結之單體結構單元上。該單體 結構單元可為核苷或可與固相合成相容之其他有機化合 物。 用於本發明接合物中之dsRNA可方便地且通常藉助固相 «成之热知技術製備。用於該合成之設備由數個供應商出 售包括（例如）Applied Biosystems (Foster City，CA)。可 (另外或另一選擇為）採用業内習知之用於該合成之任何其 他手段。吾人亦已知使用類似技術來製備其他寡核苷酸， 例如硫代磷酸酯及經烷基化之衍生物。 關於合成特定經修飾寡核苷酸之教示可參見以下美國專 利：美國專利第5，1；38,〇45號及第5,218，1〇5號，描述經聚胺 接合之寡核苷酸；美國專利第5,212,295號，描述用於製備 129698.doc -30- 200902069 具有對琴性鱗鍵之养核皆酸之早體；美國專利第5 378,825 戒及弟5，5 41，3 0 7號’描述具有經修傅骨架之寡核普酸；美 國專利第5,386,023號’描述經骨架修飾之寡核苷酸及其藉 由還原偶合之製備·’美國專利第5,457，191號，描述基於3_ 氮雜嘌呤環系統之經修飾之核鹼基及其合成方法；美國專 利第5,459,255號，描述基於N-2經取代嘌呤之經修飾之核 驗基；美國專利第5,521，3 02號’描述製備具有對掌性磷鍵 之寡核芽酸之方法；美國專利第5,539,〇82號，描述肽核 酸；美國專利第5,554,746號，描述具有β—内醯胺骨架之寡 核芽酸；美國專利第5,57 1,902號，描述用於合成寡核苷酸 之方法及物質；美國專利第5,578,71 8號，描述具有烷硫基 之核苷，其中該等基團可用作與附接於該核苷多個位置之 任何一個位置上之其他部分之連結體；美國專利第 5,587,361號及第5,599,797號’描述具有高對掌性純度硫代 填酸醋鍵之寡核苷酸；美國專利第5,506,351號，描述用於 製備2'-〇-烷基鳥苷及相關化合物（包括2,6_二胺基嘌呤化合 物）之方法；美國專利第5,587,469號，描述具有n-2經取代 嘻呤之寡核苷酸；美國專利第5,587,470號，描述具有3_氮 雜嗓吟之寡核苷酸；美國專利第5,223,168號及美國專利第 5’608,046號’二者均描述經接合之4’_去曱基核苷類似物； 美國專利第5,6〇2,24〇號及第5,61〇,289號，描述經骨架修倚 之寡核苷酸類似物；美國專利第6,262,241號及第5,459,255 號，描述（尤其）合成2，_氟_寡核苷酸之方法。 在本發明配體接合之dsRNA及具有配體分子之序列特異 129698.doc -31 - 200902069 性連結之核苷中’該等寡核苷酸及寡核苷可在適宜DNA合 成儀上使用標準核苷酸或核苷前體、或已具有連結部分之 核苷酸或核苷接合物前體、已具有配體分子之配體-核苷 酸或核普-接合物前體、或具有非核苦配體之結構單元組 裝。 當使用已具有連結部分之核苷酸-接合物前體時，一般 完成序列特異性連結之核苷的合成，隨後使配體分子與該 連結部分反應以形成配體接合之寡核苷酸。先前已闡述具 有多種分子諸如類固醇、維生素、脂質及報告分子之募核 普酸接合物（參見Manoharan等人PCT申請案WO 93/078 83)。在一個較佳實施例中，本發明之寡核苷酸或連結之 核皆係藉由自動合成儀使用源自配體-核苷接合物之亞磷 酿胺（phosphoramidites)以及市售且通常用於寡核苷酸合成 之標準亞磷醯胺及非標準亞磷醯胺合成。 在春核苷酸之核苷_納入2，_〇_曱基、2，_〇_乙基、2，_〇_ 丙基、21-0-烯丙基、2ι_〇_胺基烷基或2，_去氧_2,_氟基團賦 予4券核苷酸増强之雜交特性。而且，含有硫代磷酸酯骨 架之寡核苷酸具有增强之核酸酶穩定性。因此，本發明之 吕月b化、連結之核苷可擴增至包括硫代磷酸酯骨架或2匕〇· 甲基、2’-〇_乙基、2·-〇-丙基、2，-0-胺基烷基、2'-0-烯丙 基或2去氧-2 -氟基團之一或二者。一些業内已知之募核 普^修飾之概要清單可見於例如PCT公開案W0 200370918 。 在些實施例中’本發明之在5，_末端具有胺基之經官能 129698.doc -32- 200902069 化之核苷序列係使用DNA合成儀製備，並隨後使其與經選 擇配體之活性酯衍生物反應。活性酯衍生物已為彼等熟習 此員技術者所熟知。代表性活性酯包括N-氫琥珀醯亞胺 醋、四氣盼酯、五氟酚酯及五氯酚酯，胺基與該活性酯之 反應產生其中經選擇配體係藉助連結基團附接至5，-位之寡 核苷酸。5，-末端處之胺基可使用5，_胺基_修飾劑以試劑來 製備。在一個實施例中’可藉由使用配體-核苷亞磷醯胺 將配體分子接合至寡核苷酸之5，_位，其中該配體係經由連 結體直接或間接與5，-羥基連結。該等配體-核苷亞磷醯胺 一 在自動合成程序結束時使用以提供在5末端具有該配 體之經配體接合之募核苷酸。 經修飾之核苷間鍵或骨架之實例包括（例如）具有正常3，_ 5’鍵之硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 麟酸二酯、胺基烷基填酸三酯、甲基及其他烧基膦酸酯 (包括3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯）、次膦酸酯、胺基 麟酸酯（包括3'-胺基胺基填酸酯及胺基烧基胺基磷酸酯）、 硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基鱗酸 三酯、及硼烷磷酸酯、該等之2’-5'連結類似物及彼等具有 反極性者，其中相鄰核苷單元對為3'-5'對5'-3,或2'-5,對5'-2'連接。亦包括各種鹽、混合鹽及自由酸形式。 與製備上述含磷原子鍵相關之代表性美國專利包括（但 不限於）美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第 4,476,301 號、第 5,023,243 號、第 5,177，196 號、第 5,1 88,897 號、第 5,264,423 號、第 5,276,019 號、第 129698.doc •33- 200902069 5’278’302 號、帛 5,286,717 號、第 5 32i，i3i 號第 5’399’676 號、第 5,4〇5 939 ?虎、第 5 453,496 號第 5’455,233 號、第 5,466,677 冑、第 5,476,925 號、第 5’519’126 號、帛 5,536,821 號、第 5,541，3〇6 號、第 5,550’111 號、第 5,563,253 冑、帛 5,571，799 號、第 5,587,361 號、第 5,625,〇5〇號、及第 5,697,248 號，每一比 以引用方式併入本文中。 白 其中不包括磷原子之經修飾核苷間鍵或骨架（即，寡核 苷）之實例具有藉由短鏈烷基或環烷基糖間鍵、混合雜原 子及烷基或環烷基糖間鍵、或—或多個短鏈雜原子或雜環 糖間鍵所形成之骨架。該等包括彼等具有嗎淋基鍵者（部 为自核苷之糖部分形成）；矽氧烷骨架；硫化物、亞碾及 砜骨架，曱醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基骨架；亞甲基曱醯 乙醯基及硫代甲醯乙醯基骨架；含有烯烴之骨架；胺基磺 酸鹽骨架；亞甲基亞胺基及亞曱基肼基骨架；磺酸酯及磺 酿胺骨架；醯胺骨架；及其他具有混合N、〇、s及(：112組 成部分者。 與製備上述寡核苷相關之代表性美國專利包括（但不限 於）美國專利第5,034,506號、第5，166,315號、第5，185,444 號、第 5,214，134號、第 5,216，141號、第 5,235,033 號、第 5,264,562 號、第 5,264,564 號、第 5,405,938 號、第 5’434,257 號、第 5,466,677 號、第 5,470,967 號、第 5,489,677 號、第 5,541，307 號、第 5,561,225 號、第 5,596,086 號、第 5,602,240 號、第 5,610,289 號、第 129698.doc •34- 200902069 5,6ϋ2,24ϋ 就、第 5,608,046 號、第 5,610,289 號、第 5,618,704 號、第 5,623,〇7〇 號、第 5,663,312 號、第 5,633,360 號、第 5,677,437號及第 5,677,439號，每一皆以 引用方式併入本文中。 在某些情形下’該寡核苷酸可藉由非配體基團修飾。已 將許多非配體分子接合至募核苷酸以增强寡核苷酸之活 性、細胞分布或細胞攝取，並在科學文獻中可獲得實施該 等接合之程序。該等非配體部分包括諸如膽固醇 (Letsinger 等人，proc Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86.6553)、膽酸（Manoharan 等人，Bioorg. Med. Chem. Lett·，1994, 4:1053)等脂質部分、諸如己基_S_三苯曱基硫 醇（Manoharan 等人，Αηη. Ν.γ. Acad. Sci,， 1992, 660:306 ; Manoharan等人，Bioorg. Med. Chem. Let.，1993, 3:2765)等硫醚、硫代膽固醇（〇berhauser等人，Nucl Acids Res.，1992, 20:533)、諸如十二烧二醇或十一烧基殘基 (Saison-Behmoaras 等人，EMBO J·， 1991， 10:111 ;

Kabanov 等人 ’ FEBS Lett.，1990，259:327 ; Svinarchuk 等 人’ Biochimie，1993，75:49)等脂肪族鏈、諸如二-十六烷 基-外消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-〇-十六烷基-外消旋-甘 油-3-H-膦酸酯（Manoharan等人，Tetrahedron Lett., 1995, 36:365 1 ; Shea等人，Nucl. Acids Res.，1990，18:3777)等麟 月曰、l胺或聚乙一酵鍵（Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14:969)、或金鋼烷乙酸（Man〇haran 等 人 ’ Tetrahedron Lett.，1995，36:365 1)、棕櫚基部分 129698.doc -35· 200902069 (Mishra等人，Biochem. Biophys. Acta, 1995，1264:229)、 或十八烷基胺或己基胺基-羰基-氧基膽固醇部分（Cr〇〇ke等 人，J. Pharmacol. Exp. Ther.，1996, 277:923)。教示製備該 等券核苷酸接合物之代表性美國專利已在上文列示。典型 接合方案涉及合成在一或多個序列位置上具有胺基連結體 之寡核苷酸。隨後使用合適的偶合或活化試劑使該胺基與 所接合之分子反應。該接合反應可在寡核苷酸仍與固態載 體連結下實施或在寡核苷酸於溶液相中裂解之後實施。藉 由HPLC純化募核苷酸接合物一般可提供純淨接合物。使 用膽固醇接合物尤其佳，因為此一部分可增加對陰道上皮 細胞（HPV感染部位）之靶向。 本揭示内容闡述大量可用於沈默HP v靶基因並由此治療 HPV相關病症之dsRNA實施例。雖然設計具體治療劑可采 取多種形式，但某些功能特徵將把較佳dsRNA與其他 dsRNA區別開。具體而言，將測試諸如良好血清穩定性、 高效力、缺少經誘導免疫反應及良好藥物樣性能等性質 (所有皆可藉由彼等熟習此項技術者量測）以鑑別本發明之 較佳dsRNA。在-些情形下’並非所有該等功能態樣皆存 在於較佳dsRNA中。但是彼等熟習此項技術者能夠最佳化 π亥等變里及其他以選擇本發明之較佳化合物。 雖然可採用許多種核普酸修飾，但本發明者已鑑別出可 提ί、顯著改良之藥理學、免疫學及最終治療益處之化學修

飾模式。表3展示較佳用於本發明表丨中所展示雙鏈dsRNA 之化學修飾模式。 129698.doc -36- 200902069 表3

化學修飾系列 對有義鏈(5*-3’） 所作改變 對反義鍵(5’-3)所作 改變 1 (在兩條鏈太媸之箪個硫代磷酸醋） dTsdT dTsdT 2 (在兩條鏈末端之單個硫代鱗酸酯以及、所有 哺π定之2'OMe有義鏈修飾及後接A之所有U1及後 接A之所有C1之2’0me修飾） dTsdT，2,OMe@ 所有13密α定 dTsdT, 2'0Me@uA, cA 3 (在兩條鏈末端之單個硫代磷酸酯以及、所有 喊咳之2’OMe有義鏈修飾及反義鏈上的下述鹼基 之2’Ome :後接A之所有U，、後接A之所有C1、後 接G之所有U'及後接U之所有U，、 dTsdT, 2'〇Me@ 所有嘧啶 dTsdT,2OMe@nA, cA，uG，uU 4 (與1相同，只是添加與有義鏈接合之膾闳醢、 膽固醇(”外 dTsdTi，，夕卜·，、 5 (與2相同，只是添加與有義鏈接合之膽固醇） 53相同，只是添加 膽固醇("内"） dTsdT, 2OMe@uA, cA 膽固醇(”内"） dTsdT，2OMe@uA， cA，uG，uU 經載體編碼之RNAi劑

本發明dsRNA亦可在、壬牌& 在活體内以細胞内方式自重組病毒載 體表現°本發明之重組病毒載體包含編碼本發明dsRNA之 序列及任何適宜表現該等如職序列之啓動子。適宜啓動 子包括（例如）U6或Hi βΜΛ RNA Ρ〇ι in啓動子序列及巨細胞病 毋啓動子。選擇其他滴令站去 適且啓動子已為熟習此項技術者所熟 知。本發明之重組病毒 戰體亦可包含可誘導啓動子或可調 控啓動子以在特定紐继+ ^ 、、、、、气或特定細胞内環境中表現dsRNA 〇 使用重組病毒載體來將太欲。α , 术將本發明dSRNA遞送至活體内之細胞 中將在下文予以更詳細論述。 129698.doc -37. 200902069 本發明dsRNA可自重組病毒载體以兩個獨立、互補rna 分子或以具有兩個互補區之單個RNA分子表現。 可使用任何能夠接受擬表現dsRNA分子之編碼序列之病 毒載體，例如源自腺病毒（AV);腺相關病毒（AAV);逆轉 錄病毒（例如，慢病毒（LV)、彈狀病毒、鼠白血病病毒）； 疱疹病毒及諸如此類之載體。病毒載體之向性可視需要藉 由對載體用包被蛋白或來自其他病毒之其他表面抗原實施 假型包裝或藉由取代不同之病毒衣殼蛋白來改變。 例如，本發明之慢病毒載體可用來自水泡性口炎病毒 (vsv)、狂犬病病毒' 依波拉（Eb〇⑷病毒、莫科拉 (Mokola)病毒及諸如此類之表面蛋白實施假型包裝。可藉 由將該等載體設計成表現不同衣殼蛋白血清型來使本發明 AAV载體靶向不同細胞。例如，表現血清型2基因組上血 清型2衣殼蛋白之AAV載體稱為AAV 2/2。AAV 2/2載體中 之該血清型2衣殼蛋白基因可藉由血清型5衣殼蛋白基因代 替以產生AAV 2/5載體。構建表現不同衣殼蛋白血清型之 AAV載體之技術已為熟習此項技術者所熟知；參見，例 如 ’ Rabinowitz J E等人（2002)，J Virol 76:791-801 ,其全 部揭示内容以引用方式併入本文中。 選擇適用於本發明之重組病毒載體、將用於表現該 dsRNA之核酸序列插入載體中之方法及將該病毒載體遞送 至所涉及細胞中之方法已為熟習此項技術者所熟知。參 見’例如，Dornburg R (1995)，Gene Therap. 2: 301-310 ;

Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614 ； Miller A D 129698.doc -38- 200902069 (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14 ； Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30 ;及 Rubinson D A等人，Nat. Genet. 33: 40 1 -406，其全部揭示内容皆以引用方式併入本文中。 較佳之病毒載體係彼等源自AV及AAV者。在尤佳實施 例中，本發明dsRNA係作為兩個獨立、互補之單鏈RNA分 子自包含（例如）U6或HI RNA啓動子或巨細胞病毒（CMV)啓 動子之重組AAV載體表現。 適宜表現本發明dsRNA之AV載體、構建重組AV載體之 方法及將該載體遞送至靶細胞中之方法闡述於Xia Η等人 (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010 中。 適宜表現本發明dsRNA之AAV載體、構建重組AV載體 之方法及將該等載體遞送至挺細胞中之方法闡述於

Samulski R等人（1987)，J. Virol. 61: 3096-3101 ; Fisher K J 等人（1996), J· Virol，70: 520-532 ; Samulski R等人（1989), J· Virol. 63: 3822-3826 ;美國專利第 5,252,479號；美國專 利第5,139,941號；國際專利申請案第w〇 94/13788號；及 國際專利申請案第WO 93/24641號中，其全部揭示内容皆 以引用方式併入本文中。 III.包含dsRNA之醫藥組合物 在一個實施例中，本發明提供包含如本文所述之dsRNA 及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。包含該dsRNA之醫 藥組合物可用於治療與HPV靶基因之表現或活性有關之疾 病或病症’例如藉由HPV感染所介導之病理過程。基於遞 送方式調配該等醫藥組合物。一個實例係經調配用於子宮 129698.doc -39- 200902069 ;員中之局部投與或經由非經腸遞送之全身投與之組合物。 旦本發明之醫藥組合物係以足以抑制Hpv革巴基因表現之劑 置投與。本發明之發明者已禮定，因為包含本發明dsRNA 之組合物之改良功效，其可以極低劑量投與。5叫 ΝΑ/ A斤接χ者體重/天之劑量足以抑制或壓制η”靶 基因之表現’且在疣或子宮頸或肛門治療之情形下，可將 八直接施用至受感染之組織。 通常而言，dsRNA之適宜劑量將在〇〇1至5〇毫克/公斤 接受者體重/天範圍内，通常而言在1微克至1毫克/公斤體 重/天範圍内。該醫藥組合物可每天投與—次，或該敝财 可以兩:欠、三次或更多次分劑量以適當間隔全天投與或甚 至利用連續輸注或藉助陰道凝膠劑控制釋放調配物遞送投 與。在彼情形下，每一分劑量中所含有之該dsRNA必須相 應車又小以達成總日劑量。該劑量單位亦可經配製以在數天 =遞送，例如使用可在數天時間段内持續釋放該dsRNA之 習用持續釋放調配物。持續釋放調配物已為熟習此項技術 者所熟知且尤其可用於藥劑之陰道遞送，例如可用於本發 明藥劑。在該實施例中，該劑量單位含有相應多倍曰劑 量0 熟習此項技術者應瞭解，某些因素可能會影響有效治療 個體所需要之劑量及時間選擇’包括但不限於疾病或病症 之厭重程度、先前治療、該個體之總體健康狀况及/或年 齡及存在之其它疾病。而且，用治療有效量之組合物治療 個體可包括單一治療或一系列治療。本發明所涵蓋之各種 129698.doc -40- 200902069 如·之有效劑量及活體内半衰期之估計可如本文其他地 方所述利用習用方法或基於使用合適動物模型之活體内測 試來進行。 本發明者認識到’出於多種原因（包括HPV基因型之可 變性)、’可能期望同時用-種以上之本發明細A來治療 HPV感染。在實施例中，献na組合經選擇以用最少 心RNA複合混合物無向最寬範圍之Hpv基因$。吾人預 计，包含-種Μ上dsRNA類型之本發明醫藥組合物含有本 文所述各種dsRNA劑量。 dsRNA組合可以單劑型醫藥組合物共同提供。或者， 滅财組合可以單獨劑型提供’在該情形下其可同時或在 不同時間並可藉由不同手段投與。因Λ，本發明涵蓋包含 本發明dsRNA期望組合之醫藥組合物；且其亦涵蓋欲作為 組合方案之-部分提供之單— dsRNA醫藥組合物。由此，在 該後-情形下，該組合療法發明係一種投與方法而非組合 物物質。 σ 小氣遺傳學之進展已產生許多可用於研究各種人類疾病 (例如藉由HPV感染所介導之病理過程）之小鼠模型。該等 模型可用於dsRNA之活體内測試以及用於確定治療有效劑 量。 任何方法皆可用以將本發明dsRNA投與至含有感染HPV 之細胞之哺乳動物中。例如，投與可為局部投與（例如， 陰道、經皮等）；經口投與；或非經腸投與（例如，藉由皮 下、心室内、肌内或腹腔内注射或藉由靜脈點滴）。投與 129698.doc -41 - 200902069 可為迅速的（例如，藉由注射），或可在—段時間内發生（例 如，藉由緩慢輪注或缓釋調配物投與）。 — 舣而σ，當治療具有感染Hpv之細胞之哺乳動物時， 該等dsRNA分子—般係以陰道凝膠劑或乳f投與。例如， 故脂質體或未經脂質體調配之dsRNA可直接局部施用於子 呂頸、肛門道或諸如生殖器疣等Hpv病變。對於局部投 、 RNa刀子調配成諸如滅菌及非滅菌水溶液、存 於常見溶劑（例如醇）中之非水溶液或存於液體或固體油基 、中之/谷液等組合物。該等溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑 及其他適宜添加劑。用於局部投與之組合物可經調配呈經 皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧 劑、液體及粉劑形式。凝膠劑及乳膏可使用業内習知之聚 合物及透化劑調配。可使用子宮頸帽、陰道隔膜、經塗覆 文全套、手套及諸如此類將含有該dsRNA及有關賦形劑之 凝膠劑或乳膏施用至子宮頸。可添加習用醫藥載劑、水 性、粉末或油性基質、增稠劑及諸如此類。 對於非經腸、鞘内或心室内投與，可將dsRNA分子調配 成諸如滅菌水溶液等組合物，該等滅菌水溶液亦可含有緩 衝诏稀釋劑及其他適宜添加劑（例々"渗透促進劑、載 劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑）。 另外，可利用非病毒性方法將dsRNA分子投與至含有感 染HPV之細胞之哺乳動物中，例如闡述於(例如)美國專利 第6,271，359號中之生物或非生物手段。非生物遞送可藉由 夕種方法達成，該等方法包括（但不限於）⑴帛本文所提 129698.doc -42- 200902069 供之dsRNA酸性分子荷載脂質體及（2)使dsRNA分子與脂 質或脂質體複合以形成核酸-脂質或核酸-脂質體複合物。 該脂質體可由通常用以活體外轉染細胞之陽離子及中性脂 質構成。陽離子脂質可與帶負電荷之核酸複合（例如，電 荷聯合）以形成脂質體。陽離子脂質體之實例包括（但不限 於）lipofectin、lipofectamine、lipofectace、DOTAP (1 2-- 油醯基-3-三曱基銨丙烷）、DOTMA (N-[l，2(2,3-二油基氧 基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨）、DOSPA (2,3-二油醯基氧 基-N-[2-(精胺醯胺基）乙基卜N，N_二曱基小丙録）、 DOGS( 一（十八烧基）醯胺基甘胺醯基精胺）及DC-膽固醇 (3，[N_Nl，N-二甲基伸乙基二胺）-胺甲醯基]膽固醇 用於形成脂質體之程序已為熟習此項技術者所熟知。脂 質體組合物可自（例如）磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醢磷脂醯膽 驗、二棕橺醯填脂醯膽鹼、二肉豆蔻酸礙脂醯甘油或二油 醯基磷脂醯乙醇胺形成。可市面購得許多親脂劑，包括 Lipofectin.RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.)及 Effectene.TM. (Qiagen，Valencia，Calif)。另外， 可使用諸如DDAB或DOTAP等市售陽離子脂質使全身遞送 方法最佳化，每一種陽離子脂質均可與諸如D0Pe或膽固 醇等中性脂質混合。在一些情形下，可使用諸如彼等藉由

Templeton 等人（Nature Biotechnology，15: 647-652 (1997)) 所闡述者等之脂質體。在其他實施例中，可使用諸如聚伸 乙基亞胺專聚陽離子來達成活體内及離體遞送⑺“以仏等 人，J. Am Soc_ Nephrol. 7: 1728 (1996))。關於使用脂質體 129698.doc -43· 200902069 來遞送核酸之額外資訊可參見美國專利第6,27 1，359號、 PCT 公開案 WO 96/40964 及 Morrissey, D.等人 2005. Nat

Biotechnol. 23(8): 1002-7 中。 將dsRNA分子投與至含有感染HPV之細胞之哺乳動物中 之其他非病毒性方法包括諸如脂複合體及奈米乳液等基於 陽離子脂質之遞送系統（除脂質體外）。另外，可使用濃縮 聚合遞送系統（即，DNA-聚合物複合物或"聚合複合體"）， 包括但不限於殼聚糖、聚（L-離胺酸）（PLL)、聚乙烯亞胺 (PEI)、樹枝狀聚合物（例如，聚醯胺_胺（ρΑΝΑΜ)樹枝狀聚 合物）及保麗視明（p〇l〇xamine)。另外，可使用非濃縮聚合 遞送系統’包括但不限於泊洛沙姆（p〇l〇xamer)、明膠、 PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物）、pvp(聚乙烯吡咯啶酮）及 PVA(聚乙烯醇）。 用於上述遞送或投與技術之程序已為熟習此項技術者所

’、、、、例如，/農縮聚合遞送系統藉由容易地與陰離子DNA

分子複合起作用；例如，聚（L_離胺酸）（pLL)藉由形成可與

帶負電荷之細胞表面相互❹之帶正電荷之複合物並隨後 經歷快速内陷起作用Q 生物遞送可藉由多種方法遠士 忐達成，包括（但不限於）使用病 毒載體。例如，病毒載體「仏丨上 載體(例如，腺病毒及疱疹病毒載體) 可用以將dsRNA分子遞送至皮廢 ， 皮膚、，，田胞及子宮頸細胞。可使 用標準分子生物學技術將本 入止义2 又所耠供之一或多種dsRNA引 入至許夕先珂提出以將核酸 疋主細胞中之不同病喜巷鞞 之一中。可使用該等所得病^㈣ 届毋載體 毋载體將該一或多種dsRNA藉 129698.doc -44- 200902069 由（例如）感染遞送至細胞中。 本發明dsRNA可調配於醫蘂μ 月° &晉桌上可接受之載劑或稀釋劑 中。”醫藥上可接受之載杳丨ιγ太 (本文中亦稱為"賦形劑"）係醫 藥上可接受之溶劑、懸浮劑、或任何其他藥理學惰性媒 劑。醫藥上可接受之載劑可為液體或固體，並可繁於計劃 之投與方式選擇以提供期穿 k供期望體積、稠度及其他有關傳輸及 化予特性典型之醫藥上可接受之載劑包括(以舉例方式 而非限定方式）：水；鹽水溶液；結合劑(例如，聚乙^比 洛咬網或經丙基甲基纖維素）；填料（例如，乳糖及其他 糖、明膠或硫酸碎)；濁滑劑(例如，殿粉、聚乙二醇或乙 酸鈉）’朋解劑(例如’澱粉或澱粉羥乙酸鈉及潤濕劑 (例如，月桂基硫酸鈉）。 月 另外可將乾向HPV乾基因之dsRNA調配成含有與其他 刀子77子、構或核酸混合物混合、囊封、接合或以其他 方式聯合之献财之組合物。例如，含有一或多種靶向 =6ΑΡ基因之献财劑之組合物可含有其他治療齊】，例如抗 炎性藥物(例如，非類固醇類抗炎性藥物及皮質類固醇认 抗病毒藥物（例如’利巴韋林a—)、阿糖腺苦 (darablne)、阿昔洛維（acyclovir)及更昔洛韋 — Ο)。在-些實施例中，組合物可含有-或多種 八有〃、HPV%基因互補之序列之與去角質劑。去角 貝M係》離或鬆他表皮之角質層之藥劑。纟角質劑之實例 。括(仁不限於)水楊酸。其他實例提供於美國專利第 ’ 3,417號中。去角質劑可以可有效增强dsRNA透入（例 129698.doc -45- 200902069 如)諸如皮膚等組織中的量使用。例如，I角質劑可以能 夠使施用至生殖益夜之dsRNA透過該疣的量使用。 Μ化合物之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動 物中错由標準醫藥程序來測定，例如，用於測定LD50(導 致群體50%死亡之劑量）及ED5〇(在5〇%群體中具有治療效 ，之劑量）之程序。毒性與治療效果間之劑量比即為治療 指數且其可表示為比率咖娜50。可展示高治療指 化合物較佳。 自細胞培養分析及動物研究所獲得之數據可用於調配適 用於人類之劑量範圍。本發明組合物之劑量通常位於具有 較低毒性或無毒性之循環濃度（包括ed5〇)範圍内。該劑量 可端視所用劑型及所用投與途徑在此範圍内變化。對於本 ^方法中所用之任何―種化合物而言，皆可根據細胞培 旦分析來初步估測治療有效劑量。可在動物模型中調配劑 里以達成該化合物或（合適時）革巴序列之多狀產物（例如，達 成多肽之降低濃度)之包括IC5〇(即，可對症狀達成半數最 大=制之測試化合物濃度’如在細胞培養物中所測定）之 :¼血漿濃度範圍。該資訊可用以更準確地確定可用於人 類之劑量。血襞含量可藉由（例如）高效液相層析來量測。 除上文所論述之其單獨投與或作為多元組合投與外，本 理:献财可與其他可有效治療藉由Η”感染所介導之病 理過％之習知藥劑組合投與。盖 使用業内已知或本文所述功效:標二:執行醫師可基於 調節dSRNA投與之量及時間選擇。h貝所觀察到之結果 129698.doc -46- 200902069 dsRNA組纟可在活體外及#體内制肖鑑別較佳單— dsRNA所採用方法相同之方法來測試。可基於純生物資訊 學原理來選擇該等組合’其中選擇可覆蓋最寬範圍基因型 之最小數量之siRNA。或者，該等組合可基於根據本文對 於單一 dsRNA劑所述之彼等方法之活體外或活體内評價來 選擇。用於測試dsRNA組合之較佳分析係用於評價ΗΡν J 6 陽性癌症細胞系中s i R N A介導之η p v靶基因敲低之表型結 果（例如SiHa或Caski ’如闡述於（例如）Hengstermann等人 (2005) Journal Vir· 79(M): 9296 ;及Butz 等人（2〇〇3) Oncogene 22: 5938)中或器官型培養系統（如闡述於（例 如）Jeon等人（1995) Journal Vir. 69(5):2989)。 本發明者已鑑別出可用以治療HPV感染之dsRNA之某些 較佳組合。最一般而言，該dsRNA組合包含一種以上之選 自表1之dsRNA。因此本發明涵蓋在組合療法中使用2種、 3種、4種、5種或更多種選自表iidsRNA雙鏈。原則上， 為簡化治療產品起見，較佳為最小數量之dsRNA。此促使 選擇覆蓋最大數量有害或潛在有害HPV基因型之dsRNA， 且實際上可能需要選擇不一定覆蓋所有該等Hpv基因型之 組合。 治療由HPV感染所引起之疾病之方法 本文所述方法及組合物可用於治療由人類乳頭狀瘤病毒 所引起之疾病及病狀，其可為臨床或亞臨床乳頭狀瘤病毒 感染之結果。該等疾病及病狀（本文中有時稱為”HPV相關 病症"或π藉由HP V感染所介導之病理過程”）包括（例如）上 129698.doc •47- 200902069 皮惡性腫瘤、皮膚癌(非黑色素瘤或黑色素瘤）、諸如子宮 頸癌、HPV相Μ前病變（包括LSIwhsil子宮頸組織）等 肛門生殖惡性腫瘤、肛門癌、惡性病變、良性病變、乳頭 狀瘤癌、乳頭狀囊腺瘤、乳頭狀瘤神經病變 (neuropathi剛）、乳頭狀瘤病、皮膚及黏膜乳頭狀瘤、濕 疣、成纖維細胞瘤及其他與乳頭狀瘤病毒有關之病理病 狀。 ' 例如，本文所述組合物可用於治療由Hpv所引起之疣。 該等疣包括（例如）常見疣（尋常疣），例如，手掌疣、跖疣 及曱周疣；扁平疣及絲狀疣；肛門乳頭狀瘤、口腔乳頭狀 瘤、咽乳頭狀瘤、喉乳頭狀瘤及舌乳頭狀瘤；及性病濕疣 (尖銳濕疣）’亦稱為生殖器疣（例如，陰莖、外陰、陰道及 子宮頸疣），其係HPV感染之最嚴重表現之一。HPV DNA 可見於所有級別之子宮頸上皮内贅瘤（CIN j — 中，且 HP V類型之特定亞類可見於子宮頸原位癌瘤中。因此，認 為患有生殖器疣（含有特定HPV類型）之女性具有發生子宮 頭癌之面風險。 伴隨乳頭狀瘤病毒感染之最常見疾病係良性皮膚疣或常 見:庑。常見疣通常含有HPV類型1、2、3、4或10。由乳頭 狀瘤病毒所引起之其他病狀包括（例如）喉乳頭狀瘤，其係 良性喉上皮腫瘤。兩種乳頭狀瘤病毒類型（HpV_6及Ηρ 1 1)最常引起喉乳頭狀瘤。本文所述該等組合物可用於治 療該等疾病及病狀。 本文所述該等組合物亦可用於治療疣狀表皮發育不良 129698.doc -48- 200902069 (Ev)，其係稀有之特徵在於出現小微紅斑疹狀散布扁平疣 之以遺傳方式傳播之疾病。 另外，本文所述該等組合物可用於治療由細胞轉化 (HPV係病原劑）導致之病變，例如用於治療子宮頸癌。 本文所述該等組合物亦可用於治療Ηρν誘導之發育異常 (例如’陰莖、外陰、子宮頸、陰道、口腔、肛門及咽發 育異常）及用於治療HPV誘導之癌症（例如，陰莖、外陰、 子宮頸、陰道、肛門、口腔、咽及頭頸癌）。 本發明亦可藉由包括特定献财與另一抗癌化學治療劑 (例如任何習用化學治療劑)之組合來實踐"寺定結合劑與 該等其他藥劑之組合可使該化學治療方案更有效力。許多 化學治療方案因為能夠納入本發明方法中而本身在熟練從 業人員之考慮中。可使用任何化學治療劑，包括院基化 劑、抗代謝物、激素及拮抗劑、放射性同位素以及天秋產 物。例如，本發明化合物可與諸如多柔比星（d_rubicin) 及其他葱環抗生素類似物等抗生素、諸如環磷酸胺 (cycloph — de)等氮[諸如5_氧尿喷π定等喷。定類似 物、順銘、經基脲、紫杉醇及其天然及合成衍生物及諸如 此類—起投與。作為另一實例’在諸如乳腺癌等混合腫瘤 L中該等腫瘤包括促性腺素依賴性及促性腺素非依賴性 細胞）情形下，該化合物可與亮丙瑞林（Ieupr〇Hde)或戈舍 =林（g〇serenn)(LH_RH之合成肽類似物）結合投與他抗 •瘤方案包括使用四環素化合物與另一治療方式(例如， 外科手術、放射等)，本文中亦稱為”輔助抗賢 129698.doc -49- 200902069 此本發明方法可與該等習用方案一起使用以提供减少副 作用及增强功效之益處。 在又替代方案中，把向E6AP之該dsRNA可用以治療神 經學及行為病症。藉由鑑別天使症候群（Angelman syndrome)患者中之E6AP突變體發現E6AP與神經學及行為 病症有關。天使症候群（AS)係一種特定的神經行為病症， 其特徵在於精神發育遲緩、缺乏語言能力、過度大笑、癲 癇發作、共濟失調及特徵性EEG型式。（Hitchins，M p.等 人 2004. Am J Med Genet A. 125(2): 167-72.)。推測起來， 治療之意圖並非誘導該等病狀；相反，如在許多遺傳型缺 陷中所觀察，該E6AP在神經學及行為病狀中具有至關重 要作用之迹象亦表明該革巴可能在人類病理學中具有多種作 用且可能為其中E6AP沈默將抵償其他生物化學缺陷或疾 病之s亥類型中其他疾病之適宜靶。本文所用ΙΈ6Αρ相關病 症包括上文所述HP V相關病症及其他神經學及行為病 症。 抑制E6AP基因表現之方法 在又一態樣中，本發明提供抑制哺乳動物中E6Ap基因 表現之方法。該方法包含向哺乳動物投與本發明表丨之組 合物以沈默輕E6AP基因之表現。由於本發明之該等dsRNA 具有尚度特異性，因此其特異性地靶向靶E6Ap基因之 RNA(原始或經處理的）。使用該等dsRNA來抑制該等E6Ap 基因表現之組合物及方法可如本文其他地方所述實施。 在一個實施例中，該方法包含投與包含dsRNA之組合 129698.doc -50- 200902069 :一其中該献NA包含與擬治療哺乳動物之E6Ap基因之至 ==分RNA轉錄物互補之料酸序列。當擬治療之生物 二诸：人類等哺乳動物時，該組合物可藉由熟習此項技 打所習知之任何方式投與，包括但不限於經口或非經腸 途包括靜脈内、肌内、皮下、經皮、氣道(氣溶膠)、 經…經直腸、經陰道及局部(包括經口腔及經舌下)投 與。在較佳實施例中，，亥等組合物係藉由局部/陰道投與 或藉由靜脈輸注或注射投與。 除非另有說明，否則本文所用所有技術及科學術語皆具 有與普通熟習本發明所屬技術者通常所瞭解含義相同之含 義。儘管在本發明之實踐或測試巾可使用與彼等本文所聞 述者類似或等效之方法及材料，但下文仍對適宜之方法及 材料加以闡述。本文所述及之所有出版物、專利申請案、 專利、及其它參考文獻之全部内容皆以引用方式併入本文 中。倘若出現矛盾，則以本說明書（包括定義）為准。此 外，該等材料、方法及實例僅出於說明之目的而非意欲限 制本發明。 實例 E6AP基因之基因步移 貫細< siRNA設計以鑑別乾向人類泛素蛋白連接酶 (ube3A，亦稱為E6AP)之siRNA。使用代表不同同型異構 體之 E6AP之人類 mRNA 序列（NM—130838.1、NM 130839 1、 NM_000462.2)。 所有人類E6AP同型異構體皆使用BioEdit軟體之 129698.doc -51 - 200902069

Clustal W多重比對功能（Thomp son J.D.等人，Nucleic Acids Res· 1994，22:4673)以確定 mRNA 序列 NM—130838.1 為最短 序列以及證實自參考序列之位置5至449 1 (端位）序列守恒， 此為有效靶向所有E6AP同型異構體之要求。 鑑別所有跨越E6AP參考序列NM—130838.1之可能之重叠 19mer(代表siRNA有義鏈序列），產生4473個19mer候選序 歹將其組合’该4候選把序列覆蓋Ε6ΑΡ mRNA之 5 'UTR、編碼及3 ’UTR結構域及該等結構域之接合位點。 在對候選庫中之siRNA進行分級及選擇時，使用與不相 關革巴相互作用之預測可能性（脫靶（off_target)可能性）作為 分級參數。具有低脫靶可能性isiRNA被定義為較佳者並 認為其在活體内更具有特異性。 為預測siRNA特異性脫靶可能性，作出以下假定： 1) 與鏈之2至9位置（從5’數到3，）（種子區）中之乾基因之 互補性可足以使彼鏈與自該靶基因轉錄 互作用並隨後向下調節（Jackson al，等人Nat

Biotechnol. 2003 Jun; 21(6):635-7) 2) 每條鏈之位置1及19與脫靶相互作用不相關 3) 種子區可能比序列之其餘部分對脫靶可能性貢獻 更大 4) 鏈 列 大 之切割位點區域位置1〇及i丨（從5，數到3，）可能比序 3’至切割位點（非種子區）對脫靶可能性貢獻更 ，但不及種子區大 5) 基於siRNA鏈序列與該基因 序列之互補性及錯配位 129698.doc -52- 200902069 置同時考慮假定！至4可計算每一基因及每條鍵之脫 靶分數 6) 假定所引入之内部修飾可能使有義鏈失去活性，則 僅反義鏈之脫靶可能性與此相關 7) 自根據本發明標準展示最高同源性之基因（最佳脫革巴 基因）可推斷仙财之脫革巴可能性，因此可藉由各自 基因之脫靶分數表示 為鑑別潛在脫乾基因，對照公開可得之人類⑺讓序列 對19膽反義序列進行同源性搜索。為該目的，使所有 19mer候選反義序列對照人類RefSeq資料庫實施FastA(3 4 版本）搜索。使用Perl脚本以自候選19mer序列產生反義序 列（Ped脚本2)。用參數/數值對-g 30 -f 30 _L _i 執行

FastA搜索以考慮全長19mer内之同源性並形成適用於下— 步驟中脚本分析之輸出格式。該搜索產生候選siRNAs之潛 在脫靶基因之清單。 此外FastA技索參數使用數值_E15000以使具有8個以 上與19mer有義鏈序列相同之連續核鹼基之資料庫輸入項 極可能轉移至FastA輸出檔，同時展示整個1911161>長度之同 源性（參見假定丨）。 為鑑別最佳脫靶基因及其脫靶分數，對該FastA輸出檔 進行7刀析。對於各潛在脫靶基因，摘錄各丨9mer輸入序列 的以下脫靶特性： 種子區中錯配之數量 非種子區中錯配之數量 129698.doc -53- 200902069 切割位點區域中錯配之數量 如下計算各脫靶基因之脫靶分數： (種子錯配數量乘以1 〇) + (切割位點錯配數量乘以五 非種子錯配數量 摘錄各輸入19mer序列之最低脫靶分數並相繼寫入輸出 檔，產生對應於該等輸A19mer序列之所有siRNAs之:靶 分數之清單。 為產生一排序之siRNAs，將脫靶分數輸入一個結果表 中。最後所有siRNAs按照脫靶分數以遞减次序分類，並將 -列中含有多於3個G之片段的序列排除在選擇之外。 選擇並合成脫乾分數>=3之327個siRNAs(表… 129698.doc -54- 200902069 ·#>? v^piisp Wdv9w 呕與 I< !-1-------1~- SEQ 具有雙懸突之反義鏈 |SEQID ID (引導序列） 丨號： 號： i 「 j ! ! j j ! 1 序列(5'-3') 1 i I j ! ! f 丨 1...................................-—................... _ ................................"" 具有雙懸突之有義鏈 1 (乾序列） 1 序列(5'-3') ! I SEQ ID 丨:號： /—V, eg .i ^：j^{ % W ^ « 〇 ^ m B I 全部19 mer把 j 位點之序列 j ΟΪΊΟΙ—αΝ LL9 xxouvounuwwvnvnn°nw°lnrt σ'ε τοτ - as9G .HH.8a0spu0^apsuuu.p 6邙内 s2GI-aN S5 ^δβυ<§δ,&<§Β<υϋο 5e 卜rtIGItaN 邙卜 9 HH6u<o<IDP^<uoob 9r,IGtiaaε卜s ^Ha^58<upa4^UOUDUD^寸 m smlct-aM zrs XHOneoan^unuwwuvuDVu1^ε ^ετοΐ-α2X5 H^OPP50D3^UOOD505 寸^E ε ε τ a t - ακ cr'9HHnBn33vw§vrspa ε·3·*·5 3ετ°ν§ 699 xx.nnnrwoo^ooaonDwuan t ε T a 1> i 899 H J^U3U<DVD°0 vnwvnDr5Is OCTOt-ON H.H«.SODODO<006B^§0 0·*ε mMTOT —aN 999 XXVDDnoaDSOVBnvavov B ΒετοτύΝ <LIYBVnu9vonso:mylD®£ε 卜,NIS i i JbrluCJun3w°VKC5b l££ ST°I -ON S9HHODYS°voli3r5 9£ E ,nINT°I 丨 on εω9 JJilo^iloaYYOYOnnunnriv0sae ^ΝΤΟΤ-α2ΰφ ^BUISSUDUUUO^US^Με εΝΙαΙ -aa°^必 xxnnn50wvn0rfnv°DP5n"εε εαΙαιχΙΝ 6S HBU3ib§ODODUU08 Γεε TesI-ON 8S Hlpb<DSVUD3n9wun8n 日 a^Ict -αζrs HBUPau<,340§P^UU^UB°t ε ^IIGI-PNi 9SWHHO<OBOiDooiu^up3b 卬2£ SHIaT-aN,r,s9 δυνυπν30νϋηϋδυυδη 82€ XXPPVDW3i S8n8 ε'Ν .LSDOOSdrDsvnvonsv είΝ XXVUBWUVnwvadson0τζ xlDODCmQvn wvnBOB s XXVSDDDBDrfB85_°SI XH50a9rlo¥0nwpu<us HS8svuDDBnv§vwup IXWODa^BVBObonww 3t llwDnaLisv3B°uDWVV SI HXV^DVDnnv3°onunD— s :u,Bvnw0aDun0YuVUDn3 ε τ llr&nvnw°nuunodvuun εΐ HHUS<S05<UDUO<D<OD II ΙΙ,ννοοοδΑπονδονηηνο°t ΗΗΟναϋνννσδαοδυΒν0m x!on¥wnw°rGnnrfuvrov00 llin°°ODV03wni Γ U.WVOBW.DVnnBDnwv 9 ISSSDVUVUBSnvoi 扪 HHS33BO<0<OODOUD<< 邙 xH3YDn°03nvBB§SD ^ ioso<OBOa,SDUO<ODU z XXVDVDSViysauowvoaD ^

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York，NY，USA中之標準核苷亞磷醯胺化學將該等結構 單元納入募核糖核苷酸鏈序列中之經選擇位點上。藉由用

Beaucage試劑（Chruachem有限公司，Glasgow，UK)存於乙 腈（1 %)中之溶液代替峨氧化劑溶液引入硫代填酸酯鍵。其 他輔助試劑係自Mallinckrodt Baker(Griesheim，德國）獲 得。 藉由陰離子交換HPLC之粗募核糖核苷酸之去保護及純 化係按照規定程序實施。產量及濃度係藉由各自RNA溶液 在260奈米波長處之UV吸收使用分光光度計（Du 640B， 129698.doc -66- 200902069

Beckman Coulter GmbH，Unterschleipheim，德國）測定。 雙鏈RNA係藉由將互補鏈之等莫耳溶液混合於退火缓衝劑 (20 mM鱗酸鈉、ρΗ 6·8 ; 1〇〇瘦氯化納）中產生，在85 _ 90°C水浴辛加熱3分鐘並在3 _ 4小時時間段内將其冷却至 室溫。將經退火之RNA溶液儲存於_2〇。〇下直至使用。 對於合成經3’-膽固醇接合之siRNA(本文中稱為_膽固醇_ 31) ’使用經適當修飾之固態載體來進行RNA合成。如下製 備經修飾之固態載體： 二乙基-2-氮雜丁烧_丨，4_二甲酸酯aa

將4 · 7 Μ虱氧化鈉水溶液（5 〇毫升）添加至甘胺酸乙自旨鹽酸 鹽（32.19克’ 〇,23莫耳）存於水（50毫升）中之經授拌冰冷溶 液中。隨後，添加丙烯酸乙酯（23.1克，0.23莫耳）並將該 混合物在室溫下攪拌直至藉由TLC確定反應完成。在19小 時後，用二氯曱院（3 X 1 00毫升）使該溶液分層。用無水硫 酸鈉乾燥有機層、過濾並蒸發。蒸餾殘留物以提供 ΑΑ(28·8克，61%) 〇 3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9Η-苐-9-基曱氧基羰基-胺基）·己 酿基]-胺基}-丙酸乙基醋ΑΒ 〇

FmocHN^^/-xSv^〇 Ο ΑΒ 129698.doc -67- 200902069 將Fmoc-6-胺基-己酸（9.12克，25.83毫莫耳）溶解於二氯 曱烧（50毫升）中並用冰冷却。將二異丙基碳化二亞胺（3 25 克，3.99毫升，25.83毫莫耳）添加至〇它下之該溶液中。隨 後繼之添加二乙基-氮雜丁烷_i，4_二甲酸酯（5克，24 6毫莫 耳）及二曱基胺基吡啶（0·305克，2·5毫莫耳）。使該溶液至 室溫並再攪拌6小時。藉由TLC確定反應完成。在真空下 浪縮s亥反應混合物並添加乙酸乙酯使二異丙基脲沈殿。過 遽懸浮液。用5¾鹽酸水溶液、5%碳酸氫鈉及水洗滌濾 液。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥並濃縮以得到粗產物， 將其藉由管柱層析（50% EtOAC/己烷）純化獲得丄丨^克 (88%) AB。

3-[(6-胺基-己醯基）_乙氧基羰基曱基_胺基]_丙酸乙基酯 AC

AC 將3-{乙氧基羰基甲基_[6_(91^_苐_9_基甲氧基羰基胺基 己醯基]-胺基卜丙酸乙基酯AB(11.5克，21·3毫莫耳）溶解於 〇°C下之存於二甲基甲醯胺中之2〇%六氫吡啶中。將該溶液 繼續攪拌1小時。在真空下濃縮反應混合物，向殘留物中 添加水並用乙酸乙酯萃取產物。藉由轉化成粗產物之鹽酸 鹽純化該粗產物。 3-({6-[17-(1，5-二曱基-己基）_ι〇，ΐ3 -二甲基 _2,3,4,7,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊二烯并[a]菲_3_ 基 129698.doc -68· 200902069 氧基羰基胺基]-己醯基}乙氧基幾基甲基-胺基）-丙酸乙基

將3-[(6-胺基-己醯基）_乙氧基羰基甲基-胺基]-丙酸乙基 酯AC之鹽酸鹽（4.7克，14.8毫莫耳）吸收於二氯甲烷中。將 懸浮液在冰上冷却至〇°C。向該懸浮液中添加二異丙基乙 基胺（3.87克，5.2毫升，30毫莫耳）。向所得溶液中添加氯 曱酸膽固醇（6.675克，14.8毫莫耳）。將該反應混合物攪拌 過夜。用二氣曱烷稀釋該反應混合物並用丨0〇/〇鹽酸洗滌。 藉由急驟層析（10.3克，92%)純化該產物。 1-{6-[17-(1，5 -二曱基 _ 己基）-io，。-二曱基 _2,3,4,7,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊二烯并[a]菲-3-基 氧基幾基胺基]-己酸基}-4-氧代比U各π定-3-甲酸乙基酯ae

°Y Α£ 將第三丁醇鉀（1.1克，9.8毫莫耳）在30毫升無水甲笨中 製成漿液。將該混合物在冰上冷却至〇〇C並在2〇分鐘内邊 攪拌邊緩慢添加5克（6.6毫莫耳）二酯ad。添加期間保持溫 129698.doc •69· 200902069 度低於5C。在0C下繼續授拌30分鐘並添加1毫升冰乙 酸’隨後立即添加4克存於40毫升水中之NaH2p〇4.H2〇。 將該所得混合物萃取兩次，每次用1 〇〇毫升二氯曱烷並將 5併之有機萃取物洗務兩次，每次用10毫升麟酸鹽緩衝 劑’乾燥並蒸發至乾燥。將殘留物溶解於60毫升甲苯中， 冷却至0°c並用三份50毫升冷pH 9.5碳酸鹽緩衝劑萃取。用 磷酸將水性萃取物調節至pH值為3，並用5份4〇毫升氯仿萃 取，將其合併、乾燥並蒸發至乾燥。藉由管柱層析使用 25%乙酸乙酯/己烷純化殘留物以提供19克b_酮酯㈠9%)。 [6-(3-羥基-4-羥基曱基-u比咯啶_丨_基）_6_氧代_己基]-胺基 曱酸 17-(1,5-二曱基-己基）_1013_ 二曱基 _2,3,4,7,8,9，1〇, 11，12，13，14，15，16，17-十四氫 _iH_環戊二烯并[a]菲 _3_基酯

將甲醇（2毫升）在1小時時間段内逐滴添加至b-酮酯 八丑^^克’：二宅莫耳认蝴氫化納⑼咖克^毫莫耳诗於 AE(1.5 克，2.

併之乙酸乙自旨層並在真空 佼，添加1 N HC1(12,5毫升）， 取混合物。經無水硫酸鈉乾燥合 下濃縮以獲得產物，將該產物藉 129698.doc -70· 200902069 由管柱層析（10% MeOH/CHCl3)純化（89%)。 (6-{3-[雙-(4-曱氧基_苯基）_苯基-甲氧基甲基卜4_羥基_吼 咯啶-1-基}-6-氧代-己基）_胺基甲酸17_(1，5_二甲基_己基）_ 1〇，13-二甲基-2,3,4,7,8,9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫_ 1 環戊二烯并[a]菲-3_基酯ag

藉由在真空中用吼啶（2x5毫升）蒸發來乾燥二醇AF(1.25 毫克’ 1.994毫莫耳）。邊攪拌邊添加無水。比啶（10毫升）及 4,4'-二曱氧基三苯甲基氣化物（0.724克，2.13毫莫耳）。在 室溫下實施該反應過夜。藉由添加甲醇終止該反應。在真 空下濃縮反應混合物並向殘留物中添加二氣曱烷（5〇毫 升）。用1 Μ碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層。經無水硫酸鈉乾 综有機層、過濾並濃縮。藉由用甲苯蒸發來移除殘留之吡 σ定。藉由管柱層析（2% MeOH/氣仿，Rf=〇.5，存於5% MeOH/CHCl3 中）純化粗產物（1.75 克，95%)。 琥功酸單-(4-[雙-(4-甲氧基-苯基）_苯基-曱氧基曱基] {6-[17-(1，5-二曱基_己基）_1〇，13-二曱基2,3,4,7,8,9，10，11， 12，13，14，15，16，17-十四氫-1H環戊二烯并㈤菲_3_基氧基羰 129698,doe 71 200902069 基胺基]-己醯基吡咯啶_3_基）酯ah

將化合物AG〇.〇克’丨.05毫莫耳）與琥站酸酐（〇 15〇克， 1.5笔莫耳）及DMAP(0.〇73克，〇.6毫莫耳）混合並在真空中 於4〇°C下乾燥過夜。將該混合物溶解於無水二氣乙烷（3毫 升）中，添加二乙胺（0.318克，0.440毫升，3.15毫莫耳）並 將該溶液在室溫下於氬氣氣氛中攪拌丨6小時。隨後將其用 二氯甲烷（40毫升）稀釋並用冰冷擰檬酸水溶液（5 wt%，％ 毫升）及水（2 X 20毫升）洗滌。經無水硫酸鈉乾燥有機相並 濃縮至乾燥。殘留物原樣用於下一步驟。

經膽固醇衍生化之CPG AI

將琥珀酸鹽ΑΗ(0·254克，0.242毫莫耳）溶解於二氣曱烷/ 乙腈（3:2，3毫升）之混合物中。向彼溶液中相繼添加存於 乙腈（1.25毫升）中之DMAP(0.〇296克，0.2C亳莫耳）、存於 乙腈/二氯乙烷（3:1，L25毫升）中之2,2|_二硫代_雙（5_硝基 129698.doc -72- 200902069 吡啶）（0.075克，0.242毫莫耳）。向所得溶液中添加存於乙 腈（0.6毫升）中之三苯基膦（〇.〇64克，〇 242毫莫耳）。該反 應混合物之顏色變為鮮撥色。使用機械腕式振盪器（wrist_ action shaker)短暫攪動溶液（5分鐘）。添加長鏈燒基胺_ CPG (LCAA-CPG)(1.5克’ 61 mM)。將該懸浮液攪動2小 時。藉助燒結漏斗過濾CPG並相繼用乙腈、二氯甲烧及鍵 洗滌。使用乙酸酐/吡啶掩蔽未反應之胺基。藉由實施 量測（37 mM/克）來量測所達成之CPG裝載。 具有5-12-十一烧酸雙癸基酿胺基團（本文中稱為，,5, C32-”）或5'-膽固醇基衍生基團（本文中稱為”5，_膽固醇_")之 siRNA之合成係如WO 2004/065601中所述實施，除對於膽 固醇基衍生物氧化步驟係使用Beaucage試劑實施以在核酸 寡聚物之y-端引入硫代磷酸酯鍵外。 dsRNA表現載體 在本發明之另一態樣中，調介E6AP基因表現活性之 E6AP特異性dsRNA分子係自插入DNA或RNA載體中之轉錄 單元表現（參見，例如，Couture，A.等人，77(?. (1996) 12:5-10 ; Skillern, A.等人，國際PCT公開案第评〇 〇〇/22113 號’ Conrad，國際PCT公開案第WO 00/221 14號及

Conrad ’美國專利第6,〇54,299號）。該等轉基因可作為殘 性構建體、環狀質粒或病毒載體引入，其可作為融合至宿 主基因組中之轉基因被納入及遺傳。該轉基因亦可經構建 以容許其作為染色體外質粒被遺傳（Gassmann，等人，

Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292) 〇 129698.doc -73- 200902069 dsRNA之各鏈可藉由兩個單獨表現載體上之啓動子轉錄 並共轉染至靶細胞中。或者，該dsRNA之各單獨鏈可藉由 均位於相同表現質粒上之兩個啓動子轉錄。在較佳實施例 中’ dsRNA係作為藉由連結體聚核苷酸序列連接之反向重 複表現，如此該dsRNA具有莖及環結構。 該重組dsRNA表現載體通常為DNA質粒或病毒載體。表 現病毒載體之dsRNA可基於（但不限於）以下構建：腺相關 病毒（評述參見 Muzyczka，等人，Cwrr. Micro, /mm㈣〇/· (1992) 158:97-129));腺病毒（參見，例如， Berkner，等人，BioTechniques (1998) 6:616)、Rosenfeld等 人（1991，Science 252:431-434)、及 Rosenfeld 等人（1992)， CW/ 68:143-15 5));或曱病毒以及其他業内習知者。已使 用逆轉錄病毒來將多種基因引入至活體外及/或活體内之 許多不同細胞類型（包括上皮細胞）中（參見，例如，Egl it is 等人，(1985) 230:1395-1398 ; Danos 及 Mulligan， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464 ； Wilson^ 人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018 ; Armentano 等人，1990，Proc· Natl, Acad. Sci. USA 87:61416145 ; Huber等人，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043 ; Ferry等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-83 8 1 ; Chowdhury 等人，1991, Science 254:1802-1805 ; van Beusechem. 等人，1992，Proc.Nad· Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay等人，1992, Human Gene Therapy 3:641-647 ; Dai 等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 129698.doc -74- 200902069

USA 89:10892-10895 ; Hwu 等人，1993，J. Immunol. 150:4104-41 15 ;美國專利第4,868，116號；美國專利第 4,980,286號；PCT申請案第WO 89/07136號；PCT申請案 第 WO 89/02468 號；PCT申請案第 WO 89/05345號；及 PCT 申請案第WO 92/07573)。能夠轉導並表現插入至細胞基因 組中之基因之重組逆轉錄病毒載體可藉由將該重組逆轉錄 病毒基因組轉染至諸如PA317及Psi-CRIP等適宜包裝細胞 糸中.產生（Comette等人，1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone等人 ’ 1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349)。 重組腺病毒載體可用以感染敏感性宿主（例如，大鼠、倉 鼠、狗及黑獲猩）之多種細胞及組織（Hsu等人，1992，J. Infectious Disease, 166:769)，且亦具有感染時不需要有絲 分裂活躍細胞之優點。 本發明DNA質粒或病毒載體中驅動dsRNA表現之啓動子 可為真核RNA聚合酶1(例如核糖體RNA啓動子）、RNA聚合 酶Π(例如CMV早期啓動子或肌動蛋白啓動子或m snRNA 啓動子）或通 < 而言為RNA聚合酶πΐ啓動子（例如（J6 snRNA 或7SK RNA啓動子）或原核啓動子（例如T7啓動子，倘若該 表現夤粒亦編碼自Τ7啓動子轉錄所需要之T7 RNA聚合 酶）。該啓動子亦可直接轉基因表現至胰腺（參見，例如膜 腺之姨島素調節序列（Bucchini等人，1986, ϋ

Acad. Sci. USA 83:25 1 1-25 15))。 另外’可準確調節轉基因之表現，例如，藉由使用諸如 對某些生理調節劑敏感之調節序料可誘導之調節序列及 129698.doc -75- 200902069 表現系統，例如’循環葡萄糖含量或激素（D〇cherty等人， 1994，FASEB J· 8:20-24)。該等適宜控制細胞或哺乳動物 中轉基因表現之可誘導之表現系統包括藉由蜆皮素、藉由 雌激素、黃體酮、四環素、二聚化學誘導劑及異丙基_p_ D1-硫代吡喃半乳糖苷（EPTG)調節。熟習此項技術者將能 夠基於dsRNA轉基因之擬定用途選擇合適之調節/啓動子序 列。 通常而言’如下文所述遞送能夠表現dsRNA分子之重組 載體並在靶細胞中持續存在。或者，可使用能提供dsRNA 分子瞬時表現之病毒載體。可根據需要重複投與該等載 體。一旦表現，該等dsRNA則與靶RNA結合並調介其功能 或表現。表現載體之dsRNA之遞送可為全身性的，例如藉 由靜脈内或肌内投與、藉由投與至外植自患者之靶細胞中 繼之重新引入至該患者中、或藉由能夠引入至期望靶細胞 中之任何其他手段。 一般將dsRNA表現DNA質粒作為與陽離子脂質載劑（例 如寡核苷酸轉染（〇lig0fectamine))或以非陽離子脂質為主 之載劑（例如Transit- TKOTM)之複合物轉染至靶細胞中。 用於在一週或更長時間段内靶向單個Ε6ΑΡ基因或多個 Ε6ΑΡ基因不同區域之經dsRNA介導之敲低之多重脂質轉染 亦涵蓋於本發明中。可利用多種習知方法監測本發明载體 成功引入宿主細胞中。例如，瞬時轉染可用報告基因指 不，例如螢光標記物，例如Green Fluorescent Protein (GFP)。使用能夠使經轉染細胞對特異性環境因素（例如’ 129698.doc -76- 200902069 抗生素及藥物）具有抗性（例如潮徽細抗性）之標記物可確 保來自體内之細胞之穩定轉染。 該㈣AP特異性dsRNA分子亦可插人至載體中並用作人 類患者之基因治療載體。基因治療载體可藉由(例如)靜脈 内注射、局部投與（參見美國專利第5,328,47〇號）或藉由立 體定位注射（參見例如，Chen等人（1994) pr〇c则

Sci· USA 91:3〇54·3()57)遞送至個體。基因治療載體之醫藥 製劑可包括於可接受之稀釋劑中之基因治療載體，或可包 含其中埋置有基因遞送媒劑之緩釋基質。或者，在可自重 組細胞產生完好且完整之基因遞送載體（例如，逆轉錄病 毒載體）之情形下，該醫藥製劑可包括一或多種能夠產生 該基因遞送系統之細胞。 HCT-116細胞中Ε6ΑΡ siRNA之篩選 HCIM16 細胞係自 DSMZ (Deutsche Sammlimg von Mikroorganismen und ZE1 lkulturen) (Braunschweig，梓 國’目錄編就為ACC 581)獲得並在補充含有i〇%胎牛血清 (FCS)、青黴素1〇〇 U/毫升、鏈黴素1〇〇微克/毫升及2 mM L-麩胺醯胺之 McCoys(Biochrom AG，Berlin，德國，目錄 編號F1015)中於37°C下在含有5% C〇2之氣氛中於加濕培養 箱中培養。 對於用siRNA轉染，將HCT-116細胞以2_〇xl〇4個細胞/孔 之密度在96孔板中接種並直接轉染。如製造商所述用 lipofectamine 2000 (Invitrogen)實施siRNA(對於單劑量篩 選30 nM及3 nM)轉染。 129698.doc -77- 200902069 在轉染後24小時，根據標準方案裂解HCT-1 1 6細胞並用 Quantigene Explore套組（Panomics公司，（Fremont, CA)(先 前為Genospectra公司））量化E6AP mRNA之表現程度。以 GAP-DH mRNA為基準對E6AP mRNA含量實施標準化。對 於每一種siRNA，收集四個單獨數據點。與E6AP基因不相 關之siRNA雙鏈用作對照。給定E6AP特異性siRNA雙鏈之 活性係以經處理細胞中E6AP mRNA之濃度佔經對照siRNA 雙鏈處理之細胞中E6AP mRNA之濃度之百分比呈現。 下表2提供結果。鑑別出許多靶向該E6AP基因之活性 siRNA分子。表2 靶向E6AP之dsRNA之活性 在30nM下剩 在30nM下 雙鏈名稱 餘轉錄物之平 均百分比 在30 nM下 之標準偏差 雙鏈名稱 剩餘轉錄物之在30 nM下& 平均百分比 標準偏盖 ND-10118 17.66 1.99 ND-10283 17Λ5 2-99 ND-10119 22.63 2.07 ND-10284 27.81 3.86 ND-10120 25.30 2.17 ND-10285 14Λ1 1.66 ND-10121 22.16 2.12 ND-10286 25.23 2.1° ND40122 21.29 3,19 ND-10287 6.37 〇.5〇 ND-10123 14*25 2.24 ND-10288 14.58 1.39 ND-10124 29.18 2.04 ND-10289 16.54 2.25 ND-10125 21-76 2.58 ND-10290 12,05 2.53 ND-10126 34.49 2.87 ND-10291 22.07 3.3〇 ND-10127 20.06 1.59 ND-10292 70,58 9.44 ND-10128 43.10 4.23 ND-10293 14.72 2.〇5 ND-10129 21.23 3.33 ND-10294 11.42 0.42 ND-10130 26.72 2.38 ND-10295 19.95 1.07 ND-10131 14.42 1.85 ND-10296 14.97 0.36 ND-10132 22.26 4.11 ND-10297 15,64 1.5S ND-10133 25.6Θ 1.98 ND-10298 16.99 〇.8〇 NO-10134 28.12 0.88 ND-10299 18.26 2.〇1 ND-10135 38.42 3.24 ND-10300 20.01 1.31 ND-10136 15.54 2.55 ND-10301 14.44 0.64 ND-10137 36.32 4.42 ND-10302 41.22 3-73 ND-10138 36.77 5.69 ND*10303 37.74 6.03 ND-10139 19.09 2.75 ND-10304 10.90 0‘75 ND-10140 10.30 1.79 ND-10305 14.71 3.13 ND-10141 43.13 12.88 ND-10306 52.68 4.91 ND-10142 35.73 2.65 ND-10307 24.24 0.33 129698.doc .78_ 200902069 ND-10143 ND-10144 MCM0U5 ND-10146 ND-10147 ND-10148 ND-10149 NO-10150 ND-10151 ND-10152 ND-10153 ND-10154 ND-10155 ND^10156 ND-10157 ND-10158 ND-10159 ND-10160 ND-10161 ND-10162 ND-10163 ND-10164 ND-10165 ND-10166 ND-10167 ND-10168 ND-10169 ND-10170 ND-10171 ND-10172 ND-10173 ND-10174 ND-10175 ND-10176 ND-10177 ND-10178 ND-10179 ND-10180 ND-10181 ND-10182 ND-10183 ND-10184 ND-10185 ND-10186 ND-10187 ND-10188 ND-10189 21.24 2.26 ND-10308 54.90 3.97 17.64 3.47 ND-10309 54.76 10.28 19.02 3.28 ND-10310 22.17 1.68 20.39 3.57 ND-10311 24.79 2.11 20.99 1.21 ND-10312 17,33 2.88 76.62 11,31 ND-10313 17,55 4.00 39.27 5.88 ND-10314 23.02 4.28 26.90 1.86 ND-10315 13.33 1.88 18.88 1.08 ND-10316 19.61 3.16 21,77 2.79 ND-10317 17.29 1.13 15,93 2.07 ND-10318 18J8 1.73 45.64 3.75 ND-10319 17,46 4.72 15.85 1,61 ND-10320 19.37 2.32 17.86 2.88 ND-10321 64,52 3.68 25.83 2.64 ND-10322 17.02 3.52 46.13 3.63 ND-10323 47.08 4.36 12.76 1+03 ND-10324 20.06 1.65 17.45 1*40 ND-10325 93,65 11.68 11.21 0.96 ND-10326 18,09 3.77 42.00 5.65 ND-10327 23,52 4.09 36.02 4.20 ND-10328 19.58 4.04 58.42 8.32 ND-10329 71.26 4.08 18.58 2.63 ND-10330 22.76 1*92 26.03 3.03 ND-10331 23.96 1.40 16.87 5.53 ND-10332 31.98 2.53 18.86 1.96 ND-10333 19.35 2.76 32.31 3.92 ND-10334 22.21 2.20 22.71 3.45 ND-10335 58.81 6.69 12,39 3,02 ND-10336 25,38 3.14 13.53 1.72 ND-10337 14.70 1,37 67.35 4.47 ND-10338 30,50 3.75 13.44 1.15 ND-10339 36.81 5,22 19.24 1.89 ND-10340 65.85 2.35 34.75 2.35 ND-10341 57.67 2.06 27,58 3.78 ND-10342 16.25 1.61 10.76 1.32 ND-10343 22.54 1.78 45.45 7.56 ND-10344 17.76 190 88.36 11.08 ND-10345 31.65 2.34 33.41 5.36 ND-10346 15.63 1.69 16.39 1.93 ND-10347 29.52 2.48 14.21 1.26 ND-10348 15.28 1.01 17.63 1.94 ND-10349 20.37 2.26 31.21 2.96 ND-10350 36.74 4.34 15.85 1.59 ND-10351 42.98 2.06 20.72 3.28 ND-10352 10.78 1.82 43.08 3.80 ND-10353 18.53 1,48 18.50 2.95 ND-10354 14.95 0.66 129698.doc -79- 200902069 ND-10190 ND-10191 ND-10192 ND-10193 ND-10194 ND-10195 ND-10196 ND-10197 ND-10198 ND-10199 ND-10200 ND-10201 N010202 ND-10203 ND-10204 ND-10205 ND-10206 ND-10207 ND-10208 ND-10209 ND-10210 ND-10211 ND-10212 ND-10213 ND-10214 ND-10215 ND-10216 ND-10217 ND-10218 ND-10219 ND-10220 ND-10221 ND-10222 ND-10223 ND-10224 ND-10225 ND-10226 ND-10227 ND-10228 ND-10229 ND-10230 ND-10231 ND-10232 ND-10233 ND-10234 ND-10235 ND-10236 43.59 2.94 ND-10355 34.81 3.09 13.33 1.46 ND-10356 86J3 4.10 14.69 2,18 ND-10357 28.86 3.35 9.86 0.91 ND-10358 10,04 1.16 19.71 3.49 ND-10359 9.50 0.88 11.75 1.75 ND-10360 14,63 0.18 16,32 3.59 ND-10361 26.72 1.84 21.00 3.62 ND-10362 24.12 1.32 24.06 3.53 ND-10363 17.32 1.54 57.92 11.64 ND-10364 25.85 2,53 14,31 1.47 ND-10365 15*99 2.50 42.05 2,20 ND-10366 20,32 3.27 58.23 7.77 ND-10367 18.23 3.67 13*85 1.41 ND^10368 11*45 1.91 16.18 1,26 ND-10369 15.69 1.49 15-76 1,71 ND-10370 53,37 4.67 14.78 2.55 ND-10371 24.71 2.42 17.67 2,81 ND-10372 14,08 1.42 7.50 2.37 ND-10373 85.92 6.67 91-36 15.11 ND-10374 17.84 1-52 27.56 2.65 ND-10375 15.51 2.28 41.43 5.64 ND-10376 17.49 1J5 30.82 4,81 ND-10377 15,98 2.79 12.97 1.52 ND-10378 16.99 2.71 19,53 2.31 ND-10379 65.20 6,45 47.38 9,79 ND-10380 12.26 1.75 1.59 18.12 2.03 NO-10381 15.82 12,51 1.97 ND-10382 36,31 2.72 25.56 3.83 ND-10383 15,15 1.72 81.47 13,73 ND-10384 18.34 1.31 42.93 374 ND-10385 17,14 1.51 9·22 2.09 ND-10386 14.83 1.67 13.38 1.S9 ND-10387 13,41 2.42 14.84 0.96 ND-10388 25.62 3.19 15.56 1.67 ND-10389 21.84 1.17 35.58 3.00 ND-10390 12,71 2.10 4d.38 3.47 ND-10391 48,10 4.21 8.24 1,03 ND-10392 14,42 1.77 48,31 3,86 ND-10393 24,34 2.27 16.51 1.79 ND-10394 21,08 2.07 43-19 4.51 ND-10395 16,74 3.30 41.29 3.49 ND-10396 12,06 1.13 14.21 1.34 ND-10397 44.74 4.77 54.04 4.03 ND-10398 60,44 7.22 19.76 1.64 NO-10399 9.71 1,59 16.66 1.24 ND-10400 23.92 3.73 93.09 4.20 ND-10401 22.11 2.14 129698.doc -80- 〆 200902069

ND-10237 12.28 0.91 ND-10402 20,63 1.38 ND-10238 13.66 1.20 ND-10403 65.43 5.95 ND-10239 21.61 1.86 ND-10404 27,26 2.88 ND-10240 55,26 3.89 ND.10405 14.97 1.44 ND-10241 18.24 1,87 ND-10406 13.69 0.97 ND-10242 16,05 2,18 ND-10407 27.65 1.98 ND-10243 33.65 4.73 ND-10408 25.92 1,30 ND-10244 42.58 6.33 ND-10409 6.55 0.76 ND-10245 11.90 0.94 ND-10410 17,62 2.42 ND-10246 19.15 2.37 ND-10411 14.78 2.72 ND-10247 73,91 9J5 ND-10412 92.60 9.76 ND-10248 37.44 5.96 ND-10413 13,62 0.69 ND-10249 37.62 4,47 ND-10414 34.45 1J7 ND-10250 68,05 8.23 ND-10415 29.44 4.14 ND-10251 10.47 1.51 ND-10416 14.70 1.87 ND-10252 89.61 8,08 ND-10417 21.80 2.69 NCM0253 21.85 3.32 ND-10418 107,83 9.24 ND-10254 19.81 2-12 ND-10419 36.97 5.30 ND-10255 7.20 0.84 ND-10420 15.00 2.31 ND-10256 45,03 3.65 ND-10421 19.17 3.65 ND 10257 20.71 2.14 NO-10422 23.86 2.63 ND-10258 30.07 2.59 ND-10423 21.55 0.35 ND-10259 24.85 2.94 ND-10424 31·β1 3,81 ND-10250 14.58 1,79 ND-10425 27.34 2.29 ND-10261 32.53 3.24 ND-10426 42.72 2.80 ND-10262 26.63 3.78 ND-10427 24.49 2-04 NO10263 72,06 6.75 ND-10428 24.97 1.00 ND-10264 93.19 12.63 ND-10429 15.47 2.36 NDf10265 19.70 1.96 ND-10430 17.65 2.25 ND-10266 108.26 10.65 ND-10431 20.23 3.72 ND-10267 14.69 1.22 ND-10432 30.69 5.52 ND-10268 28.16 3.50 ND-10433 16.69 1.30 ND-10269 43.98 7.03 ND-10434 44.68 4.63 ND-10270 13,09 1.36 ND-10435 50.13 4.22 ND-10271 13.92 0.99 ND-10436 35,13 1.63 ND-10272 14.43 1.25 ND-10437 48.34 3.87 ND-10273 17.91 1.03 ND-10438 35.36 2.60 ND-10274 17-81 2.72 ND-10439 17.92 154 ND-10275 19J2 3,09 ND-10440 21.45 2.96 ND-10276 8.92 1.34 ND-10441 25T7 4.43 NO-10277 49.34 5.11 ND-10442 16.20 2.39 ND-10278 4β·61 6.12 ND-10443 27.37 1.63 ND-10279 16.49 1.61 ND-10444 20.49 1.49 ND-10280 14,14 0.91 ND-10281 13.55 1.86 ND-10282 27.29 4,14 等 文 彼等熟 方法及 隨附申 習此項技術者熟諳本揭 組合物以及其他方法及 請專利範圍之整個範圍 示内容中所具體陳述之彼 組合物，此使其能夠在後 内實施本發明。 129698.doc -81 -

Claims (1)

1. 200902069 十、申請專利範圍： 1' 一種用於抑制細胞中人類E6AP基因表現之雙鏈核糖核酸 (dsRNA) ’其中該dsRNA包含至少兩條彼此互補之序 列’其中有義鏈包含第一序列及反義鏈包含第二序列， 該第二序列包含一個與至少一部分編碼E6AP之mRNA基 本上互補之互補區域，且其中該互補區域之長度小於3〇 個核苷酸，且其中該dsRNA與表現該E6AP之細胞接觸時 抑制該E6AP基因之表現至少40%。 2 ·如請求項1之dsRNA，其中該第一序列係選自由表1組成 之群’且該第二序列係選自由表1組成之群。 3. 如請求項1之dsRNA，其中該dsRNA包含至少一種經修飾 之核普酸。 4. 如請求項2之dsRNA，其中該dsRNA包含至少一種經修飾 之核苷酸。 5. 如請求項3或4之dsRNA，其中該經修飾之核苷酸係選自 經2'-〇-甲基修飾之核苷酸、包含5，_硫代磷酸酯（ph〇S-phorothioate)基團之核苷酸、及與膽固醇基衍生物或十 二烧酸雙癸基醯胺基團連結之末端核苷酸之群。 6. 如請求項3或4之dsRNA，其中該經修飾之核苷酸係選自 經2，-去氧_2，-氟修飾之核普酸、經21-去氧-修飾之核苷 酸、鎖定核苷酸、無驗基（abasic)核苷酸、經2'-胺基-修 飾之核苷酸、經2'-烧基-修飾之核苷酸、嗎淋基核苷 酸、胺基碌酸酯（phosphoramidate)及包含非天然鹼基之 核苷酸。 129698.doc 200902069 7. 如請求項3或4之dsRNA ’其中該第一序列係選自由表1組 成之群，且該第二序列係選自由表1組成之群。 8. 如請求項6或7之dsRNA，其中該第一序列係選自由表以且 成之群，且該第二序列係選自由表1組成之群。 9. 一種細胞，其包含如請求項1之dsRNA。 1 〇· —種用於抑制生物體中E6AP基因表現之醫藥組合物，其 包含dsRNA及醫藥上可接受之載劑，其中該dsRNA包含 至少兩條被此互補之序列，且其中有義鍵包含第—序列 及反義键包含第二序列，該第二序列包含一個與至少一 部分編碼E6AP之mRNA基本上互補之互補區域，且其中 該互補區域之長度小於30個核苷酸，且其中該dsRNA與 表現該E6AP之細胞接觸時抑制該E6AP基因之表現至少 20%。 11.如請求項ίο之醫藥組合物，其中該dsRNA之該第一序列 係遥自由表1組成之群，且該dsRNA之該第二序列係選自 由表1組成之群。 1 2，如請求項丨〇之醫藥組合物，其中該d s R N A之該第一序列 係選自由表l組成之群，且該dsRNA之該第二序列係選自 由表1組成之群。 13’種抑制細胞中E6Ap基因表現之方法該方法包含： ()向°亥田胞中引入雙鏈核糖核酸（dsRNA)，其中該 —Α。3至；兩條彼此互補之序列，且其中有義鏈包 J序列及反義鏈包含第二序列，該第二序列包含一 個與至少—部分編㈣㈣之趣基本上互補之互補區 129698.doc 200902069 域’且其中該互補區域之長度小於3〇個核苷酸，且其中 該dsRNA與表現該E6AP之細胞接觸時抑制該E6Ap基因 之表現至少40% ;及 (b)將步驟（a)中所產生之細胞保持足以使該E6Ap* 因之mRNA轉錄物降解之時間，由此抑制該細胞中該 E 6 A P基因之表現。 14. 一種治療、預防或控制Hpv感染所介導之病理過程之方 法，其包含向需要該治療、預防或控制之患者投與治療 或預防有效量之dsRNA，其中該dsRNA包含至少兩條彼 此互補之序列，且其中有義鏈包含第一序列及反義鏈包 含第二序列，該第二序列包含一個與至少一部分編碼 E6AP之mRNA基本上互補之互補區域，且其中該互補區 域之長度小於30個核苷酸，且其中該dsRNA與表現該 E6AP之細胞接觸時抑制該E6AP基因之表現至少4〇y0。 15. —種用於抑制細胞中E6AP基因表現之載體，該載體包含 一個調節序列可操作地連接於一個編碼dsRNAi至少一 鏈之核苷酸序列，其中該dsRNA之一鏈與至少一部分編 碼E6AP之mRNA基本上互補，且其甲該dsRNAi長度小 於30個鹼基對，且其中該dsRNA與表現該£6八]?之細胞接 觸時抑制該E6AP基因之表現至少4〇〇/0。 1 6. —種細胞’其包含如請求項1 6之載體。 17. —種用於降低細胞中人類E6Ap基因表現程度之雙鏈核糖 核酸（dsRNA)，其中該dsRNA包含至少兩條彼此互補之 序列，且其中有義鏈包含第一序列及反義鏈包含第二序 129698.doc 200902069 列，該第二序列包含一個與至少一部分編碼E6AP之 mRNA基本上互補之互補區域，且其中該dsRNA與表現 該E6AP之細胞接觸時降低該E6AP基因之表現程度。 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 如請求項1 7之dsRNA，其中該接觸使該E6AP基因之表現 程度降低至少40%。 如請求項1 7之dsRNA，其中該接觸係在活體外於3〇 nM 或更小濃度下實施。 一種用於降低生物體内E6AP基因表現程度之醫藥組合 物，其包含如請求項17之dsRNA及醫藥上可接受之載 劑。 種〜療HPV相關病症之方法，其包含向需要該治療之 患者投與治療有效量之如請求項1 7之dsRNA。 一種治療Ε6ΛΡ相關病症之方法，其包含向需要該治療之 患者投與治療有效量之如請求項1 7之dsRNA。 種醫藥組合物，其包含至少兩種選自請求項2之dsRNA 之 dsRNA 〇 種冶療HPV相關病症之方法，其包含向需要該治療之 患者投與治療有效量之如請求項23之醫藥組合物。 129698.doc 200902069 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (_ κ 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 129698.doc