CN101743311A - 治疗HPV感染的dsRNA组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染的双链核糖核酸(dsRNA)。dsRNA包含具有小于30个核苷酸长度(通常的长度为19-25个核苷酸)的核苷酸序列的反义链，该核苷酸序列与选自人E6AP基因的HPV靶基因的至少一部分基本互补。本发明还涉及一种包含dsRNA和药学上可接受的载体的药物组合物；通过使用该药物组合物治疗由HPV感染和E6AP基因的表达引起的疾病的方法；以及抑制细胞中HPV靶基因表达的方法。

Description

治疗HPV感染的dsRNA组合物和方法
技术领域
本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)及其在介导RNA干扰以治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染介导的病理过程(例如子宫颈癌、肛门癌、HPV相关癌前病变和生殖器疣)中的用途。
背景技术
乳头瘤病毒(PV)为诱导上皮过度增生性病变的无包膜DNA病毒。乳头瘤病毒广泛存在于自然界，并已在高等脊椎动物中发现。特别是来自人、牛、兔、马和狗的病毒已被表征。1993年，棉尾兔乳头瘤病毒(CRPV)成为第一种被描述的乳头瘤病毒。从此以后，棉尾兔乳头瘤病毒和1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)一直被用作研究乳头瘤病毒的实验原型。大多数动物乳头瘤病毒与单纯的上皮增生性病变相关，并且动物中的大多数病变是皮肤病变。在人类中，已经鉴定出多于100种的乳头瘤病毒(HPV)，并根据感染部位(皮肤上皮和粘膜上皮(口腔和生殖器粘膜))对其进行了分类。皮肤相关疾病包括扁平疣和跖疣等。粘膜相关疾病包括喉乳头状瘤和肛门生殖器疾病，包括宫颈癌(Fields，1996，Virology，3rd ed.Lippincott-Raven Pub.，Philadelphia，N.Y.；Bernard，H-U.，2005.J.Clin.Virol.328：S1-S6)。
人乳头瘤病毒(HPV)感染是世界上最普遍的性传播感染之一。大部分的HPV感染是无害的。一些类型的HPV会引起生殖器疣，表现为在男性和女性的生殖器区域(包括阴道、子宫颈、外阴(阴道之外的区域)、阴茎和直肠)出现一个或多个肿块。许多感染HPV的人没有症状。
尽管大多数HPV亚型只造成良性病变，但是某些亚型被认为是高危的，并会导致更严重的病变，例如子宫颈和肛门发育异常。15种类型的HPV近期被划分为高危类型(Munoz，N.等人2003.N.Engl.J.Med.348(6)：518-27)。这些高危亚型具有遗传多样性，主要的病毒衣壳蛋白的L1基因证明有＞10％的序列差异(Bernard，H-U.，2005.J.Clin.Virol.328：S 1-S6)。
携带HPV感染的女性通常无症状，只有在子宫颈筛查之后才能发现她们的病变。子宫颈筛查主要采用巴氏试验(Pap test)进行。巴氏试验是用来识别异常子宫颈细胞的子宫颈组织的组织学评价。作为巴氏试验的一部分，HPV感染的存在和具体的亚型可以使用基于核酸的分析来确定，例如PCR或商业化的杂交捕获II技术(HCII)(Digene，Gaithersburg，马里兰，美国)。
如果鉴别到异常的子宫颈细胞，则将其划分为不同等级：具有较低的发展成癌症的风险的LSIL(低等级鳞状上皮内病变)(包括称为CIN-1的细胞(“子宫颈上皮内瘤-1”))；或具有较高的发展成癌症的可能性的HSIL(高等级鳞状上皮内病变)，包括称为CIN-2和CIN-3的细胞。
大约85％的低等级病变会自发恢复，其余的或者维持不变、或者发展成为高等级病变。如果不进行治疗的话，大约10％的高等级病变预期会转化成为癌组织。尽管其它的几种转化HPV亚型也与发育异常相关，但是HPV-16和HPV-18最经常与发育异常相关。
近期研究显示多达89％的HIV阳性的男性同性恋者有可能感染这些高危HPV亚型。HIV阳性患者还更有可能同时感染多种亚型的HPV，这与高危发育异常进展有关。
过去20年的证据使人们普遍接受这样的观点：尽管感染HPV并不一定会导致子宫颈癌，但是子宫颈癌的发展是由HPV感染引起的。子宫颈癌中存在HPV的几率估计为99.7％。与子宫颈癌一样，肛门癌也被认为在HPV感染与发展成为肛门发育异常以及肛门癌之间具有类似的关联。在一项对HIV阴性的肛门癌患者的研究中，发现88％的肛门癌患者感染HPV。美国2003年估计发生子宫颈癌新病例12200例，子宫颈癌死亡4100例；肛门癌新病例4000例，肛门癌死亡500例。尽管在过去的40年中，由于广泛开展了预防性的筛查，使得子宫颈癌的发病率已有所下降，但是肛门癌的发病率却在上升。肛门癌发病率的上升可能部分是由于HIV感染，因为HIV阳性的患者相比普通人群具有较高的肛门癌发病率。肛门癌在普通人群中的发病率是每100000人中发病0.9例，而肛门癌在男性同性恋人群中的发病率是每100000人中发病35例，在HIV阳性的男性同性恋人群中的发病率是每100000人中发病70-100例。事实上，由于HIV感染的患者中肛门发育异常非常普遍并且发展为肛门癌的趋势也逐渐增长，《2003USPHA/IDSA Guidelines for theTreatment of Opportunistic Infections in HIV Positive Patients》中将会包括针对那些诊断为肛门发育异常的患者的治疗方针。
目前尚没有已知的治愈HPV感染的方法。现有一些治疗生殖器疣的方法，尽管生殖器疣经常会不治而愈。该治疗方法取决于诸如生殖器疣的大小和位置等因素。治疗包括使用咪喹莫特乳膏、20％鬼臼树脂抗有丝分裂溶液、0.5％普达非洛溶液、5％5-氟尿嘧啶乳膏和三氯乙酸。孕妇不推荐使用鬼臼树脂或普达非洛，因为它们被皮肤吸收，有可能导致出生缺陷。孕妇也不推荐使用5-氟尿嘧啶乳膏。可以通过冷冻(冷冻手术)、灼烧(电灼术)或激光治疗来物理去除小的生殖器疣。对其它治疗没有响应的大的疣可能只能通过手术切除。已知生殖器疣在物理切除之后还会复发；在这样的情况下，曾经直接向这些疣注射α干扰素。但是，α干扰素是昂贵的，并且其使用也并没有降低生殖器疣的复发率。
因此，需要有效的HPV治疗来满足人们的需要。令人惊讶的是，已经发现了能够满足这种需要的化合物，并且提供了其它的益处。
近期，双链RNA分子(dsRNA)已显示在被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调节机制中能够阻断基因的表达。WO99/32619(Fire等人)公开了使用至少25个核苷酸长度的dsRNA来抑制秀丽线虫(C.elegans)中的基因表达。dsRNA也已显示出能够降解其它生物体中的靶RNA，包括植物(参见例如WO 99/53050，Waterhouse等人；和WO 99/61631，Heifetz等人)、果蝇(参见例如Yang，D.，等人，Curr.Biol.(2000)10：1191-1200)和哺乳动物(参见WO 00/44895，Limmer；和DE 10100586.5，Kreutzer等人)。这种天然机制已经成为开发用于治疗由异常或不希望的基因调控引起的病症的新型药物制剂的焦点。
PCT公布WO 03/008573公开了先前的开发用于治疗由HPV感染引起的疾病的基于核酸的药物的尝试。该公布报告了使用针对HPV mRNA的两种siRNA来抑制基于细胞的系统中的HPV复制；相关公布见Jiang，M.等人2005.N.A.R.33(18)：el51。
尽管在RNAi领域已经取得了显著的进步，在治疗HPV感染介导的病理过程中也取得了进步，但是仍然需要能够抑制HPV感染进展以及能够治疗HPV感染相关疾病的制剂。该挑战是非常严峻的，因为这样的制剂必须设计成能够抑制显示出非常大的基因型多样性的所有高危HPV亚型。
发明内容
本发明通过使用双链核糖核酸(dsRNA)来沉默化(silence)对HPV繁殖关键的基因表达，提供了解决治疗HPV感染相关疾病中的问题的方案。E6AP是人宿主种类中HPV增殖所需的保守基因。
本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)，以及使用这样的dsRNA抑制细胞或哺乳动物中E6AP基因表达的组合物和方法。本发明还提供了治疗由E6AP基因的表达和HPV感染引起的病理状态和疾病(例如子宫颈癌和生殖器疣)的组合物和方法。本发明的dsRNA包含RNA链(反义链)，该RNA链具有小于30个核苷酸的长度(通常为19-24个核苷酸长度)的区域，该区域与E6AP基因的mRNA转录物的至少一部分基本互补。
在一个实施方案中，本发明提供了抑制E6AP基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。该dsRNA包含至少两种相互互补的序列。dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链。反义链包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的核苷酸序列，并且互补区具有小于30个核苷酸的长度，通常为19-24个核苷酸的长度。一旦与表达E6AP的细胞相接触，dsRNA可至少40％地抑制E6AP基因表达。
例如，本发明的dsRNA分子可以包含选自表1中有义序列的dsRNA的第一序列以及选自表1中反义序列的第二序列。本发明的dsRNA分子可以包含天然存在的核苷酸，或者可以包含至少一种修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸基团的核苷酸和与胆甾醇衍生物连接的末端核苷酸。可替代地，修饰的核苷酸可以选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。一般而言，这样的修饰的序列将会基于选自表1中有义序列的所述dsRNA的第一序列和选自表1中反义序列的第二序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的一种dsRNA的细胞。该细胞一般为哺乳动物细胞，例如人类细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制生物体(一般为人类受试者)中E6AP基因表达的药物组合物，其包含一种或多种本发明的dsRNA和药学上可接受的载体或递送载体(delivery vehicle)。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制细胞中E6AP基因表达的方法，包括下述步骤：
(a)将双链核糖核酸(dsRNA)导入细胞，其中，该dsRNA包含至少两种相互互补的序列。该dsRNA包括包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链。反义链包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的互补区，其中，互补区的长度小于30个核苷酸、一般为19-24个核苷酸的长度，其中，一旦与表达所述E6AP的细胞相接触，dsRNA会抑制E6AP基因的表达至少40％；和
(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段足以获得E6AP基因的mRNA转录物的降解的时间，从而抑制细胞中E6AP基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗、预防或控制由HPV感染介导的病理过程(例如癌症或生殖器疣)的方法，包括给予需要这种治疗、预防或控制的患者治疗或预防有效量的本发明的一种或多种dsRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于抑制细胞中E6AP基因表达的载体，该载体包含与编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操作地连接的调控序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含抑制细胞中E6AP基因表达的载体的细胞。该载体包含与编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操作地连接的调控序列。
附图说明
无附图。
具体实施方式
本发明通过使用双链核糖核酸(dsRNA)来沉默化对HPV增殖关键的基因表达，提供了解决治疗HPV感染相关疾病中的问题的方案。特别地，本发明的dsRNA沉默化人E6AP基因，一种人宿主种类中HPV增殖所需的保守基因。在此，这些基因有时被统称为HPV靶基因。
本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)，以及使用dsRNA来抑制细胞或哺乳动物中E6AP基因表达的组合物和方法。本发明还提供了使用dsRNA来治疗哺乳动物中由E6AP基因的表达和HPV感染引起的病理状态和疾病的组合物和方法。dsRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程引导了序列特异性的mRNA降解。
本发明的dsRNA包含RNA链(反义链)，该RNA链包含小于30个核苷酸长度(通常为19-24个核苷酸长度)的区域，该区域与HPV靶mRNA转录物的至少一部分基本互补。这些dsRNA的使用使得哺乳动物中与HPV复制和/或维持有关的基因的mRNA能够发生靶向降解。使用基于细胞和基于动物的分析，本发明人已经证明：极低剂量的这些dsRNA可以特异性地以及高效地介导RNAi，因而显著抑制E6AP基因的表达。因此，通过靶向HPV生活周期中涉及的宿主因子基因，包含这些dsRNA的本发明的方法和组合物可用于治疗由HPV感染介导的病理过程。
HPV靶标的描述：HPV E1和E6和人E6AP
人宿主的细胞遍在蛋白连接酶E6AP通过其与病毒E6蛋白质的复合物参与HPV、特别是整合型(非附加型)HPV的复制。E6与许多调控细胞增殖途径的蛋白质相结合，并通常引起它们的降解(Chakrabarti，O.和Krishna，S.2003.J.Biosci.28：337-348)。E6与E6AP复合，以靶向肿瘤抑制物p53，从而实现降解(Scheffner，M.等人，1990.Cell.63：1129-1136；和Scheffner，M.等人，1993.Cell75：495-505)。通过使p53失活，病毒不但阻止了p53介导的感染细胞的细胞凋亡(Chakrabarti和Krishna，2003)以及有利于可被p53阻断的其DNA的复制(Lepik，D.等人1998.J.Virol.72：6822-6831)，而且通过降低p53介导的基因组完整性的控制而有利于肿瘤发生(Thomas，M.等人1999.Oncogene.18：7690-7700)。
E1和E6都已经在Fundamental Virology，3rd ed.Bernard N.Fields，David M.Knipe，和Peter M.Howley，eds.Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996的第947-978页的Peter M.Howley的“Papillomaviridae：The Viruses and Their Replication”中进行了详细的描述。E1ORF编码质粒DNA复制所必需的68-76kD的蛋白质。全长E1产物为磷酸化的核蛋白，与BPV1的LCR中的复制起点相结合。E1还显示与ATP相结合，并在体外与被称为E2转录反式激活蛋白(E2TA)的全长E2蛋白质相结合，从而提高了病毒的转录。与E2的结合还加强了E1对DNA复制起点的亲和力。在HPV-16中，E1对无限增殖化具有间接的影响。
E6是小的碱性细胞转化蛋白质(例如HPV16E6包含151个氨基酸)，大约为16-19kD，位于核基质和非核膜部分。E6基因产物包含4个Cys-X-X-Cys基序，说明有可能与锌结合；它还可以作为核酸结合蛋白。在高危HPV(例如HPV-16)中，E6和E7蛋白质是使它们的宿主——鳞状上皮细胞无限增殖化的必要和充分条件。高危HPV的E6基因产物显示与p53相复合，并促进其降解。
下述的具体描述公开了如何制备和使用dsRNA和包含dsRNA的组合物来抑制HPV靶基因的表达，以及用于治疗由HPV感染引起的疾病和病症(例如子宫颈癌和生殖器疣)的组合物和方法。本发明的药物组合物包含具有反义链的dsRNA和药学上可接受的载体，该反义链包含小于30个核苷酸长度(一般为19-24个核苷酸长度)的互补区，该互补区与HPV靶基因的RNA转录物的至少一部分基本互补。本发明的一个实施方案在药物制剂中联合使用多于一种的dsRNA(可选地，靶向不同的HPV靶基因)。
因此，本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA和药学上可接受的载体的药物组合物、使用该组合物抑制一种或多种HPV靶基因表达的方法以及使用该药物组合物治疗由HPV感染引起的疾病的方法。
I.定义
为了方便起见，下面提供了说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语和短语的含义。如果在说明书的其它部分使用的术语与此部分提供的定义存在明显区别，以此部分的定义为准。
每个“G”、“C”、“A”和“U”一般分别代表包含作为碱基的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。但是，应当理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可指如下文进一步详述的修饰的核苷酸，或者替代部分。本领域技术人员知道鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分替代，而不会显著改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如，非限制性地，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在本发明的核苷酸序列中被包含例如肌苷的核苷酸替代。包含这样的替代部分的序列是本发明的实施方案。
此处所使用的“E6AP”是指遍在蛋白连接酶E3A(ube3A，还被称为E6相关蛋白质或E6AP)基因或蛋白质。代表不同同工型的E6AP的人mRNA序列以GenBank登录号NM 130838.1、NM 130839.1和NM 000462.2提供。
此处所使用的“E1”是指16型人乳头瘤病毒(HPV 16)E1基因(GenBank登录号NC 001526，核苷酸865至2813)。此处所使用的“E6”是指16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6基因(GenBank登录号NC 001526，核苷酸65至559)。E1和E6基因的许多变体也已经被公开。意在使用“E1”和“E6”涵盖这些和将来发表的E1和E6基因变体，除非文中特别排除。
此处所使用的“靶序列”是指在一种HPV靶基因的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的相邻部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
此处所使用的术语“包含序列的链”是指包含由使用标准核苷酸命名法表示的序列所描述的核苷酸链的寡核苷酸。
当用于描述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的关系时，本领域技术人员知道，除非特别说明，此处所使用的术语“互补”是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交和形成双链体结构的能力。这样的条件例如可以是严格性条件，该严格性条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，在50℃或70℃下12-16小时，然后进行洗涤。也可以使用其它的条件，例如生物体内可能遇到的生理相关条件。本领域技术人员根据杂交核苷酸的最终应用能够确定测试两种序列互补性的最佳条件设置。
这包括将包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整个长度内进行碱基配对。这些序列可被称为相对于彼此“完全互补的”。但是，当此处称第一序列相对于第二序列“基本互补”时，这两种序列可以为完全互补的，或者在杂交之后，它们可以形成一个或多个、但是通常不多于4个、3个或2个错配的碱基对，同时保持在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。但是，当两种寡核苷酸被设计为在杂交之后形成一个或多个单链突出端(overhang)时，这样的突出端在确定互补性时不应该被认为是错配。例如，包含21个核苷酸长度的一种寡核苷酸和23个核苷酸长度的另一种寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，在本发明中也可以称为“完全互补的”。
此处所使用的“互补的”序列还可以包括非Watson-Crick碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，或者完全由所述碱基对形成，只要上述对于其杂交能力的要求能够满足即可。
此处的术语“互补的”、“完全互补的”和“基本互补的”可根据dsRNA的有义链和反义链之间的碱基配对或dsRNA的反义链和靶序列之间的碱基配对进行使用，可根据所使用的上下文进行理解。
此处所使用的与信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互补的”多核苷酸是指与兴趣mRNA(例如编码E6AP)的相邻部分基本互补的多核苷酸。例如，如果该序列与编码E6AP的mRNA的非中断部分基本互补的话，多核苷酸与E6AP mRNA的至少一部分互补。
此处所使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子复合物，其具有包含两条反平行的并且如上定义的基本互补的核酸链的双链体结构。形成双链体结构的两条链可以为一个较大RNA分子的不同部分，或者它们也可以为单独的RNA分子。如果是单独的RNA分子，这样的dsRNA在文献中通常被称为siRNA(“小干扰RNA”)。如果两条链是一个较大分子的部分，并因此被位于一条链的3’末端和相对另一条链的5’末端之间的非间断核苷酸链连接，形成双链体结构时，连接RNA链被称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。当两条链通过除了位于一条链的3’末端和相对另一条链的5’末端之间的非间断核苷酸链之外的手段共价连接而形成双链体结构时，该连接结构被称为“连接体”。RNA链可以包含相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目为dsRNA中最短链的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构之外，dsRNA可以包含一个或多个核苷酸突出端。此外，本说明书使用的“dsRNA”可以包括对于核糖核苷酸、核苷间联接、端基、帽(cap)和偶联部分的化学修饰，包括在多个核苷酸处的实质修饰并且包括此处所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。在本说明书和权利要求书中，“dsRNA”包括用于siRNA类型分子中的任何这样的修饰。
此处所使用的“核苷酸突出端”是指未配对的核苷酸，或者是指当dsRNA中一条链的3’末端超出另一条链的5’末端伸长或相反的情况下从dsRNA双链体结构中突出的核苷酸。“钝”或“平端”是指在dsRNA的末端没有未配对的核苷酸，即不存在核苷酸突出端。“平端”dsRNA为在整个长度中均为双链的dsRNA，即分子的任一末端都不存在核苷酸突出端。为了清楚起见，在确定siRNA是具有突出端还是为平端时，不考虑与siRNA的3’末端或5’末端相连的化学帽或非核苷酸化学部分。
术语“反义链”是指包含与靶序列基本互补的区域的dsRNA的链。此处所使用的术语“互补区”是指与此处所限定的序列(例如靶序列)基本互补的反义链上的区域。当互补区与靶序列不完全互补时，错配出现在末端区域是最可以接受的，如果出现错配的话，通常出现在一个末端区域或两个末端区域中，例如5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。
此处所使用的术语“有义链”是指包含与反义链区域基本互补的区域的dsRNA链。
本领域的技术人员应当知道，当用于dsRNA时，“导入细胞内”是指有利于向细胞内的摄取或吸收。dsRNA的吸收或摄取可通过未辅助的扩散性或主动细胞过程进行，或者通过辅助剂或装置进行。该术语的含义不局限于体外细胞；当细胞是活生物体的部分时，dsRNA也可“被导入细胞内”。在这样的情况下，导入细胞内将包括运送到生物体中。例如，对于体内递送，可将dsRNA注射到组织部位或系统施用。在体外导入细胞内包括本领域已知的方法，例如电穿孔和脂转染。
用于HPV靶基因时，此处的术语“沉默化”和“抑制表达”是指至少部分抑制HPV靶基因的表达，表现为与第二细胞或细胞组相比，由可从第一细胞或细胞组中分离出来的HPV靶基因转录的mRNA的量降低，在该第一细胞或细胞组中，HPV靶基因被转录，并且该第一细胞或细胞组经过处理，以使得HPV靶基因的表达受到抑制，而所述第二细胞或细胞组与所述第一细胞或细胞组基本相同，但是未经这样的处理(对照细胞)。抑制的程度通常表示为
(对照细胞中的mRNA)-(受处理细胞中的mRNA)·100％
(对照细胞中的mRNA)
可替代地，抑制的程度可以用与HPV靶基因转录功能上相关的参数的降低来表示，例如由细胞分泌的、HPV靶基因编码的蛋白质的量，或显示某些表型例如细胞凋亡的细胞的数量。原则上，HPV靶基因的沉默化可以在或者通过组成型或者通过基因工程表达靶标的任何细胞中通过任何适当的分析确定。但是，当为了确定特定的dsRNA是否在某种程度上抑制HPV靶基因的表达而需要参考并因此包括在本发明中时，下述实施例中提供的分析可作为这样的参考。
例如，在某些情况下，给予本发明的双链寡核苷酸将抑制E6AP基因的表达至少大约20％、25％、35％或50％。在某些实施方案中，给予本发明的双链寡核苷酸将抑制E6AP基因至少大约60％、70％或80％。在某些实施方案中，给予本发明的双链寡核苷酸将抑制E6AP基因至少大约85％、90％或95％。表2给出了在体外试验中，使用不同浓度的不同E6AP dsRNA分子得到的宽范围的转录抑制值。
在用于HPV感染时，术语“治疗”等是指由HPV感染介导的病理过程的减轻或改善。这样的描述包括使用本发明的治疗剂来预防或防止HPV感染，以及由HPV感染引起的症状或病变的减轻。在本发明的内容中，当涉及下述其它任何状况(除HPV感染介导的病理过程以外)时，术语“治疗”等是指减轻或改善至少一种与这种状况相关的症状，或者减缓或逆转这种状况的发展。
此处所使用的短语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在治疗、预防或控制由HPV感染介导的病理过程或者由HPV感染介导的病理过程的明显症状中提供治疗益处的量。具体的治疗有效量可由普通的医师容易地进行确定，并可根据本领域已知的因素进行改变，例如由HPV感染介导的病理过程的类型、患者的病史和年龄、由HPV感染介导的病理过程的阶段以及其它抗疾病药剂的给药。
此处所使用的“药物组合物”包含药理学上有效量的dsRNA和药学上可接受的载体。此处所使用的“药理学上有效量”、“治疗有效量”或简称“有效量”是指能够有效产生预期的药理学、治疗或预防结果的dsRNA的量。例如，如果在特定的临床治疗中，当与疾病或病症相关的可测量的参数至少降低25％才被认为是有效时，那么，治疗该疾病或病症的药物的治疗有效量为实现该参数至少降低25％所需的量。
术语“药学上可接受的载体”是指用于给予治疗剂的载体。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语特别不包括细胞培养基。对于口服给药，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和碳酸钙，以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸为合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而如果存在润滑剂的话，一般为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果需要的话，片剂可由例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料包衣来延缓在胃肠道中的吸收。
此处所使用的“转化的细胞”为已导入载体并可表达dsRNA分子的细胞。
II.双链核糖核酸(dsRNA)
在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制细胞或哺乳动物中HPV靶基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中，该dsRNA包括包含与在表达HPV靶基因中形成的mRNA的至少一部分互补的互补区的反义链，其中，该互补区小于30个核苷酸长度，通常为19-24个核苷酸长度，其中，在与表达所述HPV靶基因的细胞相接触之后，所述dsRNA抑制所述HPV靶基因的表达至少10％、25％或40％。
dsRNA包含足够互补以杂交形成双链体结构的两条RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含与来自在表达HPV靶基因中形成的mRNA序列的靶序列基本互补、一般完全互补的互补区，另一条链(有义链)包含与反义链互补的区域，因而在合适的条件下混合时，两条链杂交并形成双链体结构。一般而言，双链体结构为15至30个碱基对长度，更一般为28至25个碱基对长度，更一般为19至24个碱基对长度，最一般为19至21个碱基对长度。同样地，与靶序列的互补区为15至30个核苷酸长度，更一般为18至25个核苷酸长度，更一般为19至24个核苷酸长度，最一般为19至21个核苷酸长度。本发明的dsRNA还可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端。可以使用下述本领域已知的标准方法来合成dsRNA，例如使用自动DNA合成仪，例如Biosearch，Applied Biosystems，Inc.销售的自动DNA合成仪。在一个优选实施方案中，HPV靶基因为人E6AP基因。在特定的实施方案中，dsRNA的反义链包含选自表1中有义序列的链，和选自表1中反义序列的第二序列。靶向表1提供的靶序列中的其它地方的替代反义试剂可以使用靶序列和侧翼E6AP序列容易地确定。
在进一步的实施方案中，dsRNA包含选自表1中提供的序列的至少一种核苷酸序列。在另一个实施方案中，dsRNA包含选自该组的至少两种序列，其中，所述至少两种序列中的一种与所述至少两种序列中的另一种互补，并且所述至少两种序列中的一种与在表达E6AP基因中产生的mRNA的序列基本互补。一般而言，dsRNA包含两种寡核苷酸，其中，一种寡核苷酸描述为表1中的有义链，第二种寡核苷酸描述为表1中的反义链。表1提供了每种优选dsRNA的双链体名称和序列ID号。
本领域技术人员知道：包含20-23个、特别是21个碱基对的双链体结构的dsRNA能够特别有效地诱导RNA干扰(Elbashir等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。但是，也有人发现更短或更长的dsRNA也是有效的。在上述的实施方案中，由于表1中提供的寡核苷酸序列的性质，本发明的dsRNA可以包含至少一条长度最短为21nt的链。可以合理地预期，表1中的一种序列只在其一端或两端减去几个核苷酸，包含该序列的较短dsRNA可与上述dsRNA类似地有效。因此，本发明涉及这样的dsRNA：其包含表1中一种序列的至少15、16、17、18、19、20或更多个相邻核苷酸的部分序列，并且在下述FACS分析或其它分析中，抑制HPV靶基因表达的能力与包含全长序列的dsRNA相比，抑制区别不超过5、10、15、20、25或30％。使用提供的参考序列和靶序列可以容易地制备在表1所提供的靶序列内切割的其它dsRNA。
此外，表1提供的RNAi试剂能够识别在对基于RNAi的切割敏感的相应HPV靶mRNA中的位点。因此，本发明进一步包括在由本发明的一种试剂靶向的序列内靶向的RNAi试剂。在此使用时，如果第二RNAi试剂在与第一RNAi试剂的反义链互补的mRNA内的任意位置切割信使，则该第二RNAi试剂被称为在第一RNAi试剂的序列内靶向。这样的第二试剂通常由来自表1中提供的一种序列的至少15个相邻的核苷酸组成，这些核苷酸与来自与HPV靶基因中选择的序列相邻的区域的附加核苷酸序列连接。例如，SEQ IDNO：1的最后15个核苷酸(减去添加的AA序列)加上后面的来自靶E6AP基因的6个核苷酸，产生了基于表1中提供的一种序列的包含21个核苷酸的单链试剂。
本发明的dsRNA可以包含一个或多个与靶序列的错配。在优选实施方案中，本发明的dsRNA包含不多于3个错配。如果dsRNA的反义链包含与靶序列的错配的话，优选该错配区域并非位于互补区的中心。如果dsRNA的反义链包含与靶序列的错配的话，优选该错配局限于每个末端的5个核苷酸，例如互补区5’或3’端的5、4、3、2或1个核苷酸。例如，对于与HPV靶基因区域互补的23个核苷酸的dsRNA链而言，dsRNA通常在中心13个核苷酸内不包含任何错配。本发明描述的方法可用于确定包含与靶序列的错配的dsRNA是否能够有效地抑制HPV靶基因的表达。尤其是当HPV靶基因中特定的互补区已知在病毒(如果是E1或E6的话)或人群(对于E6AP)中具有多态性序列差异时，考虑包含错配的dsRNA在抑制HPV靶基因表达中的有效性是非常重要的。
在一个实施方案中，dsRNA的至少一端具有包含1至4个、通常为1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸的突出端的dsRNA比它们的平端对应物具有意想不到的好的抑制性能。此外，本发明人已经发现：存在仅一个核苷酸的突出端能够加强dsRNA的干扰活性，而不会影响它的整体稳定性。仅具有一个突出端的dsRNA证明在体内，以及在多种细胞、细胞培养基、血液和血清中特别稳定和有效。一般而言，单链突出端位于反义链的3’末端或可选地位于有义链的3’末端。dsRNA还可以具有平端，通常位于反义链的5’末端。这样的dsRNA具有提高的稳定性和抑制活性，因而可以以低剂量-即小于每日5mg/kg接受者体重的剂量给药。一般而言，dsRNA的反义链在3’末端具有核苷酸突出端，5’末端为平端。在另一个实施方案中，突出端中的一个或多个核苷酸由核苷硫代磷酸取代。
在另一个实施方案中，dsRNA经化学修饰以提高其稳定性。本发明的核酸可以使用本领域已知的方法来合成和/或修饰，例如在《Current protocols in nucleic acid chemistry》，Beaucage，S.L.等人(Edrs.)，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，纽约州，美国中描述的那些方法，该文献在此引入作为参考。化学修饰可以包括但不限于2’修饰、寡核苷酸的糖或碱基的其它位点的修饰、非天然碱基引入寡核苷酸链、与配体或化学部分共价连接以及使用可选的连接(linkage)(例如硫代磷酸)来替代核苷酸之间的磷酸连接。还可以使用一种以上的这样的修饰。
可以使用多种公知技术中的任一种实现两个单独的dsRNA链的化学连接，例如通过引入共价键、离子键或氢键；疏水相互作用、范得华力或堆积相互作用；通过金属离子配位或通过使用嘌呤类似物。一般而言，可用于修饰dsRNA的化学基团包括但不限于亚甲基蓝；双功能基团，一般为双-(2-氯乙基)胺；N-乙酰基-N’-(对-乙醛酰基苯甲酰基)胱胺；4-硫尿嘧啶；和补骨脂素。在一个实施方案中，连接体为六乙二醇连接体。在这种情况下，使用固相合成法生成dsRNA并根据标准方法(例如Williams，D.J.，和K.B.Hall，Biochem.(1996)35：14665-14670)引入六乙二醇连接体。在一个特定的实施方案中，反义链的5’末端和有义链的3’末端通过六乙二醇连接体化学连接。在另一个实施方案中，dsRNA的至少一个核苷酸包含硫代磷酸或二硫代磷酸基团。dsRNA末端的化学键通常由三螺旋键形成。表1提供了本发明的修饰的RNAi试剂的例子。
在另一个实施方案中，两条单链中的一条或两条的核苷酸可经过修饰来预防或抑制细胞酶(例如但不限于某些核酸酶)的降解活性。用于抑制细胞酶降解核酸的活性的技术是本领域已知的，包括但不限于2’-氨基修饰、2’-氨基糖修饰、2’-F糖修饰、2’-F修饰、2’-烷基糖修饰、不带电的骨架的修饰、吗啉代修饰、2’-O-甲基修饰和氨基磷酸酯(参考例如Wagner，Nat.Med.(1995)1：1116-8)。因而，dsRNA上核苷酸的至少一个2’-羟基基团被化学基团取代，通常被2’-氨基或2’-甲基取代。还可以修饰至少一个核苷酸来形成锁定核苷酸。这样的锁定核苷酸包含连接核糖的2’-氧和核糖的4’-碳的亚甲基桥。包含锁定核苷酸的寡核苷酸在Koshkin，A.A.，等人，Tetrahedron(1998)，54：3607-3630和Obika，S.等人，TetrahedronLett.(1998)，39：5401-5404中有描述。将锁定核苷酸引入寡核苷酸中改善了对互补序列的亲和力，并使解链温度增加几度(Braasch，D.A.和D.R.Corey，Chem.Biol(2001)，8：1-7)。
将配体与dsRNA偶联能够提高其细胞吸收，以及向特定组织的靶向，或者特定细胞类型(例如阴道上皮细胞)的摄取。在某些情况下，疏水配体与dsRNA偶联，有利于直接透过细胞膜。可选地，与dsRNA偶联的配体为受体介导的胞吞作用的底物。这些方法已用于促进反义寡核苷酸和dsRNA试剂的细胞透过。例如，胆固醇与不同的反义核苷酸偶联之后，使得化合物与未偶联的类似物相比具有显著提高的活性。参考M.Manoharan Antisense&Nucleic Acid DrugDevelopment 2002，12，103。与寡核苷酸偶联的其它亲脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-双-O-(十六烷基)甘油和甲醇。用于受体介导的胞吞作用的配体的一个例子是叶酸。叶酸通过叶酸-受体介导的胞吞作用进入细胞内。携带叶酸的dsRNA化合物能够通过叶酸-受体介导的胞吞作用有效地转运到细胞内。Li和合作者报告了叶酸与寡核苷酸的3’末端的连接使得寡核苷酸的细胞摄取增加了八倍。Li，S.；Deshmukh，H.M.；Huang，L.Pharm.Res.1998，75，1540。与寡核苷酸偶联的其它配体包括聚乙二醇、碳水化合物组、交联剂、卟啉配合物和递送肽。
在某些情况下，阳离子配体与寡核苷酸的偶联导致提高的核酸酶抗性。代表性的阳离子配体的例子包括丙基铵和二甲基丙基铵。有趣的是，当阳离子配体遍布核苷酸中分散时，据报告反义寡核苷酸能够保持它们与mRNA的高结合亲和力。参见M.ManoharanAntisense&Nucleic Acid Drug Development 2002，12，103和其中所引用的参考文献。
可以使用具有悬垂反应官能团的dsRNA，例如连接分子连接到dsRNA上产生的dsRNA，来合成配体偶联的本发明的dsRNA。这种反应性的寡核苷酸可与市售配体、合成的带有任一种保护基的配体或连接有连接部分的配体直接反应。在某些优选实施方案中，通过使用已经与配体适当偶联并且还可以进一步连接到固体支持材料上的核苷单体，本发明的方法有利于合成配体偶联的dsRNA。这些任选地与固体支持材料相连的配体-核苷偶联物根据本发明的方法的一些优选实施方案制备，是通过选择的血清结合配体与位于核苷或寡核苷酸的5’位置上的连接部分的反应。在某些情况下，具有与dsRNA 3’末端连接的芳烷基配体的dsRNA是这样制备的：首先通过长链氨基烷基将单体结构单元与可控孔度玻璃(controlled-pore-glass)支持物共价连接。然后通过标准的固相合成技术将核苷酸与结合在固体支持物上的单体结构单元相键合。单体结构单元可以是与固相合成兼容的核苷或其它有机化合物。
可以使用公知的固相合成技术方便地和常规地制备在本发明的偶联物中使用的dsRNA。用于这种合成的仪器由几家销售商提供，包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。还可以另外地或可替代地使用本领域已知的用于这种合成的其它任何方式。也知道使用类似的技术来制备其它的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
关于合成特定的修饰寡核苷酸的教导可参考下述美国专利：美国专利5,138,045和5,218,105，涉及聚胺偶联的寡核苷酸；美国专利5,212,295，涉及用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸的单体；美国专利5,378,825和5,541,307，涉及具有修饰的骨架的寡核苷酸；美国专利5,386,023，涉及骨架修饰的寡核苷酸及其通过还原偶联的制备；美国专利5,457,191，涉及基于3-脱氮嘌呤环系统的修饰的核碱基及其合成方法；美国专利5,459,255，涉及基于N-2取代的嘌呤的修饰的核碱基；美国专利5,521,302，涉及用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸的方法；美国专利5,539,082，涉及肽核酸；美国专利5,554,746，涉及具有β-内酰胺骨架的寡核苷酸；美国专利5,571,902，涉及用于合成寡核苷酸的方法和材料；美国专利5,578,718，涉及具有烷基硫代基团的核苷，其中这些基团可用作与核苷多个位置中的任一位置连接的其它部分的连接体；美国专利5,587,361和5,599,797，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸连接的寡核苷酸；美国专利5,506,351，涉及用于制备2’-O-烷基鸟苷和相关化合物(包括2，6-二氨基嘌呤化合物)的方法；美国专利5,587,469，涉及包含N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美国专利5,587,470，涉及包含3-脱氮嘌呤的寡核苷酸；美国专利5,223,168和美国专利5,608,046，均涉及偶联的4’-去甲基核苷类似物；美国专利5,602,240和5,610,289，涉及骨架修饰的寡核苷酸类似物；美国专利6,262,241和5,459,255，特别涉及合成2’-氟-寡核苷酸的方法。
在具有序列特异性连接的本发明的核苷的配体偶联的dsRNA和配体分子中，使用标准的核苷酸或核苷前体、或者已经带有连接部分的核苷酸或核苷偶联物前体、已经带有配体分子的核苷酸或核苷偶联物前体、或带有非核苷配体的结构单元，可以在合适的DNA合成仪上装配寡核苷酸和寡核苷。
当使用已带有连接部分的核苷酸-偶联物前体时，通常先完成序列特异性连接的核苷的合成，然后配体分子与连接部分反应形成配体偶联的寡核苷酸。带有多种分子(例如类固醇、维生素、脂质和受体分子)的寡核苷酸偶联物以前已经描述(参见Manoharan等人，PCT申请WO 93/07883)。在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷是通过自动合成仪合成的，其中除了使用可商购获得和寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺以外，还使用来自配体-核苷偶联物的亚磷酰胺。
在寡核苷酸的核苷中引入2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-烯丙基、2’-O-氨基烷基或2’-脱氧-2’-氟基团使得寡核苷酸的杂交能力增强。此外，包含硫代磷酸骨架的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此，本发明的功能化的、连接的核苷可以增加，以包括硫代磷酸骨架或者2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-氨基烷基、2’-O-烯丙基或2’-脱氧-2’-氟基团中的一个或两个。例如PCT公布WO 200370918概括列举了本领域已知的一些寡核苷酸修饰。
在一些实施方案中，使用DNA合成仪来制备在5’末端具有氨基的本发明的功能化核苷序列，然后与选择的配体的活性酯衍生物反应。活性酯衍生物是本领域技术人员已知的。代表性的活性酯包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基和活性酯的反应产生了寡核苷酸，在其5’位置上通过连接基团与选择的配体相连。可以使用5’-氨基-修饰物(5′-Amino-Modifier)C6试剂来制备5’末端的氨基。在一个实施方案中，通过使用配体-核苷亚磷酰胺，配体分子可与寡核苷酸在其5’位置处偶联，其中，配体与5’-羟基直接连接或通过连接体间接相连。这样的配体-核苷亚磷酰胺通常在自动合成程序的最后使用，以提供在5’末端带有配体的配体偶联的寡核苷酸。
修饰的核苷间连接或骨架的例子包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫逐氨基磷酸酯、硫逐烷基磷酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯，它们具有正常的3’-5’连接，2’-5’连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中核苷单元的相邻的配对为连接的3’-5’对5’-3’或2’-5’对5’-2’。还可以包括不同的盐、混合盐和游离酸形式。
涉及制备上述包含磷原子的连接的代表性的美国专利包括但不限于美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；和5,697,248，在此均引入作为参考。
不包括磷原子的修饰的核苷间连接或骨架的例子(即寡核苷)具有由短链烷基或环烷基糖间连接、混合杂原子和烷基或环烷基糖间连接、或一种或多种短链杂原子或杂环糖间连接形成的骨架。包括具有吗啉代连接(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；和其它具有N、O、S和CH2混合组分的骨架。
涉及制备上述寡核苷的代表性的美国专利包括但不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，在此均引入作为参考。
在某些情况下，寡核苷酸可由非配体基团修饰。许多非配体分子已与寡核苷酸偶联，以提高寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，可在科技文献中查阅到用于进行这种偶联的方法。这些非配体部分包括脂质部分，例如胆固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：6553)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4：1053)、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765))、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20：533)、脂肪链(例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10：111；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75：49))、磷脂(例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777))、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)、或棕榈基部分(Mishra等人，Biochem.Biophys.Acta，1995，1264：229)、或十八烷胺或己基氨基-羰基-羟胆甾醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923)。以上已经列举了教导如何制备这样的寡核苷酸偶联物的代表性的美国专利。典型的偶联方案包括合成在其序列的一个或多个位置上带有氨基连接体的寡核苷酸。然后使用适当的偶联剂或活化剂，使氨基与将要偶联的分子反应。偶联反应可以使用仍然结合在固体支持物上的寡核苷酸进行，也可以在溶液相中切下寡核苷酸后进行。使用HPLC纯化寡核苷酸偶联物得到纯的偶联物。使用胆固醇偶联物是特别优选的，因为这种部分能够增加向阴道上皮细胞(HPV感染部位)的靶向。
本发明描述了用于沉默化HPV靶基因并因此治疗HPV相关病症的dsRNA的多种实施方案。虽然特定治疗剂的设计可以采用多种形式，某些功能特征将会从其它的dsRNA中区别出优选的dsRNA。特别地，将测试本领域技术人员可进行测量的例如良好的血清稳定性、高效力、缺乏诱导的免疫应答和良好的药物样行为等特征，以鉴定本发明优选的dsRNA。在某些情况下，优选的dsRNA并不会具有所有这些功能特征。但是，本领域技术人员能够优化这些变量和其它因素来选择本发明的优选化合物。
虽然许多核苷酸修饰都是可能的，但是本发明人确定了一些化学修饰模式，它们能够提供显著提高的药理学、免疫学和最终治疗益处。表3示出了本发明表1中列出的双链dsRNA优选使用的化学修饰模式。
表3
  化学修饰系列   对有义链进行的改变(5’-3’)   对反义链进行的改变(5’-3’)
  1(在两条链末端的单个硫代磷酸)   dTsdT   dTsdT
  2(在两条链末端的单个硫代磷酸，加上所有嘧啶的2’O Me有义链修饰，以及所有A之前的U和所有A之前的C的2’Ome修饰)   dTsdT，在所有嘧啶处2’O Me   dTsdT，在uA、cA处2’O Me
  3(在两条链末端的单个硫代磷酸，加上所有嘧啶的2’O Me有义链修饰，以及在反义链上所有A之前的U、所有A之前的C、所有G之前的U和所有U之前的U的指定碱基的2’O me)   dTsdT，在所有嘧啶处2’O Me   dTsdT，在uA、cA、uG、uU处2’O Me
  4(与1相同，除了添加与有义链偶联的胆固醇)   胆固醇(“外”)   dTsdT(“外”)
  5(与2相同，除了与有义链偶联的胆固醇)   胆固醇(“内”)   dTsdT，在uA、cA处2’O Me
  6(与3相同，除了与有义链偶联的胆固醇)   胆固醇(“内”)   dTsdT，在uA、cA、uG、uU处2’O Me
编码RNAi试剂的载体
本发明的dsRNA还可通过重组病毒载体在体内细胞内表达。本发明的重组病毒载体包含编码本发明的dsRNA的序列和用于表达dsRNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括例如U6或H 1RNA pol III启动子序列以及巨细胞病毒启动子。本领域技术人员知道其它合适的启动子的选择。本发明的重组病毒载体还可以包含用于在特定的组织或特定的细胞内环境中表达dsRNA的诱导型或调节型启动子。下面将会详细描述如何使用重组病毒载体在体内将本发明的dsRNA转运到细胞内。
本发明的dsRNA可以由重组病毒载体表达，或者表达为两个单独的互补RNA分子，或者表达为具有两个互补区的单个RNA分子。
可以使用任何能够接受将要表达的dsRNA分子的编码序列的病毒载体，例如来自以下病毒的载体：腺病毒(AV)；腺相关病毒(AAV)；逆转录病毒(例如慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒等。可以适当地通过假型化(pseudotyping)具有来自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原的载体、或者通过取代不同的病毒衣壳蛋白来改变病毒载体的向性。
例如，来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白可以假型化本发明的慢病毒载体。通过工程化载体使其表达不同的衣壳蛋白血清型，本发明的AAV载体可靶向不同的细胞。例如，表达血清型2基因组上的血清型2衣壳的AAV载体被称为AAV 2/2。AAV 2/2载体中的这种血清型2衣壳基因可被血清型5衣壳基因代替，而产生AAV 2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术是本领域已知的，例如参见Rabinowitz J E等人(2002)，J Virol 76：791-801，其全部内容在此引入作为参考。
适用于本发明的重组病毒载体的选择、将用于表达dsRNA的核酸序列插入载体中的方法，以及将病毒载体转运到兴趣细胞的方法是本领域已知的。例如参见Dornburg R(1995)，Gene Therap.2：301-310；Eglitis M A(1988)，Biotechniques 6：608-614；Miller A D(1990)，Hum Gene Therap.1：5-14；Anderson W F(1998)，Nature 392：25-30；和Rubinson D A等人，Nat.Genet.33：401-406，其全部内容在此引入作为参考。
优选的病毒载体为来自AV和AAV的载体。在一个特别优选的实施方案中，本发明dsRNA表达为来自重组AAV载体的两个单独的、互补的单链RNA分子，该载体包含例如U6或H1RNA启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子。
用于表达本发明的dsRNA的合适的AV载体、构建重组AV载体的方法和将载体转运到靶细胞的方法已在Xia H等人(2002)，Nat.Biotech.20：1006-1010中描述。
用于表达本发明的dsRNA的合适的AAV载体、构建重组AAV载体的方法和将载体转运到靶细胞的方法已在Samulski R等人(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J等人(1996)，J.Virol，70：520-532；Samulski R等人(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利5,252,479；美国专利5,139,941；国际专利申请WO 94/13788；和国际专利申请WO 93/24641中描述，其全部内容在此引入作为参考。
III.包含dsRNA的药物组合物
在一个实施方案中，本发明提供了包含此处所描述的dsRNA以及药学上可接受的载体的药物组合物。包含dsRNA的药物组合物可用于治疗与HPV靶基因的表达或活性相关的疾病或病症，例如由HPV感染介导的病理过程。基于给药方式配制这些药物组合物。一个例子是配制成经子宫颈局部给药或者经肠胃外递送系统给药的组合物。
本发明的药物组合物以足以抑制HPV靶基因的表达的剂量给药。本发明人已经确定，由于其提高的有效性，包含本发明的dsRNA的组合物可以以令人惊讶的低剂量给药。每日每千克接受者体重5mg dsRNA的剂量足以抑制或降低HPV靶基因的表达，对于针对疣或子宫颈或肛门的治疗，可以直接对感染组织给药。
一般而言，合适的dsRNA剂量范围为每日每千克接受者体重0.01至5.0毫克，一般是每日每千克体重1微克至1毫克。可以每日给予一次药物组合物，或者可以在一天当中以适当的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量给予dsRNA，或者甚至使用阴道凝胶的控制释放制剂进行连续输注或递送。在这种情况下，每个亚剂量中包含的dsRNA必然相应地较低，以实现总的日剂量。剂量单元还可以配制供几天给药，例如，使用传统的缓释制剂使dsRNA在几天的时间内持续释放。缓释制剂是本领域已知的，特别适用于药物的阴道给药，例如可以用于本发明的药物。在这个实施方案中，剂量单元包含相应的多个每日剂量。
本领域技术人员应当知道，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄和存在的其它疾病。此外，使用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列的治疗。可以使用传统的方法或基于使用适当的动物模型进行的体内测试来估计本发明包括的各dsRNA的有效剂量和体内半衰期，如本文其它地方所述。
本发明人意识到，由于多种原因，包括HPV基因型的变异性，有可能需要同时使用多于一种的本发明的dsRNA来治疗HPV感染。在一个实施方案中，选择dsRNA的组合，使其能够靶向最宽范围的HPV基因型，同时具有最不复杂的dsRNA混合物。包含多于一种类型的dsRNA的本发明的药物组合物预期包含此处所述的各dsRNA的剂量。
dsRNA的组合可以在单一剂型药物组合物中一起提供。可选地，dsRNA的组合可以在单独的剂型中提供，在这种情况下，它们可以同时或不同时给药，并且可能通过不同的方式给药。因此，本发明涉及包含本发明的dsRNA的理想组合的药物组合物；还涉及旨在作为联合疗法的一部分提供的单一dsRNA的药物组合物。在后一情况下，联合治疗的发明因此是给药方法，而不是物质的组合物。
小鼠遗传学的进展产生了许多用于研究不同人类疾病(例如由HPV感染介导的病理过程)的小鼠模型。这些模型用于dsRNA的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。
可以使用任何方法将本发明的dsRNA给予到包含感染HPV的细胞的哺乳动物。例如，给药可以是局部的(例如阴道、经皮等)；口服的；或肠胃外的(例如皮下、心室内、肌肉内或腹膜内注射，或者通过静脉滴注)。可以快速给药(例如通过注射)，或者也可以在一段时间内给药(例如通过慢速输注或给予缓释制剂)。
典型地，当治疗携带感染HPV的细胞的哺乳动物时，dsRNA分子以阴道凝胶或乳膏的形式局部给药。例如，配制的含或不含脂质体的dsRNA可以直接局部给药到子宫颈、肛道或HPV病变处，例如生殖器疣。对于局部给药，可将dsRNA分子配制为组合物，例如灭菌和非灭菌水溶液、在普通溶剂(例如酒精)中的非水溶液，或在液体或固体油基中的溶液。这些溶液还可以包含缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。用于局部给药的组合物可被配制成为透皮贴剂、软膏、洗液、乳膏、胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的形式。可以使用本领域已知的聚合物和透化剂来配制胶剂和乳膏。可以使用子宫颈帽、阴道隔膜、涂覆避孕套、手套等将包含dsRNA以及相关的赋形剂的胶剂和乳膏施用到子宫颈。可以添加传统的药物载体、水溶液、粉末或油状基质、增稠剂等。
对于肠胃外、鞘内或心室内给药，dsRNA分子可被配制到组合物中，例如灭菌水溶液，还可以包含缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂(例如穿透增强剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体)。
此外，使用非病毒的方法(例如生物或非生物方式，例如在美国专利6,271,359中所述)，可以将dsRNA分子给予到包含HPV感染的细胞的哺乳动物中。可以使用多种方法进行非生物递送，包括但不限于(1)将在此提供的dsRNA酸分子装载到脂质体中，和(2)将dsRNA分子与脂质或脂质体进行复合以形成核酸-脂质或核酸-脂质体复合物。脂质体可以包含通常用于体外转染细胞的阳离子和中性脂质。阳离子脂质可以与带负电的核酸复合(例如电荷结合)形成脂质体。阳离子脂质体的例子包括但不限于lipofectin、lipofectamine、lipofectace、DOTAP(1，2-二油酰-3-三甲铵丙烷)、DOTMA(N-[1，2(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOSPA(2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺甲酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵)、DOGS(二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺)和DC-chol(3，[N-N′，N-二甲基乙二胺)-氨基甲酰基]胆固醇)。
形成脂质体的程序是本领域已知的。脂质体组合物可例如由磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或二油酰磷脂酰乙醇胺形成。许多亲脂性试剂可以商购获得，包括Lipofectin.RTM.(Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，Calif.)和Effectene.TM.(Qiagen，Valencia，Calif.)。此外，可以使用市售的阳离子脂质(例如DDAB或DOTAP，每种都可以与例如DOPE或胆固醇的中性脂质混合)来优化系统递送方法。在一些情况下，可以使用Templeton等人(Nature Biotechnology，15：647-652(1997))描述的脂质体。在另一些实施方案中，可以使用聚阳离子(例如聚乙撑亚胺)来实现体内和离体的递送(Boletta等人，J.Am Soc.Nephrol.7：1728(1996))。还可以在美国专利6,271,359、PCT公开WO 96/40964和Morrissey，D.等人2005.Nat Biotechnol.23(8)：1002-7中发现关于使用脂质体递送核酸的其它信息。
将dsRNA分子给予到包含HPV感染的细胞的哺乳动物的其它非病毒方法包括基于阳离子脂质的递送系统(除了脂质体以外)，例如脂复合物(lipoplex)和纳米乳剂。此外，还可以使用缩合聚合物递送系统(即DNA-聚合物复合物或“聚复合物(polyplex)”，包括但不限于壳聚糖、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙撑亚胺(PEI)、树状聚体(dendrimer)(例如聚乙二胺(PANAM)树状聚体)和泊洛沙胺。此外，还可以使用非缩合的聚合物递送系统，包括但不限于泊洛沙姆、明胶、PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和PVA(聚乙烯醇)。
上述递送或给药技术的方法是本领域已知的。例如，缩合聚合物递送系统是通过与阴离子DNA分子容易地复合而起作用的；例如，聚(L-赖氨酸)(PLL)通过形成与负电细胞表面相互作用的带正电荷复合物、然后发生快速内在化而起作用。
可以使用多种方法完成生物递送，包括但不限于使用病毒载体。例如，可以使用病毒载体(例如腺病毒和疱疹病毒载体)将dsRNA分子递送到皮肤细胞和子宫颈细胞中。可以使用标准的分子生物学技术将一种或多种此处提供的dsRNA导入到以前为了将核酸递送到细胞内而开发的众多不同病毒载体中的一种内。可以使用这些产生的病毒载体将一种或多种dsRNA递送到细胞内，例如通过转染。
本发明的dsRNA可被配制在药学上可接受的载体或稀释剂中。“药学上可接受的载体”(在此也被称为“赋形剂”)为药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其它任何药理学惰性载体。药学上可接受的载体可以为液体或固体，可以根据计划的给药方式进行选择，以提供理想的大规模、一致性和其它相关的递送和化学性质。典型的药学上可接受的载体包括但不限于水；盐溶液；粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖和其它糖、明胶或硫酸钙)；润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(例如淀粉或淀粉羟乙酸钠)和湿润剂(例如月桂基硫酸钠)。
此外，靶向HPV靶基因的dsRNA可配制成为组合物，该组合物包含与其它分子、分子结构或核酸混合物相混合、胶囊化、偶联或以其它方式结合的dsRNA。例如，包含靶向E6AP基因的一种或多种dsRNA试剂的组合物可以包含其它治疗剂，例如消炎药(例如非甾体消炎药和皮质类固醇)和抗病毒药(例如利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦)。在一些实施方案中，该组合物可以包含一种或多种具有与HPV靶基因互补的序列的dsRNA，以及角质溶解剂。角质溶解剂为分离或放松表皮角质层的药物。角质溶解剂的例子包括但不限于水杨酸。美国专利5,543,417提供了其它的例子。可使用有效量的角质溶解剂来提高dsRNA的穿透，例如进入组织(例如皮肤)。例如，可以使用一定量的角质溶解剂，使施用到生殖器疣的dsRNA可以渗入整个疣。
可以在细胞培养物或试验动物中使用标准的药物方法(例如确定LD50(种群的50％致死的剂量)和ED50(种群的50％治疗有效的剂量))来确定这些化合物的毒性和治疗有效性。毒性和治疗效果之间的剂量比例为治疗指标，可以表示为LD50/ED50之比。显示高治疗指标的化合物为优选化合物。
从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于确定人使用的剂量范围。本发明的组合物的剂量通常在循环浓度的范围之内，包括ED50，具有非常少的毒性或没有毒性。取决于使用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变化。对于任何用于本发明的方法中的化合物而言，可以根据细胞培养分析初步估计治疗有效剂量。可以将剂量配制到动物模型中，从而达到化合物或(如果合适的话)靶序列的多肽产物(例如实现多肽浓度的降低)的循环血浆浓度范围，包括在细胞培养中确定的IC50(即达到半数最大症状抑制的测试化合物的浓度)。这些信息可用于精确确定对人有用的剂量。可以通过例如高效液相色谱来测量血浆中的水平。
除了上述单独给药或者组合给药，本发明的dsRNA还可以与其它已知有效治疗HPV感染介导的病理过程的药物联合给药。在任何情况下，医生可以根据使用本领域已知或此处描述的有效性的标准测量获得的结果来调节dsRNA给药的量和时间。
使用与确定优选的单个dsRNA相同的方法在体外和体内测试dsRNA的组合。可以仅仅基于生物信息学来选择这些组合，其中，选择能够覆盖最宽的基因型范围的最小数量的siRNA。或者，可以按照此处对于单个dsRNA试剂所述，基于体外或体内评价来选择这些组合。用于测试dsRNA组合的优选的分析是评价在HPV 16阳性癌细胞系中(例如SiHa或Caski，例如在Hengstermann等人(2005)Journal Vir.79(14)：9296；和Butz等人(2003)Oncogene 22：5938中描述)或者在器官型培养系统中(例如在Jeon等人(1995)JournalVir.69(5)：2989中描述)的siRNA介导的HPV靶基因抑制(knockdown)的表型结果。
本发明人已经确定了某些优选的可用于治疗HPV感染的dsRNA组合。最一般地来说，dsRNA的组合包含多于一种选自表1的dsRNA。因此，本发明涉及选自表1的2、3、4、5或更多种dsRNA双链体在联合治疗中的应用。原则上，为了简化治疗产品，最小数量的dsRNA是优选的。这就促使dsRNA的选择包含最大数量的有害或潜在有害的HPV基因型，并且事实上可以证明组合的选择无需包括所有这些HPV基因型。
治疗由HPV感染引起的疾病的方法
此处所描述的方法和组合物可用于治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病和病症，该疾病和病症可能是临床或亚临床乳头瘤病毒感染的结果。这些疾病和病症在此有时也被称为“HPV相关病症”或“由HPV感染介导的病理过程”，包括例如上皮恶性肿瘤、皮肤癌(非黑素瘤或黑素瘤)、肛门生殖器恶性肿瘤(例如子宫颈癌)、HPV相关癌前病变(包括LSIL或HSIL子宫颈组织)、肛门癌、恶性病变、良性病变、乳头状瘤、乳头状腺囊瘤、神经性乳头瘤、乳头状瘤病、皮肤和粘膜乳头瘤、湿疣、成纤维细胞瘤和其它与乳头瘤病毒相关的病理状况。
例如，此处所描述的组合物可用于治疗由HPV引起的疣。这样的疣包括例如普通疣(寻常疣)，例如手掌疣、跖疣、甲周疣；扁平疣和丝状疣；肛门、口腔、咽、喉和舌乳头状瘤；性病湿疣(尖锐湿疣)也称为生殖器疣(例如阴茎、外阴、阴道和子宫颈疣)，是最严重的HPV感染表现之一。HPV DNA可在所有级别的子宫颈上皮内肿瘤(CIN I-III)中发现，HPV类型的特定亚组可在子宫颈的原位癌中发现。因此，患有生殖器疣、携带特定的HPV类型的女性被认为具有发展成为子宫颈癌的高风险。
最常见的与乳头瘤病毒感染相关的疾病为良性皮肤疣或普通疣。普通疣通常包含1、2、3、4或10型HPV。其它的由乳头瘤病毒引起的病症包括例如喉乳头状瘤，这是一种良性的喉上皮肿瘤。乳头瘤病毒HPV-6和HPV-11为与喉乳头状瘤相关的最常见的两种类型。此处所描述的组合物可用于治疗这些疾病和病症。
在此描述的组合物也可用于治疗疣状表皮发育不良(EV)，这是一种罕见的遗传转播疾病，其特征在于散布着小的红色斑点的扁平疣。
此外，在此描述的组合物可用于治疗以HPV作为病原的、由细胞转化引起的病变，例如，用于治疗子宫颈癌。
此处所描述的组合物还可用于治疗HPV诱导的发育异常，例如阴茎、外阴、子宫颈、阴道、口、肛门和咽发育异常，和治疗HPV诱导的癌症，例如阴茎、外阴、子宫颈、阴道、肛门、口腔、咽和头颈癌。
本发明还可以通过包括特定的dsRNA与另一种抗癌化疗剂例如任何常规的化疗剂联合来实施。特定的结合剂与其它药物的联合使用可以加强化疗方案。本领域的技术人员还可以想到能够向本发明的方法中加入的许多化疗方案。可以使用任何化疗剂，包括烷化剂、抗代谢物、激素和拮抗剂、放射性同位素和天然产物。例如，本发明的化合物可与抗生素(如阿霉素)和其它蒽环类类似物、氮芥(例如环磷酰胺)、嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶)、顺铂、羟脲、紫杉醇及其天然和合成衍生物等一起给药。作为另一个例子，对于混合型肿瘤，例如乳腺的腺癌，其中，肿瘤包含依赖促性腺激素的和不依赖促性腺激素的细胞，该化合物可与亮丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽类似物)共同给药。其它的抗肿瘤方案包括使用四环素化合物和其它的治疗方式，例如手术、放射等，在此也被称为“辅助抗癌方式”。因此，本发明的方法可与这样的常规治疗联合使用，具有降低副作用和提高有效性的优点。
在另一个替代方案中，靶向E6AP的dsRNA可用于治疗神经障碍和行为异常。通过确定患有Angelman综合征的患者中的E6AP突变，发现E6AP与神经障碍和行为异常相关。Angelman综合征(AS)为一种特别的神经行为异常，其特征在于智力迟钝、失语、过笑、癫痫发作、共济失调和特有的EEG模式(Hitchins，M.P.等人2004.Am J Med Genet A.125(2)：167-72)。推测诱导这种状况不是治疗的意图；相反，正如在许多遗传性缺陷中观察到的一样，E6AP在神经和行为状况中具有关键作用的这种证据也表明了该靶标在人类病理学中可能具有多种作用，并且可能是这一类别的其它疾病的合适靶标，在这一类疾病中，E6AP的沉默化将会弥补其它生化缺陷或疾病。此处所使用的“E6AP相关病症”包括上述HPV相关病症和其它的神经和行为异常。
抑制E6AP基因表达的方法
另一方面，本发明提供了抑制哺乳动物中E6AP基因的表达的方法。该方法包括给哺乳动物施用本发明表1中的组合物，以使靶基因E6AP的表达沉默化。由于它们的高特异性，本发明这些dsRNA特异性地针对靶基因E6AP的RNA(初级的或处理的)。使用这些dsRNA抑制这些E6AP基因表达的组合物和方法可如本文其它部分所述实现。
在一个实施方案中，此方法包括施用包含dsRNA的组合物，其中该dsRNA包含与将要治疗的哺乳动物的E6AP基因RNA转录物至少一部分互补的核苷酸序列。当被治疗的生物体是如人类的哺乳动物时，该组合物可以使用本领域内公知的任何方式给药，包括但不限于口服或者肠胃外途径，包括静脉内、肌肉内、皮下、经皮、呼吸道(气溶胶)、经鼻、直肠、阴道以及局部(包括口腔和舌下)给药。在优选的实施方案中，该组合物通过局部/阴道给药或者静脉输液或注射给药。
除非另外指出，此处所用的所有技术和科技术语的含义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。尽管与此处的描述相似或等同的方法和材料也可用于实施或测试本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。在此提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献在此全文引入作为参考。如果存在冲突，以本说明书(包括定义部分)为准。此外，材料、方法和实施例仅为示例性的，并不意于局限本发明。
实施例
E6AP基因的基因步移(walking)
设计siRNA以鉴定靶向人遍在蛋白连接酶E3A(ube3A，还被称为E6AP)的siRNA。使用代表不同同工型的人E6AP mRNA序列(NM_130838.1，NM_130839.1，NM_000462.2)。
对所有人E6AP同工型应用BioEdit软件的ClustalW多重序列对比功能(Thompson J.D.，等人，Nucleic Acids Res.1994，22：4673)以确定mRNA序列NM 130838.1为最短的序列，同时证实了参考序列的位点5至4491(末端位点)的序列保守性，这是所有E6AP同工型有效靶向的条件。
确定了横跨E6AP参考序列NM 130838.1的所有可能的重叠19聚体(代表siRNA有义链序列)，得到4473种19聚体的候选序列。综合起来，这些候选靶序列覆盖了E6AP mRNA的5′UTR、编码区和3′UTR域，以及这些域的连接位点。
为了从候选序列的集合中排序和选择siRNA，预测的与无关靶标相互作用的可能性(脱靶可能性(off-target potential))被作为排序参数。具有低的脱靶可能性的siRNAs被确定为优选的，并且假定更具有体内特异性。
为了预测siRNA特异性的脱靶可能性，做出以下假设：
1)在链的2至9位(从5′至3′)(种子区域)与靶基因的互补性可能足以让该链与从该靶基因转录的mRNA发生相互作用以及随后的表达下调(Jackson AL，等人Nat Biotechnol.2003Jun；21(6)：635-7)。
2)每条链的1到19位与脱靶相互作用无关
3)种子区域对脱靶可能性的贡献可能大于其他序列
4)一条链的切割位点区域位置10和11(从5′至3′)对于脱靶可能性的贡献可能比位于切割位点3′的序列(非种子区域)的贡献大，但是没有种子区域的贡献大
5)考虑假设1到4，基于siRNA链序列与基因序列的互补性以及错配的位置，可以计算每个基因和每条链的脱靶得分
6)假设有义链活性可能被引入的内部修饰消除，只有反义链的脱靶可能性是相关的
7)siRNA的脱靶可能性可以从根据我们的标准表现出最高同源性的基因(最佳脱靶基因)来推断，因此可以表示为与相应基因的脱靶得分
为了确定潜在的脱靶基因，将19聚体反义链序列对可公开获得的人mRNA序列进行同源性检索。基于这个目的，使用所有的19聚体候选反义序列对人RefSeq数据库进行FastA(3.4版本)检索。使用Perl脚本(script)从候选19聚体序列中产生反义序列(perl脚本2)。为了在19聚体的全长上考虑同源性，并格式化适合于下一步脚本分析的输出，使用参数/数值对-g 30-f 30-L-i-H执行FastA检索。此检索产生对于候选siRNA的可能的脱靶基因的列表。
进一步，FastA检索参数使用数值-E 15000，以使具有多于8个连续核碱基的数据库条目与19聚体有义链序列相同，这些有义链序列很有可能被转移到FastA输出文件，同时显示19聚体全长的同源性(参见假设1)。
为了确定最佳的脱靶基因及其脱靶得分，分析FastA输出文件。对每个可能的脱靶基因，提取每一个19聚体输入序列的以下脱靶性质：
种子区域中的错配数
非种子区域中的错配数
切割位点区域中的错配数
每种脱靶基因的脱靶得分计算如下：
(种子错配数乘以10)+(切割位点错配数乘以1.2)+非种子错配数
对每个输入19聚体序列提取最低脱靶得分，并连续写入输出文件，产生对应于输入19聚体序列的所有siRNA的脱靶得分列表。
为了产生siRNA排序，将脱靶得分输入结果表格。所有的siRNA最终根据脱靶得分按降序排列，并且从选择中排除在同一行中包含多于3个G的延伸的序列。
选择并分析了327个脱靶得分＞＝3的siRNA(表1)
Figure G2008800150389D00381
Figure G2008800150389D00391
Figure G2008800150389D00401
Figure G2008800150389D00411
Figure G2008800150389D00441
Figure G2008800150389D00451
Figure G2008800150389D00461
Figure G2008800150389D00471
Figure G2008800150389D00481
dsRNA合成
试剂来源
在此没有具体给出试剂的来源，这些试剂可以从任何分子生物学试剂供应商处获得，具有可应用于分子生物学的质量/纯度标准。
siRNA合成
单链RNA是应用Expedite 8909合成仪(Applied Biosystems，Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德国)以及可控孔度玻璃(CPG，
Figure G2008800150389D00491
Proligo Biochemie GmbH，汉堡，德国)作为固相支持体，以1微摩尔的规模通过固相合成产生的。分别使用相应的亚磷酰胺和2’-O-甲基亚磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH，汉堡，德国)通过固相合成产生RNA和含有2’-O-甲基核苷酸的RNA。应用例如记载于Current protocols in nucleic acid chemistry，Beaucage，S.L.等人(Ed rs.)，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，纽约，美国中的标准核苷亚氨基磷酸酯化学法，这些结构单元被添加到寡核糖核苷酸链的序列的所选位置上。通过用含Beaucage试剂(Chruachem Ltd，Glasgow，UK)的乙腈溶液(1％)代替碘氧化剂溶液，引入硫代磷酸连接。其它辅助试剂从Mallinckrodt Baker(Griesheim，德国)获得。
根据确定的操作步骤，使用阴离子交换HPLC进行寡核糖核苷酸粗品的脱保护以及纯化。使用分光光度计(DU 640B，BeckmanCoulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)测量相应RNA溶液在260nm波长下的紫外吸收，由此确定收率和浓度。双链RNA如下产生：将等摩尔的互补链溶液在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH 6.8；100mM氯化钠)中混合，在85-90℃水浴中加热3分钟，经3-4小时冷却至室温。退火的RNA溶液储存于-20℃直至使用。
为了合成3′-胆固醇-偶联的siRNA(在此称为-Chol-3′)，经过适当修饰的固相支持体用于RNA合成。该修饰的固相支持体如下制备：
2-氮杂丁-1，4-二甲酸二乙酯AA
Figure G2008800150389D00501
将4.7M氢氧化钠水溶液(50mL)加入搅拌的、冰冷的甘氨酸乙酯盐酸盐(32.19g，0.23mol)水溶液(50mL)中。接着，加入丙烯酸乙酯(23.1g，0.23mol)并在室温下搅拌混合物，直至由TLC确定反应完成。19小时后，使用二氯甲烷(3×100mL)将溶液分层。有机层用无水硫酸钠干燥、过滤并蒸发。残余物蒸馏生成AA(28.8g，61％)。
3-{乙氧羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB
Figure G2008800150389D00502
Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g，25.83mmol)溶于二氯甲烷(50mL)并用冰冷却。在0℃下，将二异丙基碳二亚胺(3.25g，3.99mL，25.83mmol)加入此溶液中。继而加入氮杂丁-1，4-二甲酸二乙酯(5g，24.6mmol)和二甲氨基吡啶(0.305g，2.5mmol)。待此溶液至室温，搅拌6小时。由TLC确定反应完成。反应混合物在真空下浓缩，并加入乙酸乙酯沉淀二异丙基尿素。过滤悬浮液。用5％盐酸水溶液、5％碳酸氢钠及水洗涤滤过物。合并有机层，用硫酸钠干燥并浓缩成粗产物，粗产物用柱色谱法纯化(50％EtOAC/己烷)，得到AB 11.87g(88％)。
3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC
在0℃下，将3-{乙氧羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解于含20％哌啶的二甲基甲酰胺中。继续搅拌溶液1小时。反应混合物真空浓缩，加水至残留物中，产物用乙酸乙酯萃取。粗产物通过转化成其盐酸盐纯化。
3-({6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰基}乙氧羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD
Figure G2008800150389D00512
3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的盐酸盐(4.7g，14.8mmol)吸收于二氯甲烷中。悬浮液用冰冷却至0℃。二异丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)加入此悬浮液中。向得到的溶液中加入胆固醇氯甲酸酯(6.675g，14.8mmol)。搅拌反应混合物过夜。用二氯甲烷稀释反应混合物，并用10％盐酸溶液清洗。产物通过急骤色谱法纯化(10.3g，92％)。
1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰基}-4-氧代-吡咯-3-甲酸乙酯AE
Figure G2008800150389D00521
将叔丁醇钾(1.1g，9.8mmol)在30mL干甲苯中成浆。混合物用冰冷却至0℃，20分钟内边搅拌边缓慢加入5g(6.6mmol)二酯AD。添加过程中，温度保持在5℃以下。继续在0℃搅拌30分钟，加入1mL冰醋酸后立即加入溶于40mL水的4g  NaH2PO4.H2O。产生的混合物用每次100mL二氯甲烷萃取两次，合并有机层，用每次10mL磷酸盐缓冲液清洗两次，干燥，蒸发至干。剩余物溶于60mL甲苯，冷却至0℃，用三份50mL的冷pH 9.5碳酸盐缓冲液萃取。用磷酸调节水提取物至pH 3，用五份40mL的氯仿萃取，合并，干燥，蒸发至干。剩余物用柱色谱法纯化(使用25％乙酸乙酯/己烷)，生成1.9g b-酮酯(39％)。
[6-(3-羟基-4-羟甲基-吡咯烷-1-基)-6-氧代-己基]-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3基酯AF
1小时内，将甲醇(2mL)逐滴加入回流的b-酮酯AE(1.5g，2.2mmol)与硼氢化钠(0.226g，6mmol)在四氢呋喃(10mL)中的混合物中。在回流温度下继续搅拌1小时。冷却至室温后，加入1N HCl(12.5mL)，混合物用乙酸乙酯萃取(3×40mL)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，并真空浓缩，产物用柱色谱法纯化(10％MeOH/CHCl3)(89％)。
(6-{3-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羟基-吡咯-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3基酯AG
Figure G2008800150389D00531
二醇AF(1.25g 1.994mmol)通过在真空下与吡啶(2×5mL)蒸发干燥。边搅拌边加入无水吡啶(10mL)和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g，2.13mmol)。室温反应过夜。加入甲醇终止反应。反应混合物真空浓缩，向剩余物中加入二氯甲烷(50mL)。有机层用1M的碳酸氢钠水溶液清洗。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残余的吡啶通过与甲苯蒸发而除去。粗产物用柱色谱法(2％甲醇/氯仿，Rf＝0.5，在5％甲醇/氯仿中)纯化(1.75g，95％)。
琥珀酸单(4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰基}-吡咯-3-基)酯AH
化合物AG(1.0g，1.05mmol)与琥珀酸酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmol)混合，于40℃过夜真空干燥。将混合物溶解于无水二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，并在氩气氛下室温搅拌16小时。然后用二氯甲烷(40mL)稀释，用冰冷柠檬酸水溶液(5wt％，30mL)以及水(2×20mL)清洗。用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩至干。剩余物用于下一步反应。
胆固醇衍生化的CPG AI
Figure G2008800150389D00542
将琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶于二氯甲烷/乙腈(3∶2，3mL)混合物中。在此溶液中依次加入DMAP(0.0296g，0.242mmol)的乙腈(1.25mL)溶液、2，2′-二硫-双(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)的乙腈/二氯甲烷(3∶1，1.25mL)溶液。在所生成的溶液中再加入溶于乙腈(0.6ml)的三苯基膦(0.064g，0.242mmol)溶液。反应混合物变为鲜桔色。溶液用机械腕摇床短暂摇动(5mins)。加入长链烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。将悬浮液摇动2小时。用烧结漏斗过滤CPG，并依次用乙腈、二氯甲烷和乙醚清洗。未反应的氨基用乙酸酐/吡啶掩蔽(masked)。获得的CPG的载量通过进行紫外测量而确定(37mM/g)。
含有5′-12-月桂酸双癸基酰胺基团(在此称为″5′-C32-″)或者5′-胆固醇衍生基团(在此称为″5′-Chol-″)的siRNAs按照WO2004/065601所述合成，不同之处是对于胆固醇衍生物，为了在核酸寡聚体的5′端引入硫代磷酸连接，氧化步骤使用Beaucage试剂完成。
dsRNA表达载体
在本发明的另一方面，调控E6AP基因表达活性的E6AP特异性dsRNA分子由插入DNA或RNA载体内的转录单元表达(参见例如，Couture，A，等人，TIG.(1996)，12：5-10；Skillern，A.，等人，国际PCT公布WO 00/22113，Conrad，国际PCT公布WO 00/22114，和Conrad，美国专利6,054,299)。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，它们可以并入宿主基因组并作为整合至宿主基因组中的转基因遗传。这些转基因也可以构建为允许作为染色体外质粒遗传(Gassmann，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
dsRNA的各链可由位于两个分别的表达载体上的启动子转录并且共转染进一个靶细胞内。或者，dsRNA的各链可以由均位于同一个表达质粒上的启动子转录。在一个优选实施方案中，dsRNA表达为通过连接体多核苷酸序列连接的反向重复，使得dsRNA具有茎环结构。
重组dsRNA表达载体通常是DNA质粒或者病毒载体。表达dsRNA的病毒载体可以基于但不限于腺相关病毒(综述见Muzyczka，等人，Curr.Topics Micro.Immunol.(1992)158：97-129))、腺病毒(见，例如，Berkner，等人，BioTechniques(1998)6：616)，Rosenfeld等人(1991，Science 252：431-434)，和Rosenfeld等人(1992)，Cell68：143-155))或α病毒以及本领域已知的其他病毒进行构建。逆转录病毒已被用于在体内和/或在体外将多种基因引入许多不同的细胞型中，包括上皮细胞(见，例如，Eglitis，等人，Science(1985)230：1395-1398；Danos和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)85：6460-6464；Wilson等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：3014-3018；Armentano等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6141-6145；Huber等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8039-8043；Ferry等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8377-8381；Chowdhury等人，1991，Science 254：1802-1805；vanBeusechem.等人，1992，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89：7640-19；Kay等人，1992，Human Gene Therapy 3：641-647；Dai等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895；Hwu等人，1993，J.Immunol.150：4104-4115；美国专利4,868,116；美国专利4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO 92/07573)。可以通过将重组逆转录病毒基因组转染至合适的包装细胞系，例如PA317和Psi-CRIP(Comette等人，1991，Human Gene Therapy 2：5-10；Cone等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349)，来产生能够转导和表达插入细胞基因组的基因的重组逆转录病毒载体。重组逆转录病毒载体可用于感染易感宿主(如大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织(Hsu等人，1992，J.Infectious Disease，166：769)，同时具有感染无需有丝分裂活跃细胞的优点。
在本发明的DNA质粒或病毒载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I(如核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(如CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或U1snRNA启动子)，或者一般的RNA聚合酶III启动子(如U6snRNA或7SK RNA启动子)，或原核启动子，比如T7启动子，只要该表达质粒也编码由T7启动子转录所需的T7RNA聚合酶。该启动子也可以将转基因表达引导至胰腺(参见，例如，胰腺内的胰岛素调控序列(Bucchini等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2511-2515))。
另外，转基因的表达可被精确调控，比如，使用诱导型调控序列和表达体系，比如对特定生理调节因素(如循环葡萄糖水平或者激素(Docherty等人，1994，FASEB J.8：20-24)敏感的调节序列。这些适用于控制转基因在细胞或者哺乳动物中表达的诱导型表达体系包括由蜕皮素、雌激素、孕酮、四环素、二聚化化学诱导剂以及异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(EPTG)的调控。本领域技术人员能够根据dsRNA转基因的预期用途选择合适的调节/启动子序列。
一般来讲，能够表达dsRNA分子的重组载体如下所述递送，并且保持在靶细胞中。或者，可以使用提供dsRNA分子的瞬时表达的病毒载体。这些载体可根据需要重复使用。一旦被表达，dsRNA就结合在靶RNA上，并且调节其功能或者表达。表达dsRNA的载体可以系统递送，例如通过静脉内或者肌肉内施用，通过向从患者中外植出的靶细胞施用并随后重新引入患者体内，也可通过允许引入所需的靶细胞内的其他任何方法。
dsRNA表达DNA质粒通常是作为与阳离子脂质载体(如Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(如Transit-TKOTM)的复合物而被转染至靶细胞内。本发明也涉及在一周或者更长时间内针对单个E6AP基因或者多个E6AP基因不同区域的dsRNA介导的抑制的多脂质转染。本发明的载体向宿主细胞内的成功引入可以通过各种已知方法进行监控。比如，瞬时转染可以用报告子作为信号，比如荧光标记，如绿色荧光蛋白(GFP)。离体细胞的稳定转染可以使用给转染细胞提供对特定环境因素(如抗生素和药物)的抗性(如潮霉素B抗性)的标记来确定。
E6AP特异的sRNA分子也可以插入载体中，并作为应用于人类患者的基因治疗载体。基因治疗载体可以通过如静脉注射、局部给药(见美国专利5,328,470)或者立体定向注射(参见，例如Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)给予受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含包埋基因递送载体的缓释基质。可选择地，当完整基因递送载体(如逆转录病毒载体)可由重组细胞完整地产生时，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一个或者多个细胞。
在HCT-116细胞中的E6AP siRNA筛选
HCT-116细胞从DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)(Braunschweig，Germany，cat.No.ACC 581)得到，在37℃和5％CO2气氛的潮湿温箱中，在添加了10％胎牛血清(FCS)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml及2mML-谷氨酰胺的McCoys(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.F1015)培养基中进行培养。
对于siRNA的转染，将HCT-116细胞以2.0×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上并立即转染。按供应商提供的方法，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行siRNA转染(对于单剂量筛选为30nM和3nM)。
转染后24小时将HCT-116细胞裂解，按照标准方案、使用Quantigene Explore试剂盒(Panomics，Inc.(Fremont，CA)(以前为Genospectra，Inc.))定量测定E6AP mRNA的表达水平。E6AP mRNA水平针对GAP-DH mRNA进行标准化。每一个siRNA采集四个单独的数据点。使用与E6AP基因不相关的siRNA双链体作为对照。特定E6AP特异性siRNA双链体的活性表示为处理细胞中的E6APmRNA浓度相对于用对照siRNA双链体处理的细胞中的E6APmRNA浓度的百分比。
下面的表2给出了结果。确定了许多靶向E6AP基因的活性siRNA分子。
表2靶向E6AP的dsRNA的活性。
Figure G2008800150389D00591
Figure G2008800150389D00601
Figure G2008800150389D00611
Figure G2008800150389D00621
本领域技术人员熟悉本说明书中具体公开的方法和组合物以及其它方法和组合物，从而能够在随后所附的权利要求书的全部范围内实施本发明。

Claims (24)

1.一种抑制细胞中人E6AP基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中，所述dsRNA包含至少两种相互互补的序列，其中，有义链包含第一序列，反义链包括包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的互补区的第二序列，其中，所述互补区的长度小于30个核苷酸，其中，一旦所述dsRNA与表达所述E6AP的细胞相接触，会抑制所述E6AP基因的表达至少40％。
2.根据权利要求1所述的dsRNA，其中，所述第一序列选自表1，所述第二序列选自表1。
3.根据权利要求1所述的dsRNA，其中，所述dsRNA包含至少一种修饰的核苷酸。
4.根据权利要求2所述的dsRNA，其中，所述dsRNA包含至少一种修饰的核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述修饰的核苷酸选自：2’-O-甲基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸基团的核苷酸和与胆甾醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺连接的末端核苷酸。
6.根据权利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述修饰的核苷酸选自：2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
7.根据权利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述第一序列选自表1，所述第二序列选自表1。
8.根据权利要求6或7所述的dsRNA，其中，所述第一序列选自表1，所述第二序列选自表1。
9.一种包含权利要求1所述的dsRNA的细胞。
10.一种用于抑制生物体中E6AP基因表达的药物组合物，包含dsRNA和药学上可接受的载体，其中，dsRNA包含至少两种相互互补的序列，其中，有义链包含第一序列，反义链包括包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的互补区的第二序列，其中，所述互补区的长度小于30个核苷酸，其中，一旦所述dsRNA与表达所述E6AP的细胞相接触，会抑制所述E6AP基因的表达至少20％。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述dsRNA的所述第一序列选自表1，所述dsRNA的所述第二序列选自表1。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述dsRNA的所述第一序列选自表1，所述dsRNA的所述第二序列选自表1。
13.一种抑制细胞中E6AP基因表达的方法，该方法包括：
(a)将双链核糖核酸(dsRNA)导入细胞，其中，该dsRNA包含至少两种相互互补的序列，其中，有义链包含第一序列，反义链包括包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的互补区的第二序列，其中，所述互补区的长度小于30个核苷酸，其中，一旦所述dsRNA与表达所述E6AP的细胞相接触，会抑制所述E6AP基因的表达至少40％；和
(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段足以获得E6AP基因的mRNA转录物的降解的时间，从而抑制细胞中E6AP基因的表达。
14.一种治疗、预防或控制HPV感染介导的病理过程的方法，包括给予需要这种治疗、预防或控制的患者治疗或预防有效量的dsRNA，其中，该dsRNA包含至少两种相互互补的序列，其中，有义链包含第一序列，反义链包括包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的互补区的第二序列，其中，所述互补区的长度小于30个核苷酸，其中，一旦所述dsRNA与表达所述E6AP的细胞相接触，会抑制所述E6AP基因的表达至少40％。
15.一种抑制细胞中E6AP基因表达的载体，所述载体包含与编码dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操作地连接的调控序列，其中，所述dsRNA的一条链与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补，其中，所述dsRNA的长度小于30个碱基对，其中，一旦所述dsRNA与表达所述E6AP的细胞相接触，会抑制所述E6AP基因的表达至少40％。
16.一种包含权利要求16所述的载体的细胞。
17.一种用于降低细胞中人E6AP基因表达水平的双链核糖核酸(dsRNA)，其中，所述dsRNA包含至少两种相互互补的序列，其中，有义链包含第一序列，反义链包括包含与编码E6AP的mRNA的至少一部分基本互补的互补区的第二序列，其中，一旦所述dsRNA与表达所述E6AP的细胞相接触，会降低所述E6AP基因的表达水平。
18.根据权利要求17所述的dsRNA，其中，所述接触降低了所述E6AP基因的表达水平至少40％。
19.根据权利要求17所述的dsRNA，其中，所述接触以30nM或更低的浓度在体外进行。
20.一种用于降低生物体中E6AP基因表达水平的药物组合物，包含权利要求17所述的dsRNA和药学上可接受的载体。
21.一种治疗HPV相关病症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求17所述的dsRNA。
22.一种治疗E6AP相关病症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求17所述的dsRNA。
23.一种药物组合物，包含至少两种选自权利要求2所述的dsRNA中的dsRNA。
24.一种治疗HPV相关病症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求23所述的药物组合物。
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