TW200844110A - Diagnosis and treatment of alzheimer's disease and other neurodementing diseases - Google Patents

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Richard Dodel
Michael Bacher
Michael Przybylski
Raluca Stefanescu
Marilena Manea
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Univ Marburg Philipps
Univ Konstanz
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Description

200844110 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於阿茲海默氏症及其他神經性失智疾病之診 斷及治療。 本申請案主張以下的優先權·· 2007年1月丨丨曰申請之美國臨 時申請案第60/884,513號、2007年1月U曰申請之美國臨時申 請案第60/884,526號、2007年10月22曰申請之美國臨時申請案 第60/981,667號、2007年10月22日申請之美國臨時申請案第 (60/981，675號、2007年1月11曰申請之歐洲專利申請案第 07000507.9號、2007年1月11日申請之歐洲專利申請案第 07000521.0號、2007年10月22日申請之歐洲專利申請案第 07119002.9號、2007年10月22日申請之歐洲專利申請案第 07119026.8號，該等案件之全文以引用的方式併入本文中。 【先前技術】 老年群體中癡呆之最常見形式，阿茲海默氏症（AD)(流 r 行率：1000/100,000 ; >65歲）為發達國家中死亡之第四大 L/誘因。皮質萎縮、神經元喪失、區域特異性殿粉樣蛋白沈 積、神經炎斑塊及神經原纖維纏結為AD腦中之主要神經 病理學特徵。認為此等改變與臨床上定義AD之認知衰退 相關聯。在此等標諸内，神經炎斑塊為殿粉樣蛋白免疫反 應性、硫代黃素（thioflavin)陽性、且伴隨有星形膠質細胞 增生、小神經膠質細胞增生、細胞支架改變及突觸喪失。 斑塊内之神經炎退化程度與癡呆之臨床參數相關。神經炎 斑塊為通常以中等至較大數量見於AD腦之邊緣結構及相 128311.doc 200844110 關新皮質中之球形多細胞病灶。此等斑塊包含包括大量與 非原纖維形式之狀互混之殿粉樣蛋白原纖維的澱粉樣蛋 白-β肽（Αβ)之胞外沈積物。該等斑塊亦含有可變數量之通 常位於極接近原纖維殿粉樣蛋白核心處之活化微神經膠質 細胞’以及環繞該核心之反應性星形膠質細胞。 神經炎斑塊之主要組份，即β_澱粉樣蛋白多肽（Αβ)係產 生自車父大鈾驅蛋白，即滿t粉樣蛋白前驅蛋白（App)(Kang等 人，1987 ; Tanzi等人，1987)。Αβ係由正常細胞產生且可 ( 作為健康人類血漿及腦脊髓液（CSF)中之循環肽而偵測。 儘管未完全瞭解澱粉樣蛋白前驅蛋白（Αρρ)於腦中之生理 作用’但ΑΡΡ之言吳義突變賦予八咐綱之常染色體顯性遺 傳且闡明了可能重要之發病機制。認為神經炎斑塊（屍體 剖檢中滿足確診AD之神經病理學標準之結構）中Ap(App之 39_42胺基酸蛋白水解產物）之積聚為疾病進展之原因。 APP之主要Αβ裂解產物為Αβ〇_42)多肽’但。端^今至^較 i 短之A»3肽亦係藉由膜中之蛋白水解（γ-分泌酶）裂解產生。 Αβ(1-42)之Ν端部分限定於Αρρ之胞外區中，且Αβ肽之主 要C端部分含於跨膜域内。 與fad相關之ΑΡΡ中之誤義突變發生於Αβ域附近且致使 4 kDa Αβ肽產生之增加。在AD中已假設^之合成增加 及/或π除減少可導致澱粉樣蛋白斑塊沈積且隨後導致與 疾病相關之神經病理學改變。使用合成娜之活體外研究 中展示神經毒性取決於為原纖維狀且主要為β摺疊片構型 之Αβ 〇 1283 II.doc 200844110 含有β’粉樣蛋白前驅蛋白（App)之神經毒性殺粉樣蛋 片4又（Αβ)作為主要產物之胞外斑塊積聚為阿茲海默氏 症（AD)之特徵之一。儘管將ΑΡΡ認作AD之關鍵分子，但 APP之分子（病理降解）生理降解及蛋白水解路徑，及肽 之細胞相互作用及生物化學結果仍不清楚。儘管缺少關於 Αβ所竹生之斑塊之形成及沈積的降解路徑及細胞轉運之詳 細描述，但對開發基於由Ap(1_42)m產生之具有治療活性 的抗體之AD免疫法的最近研究已在阿茲海默氏症之轉殖 基因小鼠模型中取得了初步成功。若干報導已表明藉由以 Αβ(1-42)免疫所產生之抗體能夠藉由分解Αρ原纖維來抑制 Αβ斑塊之形成，且改善小鼠空間記憶之損害。轉殖基因 APPV717F小鼠（TG小鼠）為具有年齡及區域相關Α(3(1_4〇) 及Αβ( 1-42)沈積物之得以良好表徵的AD樣斑塊病理學模型 (Games等人，1995)。最近，Schenk等人及其他人研究在 以預凝集Αβ(1-42)免疫或投與對抗Αβ之抗體後Αρρν717ρ TG小鼠體内Αβ沈積之改變（Bard等人，2000 ; Schenk等 人，1999)。Αβ抗體之免疫及投與顯著削弱澱粉樣蛋白斑 塊沈積、神經炎營養不良及星形膠質細胞增生。在此等研 究中，小鼠抗人類Αβ抗體力價增加為所觀測之斑塊負荷降 低所必需。此等發現增加了 Αβ抗原形成及清除之可能性： 抗體複合物可在中樞神經系統内之抗體產生後或藉由外周 抗體跨過血腦障壁（ΒΒΒ)轉運來減少腦Αβ沈積。此外，被 動免疫似乎藉由改變CNS與血漿之間的Αβ平衡來降低腦Αβ 負荷（DeMattos等人，200 1)。值得注意的是，主動或被動 128311.doc 200844110 免疫顯著逆轉APPV717F小鼠或其他APP轉殖基因小鼠之 订為及記憶損害（Dodart等人，2002 ; Janus等人，2000 ; Morgan等人，2000)。此等結果顯示免疫可能藉由改變可 /谷Α β心a物來預防§己憶缺失。因此，以主動或被動免疫來 治療AD患者為以Αβ肽之產生、清除及凝集為標靶之若干 新興治療方法中之一種。 基於此等結果，開始使用主動免疫程序[Αβ(1-42)肽及/ 或其預凝集體；佐劑：QS21]之臨床試驗來治療患有確定 AD之患者。不幸地是，產生嚴重副作用（，，腦膜腦炎，，），且 停止臨床試驗。分析在此臨床試驗中以主動免疫治療之 AD患者子群（n=30)(Hock等人，2002 ; Hock等人，2003)。 作者證明⑴免疫誘導對抗Αβ(1_42)之抗體的產生，及（Η)在 可觀測到抗體產生之患者體内認知衰退與未經治療之對照 組相比得以顯著減輕。作者推斷免疫可為Ad之治療選 擇。 隶近之研究更詳細地闡明以Αβ(1-42)免疫後產生之抗體 之辨硪特性。此作用引起由轉殖基因AD小鼠體内所產生 之抗體所辨識的特異性Αβ抗原決定基之鑑別（McLaurin等 人，2002 ; Przybylski等人，2003)。已藉由使用選擇性蛋 白水解切除技術（抗原決定基—切除）組合高解析度質譜法 (FTICR-MS)作為具有鑑別抗原決定基之高敏感性及特異性 的生物分析工具來獲得此等結果（Macht等人1996 ; Suckau 等人1992 ; Macht等人2004 ;參見圖1，2)。使用經固定Αβ 抗原免疫複合物之質譜抗原決定基切除，鑑別抗原決定基 128311.doc 200844110 由Αβ(1-42)之殘基（4-10) (FRHDSGY)組成。此辨識結構之 選擇性係藉由闡明來自AD斑塊之相同抗原決定基，來自 Αβ-基原纖維之Αβ(1-42)萃取物，化學合成之Αβ(1-42)及其 他包含Ν端Αβ序列之（Αβ不相關）多肽來確定（przybylski等 人2003)。 天然產生之抗Αβ自體抗體（Αβ自體抗體）係由Du等人於 來自未經免疫之人類之血液及CSF中鑑別（Du等人， 2001)。如免疫沈澱（Du等人，2〇〇1)&ELISA所展示，此等 抗體特異性辨識人類Αβ。此外，該等抗體易於辨識沈積於 PDAPP轉殖基因小鼠腦中之合成Αβ(ΐ-40)以及人類Αβ。此 外’在Αβ自體抗體存在下降低Αβ肽之原纖化/低聚合及神 經毒性（Du等人，2003)。 此外’已研究患有阿茲海默氏症之患者體内Αβ自體抗體 濃度與對照組相比是否存在差異。有趣的是，發現兩組之 間的顯著差異，致使患有阿茲海默氏症之患者體内對抗Αβ 之抗體力價實質性降低（大約15_2〇倍）。此等結果最近已經 其他小組證實（Weksler等人，2004)。對抗Αβ之抗體亦可於 市售靜脈内IgG製劑（IVIgG)中偵測。以此等靜脈内免疫球 蛋白製劑治療患有不同神經疾病之患者致使CSF中Αβ濃度 降低（Dodel等人，2002)。亦於幼年（4個月）ΑΡΡ轉殖基因 (TgCRND8)小鼠體内確立Αβ自體抗體預防Αβ斑塊沈積及 給予保護以免於Αβ斑塊沈積之實質效應。此外，在利用5 名患有AD之患者的預備試驗中，傳遞IVIgG之後總Αρ在 CSF中顯著降低且在血清中增加（D〇dei等人，2〇〇4)。在六 128311.doc -10 - 200844110 個月之觀測時段中，在所研究之五名患者中未觀測到認知 退化。此等結果已於包括8個以IVIgG治療之八〇患者之近 期預備試驗中得以證實（Relkin等人，2006)。 然而，向患有AD之患者投與IVIgG並不方便且與高成本 相關聯，因為治療性Αβ自體抗體之分數較低。此製劑中絕 大多數IgG並不具有Αβ特異性且可導致不合乎需要的效 應。此外，IVIgG之來源有限，鑒於患有阿茲海默氏症之 患者之流行率，其為不可接受之缺點。 偵測及監測AD及其他類似神經性失智疾病之進展之方 法並不足夠。目础AD診斷分為三組··⑴測定遺傳危險因 素或突變（主要用於fad情況，但不用於偶發性AD診斷）； (Π)神經成像法；及（iii)基於生物化學/生物標誌之診斷。 目W關於開發基於生物標誌之診斷程序之工作主要聚焦於 CSF，其主要缺點為該等方法需要精製侵襲性材料。與腦 所衍生之生物標誌相關之主要問題為臨床上所檢查之對照 t 物通常亦包括具有臨床前AD病理之患者。此外，目前可 用之生物標誌具有低特異性之主要缺點。已注意到於額葉 皮質中表現，由腦蛋白質組研究方法鑑別為由AD中假定 血腦障壁改變所產生之可能之腦生物標誌的一系列蛋白質 之類似缺點。 已主要藉由測定SP及NFT組份（例如Αβ肽，Αβ(1_4〇) (SEQ ID NO. 1)及Ap(1-42))(發現具有高含量）及高磷酸化 Tail蛋白來進行血漿及血清中生物標誌之研究。然而，認 為Αβ測定之特異性，及於早期及區別診斷中之應用為不確 128311.doc 200844110 疋的’已描述為已進展之神經退化的標誌之蛋白Tau測定 亦為相同情況。 因此’對治療及偵測諸如ad之神經性失智疾病之改良 方法存在需要。 【發明内容】 在一態樣中，提供分離單株人類抗β澱粉樣蛋白抗體， 其包含一個以上胺基酸序列，該等胺基酸序列係選自由下 € 列序列組成之群的至少兩個一致胺基酸序列：SEq ID no:
6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ m N〇· 10及SEQ ID MO: 11，其中該一個以上胺基酸序列 各自係來自不同SEQ ID NO，其中該抗體以比與單體形式 Αβ結合之親和力高之親和力與二聚形式Ap結合。 在一實施例中，抗體包含兩個以上胺基酸序列，該等胺 基S文序列係選自由下列序列組成之群的至少三個一致胺基 酉夂序列· SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、 I SEQ ID N0: 9、SEQ ID NO·· 10及 SEQ ID NO: 11，其中該 兩個以上胺基酸序列各自係來自不同SEQ ID N〇。在另一 只施例中’該抗體包含三個以上胺基酸序列，該等胺基酸 序列係選自由下列序列組成之群的至少四個一致胺基酸序 列· SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: l〇及 SEQ ID NO: 11，其中該三個 以上胺基酸序列各自係來自不同SEQ ID N〇。在另一實施 例中’該抗體包含四個以上胺基酸序列，該等胺基酸序列 係選自由下列序列組成之群的至少五個一致胺基酸序列： 128311 .doc 200844110 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID N〇：9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11，其中該四個以 上胺基酸序列各自係來自不同SEQ ID NO。在另一實施例 中，該抗體包含來自下列各一致胺基酸序列之胺基酸序 歹丨J : SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11。 在一實施例中，抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 45作為特定輕鏈CDR，分別 為CDR1、CDR2及CDR3，且包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 23 及 SEQ ID NO: 29作為特定重鏈CDR， 分別為CDR1、CDR2及CDR3，而在另一實施例中，抗體 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 53及SEQ ID NO: 60。在其他 實施例中，抗體包含胺基酸序列SEQ ID NOM45及SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 60、 SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 61 或 SEQ ID NO: 145及SEQ ID NO: 62。抗體亦可包含來自下列胺基酸 序列之CDR : SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NOM48、SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 61 或 SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 62。 128311.doc 13 200844110 在另一態樣中，抗體與包含Αβ(2 1-37)之肽結合，而在 另一態樣中，抗體遮蔽八0(21_37)殘基使其免於蛋白水解 消化。在另一態樣中，當抗體偶合至與NHS活化之胺基 己酸偶合之瓊脂糖時，該抗體與Αβ(12-40)或Αβ(20-37)特 異性結合，但不與Αβ(17-28)、Αρ(25_35)4Αρ(3ι_4〇)特異 性結合。 ^ 亦可將本發明之抗β澱粉樣蛋白抗體調配為醫藥組合 物。 在另一態樣中，預防或治療患者神經性失智疾病之方法 包含向該患者投與治療上可接受量之本發明抗^殿粉樣蛋 白抗體◊該等方法可用於預防或治療選自由阿兹海默氏 症、唐氏症候群（D〇wn's Syndrome)、路易體型癡呆 (dementia with Lewy bodies)、額顳葉型癡呆（frontotemporal dementia)、 澱粉樣腦血 管病變 angiopathy)及澱粉樣變性病組成之群之神經性失智疾病。 在一較佳實施例中，神經失智疾病為阿茲海默氏症。 在另一實施例中，本發明之抗β澱粉樣蛋白抗體可用於 製造用以延緩或預防神經性失智疾病進展之藥劑。 在另一態樣中，提供偵測或量測患者神經性失智疾病進 展之方法，其包含（Α)量測來自該患者之樣本中對抗第— Αβ肽之抗體力價，其中第一 Αβ肽至少包含Αβ(3〇·37)之序 列且至多包含Αβ(12-40)之序列；（Β)量測來自該患者之樣 本中對抗第二Αβ肽之抗體力價，其中該第二八^肽至少包 含Αβ(4-1〇)之序列且至多包含Αβ(1，之序列；及（c)比較 128311.doc -14 - 200844110 來自步驟（A)與（B)之力價。太 . J刀1貝在—些實施例中，第—Αβ肽至
少包含續21·37)之序列H實施财，該方法另外 包含比較患者力價與所測定之正常及ad患者之力價，盆 中對抗第-Αβ肽之較高力價與阿兹海默氏症顯現及:或進 展之較低危險相關聯。該等方法亦可包含比較患者力價虚 ㈣^正常及AD患者之力價’其中相對於對抗第二Αβ 肽之力^對抗第-Αβ肽之較高力價與阿兹海默氏症顯現 及/或進展之較低危險相關聯。或者，該等方法可包含比 較患者力價與對正常及AD患者所測定之力價其中對抗 第二Αβ肽之較高力價與阿兹海默氏症顯現及/或進展之較 高危險相關聯。在另一實施例中，該等方法另外包含比較 患者^價與對正常及AD患者所敎之力冑，其中相對於 對抗第Αβ肽之力價，對抗第二狀之較高力價與阿兹 海默氏症顯現及/或進展之較高危險相關聯。 亦提供_或量測患者神經性失智疾病進展之方法，其 包含Α)於給定時間點自該患者獲得第—樣本；Β)在稍後時 間點自該患者獲得第二樣本；c)量測該等第—及第二樣本 中對抗至少包含AP(30-37)且至多包含Αβ(12-40)之抗原決 定基之抗體力價；及D)比較該等第一及第二樣本之力價。 其他該等方法包含Α)在給定時間點自該患者獲得第一樣 本，Β)在稍後時間點自該患者獲得第二樣本；C)量測該等 第一及第一樣本中對抗至少包含Αβ(4_1〇)且至多包含Αβ(卜 20)之抗原決定基之抗體力價；及D)比較該等第一及第二 樣本之力價。在其他實施例中，該等方法包含Α)於給定時 128311.doc -15- 200844110 間點自該患者獲得第一樣本；B)在稍後時間點自該患者獲 得第二樣本；c)量測該等第一及第二樣本中對抗包含 Αβ(30-37)之抗原決定基之抗體力價；及 D)比較該等第一及第二樣本之力價。 在另一態樣中，提供包含下列各物之套組：（Α)第一 Αβ 肽，其至少包含Αβ(30-37)之序列且至多包含Αβ(ΐ2_4〇)之 序列，及（Β)第二Αβ肽，其中該第二Αβ肽至少包含Αρ(4_ ( 10)之序列且至多包含Αβ(1-20)之序列。 以下圖式形成本發明說明書之—部分且包括該等圖式以 進一步展示本發明之某些態樣。參考此等圖式中之一或多 者、…a本文中所王現之特定實施例之詳述可更佳地理解本 發明。 【實施方式】 Αβ自體抗體係自AD患者及健康對照者之血清或混合之 市售血清免疫球蛋白（IVIgG)分離。測定重鏈及輕鏈可變 ( 區之cDNA及胺基酸序列，且於哺乳動物細胞中表現所有 可能之重鏈及輕鏈對。發現許多此等配對以比與Αβ單體結 合之親和力高之親和力與Αβ二聚體結合，且展示其中之一 者CSL純系7具有可能適用於治療AD之生物活性。本發明 者進一步發現抗Αβ(2 1-47)自體抗體之CDR具有高度同源 性。因此，測定一致CDR且將其用以製備適用於預防或治 療如AD之神經性失智疾病之人類抗p澱粉樣蛋白抗體。本 發明者亦令人驚訝地發現AD患者與健康對照者相比對抗 128311.doc -16- 200844110 Αβ(4-10)之抗體力價增加且對抗Αρ(2ι_37)之抗體力價降 低。因此’本發明者不僅發現用於偵測及量測如之神 經性失智疾病進展之方式，亦發現用於延遲Ad發作或進 展之方法。亦提供用於偵測及量測如ADi神經性失智疾 病進展之套組。 定義 本文所使用之術語”Αβ多肽”定義具有胺基酸序列SEQ m NO. 01之夕肽或其片段。該等片段特別包含具有序列 ID NO: 02之多肽。 本文所使用之術語”抗體”亦包含抗體衍生物及/或片段。 該等抗體衍生物或片段保持完整抗體之抗原結合特性，但 缺少完整抗體之一些序列，例如Fc域。該等衍生物或片段 之實例包括（但不限於）可經由分別以木瓜蛋白酶或胃蛋白 酶使抗體酶促消化而獲得之Fab4F(ab，）2片段、單鏈可變 片段（scFv)、Fv片段、微型抗體及雙功能抗體。 本文所使用之術語’，自體抗體”一般係指針對人體蛋白上 之抗原決定基且可見於未以各別抗原預先免疫之人類受檢 者血液或腦脊髓液中的抗體。同時，術語”抗Αβ(2ι_37)自 體抗體”係指與包含Ap(21-37)(SEQ ID NO: 2)之Αβ肽結合 且遮蔽該SEQ ID ΝΟ 2使其免於蛋白水解消化之自體2 體。該等抗自體抗體亦以比與對應八0單體結合 之親和力高之親和力與Αβ二聚體結合。 本文所使用之術語"CDR”係指互補判定區。通常可於抗 體輕鏈以及重鏈上之可變區中發現該等CDR區中之3 = 128311.doc -17· 200844110 (CDRl、CDR2、CDR3)。此六個高變區各自可促成抗體之 抗原特異性。然而，本文所使用之術語CDR不暗示所提及 之分子實際上為抗體。而認為該術語表示有助於本發明之 多肽與全長Αβ多肽（Αβ 1-40)之C端部分特異性結合，尤其 有助於與Αβ(2 1-3 7)多肽結合之序列。因此，經工程化以 與該抗原決定基結合之抗體衍生物或其他多肽亦可展現 CDR。 本文所使用之術語’’一致CDR’’係指藉由根據Kabat編號系 統對準兩個或兩個以上給定CDR序列所衍生之單一序列。 (參見 Kabat，Ε· A.，Wu，T. T·，Perry，Η· M·, Gottesman，K. S.&Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) NIH 出版號 91-3442 第 5 版及 R. Kontermann，S，Dtibel (編），Antibody Engineering; Springer Lab Manual Series; Springer，Heidelberg 2001，兩者均係以引用的方式併入本 文中）。因此，對於π—致CDR"之各胺基酸位置而言，測定 可於彼位置處出現之胺基酸一致性。根據Kabat編號來進 行CDR命名以及胺基酸插入。 術語’’雙功能抗體”係指具有兩個抗原結合位點之小抗體 片段，該等片段包含於同一多肽鏈（VH VL)中與輕鏈可變 域（VL)連接之重鏈可變域（VH)。藉由使用過短而不容許於 同一鏈上兩個結構域之間配對之連接子，迫使該等結構域 與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能 128311.doc -18- 200844110 抗體於（例如）EP 404,097、WO 93/11161中更充分描述。 本文所使用之術語”抗原決定基”或”抗原決定基肽” 一般 係指包含衍生自由特異性抗體結合之抗原之分子辨識肽序 列或結構的多肽。其為抗原為抗體所特異性辨識之免疫決 定基。抗原決定基可包含呈空間或不連續構型之至少5 個，較佳至少8個胺基酸。抗原決定基亦可包含多肽鏈之 單一區段，該區段包含最小長度為約5個胺基酸之連續線 性胺基酸序列。
nFv"為含有完全抗原辨識及結合位點之最小抗體片段。 此區域由緊密非共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可 變域之二聚體組成。在此構型中，各可變域之三個CDR相 互作用以界定VH VL二聚體表面上之抗原結合位點。六個 CDR共同賦予抗體以抗原結合特異性。 本文所使用之術語”部分”係指#有獨特功能之多狀部 分。該等部分可提供通常不存在於多肽其餘部分中之結構 或功能特徵或該特徵由此部分增強。該等功能或結構部分 可（例如）提供多肽之結合、穩定或偵測。該部分自身可為 多狀或可為向？肽提供所需功能之任何其他化合物。該部 分與多肽穩定締合，詳言之，與多肽共價偶合。本文所使 用之術語部分不提供關於此部分與多肽自身相比之尺寸之 任何資訊。該部分可比與盆偶合 、 ，、，、1两口之夕肽小、具有相同尺寸 或比與其偶合之多肽大。 本文所使用之術語，， 群體（亦即構成該群體 單株抗體π係指自大體上均質 之個別抗體除可以少量存在 之抗體 之可能 128311.doc -19- 200844110 之天然產生的突變以外為^ 為相同的）所獲得之抗體。與通常 包括針對不同抗原決定基 、吊 之不冋抗體之多株抗體製劑對
比，單株抗體具有高度特里把 ^ ^ T 将異性，係針對特異性抗原位點或 抗原決定基。 、曰巧、大^征·，或”ad 型神經性失智疾病"係、指選自阿茲海默氏症、唐氏症候 群、路易體型癡呆、額顯葉型癡呆之疾病以及諸如殿粉樣
腦血管病變及澱粉樣變性病之病症。 術語’’經募聚”、”寡聚物”及丨丨宜取 八W次养聚”係指亦包含Αβ二聚 體、三聚體、四聚體及更宾幼宣 文阿級养聚物之Αβ多聚體，但不指 Αβ原纖維。 本文所使用之術語，，斑塊特異性，，抗體係指針對Αρ多狀之 Αβ(4-10)抗原決定基之抗體。 本文所使用之術語，，多肽，，係指具有至少5個胺基酸殘基 之多肽鏈。該術語亦指-個以上多肽鏈之組合，例如四個 多肽鏈之組合，諸如IgG抗體。 本文所使用之術語”互補位，，或，，互補位肽，，一般定義衍生 自特異性單株或多株抗體之分子辨識肽序列。此辨識肽序 列對抗原決疋基展現特異性結合特性，且可包含抗體之可 變及/或恆定區部分序列。 本文所使用之’’與抗原決定基χ特異性結合”係指抗體以 比與其他抗原決定基結合之親和力高之親和力與特定抗原 決定基（例如抗原決定基X)結合之特性。 本文中所使用之11與Αβ之寡聚結構特異性結合”意謂各別 128311.doc -20- 200844110 抗體以比與Αβ單體結構結合之翱 聚結構結合。 系見和力高之親和力與Αβ募 /⑽之，'治療有效量”係指於顯著數量之需要該治療之 文檢者體内提供投與該抗體所违 '、 旦^麻士曰 所達成之特定藥理反應的劑 ^可精由預防或改善所治療之神經性失智疾 :之不利病況或症狀來確定。適當劑量 型、階段及嚴重性以及投藥模式而定。應強調’即使= 此項技術者認為該懸為”治療有效量”，但在特定情:下
才又與特^檢者之”治療有效量”對特定疾病而言可能 對100%之所治療患者有效。 F 之=:力價，，表示樣本(通常血液)中特定抗體之量或濃度 術語"治療”及其類似者係指獲得所需藥理及/或生 應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可為胸 及/或就部分或完全較或治癒疾病及/或可歸因於 病之不利效應而言可為治療性效應。"治療,,涵蓋哺乳 動=人類)疾病之任何治療，且包括:⑷預防= 於U疾病或症狀，但尚未經診斷患病之受檢者 疾病或/症狀；（b)抑制該疾病症狀，亦即使其發展停滞^ ⑷緩解m症狀，亦㈣起疾病或症狀料。 s 抗體 定基Αβ(21-1_4〇)之c端 在一悲樣中，本發明係關於與抗原決 37)(SEQ ID NO 2)特異性結合之多肽。 本^月之夕肽可為（例如）與全長多肽（A0 128311.doc 200844110 部分，尤其與以AP(21-37)(SEQ ID NO: 2)表示之抗原決定 基結合之抗體、抗體片段或任何其他多肽。 在一態樣中，本發明多肽尤其在生理條件下（例如？11值 為約7·4, PBS中約50至約150祕之鹽濃度）能夠與包含澱 杈樣蛋白β之抗原決定基Ap(21-37)(SEQ ID NO 2)之多肽特 異性結合。在一實施例中，多肽在活體外條件下具有至少 約 HM Μ，約 10-6 Μ，約 10-7 Μ，約 1〇-8，約 1〇_9 M，約 1(Μ〇 M，約10-11 M，約1(M2 IV[或更高之相對解離常數 (相對KD ;反應活體外結果，但在活體内條件下不一定為 相同值）。舉例而言，多肽與以AP(21-37Xseq m NC): 2) 表示之抗原決定基結合之相對解離常數可在約1〇_8 M至約 10-12 Μ之間，尤其為約1至5〇xl〇_9 M。該解離速率常數 可易於使用製造商所概述之一般程序或此項技術中已知之 其他方法，使用動力學分析技術（諸如表面電漿共振 (BIAcore 或 Biosensor))來測定。 在另一悲樣中，令人驚奇地發現對Αβ(21_37)具特異性 之多肽具有鬲度同源性。因此，提供包含選自一致CDR序 列之序列的多肽。因此，在一實施例中，本發明之多肽可 包含具有如以一致序列SEQ ID NO: 6至8中之任何者表示 之序列之CDR序列。 SEQ ID NO: 6至8表示能夠與SEQ ID NO: 2結合之抗體 重鏈CDR區的一致序列。該等一致序列係衍生自源自經本 發明者鑑別與SEQ ID NO: 2特異性結合之抗體之序列資 訊。詳言之’所鑑別之重鏈CDR區一致序列（亦即SEQ id 128311.doc -22- 200844110 NO: 6至8及SEQ ID No 1 53至1 6 1)及輕鏈CDR區一致序列 (亦即SEQ ID NO: 9至11)係源自如實例2A所述分離之天然 產生人類抗體。 SEQ ID NO: 6表示重鏈CDR1 —致序歹4，其中 SEQ ID NO: 6位置1處即Kabat位置H31處之胺基酸可為 Ser、Gly 或 Asn ; SEQ ID NO: 6位置2處之胺基酸即Kabat位置8 H32處之胺 基酸為Tyr ; f% SEQ ID NO: 6位置3處之胺基酸即Kabat位置H33處之胺基 酸可為Trp或Asp ; SEQ ID NO: 6位置4處之胺基酸即Kabat位置H34處之胺基 • 酸為Met，且 SEQ ID NO: 6位置5處之胺基酸即Kabat位置H35處之胺基 酸可為Ser或His ; SEQ ID NO: 153表示較佳之重鏈CDR1 —致序歹J，其中 SEQ ID NO: 153位置1上即Kabat位置H31處之胺基酸可為 i
Asn或 Ser > SEQ ID NO: 153位置2處之胺基酸即Kabat位置8 H32上之 胺基酸為Tyr ; SEQ ID NO: 153位置3處之胺基酸即Kabat位置H33處之胺 基酸可為Asp或Trp ; SEQ ID NO: 153位置4處之胺基酸即Kabat位置H34處之胺 基酸為Met，且 SEQ ID NO: 153位置5處之胺基酸即Kabat位置H35處之胺 128311.doc -23- 200844110 基酸可為His或Ser。 SEQ ID NO: 154表示更佳之重鏈CDR1—致序歹，其中 SEQ ID NO: 154位置1處即Kabat位置H31處之胺基酸為 Asn ； SEQ ID NO: 154位置2處之胺基酸即Kabat位置8 H32處之 胺基酸為Tyr， SEQ ID NO: 154位置3處之胺基酸即Kabat位置H33處之胺 基酸為Asp， SEQ ID NO: 154位置4處之胺基酸即Kabat位置H34處之胺 基酸為Met，且 SEQ ID NO: 154位置5處之胺基酸即Kabat位置H35處之胺 基酸為His。 SEQ ID NO: 155表示更佳之重鏈CDR1 —致序歹，其中 SEQ ID NO: 155位置1處即Kabat位置H31處之胺基酸為 Ser ; SEQ ID NO: 155位置2處之胺基酸即Kabat位置8 H32處之 胺基酸為Tyr， SEQ ID NO: 155位置3處之胺基酸即Kabat位置H33處之胺 基酸可為Trp或Asp， SEQ ID NO: 155位置4處之胺基酸即Kabat位置H34處之胺 基酸為Met，且 SEQ ID NO: 155位置5處之胺基酸即Kabat位置H35處之胺 基酸為Ser。 SEQ ID NO: 7表示重鏈CDR2—致序歹，其中 128311.doc -24- 200844110 SEQ ID NO: 7位置1處之胺基酸即Kabat位置H50處之胺基 酸可為Ser或Arg或Glu ; SEQ ID NO: 7位置2處之胺基酸即Kabat位置H51處之胺基 酸可為Val或lie ; SEQ ID NO: 7位置3處之胺基酸即Kabat位置H52處之胺基 酸可為Lys或Gly或Asn ; SEQ ID NO: 7位置4處之胺基酸即Kabat位置H52a處之胺基 酸可為Gin或無胺基酸； SEQ ID NO: 7位置5處之胺基酸即Kabat位置H53處之胺基 酸可為Asp或Phe或Thr或Arg ; SEQ ID NO: 7位置6處之胺基酸即Kabat位置H54處之胺基 酸可為Gly或Phe或Ala或Ser ; SEQ ID NO: 7位置7處之胺基酸即Kabat位置H55處之胺基 酸可為Ser或Gly ; SEQ ID NO: 7位置8處之胺基酸即Kabat位置H56處之胺基 酸可為Glu或Gly或Arg或Asp或Ala ; SEQ ID NO: 7位置9處之胺基酸即Kabat位置H57處之胺基 酸可為Lys或Pro或Ser或Thr或Arg ; SEQ ID NO: 7位置10處之胺基酸即Kabat位置H5 8處之胺基 酸可為Tyr或Leu或Ala或Asn ; SEQ ID NO: 7位置11處之胺基酸即Kabat位置H59處之胺基 酸可為Tyr或Ala ; SEQ ID NO·· 7位置12處之胺基酸即Kabat位置H60處之胺基 酸可為Val或Thr或Ala或Asn ; 128311.doc -25- 200844110 SEQ ID NO: 7位置13處之胺基酸即Kabat位置H61處之胺基 酸可為Asp或Gly或Pro ; SEQ ID NO: 7位置14處之胺基酸即Kabat位置H62處之胺基 酸為Ser ; SEQ ID NO: 7位置15處之胺基酸即Kabat位置H63處之胺基 酸可為Val或Leu ; SEQ ID NO: 7位置16處之胺基酸即Kabat位置H64處之胺基 酸為Lys，且 SEQ ID NO: 7位置17處之胺基酸即Kabat位置H65處之胺基 酸可為Gly或Ser。 SEQ ID NO: 156表示較佳之重鏈CDR2—致序歹ij，其中 SEQ ID NO: 156位置1處之胺基酸即Kabat位置H50處之胺 基酸可為Arg或Ser或Glu ; SEQ ID NO: 156位置2處之胺基酸即Kabat位置H51處之胺 基酸可為lie或Val ; SEQ ID NO: 156位置3處之胺基酸即Kabat位置H52處之胺 基酸可為Gly或Lys或Asn ; SEQ ID NCh 156位置4處之胺基酸即Kabat位置H52a處之胺 基酸可為Gin或無胺基酸； SEQ ID NO: 156位置5處之胺基酸即Kabat位置H53處之胺 基酸可為Thr或Asp或Arg ; SEQ ID NO: 156位置6處之胺基酸即Kabat位置H54處之胺 基酸可為Ala或Gly或Ser ; SEQ ID NO: 156位置7處之胺基酸即Kabat位置H55處之胺 128311.doc -26- 200844110 基酸可為Gly或Ser ; SEQ ID NO: 156位置8處之胺基酸即Kabat位置H56處之胺 基酸可為Arg或Asp或Glu或Ala ; SEQ ID NO: 156位置9處之胺基酸即Kabat位置H57處之胺 基酸可為Thr或Arg或Lys ; SEQ ID NO: 156位置10處之胺基酸即Kabat位置H58處之胺 基酸可為Asn或Tyr ; SEQ ID NO: 156位置11處之胺基酸即Kabat位置H59處之胺 ( 基酸為Tyr ; SEQ ID NO: 15 6位置12處之胺基酸即Kabat位置H60處之胺 基酸可為Asn、Ala或Val ; . SEQ ID NO: 15 6位置13處之胺基酸即Kabat位置H61處之胺 基酸可為Pro或Gly或Asp ; SEQ ID NO: 15 6位置14處之胺基酸即Kabat位置H62處之胺 基酸為S e r ; SEQ ID NO: 15 6位置15處之胺基酸即Kabat位置H63處之胺 基酸可為Leu或Val ; SEQ ID NO: 156位置16處之胺基酸即Kabat位置H64處之胺 基酸為Lys，且 SEQ ID NO·· 156位置17處之胺基酸即Kabat位置H65處之胺 基酸可為Gly或Ser。 SEQ ID NO·· 157表示更佳之重鏈CDR2—致序歹U，其中 SEQ ID NO: 157位置1處之胺基酸即Kabat位置H50處之胺 基酸可為Arg或Glu ; 128311.doc -27- 200844110 SEQ ID NO: 157位置2處之胺基酸即Kabat位置H51處之胺 基酸為IIe ; SEQ ID NO: 157位置3處之胺基酸即Kabat位置H52處之胺 基酸可為Gly或Asn ; SEQ ID NO: 157位置4處之胺基酸即Kabat位置H53處之胺 基酸可為Thr或Arg ; SEQ ID NO: 157位置5處之胺基酸即Kabat位置H54處之胺 基酸可為Ala或Ser ; SEQ ID NO: 157位置6處之胺基酸即Kabat位置H55處之胺 基酸為Gly ; SEQ ID NO: 157位置7處之胺基酸即Kabat位置H56處之胺 基酸可為Arg或Asp或Ala ; SEQ ID NO: 157位置8處之胺基酸即Kabat位置H57處之胺 基酸可為Thr或Arg ; SEQ ID NO: 157位置9處之胺基酸即Kabat位置H58處之胺 基酸可為Asn或Tyr ; SEQ ID NO·· 157位置10處之胺基酸即Kabat位置H59處之胺 基酸為Tyr ; SEQ ID NO: 157位置11處之胺基酸即Kabat位置H60處之胺 基酸可為Asn或Ala ; SEQ ID NO: 157位置12處之胺基酸即Kabat位置H61處之胺 基酸可為Pro或Gly ; SEQ ID NO: 157位置13處之胺基酸即Kabat位置H62處之胺 基酸為Ser ; 128311.doc -28- 200844110 SEQIDNO:15 7位置14處之胺基酸即Kabat位置H63處之胺 基酸可為Leu或Val ; SEQ ID NO: 157位置15處之胺基酸即Kabat位置H64處之胺 基酸為Lys，且 SEQ ID NO·· 157位置16處之胺基酸即Kabat位置H65處之胺 基酸可為Gly或Ser。 SEQ ID NO: 158表示更佳之重鏈CDR2—致序歹，其中 SEQ ID NO: 158位置1處之胺基酸即Kabat位置H50處之胺 基酸為Ser ; SEQ ID NO: 158位置2處之胺基酸即Kabat位置H51處之胺 基酸為Val ; SEQ ID NO: 158位置3處之胺基酸即Kabat位置H52處之胺 基酸為Lys ; SEQ ID NO: 158位置4處之胺基酸即Kabat位置H52a處之胺 基酸為Gin ; SEQ ID NO: 158位置5處之胺基酸即Kabat位置H53處之胺 '1 基酸為Asp ; SEQ ID NO: 158位置6處之胺基酸即Kabat位置H54處之胺 基酸為Gly ; SEQ ID NO: 158位置7處之胺基酸即Kabat位置H55處之胺 基酸為Ser ; SEQ ID NO: 158位置8處之胺基酸即Kabat位置H56處之胺 基酸為Glu ; SEQ ID NO: 158位置9處之胺基酸即Kabat位置H57處之胺 128311.doc -29- 200844110 基酸為Lys ; SEQIDNO:15 8位置10處之胺基酸即Kabat位置H5 8處之胺 基酸為Tyr ; SEQIDNChl5 8位置ll處之胺基酸即Kabat位置H59處之胺 基酸為Tyr ; SEQIDNO:15 8位置12處之胺基酸即Kabat位置H60處之胺 基酸為Val ; SEQIDNO:15 8位置13處之胺基酸即Kabat位置H61處之胺 t 基酸為Asp ; 8£(^10 1^0:15 8位置14處之胺基酸即〖35&^立置1162處之胺 基酸為Ser ; . SEQ ID NO: 158位置15處之胺基酸即Kabat位置H63處之胺 基酸為Val ; SEQ ID NO: 158位置16處之胺基酸即Kabat位置H64處之胺 基酸為Lys，且 SEQ ID NO: 158位置17處之胺基酸即Kabat位置H65處之胺 / 基酸為Gly。 SEQ ID NO: 8表示重鏈CDR3—致序歹，其中 SEQ ID NO: 8位置1處之胺基酸即Kabat位置H95處之胺基 酸可為Asp或Gly ; SEQ ID NO: 8位置2處之胺基酸即Kabat位置H96處之胺基 酸可為A1 a或G1 y ; SEQ ID NO: 8位置3處之胺基酸即Kabat位置H97處之胺基 酸可為Ser或Gly ; 128311.doc -30- 200844110 SEQ ID NO: 8位置4處之胺基酸即Kabat位置H98處之胺基 酸可為Ser或Arg ; SEQ ID NO: 8位置5處之胺基酸即Kabat位置H99處之胺基 酸為Trp ; SEQ ID NO: 8位置6處之胺基酸即Kabat位置HI 00處之胺基 酸可為Tyr或Ala ; SEQ ID NO: 8位置7處之胺基酸即Kabat位置HlOOa處之胺 基酸可為Arg或Pro或Asp ; SEQ ID NO: 8位置8處之胺基酸即Kabat位置H100b處之胺 基酸可為Asp或Leu ; SEQ ID NO: 8位置9處之胺基酸即Kabat位置H100c處之胺 基酸可為Trp或Gly或Ala ; SEQ ID NO: 8位置10處之胺基酸即Kabat位置HI 00d處之胺 基酸可為Phe或Ala ; SEQ ID NO: 8位置11處之胺基酸即Kabat位置H100e處之胺 基酸可為Phe或無胺基酸； SEQ ID NO: 8位置12處之胺基酸即Kabat位置H101處之胺 基酸為Asp，且 SEQ ID NO: 8位置13處之胺基酸即Kabat位置H102處之胺 基酸可為Pro或lie ; SEQ ID NOM5 9表示較佳之重鏈CDR3—致序歹U，其中 SEQ ID NO: 159位置1處之胺基酸即Kabat位置H95處之胺 基酸可為Gly或Asp ; SEQ ID NO: 159位置2處之胺基酸即Kabat位置H96處之胺 128311.doc -31 - 200844110 基酸可為Ala或Gly ; SEQ ID NO·· 159位置3處之胺基酸即Kabat位置H97處之胺 基酸可為Gly或Ser ; SEQ ID NO: 159位置4處之胺基酸即Kabat位置H98處之胺 基酸可為Arg或Ser ; SEQ ID NO: 159位置5處之胺基酸即Kabat位置H99處之胺 基酸為Trp ; SEQ ID NO: 159位置6處之胺基酸即Kabat位置HI 00處之胺 基酸可為Ala或Tyr ; SEQ ID NO: 159位置7處之胺基酸即Kabat位置HlOOa處之 胺基酸可為Pro或Arg或Asp ; • SEQ ID NO: 159位置8處之胺基酸即Kabat位置HlOOb處之 胺基酸可為Leu或Asp ; SEQ ID NO: 159位置9處之胺基酸即Kabat位置HlOOc處之 胺基酸可為Gly或Trp或Ala ; SEQ ID NO: 159位置10處之胺基酸即Kabat位置HI00d處之 i 胺基酸可為Ala或Phe ; SEQ ID NO: 159位置11處之胺基酸即Kabat位置H100e處之 胺基酸可為Phe或無胺基酸； SEQ ID NO: 159位置12處之胺基酸即Kabat位置H101處之 胺基酸為Asp，且 SEQ ID NO: 159位置13處之胺基酸即Kabat位置H102處之 胺基酸可為lie或Pro。 SEQ ID NO: 160表示更佳之重鏈CDR3—致序列，其中 128311.doc -32- 200844110 SEQ ID NO: 160位置1處之胺基酸即Kabat位置H95處之胺 基酸為Gly ; SEQ ID NO: 160位置2處之胺基酸即Kabat位置H96處之胺 基酸為Ala ; SEQ ID NO: 160位置3處之胺基酸即Kabat位置H97處之胺 基酸為Gly ; SEQ ID NO: 160位置4處之胺基酸即Kabat位置H98處之胺 基酸為Arg，
SEQ ID NO: 160位置5處之胺基酸即Kabat位置H99處之胺 基酸為Trp ; SEQ ID NO: 160位置6處之胺基酸即Kabat位置HI 00處之胺 基酸為Ala ; SEQ ID NO: 160位置7處之胺基酸即Kabat位置HlOOa處之 胺基酸為Pro ; SEQ ID NO: 160位置8處之胺基酸即Kabat位置H100b處之 胺基酸為Leu ; SEQ ID NO: 160位置9處之胺基酸即Kabat位置HlOOc處之 胺基酸為Gly ; SEQ ID NO: 160位置10處之胺基酸即Kabat位置HI00d處之 胺基酸為Ala ; SEQ ID NO: 160位置11處之胺基酸即Kabat位置H100e處之 胺基酸為Phe ; SEQ ID NO: 160位置12處之胺基酸即Kabat位置H101處之 胺基酸為Asp，且 128311.doc -33- 200844110 SEQ ID NO: 160位置13處之胺基酸即Kabat位置H102處之 胺基酸為11 e。 SEQ ID NO: 161表示更佳之重鏈CDR3—致序列，其中 SEQ ID NO: 161位置1處之胺基酸即Kabat位置H95處之胺 基酸為Asp ; SEQ ID NO: 161位置2處之胺基酸即Kabat位置H96處之胺 基酸可為Gly或Ala ; SEQ ID NO: 161位置3處之胺基酸即Kabat位置H97處之胺 ( 基酸可為Ser或Gly ; SEQ ID NO: 161位置4處之胺基酸即Kabat位置H98處之胺 基酸可為Ser或Arg ; SEQ ID NO: 161位置5處之胺基酸即Kabat位置H99處之胺 基酸為Trp ; SEQ ID NO: 161位置6處之胺基酸即Kabat位置H100處之胺 基酸可為Tyr或Ala ; SEQ ID NO: 161位置7處之胺基酸即Kabat位置HlOOa處之 胺基酸可為Arg或Asp ; SEQ ID NO: 161位置8處之胺基酸即Kabat位置HlOOb處之 胺基酸可為Asp或Leu ; SEQ ID NO: 161位置9處之胺基酸即Kabat位置HlOOc處之 胺基酸可為Trp或Ala ; SEQ ID NO: 161位置10處之胺基酸即Kabat位置HI 00d處之 胺基酸為P h e， SEQ ID NO: 161位置11處之胺基酸即Kabat位置H101處之 128311.doc -34- 200844110 胺基酸為Asp，且 SEQ ID NO: 161位置12處之胺基酸即Kabat位置H102處之 胺基酸可為Pro或lie。 在另一實施例中，本發明之多肽包含如以SEQ ID NO: 6 至8表示之所有三個各別一致CDR序列作為CDR。 在另一實施例中，本發明之多肽包含如以SEQ ID NO: 6 至8表示之各別一致CDR序列中之至少兩者。 在另一實施例中，本發明之多肽包含具有如以一致序列 SEQ ID NO: 6至11中之任何者表示之各別一致序列中的至 少兩者之CDR序列。 SEQ ID NO: 9至11表示能夠與SEQ ID NO: 2結合之抗體 輕鍵CDR區之一致序列。該等一致序列係衍生自源自經本 發明者鑑別與SEQ ID NO: 2特異性結合之抗體之序列資 訊。詳言之，所鑑別之輕鏈CDR區之一致序列係源自如實 例2 A所述分離之天然產生之人類抗體。 SEQ ID NO: 9表示κ輕鏈免疫球蛋白CDR1區之CDR1 — 致序列，其中： SEQ ID NO: 9位置1處之胺基酸即Kabat位置L24處之胺基 酸可為Arg ; SEQ ID NO: 9位置2處之胺基酸即Kabat位置L25處之胺基 酸可為Ala或Glu ; SEQ ID NO: 9位置3處之胺基酸即Kabat位置L26處之胺基 酸可為Ser ; SEQ ID NO: 9位置4處之胺基酸即Kabat位置L27處之胺基 128311.doc -35- 200844110 酸可為Gin ; SEQ ID NO: 9位置5處之胺基酸即Kabat位置L28處之胺基 酸可為Ser或Gly ; SEQ ID NO: 9位置6處之胺基酸即Kabat位置L29處之胺基 酸可為Val或lie ; SEQ ID NO: 9位置7處之胺基酸即Kabat位置L30處之胺基 酸可為Asn或Arg或Ser ; SEQ ID NO·· 9位置8處之胺基酸即Kabat位置L31處之胺基 ; 酸可為Ser或Asn ; SEQ ID NO: 9位置9處之胺基酸即Kabat位置L32處之胺基 酸可為Tyr ; . SEQ ID NO: 9位置10處之胺基酸即Kabat位置L33處之胺基 酸可為Leu ;且 SEQ ID NO: 9位置11處之胺基酸即Kabat位置L34處之胺基 酸可為Ala。 SEQ ID NO: 10表示κ輕鏈免疫球蛋白CDR2區之CDR2 — V 致序列，其中： SEQ ID NO: 10位置1處之胺基酸即Kabat位置L50處之胺基 酸可為Ala或Gly或Lys或Trp ; SEQ ID NO: 10位置2處之胺基酸即Kabat位置L51處之胺基 酸可為Val或Ala ; SEQ ID NO: 10位置3處之胺基酸即Kabat位置L52處之胺基 酸可為Ser或Ala ; SEQ ID NO: 10位置4處之胺基酸即Kabat位置L53處之胺基 128311.doc -36- 200844110 酸可為Thr或Ser或Asn或lie ; SEQ ID NO: 10位置5處之胺基酸即Kabat位置L54處之胺基 酸可為Arg或Leu ; SEQ ID NO: 10位置6處之胺基酸即Kabat位置L55處之胺基 酸可為Ala或Gin或Phe或Glu，且 SEQ ID NO: 10位置7處之胺基酸即Kabat位置L56處之胺基 酸可為Thr或Ser。 SEQ ID NO: 11表示/c輕鏈免疫球蛋白CDR3區之CDR3 一致序列，其中： SEQ ID NO: 11位置1處之胺基酸即Kabat位置L89處之胺基 酸可為Gin ; SEQ ID NO: 11位置2處之胺基酸即Kabat位置L90處之胺基 酸可為Gin ; SEQ ID NO: 11位置3處之胺基酸即Kabat位置L91處之胺基 酸可為Ala或Tyr ; SEQ ID NO: 11位置4處之胺基酸即Kabat位置L92處之胺基 酸可為Gly或Asn ; SEQ ID NO: 11位置5處之胺基酸即Kabat位置L93處之胺基 酸可為Ser ; SEQ ID NO: 11位置6處之胺基酸即Kabat位置L94處之胺基 酸可為Ser或Phe ; SEQ ID NO: 11位置7處之胺基酸即Kabat位置L95處之胺基 酸可為Gin或Pro ; SEQ ID NO: 11位置8處之胺基酸即Kabat位置L96處之胺基 128311.doc •37- 200844110 酸可為Gly或Leu ;且 SEQ ID NO: 11位置9處之胺基酸即Kabat位置L97處之胺基 酸可為Thr。 在一實施例中，本發明之多肽包含如以SEQ ID NO: 6至 1 1表示之所有三個各別一致CDR序列作為輕鏈CDR。 在一實施例中，本發明之多肽包含選自如以SEQ ID NO·· 9至11表示之所有三個各別一致CDR序列之至少兩個輕鏈 CDR。 甚至更佳為包含至少兩個選自所表示之輕鏈一致CDR序 列（SEQ ID NO: 9至11)之CDR序列或至少兩個所表示之重 鏈一致CDR序列（SEQ ID NO: 6至8)或至少一個來自輕鏈之 CDR(SEQ ID NO: 9至11)及至少一個來自重鏈之CDR(SEQ ID NO: 6至8)的多肽。 在一實施例中，本發明之多肽包含如以SEQ ID NO: 9至 1 1表示之所有三個各別一致CDR序列作為輕鏈CDR。 甚至更佳為包含至少兩個選自所表示之輕鏈一致CDR序 列（SEQ ID NO: 9至11)之CDR序列及/或至少兩個所表示之 重鏈一致CDR序列（SEQ ID NO: 6至8)的多肽。 在一實施例中，提供分離單株抗β澱粉樣蛋白抗體，其 包含一個以上胺基酸序列，該等胺基酸序列係選自由下列 序列組成之群的至少兩個一致胺基酸序列·· SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11，其中該等一個以上胺基酸序 列各自係來自不同SEQ ID NO，其中該抗體以比與單體形 128311.doc -38 - 200844110 式Αβ結合之親和力高之親和力與二聚形式之Αβ結合。 在另一實施例中，本發明之多肽包含如以SEQ ID NO: 13至20表示之序列中之一者作為重鏈上之CDR1，如以 SEQ ID NO: 21至27及149表示之序列中之一者作為重鏈上 之CDR2 ;及/或如以SEQ ID NO: 28至32表示之序歹U中之一 者作為重鏈上之CDR3。 在另一實施例中，本發明之多狀包含至少兩個選自重鍵 CDR1、CDR2 及 CDR3 以及輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3 之一 r 1 致序列之一致CDR序列，其中該等一致序列係藉由根據
Kabat編號對準以下抗體可變區之序列而衍生： a)對於重鏈之CDR1而言，SEQ ID NO: 56至71及148 . b)對於重鏈之CDR2而言，SEQ ID NO·· 56至71及148 c) 對於重鏈之CDR3而言，SEQ ID NO: 56至71及148 d) 對於輕鏈之CDR1而言，SEQ ID NO: 47至55及145至147 e) 對於輕鏈之CDR2而言，SEQ ID NO: 47至55及145至147 f) 對於輕鏈之CDR3而言，SEQ ID NO: 47至55及145至 \ ' 147 ° SEQ ID NO 13 至 20 表示 CDR1 序歹 ij，SEQ ID NO 21 至 27 及149表示CDR2序列且SEQ ID NO 28至32表示CDR3序 歹，本發明者發現該等CDR1、CDR2、CDR3序列存在於 與Αβ(1_40)之C端部分結合，尤其與Αβ(21-37)結合之抗體 重鍵上。 在另一實施例中，本發明之多肽包含如以SEQ ID NO: 33至37表示之序列中之一者作為輕鏈上之CDR1，如以 128311.doc -39- 200844110 SEQ ID NO: 38至43及150至152表示之序列中之一者作為 輕鏈上之CDR2 ;及/或如以SEQ ID NO: 44至46表示之序列 中之一者作為輕鏈之CDR3。 SEQ ID NO 33 至 37 表示 CDR1 序歹 ij，SEQ ID NO 38 至 43 及150至152表示CDR2序列且SEQ ID NO 44至46表示CDR3 序歹U，本發明者發現該等CDR1、CDR2、CDR3序列存在 於與Αβ(1_40)之C端部分結合，尤其與Αβ(21-37)結合之抗 體輕鏈上。
在一較佳實施例中，本發明之多肽於重鏈上包含選自 SEQ ID NO: 13 至 20之 CDR1 序歹ij，選自 SEQ ID NO: 21 至 27及148之CDR2序列，及/或選自SEQ ID NO: 28至32之 CDR3序歹，且於輕鏈上包含選自SEQ ID NO·· 33至37之 CDR1 序歹ij，選自 SEQ ID NO: 38至 43 及 150至 152之 CDR2 序列，及/或選自SEQ ID NO: 44至46之CDR3序列。 詳言之，本發明之多肽於輕鏈上可包含： a) SEQ ID NO·· 34作為 CDR1 SEQ ID NO: 44作為 CDR3 b) SEQ ID NO: 33 作為 CDR1 SEQ ID NO: 44作為 CDR3 c) SEQ ID NO: 37作為 CDR1 SEQ ID NO: 46作為 CDR3 d) SEQ ID NO: 34作為 CDR1 SEQ ID NO: 44作為 CDR3 e) SEQ ID NO: 3 5作為 CDR1 SEQ ID NO: 38作為 CDR2及 或 SEQ ID NO: 42作為 CDR2及 或 SEQ ID NO: 43作為 CDR2及 或 SEQ ID NO: 40作為 CDR2及 或 SEQ ID NO: 38作為 CDR2及 128311.doc -40- 41作為CDR2及 41作為CDR2及 38作為CDR2及 39作為CDR2及
i 21作為CDR2及 27作為CDR2及 26作為CDR2及 21作為CDR2及 23作為CDR2及 22作為CDR2及 27作為CDR2及 200844110 SEQ ID NO: 44作為 CDR3，或 f) SEQ ID NO: 33作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 44作為 CDR3，或 g) SEQ ID NO: 33作為 CDR1，SEQ ID NO· SEQ ID NO: 45作為 CDR3，或 h) SEQ ID NO: 34作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 44作為 CDR3，或 i) SEQ ID NO: 36作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 44作為 CDR3。 詳言之，本發明之多肽於重鏈上亦可包含 a) SEQ ID NO: 13作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28作為 CDR3，或 b) SEQ ID NO: 14作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 30作為 CDR3，或 c) SEQ ID NO: 13作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28作為 CDR3，或 d) SEQ ID NO: 14作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 30作為 CDR3，或 e) SEQ ID NO: 15作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29作為 CDR3，或 f) SEQ ID NO: 15作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29作為 CDR3，或 g) SEQ ID NO: 20作為 CDR1，SEQ ID NO: SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或 128311.doc -41 - 200844110 h) SEQ ID NO: 18作為 CDRl，SEQ ID NO: 25作為 CDR2及 SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或 i) SEQ ID NO: 18作為 CDRl，SEQ ID NO: 27作為 CDR2及 SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或 j) SEQ ID NO: 14作為 CDRl，SEQ ID NO: 27作為 CDR2及 SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或 k) SEQ ID NO: 14作為 CDRl，SEQ ID NO: 21 作為 CDR2及 SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或
1) SEQ ID NO: 16作為 CDRl，SEQ ID NO: 21 作為 CDR2及 SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或 m) SEQ ID NO: 19作為 CDRl，SEQ ID NO: 21 作為 CDR2 及 SEQ ID NO: 32作為 CDR3，或 n) SEQ ID NO: 1 6作為 CDRl，SEQ ID NO: 2 1 作為 CDR2及 SEQ ID NO: 28作為 CDR3，或 o) SEQ ID NO: 17作為 CDRl，SEQ ID NO: 26作為 CDR2及 SEQ ID NO: 31作為 CDR3，或 p) SEQ ID NO: 14作為 CDRl，SEQ ID NO: 24作為 CDR2及 SEQ ID NO: 28作為 CDR3。 甚至更佳為本發明之包含以下各者之多肽： a)在輕鏈上，SEQ ID NO: 34 作為 CDRl，SEQ ID NO: 38 作為CDR2及SEQ ID NO: 44作為CDR3，及在重鏈上， SEQ ID NO: 13作為 CDRl，SEQ ID NO: 21 作為 CDR2及 SEQ ID NO: 28作為 CDR3，或 b)在輕鏈上，SEQ ID NO: 33 作為 CDRl，SEQ ID NO: 42 128311.doc 42- 200844110 作為CDR2及SEQ ID NO: 44作為CDR3，及在重鏈上， SEQ ID NO: 14作為 CDR1，SEQ ID NO: 27作為 CDR2及 SEQ ID NO: 30作為 CDR3。 甚至更佳為本發明之包含具有SEQ ID NO: 53序列之可 變輕鏈及具有SEQ ID NO: 60序列之可變重鏈的多肽，或 包含具有 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 41 及 SEQ ID NO: 45之CDR序歹丨j之輕鏈及具有SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 29之CDR序歹丨J之重鏈的多肽。 如本發明者所確定，SEQ ID NO: 47至55及145至147表 示能夠與Αβ(1-40)之C端部分特異性結合，尤其與Αβ(21-37)特異性結合之抗體的輕鏈可變區且SEQ ID NO: 56至71 及148表示能夠與Αβ(1-40)之C端部分特異性結合，尤其與 Αβ(21-37)特異性結合之抗體的重鏈可變區。重鏈及輕鏈 可變區負責產生抗原特異性。因此，在另一實施例中，本 發明之多肽包含選自SEQ ID NO: 47至55及145至147之序 列，及/或選自SEQ ID NO: 56至71及148之序歹。在特別 較佳實施例中，本發明之多肽包含SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 56或 SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 57。
SEQ ID NO: 47至55及145至147之輕鏈各自可與SEQ ID NO: 56至71及148之重鏈中之任一者組合。因此提供包含 以下各者之抗β澱粉樣蛋白抗體：SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO·· 47及 SEQ ID NO· 57 ; SEQ ID Ν〇·· 47及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ 128311.doc -43- 200844110
ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO:
47及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 47及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ
ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID
NO: 48及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ
ID NO: 48及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID
NO: 65 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ
ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 48及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID
NO: 48及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO·· 65 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ -44· 128311.doc 200844110
ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 49 及 SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 7〇 ; SEQ ID NO: 49及
SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 49及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ
ID NO: 50及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO·· 59 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ
ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID
NO: 50及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 50 及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 50及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ
ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID
NO: 61 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ
ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 51 及 128311.doc -45- 200844110
SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ
ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID
NO: 52及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 53 及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO·· 53 及 SEQ
ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 54及 128311.doc -46- 200844110
SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ
ID NO: 54及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID
NO: 62 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO:
145 及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 145 及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 145 及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO·· 145及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID 128311.doc -47- 200844110 NO: 145及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 145
及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NOM45及 SEQ
ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO·· 59 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 146 及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NOM46及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 66 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 146 及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 7〇 ;
SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 56 ; SEQ ID NOM47及 SEQ ID NO: 57 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 58 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 59 ; SEQ ID NO: 147 及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NCh 62 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 63 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 64 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 65 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO·· 66 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 67 ; SEQ ID NO: 147 128311.doc -48- 200844110 及 SEQ ID NO: 68 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 69 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 70 ; SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 71 ;或 SEQ ID NO: 147及 SEQ ID NO: 148 °
在較佳實施例中’抗β殿粉樣蛋白抗體包含SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 52及 SEQ
ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 62 ; SEQ ID NO: 54及
SEQ ID NO: 60 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 54及 SEQ ID NO: 148 ; SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 148 ; or SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 61。 此外，SEQ ID NO 72至74表示能夠與Αβ(1-40)之C端部 分特異性結合，尤其與Αβ(21-3 7)特異性結合之抗體的輕 鏈恆定區且SEQ ID NO 75至77表示能夠與Αβ(1_40)之C端 部分特異性結合，尤其與Αβ(2 1-37)特異性結合之抗體的 重鏈怪定區。因此，在另一實施例中，本發明之多肽可包 含選自SEQ ID NO: 72至74之序列，及/或選自SEq id NO: 75至77之序列。詳言之，本發明之多肽可包含選自SEQ ID NO: 72或73之序列，及選自SEQ ID N〇 75至77之序列。 能夠與Αβ( 1 -40)之C端部分特異性結合，尤其與Αβ(21 -37)特異性結合之抗體輕鏈之由可變區及恆定區組成的完 整序列係以SEQ ID NO: 78至93表示。 因此，在本發明之另一實施例中，本發明之多肽包含選 128311.doc -49- 200844110 自SEQ ID NO: 78至93之序列。 能夠與Αβ(1-40)之C端部分特異性結合，尤其與Αβ(21-3 7)特異性結合之抗體重鍵之由可變區及但定區組成的完 整序列係以SEQ ID NO: 94至137表示。因此，在本發明之 另一實施例中，本發明之多肽包含選自SEQ ID NO: 94至 13 7之序列。 在一甚至更佳之實施例中，本發明之多肽包含以SEQ ID NO: 78表示之序列及以SEQ ID NO: 94表示之序列或以SEq ID NO: 80表示之序列及以SEQ ID NO: 97表示之序列。相 同情況適用於各別鏈及其組合之類似同功異型物（如可自 圖23a獲得）。 亦可鑑別構架區之一致序列。若將重鏈及輕鏈之可變區 胺基酸序列分別根據Kabat規則排比，則可以類似於以上 關於CDR區所述之方式比較位於CDR1之N端，CDRi與 CDR2之Μ，CDR2與CDR3之間及CDR3之C端的所謂構架 區，且可產生本發明抗體構架之一致序列。 需注意，本發明者發現能夠與Ap(1_4〇)2C端部分特異 性結合，尤其與Αβ(21-37)特異性結合之抗體 κ輕鏈之約18
128311.doc -50- 200844110 44致序列所表不之序列，尤其如以m N〇: i38至 143表示之序列。 在另κ ^例中’本發明多肽與寡聚形式之卜殿粉樣蛋 白多肽特異性結合。作為非限制性實例，多肽可與寡聚形 式之Αβ(1-40)或募聚形式之A(3(12_2G)或寡聚形式之颂2卜 37)、、、σ σ。在一悲樣中，當在4它下，在磷酸鈉，15〇 福咖丨⑽值為7·4)中培育隔夜時，本發明多肽能夠與寡 聚形式之Αβ(1-40)特異性結合。 在另一態樣中，本發明自體抗體以比與對應人(3單體結合 之親和力高之親和力與Αβ二聚體結合。
一般而言，結合親和力為抗體_抗原組合之量度且係關 於當和與任何其他抗原決定基之結合比較時給定抗體與一 抗原決定基結合之選擇性。此優先或選擇性結合可定量為 結合親和力或力價。計算抗體親和力之方法於此領域中為 熟知的。參見例如 practical ImniUn〇l〇gy，第 3 章，Frank C
Hay & 〇iwyn UR Westwood5 Blackwell Publishing (2002) ·，Measuring Immunity: Basic Bi〇1〇gy&CHnical
Assessment，第 16 章，Michael T & a零s w
Thomson (編），Academic Press (2〇〇5)，兩者均係以引用的 方式併入本文中。 在一較佳實施例中，當本發明之多肽為抗體時，該抗體 可為單株抗體。單株抗體具有展現較低交叉反應性之優 點。 在另一較佳實施例中，本發明之多肽包含與Ap(21_ 128311 .doc -51 - 200844110 37)(SEQ ID NO·· 2)結合之抗體衍生物及/或片段。此項技 術中所一知，可將抗體（例如）以蛋白酶進行酶處理以獲得 保持完整抗體之抗原結合特性，但缺少以域之抗體片段。 該等片段（例如）為Fab或F(ab，）2片段，其可分別經由以木瓜 蛋白酶或胃蛋白酶來酶消化抗體而獲得。另一抗體片段為 抗體之單鏈可變片段（scFv)，亦即抗體之重鏈及輕鏈可變 區經由短可撓性連接子（通常為絲胺酸、甘胺酸）之融合。 通常，該嵌合分子儘管移除恆定區且引入連接肽，但仍保 持原抗體之特異性。單鏈可變片段可藉由使編碼該融合蛋 白之各別核酸基因工程化而獲得。該片段之優點為其僅由 單多肽鏈組成，該單多肽鏈比包含至少4個需要正確組裝 以充分起作用之多肽鏈之全抗體更容易在人造表現系統中 表現且適當摺疊。 若本發明之多肽為抗體，則人類抗體由於其於人體内之 低免疫原性而為較佳 '然而，抗體或其片段可源自適用於 產生抗體之任何物種。詳言之’非人類抗體可源自小鼠、 雞、兔、大鼠、驢、駱騎、單峰駱騎、鯊魚及羊騎。駱 r匕、單峰絡r匕、！魚及羊銳之抗體具有以下優點，即此等 動物具有僅由均二聚體組成之抗體。因此，該等多肽具有 與以上關於單鏈可變片段所述類似之表現及組裝優點。 在另-較佳實施例中’抗體、其衍生物或片段為人類化 抗體：其衍生物或片段，亦即儘管其抗原結合域或部分為 非人類來㉟i抗體、其衍生物或片段之其餘部分為人類 來源。在另一較佳實施例中，抗體、其衍生物或片段為敌 128311.doc -52- 200844110 合抗體，亦即儘管其可變域或部分為非人類來源，但恆定 域為人類來源。兩個實施例用於降低由於非人類來源蛋白 域免疫原特性之副作用之目的。在一甚至更佳之實施例 中，與澱粉樣蛋白-β肽（1-40)(SEQ ID NO: 1)之抗原決定基 AP(21-37)(SEQ ID NO: 2)結合之多肽為僅包含與該抗原決 定基結合之抗體互補位之抗體衍生物或片段。該互補位之 實例為（例如）包含經由插入序列或經由合成連接子連接之 重鏈及輕鏈之各別CDR域的胺基酸序列之多肽。 在一恶樣中’本發明抗體涵蓋特異性抗Αβ(2 1-37)自體 抗體之對偶基因變異體，經保守性修飾之變異體，及次要 重組修飾體。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當核苷 酸改變引入編碼DNA或藉由肽合成來製備。該等變異體包 括（例如）抗體胺基酸序列内殘基之缺失及/或插入及/或取 代。進行缺失、插入及取代之任何組合以達成最終構築 體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。胺基酸改 k亦可改變抗體之後轉譯過程，諸如改變糖基化位點之數 量或位置。 胺基酸序列插入可包括（例如）長度在一個殘基至含有一 百個或一百個以上殘基之多肽範圍内之胺基端及/或羧基 端融合’以及單一或多個胺基酸殘基之序列内插入。末端 插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與抗原 決定基標籤或補救受體抗原決定基融合之特異性結合劑或 抗體（包括抗體片段）。其他插入變異體包括（例如）在\端或 C端與增加抗體血清半衰期之多肽融合。 128311.doc -53- 200844110 其他類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在 抗體分子中移除至少一個胺基酸殘基且在其位置上插入一 不同殘基。基於常見側鏈特性將天然產生之殘基分組： (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性： cys、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性： asn、gin、his、lys、arg ; (5) 影響鏈方位之殘基：giy、pro ;及 (6) 方香性：trp、tyr、phe。 保守取代涉及將一胺基酸以其種類中之另一成員置換。 非保守取代涉及將此等種類之一之成員以另一種類之成員 置換。保守取代之實例包括以val、leil或iie置換aia ;以 lys gin 或 asn 置換 arg，以 gin、his、asp、lys 或 gin 置換 asn ’以glu或asn置換asp ;以ser或ala置換cys ;以asn或glu 置換gin ’以asp或gin置換glu ;以ala置換gly ;以asn、 gin lys 或 置換 his，以 leu、val、met、ala 或 phe 置換 lie ;以正白胺酸、ue、va卜met、ala或phe置換leu ;以 arg、gly、asn 置換 lys，以 leu、phe 或 ile 置換 met ;以 leu、 val、ile、aia 或 tyr 置換 phe ;以 aia 置換 pr〇 ;以 thr 置換 ser ;以 ser 置換 thr ;以 tyr 或 phe 置換 trp ;以 trp、phe、thr 或ser置換tyr ;及以ile、leu、met、phe、ala或正白胺酸置 換 val。 一般亦可以絲胺酸來取代與維持特異性結合劑或人類化 或變異抗體之適當構型無關之任何半胱胺酸殘基來改良分 128311.doc -54- 200844110 子之氧化穩定性且預防異常交聯。相反而言，可將半胱胺 酸鍵添加至特異性結合劑或抗體中來改良其穩定性（尤其 當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時）。 f 亦可（例如）藉由使見於抗體中之一或多個碳水化合物部 分缺失，及/或添加一或多個不存在於抗體中之糖基化位 點來產生具有相對於母抗體經改質之糖基化模式之變異糖 基化變異體。包括抗體之多肽之糖基化通常為N連接糖基 化或〇連接糖基化。N連接係指將碳水化合物部分連接至 文夂坎丞之側鏈上。二肽序列天冬醯胺酸-x_絲胺 酸及天冬醯胺酸-χ'蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何 胺基酸）為用於碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈之酶連 接之辨識序列。多月太Φ r»·* 夕肽中此專二肽序列中任一者之存在產生 曰在糖基化位點。因此’可藉由改變胺基酸序列使其含有 此等二肽序列中之—或多者來將N連接之糖基化位點添加 至抗體中。Ο連接糖基化係指將糖ν·乙醯半乳胺糖、半乳 t或木糖中之：；者與經基胺基酸連接，最常見之經基胺基 酉夂為絲胺酸或蘇胺酸 彳杳总 妝馱儘官亦可使用5-羥基脯胺酸或5_羥 基離胺酸。可藉由於 μ 、几體序列中插入或取代一或多個絲胺 酉文或蘇胺酸殘基來將〇連 、^ 丈牧糖|化位點添加至特昱性纟士人 劑或抗體中。 π …。 用以增加血清丰奈Μ 由入、衮翊之修飾亦可為合乎需要的，例如藉 由合併或添加補救受轉处 區域突變或藉由將抗^二:原決定基（例如藉由使適當 藉由DNA或肽合成將基併人肽標籤中’接著(例如） 、肽軚織與抗體於任一端或中部融合， 12831 l.doc -55- 200844110 參見例如WO 96/32478);或添加分子，諸如peg或其他水 可溶聚合物，包括多醣聚合物。 抗體之製備 多株抗體 多株抗體較佳藉由多次皮下（SC)或腹膜内（ip)注射相關抗 原及佐劑而於動物體内產生。或者，可將抗原直接注射至 動物淋巴結中（參見Kilpatrick等人，Hybridoma，16:381 · ,389, I"7)。可藉由使用雙功能劑或衍生劑（例如馬來醯亞 %
胺苯甲醯基績琥珀醯亞胺酯（經由半胱胺酸殘基接合）、N 羥基琥珀醯亞胺（經由離胺酸殘基）、戊二醛、琥珀酸酐或 此項技術中已知之其他試劑）將相關抗原與在待免疫之物 種中具免疫原性之蛋白質（例如，匙孔螺血氰蛋白、血清 白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑）接合而 獲得改良之抗體反應。 —藉由將（例如）1〇〇 μ§蛋白質或接合物（對於小鼠而言）與3 ί 體積佛氏70全佐劑（Freund's complete adjuvant)組合且將溶 ^於多個部位皮内注射而使動物對抗原、免疫原性接合物 或衍生物免疫。一個月後，藉由於多個部位皮下注射而以 佛氏完全佐劑中1/5至1/1〇原始量之肽或接合物使動物加強 2疫。在加強免疫注射後7_14天時，對動物進行採血且檢 ”清之抗體力價。對動物加強免疫直至力價平穩。較佳 :也’以相同抗原但經由不同交聯試劑接合之接合物來對動 勿加強免疫。接合物亦可於重組細胞培養物中以蛋白融合 物形式製成。又，諸如礬之凝集劑適用以增強免疫反應。 1283ll.d〇( -56- 200844110 單株抗體 單株抗體可使用K〇hler等人，Nature, 256:495(1975)首 先描述之融合瘤法或藉由重組DNA法製成。在融合瘤法 中，使小鼠或其他適當宿主動物(諸如大鼠、倉鼠或彌猴) 免疫以引出產生或㈣產生將與用於免疫之蛋自特異性結 合之抗體的淋巴細胞。或者’可使淋巴細胞在活體外免 疫。接著使用合適融合劑（諸如聚乙二醇）使淋巴細胞與骨 髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞（Goding, M〇n〇ci〇nai Antibodies: Principles and Practice，第 591〇3 頁（^⑷滅
Press, 1 986))。使如此製備之融合瘤細胞接種且生長於較 佳含有一或多種抑制未經融合親本骨髓瘤細胞生長或存活 之物質之合適培養基中。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺 乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT或hprT)， 則融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷 (HAT培養基），該等物質防止HGPRT缺乏細胞之生長。 車父仏月：¾^瘤細胞為彼專有效融合，支持由所選擇之抗體 產生細胞穩定高量產生抗體且對培養基敏感之細胞。亦描 述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨 髓瘤細胞株（Kozbor，J. Immunol·, 133: 3001 (1984); Brodeur等人 ’ Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51 _63 頁（Marcel Dekker，Inc., New York，1987))。例示性小鼠骨髓瘤細胞株包括彼等源自可 自 Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif· USA購得之MOP-21及M.C.-ll小鼠腫瘤及可自美國菌種保 128311.doc -57- 200844110
存中心（American Type Culture Collection)，Rockville，MD USA購得之SP-2或X63-Ag8-653細胞之骨髓瘤細胞株。檢 定使融合瘤細胞生長之培養基中針對抗原之單株抗體之產 生。較佳地，由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性 係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合檢定（諸如放射性免疫 檢定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（EUSA))來測定。單株抗 體之結合親和力可（例如）藉由BIAc〇re或Scatchard分析來測 疋（Munson尋人，Anal. Biochem·，107:220 (1980)) 〇 鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體之 融合瘤細胞後，可使該等純系藉由限制稀釋程序次選殖且 藉由標準方法生長⑴〇ding，M〇n〇cl〇nal Antib()dies: Principles and Practice，第 59_103 頁（Academic 卜叫， 1986))。用於此目的之合適培養基包括（例如）D_MEM〇或 RPMI 1640培養基。此外，融合瘤細胞可在活體内如動物 體内之腹水腫瘤生長。藉由習知免疫球蛋白純化程序（諸 1 如蛋白質A瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳法、透 析或親和力層析法）將次純系所分泌之單株抗體自培養 基、腹水或血清合適地分離。 抗體之重組產生 所關注之免疫球蛋白之胺基酸序列可藉由直接蛋白質定 序來測定且合適編碼核苷酸序列可根據通用密碼子表來設 計。 或者，可使用習知程序（例如藉由使用能夠與編碼單株 抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的募核苷酸探針）將 128311.doc -58- 200844110 編碼單株抗體之DNA自融合瘤細胞分離且定序。序列測定 一般將需要分離所關注之基因或CDNA之至少一部分。通 常’其需要選殖編碼單株抗體之DNA或mRNA。使用標準 技術來進行選殖（參見例如Sambro〇k等人（i989)Molecular
Cloning: A Laboratory Guide，第 1-3 卷，Cold Spring
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Harbor press，其係以引用的方式併入本文中）。舉例而 吕’可藉由反轉錄聚A+ mRNA，較佳膜相關mRNA來建構 cDNA庫’且使用對人類免疫球蛋白多肽基因序列具特異 性之探針來篩檢庫。在一較佳實施例中，使用聚合酶鏈反 應（PCR)來擴增編碼所關注之免疫球蛋白基因區段（例如輕 鏈可、k區段）之cDNA(或全長cdnA之部分）。可易於將經擴 增之序列選殖至任何合適之載體（例如表現載體、微基因 載體或噬菌體呈現載體）中。應瞭解，所使用之特定選殖 方法並非絕對的，只要其可能測定所關注之免疫球蛋白多 肽之一些部分的序列即可。 >用於選殖及定序之—個RNA來源為藉由自轉殖基因小鼠 獲得B細胞且將b細胞與永生細胞融合而產生之融合瘤。 使用融合瘤之優點為其可易於_檢，且選擇產生所關注之 人類早株抗體之融合瘤。或者’可將爾自經免疫動物之 B細胞（或全脾）分離。當使用除融合瘤以外之來源時，可 ^需要篩檢編碼具有特異性結合特徵之免疫球蛋白或免疫 姑蛋白夕肽之序列。該篩檢之—種方法為使用菌體呈現 術巫囷體呈現係描述於（例如）Dower等人，w〇 128311.doc -59- 200844110 K〇P_ski，Pr〇c. Natl. Acad Sci Κ π· 45卿)中’該等文獻各自係以引用的方式併入本文 中。在使用唆菌體呈現技術之一實施例中，將來自經免疫 之轉殖基因小鼠之eDNA(例如總脾eDNA)分離，使用pa 來擴增編碼免疫球蛋白多肽之—部分（例如⑽區）之_Α 序列，且將經擴增之序列插人㈣體载體中。藉由標準技 術（諸如淘選）來鑑別編碼所關注之肽（例如具有所需結合特 徵之可變區肽）之cDNA。 接者測疋經擴增或選殖之核酸之序列。通常，測定編碼 免疫球蛋白多肽之整個可變區之序列，然@，有時僅可變 區之-部分需要定#，例如CDR編碼部分。通常，經定序 邛刀之長度將為至少30個鹼基，且更通常將對編碼至少約 三分之一長度或至少約一半長度之可變區的鹼基定序。
可對自cDNA庫分離之純系，或當使用pCR時在次選殖 經擴增之序列後，或藉由對經擴增之區段進行直接PCR定 序來進行定序。使用標準技術來進行定序（參見例如
Sambrook 專人（1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Gmde ’ 第 i_3卷，c〇ld Spring Harb〇r Press及 Sanger，F 等 人（1977)Proc· Natl· Acad· Sci· USA 74: 5463-5467，其係 以引用的方式併入本文中）。藉由比較經選殖之核酸序列 與公開之人類免疫球蛋白基因及cDNa序列，熟習此項技 術者根據經定序之區域可易於確定⑴融合瘤免疫球蛋白多 月太（包括重鏈之同型）之生殖系區段使用及（ii)重鏈及輕鏈可 變區之序列，包括由N區添加及體細胞突變過程產生之序 128311.doc •60- 200844110 列。免疫球蛋白基因序列資訊之一個來源為National Center for Biotechnology Information, National Library of
Medicine，National Institutes of Health，Bethesda，MD。 f
經分離後，可將DNA可操作性連接至表現控制序列或置 放於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至不另外產生 免疫球蛋白之宿主細胞（諸如大腸桿菌（五c〇/〇細胞、猴 cos細胞、中國倉鼠卵巢（CH0)細胞或骨髓瘤細胞）中以引 導重組宿主細胞中單株抗體之合成。 表現控制序列表示特定宿主有機體中可操作性連接編碼 序列之表現所必需之DNA序列。適用於原核生物之控制序 列（例如）包括啟動子，視情況之操縱子序列及核糖體結合 位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號及強 化子。 當使核酸與另-核酸序列功能相關時，其經可操作性連 接舉例而5，若前序列或分泌前導子表現為參與多肽分 泌之則蛋白，則其〇财與該多肽之dna可操作性連接；若 啟動子或強化子影響編碼序狀轉錄，則其與該序列可操 作|±連接，或若核糖體結合位點經定位以便於轉譯，則其 =與編碼序料操作性連接。言，可鮮性連接意 :經連接之DNA序列為相連的且在分泌前導 :連的且在閱讀相中。然而，強化子不一定為相連二 可：由在便利的限制位點接合而完成。若不存在該等： 則可根據習知實務來使用合成募讀接附子或= 128311.doc -61 · 200844110 細胞、細胞株及細胞培養物通常可互換使用，且所有該 等名稱包括子代。無論轉移數量如何，轉化株及經轉化之 細胞亦包括初級主題細胞及源自其之培養物。亦瞭解，由 於故意或無意突變，所有子代之DNA含量可能並非精確相 同g括具有與經初始轉化之細胞中所篩檢之功能或生物 活性相同的功能或生物活性之突變子代。 亦提供編碼特異性抗體，視情況與由宿主細胞所辨識之 控制序列可操作性連接之經分_核酸，包含該等核酸之載 體及宿主細胞，及用於產生抗體之重組技術，其可包含培 養佰主細胞使得核酸得以表現，且視情況自宿主細胞培養 物或培養基回收抗體。 此項技術中已知各種載體。載體組份可包括下列各物中 之或夕者· ^號序列（其例如可引導抗體之分泌）、複製 起點、一或多個選擇性標誌基因（其例如可賦予抗生素或 其他藥物抗性、補足營養缺陷或供應培養基中不可獲得之 關鍵養分）、強化子元素、啟動子及轉錄終止序列，其皆 為此項技術中所熟知的。 a適伤主、、、田胞包括原核生物、酵母或較高等真核細胞。 合適原核生物包括真細菌（Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或 革蘭氏陽性有機體’例如腸内® (Enterohacteriaeeae)，諸 如埃希氏围（ESeheHehia)(例如大腸桿菌）、腸桿菌 (Enterobacter)、伊文氏桿菌即心⑷、克雷伯氏菌 (KlebsieUa)、變形桿菌屬（Proteus)、沙門氏菌 (Μ"101"11")(例如鼠傷寒沙門氏桿菌（Salm_lla 128311.doc -62- 200844110 typhimurium))、沙雷氏菌（Serratia)(例如黏質沙兩菌 (Serratia marcescans))及志賀氏菌（shigella)以及桿菌 (Bacmi)(諸如枯草桿菌（B· subtilis)及地衣芽跑桿菌（B licheniformis))、假單胞菌（Pseudomonas)及鍵徽菌 (Streptomyces)。除原核生物以外，真核微生物（諸如纖狀 真菌或酵母）為抗體編碼載體之合適選殖或表現宿主。釀 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)或常見麵包酵母（baker，s yeast)在低等真核宿主微生物中為最常用的。然而，通常 可使用許多其他種屬、物種及菌株，諸如畢赤酵母 (Pichia)，例如曱醇酵母（P· pastoris)、粟酒裂殖酵母 (S chi zo saccharomyces pombe) ； 刻 魯 維拉菌 (Kluyveromyces)、耶氏酵母（Yarrowia);假絲酵母 (Candida);裏氏木徽（Trichoderma reesia);粗輪脈抱菌 (Neurospora crassa);許旺酵母（Schwanniomyces)，諸如西 方許旺酵母（Schwanniomyces occidentals);及絲狀真菌， 諸如脈孢菌（Neurospora)、青黴菌（Penicillium)、彎頸黴菌 (Tolypocladium)及曲黴菌（Aspergillus)宿主，諸如構巢麯 黴（A. nidulans)及黑曲黴菌（A· niger)。 用於表現糖基化抗體之合適宿主細胞係源自多細胞有機 體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別 許多來自諸如草地黏蟲（Spodoptera frugiperda)(毛蟲）、埃 及伊蚊（Aedes aegypti)(蚊子）、白紋伊蚊（Aedes albopictus) (蚊子）、黑腹果蜗（Drosophila melanogaster)(果蠅）及家蠶 (Bombyx mori)之宿主的桿狀病毒株及變異體及相應容許 128311.doc -63- 200844110 昆蟲宿主細胞。用於轉染該等細胞之各種病毒株可公開獲 得，例如苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica)NPV之L-I 變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株。 然而，最感興趣者為脊椎動物細胞且培養物（組織培養 物）中脊椎動物細胞之繁殖為常規的。適用之哺乳動物宿 主細胞株之實例為中國倉鼠卵巢細胞，包括CHOK1細胞 (ATCC CCL61)及中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(DXB-11、DG-44 ; Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980));由 SV40轉化之猴腎 CV1 株系（COS-7，ATCC CRL 1 65 1);人類胚胎腎株系（經次選殖以於懸浮培養物中生長 之 293 或 293 細胞，[Graham 等人，J. Gen Virol. 36: 59 (1977)];幼倉鼠腎細胞（ΒΗΚ、ATCC CCL 10);小鼠塞爾 托利細胞（Sertoli cell)(TM4，Mather，Biol· Reprod· 23: 243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠 猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL- 15 87);人類子宮頸癌瘤 細胞（HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠（buffalo rat)肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（WI38，ATCC CCL 75);人類肝 腫瘤細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人，Annals N.Y Acad· Sci· 383: 44-68 (1982)); MRC 5 細胞及 FS4 細 胞。 可在各種培養基中培養宿主細胞。市售之培養基，諸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、最低必需培養基（(MEM)，Sigma)、 128311.doc -64- 200844110 RPMI-1640(Sigma)及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)((DMEM)，Sigma)適 用於培養宿主細胞。此外’描述於Ham等人，Meth. Εηζ· 58: 44 (1979) ; Barnes 等人，Anal· Biochem. 102: 255 (1980);美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5，122,469 號、 W090103430、WO 87/00195、或美國專利公開案第 3〇,985 號中之任何培養基均可用作宿主細胞之培養基。若需要， 可以激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白或表 皮生長因子）、鹽（諸如氣化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽）、緩 衝劑（諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸
培養宿主細胞後，抗體可於周質空間
使用所闕注 胞内產生，或 步驟細胞内產 片（宿主細胞或 J28311.doc 陽離子或陰離子交換 闕注之抗原或蛋白質 -65- 200844110 A或蛋白質G作為親和力配位體來純化抗體組合物。蛋白 質A可用以純化基於人類γ1、”或”重鏈之抗體（Lindmark 等人，J· Immunol· Meth· 62:卜13 (1983))。蛋白質 G 係推 薦用於所有小鼠同型及人類y3(Guss等人，2〇 EMB〇 5: 15671575 (1986))。親和力配位體所連接之基質為最通常 之瓊脂糖，但亦可使用其他基質。機械穩定基質，諸如受 控微孔玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯容許比可以瓊脂糖所 ^ 達成者快之流動速率及比其短之加工時間。當抗體包含 1 CH3域時，BakerbondABXTM樹脂（j· T. Baker，Phillipsburg， 25 NJ·)適用於純化。視待回收之特異性結合劑或抗體而 疋，其他蛋白質純化技術（諸如乙醇沈殿、逆相HpiC、色 譜聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱）亦為可行的。 手邊具有本專利申請案資訊之熟習此項技術者將易於知 曉如何進行本發明之方法。一個實例為以具有seqidn〇： 2序列之多肽塗覆瓊脂糖管柱，隨後與源自該樣本之免疫 、 球蛋白部分（抗體部分）一起培育，進行洗滌步驟且隨後對 與管柱結合之APGNST)特異性抗體進行溶離。對於本發 明之分離法而言，包含Ap多肽之胺基酸序列之多肽（其中 Αβ多肽之序列至少具有SEQ ID N〇: 2之序列且至多具有 SEQ ID N0: 4之序列）額外包含諸如標籤或標誌之部分， 尤其生物素、抗生蛋白鏈菌素、GST、ms、STREp-標 籤、Myc、HA、聚-L-離胺酸、聚_L_離胺酸丄_丙胺酸共聚 物、聚-Aib(a·胺基異丁酸）、聚_β_丙胺酸、聚_L_丙胺酸、 聚-D-離胺酸 '聚_D_離胺酸_D_丙胺酸共聚物、聚_d_丙胺 128311.doc -66 - 200844110 酸或聚-L-胺基酸與聚_D_胺基酸之組合。此等標誌可提供 此多肽與載體之便利化結合。溶離（亦即將本發明之多肽 與載體分離）可（例如）藉由應用至pH值為2之短期值改 變，藉由添加過量之包含犯(5 ID N〇: 2之序列的多肽，或 藉由增加溶離緩衝劑之鹽含量來達成。此外，將多肽自受 檢者企清分離或自市售IVIgG製劑分離之非限制性實例係 於本發明申請案之實例部分更詳細給出。 抗體不僅可源自人類受檢者，亦可源自動物。除以類似 於上述方法之方法將預先存在之抗Ap(21_37)自體抗體自 该動物之血液分離以外，可額外以包含Αβ多肽之胺基酸序 列之多肽使該等動物免疫，其中該Αβ多肽之序列至少具有 SEQ ID NO: 2之序列且至多具有SEQ m Ν〇: 4之序列。若 干輪免疫後，可藉由常規方法自動物血液中獲得相應的產 生Αβ特異性抗體之B細胞。 若需要，則可（例如）藉由將細胞自動物之脾分離且藉由 以艾巴病毒（Epstein Barr virus)轉染使其永生或藉由將細 胞與骨髓瘤細胞融合（融合瘤技術）來將該等B細胞純系（人 類或動物來源）轉化為細胞株。融合瘤技術特別適用於大 量產生抗體。 或者’（若合適）可藉由習知多肽合成，藉由活體外轉譯 或藉由合成多肽及蛋白質之任何其他方式直接合成本發明 夕狀°、、‘此項技術者熟悉眾多適當的技術且能夠容易地 將其應用於本發明標的物。 此外’與澱粉樣蛋白_P(1_4〇)(SEq 1〇 No:丨）之抗原決定 128311.doc -67- 200844110 基Ap(21_3 7)(SEQ ID NO·· 2)結合之多肽可源自除抗體以外 之其他蛋白質。舉例而言，抗運載蛋白（anticaHn)可經工 矛王化以與某些抗原決定基結合，亦即與以seq 2表 示之抗原決定基結合。#運載}白為一類基於月旨質運載蛋 白支架之經工程化之配位體結合蛋白。使用環狀區之靶向 突變及生物化學選擇技術，可產生低分子量物質及巨分子 蛋白靶之具有新穎配位體特異性之變異體（參見de i99 Μ 068 ; Schlehuber等人，J· Mol· Bi〇1 (2〇〇〇)，297 ⑺第 1 105-1 120 頁；Expert 0pin Bi〇1 几以 2〇〇5, 5(ιι)，第 1453-62頁）。該多肽與Αβ c端部分，尤其與八0(21_37)之結 合亦可提供對Αβ肽聚合之抑制且因此提供治療及/或預防 阿茲海默氏症及其他神經性失智疾病之有效方式。 亦可經由重組表現系統獲得本發明之多肽。為表現本發 明之多肽，必需產生各別核酸表現構築體。因此，本發^ 亦係關於具有編碼本發明之多肽，尤其編碼上述抗體、其 衍生物或片段中之一者之輕鏈或重鏈，或編碼本發明之另 一蛋白質（諸如與Αβ(2 1-37)結合之抗運載蛋白的序列之核 酸。該核酸可（例如）藉由（例如）經由質譜法，經由Edm扣定 序或熟習此項技術者已知之任何其他蛋白質定序法來鑑別 上述肽中之一者之胺基酸序列而獲得。根據遺傳編碼，核 酸序列可源自胺基酸序列。較佳地，使所產生之核酸序列 關於所關注各別表現系統之密碼子使用最佳化。或者， 分離表現該抗體之細胞（見上文）且對編碼對Ap之c端具特 異性之抗體重鏈及輕鏈的基因座或111111^入進行定序。對於 128311.doc -68- 200844110 某些表現系統而言，此核酸序列可能需經調適以提供最佳 密碼子使用。手邊具有上述核酸序列之熟習此項技術者將 能夠容易地產生用於合適表現系統之表現構築體。因此， 本發明亦係關於提供本發明多肽之表現之表現構築體，且 係關於表現本發明之多肽或其片段之分離細胞。表現構築 體（亦即載體）包括質體、黏質體、病毒（噬菌體、動物病毒 及植物病毒）、附加體及人造染色體（例如YAC)。熟習此項 技術者能夠藉由標準重組技術建構載體。該細胞可為（例 如）骨髓瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞、敍利亞倉鼠卵巢細 胞、人類胚胎腎細胞、昆蟲細胞（桿狀病毒系統）或經本發 明之表現載體轉化之轉殖基因植物細胞（參見Schiiiberg等 人 ’ Cell Mol Life Sci· 2003 60(3):第 43 3-445 頁）或内因性 表現本發明之多肽之細胞（融合瘤）。本發明重組多肽之表 現不限於真核細胞，且亦可於原核生物體内表現。可藉由 此項技術中所熟知之純化方式自任何該細胞獲得本發明之 重組多肽。 在一較佳實施例中，本發明之多肽為抗體或其片段且視 情況經兩個表現載體（亦即一個輕鏈表現載體及一個重鏈 表現載體）編碼。 為於多肽片段Αβ(2 1-37)内結合，抗體或其片段首先需 要元整抗原結合域（可變域）。該抗體恆定區對於抗原結合 而0通书並非絕對的。因此，熟習此項技術者清楚，若本 發明之多肽為抗體或其片段，則此抗體/片段可具有選自 由1gG、IgM、igA、igD及IgE組成之群之任何給定同型， 128311.doc -69- 200844110 包括此等同型之所有各另^ ^ ^谷別子類。若本發明之多肽 胞或融合瘤細胞中表現為抗體，則該同型可藉由額外表現 或投與活化誘發之胞㈣核㈣彳# 者已知之刺激因子來轉換。 在只把例中，將本發明之多肽與預防斑塊凝隼及/或 致使毒性娜聚物分裂之㈣化學偶合或融合。該物質可 為（例如）裂解用於實驗表糌太表 录徵本發明之抗原決定基之澱粉樣 ί 蛋白β多肽的蛋白酶，亦即絲胺酸_蛋白酶，如姨蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶，·或Lys_C蛋白酶、Arg，白酶、Asp_N-蛋 白酶，亦非特異性蛋㈣，諸如蛋㈣m菌蛋白 酶、枯草桿菌蛋白酶。 本發明亦係關於將本發明多肽自樣本分離之方法，該方 法包含以下步驟： a) 將包含Αβ多肽胺基酸序列之多肽與樣本一起培育，其中 Αβ多肽之序列至少具有SEQ ID Ν〇: 2(亦即Αβ(2ΐ3川之 序列且至多具有SEQIDN0: 4(亦即αΡ(12_4〇))之序列， 該多肽係固定於載體上。 b) 將4樣本與載體分離。 c) 將與步驟a)之多肽結合之本發明多肽與載體分離。 在一替代方法中，本發明之多肽可藉由將樣本與包含八@ 多肽之胺基酸序列之多肽一起培育來獲得，其中在與載體 一起培育之前，Αβ多肽序列至少具有SEQ m N〇: 2之序列 且至多具有SEQ ID NO: 4之序列。因此，本發明亦係關於 將本备明多肽自樣本分離之方法，該方法包含以下步驟： 12831 l.doc -70- 200844110 a) 將包含Αβ多肽之胺基酸序列之多肽與樣本一起培育，其 中Αβ多肽序列至少具有SEq ID Ν0: 2之序列且至多具有 SEQ ID NO: 4之序列，及隨後 b) 將該樣本與對步驟a)之多肽具有結合親和力之載體一起 培育，及 c) 將該樣本與載體分離，及， d) 將與步驟a)之多肽結合之本發明多肽與載體分離。 此項技術中熟知獲得上述多肽之策略及技術，亦即經由 於所關注之細胞株中基因工程化及表現各別多肽。本發明 之抗體片段不必在實體上源自完整抗體，且亦可藉由習知 方式經基因工程化。 上述多肽可（例如）藉由篩檢源自人類受檢者血液之抗體 與SEQ ID NO 1之胺基酸21至37(亦即SEQ ID NO: 2)的結 合能力而獲得。 治療方法 在另一態樣中，本發明係關於上述本發明多肽於人類醫 學及獸醫學中之用途。 詳言之，本發明之多肽可用於製造用來治療及/或預防 下列疾病之進展的藥劑：阿茲海默氏症、唐氏症候群、路 易體型癡呆、額顳葉型癡呆、澱粉樣腦血管病變及/或殿 粉樣變性病。 此外，本發明係關於包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽的用 途，其中該Αβ肽至少具有SEQ ID NO: 2之序列且至多具有 SEQ ID NO: 4之序列，該包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽係 128311.doc •71 · 200844110 用於人類醫學及獸醫學’特別係用於製造供治療及/或預 防下列疾病之藥劑：阿兹海默氏症、唐氏症候群、路易體 型癡呆、額顳葉型癡呆、殿粉樣腦血管病變及殿粉樣變性 病。 在本發明中，本發明者鑑別由自AD患者以及健康對照 個體之血清分離之Αβ自體抗體所辨識的兩個^抗原決定 基序列。發現健康對照個體之Α(3自體抗體特異性辨識邱 序列之c端部分，亦即Ap(21_37)(SEQ m Ν〇· &此外， AD患者具有分數增加之辨識Αβ多肽之續*部分（剛 ID NO. 3)的抗體，同時具有分數降低之辨識轉多狀之 Αβ(2 1-37)部分之抗體。此外，本發明者發現在+羅患ad 之健康個體體内，針對Αβ之特異性c端抗原決定基（亦即 Αβ(21-37))之Αβ自體抗體量與結合郫(4_1〇)之郫自體抗體 量的比率遠高於AD患者。與此抗原決定基之結合似乎抑 制斑塊之形成且因此延遲AD之發作或進展。其提供藉由 ( 向人類受檢者或動物投與藥劑之新治療方法之基礎，該等 某背]與忒抗原決疋基結合且藉此預防八卩肽之凝集。其延遲 阿茲海默氏症之發作及/或進展，且因此提供有價值的治 療性/預防性藥物。 本發明者咸信其已鑑別一類隨時間由進化選擇之靶向 之毒性募聚物的天然人類抗體作為人體防止神經性失智疾 病之天然方式。預期該等抗體不具有病理效應，諸如彼等 藉由與血官中Αβ或相關肽結合而誘發之效應（pfeifer等 人，Sclence，298:1379 ; Herzig等人，Nat Neur〇sicence 128311 .d〇c -72- 200844110 7:954-960 (2004)) 〇 因此，本發明亦传腿 J係關於上述多肽用於製 或預防下列疾病之進展 w用乂〜療及/ 阿兹海默氏症、唐氏症候雜 疾病、 &症候群、路易體型癡呆、 呆、澱粉樣腦血管病傲B 領顳葉型癡 扃鲛及澱粉樣變性病。上述 療/預防係藉由預防Αβ斑塊 ' /… 段而定，其產生對疾病之預各別㈣^ 後Η例如)藉由預防斑塊之進編 /形成。在一較佳實施例 中，調配用於治療及/或預防患者腦中斑塊之藥劑。 或者’如以上已指出’本發明亦係關於包含郫多肽之胺 基酸序列之多肽（其中Αβ多肽至少 狀主ν具有SEQ ID NO·· 2之序 列且至多具有SEQ ID NO· 4 +广X丨、 •之序列）用於製造供治療下列 疾病之藥劑之用途：阿兹海默氏症、唐氏症候群、路易體 型癡呆、額顳葉型癡呆、殿粉樣腦血管病變及/或殿粉樣 變性病。在該情形中，此抗原決定基用於使人類或動物受 檢者主動免疫以增強對抗Αβ(21·37)之内因性抗體產生。 該免疫法亦可利用DNA疫苗，其具有避免投與^蛋白片段 之優點。因此’本發明亦係關於編碼包含Αβ多狀之胺基酸 序列之多肽的核酸分子，其中Αρ多肽至少具有SEQ m NO: 2之序列且至多具有SEQ ID N〇: 4之序列。因此，本 發明亦係關於此核酸序列用於製造供治療及/或預防下列 疾病之藥劑的用途：阿茲海默氏症、唐氏症候群、路易體 型癡呆、額顳葉型癡呆、澱粉樣腦血管病變或澱粉樣變性 病0 128311.doc 73· 200844110 醫藥調配物之投與及製備 可將抗Αβ抗體調配為包含適用於所需傳遞法之載體之醫 藥組合物。合適載體包括任何材料，該材料在與抗體組合 時保持Αβ之高親和力結合且不與受檢者之免疫系、统反應。 實例包括（但不限於）許多標準醫藥載體中之任何者，諸如 無菌填酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、抑菌水及其類似物。可 使用各種水性載體，例如水、緩衝水、〇.4%生理食鹽水、 广0.3%甘胺酸及其類似物，且該等水性載體可包括進行適度 ' 化學改質或其類似者用於增強穩定性之其他蛋白質，諸如 白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。 調配物中例示性抗體濃度可在約〇1 mg/ml至約18〇 • mg/ml或約 〇·1 mg/ml至約 50 mg/m卜或約 〇·5 mg/ml至約 25 mg/ml，或約2 mg/ml至約10 mg/ml之範圍内。可製備（例 如）pH值在約4.5至約6·5，或約4·8至約5.5，或約5〇範圍内 之pH值緩衝溶液中之抗體的水性調配物。適用於此範圍内 ( 之pH值之緩衝劑實例包括（例如）乙酸鹽（例如乙酸鈉）、琥 珀酸鹽（諸如琥珀酸鈉）、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及 其他有機酸緩衝劑。視（例如）緩衝劑及所需調配物等張性 而疋’緩衝劑濃度可為約1 mM至約200 mM，或約10 mM 至約60 mM。 调配物中可包括亦可穩定抗體之張力劑。例示性張力劑 包括糖醇’諸如甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。較佳地，水性 調配物為等張的，儘管高滲或低滲溶液可為合適的。調配 物中糖醇之例示性濃度可在約1 %至約i 5〇/。w/v之範圍内。 128311.doc -74- 200844110 亦可向抗體調配物中添加界面活性劑以降低所調配抗體 之凝集及/或使調配物中微粒之形成最小化及，或降低吸 附。例示性界面活性劑包括非離子界面活性劑，諸如聚山 梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯8〇)或泊洛沙姆 (poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。例示性界面活性劑濃度 可在約至約〇.5%，或約G.⑻5%^G2%，或約 0.004°/。至約〇.〇i%w/v之範圍内。 在一實施例中，調配物含有以上所鑑別之試劑（亦即抗 體、緩衝劑、多元醇及界面活性劑）且基本上不含一或多 種防腐劑，諸如苄醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇及苄索氣 銨。在另一實施例中，調配物中可包括（例如）約〇1%至約 2%，或約0·5%至約1%範圍内之濃度之防腐劑。調配物中 可包括一或多種其他醫藥學上可接受之載體、賦形劑或穩 定劑，諸如描述於Remington，s Pharmaceutical第 16版，〇sol，A•編（1980)中之彼等載體、賦形劑或穩定劑， 其限制條件為其不會不利地影響所需調配物特徵。可接受 之載體、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受 者無毒性且包括：額外緩衝劑；共溶劑；抗氧化劑，包括 抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，諸如EDTA ;金屬錯合物 (例如Zn-蛋白質錯合物）；生物可降解聚合物，諸如聚酯； 及/或成鹽抗衡離子，諸如鈉。 藉由以凍乾調配物或水溶液之形式將具有所需純度之抗 體與可選之生理上可接受之載體、賦形劑或穩定劑 (Remington’s Pharmaceutical Sciences 第 16版，〇s〇i，a 編 128311.doc -75- 200844110 ())^ °來製備抗體治療性調配物以供儲存。可接爲之 無毒性，1包括:：: Γ用之劑量及濃度下對接受者 機酸;抗氧化劑:=碟酸鹽、檸檬酸鹽及其他有 如十八基二ΨΛ 壞血酸及曱硫胺酸；防腐劑（諸 :―甲基卞基氯化銨；氯化六羥季銨；氣化苯甲烴 銨、苄索氯銨；1齢、Τ ^ 4、 丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯， “ °、羥基本曱酸甲酯或對羥基苯曱酸丙兒茶酚；間 r
本一紛；環己醇；3-戊醇；及間甲紛)；低分子量(小於約 :個殘基)之多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免 疫球蛋白’親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基 酸’諸如甘胺酸、麵醯胺酸、天冬醯胺酸 酸或離胺酸…、雙畴及其他碳水化合物，包括葡二 糖、甘露糖、麥芽糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖， 諸如嚴糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子， 諸如鈉，金屬錯合物（例如Ζη_蛋白質錯合物）；及/或非離 子界面活性劑，諸如TWeentm、plur〇nicstm或聚乙二 醇（PEG)。 在κ %例中’合適調配物含有等張緩衝劑（諸如磷酸 鹽、乙酸鹽及丁RIS緩衝劑）以及調節張力且穩定化之張力 Λ (諸如糖醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化鈉）。該張力劑之一 貝例為5 /〇山梨糖醇或蔗糖。此外，調配物視情況可包括 界面’舌性劑以便防止凝集且用於穩定在0.01至〇·〇2% w/v。 周配物之pH值可在4.5-6.5或4.5至5·5之範圍内。抗體醫藥 。周配物之其他例示性描述可見於US 2003/01 133 16及美國 12831 l.d〇c -76- 200844110 專利第6，m，586號中，其各自之全文係以引用的方式併人 本文中。 本文中之調配物（若需要）亦可含有一種以上之活性化合 物用於所治療之特定適應症，較佳為具有彼此無不利料 之互補活性之彼等化合物。舉例而言，可能需要進一步提 供免疫抑制劑。該等分子合適地以對於所欲目的有效之量 組合存在。 里 r〜活性f份亦可包封於以下各者中：（例如)藉由凝聚技 岈或藉由界面承合製備之微囊（分別例如羥甲基纖維素 或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲醋）微囊）；膠狀藥物傳遞 系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及 奈米膠囊）；或巨乳液或微細胞。該等技術係揭示於 Remlngton’s PharmaceuUcaI Scienc^ _，〇 (1980)中。 ’ ·‘ 亦涵㈣㈣及晶體形式之抗體。製造懸浮液及晶體形 〔 式之方法為熟習此項技術者所已知。 ‘ 肖用於活體内投與之調配物必須為無菌的。可藉由習 ^熟知之殺菌技術對本發明組合物殺菌。舉例而言，殺 困易於糟由經由無菌濾膜過濾來完成。所 以供使用或在無菌條件下坍、卢曰、去私 、，工匕褒 制卞"— 、困條件下過濾且凍乾，投與前將經凍乾之 組合。通常採用冷凌乾燥法以使多肽穩定 ,纟其當多肽在液體組合物中相對不穩定時 ’、、、0 4 。凍乾週期通常包含三個步驟 . 及次級乾烨.w.n. Q凍、初級乾秌
WlUl_ 及 P0川，Joun-1 of ParenteraI 128311.doc -77- 200844110
Science and Techn〇1〇gy，第 38 卷，第 2 期第 Μ·” 頁 (1984)。在冷凍步驟中，使溶液冷卻直至其經充分冷凍。 溶液中之大量水在此階段形成冰。冰在初級乾燥階段中昇 華，其係藉由使用真空使腔室壓力降低至冰之蒸氣壓力以 下來進行。最終，在降低之腔室壓力及升高之存放溫度下 於次級乾燥階段移除所吸附之水或結合水。該方法產生稱 為凍乾餅塊之材料。其後，可在使用前將餅塊復水。 翁: ’東乾材料之標準復水實務為添加回一體積純水（通常等 效於在凍乾期間所移除之體積），儘管有時將抗菌劑之稀 溶液用於產生供非經腸投與之藥物；Chen，Drug Devel〇pment 及 Industrial pharmacy，第 18 卷 第。及匕 期，第 13 1 1-1354頁（1992)。 在些h況下已指出賦形劑係用作冷;東乾燥產物之穩定 劑 ’ Carpenter等人，Developments in Biological Standardization， 第74卷’第225-239頁（1991)。舉例而言，已知賦形劑包括 、 糖醇（包括甘露糖醇、山梨糖醇及甘油）；糖（包括葡萄糖及 蔗糖）；及胺基酸（包括丙胺酸、甘胺酸及麵胺酸）。 此外，糖醇及糖通常係用以保護多肽使其免受冷凍及乾 燥所誘發之損害且增強以乾燥狀態儲存期間之穩定性。一 般而言’糖，尤其雙醣在冷凍乾燥過程中及儲存期間皆為 有效的。已報導其他種類之分子（包括單醣及雙醣）及聚合 物（諸如PVP)亦為凍乾產物之穩定劑。 對於注射而言，醫藥調配物及/或藥劑可為適用於以上 128311.doc -78- 200844110 述適當溶液復水之粉末。其實例包括（但不限於）冷來乾燥 粉末、旋轉乾燥粉末或噴霧乾燥粉末、非晶形粉末、^ n殿物或微粒。對於注射而言，調配物可視情況含有 穩定劑、pH值改質劑、界面活性劑、生物可用性改質劑及 其組合。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含 有抗體之固體疏水性聚合物之半透基質，該等基質係呈成 形物品之形式，例如薄膜或微囊。持續釋放基質之實例包 括聚酯、水凝膠（例如聚（2_羥乙基_甲基丙烯酸酯）或聚（乙 烯醇））、聚交酯（美國專利第3,773,919號）、L_麩胺酸與丫乙 基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可 降解乳酸-乙醇酸共聚物，諸如Lupr〇n Dep〇tTM(包含乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林（leupr〇Ude acetate)之可注射 微球體）及聚-D七）-3_羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯 酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠釋放分子歷時超過丨〇〇天， 但某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短之時段。當經囊封之抗 體保持於體内歷時較長之時間時，其可由於暴露於3 tC之 濕度下而變性或凝集，導致生物活性喪失及免疫原性或其 他功能特性有可能改變。視所涉及之機制而定可設計用於 穩定化之合理策略。舉例而言，若發現凝集機制為經由 硫-二硫互換形成分子間s-s鍵，則穩定化可藉由修飾硫氫 基殘基，由酸性溶液凍乾，控制水分含量，使用適當添加 劑且研製特定聚合物基質組合物來達成。 如本文所述可將本發明之調配物設計為短效，快速釋 128311.doc -79- 200844110 放’長效或持續釋放調配物。因此 ri,, ^ . 口此，亦可調配醫藥調配物 以違成党控釋放或緩慢釋放。 可視疾病病況、受檢者年齡、體重、一 叙健康狀況、性 =特：:：間間隔、投藥途徑、排泄速率及藥物組 來调即特疋劑罝。含有有效量之以上劑型中之任何者完 全在常規實驗之範圍内，且因此& ^ 且口此几全在本發明之範疇内。 特』結合劑或抗體係藉由任何合適之方式投盘 非經腸、皮下、腹膜内、肺内 11右為局部治療所需 二1為病灶内投與。非經腸輸液包括靜脈内、動脈内、 =二肌肉内、皮内或皮下投與。此外，特異性結合劑 或抗體合適地藉由脈動輸液 、 将幻以哀減劑Ϊ之特異性会士 a诏或抗體脈動輸液而投與。 ^ 1、 叙仏地，部分視投藥為輛軔 或長期投藥而定，给攀#兹± 〜 暫 广…条係精由注射，最佳靜脈内或皮下注 射、·、6予。涵盖其他投華纟 -黏膜、首腺“法，包括局部投與，尤其為經皮、 置：之導ΐΓ二服或局部投與(例如經由緊鄰所需部位 g取么地，抗體係經靜脈内於生理溶液中以 0.01 mg/kg至】〇〇 m /k § kg之間靶圍内之劑量，以每日至每週 3至：月之頻率(例如每天、每隔-天、每三天或每週： 、或6次），較佳以〇1至45叫~、〇1至15 ^錢續g範圍内之劑量，以每週如次之頻率，= 至45 mg/kg，每月一次而投與。 〆 對腦投藥 此項技術中已知會银料_ & ^ 而言，化合物可夢由直:與化合物之各種方法。舉例 了精由直接腦室内或鞘内注射，較佳經由緩 128311.doc -80 - 200844110 慢輸液以使對腦實質衝擊最小化而投與。亦可使用腦中緩 慢釋放植入物或（若藥物為多肽）所植入之產生藥物之重組 細胞來傳遞所需藥物。血腦障壁（BBB)可伴隨藥物投與而 被滲透以許可藥物跨過BBB移動。滲透劑包括諸如高滲甘 露糖醇之滲透劑，或另一種滲透劑，諸如緩激肽、烧基甘 油、超音、電磁輻射或副交感神經支配。 或者’可利用受體介導之轉運來對腦投藥。此項技術中 已知直接跨過BBB之肽及蛋白質可用作容許治療劑在傳遞 至血流中之後跨過BBB之選擇性治療劑的載體（pan等人，
Brain Research Reviews，46:32-43，2004 ; Misra等人，J
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Pharmacol Ther· 2004年 10 月；104(1):29-45 ; Poduslo，美國 申明公開案弟 2003/00821 91 號；Poduslo 等人，Biochem 43:6064-6075，2004)。舉例而言，p0(jusi0，w〇 03/020212 描述抗體與澱粉樣蛋白β蛋白片段接合，接著由低密度脂 蛋白受體相關蛋白-1 (ΒΒΒ處之轉運體）吸收。跨過βββ之 肽之其他實例包括與運鐵蛋白受體（ΒΒΒ處之轉運體）結合 之運鐵蛋白；運鐵蛋白受體之單株抗體，諸如〇χ26 ;細 胞穿透肽，諸如ΤΑΤ轉導域、穿膜肽⑦⑶价州…或Syn B1 ;及與低密度脂蛋白受體相關蛋白_2(bbb處之另一種轉 運體）結合之RAP(參見pan等人，j Cell Sci 2004 Oct l;117(Pt 21)··5071·8)。 文體所介導之對腦之藥物傳遞可採用嵌合肽技術，其中 將不可轉運之藥物與ΒΒΒ轉運載體接合。後者可為經歷活 128311.doc 200844110 體内受體介導之穿過BBB之轉胞吞作用的經修飾蛋白或、☆ 體特異性單株抗體。以化學連接子、抗生物素蛋白_生^ 素技術、？炎乙二醇連接子或脂質體促進藥物與轉運載體之 接合。以嵌合肽技術將多種治療物質傳遞至腦，包括基於 肽之藥物、反義治療物質(包括肽核酸(pNA))及併入：質 體内之小分子。或者，可將藥物囊封於脂質體或奈米粒子 中’接著將其與BBB轉運載體連接。 與其他藥劑一起投與 抗體可與其他抗澱粉樣蛋白基因治療劑同時投與。同時 投與包：於不同時間且以不同途徑投與兩種不同治療劑， 只要在藥#丨發揮其治療效應期間存在 、此項技術:已知之例示性抗屬蛋白劑:二 私樣蛋白|3抗冑，此項技術中已知的降低搬粉樣蛋白積聚 之病原效應之消炎藥（例如⑽剔及心_2抑制劑）；降低膽 固醉樂，、β_分泌酶抑制劑；或降低歸因於投與Αβ抗體之炎 性反應或允許監測抗Αβ抗體之副作用之消炎藥。 本心明之樂劑之投與可經由任何常見途徑達成。儘管靜 脈途徑為較佳實施例’但涵蓋其他投藥途徑。其包括口 服、工T經頰、經直腸、經陰道或局部投藥途徑 者’投與可藉由正位、皮内、皮下、肌肉内投 與。 仅 2另—較佳實施例中’調配包含本發明之多肽之本發明 ==於t別疾病之第二藥劑組合投與。該等治療物 、貝1，、，、乙&膽鹼酯酶抑制劑或NMDA(N-甲基-D-天冬 128311.doc -82- 200844110 同時或之 胺酸鹽）受體拮抗劑。可在第二藥劑投與之前 後投與本發明之藥劑。 在另一態樣中，本發明係關於治療及/或預防下列疾病 之方法：P可茲海默氏症、唐氏症候群、路易體型癡呆、、: 顳葉型癡呆、澱粉樣腦血管病變或澱粉樣變性病，其包含 向有此需要之受檢者投與上述本發明多肽中之一或多者。
本發明亦係關於包含Αβ多肽之胺基酸序列之多肽用於將 本發明多肽自樣本分離的用途，其中Αβ多肽序列至少具有 SEQ ID NO·· 2(亦即Αβ(21_37))之序列，且至多具有seq出 >^〇:4(亦即八0(12-4〇))之序列。 偵測及量測疾病進展 肽 在另一態樣中，提供適用於偵測及/或量測阿茲海默氏 症及其他神經性失智疾病進展之Αβ肽。 本發明者鑑別由自AD患者以及健康對照個體血清分離 之Αβ自體抗體所辨識的兩個Αβ抗原決定基序列。發現健 康對照個體之Αβ自體抗體特異性辨識Ap序列之c端部分， 亦即AP(21-37)(SEQ ID NO: 2)或包含Αβ(21·37)之任何其他 序列。此外，AD患者具有分數增加之辨識Αβ多肽之Ν端， 尤其Αβ(4-10)抗原決定基（SEQ ID NO·· 3)之抗體，同時具 有分數降低之辨識Αβ多肽之c端，尤其Αβ(21-37)抗原決定 基或包含Αβ(21-37)之任何其他序列的抗體。其提供藉由 測定Αβ抗體之新穎早期AD診斷法之基礎，其中對於受檢 者疾病進展之預後而言，升高之Αβ自體抗體（Αβ2ι_37)含 128311.doc -83- 200844110 為丨生^曰示亦即π健康’’，而升高之"斑塊特異性"Αβ(4-ίο)抗體含量為負性指示，亦即”患病，，。 在心樣中’本發明係關於包含Αβ肽之胺基酸序列 之多肽，其中Αβ肽至少具有seq ι〇 Ν〇· 2之序列且至多具 有SEQ ID NO: 4之序列。 /、有如上所列出之八爲序列之本發明多肽可為（例如）澱粉 樣蛋白β自身之Αβ(2ΐ-37)片段。其他可能之實施例包含（例 ( ' 如）Αβ(2ίΜ7)、Αβ(12_37)、Ap(12-40)(SEQ ID NO·· 4)、 1 Αβ(2ίΜ〇)、Αβ(21_40)等。此多肽片段可與其他部分接 合。其意謂本發明之多肽除Αβ(21-37)部分以外亦可包含 〃他夕肽序列或非多肽結構或部分。與多肽片段連接之 • 彳刀可促進本發明方法之效能。在其他態樣中，Αβ多肽可 • 形成寡聚物。該等寡聚物之實例包括(但不限於)募聚形式 之Αβ(1’或寡聚形式之Αβ〇2_3〇)或募聚形式之项21_ 37) ° ( 因此，在一較佳實施例中，本發明之多肽額外包含諸如 標籤或標誌之其他部分，其尤其有利於多肽與載體之連 接。詳言之，該等標籤可提供多肽於以各別拮抗劑塗覆之 載體上的固定。該等部分之實例為生物素、抗生蛋白鏈菌 素、GST、HIS、STREP-標藏、Myc、ΗΑ、聚心離胺酸、 聚心離胺酸—L-丙胺酸共聚物、聚种，基異丁酸）、
聚β丙胺鲅丙胺酸、聚離胺酸、聚離胺酸_ D-丙胺酸共聚物、聚_D_丙胺酸或聚心胺基酸與聚』-胺基 西夂之、、且ά如些本發明方法中所使用，包含SEQ ID NO 128311.doc -84 - 200844110 3之序列且至多包含SEQ ID NO: 5之序列之多肽亦可包含 該等額外部分。 可將上述肽標誌與分別具有（例如）SEQ ID NO 2或3序列 之夕肽直接融合。若標誌/標籤與（例如）A(3(21_37)肽之間 而要較向可撓性，則可引入連接子。該等連接子可（例如） 為聚甘胺酸或聚丙胺酸連接子。可將生物素（非肽物質）與 本發明多狀共價連接。自先前技術已知眾多可能用於固定 本發明多肽之標誌與載體之組合。 在一較佳實施例中，具有（例如）SEq ID NO: 2之序列之 上述多肽的區域不為β摺疊構型。已展示Αβ之β摺疊片構型 為產生神經毒性之原因。因此，健康個體體内之Αρ(2 ^ _ 3 7)抗體特別辨識Αβ(21-3 7)區或包含Αβ(21-3 7)之任何其他 序列（若其為無規線圈或α螺旋構型）。因此，在另一較佳 實施例中，上述具有SEq ID ΝΟ: 2之序列或包含Αβ(21_37) 之任何其他序列的多肽之區域側接有胺基酸序列，其防止 或減少具有SEQ ID NO: 2之序列之多肽區之β摺疊形成。 較佳地，該等側接胺基酸序列位於緊密接近於Αβ序列段 (例如具有SEQ ID NO: 2之序列）之Ν端及/或C端處，及/或 該等側接胺基酸序列包含寡聚肽，該等募聚肽包含（例 如）L-丙胺酸、D-丙胺酸、Aib(a-胺基異丁酸）、β_丙胺 酸、D-顯胺酸、L-甘胺酸、D-甘胺酸及/或相關疏水性胺 基酸。特別較佳之側接胺基酸序列為寡聚肽，諸如_(L_丙 胺酸）η-、-(D-丙胺酸）n-、-(Aib)n-、-(β-丙胺酸）n— _(〇_ 綠 胺酸）n_、_(L_甘胺酸）n_、_(D_甘胺酸v，其中η較佳在約2 128311.doc -85- 200844110 一其之乾圍内。該等側接區亦確保本發明多肽之抗原決 疋基Αβ⑺-37)不以β摺疊構型存在，此可為樣本中之 ?(2!-37)自體抗體接近。在一些實施例中，卜殿粉樣蛋白 多肽為寡聚形式。 而，在特定實施例中，本發明之多肽為不且有除 Αβ(2〇-37)>Λβ(12-37).Λβ(12-4〇)，Λβ(2〇.40)^Αβ(21.
’序列以外之其他序列之最小多肽。詳言之，寡聚形式 之該等多肽為本發明之較佳實施例。 ，…、而巾瞭解亦可使用除上述多肽以外之其他多肽來實 :本’X月方法’忒等其他多肽與第一單株抗體特異性結 合；該第-抗體能夠與以SEQ ID恥2表示之序列或包含 =β(21-37)之任何其他序列特異性結合，但該等多肽不與 第單株抗體特異性結合，該第二單株抗體不能與以 ID N〇 3表示之序列特異性結合。 在一較佳實施例中，本發明之多肽係藉由習知多肽合成 法直接合成（亦參見實例5)。類似方法適用於產生包含Λβ 肽之胺基酸序列之多肽，其中該肽至少具有seq NO·· 3之序列且至多具有SEQmN〇: $之序列。 或者’亦可藉由活體外轉譯或經由重組表現系統來獲得 本t月之夕肽。為表現本發明之多肽，必需產生各別核酸 表現構築體。熟習此項技術者將清楚地發現若干建構具有 、扁碼本發明多肽之核酸序列之適當表現系統的方式。隨後 使忒構築體於合適宿主細胞中表現且分離多肽。亦可將上 述標誌及/或標籤用於此純化步驟。 128311 .d〇c -86- 200844110 本發明者在AD患者血清中發現額外分數的針對Αβ肽之 Ν端抗原決定基之抗體，該等抗體不存在或僅以少量存在 於健康個體中。因此，偵測到該等抗體指示Ad之診斷、 階段及/或進展。為區分Αβ(21·37)( 一方面）與Αβ(4_1〇)或針 對Αβ之Ν端部分之其他抗體，可將包含Αβ肽之胺基酸序列 之多肽用於該等診斷法及檢定中，其中Αβ肽至少具有SEq ID NO: 3之序列（Αβ(4·10))且至多具有SEQ ID NO: 5之序 列（Αβ(1-20))。 在一實施例中，本發明係關於包含Αβ肽之胺基酸序列之 多肽，其中Αβ肽至少具有SEq ID NO: 2之序列且至多具有 SEQ ID NO: 4之序列。 因此本發明之多肽至少包含與SEq ID NO·· 1之胺基酸21 至胺基酸37範圍内之Αβ肽胺基酸序列相同之序列段。在本 文中此肽序列分別係以SEq m NO: 2或Αβ(2 1-37)表示。本 發明之多肽亦可展現Αβ肽序列中超出Αβ(2 1-37)序列之較 長序列段。然而，本發明之多肽所包含之Αβ肽序列段的長 度不應超過Αβ肽之胺基酸12至胺基酸40(本文中亦表示為 SEQ ID NO: 4或Αβ(12-40))的範圍。其確保本發明多肽之 Αβ序列段不包含與見於患有AD患者體内之斑塊特異性Αβ 抗體結合相關之胺基酸序列。本發明之多肽亦可包含其他 胺基酸序列。舉例而言，可將標籤、標誌、結合域、活化 域或類似功能部分與Αβ序列段融合（例如）以提供本發明之 夕肽與某些表面之較佳結合。類似地，可修飾本發明之多 肽以達成某些目的，諸如與螢光團或發色團、生物素或其 128311.doc •87- 200844110 類似物共彳貝偶合。在^：此ρ 牡呆些N況下，本發明之多肽之非Αβ序 列段提供Αβ(2 U7)序列殺之社播鋅—儿, ^汁幻奴之、、Ό構％疋化，從而防止或減 少此區域中之β摺疊構型之形成。 / η i 實也例中，本發明多肽與寡聚形式之β-殿粉樣蛋 白夕肽特，、ί±結合。作為非限制性實例，多月太可與寡聚形 式之ΑβΟ,或募聚形式之Αβ〇2，或寡聚形式之颂2ΐ-37)結合。在一態樣中，當在代下，在丨0福磷酸鈉、150 mM NaCl(PH值為7·4)_在攪拌下培育隔夜時，本發明多狀 能夠與寡聚形式之部（1,特異性結合。 在一較佳實施例中，上述多肽額外包含諸如標籤或標言志 之或夕個^分，尤其生物素、抗生蛋白鏈菌素、GST、 HIS、STREIM票籤、、ηα、聚·l_離胺酸、聚心離胺 _丙胺馱共♦物、聚-Aib(a-胺基異丁酸卜聚丙胺 酸、聚丙胺酸、螯 離胺酸、聚-D-離胺酸丙胺酸 共聚物、聚丙胺酸或聚·L_胺基酸與聚_d-胺基酸之组 合。 在 車父佳實施例Φ，U、4>、pi丄 上逑具有SEQ ID NO: 2之序列或包 含Αβ (21-37)之任何发仙广 他序列之多肽的區域不為β摺疊構 型。在一甚至更佳之眘 文1之實施例中，此區域為無規線圈或展現 a螺旋構型。 在另—較佳實施例中’上述具有（例如）SEQ m N0: 2之
+ 3匕3 Αβ(21·37)之任何其他序列之多肽的區域側接 有胺基酸序列，豆阶L /、防止或減少具有（例如）SEQ ID NO· 2之 序列或包含Αβ⑵-37)之任何其他序列的Αβ多肽區w摺疊 128311.doc -88- 200844110 形成，洋&之其中邊荨側接胺基酸序列位於緊密接近於A β 序列之Ν端及/或C端處且該等側接胺基酸序列含有包含下 列各物之寡聚肽：例如L-丙胺酸、D-丙胺酸、Aib(a-胺基 異丁酸）、β-丙胺酸、D-纈胺酸、L-甘胺酸、：〇_甘胺酸及/ 或相關疏水性胺基酸。特別較佳之側接胺基酸序列為寡聚 狀，諸如-(L-丙胺酸）n-、_(D_丙胺酸）η-、_(錄ν、-(卜丙 胺酸）η-、-(D-纈胺酸）n-、_(L_甘胺酸）η_、·（&#胺酸、_， f \
其中η較佳在約2至約6之範圍内。在一些實施例中，卜澱 粉樣蛋白多肽為寡聚形式。 此外，本發明係關於本發明之多肽及/或包含Αβ肽之胺 基酸序列之多肽用於診斷檢定的用途，其中Αβ肽至少具有 SEQIDNO: 3之序列且至多具有seqidn〇: 5之序列。用 於該等診斷檢定之方法係於以下例示。 方法 在另心樣中本發明係關於診斷神經性失智疾病之方 法，該方法包含以下步驟： a) 將固疋於載體上之本發明多肽與源自受檢者之樣本一起 培育，隨後 b) 將該樣本與載體分離，及， 〇债測與步驟3)之_定多肽結合之多狀。 本發明亦係關於診斷神έ ^开輕性失智疾病之方法，該方法包 含以下步驟： a)將本發明多肽與源自受 仏者之樣本一起培育，及隨後 b )將该樣本與對本發明容 夕狀具有結合親和力之載體一起培 128311.doc -89- 200844110 育， C)將該樣本與載體分離，及， d)债測與本發明多肽（該多肽係與載體結合）結合之多肽。 在另一態樣中，本發明係關於診斷神經性失智疾病之方 法’其利用至少包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸4至胺基酸 1 〇範圍内之Αβ肽胺基酸序列相同之序列段的多肽或蛋白 質。在本文中此肽序列分別係以SEq ID NO: 3或Αβ(4_1〇) 或Ν端肽表示。該多肽亦可展現Αβ肽序列中超出Αβ(4-ΐ〇) 序列之較長序列段。然而，該多肽所包含之Αβ肽序列段的 長度較佳不應超過Αβ肽之胺基酸1至胺基酸2〇(本文中亦表 示為SEQ ID NO: 5或Αβ( 1-20))的範圍。其確保本發明多肽 之Αβ序列段不包含與見於健康個體體内且針對Αβ(21_37) 之Α β自體抗體之結合相關的胺基酸。如已關於本發明多肽 所述，Ν端多肽除Αβ序列段以外亦可包含其他胺基酸序 列、部分及修飾。 因此’本發明亦係關於珍斷神經性失智疾病之方法，該 方法包含以下步驟： a) 將固定於載體上之多肽與源自受檢者之樣本一起培育， 其中該多肽包含Αβ肽之胺基酸序列，其中該Αβ肽至少 具有SEQ ID NO: 3之序列且至多具有SEQ ID NO: 5之序 列，隨後 b) 將該樣本與載體分離，及， c) 偵測與步驟a)之經固定多肽結合之多肽。 本發明亦係關於診斷神經性失智疾病之方法，該方法包 128311.doc -90- 200844110 含以下步驟： a) 將多肽與源自受檢者之樣本一起培育，其中該多肽包含 Αβ肽之胺基酸序列，其中該肽至少具有SEq id NO: 3之序列且至多具有SEQ ID N〇: 5之序列，及隨後 b) 將该樣本與對包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽具有結合親 和力的載體一起培育，其中該Αβ肽至少具有SEq ID NO: 3之序列且至多具有SEq ID N〇: 5之序列， f .¾. C)將該樣本與載體分離，及， d)偵測與多肽（該多肽包含Αβ肽之胺基酸序列，其中該Αβ 肽至少具有SEQ ID ΝΟ: 3之序列且至多具有SEQ m Ν〇: 5之序列，該多肽係與載體結合）結合之多肽。 本發明亦係關於診斷神經性失智疾病之方法，該方法包 含以下步驟： a)將固定於載體上 本一起培育， 之本發明多肽與源自受檢者之含細胞樣 b)將該樣本與載體分離，及， C)偵測與步驟a)之經固定多肽結合之細胞。 該方法包 本發明亦係關於診斷神經性失智疾病之方法 含以下步驟·· 受檢者之含細胞樣本_起培育，及 a)將本發明多肽與源自 隨後 之載體一起培 b)將該樣本與對本發 育， 明多肽具有結合親和力 )將該樣本與載體分離，及， 128311.doc 91 200844110 d)谓測與本發明多月太結合之細胞，該多狀係與載體結合。 本發明亦係關於診斷神經性失智疾病之方法，該方法包 含以下步驟： a) 將固定於載體上之多肽與源自受檢者之含細胞樣本一起 培月，其中該多肽包含Αβ肽之胺基酸序列，其中該Ap 肽至夕具有SEQ ID NO: 3之序列且至多具有SEQ ID NO: 5之序列， b) 將該樣本與載體分離，及， Ο偵測與步驟a)之經固定多肽結合之細胞。 本發明亦係關於診斷神經性失智疾病之方法，該方法包 .含以下步驟： • 幻將多肽與源自受檢者之含細胞樣本一起培育，其中該多 肽包含Αβ肽之胺基酸序列，其中該Αβ肽至少具有seq ID NO: 3之序列且至多具有SEQ m no: 5之序列，及隨 後 ( b)將該樣本與對包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽具有結合親 和力的載體一起培育，其中該Α(3肽至少具有SEq ID NO: 3之序列且至多具有SEQ ID N0: 5之序列， c) 將該樣本與載體分離，及， d) 偵測與多肽結合之細胞，該多肽包含Ap肽之胺基酸序 列，其中該Αβ肽至少具有SEQ id NO: 3之序列且至多具 有SEQ ID NO: 5之序列，該多肽係與載體結合。 在本發明之另一實施例中，包含Αβ肽之胺基酸序列之多 肽（其中該Αβ肽具有SEQ ID Ν0: 3之序列且至多具有seq 128311 .doc -92- 200844110
ί ID NO·· 5之序列）可包含如上所述之諸如標籤或標諸之額外 部分，尤其生物素、抗生蛋白鏈菌素、GST、HIS、 STREP-標籤、Myc、HA、聚-L-離胺酸、聚-L-離胺酸七 丙胺酸共聚物、聚-Aib(a-胺基異丁酸）、聚-β-丙胺酸、聚. L-丙胺酸、聚離胺酸、聚-D-離胺酸丙胺酸共聚物、 聚-D-丙胺酸或聚-L-胺基酸與聚胺基酸之組合。在一較 佳實施例中，除包涵Αβ序列之序列段以外，本發明多肽與 包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽相同，其中該Αβ肽具有SEq ID NO: 3之序列且至多具有SEQ ID NO: 5之序列。 在採用本發明多肽之本發明方法之一較佳實施例中，在 培育步驟中存在溶劑，其防止或減少具有（例如）seq m NO · 2之序列之多肽區的β摺疊形成。較佳溶劑可為用以穩 疋肽構i且防止或減少β摺叠形成之三氟乙醇（TFE)、六 氟-異丙醇或類似溶劑。較佳地，溶劑存在於包含（例如）5_ 10 mM磷酸鹽緩衝劑及15〇 mM NaC1之水溶液中。在一甚 至=佳實施例中，水溶液中TFE、六敗·異丙醇及其類似物 ’辰度在約1至約5%之範圍内較佳在約至約2%之範 ，本發明方法包含額外步驟，其中在 一個洗滌步驟。 在一較佳實施例中 偵測步驟前進行至少 在關於細胞偵測之本發 方法係LV如f 平乂1主具施例中，該等 行。’力層析法，尤其免疫親和力層析法之形式進 文檢者樣本 中與本發明多肽（例 如Αβ(2ΐ·37)或包含 12831 l.doc -93- 200844110 Αβ(21-37)之任何其他序列）結合之多肽（例如抗體）的量為 對受檢者狀態關於AD顯現及/或進展之指示。針對Αβ(2ι_ 37)序列段之多肽之濃度愈高，則保護能力愈高且ad顯現 及/或進展之危險愈低。受檢者樣本中針對Αβ(4_1〇)抗原決 定基之多肽（例如抗體）的量亦為對受檢者狀態關於AD顯現 及/或進展之指示。然而在此情況下，情形相反。針對 Αβ(4-1〇)序列段之多肽濃度愈高，則AD顯現及/或進展之 危險愈高。因此出於診斷原因，本發明之偵測法可個別進 行’且亦可組合進行以提供更具體診斷。 因此，在本發明之另一實施例中，採用本發明多肽之本 發明方法係與採用包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽（其中該 Αβ肽至少具有SEq m NO: 3之序列且至多具有SEQ m NO · 5之序列）的本發明方法組合進行。採用本發明多肽之 方法可與第二方法同時、在其之前或之後進行。 亦可藉由間接方法來診斷神經性失智疾病。本發明之方 法（利用本發明多肽或包含Αβ肽之胺基酸序列之多肽，其 中省Αβ肽至少具有SEq ID Ν〇: 3之序列且至多具有託卩 ID NO· 5之序列）係與類似方法組合，該類似方法與本發明 方法之不同之處僅在於利用包含具有Α(3(1_4〇)4Αβ(^42) 長度之夕肽之多肽，亦即全長Ap肽而非本發明方法所利用 之較短Αβ序列段。在該情形下，彼此獨立地進行兩種方法 比較忒荨方法之結果。為說明此概念，給出以下實例： 1)利用Αβ全長多肽序列之方法於樣本中產生針對全長# 之所有多肽（或分別產生該等多肽之細胞）的量（結果α)。 128311.doc •94- 200844110 ) 方面利用本發明多肽之本發明方法於樣本中產生 子本么月夕肽（諸如Αβ(2ΐ _37)或包含Αβ(2ΐ _37)之任何 其他序列）之所有多肽（或分別產生該等多肽之細胞）的量 (結果Β)。 3)沾白此項技術者現在可易於藉由將結果a減去結果β而 推斷出樣本中針對取_抗原決定基，尤其針對抗原 決定基Αβ(4-1〇)之多肽的量。 類似地，樣本中針對本發明多肽（諸如Α|3(21_3乃或包含 Αβ(21-37)之任何其他序列）之多肽（或分別產生該等多肽之 細胞）的量可藉由將以全長Αρ獲得之結果減去以包含肽 胺基酸序列之多肽（其中該Αβ肽至少具有SEQ m ν〇: 3之 序列且至多具有SEQIDNO: 5之序列，例如Αρ(4_ι〇))獲得 之結果而獲得。 因此，本發明亦係關於診斷神經性失智疾病之方法，其 中本發明之方法包含以下步驟： i)進行如上所列出之本發明之第一方法， 11)進行本發明之第二方法，其限制條件為待於該第二方法 之步驟a)中培育之多肽包含Αβ肽之全長胺基酸序列，及 iii)比較自步驟i)獲得之結果與步驟Π)之結果。 #習此項技術者應瞭解’對於以上方法而言，步驟i)係 於步驟ii)之前、同時或之後進行無關緊要。 在一實施例中，待於本發明方法中偵測之多肽為抗體， 尤其為Αβ(21-37)自體抗體或Αβ(4-1〇)自體抗體。 在一較佳實施例中，進行本發明方法來診斷阿茲海默氏 128311 .doc -95- 200844110 澱粉樣 症、唐氏症候群、路易體型癡呆、額顳葉型療呆 腦血管病變及/或澱粉樣變性病。 在另-態樣中，本發明係關於包含本發明多肽之載體。 在-較佳實施例中，載體額外包含第二多月太，該第二多肽 包含Αβ肽之胺基酸序列，其中第二多肽之肽至少具有 SEQ ID N0: 3之序列且至多具有seq⑴n〇: $之序列:、
/ V 根據本發明且用於本發明方法之載體可為能夠結合多狀 之任何合適材料，諸如珠粒，尤其磁性珠粒或瓊脂糖珠 粒’膜’尤其聚偏二氟乙稀或硝化纖維膜；玻璃；填脂糖 基質；金表面；合成表面’尤其微量滴定盤。對於某些實 施例而言，載體表面可以(例如)能夠與上述標籤及標誌結 合之藥劑塗覆。 偵測 本發明方法中可採用多種檢定來偵測或量測對抗所關注 Αβ肽之抗體力價。例示性檢定包括（但不限於）Eusa、 ELISPOT、西方墨點法（Western Bi〇t)、點潰墨法（⑽ Blot)、蛋白晶片(Protein-Chip)、表面電漿共振檢定、免疫 沈澱或免疫共沈澱或親和力層析法，尤其免疫親和力層= 法0 在一較佳實施例中，步驟幻或幻中分別包含偵測多肽之 2發明方法表示ELISA。在此情況下，載體例如為微量滴 疋盤。樣本與載體之分離係藉由將樣本液體自微量滴定盤 移除及/或藉由於培育後洗滌微量滴定盤而達成。較佳 地此^形下結合之多肽為抗體且此抗體可（例如）經由與 128311.doc -96- 200844110 (例如)鹼性磷酸酶(AP)偶合之二級抗體，且添加Ap受質致 使受質變為（例如）可為光學設備所偵測之有色化合物來偵 7 °熟習此項技術且熟悉ELISA技術者已知簡A概念之 右干k型，其亦可應用於本發明方法。 、、或者，在另-較佳實施例中，步驟e)^)中分別包含偵 測夕肽之本發明方法表示ELISp〇丁檢定。纟此情況下，載 體為例如硝化纖維盤。在此情形下將載體與樣本一起培育 f之步驟提供足夠時間以供樣本中之細胞產生足夠量：抗 _篆本”載體之刀離係藉由將樣本液體自硝化纖維盤移 除及/或藉由於培育後洗條硝化纖維盤而達成。較佳地， 經結合之多肽為抗體且此抗體可（例如）經由與（例如）驗性 A S文酶（AP)偶合之二級抗體，且添加受質（諸如 BCIP/NBT(溴_氯_。引哚基磷酸鹽/硝基四唑藍》致使受質變 為（例如）可在視覺上偵測或可由《學設備偵測之深紫色染 色來偵測。熱習此項技術且熟悉ELISPOT技術者已知 (EUSPOT概念之若干變型，其亦可應用於本發明方法。 在另一實施例中’步驟c)或d)中分別包含偵測多肽之本 發明方法表示西方墨點法或點潰墨法檢定。在此情況下， 載體為例如硝化纖維膜。對於西方墨點法而言，硝化纖維 上固定有用於本發明方法步驟a)之多肽或對用於本發明 方法步驟a)之夕肽具有結合親和力之物質。硝化纖維或類 似膜（？聊等）自身可提供對用於本發明方法步驟a)之多肽 的結合親和力。樣本與載體之分離係藉由將樣本液體自硝 化纖維膜移除及/或藉由於培育後洗務硝化纖維膜而達 128311 .doc -97- 200844110 成。較佳地，經結合客 ,、t 夕狀為抗體且此抗體（例如）經由（例 如）與辣根過氧化酶偶合 之、、、工榣圮之二級抗體，且隨後進 行發光反應及偵測來偵 、 、^ ° $此項技術且熟悉西方墨點 點/點潰墨法技術者p 西方墨點法/點潰墨法概念之若干 變型，其亦可應用於本發明方法。 在另一實施例中，步驟丄 /驟C)或d)中分別包含偵測多肽之本 發明方法表示蛋白晶Η . θ , 皮曰曰曰片，亦即蛋白微陣列。在此情況下， / 載體為（例如）經官能仆、纟士 、 犯化以結合蛋白質之玻璃表面。樣本與 載體之分離係藉由將揭太、、右 肝樣本液體自玻璃載體移除及/或藉由 t培育後絲玻璃载體而達成。較佳地，經結合之多肽為 k體且此抗體係經由與（例如）可藉由光學設備偵測之營光 木料偶σ的經“ e二級抗體偵測。熟習此項技術且熟悉蛋 白晶片技術者已知蛋白晶片概念之若干變型，纟亦可應用 於本發明方法。 在另一實施例中，步驟匀或d) _分別包含偵測多肽之本 么明方法表不表面電漿共振分析。在此情況下，載體為 (例如）金屬表面，諸如金表面。樣本與載體之分離係藉由 將樣本液體自金屬載體移除及/或藉由於培育後洗滌金屬 載體而達成。較佳地’經結合之多肽為抗體且抗體之結合 係、、二由以光學没備以特定入射角量測反射光強度而偵測。 熟習此項技術且熟悉電漿共振分析技術者已知表面電漿共 振概念之若干變型，其亦可應用於本發明方法。 在另一實施例中，步驟c)或d)中分別包含偵測多肽之本 發明方法表示拉下（pull down)實驗或免疫沈澱實驗。在此 】283 ll，d〇c -98- 200844110 情況下’載體可由違脂糖珠粒組成。將此等瓊脂糖珠粒 、幻如）乂麵胱甘肽（用於拉下檢定）或以抗體（免疫沈殺檢定） 塗覆。樣本與載體之分離係藉由將樣本液體自璦脂糖珠粒 移除及/或藉由於培育後洗料脂糖珠粒而達成。較佳 地，經結合之多肽為抗體或此抗體係經由隨後對所沈殿蛋 :錯合物進行西方墨點法分析來偵測。熟習此項技術且 u下/免疫沈殿技術者已知此等概念之若干變型，其 亦可應用於本發明方法 ^ ^ 去一個邊變型為應用免疫共沈澱方 ::、中載體僅對用於本發明方法步驟a)之多 結合親和力。 在另一實施例中，步驟p、十、丄 ^ π 驟勹或d)中分別包含偵測多肽之本 ^法係以親和力層析法形式進行。在此情況下，載體 例如習知層析管柱中之瓊脂糖，該基質與用於本 :有处二步驟之多肽或對用於本發明方法步驟a)之多肽 jr親和力的物f連接。將樣本與載體-起培育包含 檨太；要通過管柱之時間框。樣本與載體之分離係藉由將 自管柱溶離及/或藉由於培育後洗滌管柱而達 (例如 1 二、’Ό σ之多肽為抗體且此抗體（例如）係藉由 (例女有同鹽含$之緩衝劑溶離所結合之抗體且隨後 直t光學測定或藉由隨後之西方墨點法或類似 和力芦析1所冷離之多肽而價測。熟習此項技術且熟悉親 =析法技術者已知親和力層析 才=應Γ本發明方法。—個該變w免疫親和力層 其中載體經針對用於本發明方法步驟a)之多肽之抗 128311.doc -99- 200844110 體塗覆。 二實施:列中，步驟c)或d)中分別包⑽^^ 明方法係以親和力層析法形式 孚七 瓊脂糖塗覆之磁性珠粒表示況下’例如以 法步驟a)之多肽或對用於本=方=與用於本發明方 ^ 月方法步驟a)之多肽具有結 合親和力的物質連接。樣本鱼 虿 ^ Λ ^ ^ ^戟體之分離係藉由將樣本液 體自官柱溶離及/或藉由於培育 所，丄人 Θ俊/先滌官柱而達成。盥基 貝釔合之細胞為（例如）Β細胞或 η ， ώ η ^ ^ 次、、、田胞，该等細胞可於細胞 ……… L式、、、田胞儀谓測。熟習此項技術 且#u親和力層析法及流式細胞儀枯# 土 ^ 咫儀技術者已知此等概念之 右干變型，其亦可應用於本發明方法。 因此’在特別較佳實施例中，本發明方法可以elisa、 ELISPOT、西方墨點法、蛋白晶 曰日片、表面電漿共振檢定、 =沈澱或免疫共沈„親和力層析法，尤其免疫親和力 層析法進行。該等方法為診斷檢定之所有例示。㈣八或 ί親和力層析法之實例可見於實例部分。在基於表面電漿共 振（SPR)之診斷程序中，Α(3抗原決定基特異性抗體之偵測 及定量及結合動力學分析可藉由下列方法進行：將⑴經生 物素標記Αβ(21-37)-肽或Αβ⑹〇)·肽與以抗生物素蛋白/抗 生蛋白鏈菌素塗覆之SPR晶片表面結合或將（ii)Ap(2i斜 肽或Αβ(4-10)-肽以含有N端硫醇基之羧酸間隔子結合至金 曰曰曰片表面；隨後結合且測定Αβ自體抗體。熟習此項技術者 易於知曉如何將本發明方法併入上述此等標準技術及程序 中之一者中。 128311.d〇( -100- 200844110 需瞭解，儘管本發 个知月方法可以上述偵測技術（ELISa、 EUS:、西方墨點法、點潰墨法、蛋白晶片、表面電浆 二# ^疋免疫沈;殿、親和力層析法等）中之-者本身之 、Λ、行但亦可能將此等偵測技術組合或僅將其應用 於本U之偵’驟’亦即分別之步驟或句，而其他步 :可以其他形式進行。亦為熟習此項技術者顯而易見，本 f % ^月方法之偵測步驟中所獲得之資訊/信號可提供對此資 訊/信號定量之基礎。 在二丨月况下，若替代偵測多肽（例如抗體）或除偵測多 肽（例如抗體）以外，偵測產生該等多肽之細胞，則可能具 有更门^ k/f彳貝值。舉例而言，若AD患者體内產生Ap(2夏_ 37)自體抗體之細胞總數低於健康個體，或若各別產生細 胞之抗體所分泌之抗體量降低，則其可具有重要性。視結 果而疋，其可產生不同治療方法。因此，本發明亦係關於 偵測與本發明多肽結合或與包含Αβ肽胺基酸序列之多肽結 合之產生多肽的細胞，其中Αβ肽至少具有SEQ id Ν〇: 3之 序列且至多具有SEQ ID NO: 5之序列。 本發明所使用之固定多肽就此而言係指與載體偶合之多 狀。偶合可為共價偶合或非共價偶合，其可直接偶合至載 體或經由連接子/連接物質偶合至載體。若固定以非共價 方式進行，則載體或連接物質展現對本發明多肽之特異性 結合親和力，且反之亦然。結合親和力係指物質（尤其多 肽）與其他物質締合且形成穩定特異性二聚或多聚錯合物 之特性。該等締合通常依靠凡得瓦爾鍵（van der Waals 128311.doc -101 - 200844110 bond)或氫鍵。 培育步驟用於結合對之兩個搭配物（亦即彼此具有結合 親和力）可藉此締合且形成穩定錯合物之目的。培育步驟 之溫度可不同，但通常在約〇它至約4〇〇c，較佳約4^至約 37°C，甚至更佳約4°C、約16°C、約21°C或約37°C。溫度 愈高，則培育時間可能愈短。舉例而言，若培育溫度為4 C ’則其應持續至少12 h或隔夜，而對於在3 7 °c下培育而 言，通常1 h足夠。若合適，則可在方法之前以合適阻斷 劑阻斷載體，降低非特異性結合事件之可能性。阻斷劑可 為（例如）奶粉、BSA、胎牛血清或任何其他阻斷試劑。 可藉由若干方式來進行與本發明之固定多肽或包含Ap肽 胺基酸序列之多肽結合的多肽，其中Αβ肽至少具有SEq ID NO: 3之序列且至多具有SEq id NO·· 5之序列。一種可 能方法為（例如）經由質譜方式（例如MALDI_T〇f、ESI-MS、MS-FTICR)來鑑別。為達成此目的，首先藉由蛋白質 G親和力層析法將免疫球蛋白自（例如）AD患者之血清樣本 中分離，且隨後（例如）藉由Αβ抗原決定基層析法分別分離 Αβ自體抗體及Αβ斑塊特異性抗體。接著將抗體（例如）固定 於如實例中所述之瓊脂糖載體上。接著於全長Αβ多肽（例 如Αβ(1-40)或Αβ(1-42))結合後鑑別特異性Αβ抗原決定基 (八0(21-37)及八0(4-1〇))，隨後使用蛋白酶、胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶、Glu-C蛋白酶、Asp-N蛋白酶中之一或數者來 進行蛋白水解抗原決定基切除質譜分析。洗滌親和力結合 之Αβ抗原決定基直至在上清液中偵測不到信號後，將特異 128311.doc -102- 200844110 L β抗原決定基藉由以通常0.1%三氟乙酸處理而 f藉由其質子化分子離子之精確測定而鏗別 子離子質量精確性完全足以鑑別，但可藉由碰撞誘發之破 碎及片段離子之聯合MS分析進一步確定。 f G:某些Γ:而言’可應用以榮光染料或部分(例如 )軚Z，或以此夠將無色受質轉化為合適染料或螢光產 物之酶活性物質（諸如辣根過氧化酶、驗性碟酸酶、卜半乳 糖酶或其他相關酶）標記之二級抗體。偵測亦可藉由摘測 所佔據之結合位點量，亦即利用在移除樣本後與載體一起 培育之經標記Ap(2b37)抗體來完成。在此情形下f經結 合之Αβ(21-37)量為先前所結合之多肽量之指帛。後續結 合之Αβ(21-37)抗體的量愈低，則樣本中所含有之 37)結合多肽愈多。所述偵測實例並不被視為具限制性， 因為熟習此項技術者將可輕易知曉複數種可用於本發明之 偵測法。 通常，與本發明方法之步驟勾或幻中分別偵測之固定多 肽結合之多肽將為抗體，詳言之分別為Αβ(21·3乃自體抗 體或Αβ(4-10)自體抗體。然而，人體内之其他物質亦可與 (例如）Αβ(21-37)或Αβ(4-1〇)多肽結合。
同樣，藉由熟習此項技術者已知之標準技術來完成偵測 與本發明多肽結合或與包含Αβ肽胺基酸序列之多肽結合之 產生多肽的細胞，其中該Αβ肽至少具有SEQ ID NO: 3之序 列且至多具有SEQ ID NO: 5之序列。一個實例為經由流式 細胞儀分析。另一種方法為將細胞溶解、分離DNA/RNA 128311.doc -103- 200844110 且隨後使特定核苷酸序列PCR擴增。除此以外 術中亦存在複數種已公開之可用以在本發明方法 胞之其他可能性。 在先前技 中偵測細 在-較佳實施例中，分別用於本發明方法之樣本或含有 樣本之細胞係源自受檢者之血液、血漿、尿或腦脊趙液 (CSF)。在一甚至更佳之實施例中， ^ r 3有樣本之細胞係源 f \ 自血液且細胞為B細胞系。該樣本，亦即受檢者可為人 類、餐齒動物、牛、豬、犬或禽類來源。詳言之，樣本或 含有樣本之細胞可源自人類、小鼠、大鼠、兔、牛、豬、 犬、雞等。 源自受檢者之樣本係源自受檢者之組織或體液。受檢者 可為健康個體’亦即不患有AD者，$患有神經性失智疾 病之”患者”。在較佳實施例中，分別用於本發明方法之樣 本或含有樣本之細胞係獲自受檢者之血液、血漿、尿或腦 脊髓液(CSF)。在一甚至更佳之實施例中，含有樣本之細 胞係獲自血液且細胞為3細胞系。該樣本，亦即受檢者可 為人類、齧齒動物、牛、豬、犬或禽類來源。詳言之，樣 本或含有樣本之細胞可源自人類、小鼠、大鼠、兔、牛、 豬、犬、雞等。料樣本之可能製備程序由先前技術熟 知。 在採用本發明多肽之本發明方法之一較佳實施例中，在 圪月步驟中存在溶劑，其防止或減少具有SEQ ID NO·· 2之 序列之多肽區的β摺疊形成。如上所述，已展示摺疊 冓i為產生神經毒性的原因。因此，健康個體體内之 128311.doc -104- 200844110 八0(21-37)抗體特別辨識八0(21-37)區或包含八0(21_37)之任 何其他序列（若其為無規線圈或α螺旋構型）。類似於側接 胺基酸序列，溶劑可影響本發明多肽之構型狀態。詳言 之，TFE、六敗-異丙醇等可用於本發明方法，例如用於培 育步驟中以防止或減少重要抗原決定基Αβ(21_37)2β摺疊 構型，伙而保持其易為健康個體中Α(3(21_37)自體抗體接 近。較佳地，TFE係以約1%至約5%，較佳約1%至約2%範 圍内之濃度存在。 在一較佳實施例中，本發明方法包含額外步驟，其中在 偵測步驟前以洗滌溶液進行至少一個洗務步驟。洗條步驟 可增加稍後偵測信號之特異性且減少背景信號。較佳地， 洗I /合液為水。更佳地，使用如pBs或丁bs之緩衝劑來確 保恆值。洗務溶液可含有少量清潔劑以增加信號特異 f生右t號特異性較低，則洗條溶液中鹽濃度或清潔劑濃 度可增加。 I 在本發明之另一實施例中，採用本發明多肽（亦即 β( 夕肽）之本發明方法係與採用包含Αβ肽之胺基酸 ^列之多肽（其中Αβ肽至少具有SEQ ID NO: 3之序列且至 Γ1有SEQID N0:5之序列，亦即Ap(4]G))的本發明方法 苴a、/亍採用本發明多肽之方法可與第二方法同時、在 A、4 ,或之後進行。比較AP(21-37)特異性多肽豐度與 — 寺”〖生夕肽豐度將提供更詳細的AD階段及進展評 定。 本發明古、、l山 ’中之偵測步驟提供量化與Αβ(21-37)或Αβ(4_ 128311.doc 200844110 i〇)結合之多肽量之可能性。所測定之值為八〇階段及進展 之量度。舉例而言’若人類受檢者血清含有約1至1〇〇 ng/μΐ Αβ(21-37)特異性多肽及/或約〇 %/μι(亦即低於偵測 限）Αβ(4-1〇)特$性多敗，則認為該人類 為健康的。關於健康個體可達到年齡為2〇至35歲之人之血 清中各別多肽的平均濃度。對照而言，例如若受檢者血清 含有約0.01至5 ng/Hl Αβ(4·1〇)特異性多肽 / —甚至更佳約—，或若血清中斑塊二 多肽濃度比Αβ^-π)特異性多肽濃度之比率升高至〇以 上，較佳若其高於0.001、〇 〇〇2、〇 〇〇3、〇 〇〇4、〇刚、 0.010、0.015、0.020、0.030 或甚至高於 〇〇5〇，則該受檢 者可患有神經性失智疾病或有|生神經性失智疾病之危 險。隨著年齡增長，人體内所產生之免疫球蛋白量自然降 低。因此，在特定情況下，可能需要在評估以本發明方法 所獲得之結果前考慮受檢者年齡。詳言之，若（例如）年齡 約2〇至約35歲之人之血清含有約3〇至l〇〇 η咖或更多 抑(21-37)特異性多肽，則可認為其為健康的而血清中 ”僅"含有2至5 %/μ1 Αρ(21_37)特異性多肽之年齡約7〇至約 8〇歲之受檢者仍可認為其就AD而言同樣為健康的。 在一較佳實施例中，進行本發明方法來診斷神經性失智 疾病、阿兹海默氏症、唐氏症候群、路易體型癡呆、額顳 葉型癡呆、澱粉樣腦血管病變及/或澱粉樣變性病。所有 f病具有共同點，即Αβ自體抗體及Αβ斑塊特異性抗體之 濃度受如以上關於AD所給出之各別疾病影響。 128311.doc -106- 200844110 在另一態樣中，本發明係關於包含本發明多肽之載體。 在一較佳實施例中，該載體額外包含第二多肽，該第二多 肽包含Αβ肽之胺基酸序列，其中第二多肽之Ap肽至少具 有SEQ ID NO: 3之序列且至多具有SEq ID no: 5之序列。 根據本發明且用於本發明方法之載體可為能夠結合多肽 之任何合適材料，諸如珠粒，尤其磁性珠粒或瓊脂糖珠 粒，膜，尤其聚偏二氟乙烯或硝化纖維膜；玻璃；瓊脂糖 基質，金表面；合成表面，尤其微量滴定盤。對於某些實 轭例而言，載體表面可以（例如）能夠與上述標籤及標誌結 。之藥劑塗覆。熟習此項技術者將易於知曉可應用於本發 明方法之各種不同載體及可能之塗料。 套組 在另一態樣中，本發明係關於診斷神經性失智疾病之套 組，其中該套組包含本發明多肽。在一實施例中，套組含 有包含Αβ肽之胺基酸序列的第二多肽，其中第二多肽之 Αβ肽至少具有SEQ ID Ν〇: 3之序列且至多具有seq ι〇 NO· 5之序列。在另—實施例中，套組包含載體，尤其上 述載體。在另-實施财，套組含有至少包含Αβ(3(Μ7) 之序列且至多包含Αβ(12·4〇)之序列的第一Αβ肽及至少包 含Αβ(4,之序列且至？包含Αβ(1_2〇)之序歹㈣第二郫 肽4等套組可用於（例如）醫院及療養院中之常規診斷（例 如）以監測AD進展或監測八〇療法之有效性。 在另〜、樣中，本發明係關於診斷神經性失智疾病之套 組’其中該套組包含本發明多肽。 128311.doc -107- 200844110 —車又佳μ施例中，上述套組含有包含Αβ肽之胺基酸序
J的第夕肽，其中第二多肽之Αβ肽至少具有SEQ ID 之序歹】且至多具有SEQ ID NO: 5之序列。在一甚至 更佳員％例中’該套組包含载體，尤其上述載體。 套、、且可包括一或多個用於Αβ肽之容器。在一些實施例 中-亥套、、且3有獨立的容器、分隔物或隔室用於Α障及資 几材料。舉例而言，各Αβ肽可含於瓶、小瓶或注射器中， 「且資訊材料可含於塑膠套管或包裝中。在其他實施例中， 套、、且之獨立件係含於單一未經分隔之容器内。舉例而 言，各肽係含於附有才票籤形 < 之資訊材料之瓶、小瓶或注 射器中。 以下實例解釋本發明，但不認為其具有限制性。除非有 不同。兒明，否則使用如（例如）Sambr〇ck及Russei， Molecular ci〇ning: a Lab〇rat〇ry Manual，第 3版，c〇id
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New , Y〇rk所述之分子生物標準法。
V 實例： 實例ΙΑβ抗體自AD患者之分離 藉由抗原決定基特異性親和力層析法將血清抗體自 AD患者免疫分離係在瓊脂糖_G5Ap(4-i〇)親和力基質管柱 上進行。將瓊脂糖-G5Ap(4-10)親和力基質以10 ml pbs(5 πΐΓηο1]^Να2ΗΡ〇4’150ηΊηιο1Ι/1Ν&(Ι!1’ρΗ^*7.5》^;^ 且使用300 μΐ PBS轉移至1 ·7 ml小瓶中。添加goo μι(ι Pg/gl)兩種不同Αβ自體抗體（自阿茲海默氏症患者血清中分 128311.doc -108- 200844110 離）且將樣本在4°C下緩慢旋轉隔夜。將懸浮液轉移至0.8 ml微管柱（Mobitec，Gottingen，Germany)提供在無顯著材料 損失下廣泛洗滌之可能性。收集最先2 ml作為溢流溶離 份。以20 ml PBS洗滌管柱且收集最後1 ml用於一維電泳。 將親和力結合之IgG以6x〇.5 ml 0.1% TFA溶離；輕微震盪 管柱15'且將所釋放之抗體分子收集於微反應杯中。將樣本 凍乾且儲存直至1D-SDS-PAGE分析（展示於圖5中）。 亦使用Αβ(4-10)抗原決定基管柱來測試來自所研究之所 有年齡範圍之健康對照者的血清樣本中斑塊-抗體（Ν端抗 原決定基）之存在。在所有經研究之樣本中，非AD對照樣 本無可偵測之斑塊特異性抗體。 實例2抗Αβ(21-37)自體抗體自健康個體之分離 Α.抗Αβ(21-37)自體抗體之親和力分離及純化 將抗Αβ(2 1-3 7)自體抗體自（i)，市售之血清免疫球蛋白 及（Π)健康個體（HI)血清分離。如下所述，抗體之分離係藉 由採用固定於Ultralink-碘基乙醯基-固相載體上之N-半胱 胺醯基-Αβ(12-40)管柱之程序，藉由Αβ抗原決定基特異性 親和力層析法來進行。 Ν- 半胱 胺醯基 -Αβ(12-40)(Η-CVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COOH)係於 半自動肽合成器 EPS-221(INTAVIS，Langenfeld，Germany) 上，使用NovaSyn TGR樹脂（0.23 mmol/g偶合能力）上之9-苐基曱氧基魏基/第三丁基（Fmoc/iBu)化學物質，藉由固相 肽合成來合成。使用以下側鏈保護之胺基酸衍生物： 128311.doc -109- 200844110
Fmoc-Lys(Boc)_〇H、Fmoc-Asn(Trt)_OH、Fmoc-Ser(，Bu)-OH、Fmoc-Asp(〇iBu)-〇H、Fmoc-Glu(OiBu)-OH、Fmoc-
Gln(Trt)-OH ^ F^〇c-His(Trt)-OH ^ Fmoc-Cys(Trt)-OH ° ^ 成係根據以下方案進行··（i)D]vlF洗滌；（ii)以DMF中之2% DBU ’ 2%派啶進行Fm〇c去保護（5 + 10 min);⑴丨瓜以卩洗 務，（iv)偶合5當量之pm〇c胺基酸：pyB〇p : dmF中 NMM(40 min) ; (v)偶合5莫耳當量之Fm〇c胺基酸：
PyBOP : DMF 中 NMM(40 min) ; (vi)DMF洗滌（3x1 min)。 由於Αβ之C端序列之疏水性特徵，故在整個合成中採用各 胺基酸之雙偶合。合成週期完成後，使用含有95% TFA、 2.5%三異丙基矽烷及2·5%去離子水之混合物使肽自樹脂裂 解歷日寸3 h。在冷凍乾燥前，將粗產物以冷第三丁基曱基 醚沈澱，以乙醚洗滌三次且溶解於1〇%乙酸（水溶液）中。 肽之純化係藉由半製備性HPLC進行；隨後藉由HpLC及 MALDI-TOF質譜分析表徵確保肽之分子均質性。 〇CysAp(12-40)於Ultralink碘基乙醯基凝膠上之固定 由於Αβ(12-40)序列含有兩個内部離胺酸殘基，該等離 胺酸殘基可能於使用胺基之固定程序中引起副反應，故使 用與Αβ-Ν端連接之半胱胺酸殘基來製備特異性親和力管柱 以藉由經由半胱胺醯基硫醚鍵固定來確保肽分子於管 柱支撐物上均勻定向。吖内酯活化之支撐物於十六基-間 隔子末端含有埃基乙醯基（UhraLink; Perbi〇, B〇nn， Germany)，緣碘基乙醯基與半胱胺醯基_硫氫基反應以產 生穩定硫賴從而降低位阻且提供最大抗體結合能力。對 128311.doc -110- 200844110 於Cys-Ap(12-40)之共價連接而言，將3·7 mg肽溶解於50 mM Tris、5 mM EDTA-Na偶合緩衝劑（pH值為 8.5)中至 0.3 7 mg/ml之最終濃度。將溶液添加至1 mi經排乾之uitraiink-蛾基乙醯基凝膠中且在25 °C下在輕微混合下進行偶合反應 歷時1小時，隨後在不混合下反應30 min之時間。將〇.5 ml Cys-Ap(12-40)偶合之支撐物之等分試樣填充在管柱（2 5 ml，MoBiTec，G6ttingen，Germany)中，使溶液排乾。將管 柱以3 ml偶合緩衝劑洗務，且藉由於偶合緩衝劑中與1 ml 50 mM L-半胱胺酸·Η(31反應阻斷凝膠上之非特異性結合位 點歷日守2x45 min。隨後’將管柱以5 ml 1 M NaCl及5 ml 〇.11^[磷酸鈉、〇.15]\/[他(：1(阳值為7.2)洗滌，且儲存在4 °C下。將凝膠支撐物（〇·5 ml)使用5 ml PBS轉移至15 ml Falcon小瓶中且與5 ml IVIgG混合。在4°C下輕微震盛隔夜 後，使用排出液將懸浮液轉移至管柱中以將基質完全沖洗 回管柱中。將管柱以10 ml PBS洗滌8次，隨後以1〇 ml超純 水進行2個洗滌週期。將親和力結合抗體以1〇x〇 5 mi 〇」％ 三氟乙酸（TFA)自管柱溶離。隨後用於結構表徵及親和力 研究之IgG分離及製備係使用兩種不同方案進行： (a)第一程序涉及使用〇,5 M NaH2P〇4(pH值為8)將所收集 之各溶離份調節至中性pH值以維持用於親和力研究之抗體 元正性。將經結合抗體以1 〇 X 〇. 5 ml 0· 1 Μ甘胺酸緩衝劑 (ΡΗ值為2.8)自管柱溶離。將各溶離份收集於含有35 μ1 ρΗ 值為9之1 M Tris-HCl之微反應管中。為維持抗體之完整 性’在溶離後即刻藉由添加適量之Tris_Hcl或甘胺酸緩衝 128311.doc 200844110 劑來凋節中性pH值。為使管柱再生以供進一步使用，將管 柱以10 ml pH值為6.8之10 mM磷酸鈉緩衝劑洗滌一次，隨 後以10 ml含有1 Μ氣化鈉之PBS進行兩個洗滌週期，且最 終以10 ml PBS進行兩個洗滌週期。藉由BCA法（pierce; Perbio, Bonn，Germany)來測定蛋白質濃度。此程序產生單 一確定抗體之溶離。 (b)將經結合抗體以10><0.5 ml pH值為2.8之0·1 Μ甘胺酸 緩衝劑自官柱溶離。對於藉由凝膠電泳分離而言，親和力 結合抗體之溶離並非藉由隨後之1)1^值調節來進行以便降低 進行等電聚焦之樣本的鹽含量。凝膠電泳分離提供一組確 定之抗體帶（參見圖12之編號）。 Π)抗體定量 溶離份中抗體濃度係藉由Micro BCA™蛋白質檢定套組 法（Pi㈣e; Perbio，Bonn，Germany)測定。使用⑽ BCATM套組内供應之2 mg/mi牛白蛋白之儲備溶液來製備 40_0·5 pg/ml範圍内的新鮮標準稀釋液。將抗體於溶離份工 至6之間溶離，其中最高濃度在溶離份丨及3中。對於各組 10個溶離份之定量而言，製備新鮮白蛋白標準稀釋液。以 ELISA讀取器於562 nm下讀取結果。 B·經由抗原決定基切除測定由抗Ap(21-37)自體抗體辨識之 抗原決定基
使用 100 Αβ(21-37)自體抗體於 5〇〇 μΐ 〇 2 M
NaHCOs/O.S M NaCl(PH值為8·3)中之溶液固定如實例仏所 述自健康個體血清分離之自體抗體，將其添加至經正經基 128311.doc -112- 200844110 琥珀醯亞胺基（NHS)活化之6-胺基己酸偶合之瓊脂糖 (Sigma，St Louis，USA)中，且使其在 2〇°c 下結合60 min， 隨後轉移至微毛細管（MoBiTec，Goettingen，Germany)上。 將管柱以6 ml阻斷緩衝劑（0.1 Μ乙醇胺，〇·5 NaCl，pH值 = 8·3)洗滌五次，且在阻斷步驟之間以6 mi洗滌緩衝劑（0.2 M NaOAc，0.5 M NaC卜pH值=4)洗滌，其中各自為每秒 一滴。接著，將管柱於阻斷緩衝劑中培育1 h，隨後進行 另一洗滌步驟··以6 ml洗滌緩衝劑（〇.2 M NaOAc，0 5 Μ NaCl，pH值=4)及6 ml阻斷緩衝劑（〇·ι μ乙醇胺，0.5 NaCl，pH值=8·3)交替洗滌七次。最終，將管柱以2〇 mi - PBS(5 mM Na2HP04，150 mM NaCl，pH值為 7.5)洗滌。接 . 著，以每莫耳經偶合抗體約兩莫耳肽之莫耳比施加待分析 之肽。接著，將管柱以10 ml PBS洗液洗滌，且接著以1 〇 ml雙去鹽H2〇(MilliQ)洗滌以移除經非特異性結合之肽。 接著，藉由施加500 μΐ 〇· 1% TFA且將其在輕微攪動下培育 , 15分鐘來完成溶離。接著溶離含有特異性結合肽之TFA溶 液且再次施加TFA溶液2至4次。將此等溶離物混合且；東 乾，接著以MS量測。 在室溫（20-25°C )下，藉由將PBS中2_5 pg Αβ抗原以每莫 耳經偶合抗體約兩莫耳肽之莫耳比施加至如以上章節所述 產生之抗體微管柱上歷時6 0 m i η來進行抗原決定基切除。 洗條後’在37°C下在管柱上以200 μΐ PBS中0·2 pg蛋白酶 進行消化歷時2 h。移除未經結合之肽且使用500 μΐ o.p/。 三氟乙酸使抗原決定基自抗體解離。在20°C下培育1 5分鐘 128311.doc -113- 200844110 後重複此步驟5次，將抗原決定基溶離物凍乾且於丨〇 y 0.1% TFA 或 MALDu„,U3:2 AcCN : 〇 1% tfa 較佳）中復水 以供質譜分析。 7 以類似方式進行抗原決定基萃取，然而首先以未經結合 之抗原來進行蛋白水解消化且將蛋白水解消化物直接施加 於抗體管柱上。如圖6所#，發㈣基端續21_37)序列經 特異性辨識（蛋白水解遮蔽），而八0之]^端殘基易進行裂 解。因此，自健康個體分離之Αβ自體抗體所結合之經萃取 抗原決定基展現Αβ(21_37)之胺基酸序列。因此，將本發 明抗體稱作Αβ(21·37)自體抗體。 圖3展示類似實驗，其中展示針對Αρ(4_1〇)之斑塊特異 性抗體能夠遮蔽胺基酸F4 ' R5、D7使其免於蛋白水解消 化。 使用如實例2A所述自IVIgG純化之Αβ(21-37)自體抗體進 一步研究本發明抗體之特異性。亦評估抗Αβ抗體aca(基 於美國專利7,195,761 ’參見實例5)。將抗體與如下所指定 之不同邛勿Αβ肽一起培育且如以上於實例2b中所述洗 滌。如上經由MS分析溶離概況。 圖34(a-d)展示此實驗配置中本發明抗體與aP(12_4〇)及 Αβ(20_37)特異性結合，但不與 Αβ(25-35)、Αβ(17-28)或 Αβ(31-40)結合。 圖34(b)展示僅Αβ(21-37)自體抗體與Αβ(12-40)多肽特異 性結合，而非抗體All。 圖34(c)展示Αβ(21-37)抗體不與Αβ多肽Αβ(25-35)、 128311.doc -114- 200844110 Αβ(17-28)或 Αβ(31-40)結合。 圖34(d)至3 4(1)展示經固定ACA抗體與經固定Αβ(2 1-37) 自體抗體均與Αβ(1-40)結合且與Αβ(12-40)結合，但僅經固 定Αβ(21-3 7)自體抗體與Αβ(20-37)特異性結合而ACA抗體 不與其結合。無經固定之抗體與Αβ(17_28)結合。此外， 經固定抗體ACA不與Αβ(4-10)結合。 因此，本發明抗體為獨特的，因為其特徵為在以上所指 定之實驗條件下其與Αβ(12-40)及Αβ(20-37)特異性結合， 而其不與 Αβ(25-35)、Αβ(17-28)或 Αβ(31-40)結合。 Αβ自體抗體抗原決定基之結構及構型特性、結合親和力 及特異性係以下列方法進一步表徵：研究包含Αβ(2 1-37) 抗原決定基序列之合成肽；及使用丙胺酸序列突變、H-D 交換及高解析度質譜法、不同溶劑中之ELISΑ研究及CD光 譜構型分析進行精細結構映射。側接有寡-甘胺酸及寡-(D-Ala)間隔基團之經生物素標記Αβ(2 1-37)肽及肽衍生物係藉 由根據先前關於Αβ肽所述之程序之固相肽合成來合成且係 藉由逆相HPLC純化且係由MALDI及ESI質譜法就分子均質 性進行表徵（Manea等人，2004 ; Mezo等人，2004)。比較 性結合研究係使用ELISA系統，以包含不同C端序列長度 之Αβ抗原決定基肽來進行（參見下文，3)。此等結果確立 包含殘基30-37之Αβ羧基端序列末端之抗體親和力的基本 功能；此部分序列與β摺疊形成及Αβ凝集重要相關。因 此，於Αβ(12-40)中獲得完全結合親和力。對照而言，縮 短之Αβ(20-3 0)肽展示幾乎完全消除之親和力。Η-D平衡交 128311.doc -115· 200844110 主鏈氫發生快速
體）之對照結合研究不展示任何結合親和力。 C·經純化抗Ap(21_37)自體抗體之親和力評估 換後肽質譜研究展示僅Ap序列（2〇-3〇)肽 氘合併，但殘基（3〇-37)僅有少數主鏈氘化 中因構型或减集效應而遮蔽增加。抗 為評定經親和力純化抗體之品質，使用親和力純化管柱 之溢流物（經固定Αβ12-40)作為對照來進行EUSA。在2〇。〇 下，將96孔培養盤以每孔2〇〇 ngMpBS緩衝劑中之Ap(b 40)培育2小時。將培養盤以2〇〇 μ1含有〇 〇5%吐溫2〇之叩8 洗滌4次且以於PBS緩衝劑中含有〇〇5%吐溫2〇之5% BSa阻 斷2小時。接著使用iVIgG溢流物作為對照，將培養盤在2〇 °。下在輕微震盪下以5% BSA，0·05%吐溫2〇中如實例2A所 述獲得之親和力純化抗體培育2小時。洗滌後，將抗人類 辣根過氧化酶（HRP)接合抗體添加至孔中且培育1小時。添 加受質OPD後，於450 nm下測定光學密度。藉由競爭性 ELISA來測定親和力，其中Kd值在約8x1〇-9 μ至約15χ10-9 之範圍内。 D·用於抗Αβ(21_37)自體抗體序列測定之電泳分離 藉由等電聚焦如實例2Α所述獲得之抗Αβ(21-37)自體抗 體進行之電泳分離係藉由1D-SDS-PAGE及2D-SDS-PAGE進 行。使樣本於6 Μ尿素、30%甘油、2% w/v SDS、0.05 Μ T『is-HC1(PH值為8.8)、1% DTT及痕量溴酚藍中平衡30 min，接著於除以4.5%(w/v)碘乙醯胺置換DTT以外相同之 128311.doc -116- 200844110 溶液中平衡30 min。以Multiphor II水平電泳系統 (Amersham Pharmacia Biotech)使用 17 cm經固定 pH值梯度 (IPG)膠條（pH值範圍3-10，線性）來進行等電聚焦（IEF)。 以Bio-Rad Protean II xi細胞垂直電泳系統，使用ι·5 mm厚 度之10% SDS-PAGE凝膠來進行二維分離。將ipg膠條於含 有溶解於7 Μ尿素、2 1^硫脲、4% CHAPS、0.3% DTT、 pH值為3-10之2% Servalyt及痕量溴酚藍中用於庫馬斯 (Coomassie)染色之約1〇〇 凍乾抗Αβ(21_37)自體抗體及 用於銀染色之30 凍乾抗Αβ(21-37)自體抗體的溶液中再 水合隔夜。使用凝膠内再水合法施加樣本。在2〇下，使 含有樣本之經再水合之膠條在第一維中跑膠約3〇 kVh。 將置放於垂直凝膠上之膠條以SDS電泳緩衝劑（25 mM Tris-HCl，1 92 mM甘胺酸及 0· 1 % w/v SDS)中 1 %j复脂糖覆 盖且使其在母凝膠2 5 m A下進行電泳歷時3 0 m i η且在每凝 膠40 mA下進行電泳直至追蹤染料到達凝膠之陽極端。於 SDS-PAGE凝膠中分離後，將蛋白質藉由銀染色或藉由敏 感膠體庫馬斯染色觀測且使用GS-710經校準之成像密度計 (Bio-Rad)掃描（參見圖12及13)。 重鏈與輕鏈分離 抗體輕鏈與重鏈之分離係使用1D凝膠電泳進行。在反覆 擾動、超音波處理及離心下將樣本（50-200 pg)溶解於樣本 緩衝劑（4% SDS、25%甘油、50 mM Tris緩衝劑、〇 〇2〇/〇庫 馬斯藍、6 Μ尿素，pH值6.8)中以確保抗體之最大溶解。 在20°C下，藉由與1〇〇〇倍莫耳過量之二硫蘇糖醇（〇7丁）反 128311 .doc -117- 200844110 應90 min來進行二硫橋之還原。隨後在川^下，藉由與^ 倍莫耳過量之碘基乙醯胺（IAA)/DTT濃縮物反應60 min來 進仃經還原之半胱胺醯基-硫氫基之烷基化。藉由每帶施 加約20 kg抗體，使用BIO-RAD Protean-(II)電泳細胞在 12/°丙稀酿胺凝膠上進行重鏈與輕鏈帶之1D-SDS-PAGE分 離。使用來自Bio-Rad之PDQuest軟體來使1-D及2-D凝膠成 像且進行分析。凝膠經染色及掃描後，使用PDQuest軟體 之獨立演算法來降低背景雜訊水平、凝膠假影及影像之水 平或垂直拖尾。接著使用PDQuest軟體自動偵測於2-D凝膠 上分離之蛋白點且用於比較不同凝膠。偵測約2〇個帶作為 辨別點’其中藉由質譜分析來分析且鑑別丨6個重鏈點及工5 個輕鏈點。 E·抗Αβ(21-37)自體抗體序列測定之分析策略及方法之概述、 藉由以下互補及部分重疊方法的組合進行涵蓋重鏈及輕 鍵胺基酸序列之抗體之初級結構測定，CDR序列、二硫鍵 及Ν端序列及其變型之測定及多樣性（圖1〇中之概述）： ⑴對抗體帶進行1D-電泳分離及潰墨後，對完整蛋白 貝、重鏈及輕鏈進行直接EdmanN端序列測定（Ν端及CDR1 可變域）； 〇ι)重鏈及輕鏈之1D電泳分離，隨後進行經分離蛋白帶 之胰蛋白酶消化，胰蛋白酶肽之HPLC分離及肽片段之 Edman序列測定（可變序列及CDR區）； (iii)使用從頭定序與來自NCBI資料庫搜尋程序之序列測 定之組合，對藉由HPLC分離之蛋白水解肽進行lc_esi_ 128311.doc -118- 200844110 MS/MS序列測定（可變序列及CDR區）； (iv) 使用高解析度MALDI-FTICR-MS聯合資料庫搜尋； 藉由進行兩個或兩個以上資料庫搜尋程序（例如Mascot， Profound搜尋引擎）對來自抗體-同功異型物之2D凝膠電泳 分離之蛋白水解消化肽進行質譜序列指定；恆定域及部分 可變序列域； (v) 使用MALDI-TOF-MS對經HPLC分離之蛋白水解肽進 行質譜分析（恆定區序列）；此外，在不伴以及伴以二硫橋 還原下使用蛋白水解肽片段之MALDI-MS(MALDI-TOF及 MALDI-FTICR-MS)來指定及確證正確之二硫鍵； (vi) 2D凝膠電泳分離後，藉由蛋白水解肽混合物之 MALDI-MS(MALDI-T〇F-及 MALDI-FTICR-MS)來進行抗 體-同功異型物之重鏈及輕鏈連接性指定，其中最初省略 二硫蘇糖醇（DTT)還原步驟，提供等電聚焦步驟期間的完 整二硫鍵連接之抗體。接著於第二電泳步驟中進行二硫鍵 還原及烷基化。 F.抗Ap(21-37)自體抗體序列之詳述 測定藉由親和力純化自由兩個健康成人個體（男性，3〇 歲）分離之a)血清-IVIgG，及b)血清-IgG分離之抗Αβ(21-37) 自體抗體的胺基酸序列。以圖29、30及32中之結構細節指 定來展示完全抗體，重鏈及輕鏈（如上所述以二硫鍵鐘別） 之序列測定。在圖25至30中所描述之實驗細節中，用於由 互補及重疊部分序列完成序列測定之不同互補法係以& 以下各者之不同加底線代碼來展示：⑴Edman N端蛋白質 128311.doc -119- 200844110 序列測定；及（ii-v)使用 Edman定序、LC-MS/MS、MALDI-TOF-MS及高解析度MALDI-FTICR-MS及蛋白水解肽混合 物在2D電泳分離後之MALDI-FTICR-MS對藉由HPLC分離 之蛋白水解肽的序列測定。此外，已於重鏈序列中標註於 Cys-224(HC-LC)、Cys-230 及 Cys-233(HC)處鑑別之胱胺酸 殘基内部二硫鍵及重鏈-輕鏈二硫鍵。除直接指定半胱胺 酸殘基之序列位置以外，藉由自胰蛋白酶、未經還原肽混 合物（未圖示）及隨後經DTT還原之肽之質譜分子量測定來 確證二硫鍵，展示與由參考IgGl結構之結晶資料（PDB 1IG，Brookhaven蛋白質結構資料庫）所預測之二硫鍵指定 之同源性比較完全一致。 由血清IVIgG抗體，鑑別各別可變區之12個重鏈同功異 型物及5個輕鏈同功異型物之序列；輕鏈序列包含4κ及1 λ 鏈序列。對於大部分胺基酸序列而言，序列資料彼此對應 且係藉由至少兩種互補重疊部分序列測定來彼此確定。將 所有抗體序列鑑別為IgG!子類分子。 重鏈及輕鏈序列之顯著結果為鑑別恆定域中若干單一胺 基酸變化，其各自係藉由若干互補質譜法及藉由HLC分離 之胰蛋白酶肽之Edman定序來確定。藉由胰蛋白酶肽（297-304)(EEQYNSTYR)之Edman序歹ij測定來確定N-301處之N 糖基化位點；此肽於定序週期-5中提供空白。以PNGaseF N-去糖基化後，此肽產生序列測定，N-301 ;此外，去糠 基化肽之MALDI-FTICR-MS分析提供正確分子質量之鑑 別。此外，非糖基化Fc序列變化係藉由N301A之突變及藉 128311.doc -120- 200844110 由部分非糖基化N之存在來鑑別。 所測定之輕鏈及重鏈之可變序列係概述於圖25及26中， 其包含12個序列變異體（重鏈）及5個（輕鏈）。重鏈中之序列 變化遠頻繁於輕鏈中之序列變化，例外為N端序列，其展 示輕鏈有若干序列變化，但重鏈完全均質。N端序列係藉 由蛋白質之直接Edman序列分析，胰蛋白酶N端肽之Edman 定序及經HPLC分離之N端肽之LC-MS/MS定序的組合來測 定。與輕鏈N端突變相比，典型特徵為單一均一重鏈N端 重鏈（1-20)。輕鏈N端突變係藉由使用NCBI資料庫進行 blast同源搜尋來確證。 將所測定之重鏈及輕鏈區之CDR序列域概述於圖24 a至d 中。與可變域内所鑑別之突變相一致，藉由鑑別達至7個 CDR1、CDR2及CDR3序列發現重鏈序列之較高多樣性； 同時測定輕鏈CDR1及CDR2域及兩個CDR3序列變異體之4 及5個序列。使用重鏈及輕鏈CDR之逐步檢查，所有CDR 序列與Kabat規則一致匹配（Kabat，Ε· A·，Wu，Τ· T·，Perry， Η. Μ., Gottesman, Κ. S.& Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (Department of Health and Human Services, Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD) NIH 出版號 91-3442 第 5 版及 R. Kontermann, S. Dubel (編），Antibody Engineering; Springer Lab Manual Series; Springer, Heidelberg 2001;) 〇 所鑑別之CDR序列使得一致序列之衍生成為可能。 G·序列測定之實驗程序之詳述 128311.doc -121 - 200844110 i) 序列測定之蛋白質樣本製備 將自如實例2A中所述獲得之血清ivigG分離之抗Αβ(21-3 7)自體抗體凍乾且以1 pg/pL之濃度溶解於變性緩衝劑（6 Μ尿素；50 mM Tris，pH值=7.5)中。在30°C下，以 1000倍 莫耳過量之DTT進行二硫橋之還原歷時2小時。隨後以 3 000倍莫耳過量之碘基乙醯胺藉由在2〇。〇下在柔光中反應 1小時來進行游離硫醇基之烷基化。隨後將樣本凍乾，之 後藉由1D-凝膠電泳來分離重鏈與輕鏈。 ii) N端Edman蛋白質序列分析 自動胺基酸序列分析係用與140C微梯度HPLC系統、 785A可程式化吸光率偵測器及61 〇A資料分析系統連接之 Applied Biosystems 494 HT Procise定序器來進行。所使用 之所有 >谷劑及試劑具有分析超級純度（Applied Biosystems Europe，Darmstadt，Germany供應）。 所有分析中採用以下試劑及材料（Applied Bio systems): 潰墨緩衝劑：25 mM Tris-HCl、192 mM甘胺酸、〇·1〇/0 SDS、20%甲醇；PVDF膜：ProBlott，Applied Biosystems ; 渡紙：GB005(Schleicher & Schuell);潰墨器：peqLab PerfectBlue Tank-Elektroblotter Web M ;染色溶液：5〇% 甲醇中之0·1%庫馬斯藍R-250 ;退色溶液：50%含水甲 醇。 如4)所述將抗體還原、烷基化且藉由1d_Sds-PAGE分離 為重鏈及輕鏈組份。電泳分離後即刻將新鮮凝膠於轉移緩 衝劑中平衡10 min。將PVDF膜（10x10 cm，凝膠尺寸）於甲 128311.doc -122- 200844110 醇（分析級，N〇rmapur)t濕潤！ min且接著於轉移緩衝劑中 平衡20 min。將兩片濾紙剪成凝膠尺寸（1〇χ1〇，且將 濾紙浸泡於轉移緩衝劑中。 如下組裝潰墨夾層：將濕潤濾紙置放於漬墨盒之陽極 (+)側。將經平衡之PVDF膜置放於濾紙之上。將經平衡之 凝膠置放於轉移臈之上m間滤紙置放於凝夥之 上。注意不使夾層組份之間包括氣泡。接著將盒封閉且浸 沒於潰墨槽中。 以恆定電流1 mA/cm2進行漬墨歷時4小時。蛋白質轉移 完成後，將PVDF膜以MilliQ水洗滌兩次歷時15 min以移除 SDS及甘胺酸。接著將PVDF膜以甲醇洗滌丨㈤匕且接著染 色1 min。將經染色之膜以退色溶液洗滌直至蛋白點自背 景清晰可見。接著使膜在空氣中乾燥。將蛋白點切除，且 置放於Eppendorf管中且儲存在4。〇下。序列分析前，將點 以100%甲醇洗滌直至完全退色。將蛋白點置放於定序器 濾筒中且使用標準PL尸FDF蛋白法（PVDF潰墨蛋白質之脈 衝式液體疋序法’ Applied Biosystems)定序。 iii)凝膠電泳分離後抗體之蛋白水解消化 如4)所述，將重鏈與輕鏈藉由iD_凝膠電泳使用12%分離 凝膠及5%堆疊凝膠分離且以膠狀庫馬斯藍染色。 對於凝膠内蛋白水解消化及隨後之胰蛋白酶肽之HpLc 分離及質譜分析而言，將凝膠帶剪除且在25下藉由添加 MilliQ水中60%乙腈退色歷時20分鐘。移除上清液且將凝 膠點陳乾至乾燥後，添加1 ml 5 0 mM NH4HC〇3之溶、夜以 128311.doc -123 - 200844110 仏再κ σ且將其在25 c下培育2Q油。重複此程序兩次且 在4C下以蛋白酶溶液（5〇 mM NH4HC03中之12.5 ng/μΐ胰 蛋白酶）進行最終之再水合歷時45_。接著在听下將凝 勝點在1 nU 5〇 mM NH4HC〇3中培育12小時，且將蛋白片 段以1⑹於水中之6G%乙腈溶離三次歷時1小時。將溶離物 陳乾至乾燥且在HPLC及MS分析前即刻溶解。 對於2D電泳後之蛋自_別/序列及諸庫分析、藉由 了-MS/MS之序列測定及蛋白水解肽之Ε“η n端序列測 疋而5，將凝膠點切除，使其於乙腈中進行脫水且在真空 中移除乙腈後於真空離心機中乾燥。蛋白水解消化之樣本 製備係如上所述藉由以足以覆蓋凝膠片之體積之5〇 NH4HC〇3中10 mM二硫蘇糖醇（DTT)還原來進行且將蛋 白質在56。(：下進行丨小時。冷卻至室溫後，將含有〇丁丁之 溶液以相同體積之55 mM碘基乙醯胺於5〇 mM NH4Hc…中 之洛液置換。在室溫下在黑暗中在不定時震盪（渦旋）下培 育 45 min 後，將凝膠片以 5(Μ〇〇 μ1 5〇 mM NH4Hco3洗 = 1 0 mm且藉由添加相同體積之乙腈再次脫水。接著將液相 移除且將凝膠片於真空離心機中完全乾燥。 根據文獻程序將經切除之凝膠片以胰蛋白酶手動或自動 (使用 DigestPro 96 自動操作機（Intavis Bi〇analyUcai
Instruments，Langenfeld，Germany))消化。對於手動凝膠内 消化及隨後之質譜分析而言，將點切除且藉由在乃它下添 加MilliQ水中60%乙腈而使其退色歷時2〇 min。移除上清 液且將/旋膠點凍乾後，添加5〇 mM NH4HC〇3之溶液以供再 128311.doc -124· 200844110 水。且將其在25 t下培育20 min。重複此程序兩次且接著 在4°C下以蛋白酶溶液（5〇 mM NH4HC〇3中之i25 胰 蛋白酶）進行最終之再水合歷時45 min。在37〇(：下，將凝膠 點於50 mM N^HCh中培育12 h，且以水中6〇%乙腈將蛋 白水解肽溶離3-4小時。將溶離物凍乾至乾燥且於maldi_ MS分析前即刻溶解於5 μι乙腈/水中〇1%三氟乙酸（^) 中。 用於隨後之質譜分析之自動凝膠内消化係以DigestPr〇 自動操作枝（Intavis Bionalytical Instruments)來進行。 DigestPro 96為市售之消化自動操作機系統，其係由裝備 有含有溫度調控鋁反應器區塊之模組之Gils〇n 221XL自動 操作機組成。區塊可容納達至96個蛋白樣本且係安裝於執 道上，使得其可由自動操作機臂移動至洗滌位置或樣本收 集位置。將蛋白凝膠片自2D-PAGE凝膠切除且裝載於清潔 96孔PCR培養盤中，該培養盤含有貫入孔底部之小洞。將 培養盤以由蓋子及四個安裝螺桿固持於適當位置之聚矽氧 膜覆蓋。聚矽氧膜中之洞允許由經特定設計之分配針傳遞 试劑。此針具有傳遞氮壓至反應孔之第二外通道。針定位 允許由2·6巴之氮壓將液體傳遞至小瓶或自反應器排出。 如下所述之整個凝膠内消化過程係於自動操作機平台上實 細且係由DigestPro 96軟體（4,〇2版；INTAVIS)控制。簡言 之，將凝膠片以50 μΐ 50 mM NH4HC〇3洗滌四次且於各步 驟後以100 μΐ乙腈脫水。最後之收縮步驟後，將5〇 μ1酶緩 衝劑（50 mM NH4HC03中之12.5 ng/μΐ胰蛋白酶，ρΗ值約為 128311.doc -125- 200844110 8)添加至管中。將酶引至凝膠片中歷時3〇 min。隨後，添 加50 μΐ 50 mM NH4HC03溶液來覆蓋凝膠片，且在37°C下6 小時後萃取肽。以50 μΐ NH4HC〇3進行第一次萃取，隨後 以50 μΐ 1〇%甲酸進行三次萃取；在萃取之間，如上所述將 次是膠片以乙腈脫水。接著將所收集之萃取物於真空離心機 中乾爍且在MS分析前即刻再溶解於5 y MALDI-MS溶液 (乙腈：水中ο·ι%三氟乙酸，2:1)或5 μ1 ESI_MS溶液（甲醇： 水··乙酸，50··48··2(ν/ν/ν))中。對於凝膠内去糖基化而言， 使凝膠片於去糖基化緩衝劑中膨脹，該去糖基化緩衝劑係 藉由狀*合100 pL市售之Ν糖苷酶F(PNGase F)製劑（Roche，
Mannheim，Germany：^1〇()叫M碳酸氫銨緩衝劑以提 供每毫升100單位之最終酶濃度來製備。若所有液體皆為 政膠片所吸收，則將其他消化緩衝劑（但不含有F) 添加至樣本中以保持樣本在37t下培育隔夜期間濕潤。為 避免在maldi_ms分析中可能為PNGase F相關肽所干擾， 藉由以〇·1 Μ碳酸氫銨中〇.1% SDS洗滌凝膠片（四次，各自 250 pL歷時！小時）而在蛋白水解前移除糖苷酶。丟棄所有 洗滌溶液且將SDS藉由以5〇··45:5(ν/ν/ν)甲醇：水：乙酸培育 (30 min)且使用Μ碳酸氫銨中5〇%乙腈洗滌三次（各自％ min)而移除。丢棄所有洗液，且接著將凝膠塞於真空離心 機中乾蚝。對於以End〇H.苷酶進行凝膠内去糖基化而 言，使用相同程序。 接著使用來自 MimP〇re(Eschborn，Germany)iZipTip⑧ 吸管尖來進行zipTip清除程序。zipTi{mf尖為有樹脂c預8 128311.doc •126- 200844110 先填充於10 μ卜及管尖之狹窄端中之微管柱。zipTip吸管尖 含有Cls或C4逆相材料用於濃縮及純化肽及蛋白質樣本。 將ZipTipcu吸管尖應用於肽及低分子量蛋白質，而將 ZipTiPC4吸管尖應用於較高分子量蛋白質。根據製造商說 明進行完全ZipTip程序。簡言之，其基本上由五個步驟組 成：濕潤；ZipTip吸管尖之平衡；肽及蛋白質與吸管尖之 結合；洗滌；及溶離。 iv) 蛋白水解肽之HPLC分離 f 所有分析HPLC分離係以BI〇-RAD(Muenchen， Germany)2700 HPLC系統使用 Vydac C4 管柱（25〇x46 mm I.D.)及5 μιη二氧化矽（300 A孔徑）進行。以1 mL/min之流動 速率進行線性梯度溶離（0 min 0%溶劑b ; 5 min 0°/。溶劑 B，135 min 65%溶劑B，150 min 100%溶劑 B，160 min 1 00% B) ’其中溶離劑A係由水中〇· 1〇/〇三氟乙酸（Tfa)組成 且溶離劑B係由乙腈：水（80:20，v/v)中之〇·ΐ% TFA組成。 I 將通常為50 pg等分試樣之蛋白水解肽樣本溶解於2〇〇 溶 離劑Α中。肽之偵測一般係使用BIO-RAD可變波長吸光率 伯測器在220 nm下進行。 v) 蛋白水解肽之N端Ed man序列測定 在序列分析前，將姨蛋白酶肽如上所述藉由HPLC分 離，且凍乾且儲存在-20°C下。用於序列測定之樣本支撐 物係由玻璃纖維過濾器（Applied Biosystems)組成，該過遽 器經 30 pL BioBreneTM Plus(Applied Biosystems)溶液（100 pg/pL Biobrene及水中6·66 pg/pL NaCl)處理，且係使用標 128311.doc -127- 200844110 準過濾器預循環法進行預循環（3次循環）。對於序列分析而 言，將經凍乾之HPLC溶離份於15卟含有0·1% TFA之於水 中之20%(v/v)乙腈中復水。將經復水之肽溶液以5 y之等 分試樣施加於預循環之玻璃纖維過濾器上以確保儘可能接 近玻璃纖維過遽器中心分布，每次施加之後在^氣流下乾 燥 1 min 〇 所有序列分析係於如上所述之AppUed Bi〇systems 494 HT Procise定序器/140C Microgradient系統以及 785A可程 式化吸光率偵測器及610A資料分析系統上進行。所使用之 所有；谷劑及试劑係來自Applied Biosystems。用於分析蛋 白水解肽之一般方法為標準廉衝式旋禮法。 vi)藉由蛋白水解肽之ESI_LC-ms/MS進行序列測定 藉由HPLC分離之胰蛋白酶肽（參見上文）之所有序列測定 係以裝備有奈米ESI/LC離子來源系統之Bruker Esquir卜 3000+離子井 LC-MS/MS 系統（Bruker Dahonics，Bremen，
Germany)進行。將蛋白水解肽之HpLC溶離份收集於1 ml
Eppendorf杯中且凍乾至乾燥且儲存在-2〇〇c下直至lc/ms 为析。將HPLC溶離份溶解於16 μΐ含有水：乙腈（9:1，v/v) 中1 °/〇甲酸之溶劑混合物中。將樣本在2〇 t下超音波降解 處理5 min且在13000 rpm/min下離心3 min。將樣本内容物 轉移至裝備有内部微瓶（0.1 ml)之2 ml螺旋帽小瓶中且置放 於LC/MS盤中。藉助於自動注射系統將3 μ1樣本等分試樣 注射於C-18微管柱上，且採用下表中所列出之溶離梯度 (LC-MS梯度）。樣本自注射環流入管柱中且接著被引入電 128311.doc -128- 200844110 喷霧界面且經由離子光學元件進入離子井中。以時間之函 數記錄總離子電流（TIC)，且使用資料分析軟體（Bruker
Daltonics)將其轉換為質譜。自第一次LC/MS運作產生之質 譜選擇待用於MS/MS分析之最強離子。對於所鑑別之各前 驅物離子而言，在相同梯度條件（參見表格）下進行獨立 LC-MS/MS運作。抽汲系統起動後，使用前驅物質量、分 離寬度及碎裂振幅之規定於Esquire控制窗中開始母離子之 刀離及碎4。以時間之函數來記錄對應於離子碎片之總離 子電流（TIC);若在運作期間使單一母離子碎裂，則TIC含 有單峰。前驅物離子iMS/MS譜係以資料分析軟體藉由使 半峰寬處之脈衝平均化產生。將MS/MS譜内所含之碎片之 m/Z值及其強度輸出至資料分析檔案類型（副檔名為*mgf) 中將；^案上載至MS/MS Mas cot搜尋引擎中使用以下搜 尋參數進行NCBInr資料庫搜尋：分類，智人；允許之漏失 裂解’ ·1 ;肽搜尋容許度，2 Da ; MS/MS容許度，〇·8 Da;固定修飾，胺曱醯胺基甲基（半胱胺酸）；可變修飾， Met氧化。所展示之結果含有圖表形式之μ⑽機率計 为，提供對於各擊中結果產生之肽序列及蛋白質。若給定 前驅物之碎片離子的結果產生來自免疫球蛋白重鏈或輕鏈 之肽的直接鑑別計分，則認為所獲得之肽序列為正確的肽 序列。若對於給定前驅物及其MS/MS譜未直接獲得鑑別計 刀，則使用來自資料分析軟體之指定功能，藉由從頭定序 來確定肽序列。此功能將兩個碎片之間的質量差異指定為 特疋胺基S夂之貝置。若由從頭程序獲得之肽序列資料與藉 128311.doc -129- 200844110 由NCBI資料庫搜尋獲得之序列相同，則認為序列結果為 正確的。若對於特定前驅物離子進行之資料庫搜尋不提供 任何免疫球蛋白肽片段，則對應前驅物離子指定為未經鑑 別的。 LC-MS/MS梯度溶離參數表 時間(min) 溶劑A 溶劑B 0 80 20 3 80 20 6 50 50 16 20 80 18 2 98 20 2 98 22 98 2 24 98 2 vii)蛋白水解肽之MALDI-TOF質譜法 MALDI-TOF MS分析係以裝備有氮UV雷射（λ=337 nm)、 26樣本SCOUT來源、視訊系統及用於譜獲取及工具控制之 XMASS資料系統之Broker Biflex線性TOF質譜儀（Bruker Daltonics，Bremen，Germany)來進行。將 α-氰基-4-經基-肉 桂酸（HCCA)於乙腈：水中0.1% TFA(2:1 ν/ν)中之飽和溶液 用作基質。對於所有MALDI-MS分析而言，將0.8 μί基質 溶液與0.8 μ：ί樣本溶液（藉由HPLC分離之蛋白水解肽混合 物或胰蛋白酶肽）於不鏽鋼MALDI靶上混合且使其乾燥。 譜獲取係以20 kV之加速電壓（Vaee)及1.5 kV之偵測器電壓 進行。外部校正係使用牛胰島素（5734.5 Da)、經氧化牛胰 島素B鏈（3496.9)、人類神經調壓素（1673.9 Da)、人類血管 緊張素1(1297.5 Da)、人類緩激肽（1061.2)及人類血管緊張 128311.doc •130- 200844110 素ΙΙ(1047·2 Da)之單一質子化離子信號之平均質量來進 行。
viii)蛋白水解肽之 MALDI-FT-ICR-MS
MALDI-FTICR質譜分析係以裝備有主動屏蔽7T超導磁 體（Magnex，Oxford，UK)、圓柱體無限ICR分析器單元及具 有脈衝式碰撞氣體之外部Scout 100全自動X-Y靶階段 MALDI 來源之 Bruker APEX II FTICR 工具（Bruker Daltonics，Bremen，Germany)來進行。脈衝式氮雷射係在 33 7 nm下操作。 以2,5 -二經基苯甲酸（DHB)於乙腈/水中0.1% TFA(2:1 v/v)中之100 mg/mL溶液用作基質來進行肽樣本分析。將 0·5 kL基質溶液與〇·5 μί樣本溶液（胰蛋白酶肽或肽混合物） 之等分試樣於不鏽鋼MALDI無上混合且使其乾燥。外部校 正係使用牛胰島素（5730.609 Da)、經氧化牛胰島素Β鏈 (3494.651)、人類神經調壓素（1672.917 Da)、人類血管緊 張素1(1296.685 Da)、人類緩激肽（1〇6〇 569)及人類血管緊 張素11(1046.5 42 Da)之單一質子化離子信號之單一同位素 質量來進行。譜之獲取及處理係以XMASS軟體（Bruker Daltonics，Bremen，Germany)來進行 0 MALDI-FTICR-MS/MS分析係以裝備有sopj-dD(持續 偏共振碰撞誘發解離）解離、iRMpd(紅外線多光子光解離） 儀器以使肽及蛋白離子碎裂之BrUker ApexII FTICR-MS工 具來進行（Damoc等人，2003)。使藉由MALDI離子化所形 成之離子截獲於分析器單元中，且藉由使用適當頻率及振 128311.doc -131 - 200844110 :===脈衝自ICR單元中排出具有較高及較 所有離子來進行前驅物離子之分離。採用以下實 驗條件：相關清掃衰減：8-10dB;排出安全帶：500_1000 心太遠。施加此激勵的同時，藉由允許碰#氣體（氯）穿過 脈衝閥歷時20-80 msec來升高分析器單元中之壓力毫
Hz。對於S0RI_CID而言’以自回旋加速器頻率稍微偏共 振之頻率(购_ Hz)對前驅物離子施加低振幅A激勵歷 時250 msec。保持較低激勵振幅使得離子從不離開單元中
巴）°在此等條件下’前驅物離子經受許多低能量碰撞， 該等碰撞緩慢活化離子直至其達到其解離臨限。 對於IRMPD(紅外線多光子解離）實驗而言，使用25 w持 績波 C〇2 雷射（1〇·6 μηι，Synard，Mukilteo, WA，USA)將質量 選擇離子光解離。將雷射功率設定為5〇%臨限值且將雷射 輻射時間設定為50-200 msec ° 對於2D- /旋膠電泳後蛋白水解肽混合物之蛋白質鑑別及 序列測定（恆定區序列）而言，採用以下（可公開獲得）之資 料庫搜尋引擎。
Mascot-來自 Matrix Science Ltd·，London之肽質量指紋 及MS/MS離子搜尋。
ProFound-來自 Rockefeller 及 New York Universities 之肽 質量指紋。 MS-Fit-來自 University of California，San Francisco (UCSF)之肽質量指紋。 MS-Tag-來自 University of California，San Francisco 128311.doc -132- 200844110 (UCSF)之MS/MS離子搜尋。 實例3藉由ELISA測定抗原-抗體複合物之解離常數 藉由Kim等人（1990)方法之修正來測定反0值。對於測定 而言，首先自藉由如實例9B所述之間接ELISA獲得之初始 校正曲線產生所採用之抗體濃度。 1)對於間接ELISA而言，在20°C下以每孔150微升之抗生 蛋白鏈菌素來塗覆微量滴定盤歷時2小時。將孔以磷酸鹽 緩衝生理食鹽水（PBS)(Na2HP04 5 mM，NaCl 150 mM，pH 值為7.5)中〇·〇5%(ν/ν)吐溫20清潔劑洗滌一次。於PBS中製 備濃度在lxlCT6與HT8 Μ之間的生物素標記-(〇)5_Αβ(12-40) 肽，且以每孔1〇〇微升之體積將其沈積在孔中。將孔在2〇 °C溫度下培育2小時，隨後進行4次洗滌步驟且以阻斷缓衝 劑（PBS中BSA 5% w/v，0.05%吐溫-20 v/v)阻斷2小時。將 抗Αβ(12-40)抗體以阻斷緩衝劑稀釋至14><1〇-7與1〇·9 M之 間的丨辰度，且以每孔1 〇 〇微升添加。將微定量盤在2 〇 下 培育2小時且接著以Covabuffer(含有2 M NaCl、0.083 Μ MgS〇4及 0.05%吐溫-20之 0·15 M PBS，pH值為 7 2)洗務。 在20 C下將孔以與過氧化酶接合之小鼠抗人類
IgG(l:5.000)培育45 min。以含有〇·ΐ Μ檸檬酸鹽-填酸鹽、 〇· 1% OPD及0·006%過氧化氫之丨，2-苯二胺（〇pD)新製溶液 來偵測抗體結合。使用ELISA盤式讀取器（Vict〇r2，perkin
Elmer Ufe/Analytical Sciences，Boston，ΜΑ)以時間之函數 在450 nm下監測酶反應。對於各抗體及抗原濃度而言，製 備且罝測二個重複孔。觀測寬濃度範圍内吸光率與抗體濃 123311.doc -133- 200844110 度之間的正比性。使用此濃度範圍來選擇Kd測定之初始濃 度。初始濃度係選擇在光學密度對抗體濃度之曲線的線性 區域内。 2)對於Kd值之測定而言，應用以下條件。將各種濃度 (lxlO6 Μ至4.8X10·1。M)之抗原，Αβ(12_4〇)肽與恆定濃度 之源自初步ELISA校正之抗體混合。培育係使用聚丙烯試 官在PBS中5% BSA，0.05%吐溫20中進行以使抗體因吸附 於微反應管壁上之損耗降至最低。2小時後，將1〇〇 μ1各混 合物轉移至事先塗覆有生物素標記 且經阻斷之微量滴定盤之孔中且培育3〇 min。接著藉由上 述間接ELISA來量測游離抗體之濃度。藉由使用Sips座標 繪製實驗資料曲線來獲得Kd值。 測疋Αβ(12-40)肽之Αβ抗體複合物之以下平均值： a) 血清IVIG ;經純化： 8χ10·9Μ
b) 血清AbΑ(健康人類個體；年齡超過3〇歲）： 14xl(T9M c) 血清AbB(健康人類個體；年齡超過3〇歲）： 18χ1〇·9Μ 由於已於文獻中估計形成Αβ原纖維/凝集物之結合/解離 书數之範圍在1 〇 6 ]y[(所測定）之範圍内，故確定抗體之結 合為特異性結合。對於IgG抗體而言，已測定各種募肽及 多肽抗原及抗原決定基之典型Kd值在1〇_8至1〇_9 M之範圍 内。 實例4由親和力純化之IVIgG抗體抑制斑塊形成 使人類神經母細胞瘤細胞（SH-Sy5y)於補充有胎牛血 清、10 mM Hepes、4 mM麩醯胺酸及盤尼西林（penicimn) 128311.doc -134- 200844110 (每毫升200單位）、鏈黴素（200 pg/ml)之RPMI 1640培育基 中生長。將細胞以每孔30,000個細胞之密度於96孔微量滴 定盤中培育隔夜。移除培養基後，將細胞以PBS洗滌，且 將毒性Αβ募聚物（2 μΜ之最終濃度）以1〇〇 μΐ新鮮培養基之 體積添加至7·5 μΜ或15 μΜ抗Αβ(21-37)自體抗體中或不具 有抗Αβ(21-3 7)自體抗體。使用與凝膠偶合之Αβ( 1-40)(使 用實例2A中所述之偶合化學），藉由以親和力層析法自市 售之IVIgG純化抗體來獲得經親和力純化之IVIgG抗體。4 小時之培育後進行MTT測試。圖4展示Αβ所介導之毒性（灰 色條）幾乎為經親和力純化之IVIgG(黑色條）所完全拮抗。 實例4中所使用之可溶毒性Αβ募聚物可藉由在室溫下將 1 ·〇 mg Αβ溶解於400 pL HFIP中歷時10-20 min來製備。接 著將100 μΐ所付無晶種Αβ溶液添加至石夕化Eppencj0]rf管中之 900 μί DD H20中。在室溫下培育1〇-2〇 min後，將樣本以 14000 X G離心15 min且將上清液溶離份（pH值為2·8-3.5)轉 移至新石夕化管中且使其經受輕微A流歷時5_1〇 min以蒸發 HFIP。接著在22 °C下，使用經Teflon塗覆之微攪拌桿在 5 00 RPM下攪拌樣本歷時24-48小時。以6_12小時之時間間 隔取等分試樣（1〇 W)以用於藉由原子力顯微法或電子顯微 法觀測。 實例5抗Ap(21-37)自體抗體之重組表現 A•用於瞬間表現之哺乳動物表現載體建構 使用CSL純系7之輕鏈可變區（SEQ m N〇: 53)&CSL純系 7之重鏈可變區（SEQ ID NO: 60)的胺基酸序列來藉由 12831 l.doc -135- 200844110 GENEART AG(Regensburg，Germany)合成編碼此等序列之 cDNA構築體。亦設計輕鏈及重鏈cDNA構築體以含有獨特 側接限制酶位點以允許分別選殖入人類輕鏈及重鏈恆定區 上游之哺乳動物表現載體中。亦以Kozak轉譯起始序列， 即 ATG 起 始密碼 子及信 號 肽 (MESQTQVLMSLLFWVSGTCG- 輕鏈及 MGWSWIFLFLVSGTGGVLS-重鏈）使構築體工程化。 使用標準分子生物技術，將重鏈可變區選殖入哺乳動物 表現載體pcDNA3.1( + )-hIgGl中，其係基於經修飾以包括 人類IgGl恆定區及可變區插入位點下游之末端終止密碼子 之pcDN A3.1(+)表現載體（In vitro gen)。將輕鏈可變區選殖 入表現載體pcDNA3.1( + )-hK中，其係基於經修飾以包括人 類κ恆定區及可變區插入位點下游之終止密碼子之 pcDNA3.1( + )表現載體。 CSL·純系7亦經工程化為•’鼠化"形式以便於鼠類動物模型 中重複使用。將重鏈可變區選殖入哺乳動物表現載體 pcDNA3.1(+)-mIgG2a中，其係基於經修飾以包括鼠類 IgG2a恆定區及可變區插入位點下游之末端終止密碼子之 pcDNA3.1(+)表現載體（Invitrogen)。將輕鏈可變區選殖入 表現載體pcDNA3.1( + )-mK中，其係基於經修飾以包括鼠類 κ恆定區及可變區插入位點下游之終止密碼子之 pcDNA3.1(+)表現載體。如下所述使鼠化CSL純系7表現及 純化。 B.細胞培養 128311.doc -136- 200844110 自Genechoice Inc.獲得適應無血清懸浮液之293_τ細胞。 將細胞於補充有盤尼西林/鏈黴素/兩性黴素Β試劑 (Invitrogen)之 FreeStyleTM表現培養基（Invhr〇gen)中培養。 在轉染之前，將細胞維持在37°C之具有8% C02氣氛之加濕 培育器中。 C·瞬間轉染 使用293-T細胞瞬間轉染純系7表現質體係根據製造商說 明使用293fectiri轉染試劑（invitrogen)來進行。將輕鏈表現 載體與重鏈表現載體組合且以293-T細胞共轉染。將細胞 (1000 ml)以每毫升1 X 1〇6個活細胞之最終濃度轉染且在 2/10 Wave生物反應器系統2/1〇或 20/50(Wave Biotech/GE Healthcare)上於 Cellbag 2L(Wave Biotech/GE Healthcare)中 以8。/。C〇2氣氛，在37°C下培育5天。培養條件為以8。之角 母分4里搖擺35次。在轉染後4小時添加piuroni^ f_ 68(Irwitr〇gen)至0·1% v/v之最終濃度。轉染後24小時，將 細胞培養物以 Tryptone Nl(〇rgan〇technie，France)補充至 0·5% Wv之最終濃度。藉由以25〇〇 rpm離心收集細胞培養 物上β液’且接著使其在純化前通過0.45 μΜ過濾器 (Nalgene) 〇 D·蛋白質表現之分析
5天後’將20 μΐ培養物上清液於4_2〇% Tris-甘胺酸sdS 聚丙烯醯胺凝膠上電泳且藉由以庫馬斯藍試劑染色來觀測 抗體。 E.抗體純化 128311.doc -137- 200844110 在4C下使用蛋白質A親和力層析法純化CSL純系7單株 才几體其中將 MabSelect樹脂（5 ml，GE Healthcare，UK)裝 填至30 ml Poly-Prep空管柱（Bi〇-Rad，CA)中。首先將樹脂 以1 0盲柱體積之無熱原質GIBCO蒸鶴水（invitrogen，CA)洗 滌以移除儲存乙醇且接著以5管柱體積之無熱原質磷酸鹽 緩衝生理艮鹽水（PBS)(GIBCO PBS，Invitrogen，CA)平衡。 將經過渡之改良性細胞培養基（1 L)藉由重力饋料裝載於樹 脂上。接著將樹脂以5管柱體積之無熱原質pbs洗滌以移除 非特異性蛋白質。將經結合之抗體以2管柱體積之pH值為 2.8之0.1 Μ甘胺酸（Sigma，MO)溶離至含有〇·2管柱體積之 pH值為8.0之2 M Tris-HCl(Sigma，ΜΟ)以中和低pH值的溶 離份。在 4 °C 下，於 12 ml Slide-A-Lyzer 盒 MW 截止 3.5 kD(Pierce，IL)中將所溶離之抗體相對5 l PBS透析18小 時。藉由使用 Ultraspec 3000(GE Healthcare，UK)分光光度 計於280 nm處量測吸光率來測定抗體濃度。藉由SDS-PAGE分析抗體純度，其中將還原樣本緩衝劑（Invhr〇gen， CA)中之2 pg蛋白質裝載於N〇vex 10-20% Tris甘胺酸凝膝 (Invitrogen，CA)上，且於具有Tris甘胺酸SDS電泳緩衝劑 之 XCell SwreLocA:迷你槽（Invitrogen，CA)中施加 150 V 之 恆定電壓歷時90分鐘，隨後根據製造商說明使用庫馬斯染 色觀測。 上述技術可用以表現及純化任何本發明抗體。在隨後之 實驗中，將輕鏈SEQ ID NO: 47、48、50至55及145至147 選殖入表現载體pcDNA3.1( + )-hK中且與選殖入表現載體 128311.doc -138- 200844110 pcDNA3.1(+)-hIgGl 中之重鏈 SEQ ID NO: 56至 71 及 148 共 轉染。進行涵蓋所有可能之輕鏈與重鏈抗體對之總共1 87 個瞬間轉染。以下42個輕鏈與重鏈抗體對（SEQ ID NO)表 現用於純化及分析之足夠抗體：47/56、50/60、50/61、 50/62、50/67、50/68、50/69、50/148、51/60、51/61、 51/62、51/68、51/148、52/60、52/148、53/60、53/68、 53/148、54/60、54/61、54/62、54/67、54/68、54/69、 54/148、55/60、55/61、55/62、55/67、55/68、55/69、 55/148、145/60、145/61、145/62、145/68、145/148、 146/60、146/61、146/62、146/68及 146/148 ° 該等方法亦可用以產生包含所選擇之個別序列之完全人 類抗β澱粉樣蛋白抗體，該等個別序列係基於各別CDR之 一致序列，諸如SEQ ID NO: 6至11及SEQ ID NO: 153至 1 61，或各別CDR之單一序列，諸如（a)重鏈SEQ ID NO: 13 至 20 之 CDR I，b)重鏈 SEQ ID NO: 21 至 27 之 CDR2，c)重鏈 SEQ ID NO: 28 至 32 之 CDR3，d)輕鏈 SEQ ID NO: 33 至 37 之 CDR1，e)輕鏈 SEQ ID NO: 38 至 43 及 SEQ ID NO: 53 之 CDR2，f)輕鏈 SEQ ID NO: 44 至 46 之 CDR3，g)可變重鏈 SEQ ID NO: 56至 71，及h)可變輕鏈SEQ ID NO: 47至 55。 對於在吾人之研究中用作對照抗體（AC A)而言，吾人亦 選殖人類化266抗體之輕鏈及重鏈可變區序列，已知該人 類化266抗體與含於澱粉樣蛋白β肽位置13-28内之抗原決 定基結合。此等序列係自美國專利第US 7，195,761 Β2號中 獲得。特定言之，使用上述方法，將266人類化輕鏈可變 128311.doc -139- 200844110 區（US 7，195,761 B2，SEQ ID NO: 11)及 266 人類化重鏈可 變區（US 7，195,761 B2，SEQ ID NO: 12)之基因合成，選殖 入表現載體中，瞬間表現及純化。 實例6重組表現之抗Ap(21_37)自體抗體及親和力純化之 IVIgG與募聚形式之Αβ的結合 於相對於抗Αβ(21-37)單株抗體（mab)CSL純系7及相對於 如實例4所述親和力純化之IVIgG之免疫沈澱檢定中分析於 胺基端含有額外半胱胺酸之合成澱粉樣蛋白β丨_4〇肽（PSL GmbH Heidelberg)(Api-40.Cys)。採用 PBS作為陰性對照。 特定言之，評估mab CSL純系7是否使單體或寡聚物形 式之合成肽免疫沈澱。即刻（〇 h)使用再懸浮（1 mg/ml)於磷 酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS : 1〇 mM磷酸鈉，150 mM NaCl ’ pH值為7·4)中之肽或使其在37°C，900 rpm下進行 寡聚（15 h)且以小等分試樣儲存在_8〇。(：下直至使用。對於 免疫沈澱而言，在4 °C下，將30 μΐ蛋白質G珠粒（GE Healthcare)之等分試樣與5叫抗體mab CSL純系7或根據實 例2(Αβ1-40管柱）純化之5盹抗Αβ(21-37)自體抗體、2 pg Apl_4(hC：ys& 1·5 ml PBS—起培育隔夜。收集經固定之抗 體/肽。以PBS洗滌（五次）後，在95°C下，藉由添加lx非還 原NuPAGE LDS樣本緩衝劑（invitr〇gen)將肽溶離1 〇 min。 藉由於 NuPAGE 4_ 12% Bis-Tris 凝膠（Invitrogen)上電泳及 根據供應商（Invitrogen)藉由西方墨點法於硝化纖維膜上西 方轉移來完成蛋白質分離。將膜以1 X R〇ti_B1〇ck(R〇th)阻 斷且接著依次與一次抗體，1:6〇〇〇以⑽㈧」（抗Aj3)(Sigma) 128311.doc -140- 200844110 及二級抗體，HRP接合之山羊抗小鼠抗體（Pierce)—起培 育。使用 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo ScientiHc/Pierce)作為化學發光受質。 結果展示mab CSL純系7(參見圖33)及親和力純化之 IVIgG(參見圖37)與寡聚形式之Αβ1-40結合。詳言之，將 mab CSL純系7或親和力純化之IVIgG與單體（0 h)或寡聚（15 h)形式之Αβ 1-40，Cys沈澱募聚形式之肽共培育。與寡聚 形式之Αβ結合之更多結果可見於實例12D中。 實例7肽合成 根據市售之材料及公開之文獻程序，於含有聚苯乙烯-聚乙二醇樹脂及在酸性條件下可裂解之Rink-醯胺連接子 的NovaSyn TGR樹脂上藉由固相肽合成（SPPS)來合成肽生 物素-G5-FAEDVGSNKGA-NH2(生物素-G5-AP20_30)及生物 素-G5-FAEDVGSNKGAIIGLMVG-NH2(生物素-G5-AP20-37)。自始至終使用9-苐基甲氧基羰基/第三丁基 (Fmoc/tBu)化學以供使用半自動經濟型肽合成儀EPS-221 (ABIMED， Germany)合成 。使用 以下側 鏈保護 之胺基 酸衍生物：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Glu (OtBu)-OH。 合成係根據以下一般方案進行：（i)DMF洗滌（3x1 min)， (ii)以DMF中之2% DBU，2%哌啶進行Fmoc去保護（15 min)，（iii)DMF 洗滌（6x1 min)，（iv)偶合 5 當量 Fmoc 胺基 酸：PyBOP : DMF 中 NMM(40-60 min)，（v)DMF 洗滌（3x1 128311.doc -141 - 200844110 min)。對於具有疏水性C端部分之Αβ(20-37)合成而言，採 用各胺基酸之雙偶合。於樹脂上使用D-( + )-生物素來進行 N端之生物素標記。合成完成後，在室溫下使用TFA、三 乙基矽烷及去離子水混合物（95:2.5:2.5，V/V/V)使肽自樹 脂裂解歷時3 h。合成肽係於例如ELISA中使用。 實例8 Αβ(21-37)之胺基酸定序 所鑑別（經分離之Αβ抗原決定基Αβ(4-10)及Αβ(21-37))或 使用（例如合成Αβ(2 1-37))之所有抗原決定基之序列測定係 藉由以下方式進行： a) Edman定序； b) ESI- Tandem MS/MS-定序，及 c) 藉助於IRMPD碎裂進行FTICR_MS分析及碎裂。 自動胺基酸序列分析係於與型號140C微梯度系統、 785A可程式化吸光率偵測器及610A資料分析系統連接之 Applied Bio systems 型號 494 Pro cise 定序器上進行。 所使用之所有溶劑及試劑具有最高分析級純度（Applied Biosystems)。所使用之定序法為脈衝式液體。將;東乾之樣 本溶解於10 pL 0.1% TFA中。為確保儘可能接近玻璃纖維 過濾器中心分布，以2 μι等分試樣施加樣本，每次施加後 在氬流下乾燥。
實例9 ELISA ELISA係用於測定： (a)自IVIgG分離之抗Αβ自體抗體混合物中之斑塊特異性 抗Αβ(4-10)抗體 128311.doc -142- 200844110 (b) 來自人類血清之抗Αβ自體抗體與Αβ(21-37)肽、 Αβ(12-40)肽及Αβ(1-40)肽的結合 (c) 自IVIgG分離及來自個別人類血清（AD血清及健康個 體血清）之抗Αβ自體抗體與Αβ( 1-40)肽的結合及與 Αβ(21-37)抗原決定基肽的結合 (d) 重組表現之Αβ(21-37)自體抗體（CSL純系7)與Αβ部分 序列的結合
Α· Αβ(4·10)抗體之ELISA 在此實驗中，抗體（使用Cys-Ap( 1-40)抗原管柱自IVIgG 分離之抗Αβ抗體）之標準稀釋液係與用作塗覆抗原之生物 素-G5AP(4-10)肽之12次連續稀釋液組合使用。在室溫下 將96孔ELISA培養盤以每孔150微升抗生蛋白鏈菌素溶液 (於PBS中之c = 5 pg/mL)塗覆2小時。以PBS-T(pH值=7.5之 PBS中0.05%吐溫-20 v/v)將孔洗滌四次後，添加每孔100微 升經生物素標記之抗原決定基肽（pH值=7.5之PBS中50 μΜ 至0.024 μΜ之12次連續稀釋液）且將其在室溫下培育2小 時。其後，將培養盤以每孔200微升之PBS-T洗滌四次，且 以PBS中5% BSA，0.05%吐溫-20(每孔200微升，在RT下培 育2 h)阻斷非特異性吸附位點。接著，向各孔中添加每孔 100微升自IVIgG分離之抗Αβ自體抗體（於PBS中5% BSA， 0.05%吐溫-20中製備之1:150稀釋液）。其後，將培養盤在 室溫下培育兩小時且隨後以PBS-T洗滌六次。向各孔中添 加100 pL於5% BSA，0.05%吐溫-20中稀釋5000倍之過氧 化酶山羊抗人類IgG且將培養盤在室溫下培育一小時，接 128311.doc -143 - 200844110 著將其以PBS-Τ洗滌三次且以pH值=5之0.05 Μ磷酸鈉-檸檬 酸鈉緩衝劑洗滌一次。添加1 00 μί於受質緩衝劑（磷酸鹽-檸檬酸鹽）中c=l mg/mL之鄰苯二胺二鹽酸鹽（OPD)，其中 每10 mL受質緩衝劑含有2 pL 30%過氧化氫。於Wallac 1420 ¥丨以(^2丑1^18八培養盤上量測45〇11111下之吸光率。 B.藉由間接ELISA測定人類血清中之抗體 在室溫下將96孔ELIS A培養盤以每孔100微升Αβί-40肽 (於pH值為7.5之PBS緩衝劑中，c = 2.5 pg/mL)塗覆2 h。其 後，將培養盤以每孔200微升之洗滌緩衝劑（PBS-T ;含有 0.05%吐溫-20之PBS)洗滌四次，且在室溫下以阻斷緩衝劑 (PBS中5%BSA，0·l%吐溫-20)P且斷2h。以PBS-T洗務兩 次後，添加最初以1:33.3稀釋之血清，接著將其以阻斷緩 衝劑連續稀釋3倍，且在室溫下培育2 h。接著，將培養盤 以PBS-T洗滌八次，且向培養盤中添加於阻斷緩衝劑中以 1 :5000稀釋之與辣根過氧化酶接合之山羊抗人類IgG，且 將其在RT下培育1 h。將培養盤以PBS-T洗滌四次，且以 pH值=5之0.05 Μ磷酸鈉-擰檬酸鈉緩衝劑洗滌兩次。添加 100 μί於受質緩衝劑（磷酸鹽-檸檬酸鹽）中c=l mg/mL之鄰 苯二胺二鹽酸鹽（OPD)，其中每10 mL受質緩衝劑含有2 μί 30°/。過氧化氫。於Wallac 1420 Victor2 ELISA培養盤上量 測450 nm下之吸光率。使用供校正之BSA參考曲線，使用 市售之蛋白質定量套組Pierce micro-BCA，以1 pg/μΐ儲備 溶液進行Αβ抗體定量。所獲得之結果係於圖8中說明。所 給定之百分比說明來自兩次獨立ELISA測定之IVIgG中Αβ 128311.doc -144- 200844110 抗體濃度。以Αβ(2 1-37)親和力層析獲得類似結果。相反 而言，以Αβ(4-10)肽之親和力層析不產生可偵測量之與N 端抗原決定基結合之多肽。因此，對於健康個體而言以 Αβ( 1-40)獲得之結果相當於以Αβ(2 1-37)獲得之彼等結果。 C·自IVIgG分離及來自個別人類血清之抗ΑΡ自體抗艘與 ΑβΙ-40肽的結合 在室溫下將96孔ELISΑ培養盤以每孔100微升AP1-40肽 (於pH值為7.5之PBS緩衝劑中c=2.5 pg/mL)塗覆2 h。其 後，將培養盤以每孔200微升之洗滌緩衝劑（PBS-T ;含有 0.05%吐溫-20之PBS)洗滌四次，且在室溫下以阻斷緩衝劑 (PBS中5% BSA)阻斷2 h。將培養盤以每孔2〇〇微升之PBS-丁洗滌兩次後，添加每孔100微升之一次抗體（自1VISG分離 或來自個別人類血清之多株抗Αβ自體抗體）（於阻斷緩衝劑 中製備之8次連續稀釋液，1:250至1:32000之稀釋液）且將 其在室溫下培育2 h。接著將培養盤以每孔200微升PBS-T 洗滌四次且添加於阻斷緩衝劑中稀釋2000倍之二級抗體 (HRP山羊抗人類IgG，c=l pg/pL)(每孔1〇〇微升，在室溫 下培育2 h)。將培養盤以每孔200微升PBS-T洗滌三次且以 每孔200微升pH值=5之擰檬酸鹽-磷酸鹽緩衝劑洗滌一次 後，添加100 μί於受質緩衝劑（填酸鹽-檸檬酸鹽）中c= 1 mg/mL之鄰苯二胺二鹽酸鹽（〇PD)，其中每10 mL受質緩衝 劑含有 2 μί 30%過氧化氫。於Wallac 1420 Victor2 ELISA 培養盤上量測450 nm下之吸光率。 D·重組表現之Αβ(21_37)自體抗體（CSL純系7)與Αβ部分序 128311.doc -145- 200844110 列的結合 藉由以下間接ELISA比較肽生物素-G5-AP( 1-40)、生物 素-G5-Ap(12-40)及生物素-G5-AP(4-10)與重組表現之 Αβ(21-3 7)自體抗體（CSL純系7)之結合：在室溫下將96孔 ELIS Α培養盤以每孔150微升抗生蛋白鏈菌素溶液（於pH值 為7.4之PBS中c=2.5 pg/mL)塗覆2小時。以每孔200微升 PBS-T(pH值=7.4之PBS中0.05%吐溫-20 v/v)將孔洗滌四次 後，添加每孔1 00微升經生物素標記之抗原決定基肽（pH值 = 7.5之PBS中1 μΜ)且將其在室溫下培育2小時。其後，將 培養盤以每孔200微升之PBS-T洗滌四次，且以PBS中5% BSA，0.1%吐溫-20(每孔200微升，在RT下隔夜）阻斷非特 異性吸附位點。接著將培養盤以每孔200微升之PBS_T洗滌 一次。接著，將於PBS中5% BSA，0.1%吐溫-20，1% DMSO中製備之CSL純系7之8次連續稀釋液添加至孔中。 其後，將培養盤在室溫下培育兩小時且隨後以PBS-T洗滌 六次。向各孔中添加100 μί於5% BS A，0.1 %吐溫-20中稀 釋5 000倍之過氧化酶山羊抗人類IgG且將培養盤在室溫下 培育一小時，接著將其以每孔200微升PBS-T洗滌三次且以 pH值=5之0.05 Μ磷酸鈉-檸檬酸鈉緩衝劑洗滌一次。添加 1 00 pL於受質緩衝劑（填酸鹽-檸檬酸鹽）中c=l mg/mL之鄰 苯二胺二鹽酸鹽（OPD)，其中每10 mL受質緩衝劑含有2 μί 3 0%過氧化氫。於Wallac 1420 Victor2 ELISΑ培養盤上量測 45 0 nm下之吸光率。以於缺少生物素標記肽之孔中培育之 抗體稀釋液來量測檢定之背景信號。 128311.doc -146- 200844110 重組表現之抗Αβ(2 1-3 7)自體抗體CSL純系7(參見實例5) 係如上所述，使用生物素45-Αβ(1-40)、生物素-G5-Ap(12-40)及生物素-G5-AP(4-10)來評估。圖39展示CSL純系7與 Αβ(1-40)及 Αβ(12-40)結合，但不與 Αβ(4-10)結合。 實例10由本發明抗體防止原纖維形成 將 1 mg Api-40(PSL Heidelberg)以 100 μΐ 三氟乙酸 0.1%(TFA)溶解於LoBind管（Eppendorf)中且在室溫下培育1 小時。將溶液以PBS稀釋至1 mM Αβ1-40。向100 μΐ Αβ纖 維形成樣本中添加抗體至1.3 μΜ之最終濃度。 檢查以下抗體： -如實例4所述親和力純化之IVIgG -重組抗體CSL純系7(如實例5所述） -抗體ACA(美國專利7，195,761 B2) -陰性對照CSL360(CSL360為嵌合抗體且當使用生物感應 器或ELIS A分析測試時不展示與Αβ( 1-40)結合）。 在37°C下於加熱塊上進行培育隔夜。製備pH值為9.2之 甘胺酸緩衝劑中2.5mM硫代黃素T(THT)溶液。將ΙΟΟμΙ Αβ纖維形成樣本轉移至黑色96孔培養盤（Greiner)中且添加 50 μΜ THT。24小時後，以 Tecan InfiniTE M200培養盤讀 取器量測樣本之螢光（激勵450 nm，發射490 nm)。一次量 測表示平均25次閃爍。 如圖40所示，所有經測試之Αβ抗體展示與陰性對照相比 約20%之原纖化抑制。 實例11來自AD患者與年齡匹配之健康對照者之血清結合 128311.doc -147- 200844110 檢定 A ·點潰墨法 將新鮮再懸浮於PBS緩衝劑中（樣本_oh)或進行寡聚（樣 本-15h)之Αβυ5^-及ApN4〇Cys-(兩種肽均在n端具有半胱胺 酸）之墨點施加於硝化纖維膜（每3微升〇·5微克點）。 將膜在室溫下以Roti-Block(Roth)阻斷1 h且接著在4°C 下，於20 ml阻斷試劑（RotiBlock)中與1〇 初級抗體 (6Ε10，Bam90.1，IVIG，CSL-7，ACA)、AD血清（AD1)及 來自健康人類個體之血清（K4) 一起培育隔夜。在室溫下完 成與二級抗體（抗人類HRP ·· 1:1〇〇,〇〇〇 ;抗小鼠hrp : 1:6,000)之培育1 h。根據製造商說明將sUperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Scientific/ Pierce)用作化學發光受質。記錄x線薄膜上之信號歷時1〇 s-5 min 〇 如圖41所示，所有對照抗體皆展示對預期抗原決定基之 f 特異性（6Ε1〇=Αβ(1-17)，Bam90· 1=Αβ(13-28))。經純化之 i . 、 抗體CSL純系7、抗Αβ(21-37)自體抗體（根據實例4純化）、 ACA(參見實例5)，以及來自ad血清及健康個體之抗體與 Αβυο募聚物結合（樣本i5h)。僅6E10及ad血清與Αβ 1·15 結合，但不與健康患者之對照血清結合。 又，CSL純系7及如實例4所述自IVIgG純化之Αβ(21-37) 自體抗體展現與凝集/募聚形式之Αβ(Αβ(1-40) 15h，與 Αβ 1-40 Oh相反）的優先結合。比較而言，對照抗體6E1〇、
Bam90.1及ACA不展示該優先性，而是等同地與兩種Αβ結 128311.doc -148- 200844110 合。 表1 :點潰墨法分析之概述資料 肽 6E10 Bam90.1 CSL-純 系7 親和力純化之 IVIgG ACA 血清 ADI 血清 K4 Αβ1-40，Oh ++ ++ (trace) - +++ - - Αβ 140，15h ++ ++ ++ + +++ ++ ++ Αβ 1-15，Oh ++ - - - - + - Αβ 卜 15，15h ++ - - - - + -
B ： ELISA 將來自血清樣本（AD 1及年齡匹配健康人類個體，參見 以上實例11A)之IgG在根據製造商說明於蛋白質G(Pierce) 上純化後裝載於Αβ(1-16)親和力管柱（根據實例1製備）上， 以PBS及pH值為6·8之10mM磷酸鈉洗滌且以pH值為2·8之 1 00 mM甘胺酸溶離。 如實例9D所述，將溶離物於經生物素-G5-AP(4-10)塗覆 之培養盤上以ELISA分析。 結果展示與對於來自年齡匹配之健康人類個體之對照樣 本所偵測的信號相比，AD患者血清中Αβ(4-10)抗體之力價 較高（參見圖42)。 結果表示早期實驗，該實驗暗示至少對於所測試之單一 AD1血清而言，存在Αβ(4-10)自體抗體，但其量低，具有 低親和力，或可能兩者皆有。若此等結果經驗證，則其表 明將需要超敏感檢定程序以允許程序變為常規。 實例12 ELISA、Biaeore及西方墨點法中重組表現之 Αβ(21_37)自體抗體之結合特徵 表2 : ELIS A及Biaeore中重組表現之Αβ(21-3 7)自體抗體之 128311.doc -149- 200844110 結合特徵 抗體 EIA BIACORE 西方墨點分析 ACA ++-H·- ++++ 與所有種類結合 53/60 ++++ ++++ 二聚體結合 53/60 ++++ ++++ 二聚體結合 50/60 + +++ nt 50/61 + ++ nt 50/62 •- nt 50/67 - - nt 50/68 懇盡麵義;::議麵 50/69 - NT nt 50/148 11:1111¾ + Sllglllfl 47/56 讎 • nt 51/60 ++++ +++ 二聚體結合 51/61 + + nt 51/62 - - nt 51/68 賺 + nt 51/148 + + nt 52/60 ++-H- ++++ 二聚體結合 52/148 + ++ nt 53/68 师 :¾¾¾ 1震1霞ll_議議 53/148 ++++ ++++ nt 54/60 IMgg :11¾¾ III圓 54/61 ++ ++ 二聚體結合 54/62 - - nt 54/67 讎議觀獨纖.麗 _画111:__画 nt 54/68 - - nt 54/69 - 未俘獲 nt 55/60 + ++ nt 55/61 -H-+ +++ 二聚體結合 55/62 - - nt 55/67 - 未俘獲 nt 55/68 - - nt 55/69 一 細 nt 55/148 + + nt 145/60 .-H-+++ . -H-++ nt 128311.doc -150- 200844110 145/61 痛 一 nt 145/62 111111111¾ nt 145/68 - - nt 145/148 |_||_:|園_議 nt 146/60 ++++ ++++ nt 146/61 ++ nt 146/62 + - nt 146/68 +/? nt 146/148 + +++ nt 54/148 ++ + nt +/- ELISA及生物感應器結合之定性評定，其中增加（+ ) 表示ELISA及生物感應器之結合力價增加，表示解 離速率或締合速率之改良，其暗示抗體具有相對較 南之親和力。 (-) 表示不與經固定之抗體結合
Nt 表示未經測試 於基於與澱粉樣蛋白β肽之結合之ELISA測試表現免疫 球蛋白之所有抗體。如下所述將生物感應器資料基於抗體 與cys二聚體肽之定性親和力結合評定分等級。 以較高量表現且於ELISA或Biacore或西方墨點法中展示 結合之抗體為本發明之較佳實施例。未能以較高量表現或 於下述任何檢定中不結合並不一定意謂若增進表現或採用 更敏感之偵測法此等抗體將不具有功能性。 A : AP肽製備 將經凍乾之1 mg Αβ蛋白片段1-40(Αβ(1-40))肽（Sigma)再 懸浮於 200 μΐ 1，1，1，3,3,3-六氟-2-丙醇（《^1?)(31§11^)中，至 1.5 ml Eppendorf管中製成等分試樣且凍乾隔夜。將製成等 分試樣之Αβ(1-40)肽以1 mg/ml以二甲亞砜（DMSO，ICN)再 128311.doc -151 - 200844110 懸浮且儲存在4 °C下。此物質稱作d夕/0草禮。 為使Αβ(1-40)狀券聚，將Αβ(1·40)單體於1 X pbs(137 mM NaCl，10 mM碟酸鹽，2·7 mM KC1)中稀釋至 〇 1 mg/ml，且在37°C下培育3至6天，且接著儲存在下，此 物質稱作Afi〇-40)寡聚物。 將具有N端半胱胺酸殘基之Αβ蛋白片段1_4〇肽（Αβ(1-40 Cys))自凍乾狀態以5.9 mg/ml再懸浮於ddH20中，且儲存 在-80°C下。接著將Αβ(1-40 Cys)肽於1 X PBS中稀釋至0.1 mg/ml，且儲存在4 °C下，此物質稱作募求 物。 B :抗β澱粉樣蛋白抗體ELISA方案 在4°C下，在Nunc Maxisorb 96孔培養盤上將Αβ(1-40)單 體、Αβ(1-40)募聚物、Αβ(1-40 Cys)募聚物及使用牛血清 白蛋白（Sigma)或抗蛋白酶（Sigma)之對照培養盤以1 pg/mi 固定於PBS(每孔50微升）中隔夜。將孔以350 μΐ洗滌緩衝劑 (1 X PBS，0·〇5%(ν/\〇吐溫-20(Sigma))洗滌一次。接著將 孔在室溫下以阻斷緩衝劑（PBS中2%(w/v)Difco脫脂牛奶 (BD)，每孔50_15 0微升）阻斷2小時且以350 μΐ洗滌緩衝劑 洗滌一次。 將初級抗體以於抗體緩衝劑（PBS中l%(w/v)牛血清白蛋 白（81811^)，0.05〇/〇吐溫-20(81£11^))中100 4§/1111之起始濃度 於V形底孔96孔培養盤（Nunc)中以1:2連續稀釋。 以1 pg/ml之起始濃度分析對照抗體（例如6E10 mAb(Sigma)及 ACA)。 128311.doc -152- 200844110 將100 μΐ初級抗體以連續稀釋轉移至Nunc Maxis〇rb培養 盤中且在室溫下培育2-3小時。將孔以350 μ1洗滌緩衝劑快 速洗滌三次。 添加:hi000於抗體緩衝劑（每孔5〇微升）中之二級抗體綿 羊抗人類IgG-HRP及綿羊抗小鼠IgG_HRp(Chemic〇n)，且 在室溫下培育30分鐘。 接著將孔以350 μΐ洗滌緩衝劑洗滌三次，且以τΜΒ受質 (Milhp0re，Australia)(每孔5〇微升）使培養盤顯影5分鐘。 以2 Μ磷酸（每孔25 μΐ)停止反應且於wallac Victor 2培養盤 讀取器中在450 nm下，〇· 1秒讀取培養盤。 C : Ap(l_40)舆重組表現之Ap(21_37)自體抗體之相互作用 的生物感應器分析 狀樣本製備： 用於對所俘獲單株抗體進行分析之肽製備係如以上” Αβ 肽製備”部分中所描述。 生物感應器免疫球蛋白俘獲表面製備： 使用人類抗體俘獲套組（Biacore，Sweden)根據製造商說 明以5 μΐ/min之流動速率製備抗人類免疫球蛋白生物感應 器晶片，其中在NHS/ECD固定期間具有6分鐘之接觸時 間。在所有通道上達成大約10000個共振單位。 俘獲條件： 所有抗體係以20 μΐ/min之流動速率俘獲（〇1 mg/ml BSA，Hepes緩衝生理食鹽水中25 (ttg/ml)歷時2 min。在所 有實驗中，流槽1用作使用人類IgGl對照抗體（Chemic〇n， 128311.doc -153- 200844110
Australia)之基線扣除對照通道。 使用其餘3個通道來俘獲對照抗體（aca)或人類單株抗 體以測試肽結合。接著以30 μΐ/min之流動速率 ，於所有通 道上同時分析與俘獲抗體之肽結合（6〇 μ1)，且使其解離 3 00-600秒，隨後根據說明書使用51^3]^]^化12注射液自 感應器表面解吸附。 使所有樣本冷卻，隨後在12艽下使用與生物感應器 2000(GE，Sweden)連接之Multitemp(GE，Sweden)分析。 對所有單株抗體進行第二次對照實驗，其中在抗體俘獲 後直接注射60 μΐ 〇·1 mg/mi BSA , ^[邛以緩衝生理食鹽水 之注射液以考慮人類單株抗體自經固定之俘獲抗體的解 離。將此結果自使用BIA評估軟體（GE，Sweden),使用肽 產生之資料手動扣除。 在所有實驗中，在0·1 mg/ml BSA，Hepes緩衝生理食鹽 水中20_50 pg/ml下分析-料募衮教。分析前，將 革嫂自100% DMSO中1 mg/mi儲備液稀釋至〇」 mg/ml BSA，Hepes緩衝生理食鹽水中1() μ§/πι1。 圖43至45展示此分析所獲得之結果。而aca對照抗體展 示與Αβ(1-40)單艟反Αβ(1_4〇 Cys)寡聚物之等两結合，多 數本發明抗體展示與dAa-# 募衮#之優先結合。 D:抗β澱粉樣蛋白抗體N-三羥甲基甘胺酸（Tricine)SDs_ PAGE及西方墨點法方案 將Novex預製10-20% N-三羥曱基甘胺酸凝膠1〇孔 (Invitrogen)以每孔 0·5 肽（20 μΐ 中）裝載（〇 5 叫 / 2〇 μ1=25 128311.doc -154- 200844110 pg/ml) ° 分子量標誌之製備：將20 μΐ 2X N-三羥甲基甘胺酸樣本 緩衝劑非還原（TSB-NR)(3 00 mM Tris_HC卜 pH值為 8.45， 24%甘油，8% SDS，0.005%庫馬斯藍G，0.005%酚紅）添 加至20 μΐ預染色標誌（Bio-Rad)中且每孔使用20 μΐ。 樣本之製備： 100 μΐ IX TSB-NR裝載樣本係如下製備： 肽：
儲備液 稀釋液 100 μΐ Αβ 1-40單體 1.0 mg/ml 1/40 2.5 μ1+47.5 μΐ ddH2O+50 μΐ 2Χ TSB-NR 25 μ1+25 μΐ ddH2O+50 μΐ 2Χ TSB-NR Αβ 1-40寡聚物 0.1 mg/ml 1/4 Αβ 1-40 Cys寡聚物 0.1 mg/ml 1/4 25 μ1+25 μΐ ddH2O+50 μΐ 2Χ TSB-NR 將各凝膠如下以1 0色帶格式安裝，使得各測試抗體兩側 為分子量標誌色帶及空白緩衝劑色帶。為簡單起見，對分 子量位置作標誌。 1) 預染色標誌 2) Αβ 1-40單體 3) Αβ 1-40募聚物 4) Αβ 1-40 Cys募聚物
5) 1X TSB-NR 6) 預染色標誌 7) Αβ 1-40單體 8) Αβ 1-40募聚物 9) Αβ 1-40 Cys寡聚物 128311.doc -155- 200844110
10) IX TSB-NR 將另一凝膠如上進行跑膠且藉由庫馬斯及深紫染色對蛋 白質進行染色。較低敏感性之庫馬斯展示肽主要為色帶2 及3中之單體及色帶4中之二聚體（或分別為圖47及48中標 記為1、2及3之色帶7、8及9)。較高敏感性深紫揭示各色 帶中之募聚物梯級，其與mab 6E1 0及AC A之染色圖案一 致。 N-三羥甲基甘胺酸凝膠係於具有含有N—三羥甲基甘胺酸 SDS電泳緩衝劑（0.1 M Tris鹼，〇·ι μ N_三羥甲基甘胺酸， 〇·1。/。SDS)之内及外緩衝劑腔室之XCell sureLock逑你槽 (Invitrogen)中跑膠。施加125 V歷時90分鐘來完成電泳分 離。 接者使用 XCell SureLock迷你槽（Invitrogen)中之 XCell II 潰墨模組（Invitrogen)，按照膜濾紙夾層（Invitrogen)將凝膠 轉移至硝化纖維。以冷卻之IX Tris-甘胺酸轉移緩衝劑（12 mM Tris鹼，96 mM甘胺酸，20%甲醇）填充内部XCell II潰 墨模組腔室，且以冷卻之蒸顧水填充外腔室。 藉由施加25 V歷時1 ·5小時來達成轉移且隨後將硝化纖 維膜在4°C下，於50 ml阻斷緩衝劑（pbs中2%(w/v)Difco脫 脂牛奶（BD)中阻斷隔夜。 將初級抗體、對照抗體6E1 0及ACA以於1 0 ml，1 % (w/v)PBS中之牛血清白蛋白（sigma)，0.05%吐溫-20 (Sigma)中0.5 pg/ml添加至膜中，且以10_2〇 pg/ml添加重 組Αβ(2 1-3 7)，且將其在震盪下培育2-3小時。將膜以50 ml 128311.doc -156- 200844110 洗滌緩衝劑（IX PBS，0·05%(ν/ν)吐溫-20(Sigma))洗滌3次 歷時10分鐘。以於10 ml緩衝劑（如上）中〇·5 pg/mi添加二級 抗體，綿羊抗人類IgG-HRP及綿羊抗小鼠IgG_ HRP(Chemic〇n)，且將其與膜一起在震盪下培育3〇分鐘。 將膜以50 ml洗滌緩衝劑洗滌3次歷時丨〇分鐘且隨後於
Amersham Hyperfilm ECL(GE Lifesciences)上，以 Ecl
Plus(Perkin-Elmer)顯影。 圖48 ··當使用以上方案信號在偵測臨限以下時，將獏以 洗滌緩衝劑洗滌3次且接著另外在RT下以生物素標記之抗 人類 IgGl(Sigma 純系 8c/6-39，1:2〇〇〇)探測 3〇_6〇 分鐘。2 著將膜如上洗滌。#著添加抗生蛋白鏈菌素過氧化酶 (1:4_，Chemicon)歷時30分鐘且再次洗務膜。此額外步驟 擴增信號且產生使用如上所述之咖受㈣測。圖Μ中使 用經擴增之偵測系統。 / 不將如以西方墨點分析所探測之相當凝膠轉移至硝化纖 維。將一半根據製造商說明以庫馬斯藍(Novex :二=使另一半根據製造商說明進行深紫高蛋 白敏感性染色（GE，Sweden)。 實例I3斑塊沈積（Taconic小鼠） 斑塊評估 材料： 片安置於來自Mentzei 免疫染色（參見方案：
Glas之顯 免疫組織 將3 μηι厚之鼠腦組織切 微鏡載片上且以6F3D抗體 化學）。 128311.doc -157- 200844110 透射光顯微鏡：Eclipse 80i，含有Plan Apochromat物 鏡，2x-4〇x放大倍率；Nikon Instruments Europe，Nikon GmbH, Duesseldorf，Germany 成像軟體：NIS-Elements BR軟體 2.3 版，Nikon ; Nikon Instruments Europe，Nikon GmbH，Duesseldorf，Germany 數位視鏡 ：2Megapixel數位相機，Nikon(Nikon Instruments Europe，Nikon GmbH，Duesseldorf，Germany) o Excel 軟體（Microsoft Office 2003，Microsoft Corp. Redmont，USA·) 方法： 使用上述相機以4〇x放大倍率拍攝數位RGB照片。藉由 記錄定義強度臨限、最小及最大直徑之每一步驟，排除 (例如）脈管中間有孔洞之目標物"）以確保每一分析之參 數相等來建立宏。藉由應用量測框來界定所關注之區域。 在此區域内，使用上述標準來鑑別擬合於宏所提供之方案 内之’’目標物像素叢集）。由用於扣除背景之軟體建立二 元圖片。每個位置分析五個獨立場（獨立評估皮質及海馬 形成）。由軟體匯總五個分析值資料且提供小統計分析， 如每量測面積之斑塊數目，斑塊面積份額及量測面積百分 比。將每一目標物之詳細資料輸入excel檔案以供進一步分 析0 場數目 1 目標物數目 7 每場之目標物 7 量測面積 33152,5[μηι*μιη] 128311.doc -158- 200844110 面積分數 0,000211146/[μηι*μιη] 0,152147 特徵 平均值 標準偏差 最小值 最大值 面積 720,58 1438,5 0,072697 4222,5 Eq直徑 19,112 23,499 0?3〇424 73,323 周長 106,58 169,48 0,94227 514,37 寬度 7,5773 5,9398 0,20097 17,626 圓 0,70335 0,24485 0920〇55 1 量測面積 33152 0 33152 33152 特別重要者為’’面積分數ff，因為其等於斑塊面積（作標誌 面積）佔量測面積（總面積）之百分比。 所量測之特徵： 面積 面積為主要尺寸標準。在未經校正之系統中，其表示像 素數目；在經校正系統中，其表現真實面積（以μηι2給 出）。 面積分數 面積分數為分區段影像面積與量測面積之比率（定義 為：所選擇之場之平方單位）。 面積分數=面積/量測面積 圓度 僅有圓之圓度等於’’ Γ’ ；所有其他形狀係以小於’’ Γ’之圓 度值表徵。其為導出形狀量度，係由面積及周長計算。此 特徵適用於檢查形狀特徵。 圓度=4* 7Γ *面積/周長2
Eq直徑 當量直徑（Eq直徑）為源自面積之尺寸特徵。其測定與所 量測目標物具有相同面積之圓之直徑。 128311.doc -159- 200844110
Eq直徑=V(4*面積/π) 每面積之目標物 每平方單位所選場（量測面積）中之目標物數目 周長 内邊界（若目標物 ，由 0 、 45 、 90及 周長為總邊界量度。其包括外邊界及 内存在孔洞）。周長係使用Crofton氏公式 1 3 5度方向上之四個投影計算。
周長=7u*(Pr〇+pr45+pr9〇+pri35)/4 寬度 寬度為適用於狹長或較薄結構之導出特徵。其係基於桿 模型且係根據下式計算： 寬度=面積/長度 【圖式簡單說明】 圓1 :用於質譜抗原決定基鑑別之抗原決定基切除及抗 原决疋基萃取之原則。具有原生二硫鍵結之抗體免疫球蛋 白一般對内切蛋白酶（例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 AspN-蛋白酶）之蛋白水解消化具有高度抗性，且包含抗原 決定基-互補位相互作用結構之抗原多肽之抗原決定基區 域一般％保濩而免於免疫複合物中之蛋白水解降解，而游 離未結合區易進行消化。因此，接著在蛋白水解移除且沖 洗去未結合結構後仍與抗體結合之抗原決定基序列自抗體 解離且藉由質譜法鑑別。已發現電喷霧離子化（ESI)及基質 輔助雷射脫附離子化（MALDI)為適用之質譜法，且已成功 地應用於抗原決定基鑑別。”TFA，，意謂三氟乙酸。 128311.doc -160- 200844110 ’’MALDI-MS1’代表基質輔助雷射脫附離子化質譜法。 圓2 :游離可溶Αβ肽之蛋白水解肽片段之質譜鑑別。在 不藉由抗體結合複合下，由胰蛋白酶消化Αβ(1-40)引起形 成根據蛋白水解裂解特異性所預期之所有肽片段（八0(1- 5)、Αβ(6-16)、Αβ(17-28)、Αβ(17-40)、Αβ(1-16))。質譜 分析係藉由高解析度MALDI-傅立葉轉換-離子回旋加速器 共振（MALDI-Fouriertransform-ion cyclotron resonance) (MALDI-FTICR-MS)來進行，該 MALDI-FTICR-MS提供約 100,000質量解析度下離子完全同位素解析及通常卜5 ppm 之質量測定精確度的譜。所有FTICR-MS譜係由裝備有 Apollo II電噴霧/奈米電喷霧多埠離子來源及具有脈衝式碰 撞氣體之外部Scout 100全自動χ_γ靶階段MALDI來源的 Bruker(Bruker Daltonik, Bremen, Germany)Apex II 7T FT-ICR質譜儀獲得。脈衝式氮雷射係在337 nm下操作。由雷 射發射所產生之離子在15 V下於六極器中積聚0.5-1 sec， 且在-7 V下萃取至分析器單元中。將2,5-二羥基苯曱酸 (DHB，Aldrich，Germany)於乙猜：水中ο」。/。tfA(2:1)中 之100 mg/ml溶液用作基質。將〇,5 μ1樣本溶液於不鏽鋼 MALDI樣本靶上混合且使其乾燥。典型ESI條件為約2 kV 針電壓及100 nA喷霧電流。使離子於六極器中積聚2 sec且 接著將其轉移至圓柱體ICR單元中。’’ppm”代表每百萬份中 之份數。"m/zn表示質荷比。 圖3 :藉由MALDI-FTICR-MS之澱粉樣蛋白斑塊特異性 抗體之抗原決定基鑑別：由在以Αβ(1-42)或Αβ(1-42)所衍 128311.doc -161 - 200844110 生之凝集體使轉殖基因小鼠主動免疫後產生之斑塊特異性 抗體辨識的N端Αβ抗原抗定基之質譜鑑別。將經固定，純 化之抗體與Αβ(1-40)、Αβ(1_42) 一起培育且免疫複合物經 受由蛋白酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu_c蛋白酶及 Asp-N-蛋白酶之抗原決定基切除。左側譜展示胰蛋白酶消 化後仍保持結合之片段Αβ(1_16)，右側譜展示使用 蛋白酶抗原決定基切除後之Αβ(1_η)。所展示序列中 展示之黑色小箭頭表示藉由抗原決定基切除所鑑別之裂 解，灰色粗箭頭表示Αβ上發現於抗體結合後經遮蔽之基質 裂解位點。相同Αβ(4-10)抗原決定基序列係以作為抗原結 合之可溶Αβ斑塊及基原纖維鑑別且係來自小鼠抗Αρ(丨_丨6) 月太單株抗體（Bachem_Peninsula Laboratories, San Francisco)。 圓4 :如實例4所述，在存在或不存在抗Αβ(21_37)自體 抗體下Αβ募聚物對人類神經母細胞瘤細胞（SH_Sy5y)之毒 性。0D :光學密度。 圓5 ··如實例1所述，藉由Αβ( 12-40)抗原決定基特異性 親和力層析法分離之多株血清抗Αβ(2 1-3 7)自體抗體自AD 患者（AD77)之ID-凝膠電泳分離。KDa :以千道爾頓計之 分子量。IgG :免疫球蛋白G。DTT :二硫蘇糖醇。 圓6 :藉由抗原決定基切除質譜法鑑別Αβ(21-37)作為由 人類抗Αβ(2 1-37)自體抗體辨識之抗原決定基。上圖展示 Αβ(1-40)序列，其中以黑色箭頭表示不同蛋白酶之裂解。 在使用鏈黴蛋白酶進行抗原決定基切除後鑑別以Αβ序列上 128311.doc -162- 200844110 方之實心黑色箭頭表示之肽片段；藉由使用胰蛋白酶及 Glu-C-蛋白酶（R5、Ell、K16)進行抗原決定基切除發現以 Αβ序列下之黑色虛線箭頭表示之肽片段；注意Ag_5在具 有斑塊特異性抗體之免疫複合物中經完全遮蔽，而在具有 抗Αβ(2 1-3 7)自體抗體之免疫複合物中完全裂解。發現於 游離Αβ中所觀測到之以折斷箭頭表示的裂解位置在抗 Αβ(21-37)自體抗體結合後經遮蔽（Glu_c ·· Ε22、;胰 f %
蛋白酶：K28)。此處展示經鏈黴蛋白酶部分消化小時） 後之MALDI-MS分析以供說明。 圓7:自藉由Αβ(4-1〇)抗原決定基特異性層析法分離之 阿茲海默患者血清Αβ自體抗體分離辨識^^端Αρ(4_丨〇)抗原 決定基之”斑塊特異性”抗體。IgG代表免疫球蛋白G。AD 表示阿茲海默氏症。親和力管柱：G5Ap(4_1〇)。KDa :以 千道爾頓計之分子量。 圖8:辨識Αβ(4-1〇)抗原決定基之斑塊特異性、斑塊分 解Αβ抗體及辨識Αβ(21-37)羧基端抗原決定基之抗八卩(21_ 3 7)自體抗體的分子辨識機制。 圖9 : Αβ(12-40)抗原決定基特異性親和力管柱之結構及 用於分離抗^(2^7)自體抗體之實驗程序。Cys_Ap(i2_ 40):與半胱胺酸偶合之Αβ(ΐ2-40)肽。 圖10:用於親和力分離之抗Αβ(21_37)自體抗體之序列 測定的分析流程及實驗⑽：N_^^f ; Μ 區序列之2D-電泳分離、凝膠内蛋白水解消化及高解析度 FTICR-MS鑑別；肽片段之蛋白水解消化及ΗΗχ分離，隨 128311.doc -163 - 200844110 後a)Edman序列測定；b)LC-MS/MS序列測定；c)恆定區部 分序列之MALDI-TOFMS鑑別；恆定/可變部分序列之 MALDI-FTICR-MS鑑另》J。 圖11 :用於指定血清IVIgG抗Αβ(21-37)自體抗體之重鏈 與輕鏈序列對之實驗程序的分析流程。 圖12 :自IVIgG分離之多株抗Αβ(21-37)自體抗體之2維 SDS凝膠電泳分離；關於Αβ抗體同功異型物之鑑別及序列 測定參見圖22 (a-c)。DTT :二硫蘇糖醇。CHAPS : 3-[(3· 膽醯胺基丙基）-二甲基-銨基]-1-丙烷磺酸酯。 圖13 :血清IVIgG抗Αβ(21-37)自體抗體之重鏈與輕鏈之 1D-SDS-PAGE 分離。a)還原（lOOOOxDTT) ; b)烷基化（3χ 蛾 乙醯胺/ DTT)。LMW :低分子量蛋白質標準。 圖14 :經HPLC分離之抗Αβ(21-3 7)自體抗體重鏈與輕鏈 的1D-凝膠電泳分離以供Edman序列測定。LMW :低分子 量蛋白質標準。 圖15 : PVDF膜上血清IVIgG抗Αβ(21-37)自體抗體重鏈 及輕鏈之1D-凝膠電泳分離及潰墨以供Edman序列測定。 圓16 :重鏈胰蛋白酶肽之HPLC分離。對經分離之肽溶 離份進行a)Edman序列分析，b)LC-MS/MS序列測定，c)直 接 MALDI-TOF-MS及 c^MALDI-FTICR-MS 分析。 圖17 :輕鏈胰蛋白酶肽之HPLC分離。對經分離之肽溶 離份進行a)Edman序列分析，b)LC-MS/MS序列測定，c)直 接 MALDI-TOF-MS及 d)及 MALDI-FTICR-MS 分析。 圖18(a-d) ··經HPLC分離之重鏈胰蛋白酶肽、血清_ 128311.doc -164- 200844110 IVIG_G1_HC(1)_1 c(348-359 ; EPQVYTLPPSR)之 Edman序 列測定。18a ··標準。18b :殘基1。18c :殘基9。18d :殘 基11。 圓19(a-c):重鏈胰蛋白酶HPLC肽、溶離份27 (a)及 HPLC溶離份39、重鏈CDR1肽v (20-30)之LC-MS/MS序列 測定。圖19a展示總離子色譜，且以紅色環繞1.3-2·1 min 溶離時間分離之肽溶離份。（b)於1.3-2.1 min分離之肽溶離 份之ESI-質譜；（c)所選擇之帶雙電荷前驅物離子之MS/MS 碎片離子分析，m/z 482.2。 圖20(a，b):胰蛋白酶HPLC肽之MALDI-TOF-MS鑑 別。a)胰蛋白酶肽，溶離份50，重鏈（138-151)之鑑別，莫 耳質量1423 ; b)溶離份75中分離之肽，重鏈（3 75-396)之鑑 別，莫耳質量2544 Da。 圓21(a-c):來自HPLC溶離份47、66及96之重鏈恆定區 胰蛋白酶肽之MALDI-FTICR-質譜鑑別。（a)溶離份47中分 離之3種肽（於分子離子峰上表示），（349-3 59)、（349-3 64)、（137-1 51))的鑑別；（b)溶離份66中之2種肽，（260-278)及（279-292)的鑑別；（c)溶離份96中之肽（306-321)的鑑 別。 圖22(a-c) ··如圖12所說明，自進行凝膠内胰蛋白酶消化 之2D-凝膠帶分離之包含血清IVIgGl重鏈恆定區的序列之 MALDI-FT-ICR鑑別；點4重鏈（22a)、點12重鏈（22b)及點 13重鏈（22c)。序列測定係使用NCBI資料庫以5-10 ppm之 質量精確性臨限進行。 128311.doc -165- 200844110 圖23a至c :給出關於經鑑別且定序之對Αβ肽之C端部分 具特異性，尤其對Αβ(2 1-37)具特異性的抗體之概述之 表。該表提供抗體鏈樣本之名稱、樣本來源、經定序之免 疫球蛋白鏈之類型、經驗證之輕鏈與重鏈之相互作用（表 示連接形式之搭配物鏈的名稱）以及個別免疫球蛋白鏈之 確證同功異型物，及對於CDR1、CDR2及CDR3鑑別之 CDR序列類型。圖 23a : IVIG_(l)_Af ; IVIG—(2)—Β，； IVIG—(3) ; IVIG」4)—A ； IVIG」5)—B ； IVIG 一 (6); IVIG—(7) ; IVIG_(8);血清—(9);血清—（10);血清—（11); 圖 23b : IVIG_(12) ; IVIG_(13) ; IVIG_(14) ; IVIG_(15); IVIGJ16) ; IVIG_(17) ; IVIG—(18) ; IVIGJ19); IVIG一(20) ; IVIG一(21)。圖 23c :血清—(22);血清 _(23); 血清 _(24);血清 __(25)。 囷24a至q :表示所有經定序抗體鏈之經鑑別之CDR類型 及對應一致序列的表。CDR編號與圖23中所使用之CDR編 號相對應。圖24a :重鏈CDR ;圖24b :輕鏈（λ鏈以及κ 鏈）CDR;圖24c:重鏈CDR1之CDR—致序歹J ;圖24d:重 鏈CDR2之CDR—致序列；圖24e··重鏈CDR3之CDR—致序 列；圖24f : κ輕鏈CDR1之CDR—致序歹ij ;圖24g : κ輕鏈 CDR2之CDR—致序歹ij ;圖24h : κ輕鏈CDR3之CDR—致序 列；圖24i :重鏈CDR1之較佳一致序列；圖24j :重鏈 CDR1之更佳一致序列；圖24k:重鏈CDR1之更佳一致序 列。圖241 :重鏈CDR2之較佳一致序列；圖24m :重鏈 CDR2之更佳一致序列；圖24η:重鏈CDR2之更佳一致序 128311.doc -166- 200844110 列；圖24〇 :重鏈CDR3之較佳一致序列；圖24p :重鏈 CDR3之更佳一致序列；圖24q:重鏈CDR3之更佳一致序 列。 圖25a至1 :來自血清IVIgG之抗Αβ(21·37)自體抗體及個 別血清抗Αβ(21-3 7)自體抗體之輕鏈可變區序列的胺基酸 序列（關於序列概述，參見圖23)。所採用之定序法之代碼 (Edman ; Edman-蛋白 Ν 端；MALDI-TOF-MS ; MALDI-FTICR-MS ; LC-MS/MS)及CDR序歹之註解係於各序歹U底 部指出。CDR係以方框表示。 圖25a :樣本IVIG_(1)_A’之輕鏈κ可變區之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 47)。 圖25b :樣本IVIG_(2)_B’之輕鏈κ可變區之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 48)。 圖25c :樣本IVIG_(3)之輕鏈λ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 49)。 圖25d :樣本IVIG」6)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 50)。 圖25e :樣本IVIG」7)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 51)。 圖25f :樣本IVIG_(8)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 52)。 圖25g :樣本血清_(9)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 53)。 圖25h :樣本血清_(10)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列 128311.doc -167- 200844110 (SEQ ID NO: 54)。 圖25i :樣本血清_(11)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 55)。 圖25j ··樣本血清_(9)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 145)。 圖25k :樣本血清_(9)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 146)。 圖251 :樣本血清_(9)之輕鏈κ可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 147)。 囷26a至q :來自血清IVIgG之抗Αβ(21-37)自體抗體及個 別血清抗Αβ(2 1-37)自體抗體之重鏈可變區序列的胺基酸 序列（關於序列概述，參見圖23)。所採用之定序法之代碼 (Edman ; Edman-蛋白 Ν 端；MALDI-TOF-MS ; MALDI-FTICR-MS ; LC-MS/MS)及CDR序歹U之註解係於各序歹底 部指出。CDR係以方框表示。 圖26a :樣本IVIG_(4)_A之重鏈可變區之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 56)。 圖26b :樣本IVIG_(5)_B之重鏈可變區之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 57)。 圖26c :樣本IVIG」12)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 58)。 圖26d :樣本IVIG(13)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 59)。
圖26e :樣本IVIG—(14)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ 128311.doc -168- 200844110 ID NO: 60)。 圖26f :樣本IVIG_(15)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 61)。 圖26g :樣本IVIG_(16)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 62)。 圖26h :樣本IVIG_(17)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 63)。 圖26i :樣本IVIG—(18)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ 气 ID NO: 64)。 圖26j :樣本IVIG_(19)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ . ID NO: 65)。 圖26k :樣本IVIG—(20)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 66)。 圖261 ·•樣本IVIG_(21)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 67)。
圖26m :樣本血清_(22)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ί 、 ID NO: 68)。 圖26η :樣本血清—(23)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 69)。 圖26〇 :樣本血清_(24)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 70)。 圖26p :樣本血清—(25)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ ID NO: 71)。
圖26q :樣本IVIG—(14)之重鏈可變區之胺基酸序列（SEQ 128311.doc -169- 200844110 ID NO: 148)。 囷27a至c :抗Αβ(2 1-3 7)自體抗體鏈之κ及λ輕鏈恆定區 之胺基酸序列。V192L處之LC-κ-恆定區序列突變係以粗體 字表示。 圖27a :同功異型物1之恆定區輕鏈κ之完全胺基酸序列 (SEQ ID NO: 72)。 圖27b:同功異型物2之恆定區輕鏈κ之完全胺基酸序列 (SEQ ID NO: 73)。 圖27c :恆定區輕鏈λ之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 74)。 圖28a至c :所鑑別之IVIgG抗Αβ(21-3 7)自體抗體重鏈之 恆定區的胺基酸序列及序列同功異型物。於F300Y、 Ν301Α(Ν-糖基化位點）、F304Y、G331A、D360E、 L362M、S368T及V401M處鑑別之胺基酸突變係以粗體字 表示。N-30 Ist處之Ν-糖基化一致序列及位點係以帶陰影 方框及粗體灰色字來表示。 圖28a :同功異型物1之恆定區重鏈之完全胺基酸序列 (SEQ ID NO: 75)。 圖28b :同功異型物2之恆定區重鏈之完全胺基酸序列 (SEQ ID NO· 76)。 圖28c :同功異型物3之恆定區重鏈之完全胺基酸序列 (SEQ ID NO: 77)。 圖29a至p :來自血清IVIgG及個別血清之抗Αβ(21-37)自 體抗體輕鏈之完全胺基酸序列（關於樣本概述參見圖23)。 128311.doc -170· 200844110 所採用之定序法之代碼（Edman ; Edman-蛋白N端； MALDI-TOF-MS ; MALDI-FTICR-MS ; LC-MS/MS)及 CDR 序列之註解係於各序列底部指出。CDR係以方框表示。發 現具有單一位點突變之恆定區序列中可變序列域及單一胺 基酸殘基係以粗體字表示。 圖29a :樣本IVIG—(1)_A’，恆定區同功異型物1之輕鏈κ 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 78)。 圖29b ··樣本IVIG—(1)_A’，恆定區同功異型物2之輕鏈κ 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 79)。 圖29c :樣本IVIG_(2)_B’，恆定區同功異型物1之輕鏈κ 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 80)。 圖29d :樣本IVIG」2)_B’，恆定區同功異型物2之輕鏈κ 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 81)。 圖29e :樣本IVIG_(3)之輕鏈λ之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 82)。 圖29f :樣本IVIG_(6)，恆定區同功異型物1之輕鏈κ之完 全胺基酸序列（SEQ ID NO: 83)。 圖29g :樣本IVIG—(6)，恆定區同功異型物2之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 84)。 圖29h :樣本IVIG_(7)，恆定區同功異型物1之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 85)。 圖29i :樣本IVIG_(7)，恆定區同功異型物2之輕鏈κ之完 全胺基酸序列（SEQ ID NO: 86)。 圖29j :樣本IVIG_(8)，恆定區同功異型物1之輕鏈κ之完 128311.doc -171 - 200844110 全胺基酸序列（SEQ ID NO·· 87)。 圖29k :樣本IVIG—(8)，恆定區同功異型物2之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 88)。 圖291 :樣本血清_(9)，恆定區同功異型物1之輕鏈κ之完 全胺基酸序列（SEQ ID NO: 89)。 圖29m ··樣本血清_(9)，恒定區同功異型物2之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 90)。 圖29η :樣本血·清—（1 0)，怪定區同功異型物1之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 91)。 圖29〇 :樣本血清_(11)，恆定區同功異型物1之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 92)。 圖29p :樣本血清_(11)，恆定區同功異型物2之輕鏈κ之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 93)。 圖30-1至30-44 :來自血清IVIgG及個別血清之抗Αβ(21-3 7)自體抗體重鏈之完全胺基酸序列（關於樣本概述參見圖 23)。所採用之定序法之代碼（Edman ; Edman-蛋白Ν端； MALDI-TOF-MS ; MALDI-FTICR-MS ; LC-MS/MS)及 CDR 序列之註解係於各序列底部指出。CDR係以方框表示。發 現具有單一位點突變之恆定區序列中可變序列域及單一胺 基酸殘基係以粗體字表示。N-糖基化位點，N-301係以粗 體灰色字表示。 圖30-1 :樣本IVIG—(4)_A，恆定區同功異型物1之重鏈 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 94)。 圖30-2 :樣本IVIG_(4)_A，恆定區同功異型物2之重鏈 128311.doc -172- 200844110 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 95)。 圖30-3 :樣本IVIG__(4)_A，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 96)。 圖30-4 :樣本IVIG—(5)_B，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 97)。 圖30-5 :樣本IVIG」5)_B，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 98)。 圖30-6 :樣本IVIG一（5)_B，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 99)。 圖3 0-7 :樣本IVIG_(12)_B，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 100)。 圖30-8 :樣本IVIG_(12)JB，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 101)。 圖30-9 :樣本IVIG_(12)_B，恆定區 之完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 102)。 圖30-10 :樣本iviG jl3)，恆定區同 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 103)。 圖3 0-11 :樣本IVIG一（13)，恆定區同 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 104)。 圖30-12 :樣本IVIG—(13)，恆定區同 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 105)。 圖3 0-13 :樣本IVIG jl4)，恆定區同 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 106)。 圖3 0-14 :樣本IVIG jl4)，恆定區同 128311.doc @功異型物3之重鏈 同功異型物1之重鏈 同功異型物2之重鏈 同功異型物3之重鏈 同功異型物1之重鏈 同功異型物2之重鏈 同功異型物3之重鏈 功異型物1之重鏈之 功異型物2之重鏈之 功異型物3之重鏈之 功異型物1之重鏈之 功異型物2之重鍵之 -173- 200844110 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 107)。 圖3〇-15 :樣本IVIG」14)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 108)。 圖30-16 :樣本iVIG—(15)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 109)。 圖3 0-17 :樣本IVIG」15)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 110)。 圖30」8 ·•樣本IVIG—(15)，恆定區 % 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 111)。 圖3(M9 :樣本IVIG—(16)，恆定區 • 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 112)。 圖30-20 :樣本IVIG_(16)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 113)。 圖3〇-21 :樣本iVIG_(16)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 114)。 圖3〇·22 :樣本IVIG_(17)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 115)。 圖3〇-23 :樣本IVIG一（17)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 116)。 圖3 0-24 :樣本IVIGj17)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 117)。 圖3〇-25 :樣本IVIG_(18)，恆定區 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 118)。 圖3〇-26 :樣本IVIG-(18)，恆定區 128311.doc 同功異型物3之重鏈之 同功異型物1之重鏈之 同功異型物2之重鏈之 同功異型物3之重鏈之 同功異型物1之重鏈之 同功異型物2之重鏈之 同功異型物3之重鏈之 同功異型物1之重鏈之 同功異型物2之重鏈之 同功異型物3之重鏈之 同功異型物1之重鏈之 同功異型物2之重鏈之 -174- 200844110 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 119)。 圖30-27 :樣本iViG_(i8)，恆定區同功異型物3之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 120)。 圖30-28 :樣本iVIG一（19)，恆定區同功異型物重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 121)。 圖30-29 :樣本lVIG—(19)，恆定區同功異型物2之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 122)。 圖30-30 :樣本IVIG—(19)，恆定區同功異型物3之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 123)。 圖30-31 :樣本iVIG 一 (20)，恆定區同功異型物重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 124)。 圖30-32 :樣本lVIG—(20)，恆定區同功異型物2之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 125)。 圖30-33 :樣本iViG」20)，恆定區同功異型物3之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 126)。 圖30-34 :樣本IVIG 一 (21)，恆定區同功異型物重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 127)。 圖30_35 :樣本lVIG」21)，恆定區同功異型物2之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 128)。 圖30-36:樣本IVIG—(21)，恆定區同功異型物3之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 129)。 圖30-37 :樣本血清-(22)，恆定區同功異型物}之重鏈之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 130)。 圖3 0-38 :樣本血清一(22)，恆定區同功異型物2之重鏈之 128311.doc -175- 200844110 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 131)。 圖3 0-39 :樣本jk清—(23) ’怪定區同功異型物^之重鍵之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 132)。 圖30-40:樣本血清一(23)，怪定區同功異型物2之重鍵之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 133)。 圖3 0-41 ··樣本jk清—(24)，恆定區同功異型物1之重鍵之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 134)。 圖30-42 :樣本血清-(24)，恆定區同功異型物3之重鍵之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 13 5)。 圖30-43 :樣本血清—(24)，恆定區同功異型物重鍵之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 136)。 圖30-44 :樣本血清—(24)，恆定區同功異型物3之重鍵之 完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 137)。 圊31 :說明本發明之經定序抗體之κ輕鏈n端保守性質的 表。表示6種類型之由18個胺基酸殘基組成之n端序列，其 係於本發明抗體之κ輕鏈序列中鑑別。 圓 32a 及 b ·· HC-LC-κ 及 HC-LC-λ 連接之抗 Αβ(21-37)自體 抗體之内二硫鍵及間二硫鍵的機制。HC内二硫鍵為〇21-C96、C148-C204、C265-C325、C371-C429 ; LC-κ-内二硫 鍵為 C23-C89、C135-C195 ; LC-λ-内二硫鍵為 C22-C92、 C142-C201 ; HC-HC 間二硫鍵為 C230-C230、C233-C33 ; HC-LC-κ-間二硫鍵及HC-LC-λ-間二硫鍵分別為C224-C215 及 C224-C219。32a ： IVIgG 一 LC( 1) 一HC( 1) ； 32b ： IVIG—HC(1)一ΙΧλ(3)。 128311.doc -176- 200844110 囷33 ··展示重組抗Αβ(21-3 7)自體抗體CSL-純系7使如實 例6所述寡聚形式之Αβ 1 -40免疫沈澱之西方墨點法。使用 抗體 Bam 90.1(Sigma Aldrich 目錄號 Α8978 ,與 Αβ(13-28)結 合）來偵測免疫沈澱之Αβ。 圓34a : Αβ自體抗體之抗原決定基辨識特異性之分子確 證。說明 3 個合成 Αβ 多肽 Αβ(4-10)、Αβ(20-30)及 Αβ(20-37) 對藉由MALDI質譜法自健康（非AD對照個體）供體（Α及Β) 之血清分離之抗Αβ-自體抗體的親和力。如實例2Α(Αβ 12-40)中所述，將經親和力純化之抗體固定於NHS-瓊脂糖 上。質譜分析（肽混合物之MALDI_MS，上方）後將等莫耳 混合物（合成Αβ肽於pH值為7之PBS緩衝水溶液中之5 μιηοΐ 混合物）與抗體結合。洗滌溶離份之上清液之MALDI-MS揭 示Ν端Αβ(4-10)抗原決定基信號為主要離子（確證缺少Ν端 Αβ結合，中間），且繼續洗滌直至無法偵測到MS信號。以 0.1%三氟乙酸溶離後，鑑別Αβ(20-37)肽為能夠與自體抗 體結合之唯一多肽（下方）。所有MS測定均係以Bruker BilflexMALDI-TOF質譜儀進行。 圖34b :展示Αβ自體抗體之抗原決定基特異性之質譜 圖。將根據實例2Α自IVIgG純化之經固定Αβ(21-37)自體抗 體與合成Αβ(12-40)多肽一起培育。如上經由MS分析溶離 概況。資料展示Αβ(21-3 7)自體抗體與Αβ( 12-40)多肽特異 性結合。 圖34c :展示Αβ自體抗體之抗原決定基特異性之質譜 圖。將自IVIgG純化之經固定Αβ(21-37)自體抗體與合成Αβ 128311.doc -177- 200844110 多肽 Αβ(25-3 5)、Αβ(17-28)及 Αβ(31-40)—起培育。資料展 示Αβ(2 1-37)自體抗體不與Αβ部分多肽結合。 圖34d至341 :展示Αβ自體抗體之抗原決定基特異性之質 譜圖。將自IVIgG純化之經固定Αβ(21_37)自體抗體及固定 抗體ACA(參見實例5)與合成多肽Αβ(4-10)、Αβ(17-28)、 Αβ(12-40)及Αβ(20-37) —起培育。資料展示經固定ACA抗 體及經固定Αβ(21-37)自體抗體均與Αβ(1-40)結合且與 Αβ(12·40)結合，但僅經固定Αβ(21-37)自體抗體與Αβ(20-37)特異性結合。經固定抗體均不結合Αβ( 17-28)。此外， 展示經固定抗體ACA不與Αβ(4-10)結合。 圖35 :用於測定抗Αβ(21_37)自體抗體之血清ELISA。 BSA為牛血清白蛋白。HRP為辣根過氧化酶。OPD為鄰苯 二胺。IgG代表免疫球蛋白G。 圖36 : Αβ自體抗體（來自IVIgG)之ELISA測定。IVIgG代 表靜脈内IgG製劑。ELISA係以塗覆於96孔培養盤上之 Αβ(1-40)進行，且添加Αβ-抗體之稀釋液且以抗人類辣根 過氧化酶接合二級抗體測定。Αβ抗體定量係使用用於校正 之BSΑ參考曲線以1 pg/μΐ儲備溶液進行。所表示之百分比 代表來自兩個獨立ELIS A測定之IVIgG中Αβ抗體濃度。 圖37 :展示根據實例4之親和力純化之IVIgG使如實例6 所述之募聚形式Αβ 1 -40免疫沈澱之西方墨點法。使用抗 體 Bam 90.1(Sigma Aldrich 目錄號 Α8978，與 Αβ(13-28)結 合）來偵測免疫沈澱之Αβ。 圖38 :表示用於如實例13所述之AD動物模型之每抗體 128311.doc -178- 200844110 的平均總斑塊面積之條形圖。黑色柱形表示皮質中之斑塊 面積’且白色條形表示海馬區中之斑塊面積。使用Nik〇n NIS Elements軟體’於所治療動物之經免疫染色腦切片照 片上量測斑塊面積。將所量測之經CSL 36〇或CSL純系7治 療之動物（N=2)的斑塊面積取平均值（就兩隻動物而言）以與 經親和力純化IVIgG治療之動物（N=1)比較。 圖39 :展示如實例9D所論述抗Αβ(21-37)自體抗體CSL-純系7與Αβ(1-40)結合且與Αβ(ΐ2-40)肽結合，但不與Αβ(4-10)結合之ELISA資料。 圖40 : 3種不同Αβ特異性抗體：Αβ親和力管柱純化之人 類IVIgG(如實例4所述）、人類單株Αβ自體抗體CSL純系 7(如實例5所述），及對抗中端Αβ肽序列形成之人類化鼠單 株抗體（AK AC A，如實例5所述）抑制如藉由實例1 〇所述之 THT螢光染色所量測之Αβ原纖維形成的效應。THT檢定之 螢光性與原纖維Ab成比例且係用以評定原纖維形態。將在 非特異性人類單株（CSL360)存在下培育之Αβ(1-40)之螢光 性設定為100°/〇。 圖41 :如實例11Α中所述之點潰墨法分析。如實例丨i a 所述，將樣本以對照抗體（6E10，Bam90.1，CSL純系7， 親和力純化之IVIG，ACA)、來自AD患者之血清（AD1)、 來自年齡匹配之健康人類個體之血清（K4)測試。 圖42 ·將來自血清樣本（一個ad陽性樣本及一個年齡匹 配對照樣本）之IgG在於蛋白質G(Pierce)上純化後裝載於 Αβ(1-16)管柱上，以pH值為2.7之100 mM甘胺酸洗條且溶 128311.doc -179- 200844110 離。如實例116中所述，以生物素-〇5-八0(4-1〇)丑113八分析 溶離物。 圓43 :如實例12C中所述，與跟Αβ(1_40)單體之結合相 反，重組Αβ(21-37)自體抗體55/61、146/61及對照抗體 ACA與Αβ(1-40 Cys)二聚體之結合。 圓44 :如實例12C中所述，與跟Αβ( 1-40)單體之結合相 反，重組 Αβ(21-37)自體抗體 54/61、47/56、5 1/60及 53/60 與Αβ(1-40 Cys)二聚體之結合。 圖45 :如實例12C中所述，與跟Αβ(1-40)單體之結合相 反，重組 Αβ(21-37)自體抗體 146/60、52/60、53/148 及 145/60 與 Ap(l-40Cys)二聚體之結合。 圓46 : β澱粉樣蛋白肽之N-三羥甲基甘胺酸凝膠蛋白質 墨點分析。使用如Novex凝膠手冊（Invitrogen)中所述之標 準庫馬斯染色技術及較高敏感性之深紫試劑來進行β殿粉 樣蛋白肽之蛋白質觀測。深紫（GE，Sweden)係使用 Typhoon掃描儀根據製造商說明來觀測。 圓47 :如實例12D所述，比較抗體6E10、ACA及CSL純 系7與Αβ(1_40二聚體）對Αβ(1-40)單體、Αβ(1-40)募聚物及 Αβ( 1-40 Cys)寡聚物之結合的西方墨點法。 囷48 :如實例12D所述，比較重組Αβ(21-37)自體抗體與 Αβ(1-40 Cys)寡聚物對Αβ(1-40)單體之結合的西方墨點 法0 128311.doc -180-

Claims (1)

  1. 200844110 十、申請專利範圍： 1 · 一種經分離單株人類抗β澱粉樣蛋白抗體，其包含一個 以上胺基酸序列，該等胺基酸序列係選自由下列序列組 成之群之至少兩個一致胺基酸序列：SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO· 8、SEQ ID NO· 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11，其中該一個以上胺基酸序列各 自係來自不同SEQ ID NO，其中該抗體以比與單體形式 Αβ結合之親和力高之親和力與二聚形式Αβ結合。 f' 2·如請求項1之抗體，其中該抗體包含兩個以上胺基酸序 列’該等胺基酸序列係選自由下列序列組成之群之至少 三個一致胺基酸序列：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11，其中該兩個以上胺基酸序列各自係來自不同 SEQ ID NO。 3 ·如請求項1之抗體，其中該抗體包含三個以上胺基酸序 列，該等胺基酸序列係選自由下列序列組成之群之至少 I I ro<HU^^；f^J:SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、 SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11，其中該三個以上胺基酸序列各自係來自不同 SEQ ID NO。 4·如請求項1之抗體，其中該抗體包含四個以上胺基酸序 列，該等胺基酸序列係選自由下列序列組成之群之至少 五個一致胺基酸序列：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ 128311.doc 200844110 ID NO: 11，其中該四個以上胺基酸序列各自係來自不同 SEQ ID NO。 5. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含來自以下各一致胺 基酸序列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO·· 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11。 6. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 45作為特異性輕 鏈 CDR分別為 CDR1、CDR2 及CDR3，且包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 29作為特異性重鏈 CDR分另ij 為 CDR1、CDR2及 CDR3。 7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 53 及 SEQ ID NO: 60。 8. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145 及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53 及 SEQ ID NCh 60、SEQ ID NO: 51 及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 146及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NOM48、SEQ ID NO: 55 及 SEQ ID NO: 61，或 SEQ ID NO: 145 及 SEQ ID NO: 62 o 9. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含來自下列胺基酸序 列之 CDR : SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO·· 51 及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 146 128311.doc 200844110 及 SEQ id NO: 60、SEQ ID NO: 53及 SEQ ID NO: 148、 SEQ ID NO: 55及 SEQ ID NO: 61，或 SEQ ID NO: 145及 SEQ ID NO: 62。 1〇·如請求項1之抗體，其中該抗體與包含Αβ(21-37)之肽結 合。 11·如請求項1之抗體，其中該抗體遮蔽Αβ(21-37)殘基使其 免於蛋白水解消化。 12·如請求項1之抗體，其中當該抗體與NHS活化之6-胺基己 酸偶合之瓊脂糖偶合時，該抗體與Αβ部分多肽Αβ(12- 40)或 Αβ(20-37)特異性結合，但不與 Αβ(17-28)、Αβ(25-35)或Αβ(31-40)特異性結合。 13.如請求項12之抗體，其中該抗體遮蔽Αβ(21-37)殘基使其 免於蛋白水解消化。 14· 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之抗體。 15. —種如請求項丨至13之抗體的用途，其係用於製造用以 延緩或預防神經性失智疾病進展之藥劑。 16·如請求項1 5之用途，其中該神經性失智疾病係選自由阿 兹海默氏症（Alzheimer’s disease)、唐氏症候群（D〇wn，s syndrome)、路易體型癡呆（dementia with Lewy bodies)、 額顳葉型癡呆（fronto-temporal dementia)、殺粉樣腦血管 病變（cerebral amyloid angiopathy)及澱粉樣變性病組成 之群。 17·如請求項15之用途，其中該神經性失智疾病為阿茲海默 氏症。 128311.doc 200844110 18. —種偵測或量測患者神經性失智疾病之進展的方法，其 包含： / (A)量測來自該患者之樣本中對抗第一 Αβ肽之抗體力 仏，其中該第一 Αβ肽至少包含Αβ(3〇-37)之序列且至多 包含Αβ(ΐ2-40)之序列； (Β)里測來自該患者之樣本中對抗第二Αρ肽之抗體力 價，其中該第二Αβ肽至少包含Αβ(4_1〇)之序列且至多包 含Αβ(1-20)之序列；及 (c)比較來自步驟（Α)與（Β)之力價。 19. 如請求項18之方法，其中該神經性失智疾病係選自由阿 茲海默氏症、唐氏症候群、路易體型癡呆、額顳葉型癡 呆、職粉樣腦血管病變及澱粉樣變性病組成之群。 20·如請求項18之方法，其中該神經性失智疾病為阿茲海默 氏症。 21.如請求項18之方法，其中該第一 Α(3肽至少包含Αβ(2ι_ 37)之序列。 22·如請求項18之方法，其另外包含比較該等患者力價與對 正常及AD患者所測定之力價，其中對抗該第一 Αβ肽之 較向力彳貝與阿兹海默氏症顯現及/或進展之較低危險相關 聯。 23·如請求項1 8之方法，其另外包含比較該等患者力價與對 正常及AD患者所測定之力價，其中相對於對抗該第二 Αβ肽之力價，對抗該第一 Αβ肽之較高力價與阿茲海默氏 症顯現及/或進展之較低危險相關聯。 128311.doc 200844110 24. 如請求項18之方法，其另外包含比較該等患者力價與對 正常及AD患者所測定之力價，其中對抗該第二Αβ狀之 較高力價與阿兹海默氏症顯現及/或進展之較高危險相關 聯。 25. 如請求項18之方法’其另外包含比較該等患者力價與對 正常及AD患者所測定之力價’其中相對於對抗該第一 Αβ肽之力價，對抗該第二Αβ肽之較高力價與阿兹海默氏 症顯現及/或進展之較高危險相關聯。 26. —種偵測或量測患者神經性失智疾病之進展的方法，其 包含： 八 一〜不 俅不甲及在 稍後時間點量測獲自該患者之第二樣本中對抗至少包含 Αβ(30-37)且至多包含Αβ(12_4〇)之抗原決定基之抗體力 價；及 Β)比較該等第一及第二樣本之力價。 27· —種偵測或量測患者神經性失智疾病之進展的方法，其 包含： Α)於給定之時間點量測獲自該患者一 币樣本中及在 稍後時間點量測獲自該患者之第二樣本中對抗至少勺八 Αβ(4-10)且至多包含Αβ(Κ2〇)之抗原決定基之抗 價；及 A ^ B)比較該等第一及第二樣本之力價。 28· —種偵測或量測患者神經性失智疾病之進展的 包含： 八 128311.doc 200844110 A)於給定之時間點量測獲自該患者之第一樣本中及在 稍後時間點量測獲自該患者之第二樣本中對抗包含 Αβ(30-37)之抗原決定基之抗體力價；及 Β)比較該等第一及第二樣本之力價。 29. —種套組，其包含： (Α)第一 Αβ肽，其至少包含Αβ(30-37)之序列且至多包 含Αβ(12-40)之序列；及 (Β)第二Αβ肽，其中該第二Αβ肽至少包含Αβ(4_1〇)之 ( 序列且至多包含Αβ(1-20)之序列。 128311.doc -6-
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