TW200407335A - Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C - Google Patents
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Description
200407335 五、發明說明(1) 發明所屬之技術領域 本發明係關於、、去^ t i α 關於活化蛋白質c之非中和抗體。 先前技術 彳& #。g ^ ^換衡或開腹手術後發生靜脈血栓症的頻率 二HZ之治療主❹ 、a r ί a r 1 η)預防。但是,/ 而兮Φ妯雜炎一 低刀子肝素需要連曰皮下投藥, 他藥你吝斗士 杈服但因蛋白結合率非常高,會與其 m ifn ^ ^ ^ 併用上有所限制。且,任一者的 系物都會產生出血的倾而 曰尤在立丄, 、向 故’右能有可長時間持續作用 丑不會產生出血傾而沾ρ ^ ? 貝门的抗血栓樂,則可利用在剛手術後及 =完所投予,以預防血栓並提高患者之生活品質 。而對於其它的血栓症,特別是能長時間持續作用 之抗血栓藥,其開發也是被期待的。 、血栓係因血小板與血液凝固系統活化所形成,一般認 為動脈血栓主要為血小板、靜脈血栓主要為凝固系在作 用菖血液/旋固系,舌化生成凝血酵素(t h r 〇 m b i η ),以構 成血栓網f體纖維蛋白(flbrin)時,會與存在於血管内 皮上之攜凝血酵素(thrombomodulin)結合並改變性質, 使蛋白質C(Protein C; PC)活化。被活化之pc(activated protein C;aPC)可作為蛋白質s(pr〇tein S)之辅酶,使第 5a因子(Factor Va)及第8a因子(Factor Villa)不活化並 往抑制凝固系迴轉的方向進行。又,ape尚具有抑制 PAI-I(PUsminogen Activator Inhibitor-Ι)或
200407335 五、發明說明(2) TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor) 等纖溶阻害物質之作用,可以促進纖溶系。故,PC與apc 被認為具有對活化血液凝固系進行負回饋控制之重要作 用,實際上,因為先天性PC缺乏症或因第5a因子變異所產 生之aPC不應症係血栓症之發現因子之一,故apc被認為對 於血栓症之治療與預防是有效的。 另外,敗血症到目前為止並無有效的藥劑,但最近有 重組aPC對治療敗血症有效的報告(Ν· Engl. J. Med.
20 0 1,344:6 99 - 70 9 )。又,亦有關於apc可作用於血管内 皮並具有抗發炎作用的報告(j· Biol. Chem. 2001,2了6: 1 1 1 9 9 - 1 1 2 0 3 ),且在敗血症模式中,亦有關於除可抑制凝 血酶產生之外,尚可發揮抗發炎作用之報告(j. C 1 i n.
Invest. 1987,79 :918-25) 〇 但,因為aPC在血液中半衰期只有2〇〜3〇分鐘,很短, 故必需於靜脈内持續投予或長期連續投予。半衰期短的原 因係因為aPC會被生體内之生理阻害物質即蛋白質c抑制劑 (Protein C Inhibitor; PCI)或 αΐ 抗胰蛋白酶(α 片 卜antitrypsin; ΑΑΤ)被不可逆的不活化。又,即使
之前驅體PC製劑化,在生體内的半衰期仍僅有6〜8小★ 麼短’仍需持續或多次投予,在醫療經濟學上是不、 率的。 巧双 發明内容 (發明之揭示)
200407335 五、發明說明(3) —— 由前述,因aPC具有企液凝固系迴饋的機能,故直 成及作用限定於凝固系已活化之局部部分。因此,若以 aPC進打全身投予時,必需在必需的局部供給之外, 充不活化所消耗的部分。若有能增強局部里內 因性生成aPC作用之藥劑,則因其作用限定且 丨^ 本身不會被消耗,可以少量且單次投予 :ί ί广 明人等對於能抑制aPC不活化並延長半 哀期作用以增強内因性aPC作用之藥劑進行開發。 牛 為此’本發明人等對可產生抗aPC單株二二々a人产 進行選殖。並以大規模筛選融合瘤几_ :5瘤 aPC不活性化之apc抗體。_等抗f纟 …p制 產生之a P C不活化。本尚可抑制因⑽所 而抑制血液凝固系之作用,對於 抵 有用。又,本發明之抗體在敗血二f/口療及預防上極為 劑,可與aPC併用或單獨使、/正/σ療上可作為治療藥 強aPC作用。 用猎抑制血中aPC不活化以增 即,本發明係關於 用,更具體的說: ,化之抗a P C抗體及其利 (1 )係一種抗蛋白曾r 、、丈 其具有增強生體中、、* ^、或抗活化蛋白fC(aPC)之抗體, (V一種//:以 抑制生體中活化蛋白曾/^1;化蛋白質C之抗體,其具有丨 其㈡貝L不活化之活 (3 ) —種抗蛋白質c或y 、戍抗活化蛋白質c之抗體,其具有 200407335 五、發明說明(4) 抑制(a)因血液使活化蛋白質c不活化, 質C之生理阻害物質使活化蛋白質c不活化 目舌化蛋白 以上兩者之活性。 化或具有可抑制 阻室 所(、4)如第(3)項之抗體,其中活化蛋白質c之生王 物質為絲胺酸蛋白酶抑制劑(SERP I Ns )。 ' 理 (5 )如第(4 )項之抗體,其中絲胺酸蛋 ΓςρρρτΜ λ :曰姆抑制劑 N s)為蛋白質c抑制劑或α 1抗胰蛋白酶。 (6)如第(1)〜(3)任一項之抗體,係由以下(8)〜(:〇任 一胺基酸序列構成互補決定區或具有與其機能上為同 1 互補決定區。 (a) 序列識別號:9、 (b) 序列識別號:2 1 (c) 序列識別號:3 1 (d) 序列識別號:2 4 (e) 序列識別號:1 5 (f) 序列識別號:2 7 1 0及11所記載之胺基酸序列, 、2 2及2 3所記載之胺基酸序列, 、3 2及3 3所記載之胺基酸序列, 、2 5及3 4所記載之胺基酸序列, 、1 6及1 7所記載之胺基酸序列, _ 、28及29所記載之胺基酸序列, (7 )如第(1 )〜(3 )任一項之抗體,係擇自由人類抗體、 人類化抗體、嵌合抗體、抗體片段、單鏈抗體及二元體所 組成之族群。 (8) —種組合物,含有如第(1)〜(3)任一項之抗體及藥 學上可容許之載體。 、、 (9) 如(8)之組合物,尚含有蛋白質C及/或活化蛋白貝 C。(1〇)如(8)或⑻之組合物,係、使用於預防或治療因活
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第7頁 200407335 五、發明說明(5) ---- 化蛋白質C活性低下或不足所導致之發病及/或進展之 病。 ;矢 (11) 如(1 〇)之組合物,其中之疾病係指因血液凝固反 應亢進及/或發炎反應亢進所引發的疾病。 (12) 如(π)之組合物,其中血液凝固反應亢進及/或 發炎反應宄進所引發的疾病係擇自由敗血症、播種性血2管 内凝固症候群、動脈血栓症及靜脈血栓症所組成之族群: (1 3 ) —種不活化被抑制之蛋白質c或活化蛋白質c的製 造方法’其中包括使第(1)〜(3 )任一項之抗體接觸蛋白併c 或活化蛋白質C之製程。 貝 (1 4) 一種預防或治療因活化蛋白質c活性低下或不足 導致發病及/或進展之疾病的方法,包括投予(a)蛋白質c 或活化蛋白質C及(b)第(1)〜(3)任一項之抗體之製程。、 (1 5) —種預防或治療因活化蛋白質c活性低下或不足 導致發病及/或進展之疾病的套組,包括(a)蛋白質c或活 化蛋白質C及擇自第(1)〜(3 )任一項之抗體所構成群中至少 一種’及(b)包括關於治療有效量之蛋白質c及/或活化蛋 白質C與該抗體併用之記載或連結至該記載之記錄媒體。 本發明係提供可抑制aPC不活化並延長半衰期iapc非 中和抗體。本發明者發現在aPC非中和抗體中,存在有能 防止因血中PC I或AAT使aPC之抗血液凝固作用不活化並使 a P C在生體内哥命延長並增強活性之抗體。此處之a p [不活 化係指aPC在生物學上活性低下或喪失。具體上,apc之不 活化係指因血液或PCI或AAT等生體内之生理阻害物質使
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2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第9頁 200407335 五、發明說明(7) 1 998; Yuasa, J. et a 1. , Thromb. Haemost. 83, 262-267,2000)及 al 抗胰蛋白酶(AAT,Heeb,M.J· and Griffin, J.H., J. Biol. Chem. 1 988, 263:11613-11616)。 又,本發明係對抗aPC之抗體,係提供可利用以下 (i )、( i i )製程所得到之抗體, i)以是否結合於對抗aPC之抗體以測定aPC因血液之不 活化,
i i)利用與不會結合於該抗體之aPC比較,選擇與該抗 體結合之可抑制aPC不活化之抗體。 又,本發明係對抗aPC之抗體,係提供可利用以下 (i)、( i i)製程所得到之抗體, i)以是否結合於對抗aPC之抗體以測定apc因aPC不活 化因子之不活化, i i)利用與不會結合於該抗體之aPC比較,選擇與該抗 體結合之可抑制aPC不活化之抗體。
血液可為全血或血漿。又,a p C不活化因子例如有a p c 之生理阻害物質,例如PCI AAAT。欲使對抗&?(:抗體結合 於aPC時’可利用使兩者共存於溶液中例如將含有兩者之 溶液溫育5分鐘〜數小時,例如1小時左右即可。ap(:因血液 或aPC不活化因子而不活化可利用使apc與血液或apc阻害: 物質共存以實施,例如,將含有兩者之溶液溫育5分鐘〜數 小時’例如1小時左右即可。 本發明之抗aPC抗體可為單株抗體(含全長單株抗
200407335 五、發明說明(8) 一 ^ 體)、多株抗體或該等之變異體。以可安定化生產均質抗 體的角度上,以單株抗體較佳。 本發明中之「單株抗體」為實質上均質的集團,即, 組成集團之各別抗體係指除因天然所產生而存在少量變異 體以外係由均一之抗體集團所得到之抗體。單株抗體為高 度特異性’係對單一之抗原部位作用。再者,與典型上j 有對抗不同抗原決定基(epi tope)之不同抗體的慣用多株 抗體調製物比較,各單株抗體可對應於抗原上之單一抗原 決定基。除其特異性以外,單株抗體具有可以利用不會被 其他免疫球蛋白污染之融合瘤培養方式合成的優點。所謂 「單株」之修飾語係表示其係由實質上均一抗體之集團得 到之抗體特性,並非限定抗體需由特定方法製造。例如, 本發明使用之單株抗體可利用融合瘤法(K〇hi er and
Milstein, Nature 25 6:49 6 ( 1 975 ))或重組方法(美國專利 第4 8 1 6 5 6 7號)製造。本發明所使用之單株抗體亦可由噬菌 體抗體庫單離(Clackson et al.,Nature 352 : 624-628 ( 1 9 9 1 )) ;Marks et al., J. Mol. Biol 222:581-597(1991))。本發明之單株抗體包含嵌合抗體; (免疫球蛋白)、抗體變異體及抗體片段(美國專利第 48 1 6 5 6 7 號;Morrison et al·,Pr〇c· NaU· Acad· Sci USA 8 1:6 85 1 -68 5 5 ( 1 984 )),特別是重鏈(H鏈)及/或輕鏈 (L鏈)之一部分係為特定種類或來自特定之抗體分類或次 分類,而鏈之其餘部分係別的種類或來自別的抗體分類或 次分類之欲合抗體。
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200407335 五、發明說明(9) --- 一本發明中「抗體變異體」係指抗體之胺基酸序列變異 體,其中有1或以上之胺基酸殘基被改變。例如,可將抗 體之可變區改變,以改善與抗原之結合性等抗體生物學等 性。此種改變可利用部位特異之變異(參照Kunkel,
Natl· Acad. Sci. USA 82:488 ( 1 9 85 ))、PCR 變異、盒式
變異等方法進行。此種變異體在抗體之重鏈或輕鏈之可變 區的胺基酸序列具有至少7 〇 %之同一性,較佳為至少7 5%, 又較佳為至少8 0 % ’更佳為至少8 5 %,又更佳為至少9 0 %, 而最仏為至少有9 5 %之同一性。本說明書中序列之同一性 係將使序列同一性能最大之方式使序列依需要整列化並導 入適當缺口後,與原來抗體之胺基酸序列之殘基中為同一 殘基之比例來定義。 V 具體而言,鹼基序列及胺基酸序列之同一性可利用卡 林及區人絲爾所發展之演算法B l a S T ( P r 〇 c. N a 11. A c a d.
Sc l· USA 90:587 3-5877, 1 993 )決定。依照該演算法,開 發 了稱為BLASTN 及 BLASTX 之程式(Altschul et al·,J. Mol· Biol· 215:40 3-4 1 0,1 9 9 0 )。依照 BLAST 利用 BLASTN 解析驗基序列k ’參數可設定為例如s c 〇 r e = 1 0 0, wordlength=12。又,依照BLAST利用BLASTX解析鹼基序列 k ’參數可設定為例如score = 50,wordlength = 3。使用 BLAST及缺口 BLAST程式時,使用各程式之預設值。該等鮮 析方法之具體手法係公知的(參照NCBI (National Center for Biotechnology Information))之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)之網站;http://www.ncbi.nlm.
第12頁 2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200407335 五、發明說明(ίο) nih.gov) 〇 多株抗體及單株抗體可利用該行業周知的方法製作。 例如,可利用如下之方法製作。 動物免疫所使用之aPC例如有利用重組去氧核糖核酸 法或化學合成所调製之a P C胺基酸序列之全部或一部之月太 類等。人類及其他哺乳動物之aPC胺基酸序列為公知的 (Mather, T· et al·, EMBO J· 15:6822-6831(1996);
Foster, D.C., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:4673-4677(1985))。例如,可使用市售之aPC(pr〇tein C activated,來自人類血漿,SIGMA,#P2200)作為抗 原。抗原可使用aPC或其部分狀類本身,亦可將其纟士人於 載體蛋白並進行免疫。使用載體蛋白時,例如,將作σ為抗 原之aPC結合於載體蛋白質(例如,甲狀腺球蛋白 (Thyroglobul in ))後,添加佐劑。佐劑例如有佛洛依德 完全佐劑、佛洛依德不完全佐劑等,亦可將該等任一、、^ 合。 將以上述方式得到之抗原投予給哺乳動物,例如,小 鼠、大鼠、倉鼠、土撥鼠、馬、猴、兔、山羊、羊等。免 疫可使用既存之任意方法,主要以靜脈内注射、皮下注 射、腹腔内注射等方法進行。又,免疫之間隔不特別限 定’為數日至數週間隔’較佳以4〜21日之間隔進行免疫。 抗原蛋白質之免疫量對每隻小鼠每次可為例如丨〇〜丨〇 〇 # g (可為2 0〜4 0 // g),但不限定於此。 於初次免疫前及第2次以後之免疫起第3〜7曰後由動物
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採血,並分析血液中之抗體力價。又,為擴大免疫應艾, 較佳為使用明礬等凝集劑。選用之哺乳動物抗體通常^對 於抗原具有十分強結合親和性者。抗體之親和性可利用飽 和結合、酵素結合免疫吸附檢定法(eusa)及競合分析(例 如’放射性免疫分析)來決定。 多株抗體之篩選法例如可利用如抗體,實驗室手冊 (Antibodies, A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Labortoriey, Larlow and David Land Edit (1 9 8 8 ))所記載之慣用的交差結合分析進行。或,亦可使 用抗原決定基興圖(epitope mapPing(champe et al.,j Biol· Chem· 270:1388- 1394(1995))進行。測定多肽或抗 體效力之方法較佳者為使用抗體親和性定量化之方法,但 除此之外其他態樣包括,不使用結合親和性測定而對抗體 之一種或更多生物學特性進行評價之方法。該種方法因可 特別表示出抗體在治療上之有效性,故為有用的。通常但 非絶對’在此種分析中表示有改善特性之抗體其結合親和 性亦會增加。 單株抗體調製時融合瘤之製作可依例如米魯思帖等人 (Kohler, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 1981,73,3-46)之方法進行。與抗體產生細胞融合之骨^ 髓瘤細胞可使用來自小鼠、大鼠、人等各種動物並且為該 行業人員一般可取得之株化細胞。使用之細胞株係使用具 有藥劑抵抗性且具有於未融合狀態下無法生存於選擇性典 養基(如Η AT培養基)而僅在融合狀態下才可生存之性質
200407335 五、發明說明(12) 者。一般使用8 -偶氮鳥σ票吟而t性株’該細胞株欠缺次育ϋ示 呤核苷-鳥嘌呤-磷酸核酸轉移酶,無法在次黃嘌呤·氨甲 蝶呤·胸腺嘧啶(HAT)培養基内生存。骨髓瘤細胞適用者 有各種公知的細胞株,WP3x63Ag8.6 5 3 (J.Immunol· (1979) 123:1548-1550) > P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7)、 NS-l(Kohler, G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. ( 1 9 76 ) 6:5 1 1 -5 1 9 ) > MPC-11(Margu1ies, D. H. et al., Cell(1976) 8:405-415) 、SP2/0(Shulman, M· et al·, Nature(1978) 276:269-270) ^F0(de St. Groth, S. F. et al·, J· Immunol. Methods (1980) 35:1-21)、 SI94(Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148:313-323) 、R210(Galfre, G· et al·, Nature(1979) 277:1 3 1 - 1 33 ) ^ P3U1(J. Exp. Med. 1 979 ; 1 5 0 : 58 0 ; Curr Top Microbiol· Immunol· 1 978;81:1)等。又,人類骨髓 瘤及小鼠-人類異骨髓瘤細胞株亦可用於人類單株抗體之 產生(Kozbar, J. Immunol· 133:3001)(1984); Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc·,
New York)。抗體產生細胞可由例如最終免疫日起經2〜3曰 後犧牲死亡之動物身上採取。抗體產生細胞例如有脾臟細 胞、淋巴節細胞、微血管細胞等,但一般使用脾臟細胞。 具體而言,將前述動物之脾臟、淋巴節等摘出或採取後將 該等組織破碎。將所得到之破碎物懸濁於PBS、dmem、 i
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RPM 1 1 640等培養基或緩衝液,以不銹鋼篩網過淚後,I 離心以调製目的之抗體產生細胞。 13 ' 用 其次’使上述骨趙瘤細胞與抗體產生細胞進行细 合。細胞融合係於MEM、DMEM、RPMI 1 640笼氣^ ' 寸勒物細胞用典 養基中,使骨髓瘤細胞與抗體產生細胞以混合比 ° 1:;1〜1:20,於融合促進劑存在下,於30〜3Vr υ I卜接觸1〜1 5 分鐘來進行。為促進細胞融合,可使用平均分子量 1 0 0 0〜6 0 0 0 (Da)之聚乙二醇、聚乙烯基醇或仙77台病s毒等1 合促進劑或融合病毒之市售細胞融合裝置,、同 且 M便彳几體產味 細胞與骨髓瘤細胞融合。 由經過細胞融合處理後之細胞選別出目的之融人卢 其方法例如有利用在選擇性培養基中將細胞選擇性增Z的 方法。即’將細胞懸濁液以適當培養基稀釋後,分散於秦 定量平盤’在各穴中加入選擇性培養基(HAT培養基),'之^ 後適當的更換選擇性培養基以進行培養。其結果,可得到 生育出之細胞為融合瘤形式者。 又,別的態樣,亦可以馬克卡菲提(McCaf f erty)等人 (Nature 348:552-554(1990))記載之技術,由所製造之❺ 菌體抗體庫將所產生之抗體或抗體片段單離。克雷克森 (Clackson)等人(Nature 352:624-628(1991))及馬克氏等 人(J · Μ ο 1 · B i ο 1 · 2 2 2 : 5 8 1 - 5 9 7 ( 1 9 9 1 ))分別對於使用嗟 菌體庫之小鼠及人抗體之單離有所記載。又,以鏈更替 (chain shuffling)製造高親和性(nM範圍)人類抗體 (Marks et al·,Bio/Technology 10:779-782(1992))及
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第16頁 200407335 五、發明說明(14) 構築巨大噬菌體庫之方法有重組實地感染及體内重組 (Waterhouse et al., Nucleic Acid Res. 21:2265-2266(1993))等。該等技術可取代先前之單株抗 體融合瘤技術以用於單株抗體之單離。 本發明之非中和抗aPC抗體可利用例如以下篩選來選 擇。 • 1次篩選 以公知技術’如E I A (酵素免疫分析)、R IA (放射線免 疫分析)、ELISA(酵素連結免疫吸附分析)、jjTRF(均質時 間解析螢光分析)或螢光免疫法等(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane. Cold
Spring Harbor Laboratory, 1 988 )測定抗體結合特異 性,並選擇可結合於aPC者。 • 2次篩選 使用人類血毅測疋APTT(活化部分凝血活酶時間),並 選擇aPC抗血液凝固作用增強之抗體。或,將ΑΑτ或pCT添 加於a P C,以測定a P C之不活化,選擇可阻害因a a T及/或 PC I使aPC不活化之抗體。例如,若分析由融合瘤等抗體產 生細胞所得到之抗體,可鑑定會產生具有目的活性抗體之 抗體產生細胞’並將選殖體以極限稀釋法次選殖,以標準 化方法使生育(Goding,MonoclonalAn1:ibc)dies: Principles an Practice. Pp. 59-103. Academic Press,1 986 )。培養基例如可使用d-MEM或RPIM-164G培養 基。利用反覆選殖’可選擇產生較強之抑制apC不活化抗y:
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第17頁 200407335 五、發明說明(15) 體的抗體產生細胞(融合 殖。 c專),進订抗體產生細胞之選 ΡΓ上發明之&體為可抑㈣因企液或aPC阻*物- aPC不活化之抗體。其抑制 :物處而不使 將因血液或apC阻害物質 ^ 士 y " 抑制率(%), aPC活性以η表示’不會因 J :程度之 度之aPC活性以100%表示。 ,舌性為同程 不活化抑制率可利用一面改變適當抗體 定最適條件,呈體而+ 用里一面測 八股向a ,可利用以下的步 g/ml 之aPC(SIGMA,P-22 0 0 笼、〜、广 1 η η 、疋。將 1 0 " 6 z u U羊)>谷液1 〇 # 1與抗轉、、女 1 (若為融合瘤之餘選% ’合液4 0 // 人二颔之師述物,例如,為融合瘤培養上、、主、十丁 3抗:作為對照之溶液(例如骨髓瘤; 培養基等)混合,於室溫下溫育一定時間(例如養公分咖 鐘)/在該混合液中添加血漿(例如,標準血裝)Μ" 於至溫下溫育一定時間(例如,6〇分鐘)。添加“Η (/=;Λ道咖1NG,GAA 一2 0 0Α)50…不與血聚溫育 = aPC液/旋固時間係在添加ΑΡΤΤ試藥前加入血漿中並測 疋。例如於37 t下溫育3分鐘後,添加2〇mm〇1/1 CaC1 ( =,DjDE BEHRING,GMZ-31 0)50 // 1,並測定到凝固為止 花的時間。血液凝固時間可利用血液凝固自動測定裝置 (例如,Amelung , KC-10A)測定。 將未與血漿溫育並添MaPC之凝固時間(a)定為1〇〇%, 與不含抗體以作為對照之溶液溫育後與血漿溫育再添加 aPC之凝固時間(b)定為〇%,並由與融合瘤培養上清等抗體 第18頁 2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200407335
溶液溫育後盥心將、w + 於融合瘤培養卜1再添加aPC之凝固時間(c),求出對 活化抑制率(G/) = ^等抗體洛液之,旋固時間延長的作用(不 斷對於aPC不活化m(a — b)X 1〇〇})。此值越λ,則判 化合物測定aPC、、*i I制作用越強。在使用^2366等基質 而在血漿中被不守於日守亦可與上述同樣測定不與抗體溫育 較,以、則—ΡΓ /化之aPC,及以不與血漿溫育之aPC比 抗r之;=活性,並算出不活化抑制率(%)。本發明之 又率(%)較佳為10以上,更佳為15以上, 伟^了以上,再更佳為2〇以上,尚更佳為25以上,更 隹為30以上,又承/土达 更佳為3 5以上,更佳為4 〇以上,又更佳為 45以上,再更佳為5〇以上。 或,本發明之抗體較佳為可阻害因PCI或AAT等aPC阻 口物f使aPC不活化者。其作用可利用低分子基質發色試 驗測+定。若舉一例,將精製抗體溶液40 // 1與1〇 vg/mi之 aPC ’谷液1 〇 # 1於室溫下反應6〇分鐘。將apc與抗體混合液 5 0.//1加入含有肝素ίου之緩衝液(最終濃度:7〇隱〇1/][
Tris pH 8.0, 125mmol/L NaCl, lOmmol/ CaCl2, 0.1% BSA),使成為180//1。添加l〇〇//g/mi重組pc〗(附有Fiag 標記)20 /zl,於37°C下使其反應3 0分鐘。添加低分子基質 S - 23 6 6 ( 2mmol/l)50//l,並測定60分鐘後之吸光度 (40 5nm) 〇 與使用未添加PCI之aPC時的吸光度比較,若添加pC j 則吸光度下降。添加PC I之aPC活性定為〇%,未添加pc I之 aPC活性定為100%,以吸光度之平均值為根據求出抗體之
200407335 五、發明說明(17) 相對活性。本發明抗體之相對值較佳為1以上,更佳為2以 上,又更佳為3以上,更佳為5以上,又更佳為7以上,再 更佳為1 0以上,更佳為1 2以上。本發明之抗體可為具有使 用上述血漿測定APTT之抗血液凝固作用或對上述PCi iaPC 不活化具有阻害作用二者之一。即,本發明之抗體較佳為 能抑制因血液及aPC阻害物質使aPC不活化之抗體。 本發明之抗體亦可為結合於與a P C生理阻害物質相互 作用之aPC部位的抗體。此種apc之胺基酸例如已被鑑定者 有E215 、S216 或S336(Shen, L·, Biochemistry 39:2853-2860(2000))。本發明之抗體亦可為結合於apc.中 該等胺基酸中任一者或其附近者(例如,在1 〇個胺基酸以 内的部位)。製作該種抗體只要合成含有目的aPC部分之募 肽類,並以其為抗原對動物免疫使產生抗體即可。又, &?(:活性部位已知有11211、1)2 57 及8 3 60 (?〇3七61',0.(:.,
Proc· Natl· Acad. Sci. USA 82:4673-4677(1985))。結 合於含有該等胺基酸區域之抗體因可能會阻害aPC活性, 被$忍為較不好。 從取得之融合瘤採取單株抗體之方法例如有通常之細 胞培養法或腹水形成法。細胞培養法可將融合瘤於含 10〜20%胎牛血清之RPM 1 - 1 640培養基、MEM培養基或無血清 培養基等動物細胞培養基中,以通常之培養條件(例如3 7: c ’二氧化碳濃度5%)培養2〜14日,再從培養上清取得抗 體。腹水形成法可將融合瘤投予到與來自骨髓瘤細胞之哺 乳動物同種動物之腹腔,使融合瘤大量增殖。並,在1〜4
200407335 五、發明說明(18) 週後採取腹水或血清。為促進腹水形成,例如,可事先將 降植烷(pristine,2, 6, 10, 14 -四甲十五烷)投予至腹腔。 本發明中可使用之抗體可利用蛋白質紅瓊脂糖 (protein A Sepharose)、羥基磷灰石層析、硫鹽析法、 陰離子交換層析、親和性層析等公知的方法適當選擇,或 將該等組合來進行精製。 又’本發明可依上述方法,由融合瘤將所得到之抗體 基因選殖,並重組至適當載體並導入宿主内,用於以基因 重組技術產生基因重組型抗體(例如,參照Carl,Α· K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United
Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD·,1 990 )。本發 明提供編碼為本發明抗體之核酸及具有該核酸之載體。^ ΐ =二由融合瘤之傳訊核糖核酸以反轉錄酶合成抗體ΐ :二L二ίί互補去氧核糖核酸(cDNA)。若可得到編碼為 _ 區之去氧核糖核酸,則可將其與編碼為所欲抗 體不變區(C區)之去氧核糖核酸相連接,並重== ΐ抗二可,:碼為抗㈣區之去氧核糖核酸重:至Ϊ 有抗體C £去虱核糖核酸之表現載體。亦可 重組至表現載體,例如以增強子(enhancer)、/促工1區 Γ二其次… :匕 體。本發明提供表現本發明抗體之,二 本發明之抗體表現細胞包括以 ϋ田胞。 融合瘤。 Μ π負轉換之細胞及 2125-5774-PF(Nl);Chiumeow. ptd 第21頁 200407335 五、發明說明(19) (^ 1 ^ ^ -^ - ^ 在本發明中稱A 硬(或同一)之抗體較佳。該種抗體 利用將實施例新Γ ^上結合於同一部位的抗體。例如,可 肽類等以公知的;义::抗體抗原決定基用aPC之部分 得到實質上2 原,以調製結合於該抗原之抗體’ 气種t^ 口於上述單株抗體之aPC結合部位的抗體。 ί揮Ϊ與實施例所單離之抗體,對aPC活性低下 上結合於相同P邻I乍用。2個抗體是否與抗原蛋白質係實質 言,若篦〗卩位可利用例如競合實驗來決定。具體而 受到競人阻室几a?几體與aPC之結合因第2之抗aPC抗體而 可判斷第1之抗體與第2之抗體在實質上 二口 、冋的抗原部位。本發明包含實質上壯八於盥杏 之apc結合部位為相同部位的二 U血液及/或aPC阻害物質使aPC不活化之作用。 (表υ之’ ^ f) 實&例//單離任—單株抗體 指具有與實施例中所單離任-單株抗體 液及/或aPC阻害物質使aPC不活 並;有:血 ΓΖη:么稱為V區)中決定對抗原結合特異性之區 丄上各分別存在3處’其㈣端起各命名為 夾二:V 有4個胺基酸序列保存性高的領域包 存在,%為框架(framework) qCDR可移殖至其他
200407335 五、發明說明(20) 抗體’利用與所欲之抗體框架組合,可以製作重組抗體。 又’亦可在維持對抗體結合性下,改變1個或數個⑶R之胺 基酸。例如,可置換、缺失及/或附加CDR中1個或數個胺 基酸。 在變異之胺基酸殘基中,希望在保存胺基酸側鏈性質 下變異胺基酸。例如,胺基酸側鏈之性質有疏水性胺基酸 (A、I、L、Μ、F、p、、γ、v)、親水性胺基酸(R、D、 N、C、E、Q、G、Η、K、S、T)、具有脂肪族側鏈之胺基酸 (G、A、V、L、I、p)、具有羥基側鏈之胺基酸(s、τ、 Y)、具有含硫侧鏈之胺基酸(c、Μ)、具有含羧酸及醯胺側 鍊之胺基酸(D、Ν、Ε、Q)、具有含鹼性基側鏈之胺基酸 (R、Κ、Η)、具有含芳香族側鏈之胺基酸(F、η、γ、w)等 (括弧内表示胺基酸之單字母標記)。以該等各群中之胺基 酸置換則稱為保存性置換。在某些胺基酸序列上有1或_ 數個胺基酸殘基缺失、附加及/或具有以其它胺基酸置換 修飾之胺基酸序列的多肽仍可維持其生物學活性係已知的 (Mark, D. F. et al. , Pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J· &amp;
Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A· et al·, Science 224, 143卜1433, Dalbadie-McFarland, G. et al·, Proc· Natl· Acad,Sci· USA ( 1 982 ) 79, 640 9-64 1 3 )。變異之 胺基酸數不特別限定,但通常在各CDR胺基酸之4〇%以内, 較佳為3 5 %以内,再更佳為3 〇 %以内(如,2 5 %以内)。胺基
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第23頁 200407335 五、發明說明(21) f序:之同一性可利用本說明書所記載之方法決定。例 i : 抗體包括各⑽之胺基酸保存性置換的抗 豆^專抗體可期待具有與選殖體#79同等之活性。 _ r^含有上述Η鏈CDR之抗體可用於組合適當抗體L鏈之可 、交品。L鏈CDR以例如由TASSSVSSSYLH(序列識別號:21)、 STSNLASGAPT(序列識別號:22)及YHRSPFT(序列識別號·· 23) 之胺,酸序=所構成之CDR或與該等為同等機能之CDR組合 者為仏。各胺基酸序列係對應於抗體L鏈之⑶、⑶μ及 CDR3。該等CDR可插入於所欲[鏈可變區之框架間相當於 CDR1、CDR2及CDR3的位置。上述各CDR之胺基酸亦可利甩 適s置換來改變。例如,本發明之抗體包括&CDR之胺基 酸保存性置換的抗體。 。具體而言’本發明之抗體係具有以下Η鏈互補性決定 區’且具有阻害因血液及/ 4aPC阻害物質使apc不活化之 作用。 (a)由序列識別號:9、丨〇及丨丨所記載之胺基酸序列所 構成之互補性決定區。 (b )由序列識別號·· 9、1 〇及1 1之任意保存性置換的胺 基酸序列所構成之互補性決定區。 (c )由序列識別號:9中2個以内、1 〇中8個以内及1丨之3 個以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺基酸序列所構 成之互補性決定區。 (d)由序列識別號:9、1〇及Η各具有7〇%以上同一性之 胺基酸序列所構成之互補性決定區。
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200407335 五、發明說明(22) 此處’(c )中胺基酸之改變數較 有1個。X,較佳為序列識別號:有7列識別號:9中 3個以内,又更佳為2幻個。又,較個以内,又更佳為 有2個以内,以丨個以内更佳。又,:列識別號:11中 以上,以80%以上更佳,又更佳為 同-性較佳為Μ 上。 ° M上,更佳為95%以 又,本發明之抗體係具有以下L鏈互 具有阻害因血液及/或“〇阻害物質使a /、疋品且 (a) 由序列識別號:21、22及23 ’舌化之作用。 構成之互補性決定區。 “载之胺基酸序列所 (b) 由序列識別號:21、22及23之 基酸序列所構成之互補性決定區。-保存性置換的胺 (C)由序列識別號:21中5個以内、22中5個以内及23乏 個以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺基 成之互補性決定區。 J叮稱 (d)由序列識別號:21、22及23各具有7〇%以上同一 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 此處’(c)中胺基酸之改變數較佳為序列識別號:21 有4個,以3個以内更传,又以2個以内更佳,再更佳為1 個。又,較佳為序列識別號:2 2中有4個以内,以3個二 更佳,又更佳為2個以内,再更佳為1個。又,較佳為 識別號:23中有2個以内,以1個更佳。又,(d)之同二&列 佳為m以上,以80%以上更佳,又更佳為90%以丨,更佳較
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第25頁 200407335 五、發明說明(23) 為9 5 %以上。特別是以具有該等Η鏈互補決定區與l鏈互補 決定區兩者之抗體作為本發明抗體是較適當的。 本發明之抗體例如具有由(S/R)SWMN(序列識別 號:31)、RIYPGDGD(T/S)(N/I)YNGKF(R/K)G(序列識別
號:31)及?6(1/3)(173)(170)(八/3)(人/3)界卩八丫(序列識別 號:33)之胺基酸序列所構成之CDR或與其為機能上同等之 C D R。與上述相同,各該胺基酸序列相當於抗體η鏈之 CDR1、CDR2及CDR3。將該等抗體之Η鏈CDR以較佳胺基酸序 列具體例示,則例如CDR1為SSWMN(序列識別號:12)或 RSWMN(序列識別號:18),CDR2例如為 RIYPGDGDTNYNGKFEG(序列識別號:13)或 RIYPGDGDSIYNGKFKG(序列識別號:1 9),CDR3 例如為 WGITTAAWFAY(序列識別號·· 14)或WGSSGSSWFAY(序列識別 號:20)等。具體而言,可使用單株抗體#123或#285 鏈 之CDR1、2及3之組合。該等抗體可期待具有與#123或#285 有同等活性。此情形作為L鏈CDRs者,例如以 RTSENIYSYLA(序列識別號:24)、NAKTLAEGVPS(序列識別
號:25)及丫丫〇(173)?(?/丫)了(序列識別號:34)之胺基酸序列 所構成之CDR或與該等為機能上同等iCDR組合者較佳。各 該胺基酸序列對應於抗體L鏈之CDR1、CDR2及CDR3。又, 該等L鏈CDRs亦可與上述η鏈獨立使用。作為l鏈CDR3之較 佳胺基酸序列更具體例示,可使用YYGTppT(序列識別 號:26)或YYGSPYT(序列識別號:3〇),但不限定於該等序 歹1J 〇
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第26頁 200407335 五、發明說明(24) 具=言,本發明之抗體係具有以下請互補性 J用 害因血液及/或aPC阻害物質使抓不活化之 構成(之 ==號^ (b)由序列識別號:31、32及33之任意 基酸序列所構成之互補性決定區。 ^ 換的胺 (c )由序列識別號·· 3 j中2個以 5個以内胺基酸有置換、缺失及/< μ/2中8個以内及33之 成之互補性決定區。換…/或附加之胺基酸序列所構 (d)由序列識別號:31、32及33各具 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 。乂上冋一性 此處,(c)中胺基酸之改變數較佳為序 有1個。又,較佳為序列識別號:32中 二中 :更佳,又更佳為5個以内,再更佳為=二以 個以内,又更佳為2個或1個。又, 更仏為3 中有4個以内,以3個以内更佳,又=序列識別號:33 更佳。又,⑷之同一性二5:::為2、個以内,以1個 佳,又更佳為90%以上,更佳為95%以上。以8〇%以上更 又’本發明之抗體係具有以下L鏈互補性決 具有阻害因血液及/或aPC阻害物質使apc不活:之;用且 (:匕序歹"哉別號:24、25及34戶“己載。 構成之互補性決定區。 ^別所 (b)由序列識別號:24、25及34之任意保存性置換的胺 5 5774_PF(Nl);Chiumeow.ptd 第27頁 200407335 五、發明說明(25) 基酸序列所構成之互補性決定區。 (c)由序列識別號:24中5個以内、25中5個以 識別號:34之4個以内胺基酸有置換、缺失及/ 序列 基酸序列所構成之互補性決定區。 、17之胺 U)由序列識別號:24、25及34各具有70%以上 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 性 此處,(c)中胺基酸之改變數較佳為序列識別諕· 有4個,以3個以内更佳,又以2個以内更佳,再更^為中 個。又,較佳為序列識別號:25中有4個以内,以 更佳,又更佳為2個以内,再更佳為丨個。又,較佳為 識別號:3 4中有2個以内,以1個更佳。又,(d)之同二性^ 佳為75%以上,以80%以上更佳,又更佳為9〇%以上,更佳車乂 為以上。特別是以具有該等H鏈互補決定區與l鏈互^ 決定區兩者之抗體作為本發明抗體是較適當的。 本發明之抗體例如具有由DYSL fj (序列識別號:丨5 )、 WINTETGEPTYADDLKG(序列識別號:1 6)及GITLDY(序列識別 號:1 7 )之胺基酸序列所構成2CDR或與其為機能上同等之 CDR。與上述相同,各該胺基酸序列相當於抗體η鏈之 CDR1、CDR2及CDR3。該等抗體可期待與#281具有同等活 性。其為L鏈CDR時,較佳為KSSqSLLSSSNqKNFLA(序列識別 號:27)、SWASTRHSGVPD(序列識別號·· 28)及YYRYPLT(序列 識別號:2 9)之胺基酸序列所構成之CDR或與該等在機能上 為同等之CDR所組合者。 具體而言’本發明之抗體係具有以下Η鏈互補性決定
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區,且具有阻害因 作用。 血液及/或aPC阻害物質使aPC不活化之 m Λ (a)由序列識別號:15、16及17所記載之胺基酸 構成之互補性決定區。 妝丞馱序列所 I /b)由序列識別號:1 5、1 6及1 7之任意保存性置 基酸序列所構成之互補性決定區。 早存陡置換的胺 ^ ^ ε?Γ7 ",J 15 ^2 α ^16 ^ ^ ^ 4 ,j 基酸序列所構成u内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺 斤列所構成之互補性決定區。 匕處(c )中胺基酸之改變數較佳為序列識別號:丨5申 内 土又較仏為序列識別號·· 1 6中有7個以内,以6個以 個、 又更佳為5個以内,再更佳為4個以内,更佳為3: 、以内。又’較佳為序列識別號·· 17中有4個以内,以3個 L内更佳’又更佳為2個以内,以1個更佳。又,(d )之同 一性較佳為75%以上,以80%以上更佳,又更佳為9〇%以 上’更佳為9 5 %以上。 之序列識別號:15、16及17各具有70%以上同一性 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。^ 又’本發明之抗體係具有以下L鏈互補性決定區,且 具有阻害因血液及/或#〇阻害物質使apc不活化之作用。 (a) 由序列識別號:2 7、2 8及2 9所記載之胺基酸序列所 構成之互補性決定區。 (b) 由序列識別號:27、28及29之任意保存性置換的胺 基酸序列所構成之互補性決定區。
200407335 五 發明說明(27) 識別2識別號:27中8個以内、28中5個以内及序列 基酸序列所M ^以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺 」听構成之互補性決定區。 之胺基^酸由Λ列識別號·· 27、28及29各具有7〇%以上同一性 -序列所構成之互補性決定區。 有ΐ個1!\ (c)中胺基酸之改變數較佳為序列識別號:2 7中 個以内以3 f佳為6個以内’再更佳為5個以内’更佳為4 個。=技内更佳’又以2個以内更佳,再更佳為1 季又佳為序列識別號:28中有4個以内,以3個以内 4 w % ^更佳為2個以内,再更佳為1個。又,較佳為序列 =9:有2個以内,以丨個更佳。又,⑷之同 為95;。=姓以8〇%以上更佳,又更佳為9°%以上,更佳 ;.^ 特別是以具有該等H鏈互補決定區與L·鏈互補 决疋區兩者之抗體作為本發明抗體是較適當的。 4 本發明之抗體例如可為由序列識別號:1、2、3或 之可序列構成抗體Η鏈可㈣或與料具機能上同等 «之W/匕情形之[鏈,較佳為各序列識別號:5、6、7 :可:「序列構成之可變區或與具有與該等機能同等 U 則鍵組合者。具體而t,本發明之抗體係具有 以下Η鏈可變區,且呈有阻宝田a ^ aPC不活化^用。。因血液及/或心阻害物質使
槿U)由序列識別號:1、2、3或4所記載之胺基酸序列所 構成之可變區。 7 N W (b)由序列識別號:1、2、3或4之任意保存性置換的胺 2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第30頁 7或8之任意保存性j 五、發明說明(28) 基酸序列所構成之可變區。 (C)由序列識別號:;!、2、3或4中有】個或複數 置換、缺失及/或附加之胺基酸序列所構成之可變 (d)由序列識別號:1、2、3或4各具有7〇%以上 之胺基酸序列所構成之可變區。 此處,(c )中胺基酸之改變數較佳為3 〇個以内 個以内更佳,又更佳為20個以内,再更佳為15個〇 佳為10個以内,又更佳為5個以内。又,(d)之同一 為75%以上,以80%以上更佳’又更佳為9〇%以上, 以上。 又,本發明之抗體係具有以下L鏈可變區,且 害因血液及/或aPC阻害物質使81)(:不活化之作用。 U)由序列識別號:5、6、7或8所記載之胺 構成之可變區。 (b)由序列識別號:5、6 基酸序列所構成之可變區。 (C)由序列識別號:5、6、7或8中有】個或複數 置換、缺失及/或附加之胺基酸序列所構成之可變 /d)由序列識別號:5、6、7或8各具有7〇%以上 之基酸序列所構成之可變區。 此處,(c)中胺基酸之改變數較佳為3〇個以内 個以内更佳’ X更佳為20個以内,再更佳為15個以 佳為10個以内,又更佳為5個以内。又,(㈨之 為75%以±,以80%以上更佳’又更佳為9〇%以:二 胺基酸 區。 同一性 ,以25 内,更 性較佳 I佳為 I*有阻 序列所 換的胺 *基酸 I 〇 ί 一性 以25 内,吏 性較佳 L佳為 200407335
五、發明說明(29) 95%以上特別是具有該等H鏈可變區及L鏈可變區兩去 抗體作為本發明抗體是適當的。 々人改蜒胺基酸序列例如可合成編碼為改變胺 可變區之複數募㈣酸,並以該等為基礎以PG ^序列 為可'…酸。_其重組至適當的表現載體成以扁碼 ,:可:到具有所欲CDR之抗體。例如,在合成寡核苷酽 呀人鹼土混合,以製作編碼為在CDR特定位置上具有各二 胺基酸的抗體之去氧核糖核酸庫。由該基因士认 體。本發明係關於編碼為本發明抗體之核几 載體及寒有該核酸或該載體之宿主細胞。㈣; :核酸或為核糖核酉楚。載體可為質體、噬菌體、病毒二骰 公知的載體。宿主細胞包含細菌、酵母菌、昆心 細胞及哺乳動物細胞等。 植物 ▲本發明中,為使對人類之異種抗原性下降而以 變基因之重組型抗體可使用例如嵌合(chimeric)抗: 類化(humanized)抗體等。該等改變抗體可利用已豆古 ί: 巧:如有抗體之可變區及不變區互為異種 勺抗體例如,可為人以外之哺乳動物如小鼠抗 J、輕鏈'可變區與人類抗體之重鏈、輕鏈之不變區: $之抗體。該種抗體可利用將編碼為小鼠抗體可變區之 軋核糖核酸連結於編碼為人類抗體不變區之去氧= 並將其重組於表現載體中導入宿主來產生。 人’人·义 人類化抗體亦稱為再構成(reshaped)人類抗體,係以
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第32頁 200407335 五、發明說明(30) 人以外哺乳動物例如小鼠抗體等非人類抗體之重鏈或輕鏈 之互補性決定區(CDR;complementary determing region) 取代至人類抗體之互補性決定區者,其一般已知有基因重 組之方法(例如,參照j 0 n e s,e t a 1.,N a t u r e 321:522-525(1986); Reichmann et al·, Nature 332:323-329(1988); Presta Curr· Op· Struc. Biol. 2 : 5 93-5 9 6 ( 1 992 ))。具體而言,將設計使小鼠抗體CDR與 人類抗體框架區(framework region; FR)連結之去氧核糖 核酸序列以末端部分具有重疊部分之方式製作數個寡核苷 酸’依PCR合成。將所得到之去氧核糖核酸與編碼為人類 抗體不變區之去氧核糖核酸連結,再重組至表現載體,並 導入宿主’可產生該抗體(參照歐洲專利申請公開編號: EP2 3 940 0 ’國際專利申請公開編號w〇 96/〇2576號)。透過 CDR連結之人類抗體FR係選擇其互補性決定區形成良好抗 原結合部位者。人類化抗體可包含不含導入受體抗體之 CDR或框架序列任一者之胺基酸殘基。通常,導入該等胺 基酸殘基係為使抗體之抗原辯識·結合能力能更加正確最 適化而進行。亦可依需要,將抗體可變區之框架區胺基酸 置換’以使再構成抗體之互補性決定區形成適當抗原結合 區(Sato, K· et al·, cancer Res. (1993) 53, 851-856) 〇 又’取得人類抗體之方法為已知的。例如,於體外奴 淋巴球感作所欲之抗原或表現所欲抗原之細胞並將感作淋 巴球與人骨髓瘤細胞例如U 2 6 6融合,可得到具有對抗原結
2125-5774.PF(Nl);Chiume〇w.ptd 第33頁 200407335 五、發明說明(31) 合性之所欲人類抗體(參照特公平1 - 5 9 8 7 8 )。又,利用對 具有人類抗體基因之一部或全部之基因轉殖(Tg)動物以抗 原免疫,可取得所欲之人類抗體(參照Nature Geneties 7:13-21(1994); Nature Genetics 15:146- 156(1997)·
Nature 3 68:856-859 ( 1 9 94 );國際專利申請案公開編號w〇 93/12227 、W0 92/03918 、W0 94/02602 、W0 94/25585
W〇 96/340 96、WO 96/33735 )。該種Tg動物具體而言係利 用破壞非人類哺乳動物之内在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之 基因座,並透過酵母菌人工染色體(yeaM aM c=。; V )Λ體等導入人類免_ ^ ,基因座製作基因重組動物、基因剔 重鏈基因座之機能不活化例如可利用將 】又巴 (例如,C /Z區)來達成,而免产球 。V入】£或C區 機能不活化例如可在J區或C區又之,鍵(如,《鏈> 之 域導入障害來達成。 一 °卩或跨越J區或C區之區 再者,利用基因重組技術, 抗體重鏈及輕鏈之互補去t ^用、、扁碼為各該種人類化 核糖核酸之載體’“::::;;=為含該互補去氧 該抗體。此處,宿主例如 上:由培養上清中得到 再者’使用人類抗體庫,以 L。 已知。例如,可將人類技舻夕_王厅、取件抗體之技術亦為 抗體之可變區作㈣
200407335 五、發明說明(32) (s c F v ),並以噬菌體表現法表現於噬菌體表面上,以選擇 結合於噬菌體之抗原。若解析所選擇噬菌體之基因,可得 到編碼為結合於抗原之人類抗體可變區的去氧核糖核酸序 列。若能明白結合於抗原之scFv去氧核糖核酸序列,則可 製作具有該序列之適當表現載體,並利用導入適當宿主内 表現以取得人類抗體。該等方法已為公知,可參考仰 92/01047 、W0 92/20791 、W0 93/06213 、W0 93:11236 、 WO 93/ 1 9 1 72、W0 95/ 0 1 438、W0 9 5/ 1 5 388 實施。 一旦將抗體基因單離後’導入適當宿主以製作抗體時 可使用適當宿主與表現載體之組合。使用真核細胞作為宿 主% ’可使用動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞 例如有(1)哺乳類細胞,如CH0、COS、骨髓瘤細胞、 BHK(倉鼠胎兒腎臟細胞,baby hamster kidney)、HeLa、 V e r ο、( 2 )兩生類細胞,例如非洲爪蟾卵母細胞,或(3 )昆 蟲細胞,例如Sf 9、Sf21、Tn5等,或蠶等個體。植物細胞 例如有煙草屬(nicotiana),如於草(Nicotiana tabacum )由來之細胞,將該等進行癒傷組織培養即可。真菌細胞 為酵母菌例如啤酒酵母(S a c c h a r 〇 m y c e s )屬之啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae ),絲狀菌例如麴菌屬 (Aspergillus)之黑麴黴(Aspergillus niger)等。使用錄 核細胞時,有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞例如有大 腸桿菌(E· co 1 i)、枯草菌。利用將抗體基因以形質轉換導 入該等細胞中,可在體外培養已形質轉換之細胞而得到抗 體。
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第35頁 200407335 五、發明說明(33) 本發明抗體之同種型沒有限定,例如,有I gG ( I gG 1、 IgG2 、 IgG3 、 IgG4) 、 IgM 、 IgA(IgAl 、 IgA2) 、 IgD 或IgE 等,較佳者為IgG或I gM。又,本發明之抗體亦可為具有抗 體之抗原結合部之抗體片段或其修飾物。所謂「抗體片 段」係指全長抗體之一部分,一般,係包含抗原結合區或 可變區之片段。例如,有將Fab、F(ab’)2、Fv或重鏈及輕 鏈之Fv等抗體片段以適當連結子連結成單鏈Fv(scFv)、二 元體(diabody)、線狀抗體,及以抗體片段形成多特異性 抗體等。先前,抗體片段係以天然之抗體蛋白酶消化來製 造,但現在以基因工程表現重組抗體之方法亦為公知的 (參照Morimoto et al·, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992); Brennan et al., Science 229:81(1985); Co, M. S. et al., J. Immunol., 1994, 152, 2968-2976; Better, M. &
Horwitz, A· H. , Methods in Enzymo 1ogy, 1 9 8 9, 1 78, 476-496, Academic Press, Inc. ; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Acedemic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669; Bird, R. E. et al. , TIBTECH, 1991, 9, 132-137)。 「F v」片段為最小之抗體片段,其含有與完全抗原辨 識部位結合之部位。該區係1個重鏈及輕鏈之可變區以非 共價鍵強力連結之二元體(VH - VL二元體)。各可變區之3個 互補性決定區(C D R)彼此作用’並在VH - 二元體表面上形
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第36頁 200407335 五、發明說明(34) 成抗原結合部位。即,重鏈及輕鏈總共6個CDr具有作為抗 體之抗原結合部位的機能。但,已知即使1個可變區(或, 僅含有Fv之一半,即抗原特異3個CDR)較含有全結合部位 時親和力較低,但是,可以認識抗原,並具有結合能力。 故’本發明中雖抗體片段以F v為佳,但不限定於此,可為 含有可認識重鏈或輕鏈之CDR被保存之抗原,並具結合能 力之抗體片段多肽。 口口 又,Fab片段(亦稱為F(ab))進一步含有輕鏈之不變區 及重鏈之不變區(CH1)。例如,將抗體以木瓜酵素消化, 可生成稱為Fab片段,含有形成}個抗原結合部位之重鏈及 輕鏈可變區之抗原結合片段,及其餘易結晶化,稱為 Fc」之片|又。Fab片段因具有附加抗體鉸鏈區中】個或 更多半胱胺酸之來自重鏈CH1區羧基末端之故 與Fab片段以,但在其為含有形成1個抗原 原結合片段之點上,其構造上腸 使非’但與以木瓜酵素消化所得者為;J抗: 個抗原結合部位之重鏈及輕鏈可變區原片 抗體,“Η表示不變區之〗個或::;二又 :鉸鏈部之半胱胺酸中雙硫鍵切(斷來):== = 其他抗體片段亦為該行業者已釦 子性鍵、,、口之 化,則可得到具有2個抗原結合部位,並抗體以胃蛋/酶消 之Wb ^片長’及,殘餘之其他片段(稱為pFc,)。本發 第37頁 2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200407335 五、發明說明(35) 明中’以胃蛋白酶 >肖化得到之具有2個抗原結合部位並可 與抗原交差結合之抗體片段稱為類F ( a b ’)2片段。該等抗體 片段亦可利用例如重組技術製造。該等抗體片段亦可由噬 菌體抗體庫中單離。或,可由大腸桿菌等宿主直接回收 F(ab’)2-SH片段,以F(ab’)2片段之形態進行化學性鍵結 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167(1992)) > 再者,尚有別的方法,可直接由重組宿主培養物中單離 F(ab’)2 片段。 再者’本發明所使用之抗體亦可為多特異性抗體。多 特異性抗體係對至少2種類不同抗原具有特異性之抗體。 通¥ ’此種分子係結合2個抗原(即,二重特異性抗體 (bispecific antibody)),但本發明中「多特異性抗體」 包含對更多(例如,3種類)抗體具有特異性之抗體。多特 異性抗體可由全長構成之抗體或其抗體片段(如,F(ab,) 一特異性抗體)得㈣。:重特異性抗體可利用使2種類抗體 =重鏈與輕鏈(HL對)結合來製作,亦可將產生不同 體之融合瘤融合以製作產;i _舌批田a , ^ 衣#座生一重特異性抗體之融合細胞, 來得到(Millstein et al.,Natur^ 3 0 5:5 3 7-53 9 ( 1 983 ))。冉去 好 ’ 丹者,亦可以基因工程的手法掣作 二重特異性抗體。具體而古,,骆目女斗人^ j于,麦衣作 口 係將具有結合特異性之;辦 可變區融合於免疫球蛋白夕τt 體 社炎A A、产+疋人 白之不變區序列。該不變區序列較 佳為在免疫球蛋白之重赫 rH9 „riJQ ^ ^ ,里鍵不變區内,且至少含有鉸鏈、 CH2及CH3區之至少一部分。击丄 較佳者為尚含有與輕鍵结合所 必需之重鏈CH1區。將編碼失么—丄 否π〆、早工賦、口 口所 馬為免疫球蛋白重鏈融合體之去:
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氧核糖核酸及依需要編碼為免疫球蛋白輕鏈之去 酸插入至各別W現載!t,並^當宿主生物内 士 轉換。利用將各基因插人到各表現«,若各鏈之存^ 例不同時所得到之抗體收量會較冑,可調整各鏈之^ 例,但當然,亦可將編碼為複數鏈之基因插入於一個载: 二元體(diabody; Db)係指以基因融合所構築之二 抗體片段(P· Holliger et al., pr〇c. NaU. Acad 焉 SC1. USA 90:6444-6448(1993), EP4〇4〇97 號、 W〇93/n161號等)。一般,二元體係由二條;肽鏈所構 之一兀體,多肽鏈各自不同,同鏈中輕鏈可變區(、)及 鏈可變區(VH)係以5個殘基左右的連結區結合,彼此可姓人 部位很短。同一多肽鏈上編碼出之、及%因之間連結位I口 短,故無法形成單鏈V區片段而形成二元體,故二元體變 成具有2個抗原結合部位。此時,若對2個不同抗原u、b) 之VL與VH以VLa-VHb及VLb-VHa之組合同時表現以5個殘基左右 之連結位連結之形態時,會分泌2種特異性之Db。本發明 之抗體亦可為此種Db。 單鏈抗體(亦記為scFv)可利用將抗體之重鏈v區及輕 鏈V區連結以得到。ScFv總論可參照p 1 uckthun『The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies 』Vol. 11 3(Roseburg及Moore 編,Springer Verlag,New York PP2 69-3 1 5 ( 1 9 94 ))。單鏈抗體之製作方法在該行業為周知 者(例如,可參照美國專利第4 9 4 6 7 7 8號、美國專利第
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第39頁 200407335 五、發明說明(37) 526 0203號、美國專利第5〇91513號、 號等)。在該scFv中,重鏈㈣及輕鏈/區国專=545咖〇 佳為以多肽連結來連結(Hust〇 以乂連、、、。位,較
Nrj· AC"· S-· U —· l-S, 85 8δ3Γ0% 中重鏈V區及輕鏈¥區可來自同一抗體, 5883 ) °scFv 體二,結V區之肽連結可使用例如由12〜19二:A 抗 任意單鏈肽類。編碼為s c F V之去氧;^ ^ 成之 = 庠去1 氧核糖核酸中’以該等序列全部或編碼工 列之去氧核糖核酸部分作為模&,並在兩 部八之去負仿棰對利用PCR法增幅,再將編碼為肽類連結 及其兩端各自與規定之引子對組合並 二 於各重鏈、輕鏈。又,一旦製作了編碼為 cFv之去虱核糖核酸,可利用常法得到含有該恭 體及以該表現載體進行形質轉換之宿主,又,使^ 。可,常法得到scFv。該等抗體片段可以與前述樣 取:基因並由宿主表現產生。抗體之修飾物可使用 ϋ ^ 等各種分子結合之抗體。抗體修飾法在 ^員或中亦已被確立。本發明中「抗體」包含該等抗體。 所得到之抗體可以精製為均一。精製只要使用通常蛋 白=所使用之分離、精製方法即可。例如,可適當選擇層 析&柱、過濾膜、極限過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯 醯胺凝膠電泳.、等電點電泳等,並組合之’以分離、精製 抗體(Strategies for protein purification and i 2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第40頁 200407335 五、發明說明(38) characterizatiοπ I A laboratory course manual, Daniel R. Marshak et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988),但不限定於此。層析法可使 用如’親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過 濾、、逆相層析、吸附層析等。該等層析法中可使用HPLC或 FPLC等液相層析儀進行。用於親和性層析之管柱例如有蛋 白質A管柱、蛋白質(^管柱等。蛋白質a管柱例如有Hyper S,P0R0S,Sepharose F· F.(法瑪喜亞製)等。又,亦可 使用已固定化有抗原之載體,利用對抗原之結合性以精製 抗體。 本發明係提供本發明抗體、p C或a p c不活化之抑制 劑。又本發明係關於本發明抗體、PC或aPC不活化抑制劑 ^使用。利用使本發明抗體接觸pc 4aPC,可在pc〗或aat ,aPC阻害物質存在下,抑制PC或aPC不活化,及血液中Pc 或aPC之不活化。本發明係關於抑制該PC或aPC不活化之方 法,包含將本發明之aPC抗體接觸pc 4apc:的製程。投予本 發明抗體時’可單獨投予抗體,或亦可併用PC及/或aPC。 再者’亦可投予在體外以本發明抗體處理過之PC或aPC。 ,’本=明提供不活化被抑制之pc 4aPC製造方法,及以 方法‘ k之不活化被抑制之PC或#。,其中包含使本發 明抗體結合於PC或“(;之製程。 aPC已知具有抑制血液凝固及發炎的作用,利用投予
200407335 五、發明說明(39) Π:!#。非中和抗體,可使W抑制血液凝固及發炎之 效果k咼。本發明係關於血液凝 含投予本發明抗體之製程―古以:1 ^制万/夭包 PC及/或aPC之過程。此情形-步包含投: 體結合於PC及/或aPC並投f Μ ^ H 將本發明之抗 右# &八> π、+ a / 利用使用含有本發明抗體為 有效成刀之aPC不活化抑制@,可使在以^處置(例如, 血栓症及敗血症等預防與治療)中apc之效果提高。又,本 Π戶ΠίT以作為有效成分」係指含有本發明抗體 作為活性成/刀至 之-,並非限定本發明抗體之含有率。 本發明之抗體對於預防或治療因活化蛋白質c活性低落或 不足而引發之發炎及/或進展的疾病為有用的,苴中又以 預:方及/或治療因血液凝固反應宄進及/或發炎反應宄進所 怎起之疾病特別有效。該種疾病具體而言,例如有動脈血 栓症、靜脈血栓症、播種性血管内凝固(DissemiM忟廿
Intrvascular Coagulation; DIC)症候群、敗血症等。 又,本發明提供含有(a)本發明抗體及(b)pc及/或apc 之套組。该套組可使用於預防或治療因活化蛋白質c活性 低落或不足而引發之發炎及/或進展的疾病。再者',本發 明提供一種套組,其可使用於預防或治療因活化蛋白質^ 活性低落或不足而引發之發炎及/或進展的疾病,包含& 擇自PC、aPC及本發明抗體所構成群中任一者,及(^) 4己 治療有效蓋之PC及/或aPC與该抗體併用之記錄媒體或含有 連結至该記載之記錄媒體。該種疾病例如有如上述因血、夜 凝固反應亢進及/或發炎反應亢進所惹起之疾病,;具體而<
200407335 五、發明說明(40) 言,包含動脈血栓症、靜脈血栓症、播種性血管内凝固 (Disseminated Intrvascular Coagulation; DIC)症候 群、敗血症等。本套組因可使内因性aPC或由體外投予之 PC或aPC在體内活性相對上升,故為有用的,利用該等可 以對上述疾病進行預防及治療。記錄媒體例如有紙及塑膠 等印刷媒體、軟碟(f 1 e X i b 1 e d i s k )、光碟(c D)、數位影 音光碟(D V D)、半導體記憶體等電腦可讀取記錄媒體等所 浴人之圮錄媒體。典型上,例如有隨附於套件之指示書,在 此可將併用治療有效量之PC及/或3PC及抗體之事項予以記 載。連結係不直接將併用治療有效量之pc及/或&1>(:及抗體 之事項予以記載,而以箭號指向與該記载有關之事項,透 過該箭號可通往該記載。例如,指示書中有以參照另外書
5 之方式加以指示之記載,,亦包含在另外書面或URL 之方式有記載的情形。 本發明之抗體可利用經口或非經口任一者投予 劑型、婉列有注射劑型、經鼻投予 ^ t 、、工肺投予劑型、經皮投予劑刑笙 ..^ , 剎用轉喊命、+ & 久仅丁 M ^寻。注射劑型例如可 J用硭脈内注射、肌肉内注射、腹 對全身或局部投予。又,可依;:身"下主射專 田二予方法。投予量例如可在每次體重 擇、 〇· OOlmg〜l〇〇〇mg的範圍内 患者u〇lmg〜 1 0 0 0 0 0nig/b〇dy擇成例如曰,可以選擇每位 之抗體並不限制為該等投予量犯。圍之杈予1。但,本發明 本發明之抗體可依常法製 、1夕」如 5 Remington s
2125.5774.PF(Nl);Chiume〇w. ptd 第43頁 200407335 五、發明說明(41) ----
Pharmaceutical Science , Latest edition, Mark Publishing Company,Easton· U.S.A),亦可含有醫藥上 可容許載體及/或添加物。本發明係關於含有本發明抗體 及有醫藥上可容許載體及/或添加物之組合物(包括試藥及 醫藥)。例如,亦可含有界面活性劑(p E G、T w e e n等)、賦 形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等)、著色劑、香料、保存劑、 女定劑、緩衝劑(填酸、檸檬酸、其他有機酸等)、鏊合咧 (E D T A荨)、懸濁劑、等張劑、結合劑、崩壞劑、潤滑劑、 流動性促進劑、矯味劑等,但不限定無該等,亦可適^使 用其他常用載體。具體而言,例如有輕質無水石夕酸、乳 糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧曱基纖維素詞、繞甲 基纖維素鈉、經基丙基纖維素、經基丙基甲基纖維素、來 乙烯基縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯酮、明膠; 中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻油β 〇、白糖、魏 基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。又,亦可含有其他 低分子量多肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白 質、甘胺酸、谷醯胺、天冬醯胺、精醯胺及離胺酸等胺基 酸。製為注射用水溶液時,可為含有例如生理食鹽水、$ 萄糖或其他補助藥之等張液,如D-山梨糖醇、D-甘露糖、 D-甘露醇、氯化鈉等,亦可與適當溶解補助劑併用,如醇 類(乙醇等)、多元醇類(例如,丙二醇等)、非離子性界面 活性劑(聚山梨酸80、HCO-50)等。 : 又,依需要,本發明之抗體亦可置入微膠囊(羥基甲 基纖維素、澱粉、聚[甲基曱基丙烯酸]等微膠囊),或製
200407335 五、發明說明(42) 為膠體藥物傳遞系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳化 物、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照n R e m i n g t ο η ’ s Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo ed· ( 1 980 )n )。再者,製為緩釋型藥劑之方法亦為公知 的,可適用於本發明之抗體(Langer et al., J. Biomed. Mater· Res. 15: 167-277(1981); Langer, Chem· Tech. 1 2 : 98- 1 0 5 ( 1 982 );美國專利第377 3 9 1 9號;歐洲專利申請 案公開(EP)第58481 號;Sidman et al·, Biopolymeers 22:547-556(1983);EP 第133988 號) 又’亦可考量將編碼為本發明抗體之基因重組至基因 治療用載體,以進行基因治療。投予方法除了直接投予裸 露質體基因外,亦可利用包裝於微脂體等,或形成反轉錄 病毒載體、腺病毒載體、天花病毒載體、痘病毒載體載 體、腺伴隨病毒載體、HVJ載體等各種病毒載體(參照
Adolph「病毒基因體法」,CRC Press, Florid(1996)), 或被覆於膠體金粒子等顆粒載體(w〇9 3/ 1 770 6等)再投予。 但,只要能在生體内表現抗體並發揮作用,可用任意方法 才又予。較佳為以適當非經口途徑(靜脈内、腹腔内、皮 下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入或肌肉内進行 主射、注入或透過氣體誘導性粒子衝擊法(利用電子槍)、 ^鼻藥等透過黏膜的途徑)投以充足量。亦可在體外以微 =體轉染、粒子衝擊法(美國專利第4945 0 5 0號)或病毒感 染對細胞投予,並將該細胞再導入動物,以投予編碼為本 發明抗體之基因。
'PF(Nl);Chiumeow.ptd 第45頁 200407335
實施方式 (據以發明實施之最佳形態) 以下,對本發明依實施例更具體說明,但本發明不限 定於該等實施例。又’本說明書所引用之文獻全部包含^ 本說明書之一部分。 [實施例1 ]抗人類aPC抗體之製作 以aPC(Slgma,P-22 0 0 )在BALB/c小鼠腹部以皮下投予 進行免疫。確認血清抗體價上升,以20//g/m〇use抗原在 尾靜脈投予以作為最終免疫。於最終免疫的3日後將脾臟 摘出調整脾臟細胞後,與P3U1細胞融合,得到2648穴之融 合細胞。 以融合當曰作為第〇曰,在第1、2、3、5曰以HAT培養 基(含RPMI 1 640,1〇% FCS,0· 1%盤尼西林-鏈黴素,2% 乂 BM-Condimed H1及HAT)交換,並以HAT培養基進行融合瘤 之選別。於第8日回收培養上清並以EL丨s a進行1次篩選。 [實施例2 ] 1次篩選 1次篩選利用aPC(Sigma,P-22 0 0 )為抗原,以ELISA進 行。將aPC 以覆膜緩衝液(i〇〇mm〇i/L NaHC03,ρΗ9·6, 0-02w/v% NaN3)稀釋為〇.5//g/ml之濃度後,每穴各分注 1〇〇 " 1/we 1 1 於EL ISA 用 96 孔平盤(Nunc,Maxi sorp)並固 化。將平盤以微平盤清洗液清洗器(B i 〇 r a d,Μ o d e 1 1 5 5 0 ) 以潤洗緩衝液(PBS(-),〇· 05% Tween 20))洗淨,再以每 穴添加稀釋緩衝液(1 w/v% BSA,50 mmol/1,Tris-HC1
200407335 五、發明說明(44) pH8.1,150mmol/ NaGl,lmmol/1 MgGl2,0.05% 1Tween20, 0.02% w/v% NaN3 )200 //l/well並於室溫下放置1小時。除 去稀釋緩衝液後’每穴添加1 0 0 // 1 / w e 1 1融合瘤培養上 清’並於室溫下反應1小時。將平盤以潤洗緩衝液洗淨, 並在每穴添加1 0 0 // 1 / we 1 1鹼性鱗解酶標記抗小鼠I gG抗體 (Zymed 6 2-6 5 22 ),於室溫下放置1小時。將平盤以潤洗緩 衝液洗淨,並在每穴添加以基質緩衝液(5〇 mm〇i/i NaHC03,ρΗ9· 8, 10mmol/MgCl2)調製為img/mi 之基質(對确 基本基碟酸"一納)(Sigma 104)100 #l/well,於1小時後 測定 0 D 4 0 5 / 6 5 5 n m。 以可對aPC結合之市售抗aPC抗體(Sigma P7058 )作為 陽性對照。當培養上清之吸光度較陽性對照濃度為 lllng/ml所示之吸光度為高時,則當成陽性。對2648穴的 融合瘤培養上清進行探討的結果,選出3 〇 8個穴為陽性。 [實施例3 ] 2次篩選 a PC具有因抗凝固作用使血漿凝固時間延長的作用, 但因aPC在血漿中會經時而被不活化,故與血漿溫育之時 間越長其作用會減弱。抗體若具有抑制此apC不活化之作 用’則利用在與血漿溫育前加入apC,可保持aPC之凝固作 用。反之,若抗體具有中和aPC之作用,貝彳aPC的抗凝固作 用會喪失。此處,以APTT(活化部分活酶時間)作為凝固時 間指標,探討比融合瘤上清抑制a P C不活化作用。 將10/^/1111之3?(:(3丨2腿,?-2 2〇〇)溶液10//1與融合 瘤培養上清(3 7 C ’ 5 %二氧化碳培養3曰)或p 3 u丨之培養上
200407335 五、發明說明(45) 清混合,於室溫下溫育6 0分鐘。添加人類標準血漿(DADE BEHRUNG,GCH-100A)50//1於此混合液,再於室溫下溫育 60分鐘。安裝於血液凝固自動測定裝置(Anielung, KC-10A)並添加 APTT 試藥(DADE,BEHRING,GAA-2 0 0A)50// 1。。不與血槳溫育iaPC於添加Αρττ試藥前加入血漿中。於 37 C下溫育3分鐘後,添加2〇_〇1/1 CaCl2(DADE, BEMIWG,GMZ-310)50 # 1,並測定到凝固所花的時間。 1 η η。/以加上述不與血漿溫育之aPC之凝固時間(A)為 凝固時間⑻為由^ ^在與血漿溫育後加入心之 育後加入aPC之凝固日由夸,門;1 )合七瘤培養上清溫育後與血漿溫 間延長的作用(不、、 间W )求出對融合瘤培養上清凝固時 實驗進行2攻^每化抑制率(%) = {(C —β)/(Α —Β)χ 100丨)。 固時間回復(延長)者a 久^ 在2次都認為有2 0 %以上凝 定為陽性。 & *成陽性。有1 9株融合瘤培養上清認
200407335 五、發明說明(46) 表1 穴編號 不活化抑制率(%) 貢驗1 實驗2 19 36.83 20.48 41 46.81 55.49 50 23.74 21.14 64 45.70 32.02 79 87.96 68.33 123 23.45 20.68 143 25.27 34.10 172 25.52 58.64 181 26.22 33.66 192 21.36 30.18 223 26.87 22.92 236 24.56 21.66 240 22.18 22.19 243 21.25 27.87 263 21.00 27.96 281 33.82 21.64 285 24.50 28.23 298 32.29 27.19 302 27.30 20.75 [實施例4]抗體精製及因PCI對aPC不活化之作用探討 將穴編號19、41、64、79、281、298之融合瘤以含 10%超低IgG FCS HAT培養基培養後之培養上清以蛋白質G 管柱精製出IgG劃分,並以低分子基質測定PCI對aPC不活 化之作用。 具體而言,回收以10%超低IgG FCS HAT培養基50ml培 養後之融合瘤培養上清。將培養上清吸附於蛋白質G管柱 (Amersham Pharmacia Biotech , Hi十rpn
ulLrap protein G column)。以結合緩衝液(20關ol/丨磷酸緩衝液pH7 〇)l〇ml
200407335 五、發明說明(47) 洗淨後,以提取緩衝液(O.lmol/1甘胺酸緩衝液pH2.7)溶 出。將回收之IgG劃分以Centr iprep(密里博,YM-30)濃縮 後,將緩衝液置換為TBS。將所得到之IgG劃分40 // 1與1 0 // g/ml之aPC溶液1 〇 // 1於室溫下反應60分鐘。將apc與抗 體之混合液50 // 1加入含肝素10U之緩衝液(最終濃 度:70mmol/l Tris ρΗ8·0,125mmol/l NaCl,l〇mmol/l CaCl2, 0.1% BSA) ’ 使成180/zl。添加10〇#g/nil 重組 PCI (附Flag標記)溶液2 0 // 1,並於37 °C下反應30分鐘。添 加低分子基質S-2366(2mmol/l)50//l,並測定50分鐘後的 吸光度(405nm)。 表2 19 41 64 79 281 298 -PCI 0.278 0.303 0.325 0.304 0.357 0.345 0.270 0.690 0.245 0.301 0.308 0.316 0.356 0.330 0.221 0.724 平均 0.262 0.302 0.317 0.310 0.357 0.338 0.248 0.707 aPC活性(%) 0.00 9.09 12.35 10.89 21.32 17.06 (-3.59) 100.00 未添加PCI之aPC(表中之” _PCI”)吸光度為〇. 70 7,但 添加PCI者,減少到〇· 262 (表中之1,對照”)。將添加PCi時 aPC活性當成0%,未添加pc I時aPC活性當成1 〇 〇%時,以吸 光度平均值為基準求出各融合瘤由來抗體之相對活性時, 穴編號7 9為21%,281為17%,41為12%,因PCI抑制了apc不 活化。元全;又有抑制a P C不活化之2 9 8,其培養上清之同種 型顯示可能為I gG。故,可能以I gG精製無法得到活性劃 分。利用以上精製抗體及低分子基質之發色試驗,可以明 白具有血漿凝固時間延長作用之aPC不活化抑制抗體亦可
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第 50 頁 200407335 五、發明說明(48) 抑制因PCI造成的不活化。 [實施例5 ]抗aPC不活化抑制抗體之Η鏈及L鏈解析 以雷恩簡易工場迷你套組(R n e a s y Ρ 1 a n t M i n i K i t s ) (QIAGEN,Cat No. 74904 )對產生各抗體之融合瘤約1χΐ〇7 個細胞進行總核糖核酸之萃取。用聰明雷司互補去氧核糖 核酸增幅套組(SMART RACE cDNA Amplification kit)(Clonetech,Cat. No. K1811-1),由總核糖核酸進 行互補去氧核糖核酸之合成。以#281、#285之IgGl不變區 特異引子或#79、#123之IgG2不變區特異引子以愛得萬提 吉2聚合酶連鎖反應套組(Advantage 2 PCR kit)以 5’ -RACE進行PCR,使Η鏈及L鏈增幅。將增幅之Η鏈及L鏈去 氧核糖核酸片段以pGEM-Τ簡易載體(easy vector)(Promega,Cat. No· A 1 5 6 0 )選殖,以決定鹼基序 列。 將所得到之鹼基序列進行解析的結果,發現Η鏈及L鏈 之可變區胺基酸序列各如第1圖所示。因#123及#285具有 類似序列,故推測此2個選殖體彼此的抗原決定基很接 近。 產業上之可利用性 本發明提供可抑制aPC不活化之非中和a PC抗體。本發 明之抗體係透過抑制apC不活化以維持aPC活性,具有抑制 血液凝固系之活化或持續aPC之抗發炎等生理活性效果。 本發明之抗體可使用於預防或治療因活化蛋白質C活性低:
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200407335
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第52頁 200407335 圖式簡單說明 第1圖表示抑制aPC不活化之抗apc抗體其Η鏈及L鏈可 變區之胺基酸序列。圖中aPC#79、aPC#123、aPC#281及 aPC#28 5之VH區胺基酸序列各為序列識別號:丨〜4, aPC#79、aPC#123、apc#281 及 aPC#285 之 VL 區胺基酸序 各為序列識別號:5〜8。 %
2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第53頁
Claims (1)
- 200407335 六 申請專利範圍 1· 一種抗蛋白質c或抗 具有增強生體中活化舌化蛋白質C(aPC)之抗體,其 2· —種抗蛋白質c貝j作用之活性。 制生體中活化蛋白質=几/化蛋白質C之抗體,其具有抑 3 —插钤1人 活化之活性。 1 種抗蛋白質C或抗、、*儿讲 制(a)以血液使活化蛋蛋白質C之抗體,其具有抑 之生理阻害物質使活貝不活化,或(b)以活化蛋白質C 上兩者之活性。 質c不活化,或具有可抑制以 4 ·如申清專利範圚 生理阻害物質為絲胺酸I 、之抗體,其中活化蛋白質C之5. 如申請專利範圍^:,劑_ 抑制劑(SERPINs)為蛋白併Γ .之几體,其中絲胺酸蛋白酶 6. 如申請專利範圍第貝&抑項帝劑一或α 1抗騰蛋白酶。 (a)〜(f)任一胺基酸序列構成亙之抗體,係由以下 上為同等之互補決定區'構成互補決定區或具有與其機能 (b )序列識別號:2 ! (c )序列識別號:3 1 (d )序列識別號:2 4 (e )序列識別號:1 5 (f )序列識別號:2 7 序列識別號:9 ^川所記載之胺基酸序列, 、2 2及2 3所記載之胺基酸序列, 、3 2及3 3所記載之胺基酸序列, 、2 5及3 4所記載之胺基酸序列, 、1 6及1 7所兄載之胺基酸序列, 〜…^28及29所記載之胺基酸序列。 、>,·如申請專利範圍第1〜3項任一項之抗體,係擇自由 人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體片段/單鏈抗 及二元體所組成之族群。 一2125-5774. ^P(Nl);Chiumeow.ptd200407335 六、申請專利範圍 8 · —種組合物,冬 之抗體及藥學上可容許之載明專利範園第丨〜3項任一項 9·如申請專利範圍第8 _。 /或活化蛋白質C。 、之組合物,尚含有蛋白質C及 10·如申請專利範圍第8項 於預防或治療因活化蛋白晰、弟9項之組合物,係使用 及/或進展之疾病。白貝C活性低下或不足所導致發病 11.如申請專利範圍第1〇項之 指因血液凝固反應亢進及、、、、口物,其中該疾病係 病。 及/或發炎反應完進所引發的疾 12·如申請專利範圍第 反應宄進及/或發炎反庫完谁j之組合物,其中血液凝固 症、德鍤卜4 A — βπ β %、几進所引發的疾病係擇自由敗血 症、播種性血官内凝固症候 所組成之族群。 正候群、動脈血栓症及靜脈血栓症 、“13·—種不活化被抑制之蛋白質C或活化蛋白質C的製 L法’其中包括使申請專利範圍第1〜3項任一項之抗體 接觸蛋白質C或活化蛋白質c之步驟。 14· 一種預防或治療因活化蛋白質c活性低下或不足導 致發病及/或進展之疾病的方法,包括投予u)蛋白質“戈 ^化蛋白質C及(b)巾請專利範圍第卜3項任一項抗體之步 1 5. —種預防或治療因活化蛋白質c活性低下或不足導 :發病及/或進展之疾病的套組,包括⑷蛋白質c或活化 蛋白質C及擇自申請專利範圍第卜3項任一項之抗體所組成200407335 六、申請專利範圍 之族群中至少一種,及(b)包括關於治療有效量之蛋白質C 及/或活化蛋白質C與該抗體併用之記載或含連結至該記載 之記錄媒體。2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第56頁
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