TWI322814B - - Google Patents

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五、發明說明（1) 發明所屬之技術領域

本發明係關於活化蛋g P 4 A 贫白質C之非中和抗體。 先前技術 下肢關節置換術或開腹 很高》目前對此之治療主要:血栓症的頻率 (Warfarin)預防。但是八' -刀肝素及沃法林 而沃法林雖為經口投服，素需要連日皮下投藥， 他藥物產生相互作用，故；=結合率非常高，會與其 藥物都會產生出血的傾m::制。且’任-者的 且不會產生出血傾向的抗血此有可長時間持續作用 # ά 1% w π π Γ 樂，則可利用在剛手術後及 又予，以預防血拴並提高患者之生活品質 ^ „匕扪血拴症，特別是能長時間持續作用 之抗血栓樂，其開發也是被期待的。 血栓係因血小板與血液凝固系統活化所形成，一般認 為動脈血栓主要為血小板、靜脈血栓主要為凝固系在作 用。當血液凝固系活化生成凝血酵素（thr〇mbin)，以構 成血栓網^體纖維蛋白（flbrin)時，會與存在於血管内 皮上之攜凝血酵素（thrombomodulin)結合並改變性質， 使蛋白質C(Pr〇tein C; PC)活化。被活化之PC(activated protein C;aPC)可作為蛋白質s(pr〇tein s)之輔酶，使第 5a因子（Factor Va)及第8a因子（Factor Villa)不活化並

往抑制凝固系迴轉的方向進行。又，aPC尚具有抑制 PAI-I(Plasminogen Activator Inhibitor-1) A 2125-5774-PF(Nl);Chiurne〇w.ptd 第4頁 1322814 五、發明說明（2) TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor) 等纖溶阻害物質之作用，可以促進纖溶系》故，PC與apc 被認為具有對活化血液凝固系進行負回饋控制之重要作 用，實際上，因為先天性PC缺乏症或因第5a因子變異所產 生之aPC不應症係血栓症之發現因子之一，故apc被認為對 於血栓症之治療與預防是有效的。 另外，敗血症到目前為止並無有效的藥劑，但最近有 重組a P C對治療敗血症有效的報告（N. E n g 1. J. M e cL 2 00 1， 344:699-709 )。又，亦有關於apc可作用於血管内 皮並具有抗發炎作用的報告（J. Biol. Chem. 2001，276: 1 1 1 9 9 - 1 1 2 0 3 )，且在敗血症模式中，亦有關於除可抑制凝 血酶產生之外，尚可發揮抗發炎作用之報告（J. Clin. Invest· 1987， 79:918-25)。 但，因為aPC在血液中半衰期只有20〜30分鐘，很短， 故必需於靜脈内持續投予或長期連續投予。半衰期短的原 因係因為aPC會被生體内之生理阻害物質即蛋白質c抑制劑 (Protein C Inhibitor; PCI)或 αΐ 抗胰蛋白酶（α 1 -ant i tryps i η ; ΑΑΤ)被不可逆的不活化。又，即使將apc 之前驅體PC製劑化’在生體内的半衰期仍僅有6〜8小時這 麼短’仍需持續或多次投予，在醫療經濟學上是不夠有效 率的。 發明内容 (發明之揭示）

2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第5頁 1322814 五、發明說明（3) 由前述，因aPC具有企液凝固系迴饋的 成及作用限定於凝固系已活化之局部部分。因 故其生 aPC進行全身投予時’必需在必需的局部供认之外若以 持續投予以補充不活化所消耗的部分。。At、Γ ’大量 因性生成aPC作用之藥劑，則因|作用 此増強局部内

w丹1下用限定且通I 本身不會被消耗’可以少量且單次投予下就能持續作樂： 較有效…本發明人等對於能抑制apc不活化並-延作用， 衰期作用以增強内因性aPC作用之藥劑進行開發。 干

為此’本發明人等對可產生抗aPC單株抗體之融合瘤 進行選殖。並以大規模篩選融合瘤，並篩選血液中可以"抑 制aPC不活性化之抗體’結果成功的單離出可以強烈抑制 a PC不活性化之aPC抗體。該等抗體確認尚可抑制因pci所 產生之aPC不活化。本發明之抗體因係透過抑制#(^不活化 而抑制企液凝固糸之作用’對於血拾症治療及預防上極為 有用。又’本發明之抗體在敗血症治療上可作為治療藥 劑，可與aPC併用或單獨使用’藉抑制血中aPC不活化以增 強aPC作用。 即，本發明係關於抑制aPC不活化之抗apc抗體及其利 用，更具體的說： (1)係一種抗蛋白質C或抗活化蛋白質c( apc)之抗體，| 其具有增強生體中活化蛋白質C作用之活性》 (2 ) —種抗蛋白質C或抗活化蛋白質c之抗體，其具有： 抑制生體中活化蛋白質C不活化之活性。 (3) —種抗蛋白質C或抗活化蛋白質c之抗體，其具有

2125-5774-PF(Nl)；Chiumeow.ptd 第6頁 1322814 五、發明說明（4) 抑制（a)因血液使活化蛋白質C不活化，或（b)因活化蛋白 質C之生理阻害物質使活化蛋白質C不活化，或具有可抑制 以上兩者之活性。 (4 )如第（3 )項之抗體，其中活化蛋白質C之生理阻害 物質為絲胺酸蛋白酶抑制劑（S E R P I N s )。 (5 )如第（4 )項之抗體，其中絲胺酸蛋白酶抑制劑 (SERPINs)為蛋白質C抑制劑或α 1抗胰蛋白酶。 (6 )如第（1)〜（3 )任一項之抗體，係由以下（a)〜（f )任 一胺基酸序列構成互補決定區或具有與其機能上為同等之 互補決定區。 (a) 序列識別號：9 ’ (b) 序列識別號：2 1 (c )序列識別號：3 1 (d)序列識別號：2 4 (e )序列識別號：1 5 (f )序列識別號：2 7 (7 )如第（1 )〜（3 )任 1 0及11所記載之胺基酸序列， 、2 2及2 3所記載之胺基酸序列， 、3 2及3 3所記載之胺基酸序列， 、2 5及3 4所記載之胺基酸序列， 、1 6及1 7所記載之胺基酸序列， 、2 8及2 9所記載之胺基酸序列， —項之抗體，係擇自由人類抗體、 人類化抗體、嵌合抗體、抗體片段、單鏈抗體及二元體所 組成之族群。 (8) —種組合物，含有如第（1)〜（3)任一項之抗體及藥 學上可容許之載體。 (9) 如（8)之組合物，尚含有蛋白質C及/或活化蛋白質

C (1 0 )如（8 )或（9 )之組合物，係使用於預防或治療因活

2125-5"74-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第7頁 1322814 五、發明說明（5) 化蛋白質C活性低下或不足所導致之發病及/或進展之疾 病。 (1 1 )如（1 0 )之組合物，其中之疾病係指因血液凝固反 應亢進及/或發炎反應亢進所引發的疾病。 (12)如（11)之組合物，其中如液凝固反應亢進及/或 發炎反應亢進所引發的疾病係擇自由敗血症、播種性血管 内凝固症候群、動脈J&L检症及靜旅血栓症所組成之族群。

(1 3 ) —種不活化被抑制之蛋白質C或活化蛋白質c的製 造方法’其中包括使第（1)〜（3)任一項之抗體接觸蛋白質C 或活化蛋白質C之製程。 (1 4) 一種預防或治療因活化蛋白質c活性低下或不足 導致發病及/或進展之疾病的方法，包括投予（a)蛋白質c 或活化蛋白質C及（b)第（1)〜（3)任一項之抗體之製程。 (1 5) —種預防或治療因活化蛋白質c活性低下或不足 導致發病及/或進展之疾病的套組，包括（a)蛋白質c或活 化蛋白質C及擇自第（1)〜（3 )任一項之抗體所構成群中至少 一種’及（b)包括關於治療有效量之蛋白質c及/或活化蛋 白質C與該抗體併用之記載或連結至該記載之記錄媒體。

本發明係提供可抑制aPC不活化並延長半衰期之apc非 中和抗體。本發明者發現在aPC非中和抗體中，存在有能 防止因金中PCI或AAT使a PC之抗血液凝固作用不活化並使 aPC在生體内壽命延長並增強活性之抗體《此處之3pC不活 化係指aPC在生物學上活性低下或喪失。具體上，aPC之不 活化係指因血液或p C I或A A T等生體内之生理阻害物質使

丄

aPC被不可逆性的不活化。具體上’例如有，ap(：之抗血液* 凝固作用被不活化。aPC可因例如被溫育於血聚中而不活“ 化或，因與PCI或AAT等生體内之生理阻害物質接觸亦可 使其不活化。本發明之抗體係可抑制因血漿及/或apc之生 理阻害物質（PCI)等所導致之aPC不活化。若使用本發明抗 體可抑制生體内之aPC不活化，並使生體内之活化蛋白 質C作用較沒有抗體時相對上增強。因aPC不活化之抗體所 士生之抑制作用可利用實施例所記載之方法或其他方法測 心。具體上，將受測抗體與a p C 一起溫育，之後（或同時） 將该aPC與血漿或PCI等aPC阻害物質溫育後，測定aPC之活 性。以未與該抗體溫育並和血漿或p c I等a p匚阻害物質溫育<I 之aPC作為對照，能使apc不活化程度減少之抗體則判斷為 具有抑制aPC不活化之活性。apc之活性，例如抗血液凝固 作用’可利用公知的方法，測定如APTT(活化部分凝血活 酶時間，activated partial thromboplastin time)以定 量。或亦可使用發色基質pyr〇Glu-pro-Arg-pNA . HC1 (S- 2 3 6 6 )等低分子量化合物分析apc之活性。 a P C之生理阻害物質例如有絲胺酸蛋白酶抑制劑 (SERPINs)，特別是蛋白質C抑制劑（PCI, Suzuki, K. et al., J. Biol. Chem. 1983, 258:163-168; Suzuki, K.,

Fibrinolysis Proteolysis 2000, 14:133-145 Suzuki, K. et al., J. Biol. Chem. 1987, 262:611-616;

Zechmeister-Machhart, M. et al., Gene, 186, 61-66, 1997; Wakita, T. et al., FEBS Lett., 429, 263-268,

：：25-5774-?F(Nl);Chiumeow.pid

1322814 五、發明說明（7) 1998; Yuasa, J. et al., Thromb. Haemost. 83, 262-267，2000 )及 al 抗胰蛋白酶（AAT, Heeb, M.J. and Griffin, J. H. , J. Biol. Chem. 1 988, 263:11613-11616)。 又，本發明係對抗aPC之抗體，係提供可利用以下 (i)、（ i i )製程所得到之抗體， i)以是否結合於對抗aPC之抗體以測定aPC因血液之不 活化，

i i)利用與不會結合於該抗體之aPC比較，選擇與該抗 體結合之可抑制aPC不活化之抗體。 又’本發明係對抗aPC之抗體，係提供可利用以下 (i )、（ i i)製程所得到之抗體， i)以是否結合於對抗aPC之抗體以測定aPC因aPC不活 化因子之不活化， i i)利用與不會結合於該抗體之aPC比較，選擇與該抗 體結合之可抑制aPC不活化之抗體。

血液可為全血或血锻。又，aPC不活化因子例如有apc 之生理阻害物質’例如PCI及A AT。欲使對抗aPC抗體結合 於a PC時’可利用使兩者共存於溶液中例如將含有兩者之 溶液溫育5分鐘〜數小時’例如1小時左右即可。ape因血液 或aPC不活化因子而不活化可利用使以匸與赢液或以匸阻害 物質共存以實施’例如，將含有兩者之溶液溫育5分鐘〜數 小時，例如1小時左右即可。 本發明之抗a PC抗體可為單株抗體（含全長單株抗

2125-5774-PF(N]) ;Chiumeow.ptd 第10頁 1322814 五、發明說明（8) 體）、多株抗體或該等之變異體。以可安定化生產均質抗 體的角度上，以單株抗體較佳。

本發明中之「單株抗體」為實質上均質的集團，即， 組成集團之各別抗體係指除因天然所產生而存在少量變異 體以外係由均一之抗體集團所得到之抗體。單株抗體為高 度特異性’係對單一之抗原部位作用◎再者，與典型上含 有對抗不同抗原決定基（epi tope)之不同抗體的慣用多株 抗體調製物比較，各單株抗體可對應於抗原上之單一抗原 決定基。除其特異性以外，單株抗體具有可以利用不會被 其他免疫球蛋白污染之融合瘤培養方式合成的優點。所謂 「單株」之修飾語係表示其係由實質上均一抗體之集團得 到之抗體特性’並非限定抗體需由特定方法製造。例如， 本發明使用之單株抗體可利用融合瘤法（Kohler and

Milstein，Nature 256:496( 1 975))或重組方法（美國專利 第4 8 1 6 5 6 7號）製造。本發明所使用之單株抗體亦可由噬菌 體抗體庫單離（Clackson et al.，Nature 352:624-628(1991))；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:58卜597( 1 99 1 ))。本發明之單株抗體包含嵌合抗體 (免疫球蛋白）、抗體變異體及抗體片段（美國專利第

4816567號；Morrison et al.， pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:685 1 -6855( 1 984 )) ’特別是重鏈(^鏈）及/或輕鏈 (L鏈）之一部分係為特定種類或來自特定之抗體分類或次 分類’而鏈之其餘部分係別的種類或來自別的抗體分類或 次分類之嵌合抗體。

1322814 五、發明說明（9) 本發明中「抗體變異體j係指抗體之胺基酸序列變異 體，其中有1或以上之胺基酸殘基被改變。例如，可將抗 體之可變區改變，.以改善與抗原之結合性等抗體生物學辞 性。此種改變可利用部位特異之變異（參照Kunkel，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488(1985)) 、PCR 變異、盒式 變異等方法進行。此種變異體在抗體之重鏈或輕鏈之可變 區的胺基酸序列具有至少7 0 %之同一性，較佳為至少7 5 %， 又較佳為至少80%，更佳為至少85%，又更佳為至少90%， 而最佳為至少有9 5%之同一性。本說明書中序列之同一性 係將使序列同一性能最大之方式使序列依需要整列化並導 入適當缺口後，與原來抗體之胺基酸序列之殘基中為同一 殘基之比例來定義。 ' ’： 具體而言，鹼基序列及胺基酸序列之同一性可利用卡 林及歐茲爾所發展之演算法BLAST(Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 90:5873-58 77， 1 993 )決定。依照該演算法，開 發 了稱為 BLASTN 及 BLASTX 之程式（Altschul et al.，J. Mol. Biol. 2 1 5:403-4 1 0，1 9 90 )。依照 BLAST 利用 BLASTN 解析驗基序列時，參數可設定為例如s c o r e = 1 0 0， wordlength=12。又，依照BLAST利用BLASTX解析鹼基序列 時，參數可設定為例如score = 50，wordlength = 3。使用 BLAST及缺口 BLAST程式時，使用各程式之預設值。該等解 析方法之具體手法係公知的（參照MCBI (National Center for Biotechnology Information))之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)之網站；http://www.ncbi.nlm·

2125-5774-PF(N!);Chiumeow.ptd 第12頁 1322814 五、發明說明（ίο) n ih.gov) ° 多株抗體及單株抗體可利用該行業周知的方法製作。 例如，可利用如下之方法製作。 動物免疫所使用之aPC例如有利用重組去氧核糖核酸 法或化學合成所調製之aPC胺基酸序列之全部或一部之肽 類等。人類及其他哺乳動物之aPC胺基酸序列為公知的 (Mather, T. et al., EMBO J. 15:6822-6831(1996)； Foster, D. C. , Proc. Natl. Acad. Sci. 82:4673-4677(1985)) » 例如，可使用市售之apc(pr〇tein C act i vated，來自人類血漿，S I GMA，#P2200 )作為抗 原。抗原可使用aPC或其部分肽類本身，亦可將其結合於 載體蛋白並進行免疫。使用載體蛋白時，例如，將作為抗 原之aPC結合於載體蛋白質（例如，曱狀腺球蛋白 (Thy rog 1 obii 1 i η ))後’添加佐劑。佐劑例如有佛洛依德 完全佐劑、佛洛依德不完全佐劑等，亦可將該尊一曰 /哥任 '.一作匕 合0 將以上述方式得到之抗原投予給哺乳動物，例如， 鼠、大鼠、倉鼠、土撥鼠、馬、猴、兔、山羊、羊等。 疫可使用既存之任意方法’主要以靜脈内注射、$ ^注

射、腹腔内注射等方法進行。又，免痛之門眩 入兄叔之間隔不特別限 定，為數日至數週間隔’較佳以4〜21日之間隔進彳_ 抗原蛋白質之免疫量對每隻小鼠每次可為例如1〇二=义 g(可為20〜40"g)，但不限定於此。 β 於初次免疫前及第2次以後之免疫起第3〜7

曰後由動物

2j25-5774-F¥(N1 )；Chiumeow.ptd 第13頁 1322814 五'發明說明（11) 採血’並分析血液中之抗體力價。又，為擴大免疫應答， 較佳為使用明蓉等凝集劑。選用之哺乳動物抗體通常為對. 於抗原具有十分強結合親和性者。抗體之親和性可利用飽 和結合、酵素結合免疫吸附檢定法（EL IS A)及競合分析（例 如，放射性免疫分析）來決定。 多株抗體之篩選法例如可利用如抗體，實驗室手冊 (Antibodies, A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Labortoriey, Larlow and David Land Edit. (1 9 8 8 ))所記載之慣用的交差結合分析進行。或，亦可使 用抗原決定基與圖（epitope mapping(Champe et al.，j

Biol. Chem. 270:1 388- 1 394( 1 995 ))進行。測定多肽或技 體效力之方法較佳者為使用抗體親和性定量化之方法，值 除此之外其他態樣包括，不使用結合親和性測定而對抗體 之一種或更多生物學特性進行評價之方法。該種方法因可 特別表示出抗體在治療上之有效性，故為有用的。通常作 非絕對’在此種分析中表示有改善特性之抗體其結合親和 性亦會增加。

單株抗體調製時融合瘤之製作可依例如米魯思帖等人 (Kohler, G. , and Mi 1s te i n, C. , Methods Enzymol, 1981，73，3-46)之方法進行。與抗體產生細胞融合之％ 髓瘤細胞可使用來自小鼠、大鼠、人等各種動物並且為該 行業人員一般可取得之株化細胞》使用之細胞株係使用^ 有藥劑抵抗性且具有於未融合狀態下無法生存於選擇性拉 養基（如HAT培養基）而僅在融合狀態下才可生存之性質 °

2l25-5774-PF(Nl) ;Chiume〇w.ptd 第14頁 1322814 五、發明說明（12) 者。一般使用8 -偶氮烏嘌呤耐性株’該細胞株欠缺次黃嘌 呤核苷-鳥嘌呤-磷酸核酸轉移酶，無法在次黃嘌呤·氨甲 蝶呤.胸腺嘧啶（HAT)培養基内生存。骨髓瘤細胞適用者 有各種公知的細胞株，如P3x63Ag8.653(J. Immunol. ( 1979 ) 1 23:1 548-1 550 ) 'P3x63Ag8U. 1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7)、 NS-l(Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6:511-519) ' MPC-11(Margu1ies, D. H. et al., Cell( 1 976 ) 8:405-4 1 5 ) ' SP2/0(Shu 1 man, M. et al., Nature(1978) 276:269-270) 、F0(de St. Groth, S. F. et al·， J. Immunol. Methods (1980) 35:1-21) ' SI 94(Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. ( 1 978 ) 148:313-323) 'R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277:1 3 1 - 1 33 ) 'P3U1(J. Exp. Med. 1 979 ; 1 50:580; Curr Top Microbiol. Immunol. 1 978;81:1)等。又，人類骨髓 瘤及小鼠-人類異骨髓瘤細胞株亦可用於人類單株抗體之 產生（Kozbar， J. Immunol. 1 33:3 00 1 )( 1 984 ); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York)。抗體產生細胞可由例如最終免疫日起經2〜3日 後犧牲死亡之動物身上採取。抗體產生細胞例如有脾臟細 胞、淋巴節細胞、微血管細胞等，但一般使用脾臟細胞。 具體而言，將前述動物之脾臟、淋巴節等摘出或採取後將 該等組織破碎。將所得到之破碎物懸濁於pBS、dmem、 v

1322814

RPM I 1 640等培養基或緩衝液，以不銹鋼篩網過濾後利用 離心以調製目的之抗趙產生細胞。 其次，使上述骨髓瘤細胞與抗體產生細胞進行細胞融 合。細胞融合係於MEM、DMEM、RPMI 1 640等動物細胞用培 養基中’使骨髓瘤細胞與抗體產生細胞以混合比 ° 1:1〜1:20，於融合促進劑存在下，於3〇〜37t；下接觸卜15 分鐘來進行。為促進細胞融合，可使用平均分子量 1 00 0〜60 0 0 (Da)之聚乙二醇、聚乙烯基醇或仙Λ台病ί"毒等融 合促進劑或融合病毒之市售細胞融合裝置，以使抗體產生 細胞與骨髓瘤細胞融合。 由經過細胞融合處理後之細胞選別出目的之融合瘤。 其方法例如有利用在選擇性培養基中將細胞選擇性增殖的 方法。即，將細胞懸濁液以適當培養基稀釋後，分散於微 定量平盤，在各穴中加入選擇性培養基（ΗΑΤ培養基之 後適當的更換選擇性培養基以進行培養。其結果，可得到 生月出之細胞為融合瘤形式者。 又’別的態樣’亦可以馬克卡菲提（M c c a f f e r t y )等人 (Nature 348:552-554(1990))記載之技術，由所製造之噬 菌體抗體庫將所產生之抗體或抗體片段單離。克雷克森 (Clackson)等人（Nature 352:624- 628 ( 1 99 1 ))及馬克氏等· 人（J. Mol. Biol. 222:58 1 -597( 1 99 1 ))分別對於使用噬 菌體庫之小鼠及人抗體之單離有所記載。又，以鏈更替 (chain shuf f 1 ing)製造高親和性（nM範圍）人類抗體 (Marks et al.，Bio/Technology 1 0:779-782 ( 1 992 ))及

1322814 五、發明說明（14) 構築巨大噬菌體庫之方法有重組實地感染及體内重組 (Waterhouse et a 1. , Nucleic Acid Res. 21 : 2265-22 66( 1 993))等。該等技術可取代先前之單株抗 體融合瘤技術以用於單株抗體之單離。 本發明之非中和抗aPC抗體可利用例如以下篩選來選 擇。 • 1次筛選 以公知技術’如E I A (酵素免疫分析）、R I A (放射線免 疫分析）、ELISA(酵素連結免疫吸附分析）、HTRF(均質時 間解析螢光分析）或螢光免疫法等（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory, 1 988 )測定抗體結合特異 性，並選擇可結合於aPC者。 • 2次篩選 使用人類血漿測定APTT (活化部分凝血活酶時間），並 選擇aPC抗血液凝固作用增強之抗體。或，將ΑΑτ或pct添 加於aPC，以測定aPC之不活化，選擇可阻害因ΑΑΤ及/或 P CI使a P C不活化之抗體。例如’若分析由融合瘤等抗體產 生細胞所得到之抗體’可鑑定會產生具有目的活性抗體之 抗體產生細胞，並將選殖體以極限稀釋法次選殖，以標準 化方法使生育（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles an Practice. Pp. 59-103. Academic Press, 1 986 )。培養基例如可使用d-MEM或RPIM- 1 640培養 基。利用反覆選殖’可選擇產生較強之抑制aPC不活化抗·:·

I'.25-5774-?F(N*.) ;Chiume〇i.ptd 第17頁 1322814

進行抗體產生 細胞之選 五、發明說明（15) 趙的抗體產生細胞（融合瘤等^ ) 殖0 本發明之抗體為可抑制因血液或apc阻宝 aPC不活化之抗體。其抑制水平定義為。:質:不使… 將因血液或aPC阻害物質而不活化時與㈣抑制率⑻’ aPC活性以0%表示，不會因此不活性化時與 度之aPC活性以1 00%表示。 丨生為冋程 不活化抑制率可利用一面改變適當抗體之用 定最適條件，具體而言’可利用以下的步驟決 面測

g/ml 之aPC(SIGMA，P-2200 等）溶液1〇/U 與抗體溶液f4〇〇 " 1 (若為融合瘤之篩選物，例如，為融合瘤培養上清）戋不 含抗體作為對照之溶液（例如骨髓瘤細胞之培養上"清^hat 培養基等）混合，於室溫下溫育一定時間（例如，6 〇分 鐘）。在該混合液中添加血漿（例如，標準血漿）5 〇 V i，再 於室溫下溫育一定時間（例如，6 0分鐘）。添加a ρ τ T試藥 (例如 ’DADE BEHRING，GAA-200A)50//l。不與血聚溫育 之aPC血液凝固時間係在添加APTT試藥前加入血漿中並測 定。例如於37 °C下溫育3分鐘後，添加20mmol/l CaCl2(例 如’ DADE BEHRING，GMZ-310)50 β 1，並測定到凝固為止 花的時間。血液凝固時間可利用血液凝固自動測定裝置 (例如 ’ A m e 1 u n g，K C - 1 0 A)測定。 將未與血漿溫育並添加aPC之凝固時間（a)定為100%， 與不含抗體以作為對照之溶液溫育後與血漿溫育再添加 aPC之凝固時間（b)定為〇%，並由與融合瘤培養上清等抗體

2!25-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第18頁

二月後與血漿溫育再添加apc之凝固時間（c)，求出對 笮二Γ瘤培養上清等抗體溶液之凝固時間延長的作用（不 斷對：ΐ率(%)=i(c-b)/(a-b)x 100丨）。此值越大，則判 〆八：a C不活化之抑制作用越強。在使用S 2366等基質 二物測定aPC活性時亦可與上述同樣測定不與抗體溫育 :在灰聚甲被不活化之aPC，及以不與血驳溫育之apc比 =以測定apc：活性’並算出不活化抑制率（％)。本發明之 抗壯之不活化抑制率（％)較佳為1〇以上， =佳為18以上，，更佳為2〇以上，尚更佳為為：以上上，更 二3 0以上，又更佳為3 5以上，更佳為4 〇以上又更佳為 45以上，再更佳為5〇以上。 或，本發明之抗體較佳為可阻害因pci或aat等a%阻 。物質使aPC不活化者。其作用可利用低分子基質發色試 =測定。若舉一例，將精製抗體溶液4〇 ^與⑺M—之 aPC溶液iOW於室溫下反細分鐘。將抓與抗體混合液 50^加入含有肝素10U之緩衝液（最終濃度：7〇_〇ι/ι Tris pH 8.0, 125mmol/L NaCl, lOmmol/ CaCl2, 0 1% BSA)，使成為180/U。添加1〇〇#g/ml重組(附有Fug 標記）20 // 1，於37 °C下使其反應3〇分鐘。添加低分子基質 S-2366(2mmol/l)50 β 1，並測定60分鐘後之吸光度 (405nm)。

若添加PCI 與使用未添加PCI之aPC時的吸光度比較 則吸光度下降。添加PCI之aPC活性定為〇%，未添加pci之 aPC活性定為100%，以吸光度之平均值為根據求出抗體之

1322814 五、發明說明（17) 相對活性。本發明抗體之相對值較 上，又更佳為3以上，更佳為5以上，^ U上，更佳為2以 更佳為1 0以上，更佳為丨2以上。本 更佳為7以上’再

用上述血聚測定APTT之抗血液凝固；日用：:為具有使 不活化具有阻害作用二者之一。即，格b述PCI之aPC 能抑制因众液及aPC阻害物質使aPC不活化：：：體較佳為 本發明之抗體亦可為結合於與杼〇生理阻&害心物質相互 作用之aPC部位的抗體。此種aPC之胺基酸例如已被鉀定者 有E215、S216 或S336(Shen， L.， Bi〇chemistry 39:2853-2860(2000))。本發明之抗體亦可為結合於apc中 該等胺基酸中任一者或其附近者（例如，在1 〇個胺基酸以 内的部位）。製作該種抗體只要合成含有目的aPC部分之寡 肽類，並以其為抗原對動物免疫使產生抗體即可。又， aPC 活性部位已知有 H211、D257 及 S 36 0 (Foster，D.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4673-4677(1985))。結 合於含有該等胺基酸區域之抗體因可能會阻害aPC活性， 被認為較不好。 從取得之融合瘤採取單株抗體之方法例如有通常之細 胞培養法或腹水形成法。細胞培養法可將融合瘤於含 10〜20%胎牛血清之RPMI-1 640培養基、MEM培養基或無血清 | 培養基等動物細胞培養基中’以通常之培養條件（例如37 。(：，二氧化碳濃度5%)培養2〜14日’再從培養上清取得抗 體。腹水形成法可將融合瘤投予到與來自骨聽瘤細胞之哺 乳動物同種動物之腹腔，使融合瘤大量增殖"並在1 ~ 4

2l25-5774-PF(N丨）；Chiume〇w.pid

第20頁 1322814 五、發明說明（18) 週後採取腹水或血清《為促進腹水形成，例如，可事先將 降植烧（pristine, 2, 6，10, 14 -四甲十五烧）投予至腹腔。 本發明中可使用之抗體可利用蛋白質A-瓊脂糖 (protein A Sepharose)、經基磷灰石層析、硫鹽析法、 陰離子交換層析、親和性層析等公知的方法適當選擇，或 將該等組合來進行精製。 又，本發明可依上述方法，由融合瘤將所得到之抗體 基因選殖’並重組至適當載體並導入宿主内，用於以基因 重組技術產生基因重組型抗體（例如，參照Car 1，A. K.

Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United

Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD.，1 990 )。本發 明提供編碼為本發明抗體之核酸及具有該核酸之載體。具 體而言’由融合瘤之傳訊核糖核酸以反轉錄酶合成抗體可 變區（V區）之互補去氧核糖核酸（cDNA)。若可得到編碼為 目的抗體V區之去氧核糖核酸，則可將其與編碼為所欲抗 體不變區（C區）之去氧核糖核酸相連接，並重組至表現載 體°又’亦可將編碼為抗體V區之去氧核糖核酸重組至含 有抗體C區去氧核糖核酸之表現載體。亦可將表現控制區

重組至表現載體’例如以增強子（e n h a n c e r )、促進子 (promotor)控制表現。其次’以表現載體將宿主細胞形質 轉換’可表現抗體。本發明提供表現本發明抗體之細胞。 本發明之抗體表現細胞包括以抗體基因形質轉換之 融合瘤。 ’ 1及

1322814 五、發明說明（19) 本發明之抗體特別以實施例中單離之任一單株抗體 (表1)及抗原決定基重複（或同一）之抗體較佳。該種抗體 在本發明中稱為貫質上結合於同一部位的抗體。例如，可 利用將實施例所記載之單株抗體抗原決定基用apc之部分 肽類等以公知的抗原決定基與圖法解析，並以含有鑑定好 抗原決定基之肽類為抗原，以調製結合於該抗 得到實質上結合於上述單株抗體之aPC結合部位的抗體。 該種抗體可期待與實施例所單離之抗體，對apc活性低下 發揮同樣的抑制作用。2個抗體是否與抗原蛋白質係實質 士結=於相同部位可利用例如競合實驗來決定。、具體而 言，若第1之抗aPC抗體與aPC之結合因第2之抗apc抗體而 文到競合阻害，則可判斷第丨之抗體與第2之抗體在實質上 係結合：相同的抗原部位。本發明包含實質上結合於與實 施例所早離到抗體之aPC結合部位為相同部位的抗體，其 具有阻害因血液及/或aPC阻害物質使apc不活化之作用。、 f矣1、又夕’ A發明之抗體包含實施例中所單離任-單株抗體 (―表1)之互補性決定區（CDRs)或與其機能同等之互補性決 ί (ί R::】ί 指具有與實施例中所單離任-單株抗體 i 之胺基酸序列，並具有阻害因血 ί i可二Γ /物質使aPC不活化之作用者。⑽係存在於 Π上V為v區）中決定對抗原結合特異性之區 :，Λ二二上各分別存在3處，其從n端起各命名為 :二Λ 有4個胺基酸序列保存性高的領域包 子，稱為框架（framew〇rk)。CDR可移殖至其他

1322814 五、發明說明（20) 抗ω·利用與所欲之抗體框架組合，可以製作重組抗體。 又&亦可在.·隹持對抗體結合性下，改變1個或數個C D R之胺 基酸。例如，可置換、缺失及/或附加CDR中1個或數個胺 .基酸。 $在變異之胺基酸殘基中’希望在保存胺基酸側鏈性質 下變異胺基酸H胺錢側鏈之性f有疏水性胺基酸 (A、I、L、Μ ' f、p、w、γ ' v)、親水性胺基酸（R、d、 N、C、E、Q、g、h、K、S、T)、具有脂肪族側鏈之胺基酸 (G、A、V、L、I、p)、具有羥基側鏈之胺基酸（s ' τ、 Υ)、具有含硫側鏈之胺基酸（c、Μ)、具有含羧酸及醯胺側 鍊之胺基酸（D、Ν、Ε、Q)、具有含鹼性基側鏈之胺基酸 (R、Κ、Η)、具有含芳香族側鏈之胺基酸（ρ、η、γ、货）等 (括弧内表示胺基酸之單字母標記）。以該等各群中之胺基 酸置換則稱為保存性置換。在某些胺基酸序列上有1或複： 數個胺基酸殘基缺失、附加及/或具有以其它胺基酸置換 修飾之胺基酸序列的多肽仍可維持其生物學活性係已知的 (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81， 5662-5666， Zoller， M. J. &

Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1 43 1 -1 433, Da 1 badie-McFar1 and, G. et al., Proc Natl. Acad’ Sci_ USA (1982) 79， 6409-6413)。變異之 胺基酸數不特別限定’但通常在各CDR胺基酸之40%以内， 較佳為35%以内，再更佳為30%以内（如，25%以内）。胺基

1322814 五、發明說明（21) . 酸序列之同一性可利用本說明書所記載之方法決定。例 如，本發明之抗體包括各CDR之胺基酸保存性置換的抗 體。該等抗體可期待具有與選殖體#79同等之活性。 含有上述Η鏈CDR之抗體可用於组合適當抗體l鏈之可 變區。L鏈C D R以例如由T A S S S V S S S Y L Η (序列識別號：2 1)、 STSNLASGAPT(序列識別號：22)及YHRSPFT(序列識別號：23) 之胺基酸序列所構成之CDR或與該等為同等機能之CDR組合 者為佳。各胺基酸序列係對應於抗體L鏈之、CI)R2及 CDR3。邊荨CDR可插入於所欲L鍵可變區之框架間相當於 CDR1、CDR2及CDR3的位置《上述各CDR之胺基酸亦可利用 丨_ 適當置換來改變。例如’本發明之抗體包括各之胺基 · 酸保存性置換的抗體。 具體而言，本發明之抗體係具有以下Η鏈互補性決定 區’且具有阻害因血液及/或aPC阻害物質使aPC不活化之 作用。 (a) 由序列識別號：9 ' 1 〇及1 1所記載之胺基酸序列所 構成之互補性決定區。 (b) 由序列識別號：9、1 0及11之任意保存性置換的胺 基酸序列所構成之互補性決定區。 (c )由序列識別號：9中2個以内、！ 〇中8個以内及〗丨之3 W 個以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺基酸序列所構 成之互補性決定區。 (d)由序列識別號：9、1〇及丨丨各具有7〇%以上同一性之 胺基酸序列所構成之互補性決定區。

2125-5774-PF(Nl)；Chiume〇Wptd 第24頁 1322814 五，發明說明（22) ____ 此處’（C) t胺基醆之改變數較佳 有1個。又，較佳為序列識別號:1 :歹:：别唬:9中 内更佳，又更佳為5個以内，再更佳為4個固以内，以6個以 3個以内’又更佳為2或"固m圭為序歹；V別又 有2個以内，以1個以内更佳。又，（幻4别嬈：〗1中 以上，以80%以上更佳，又更佳為9〇%以上问—性較佳為75% 上。 灵佳為95%以 又’本發明之抗體係具有以鏈互補性 具有阻害因血液及/或3{5(：阻害物質使aPc不活化^ ⑷由序列識別號:21、22及23所記載之胺W 構成之互補性決定區。 斤夕i所 (b) 由序列識別號：21、22及23之任意保存性置 基酸序列所構成之互補性決定區。 、的胺 (c) 由序列識別號：21中5個以内、22中5個以内 > 3個以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺基 成之互補性決定區。 ”斤構 (d) 由序列識別號：21、22及23各具有70%以上同— 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 此處，（c)中胺基酸之改變數較佳為序列識別號：2ι 有4個’以3個以内更佳’又以2個以内更佳，再更^為工 個。又，較佳為序列識別號：22中有4個以内，以3個以 更佳，又更佳為2個以内’再更佳為1個。又，較佳為序， 識別號：2 3中有2個以内，以1個更佳。又，（d )之同—性列 佳為75%以上’以8〇%以上更佳’又更佳為9〇%以上更佳較

1322814 五、發明說明（23) 為95%以上。特別是以具有該等Η鏈互補決定區與L鏈互補 決定區兩者之抗體作為本發明抗體是較適當的。

I 本發明之抗體例如具有由（S/R)SWMN(序列識別 號：31)、RIYPGDGD(T/S)(N/I)YNGKF(R/K)G(序列識別 號：31)及WG(I/S)(T/S)(T/G)(A/S)(A/S)WFAY(序列識別 號：3 3)之胺基酸序列所構成之CDR或與其為機能上同等之 CDR。與上述相同，各該胺基酸序列相當於抗體Η鏈之 CDR1、CDR2及CDR3。將該等抗體之Η鏈CDR以較佳胺基酸序 列具體例示，則例如CDR1為SSWMN(序列識別號：12)或 RSWMN(序列識別號：18)，CDR2例如為 RIYPGDGDTNYNGKFEG(序列識別號：1 3)或 RIYPGDGDSIYNGKFKG(序列識別號：1 9)，CDR3 例如為 WGITTAAWFAY(序列識別號：14)或WGSSGSSWFAY(序列識別 號：20)等。具體而言，可使用單株抗體#123或#285之Η鏈 之CDR1、2及3之組合。該等抗體可期待具有與#123或#285 有同等活性。此情形作為L鏈CDRs者，例如以 RTSENIYSYLA(序列識別號：24) ' NAKTLAEGVPS(序列識別 號：25)及丫丫6(1'/5)?(?/丫）1'(序列識別號：34)之胺基酸序列 所構成之CDR或與該等為機能上同等之CDR組合者較佳。各 該胺基酸序列對應於抗體L鏈之CDR 1、CDR2及CDR3。又， 該等L鏈CDRs亦可與上述Η鏈獨立使用。作為L鏈CDR3之較 佳胺基酸序列更具體例示，可使用YYGTPPT (序列識別 號：26)或YYGSPYT(序列識別號：30)，但不限定於該等序 歹1J 〇

2!25-5774-PF(Nl) •.Chiumeow.pid 第26頁 1322814 五、發明說明（24) 具體而言，本發明之抗體係具有以下Η鏈互補性決定 區，且具有阻害因血液及/或aPC阻害物質使aPC不活化之 作用。 (a )由序列識別號：3 1、3 2及3 3所記載之胺基酸序列所 構成之互補性決定區。 (b)由序列識別號：3 1、3 2及3 3之任意保存性置換的胺 基酸序列所構成之互補性決定區。 (c )由序列識別號：3 1中2個以内、3 2中8個以内及3 3之 5個以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之胺基酸序列所構 成之互補性決定區。 (d)由序列識別號：31、32及33各具有70%以上同一性 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 此處，（c)中胺基酸之改變數較佳為序列識別號：3 1中 有1個。又，較佳為序列識別號：3 2中有7個以内，以6個以 内更佳，又更佳為5個以内，再更佳為4個以内，更佳為3 個以内，又更佳為2個或1個。又，較佳為序列識別號：3 3 中有4個以内，以3個以内更佳，又更佳為2個以内，以1個 更佳。又，（d)之同一性較佳為75%以上，以80%以上更 佳，又更佳為90%以上，更佳為95%以上。 又，本發明之抗體係具有以下L鏈互補性決定區，且 具有阻害因血液及/或aPC阻害物質使aPC不活化之作用。 (a) 由序列識別號：24、25及34所記載之胺基酸序列所 構成之互補性決定區。 (b) 由序列識別號：2 4、2 5及3 4之任意保存性置換的胺

2125-5774-?F(Nl);Chiumeo*.p:i 第27頁 1322814

基酸序列所構成之互補性決定區β (c) 由序列識別號：24中5個以内、25 識別號：34之4個以内胺基酸有置換、缺 及序列 基酸序列所構成之互補性決定區。 5 ’ 0之胺 (d) 由序列識別號：24、25及34各具有 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 5 -性 此處，（c)中胺基酸之改變數較佳為序 有4個，以3個以内更佳，又以2個以内更佳，^ ^ ’ 4中 Γ佳又又St序列識別號:25中有4個以内，，以3個二 更佳又更佳為2個以内，再更佳為1個。又 識別號：34中有2個以内，以i個更佳。又，π马序列 佳為75%以上，以80%以上更佳，又更佳為9〇%以丨 車乂 為95%以上《特別是以具有該等H鏈互補決定區與l鏈互補 決定區兩者之抗體作為本發明抗體是較適當的。 本發明之抗體例如具有由DYSLH(序列識別號：15)、 W I NTETGEPTYADDLKG(序列識別號：1 6 )及G I TLDY(序列識別 號：1Ό之胺基酸序列所構成之CDR或與其為機能上同等之 CDR。與上述相同’各該胺基酸序列相當於抗體η鏈之 CDR1、CDR2及CDR3。該等抗體可期待與#281具有同等活 性。其為L鏈CDR時’較佳為KSSQSLLSSSNQKNFLA(序列識別 號：27)、SWASTRHSGVPD(序列識別號：28)及YYRYPLT(序列 識別號：2 9 )之胺基酸序列所構成之CDR或與該等在機能上 為同等之CDR所組合者。 f 具體而言，本發明之抗體係具有以下Η鏈互補性決定

1322814

區且具有阻害因血液及/或apc阻害物 質使aPC不活化之 號:15、16及17所記載之胺基 構成之互補性决定區^ 基酸(序匕)列由所序堪歹?"別號：15、16及17之任意保存性置換的月 基&序列所構成之互補性決定區。 1別由7序f識別號：15令2個以内' 16 "個以内及序歹 基内胺基酸有置換、…/或附加之胺 ^ ^所構成之互補性決定區。 (d)由序列識別號：15、16及17各具有7〇%以上同一性 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。

WiL rr 7Ί /71

：# 1 π此處C )中胺基酸之改變數較佳為序列識別號：1 5中 又 較佳為序列識別號：1 6中有7個以内，以6個以 内更佳’又更佳為5個以内’再更佳為4個以内，更佳為3 個以内。又’較佳為序列識別號：丨7中有4個以内，以3個 以内更佳，又更佳為2個以内，以1個更佳。又，（d)之同 一性較佳為75%以上，以80%以上更佳，又更佳為9〇%以 上’更佳為95%以上。 又’本發明之抗體係具有以下L鏈互補性決定區，且 具有阻害因血液及/ *aPC阻害物質使apc不活化之作用。 (a) 由序列識別號：27、28及29所記載之胺基酸序列所 構成之互補性決定區。 (b) 由序列識別號：27、28及29之任意保存性置換的胺 基酸序列所構成之互補性決定區。

第29頁 1322814 五、發明說明（27) (C)由序列識別號：27中8個以内、28 識別號：29之3個p甘你亡里找 L A ^及序歹ij # ^ ^ , d個以内胺基酸有置換、缺失及/或附加之@ 基酸序列所構成之互㈣決定區。 _之胺 (d)由序列識別號：27、28及29各具 ％ 之胺基酸序列所構成之互補性決定區。 门性 右7個此以處内’I中胺基酸之改變數較佳為序列識別號：”中 有 内’較佳為6個以内，再更佳為5個以内，更伟为 個以内，以3個以内更佳，又以2個以内更佳，再更吏佳佳^

個。又，較佳為序列識別號：28中有4個以内，以3個以"、 更佳，又更佳為2個以内，再更佳為丨個。又 識別號：29中有2個以内，以}個更佳。又彳為序歹，J 佳為75%以上，以8〇9ίί以μ #估”； < 丨口J —性較 以卜/ 又更佳為9〇%以上，更佳 為95%以上。特別是以具有該等H鏈互 隹 決定區兩者之抗體作Λ太路昍 ’、疋£ /、L鏈互補 $心仇肚作為本發明抗體是較適當的。 又’本發明之抗體例如可 4之胺基醆序列構成抗_鏈可變盘；=;二:2、3或 之可變區。此情形之L鏈，較次/、忒寻具機旎上同等 或8之胺基酸序列構成之可 2序列識別號：5、6 '7 之可變區的L鏈組合者。具與具有與該等機能同等 以下Η鏈可變區，且具有阻害:’本發明之抗體係具有 aPC不活化之作用。 D 液及/或aPC阻害物質使 或4所記載之胺基酸序列所 (a)由序列識別號：丨、2 構成之可變區。 (b )由序列識別號：1、2

2125»5774-PF(M) ;Chiume〇w.ptd

或4之任意保存性置換的胺

1322814

丄砰

士特,*具有該等11鏈可變區及[鏈可變區兩者之 抗體作為本發明抗體是適當的。 可變二ΐ d、序列例如可合成編碼為改變胺基酸序列 a m纟f ί 甘酸，並以該等為基礎以PCR生成編碼 Ϊ : ί 酸。利用將其重組至適當的表現載體以表 :弃斑鹼：至:ί有所欲⑽之抗體。例⑹’在合成寡核苷酸 夺/、鹼基此& ，以製作編碼為在CDR特定位置上具有各種

的上體之去氧核糖核酸庫。由該基因庫選擇結合於 aPC並阻^其活性之抗體的選殖體，可得到本發明之抗 體。本發明係關於編碼為本發明抗體之核冑、含該核酸之 載體及寒有該核酸或該載體之宿主細n酸可為去氧核 糖核酸或為核糖核冑。載體可為質體、噬菌體 等公知的載體。宿主細胞包含細帛、酵母菌、昆蟲、 細胞及哺乳動物細胞等。 本發明中，為使對人類之異種抗原性下降而以人為改 變基因之重組型抗體可使用例如嵌合（chimeric)抗體、人 類化（humanized)抗體等。該等改變抗體可利用已知的方 法製造。嵌合抗體例如有抗體之可變區及不變區互為里 的抗體，口 ’可為人以外之哺乳動物如小鼠抗體之重 鏈、^鏈之可變區與人類抗體之重鏈、輕鏈之不變區所構 成之杬體。該種抗體可利用將編碼為小鼠抗體可變區之去 氧核糖核酸連結於編碼為人類抗體不變區之去氧核糖核酸 並將其重組於表現載體中導入宿主來產生。 人類化抗體亦％為再構成（reshaped)人類抗體係以

1322814 五、發明說明（30) 人以外哺乳動物例如小鼠抗體等非人類抗體之重鏈或輕鏈 之互補性決定區（CDR;complementary determing region) 取代至人類抗體之互補性決定區者，其一般已知有基因重 組之方法（例如，參照J ο n e s，e t a 1.，N a t u r e 321:522-525(1986)； Reichmann et al., Nature 332:323-329(1988); Presta Curr. Op. Struc. Biol. 2:593-596(1992))。具體而言’將設計使小鼠抗體cdr與

人類抗體框架區（framework region; FR)連結之去氧核糖 核酸序列以末端部分具有重疊部分之方式製作數個募核苷 酸，依PCR合成》將所得到之去氧核糖核酸與編碼為人類 抗體不變區之去氧核糖核酸連結，再重組至表現載體，並 導入宿主，可產生該抗體（參照歐洲專利申請公開編號 EP2 39400 ’國際專利申請公開編號w〇 96/0 2576號）。透過 CDR連結之人類抗體FR係選擇其互補性決定區形成良好抗 原結合部位者。人類化抗體可包含不含導入受體抗體之 CDR或框架序列任一者之胺基酸殘基。通常，導入該等胺 基酸殘基係為使抗體之抗原辯識•結合能力能更加正確最 適化而進行。亦可依需要，將抗體可變區之框架區胺基酸 置換’以使再構成抗體之互補性決定區形成適當抗原結合

區（Sato, K. et al.， Cancer Res· (1993) 53， - 85卜856 )。 又’取彳于人類抗體之方法為已知的。例如，於體外以 淋巴球感作所欲之抗原或表現所欲抗原之細胞並將感作淋 巴球與人骨髓瘤細胞例如U 2 6 6融合，可得到具有對抗原結

2125-5774-PF(Nl) ;Cr.iui3eo*'.ptd 第33頁 1322814 五、發明說明（31) 合性之所欲人類抗體（參照特公平1 -59878)。又，利用對 具有人類抗體基因之一部或全部之基因轉殖：（Tg)動物以抗 原免疫’可取付所欲之人類抗體（參照N a t u r e G e n e t i c s 7:13-21(1994); Nature Genetics 15:146-156(1997)； Nature 368:856-859( 1 994);國際專利申請案公開編號w〇 93/ 1 2227、\V0 92/039 1 8、W0 94/0 2602、W0 94/25585、 WO 96/34096、WO 96/33735)。該種Tg動物具體而言係利 用破壞非人類哺乳動物之内在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之 基因座，並透過酵母菌人工染色體（yeast artificial chromsome ’ YAG)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鍵 之基因座製作基因重組動物、基因剔除（kn〇ck 〇ut)動物 與Tg動物’並使該等動物互相交配，來製作。免疫球蛋白 重鏈基因座之機能不活化例如可利用將障害導入】區或c區 (例如，C μ區）來達成，而免疫球蛋白輕鏈（如，Λ鏈）之°° 機能不活化例如可在J區或C區之一部或跨越】區或C區之區 再者，利用基因重組技術 利用編碼為各該種人類

V /士 3次但八采貝

抗體重鏈及輕鏈之互補去氧核糖核酸較佳為含該互 核糖核酸之載體，使真核細胞形質轉換並捭 重組人類單株抗體之形質轉換細胞，可由^養丄清中= 該抗體。此處，宿主例如可為所欲之真核二胞，二= CH0細胞、淋巴球或骨髓瘤等哺乳動物細胞。 ·、 己知再之= =術亦為

1322814 五、發明說明（32) (scFv)，並以噬菌體表現法表現於噬菌體表面上，以選擇 結合於噬菌體之抗原。若解析所選擇噬菌體之基因，可得 到編碼為結合於抗原之人類抗體可變區的去氧核糖核酸序 列。若能明白結合於抗原之s c F v去氡核糖核酸序列，則可 製作具有該序列之適當表現載體，並利用導入適當宿主内 表現以取得人類抗體。該等方法已為公知，可參考W0 92/0 1 047、\V0 92/2079 1、\V0 93/0 621 3、W0 93/1 1 236、 WO 93/ 1 9 1 72、WO 95/0 1 438、WO 9 5/ 1 5388 實施。 一旦將抗體基因單離後，導入適當宿主以製作抗體時 可使用適當宿主與表現載體之組合》使用真核細胞作為宿 主時’可使用動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞 例如有（1 )哺乳類細胞，如CH0、COS、骨髓瘤細胞、 BHK(倉鼠胎兒腎臟細胞，baby hamster kidney)、HeLa ' Vero、（2)兩生類細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞，或（3)昆 蟲細胞’例如S f 9、S f 2 1、Τ η 5等，或蠶等個體。植物細胞 例如有煙草屬（nicotiana)，如終草（Nicotiana tabacum )由來之細胞，將該等進行癒傷組織培養即可。真菌細胞 為酵母菌例如啤酒酵母（S a c c h a r 〇 m y c e s )屬之啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae )，絲狀 g 例如麴菌屬 (Aspergillus)之黑麴徽（Aspergillus niger)等。使用原 核細胞時，有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞例如有大 腸桿菌（E. co 1 i ) '枯草菌。利用將抗體基因以形質轉換導 入該等細胞中’可在體外培養已形質轉換之細胞而得到抗 體。

2!25-5774-PF(Nl);Chiuir*ec*A.pid 第35頁 1322814 五、發明說明（33) 本發明抗體之同種型沒有限定，例如，有I gG ( I gG 1、

IgG2 、 IgG3 、 IgG4) 、 IgM 、 IgACIgAl 、 IgA2) 、 IgD 或IgE 等，較佳者為I gG或I gM。又，本發明之抗體亦可為具有抗 體之抗原結合部之抗體片段或其修飾物。所謂「抗體片 段」係指全長抗體之一部分，一般，係包含抗原結合區或 可變區之片段。例如，有將F a b、F (a b ’）2、F v或重鏈及輕 鏈之Fv等抗體片段以適當連結子連結成單鏈Fv(scFv)、二 元體（diabody)、線狀抗體，及以抗體片段形成多特異性 抗體等。先前，抗體片段係以天然之抗體蛋白酶消化來製 造，但現在以基因工程表現重組抗體之方法亦為公知的 (參照Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992); Brennan et al.， Science 229:81(1985); Co, M. S. et al·， J. Immunol., 1994, 152, 2968-2976; Better, M. &

Horwitz, A. H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc. ; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Acedemic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669; Bird, R. E. et al.， TIBTECH, 1991, 9, 132-137)。 「F v」片段為最小之抗體片段，其含有與完全抗原辨 識部位結合之部位。該區係1個重鏈及輕鏈之可變區以非 共價鍵強力連結之二元體（VH - VL二元體）。各可變區之3個 互補性決定區（CDR)彼此作用，並在VH-VL二元體表面上形

2125-5774-PF(Nl);Chiume〇w.ptd 第36頁 1322814 五、發明說明（34) 成抗原結合部位。即’重鏈及輕鏈總共6個CDR具有作為抗 雜之抗原結合部位的機能。但，已知即使1個可變區（或， 僅含有Fv之一半，即抗原特異3個CDR)較含有全結合部位 時親和力較低，但是’可以認識抗原，並具有結合能力β 故’本發明中雖抗體片段以F ν為佳，但不限定於此，可為 含有可認識重鍵或輕鍵之CDR被保存之抗原，並具結合能 力之抗體片段多肽。 又，Fab片段（亦稱為F(ab))進一步含有輕鍵之不變區 及重鏈之不變區（C Η 1 )。例如’將抗體以木瓜酵素消化， 可生成稱為Fab片段，含有形成1個抗原結合部位之重鏈及 輕鏈可變區之抗原結合片段，及其餘易結晶化，稱為 「Fc」之片段。Fab片段因具有附加抗體鉸鏈區中1個或 更多半胱胺酸之來自重鏈CH1區羧基末端之數個殘基，故 與Fab片段不同，但在其為含有形成1個抗原結合部位之重 鏈及輕鏈可變區之抗原結合片段之點上，其構造上與Fab 為同等的。本發明中，以蛋白酶消化所生成之抗體片段即 使非同一’但與以木瓜酵素消化所得者為同等，將含形成 1個抗原結合部位之重鍵及輕鏈可變區之抗原結合片段稱 為類Fab抗體。Fab’ -SH表示不變區之1個或以上半胱胺酸 殘基具有游離硫醇基之Fab’ 。F(ab’）片段係利用將p(ab，）2 中鉸鏈部之半胱胺酸中雙硫鍵切斷來製造。化學性鍵結之 其他抗體片段亦為該行業者已知的。將抗體以胃蛋白酶消 化’則可得到具有2個抗原結合部位，並可與抗原交差結 合之F(ab’ \片段，及，殘餘之其他片段（稱為pFc，）。本發

2125 - 5774 - PF(N1) ;Qi i meov. p:; 第37頁 1322814 五、發明說明（35) 明中，以胃蛋白酶消化得到之具有2個抗原結合部位並可 與抗原交差結合之抗體片段稱為類F(ab’）2片段。該等抗體 片段亦可利用例如重組技術製造。該等抗體片段亦可由噬 菌體抗體庫中單離》或，可由大腸桿菌等宿主直接回收 F(ab’）2-SH片段，以F(ab’）2片段之形態進行化學性鍵結 (Carter et al.， Bio/Technology 10:163-167(1992)) 〇 再者’尚有別的方法，可直接由重組宿主培養物中單離 F(ab’）2 片段。 再者，本發明所使用之抗體亦可為多特異性抗體。多 特異性抗體係對至少2種類不同抗原具有特異性之抗體。 通常’此種分子係結合2個抗原（即，二重特異性抗體 (bispecific antibody))，但本發明中「多輯里枓始栌 包含對更多(例如，類)抗體具有V異性 異性抗體可由全長構成之抗體或其抗體片段（如，F(ab， 二特異性抗體）得到。二重特異性抗體可利用使2種類抗體 之重鏈與輕鏈（HL對）結合來製作，亦可將產生不同單株抗 體之融合瘤融合以製作產生-帝牲 A / 压王一室特異性抗體之融合細胞， 來得到（Μι 1 lstein et ai,， j^ture 3=537-539⑴83))。再者，亦可以基因工程的手法製作 一重特異性抗體》具體而士 , 、 。，係將具有結合特里性之时种 可變區融合於免疫球蛋白口行生之抗體 社丸产Α广+-讲 之不變區序列。該不變區序列軔 佳為在免疫球蛋白之重鏈不 CH2及CH3區之至少一部八^ &内，且至少含有鉸鏈、 必需之重鏈⑶區1編佳Λ為尚含有與輕鏈結合所 了、构碼為免疫球蛋白重鏈融合體之去

2125-5774*PF(N1);Chiumeow.ptd 第38頁 1322814

五、發明說明（36) 氧核糖核酸及依需要编碼為 酸插入至各別的表現載體， 轉換。利用將各基因插入到 例不同時所得到之抗體收量 例，但當然，亦可將編碼為 中 〇 免疫球蛋白輕鏈之去氧核糖核 並於適當宿主生物内進行形質 各表現載體’若各鏈之存在比 會較高’可調整各鏈之表現比 複數鍵之基因插入於一個載體 二元體（diabody; Db)係指以基因融合所構築之二價 抗體片段（P. Holliger et al.， Prc)(：, Natli AcacL Sci. USA 90:6444-6448(1993)， EP404097 號、 W093/n16l號等）。一般，二元體係由二條多^肽鏈所構成 之一元體，多肽鏈各自不同，同鏈中輕鏈可變區（、）及重 鏈可變區（VH)係以5個殘基左右的連結區結合，彼此可結合 部位很短。同一多肽鏈上編碼出之'及％因之間連結位很 短’故無法形成單鏈V區片段而形成二元體，故二元體變 成具有2個抗原結合部位《此時，若對2個不同抗原（a、b) 之VL與VH aVLa-VHb及VLb-VHa之組合同時表現以5個殘基左右 之連結位連結之形態時’會分泌2種特異性之Db«本發明 之抗體亦可為此種Db。

單鏈抗體（亦記為s c F v )可利用將抗體之重鏈v區及輕 鏈V區連結以得到。S c F v總論可參照p 1 u c k t h u η『T h e Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vo 1. 113(Roseburg 及Moore 編，Springer Verlag， New York, pp2 6 9 -3 1 5 ( 1 994 ))。單鏈抗體之製作方法在該行業為周知 者（例如，可參照美國專利第4946778號、美國專利第

2125-5774*PF(N1)；Giiumeow.p:d 第39頁 1322814

5。260203號、美國專利第5〇91513號、美國專利第5455〇3〇 號等）。在該ScFv中，重鏈v區及輕鏈丫區係以連結位， 佳為以多肽連結來連結（Huston，j s et al ，

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85, 5879-5883) 〇 SCFv

中重鏈V區及輕鏈v區可來自同一抗體，亦可來自不同抗 體ί結V區之肽連結可使用例如由1 2〜1 9個殘基所構成之 任意單鏈肽類。編碼&scFv之去氧核糖核酸可利用將編碼 為前述抗體重鏈或重鏈V區之去氧核糖核酸’及編碼為輕 鏈或輕鏈V區之去氧核糖核酸中，以該等序列全部或編碼 為所欲胺基酸序列之去氧核糖核酸部分作為模板，並在兩 端以規定之引子對利用PCR法增幅，再將編碼為肽類連結 部分之去氧核糖核酸及其兩端各自與規定之引子對組合並 增幅使可連結於各重鏈 '輕鏈。又，—旦製作了編碼為 scFv之去氧核糖核酸，可利用常法得到含有該等之表現載 體及以該表現載體進行形質轉換之宿主，又，使用該宿 主，可依常法得到SCF v。該等抗體片段可以與前述以同樣 方式，取得基因並由宿主表現產生。抗體之修飾物可使用 與聚乙二醇（PEG )等各種分子結合之抗體。抗體修飾法在 5玄領域中亦已被確立。本發明中「抗體」包含該等抗體。

所得到之抗體可以精製為均一。精製只要使用通常蛋 白質所使用之分離、精製方法即可。例如，可適當選擇層 析官柱、過濾膜、極限過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯 酿胺凝膠電泳、等電點電泳等，並組合之，以分離、精製 抗體（Strategies for protein pUrificati〇ri and

2l25-5774-PF(NI) ;Chiumeow.pld 第40頁 1322814 五、發明說明（38) character i zat ion : A laboratory course manual, Daniel R. Marshak et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory， 1 988)，但不限定於此。層析法可使

用如，親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過 遽、逆相層析、吸附層析等。該等層析法中可使用HPLC或 FPLC等液相層析儀進行。用於親和性層析之管柱例如有蛋 白質A管柱' 蛋白質G管柱等。蛋白質a管柱例如有Hyper S，POROS，Sepharose F· F.(法瑪喜亞製）等。又，亦可 使用已固疋化有抗原之載體’利用對抗原之結合性以精製 抗體。 本發明係提供本發明抗體、PC *aPC不活化之抑制 劑。又本發明係關於本發明抗體、pc或apc不活化抑制劑 $使用。利用使本發明抗體接觸Pc *aPC，可在pci或AAT 等a PC阻害物質存在下，抑制pc或3 pC不活化，及血液中pc 或aPC之不活化。本發明係關於抑制該％ *ap(：不活化之方 法，包含將本發明之aPC抗體接觸pc *ap(：的製程。投予本 發明抗體時，可單獨投予抗體，或亦可併用pc及/或aPc。 再者亦可投予在體外以本發明抗體處理過之pc或#〇。 ^，本發明提供不活化被抑制之pc *aPc製造方法，及以 該=法製造之不活化被抑制之pc ^pc，其中包含使本發 明抗體結合於PC或3pc之製程。 aPC已知具有抑制血液凝固及發炎的作用，利用投予

2125-5774-PF(NI);Chiumeow.ptd 第41頁 1322814 五、發明說明（39) 本發明中aPC非中和抗體，可使aPC抑制血液凝固及發炎之 效果提高。本發明係關於血液凝固及發炎的抑制方法，包 含投予本發明抗體之製程。該方法中亦可進一步包含投予 PC及/或aPC之過程。此情形下，較佳為事先將本發明之抗 體結合於PC及/或aPC並投予。利用使用含有本發明抗體為 有效成分之aPC不活化抑制劑，可使在以aPC處置（例如， 血栓症及敗血症等預防與治療）*apC之效果提高。又，本 發明所謂「含有之以作為有效成分」係指含有本發明抗體 作為活性成分至少之一 ’並非限定本發明抗體之含有率。 本發明之抗體對於預防或治療因活化蛋白質C活性低落或 不足而引發之發炎及/或進展的疾病為有用的，其中又以 預防及/或治療因血液凝固反應亢進及/或發炎反應亢進所 忘起之疾病特別有效。該種疾病具體而言，例如有動脈血 栓症、靜脈血栓症、播種性血管内凝固（Disseminated Intrvascular· Coagulation; DIC)症候群 '敗血症等。 又，本發明提供含有（a)本發明抗體及（13扦(：及/或抒(： 之套組。該套組可使用於預防或治療因活化蛋白質c活性 低落或不足而引發之發炎及/或進展的疾病。再者，本發 明提供一種套組，其可使用於預防或治療因活化蛋白質xc 活性低落或不足而引發之發炎及/或進展的疾病，包含（a) 擇自PC、aPC及本發明抗體所構成群中任一者，及（b)記載 /。療有效i之PC及/或aPC與s玄抗體併用之記錄媒體咬含有 連結至該記載之記錄媒體。該種疾病例如有如上述因血液 凝固反應充進及/或發炎反應充進所惹起之疾病，具體而 1322814 五、發明說明（40) " 言，包含動脈血栓症、靜脈血拴症、播種性血管内凝固 (Disseminated Intrvascular Coagulation; DIC)症候 群、敗血症等。本套組因可使内因性3?(：或由體外投予之 PC或aPC在體内活性相對上升，故為有用的，利用該等可 以對上述疾病進行預防及治療。記錄媒體例如有紙及塑膠 等印刷媒體、軟碟（f 1 ex i b 1 e d i s k )、光碟（CD)、數位影 音光碟（DVD)、半導體記憶體等電腦可讀取記錄媒體等所 欲之記錄媒體。典型上，例如有隨附於套件之指示書，在 此可將併用治療有效量之PC及/或apc及抗體之事項予以記 載。連結係不直接將併用治療有效量之PC及/或aPC及抗體 之事項予以記載’而以箭號指向與該記載有關之事項，透 過該箭號可通往該記載。例如，指示書中有以參照另外書 面或URL之方式加以指示之記載，亦包含在另外書面或URL 之方式有記載的情形。 本發明之抗體可利用經口或非經口任一者投予，但以 非經口投予較佳，具體而言，例如有注射劑型、經鼻投予 劑型、經肺投予劑型、經皮投予劑型等。注射劑型例如可 利用靜脈内注射、肌肉内注射 '腹腔内注射、皮下注射等 對全身或局部投予。又，可依患者之年齡、症狀等選擇適 當投予方法。投予量例如可在每次體重每公斤 O.OOlmg〜lOOOmg的範圍内選擇。或，例如，可以選擇每位 患者O.OOlmg〜100〇〇〇mg/body範圍之投予量。但，本發明 之抗體並不限制為該等投予量。 本發明之抗體可依常法製劑化（例如，Remington’ s

2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第43頁 1322814 五、發明說明（41)

Pharmaceutical Science ， Latest edition, Mark Publishing Company, Easton. U.S.A)，亦可含有醫藥上 可容許載體及/或添加物。本發明係關於含有本發明抗體 及有醫藥上可容許載體及/或添加物之組合物（包括試藥及 醫藥）。例如，亦可含有界面活性劑（PEG、Tween等）、賦 形劑、抗氧化劑（抗壞血酸等）、著色劑、香料、保存劑、 安定劑、緩衝劑（填酸、檸檬酸、其他有機酸等）、鍪合劑 (E D T A等）、懸濁劑、等張劑、結合劑、崩壞劑、潤滑劑、 流動性促進劑、矯味劑等，但不限定無該等，亦可適當使 用其他常用載體。具體而言，例如有輕質無水石夕酸、乳 糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉 '羧甲基纖維素約、敌甲 基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基曱基纖維素、聚 乙烯基縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯酮、明膠、 中鏈脂肪酸三甘油酯 '聚氧乙烯硬化篦麻油60、白糖、致 基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。又，亦可含有其他 低分子量多肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白 質 '甘胺酸、谷醯胺、天冬醯胺、精醯胺及離胺酸等胺基 酸°製為注射用水溶液時，可為含有例如生理食鹽水、葡 萄糖或其他補助藥之等張液，如D_山梨糖醇、D-甘露糖、 D-甘露醇、氣化鈉等，亦可與適當溶解補助劑併用，如醇 類（乙醇等）、多元醇類（例如，丙二醇等）、非離子性界面 活性劑（聚山梨酸80、HCQ-50)等。 又，依需要，本發明之抗體亦可置入微膠囊（羥基甲 基纖維素、澱粉、聚[曱基曱基丙烯酸]等微膠囊），或製

2125-5774-PF(Nl) ;Chiumeow,ptc] 第44頁 1322814 五、發明說明（42) 為膠體藥物傳遞系統（微脂體、白蛋白微球體、微乳化 物、奈米粒子及奈米膠囊等）（參照"Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo ed. ( 1 980 )")。再者，製為緩釋型藥劑之方法亦為公知 的，可適用於本發明之抗體（Langer et al.， J. Bi〇med Mater. Res. 15: 167-277(1981); Langer, Chem. Tech 1 2 : 98- 1 0 5 ( 1 982 );美國專利第377 39 1 9號；歐洲專利申請 案公開（EP)第58481 號；Sidman et al.， Biopolymeers 22:547-556(1983);EP 第133988 號） 又，亦可考量將編碼為本發明抗體之基因重組至基因 治療用載體’以進行基因治療。投予方法除了直接投予裸 露質體基因外’亦可利用包裝於微脂體等，或形成反轉錄

病毒載體、腺病毒載體、天花病毒载體、痘病毒載體載 體、腺伴隨病毒載體、Η V J載體等各種病毒載體（參照

Adolph 「 或被覆於 但，只要 投予。較 下、皮内 注射、注 添鼻藥等 脂體轉染 染對細胞 發明抗體 病毒基 膠體金 能在生 佳為以 、脂肪 入或透 透過黏 、粒子 投予， 之基因 因體法」，CRC Press， Florid(1996))， 粒子等顆粒載體（W 0 9 3 / 1 7 7 0 6等）再投予《 體内表現抗體並發揮作用，可用任意方9 適當非經口途徑（靜脈内、腹腔内、皮 組織内、乳腺組織内、吸入或肌肉内進子 過氣體誘導性粒子衝擊法（利用電子搶）， f的途徑）投以充足量。亦可在體外以微 衝擊法（美國專利第4945050號）或病毒感 並將該細胞再導入動物，以投予編碼為4

丄322814 五、發明說明（43) 貫施方式 (據以發明實施之最佳形態） 以下，對本發明依實施例更具體說明，但本發明不限 定於該等實施例。又，本說明書所引用之文獻全部包含於 本說明書之一部分。 [實施例1 ]抗人類aPC抗體之製作

以aPC(Sigma，P-220 0 )在BALB/c小鼠腹部以皮下投予 進行免疫。確認血清抗體價上升，以2〇eg/mouse抗原在 尾靜脈投予以作為最終免疫。於最終免疫的3日後將脾臟 摘出調整脾臟細胞後，與P3U1細胞融合，得到2648穴之融 合細胞。 以融合當曰作為第0曰，在第1、2、3、5曰以HAT培養 基（含RPMI 1640 ’10% FCS，0.1°/。盤尼西林-鏈黴素，2% BM-Condimed H1及HAT)交換，並以HAT培養基進行融合瘤 之選別。於第8日回收培養上清並以EL I SA進行1次篩選。 [實施例2 ] 1次篩選 1次篩選利用aPC(Sigma，P-2200 )為抗原，以ELISA進 行。將aPC 以覆膜緩衝液（i〇〇mm〇i/L NaHC03，pH9. 6， 0-02w/v% NaN3)稀釋為〇.5"g/ml之濃度後，每穴各分注 100/zl/well 於 ELISA 用 96 孔平盤（Nunc，Maxisorp)並固 化。將平盤以微平盤清洗液清洗器（Bi〇ra(1，.del 1 550 ) 以湖洗緩衝液（PBS(_)，〇 〇5% Tween 20))洗淨，再以每 穴添加稀釋緩衝液（丨w/v% BSA，50 mmol/1，Tris-HCl

2125-5774-PF(Nl)；Chiume〇w.pid 第46頁 1322814 五、發明說明（45) 清混合’於室溫下溫育60分鐘。添加人類標準血漿（dAde BEHRUNG，GCH-l〇〇A)50 // 1於此混合液，再於室溫下溫育 60分鐘。安裝於血液凝固自動測定裝置（Amelung， KC-10A)並添加 APTT 試藥（DADE，BEHRING，GAA-20 0A)50/z 1。。不與灰聚溫育之aPC於添加APTT試藥前加入血漿中。於 37C下溫育3分鐘後，添加zommom CaCi2(DADE， BEHRING，GMZ-3 1〇 )5〇 // 1，並測定到凝固所花的時間。 以添加上述不與企漿溫育之apC之凝固時間（A) 100%，與P3U1培養上法，田古怂士 A 收 一 胥上，月，皿月後在與血漿溫育後加入apc之 凝固％間（B)為〇%，由盘點人# ^ Λ λ Dr t 由&合瘤培養上清溫育後與血漿溫 月後加入a P C之凝固時間广Γ、+、， . . 子間（C)未出對融合瘤培養上清凝固時 間延长的作用（不活仆；^ 伞給、佳扦S> w — 化抑制率以^以^㈧八八-8“100})。 貝驗進仃2次（實驗 固時間回復（延長）者當成在2次都認為有2〇%以上凝 定為陽性。 田战~性。有1 9株融合瘤培養上清認

1322814 五、發明說明（46) 表1 穴編號 不活化抑制率(％) 實驗1 貢驗2 19 36.83 20.48 41 46.81 55.49 50 23.74 21.14 64 45.70 32.02 79 87.96 68.33 123 23.45 20.68 143 25.27 34.10 172 25.52 58.64 181 26.22 33.66 192 21.36 30.18 223 26.87 22.92 236 24.56 21.66 240 22.18 22.19 243 21.25 27.87 263 21.00 27.96 281 33.82 21.64 285 24.50 28.23 298 32.29 27.19 302 27.30 20.75

[實施例4 ]抗體精製及因PC I對a PC不活化之作用探討

將穴編號1 9、4 1、6 4、7 9、2 8 1、2 9 8之融合瘤以含 1 0%超低IgG FCS HAT培養基培養後之培養上清以蛋白質G 管柱精製出IgG劃分，並以低分子基質測定PCI對aPC不活 化之作用。 具體而言，回收以10%超低IgG FCS HAT培養基50ml培 養後之融合瘤培養上清。將培養上清吸附於蛋白質G管柱 (Amersham Pharmacia Biotech， Hi trap protein G column)。以結合緩衝液（20mmol/l磷酸緩衝液pH7.0)10ml

2!25-5774-PF(Nl)；Chiumeow.ptd 第49頁 1322814 五、發明說明（47) 洗淨後’以提取緩衝液（〇.lm〇l/l甘胺酸缓衝液ρΗ2·7)溶 出。將回收之IgG劃分以Centriprep(密里博’ΥΜ-30)濃縮 後，將緩衝液置換為TBS。將所得到之IgG劃分40以1與10 //g/ml之aPC溶液1〇"1於室溫下反應6〇分鐘。將apc與抗 體之混合液50 y 1加入含肝素1 〇u之緩衝液（最終濃

度：70mmol/l Tris pH8.0， 125mmol/l NaCl， 10mmol/l CaCl2， 0.1% BSA)，使成180/zl。添加l〇〇"g/ml 重組 PCI (附Flag標記）溶液20以1，並於37 °C下反應30分鐘。添 加低分子基質S-2366 ( 2mmol/l )50 " 1，並測定50分鐘後的 吸光度（405nm)。 表2 對照 19 41 64 79 281 298 -PCI 0.278 0.245 0.303 0.301 0.325 0 308' 0.304 0.316 0.357 0.3—56 0.345 0.330 0.270 0.221 0.690 0.724 平均 aPC活性(％) 0.262 — 0.00 0.302 9.09' 0.317 12.35 0.310 10.89 0.357 21.32 0.338 17.06 0.248 (-3.59) 0.707 100.00

未添加PC I之aPC(表中之"- PC I")吸光度為〇. 707，但 添加PCI者，減少到〇. 262(表中之"對照11 )。將添加pci時 a P C活性當成0 %，未添加P C I時a P C活性當成1 〇 〇 %時，以吸 光度平均值為基準求出各融合瘤由來抗體之相對活性時， 穴編號79為2 1 %，28 1為1 7%，4 1為1 2%，因PC I抑制了 apc不 活化。完全沒有抑制aPC不活化之2 98，其培養上清之同種 型顯示可能為I gG。故，可能以I gG精製無法得到活性劃 分。利用以上精製抗體及低分子基質之發色試驗，可以明 白具有血聚凝固時間延長作用之a P C不活化抑制抗體亦可

2'. 2：-5774-?F(Nl );Chiumeow.ptd 第50頁 1322814 五、發明說明（48) 抑制因PCI造成的不活化。 [實施例5 ]抗aPC不活化抑制抗體之Η鏈及L鏈解析 以雷恩簡易工場迷你套組（R n e a s y Ρ 1 a n t M i n i K i t s ) (QIAGEN, Cat No. 74904 )對產生各抗體之融合瘤約lxl〇7 個細胞進行總核糖核酸之萃取。用聰明雷司互補去氧核糖 核酸增幅套組（SMART RACE cDNA Amplification kit)(Clonetech, Cat. No. K1811-1)，由總核糖核酸進 行互補去氧核糖核酸之合成。以#281、#285之IgGl不變區 特異引子或#79、#123之IgG2不變區特異引子以愛得萬提 吉2聚合酶連鎖反應套組（Advantage 2 PCR kit)以 5’-RACE進行PCR，使Η鏈及L鏈增幅。將增幅之Η鏈及L鏈去 氧核糖核酸片段以pGEM-T簡易載體（easy vector)(Promega，Cat. No_ A1560)選殖，以決定驗基序 列。 將所得到之鹼基序列進行解析的結果，發現Η鏈及L鏈 之可變區胺基酸序列各如第1圖所示。因#123及#285具有 類似序列，故推測此2個選殖體彼此的抗原決定基很接 近。 產業上之可利用性 本發明提供可抑制aPC不活化之非中和aPC抗體◊本發 明之抗體係透過抑制aPC不活化以維持aPC活性，具有抑制 血液凝固系之活化或持續aPC之抗發炎等生理活性效果。 本發明之抗體可使用於預防或治療因活化蛋白質C活性低

2125-5774-PF(Nl) ;Chiumeow.ptd 第51頁 1322814

2125〇7r4-PF(NI ) ;Cniuneow.ptd 第52頁 1322814 圖式簡單說明 第1圖表示抑制aPC不活化之抗apc抗體其Η鏈及L鏈可 變區之胺基酸序列。圖中aPC#79、apc#123、aPC#281及 aPC#285之VH區胺基酸序列各為序列識別號：1〜4， aPC#79、aPC#123、aPC#281 及 aPC# 285 之 VL 區胺基酸序列 各為序列識別號：5 ~ 8。

2125-5774-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第 53 頁 1322814 1/25

SEQUENCE LISTING

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120> ANTI-APC NON-NEUTRALIZING ANTIBODIES

<130> C1-A0214P <150> JP 2002-212582 <151〉 2002-07-22 <160〉 34 <170> Patentln version 3.1 <210〉 1 <211〉 117

<212〉 PRT <213> Mus rausculus <400〉 1 -

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 1322814 2/25 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Glu Val Tyr Pro Glu Thr Gly Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Lys Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Thr Arg Gly Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala 115 <210〉 2 <211〉 121 <212〉 PRT <213> Mus musculus 1322814 3/25 <400〉 2

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Gly lie Thr Thr Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 115 120 1322814 4/25 <210〉 3 <211〉 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ser Leu His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Leu 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 1322814 5/25

Ala Arg Gly lie Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Leu Thr 100 105 110

Val Ser Ser Ala 115 <210> 4 <211〉 121 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 4

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ser Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ser lie Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 1322814 6/25

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Gly Ser Ser Gly Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 115 120 <210〉 5 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 5

Gin lie Val Leu Ala Gin Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 1322814 7/25

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ala Trp 35 40 45 lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 6 <211〉 107

<212〉 PRT <213> Mus rausculus <400〉 6

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 10 15 1322814 8/25

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45

Asn Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys He Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin His Tyr Tyr Gly Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210〉 7 〈211〉 113

<212〉 PRT <213> Mus musculus 7 <400> 1322814 9/25

Asp Asn Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Asn Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110

Lys <210> 8 1322814 10/25 <211> 107 <212〉 PRT <213> Mus rausculus <400> 8

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Met Gly

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Arg lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys Gin His Tyr Tyr Gly Ser Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 1322814 11/25 <210〉 9 <211〉 5

<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 9

Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 <210> 10 <211〉 17

〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 10

Glu Val Tyr Pro Glu Thr Gly Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly 1322814 12/25 <210> 11 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400> 11

Gly Gly Thr Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 12 <211〉 5

<212〉 PRT <213> Mus musculus

<400〉 12

Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210〉 13 <211〉 17

PRT <212> 1322814 13/25 <213> Mus musculus <400> 13

Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Arg 15 10 15

Gly <210〉 14 <211〉 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 14

Trp Gly lie Thr Thr Ala Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210〉 15 <211〉 5

<212〉 PRT <213〉 Mus musculus 1322814 14/25 <400〉 15

Asp Tyr Ser Leu His 1 5 <210〉 16 <211〉 17

<212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 16

Trp lie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr 1 5 10 Gly

Ala Asp Asp Leu Lys 15

<210〉 17 <211〉 6

<212〉 PRT <213〉 Mus musculus 1322814 15/25 <400〉 17

Gly lie Thr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 18

<211〉 5

〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 18

Arg Ser Trp Met Asn 1 5

<210〉 19 <211〉 17

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 19

Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ser lie Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 15 10 15 1322814 16/25

Gly

<210〉 20 <211> 11 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 20

Trp Gly Ser Ser Gly Ser Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10

<210〉 21 <211> 12 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 21

Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 1322814 17/25 <210〉 22 <211〉 11 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 22

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ala Pro Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 7

<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 23

Tyr His Arg Ser Pro Phe Thr 1 5 <210〉 24 <211> 11

PRT <212〉 1322814 18/25 <213> Mus musculus <400〉 24

Arg Thr Ser Glu Asn He Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10

<210〉 25 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 25

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser

10 <210〉 26 <211〉 7

<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 26 1322814 19/25

Tyr Tyr Gly Thr Pro Pro Thr 1 5 <210〉 27 <211〉 17

<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 27

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Ser Ser Ser Asn Gin Lys Asn Phe Leu 1 5 10 15

Ala <210〉 28 <211〉 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 28

Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp 1322814 20/25 1 5 10 <210〉 29 <211〉 7

<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 29

Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210〉 30 <211〉 7

<212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400> 30

Tyr Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210〉 31 1322814 21/25 <211〉 5

<212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉

<223〉 heavy chain CDR1 <220〉

<221〉 MISC_FEATURE <222〉 （1)..(1) <223> 〃Xaa〃 at location 1 stands for Ser or Arg <400〉 31

Xaa Ser Trp Met Asn 1 5 <210〉 32 <211> 17 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> heavy chain CDR2 1322814 22/25 <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉（9)..(9) <223〉 "Xaa" at location 9 stands for Thr or Ser 〈220〉

<221〉 MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223〉 "Xaa〃 at location 10 stands for Asn or lie <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （16)..(16)

<223> ”Xaa” at location 16 stands for Arg or Lys <400> 32

Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Xaa Xaa Tyr Asn Gly Lys Phe Xaa 15 10 15

Gly <210> 33 1322814 23/25 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220> <223〉 heavy chain CDR3 <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 （3)..(3) <223〉 "Xaa〃 at location 3 stands for lie or Ser <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （4)..(4) <223〉 "Xaa〃 at location 4 stands for Thr or Ser <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 （5)..(5) <223> "Xaa〃 at location 5 stands for Thr or Gly <220〉

<221〉 MISC_FEATURE <222> (6).. (6) <223〉 "Xaa" at location 6 stands for Ala or Ser 1322814 24/25 <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉（7)..(7) <223〉 "Xaa" at location 7 stands for Ala or Ser <400〉 33

Trp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210〉 34 〈211〉 7 <212〉 PRT <213〉 Artificial <220〉 <223> light chain CDR3 <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 （4).· (4) <223〉 "Xaa" at location 4 stands for Thr or Ser <220〉 1322814 25/25

<221〉 MISC_FEATURE <222〉 （6)··(6) <223〉 "Xaa" at location 6 stands for Pro or Tyr <400> 34

Tyr Tyr Gly Xaa Pro Xaa Thr

Claims (1)

1323 1323 %年I丨月~曰修(|()正本 .炻年"月 ,ΙΒ· 284-4- 公告本 案號 921193&I 六、申請專利範圍 1. 一種抗蛋白質C或抗活化蛋白質C(aPC)之抗體，其 具有增強生體中活化蛋白質C作用之活性，包括： (a) 分別具有序列識別號：9、1 0、11的重鏈CDR1、 22、23的輕鏈 、33的重鏈CDR1 25、34的輕鏈 、17的重鏈CDR1 2 8、2 9的輕鏈 2、3，以及分別具有序列識別號：2 1 CDR1 、 2 、 3 ; (b) 分別具有序列識別號：31、32 2、3，以及分別具有序列識別號：24 CDR1 、 2 、 3 ;或 (c) 分別具有序列識別號：1 5、1 6 2、3，以及分別具有序列識別號：2 7 CDR1 、 2 、 3 ° 2. —種抗蛋白質C或抗活化蛋白質C之抗體，其具有抑 制（a)以血液使活化蛋白質C不活化，或（b)以活化蛋白質C 之生理阻害物質使活化蛋白質C不活化，或具有可抑制以 上兩者之活性，包括： 11的重鏈CDR1 22、23的輕鏈 、33的重鏈CDR1 2 5、3 4的輕鏈 、17的重鏈CDR1 2 8、.2 9的輕鏈 (a) 分別具有序列識別號：9、1 0， 2、3，以及分別具有序列識別號：21 CDR1 、 2 、 3 ; (b) 分別具有序列識別號：31、32 2、3，以及分別具有序列識別號：24 CDR1 、 2 、 3 ;或 (c )分別具有序列識別號：1 5、1 6 2、3，以及分別具有序列識別號：2 7 CDR1 、 2 、 3 °

2125-5774-PFl(Nl).ptc 第1頁 2009.11.10. 054 1322814 案號 92119361 年 月 修正 六、申請專利範圍 3. 如申請專利範圍第2項之抗體，其中活化蛋白質C之 生理阻害物質為絲胺酸蛋白酶抑制劑（SERPI Ns )。 4. 如申請專利範圍第3項之抗體，其中絲胺酸蛋白酶 抑制劑（SERPINs)為蛋白質C抑制劑或α 1抗胰蛋白酶。 5. 如申請專利範圍第卜2項任一項之抗體，係擇自由 人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體片段、單鏈抗體 及二元體所組成之族群。 6. —種抗體，其係與申請專利範圍第1 -5項中任一項 抗體之同一抗原決定基（epitope)結合。 III·

2125-5774-PFl(Nl).ptc 第2頁 2009. 11.10.055