TW200302275A - Highly-sensitive genomic assays employing chimeric bacteriophage standards - Google Patents

Description

200302275 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明提供一種利用雜交作用方法學而能敏感地定量 生物試樣中至少一種預先選定之DNA序列的方法，該方法 採用的內部標準是一種具感染性的噬菌體顆粒，其包含除 卻存在於預先挑選之DNA序列或生物試樣中經定量的DNA 以外之可偵測到的目標DNA序列；該方法採用的外部標準 是一種具感染性的噬菌體顆粒，其至少包含預先挑選之 DNA序列。 相關申請案之申述 [〇〇1]本申請案係根據35 USC § 119(e)主張2001年12月 6日提出之USSN 60/337,930之優先權，該申請案特定地以 參考文獻的形式完整地倂於本說明書中。 【先前技術】 發明背景 [002]爲了定量基因組目標物如DNA目標物，正確並且 可信賴的標準物是絕對必需的。在DNA標準物的情形之中 ，最常見的是質體DNA和PCR產物是首選，因爲它們很容 易產生。測量質體DNA和PCR產物的光密度（O.D.)可提供 對一種標準物之複本數的粗略估計，其藉由除以質體或 PCR產物的分子量得到。然而這種方法有嚴重的缺陷’大 部分是因爲光密度儀器（光度計）在定量質體和PCR產物的 不穩定性，該定量結果不只是因實驗室而異並且在同一實 驗室中也因人而異。此外，質體DNA和PCR產物也傾向不 200302275 穩定，因爲它們被發現對於多重的冷凍一解凍循環和難免 發生的Dnase污染很敏感。 【發明內容】 發明的簡要說明 [003] 就其最廣的方面而言，本發明係導向利用雜交作 用方法學敏感地定量生物試樣中至少一種預先挑選之DNA 序列的方法，該方法採用的內部標準是一種具感染性的噬 菌體顆粒，其包含除卻存在於預先選定之DNA序列或生物 試樣中經定量的DNA以外之可偵測到的目標DNA序列； 該方法採用的外部標準是至少包含有預先挑選之DNA序列 的一種具感染性的噬菌體顆粒。 [004] 在先前的方法之中，預先挑選的DNA序列可能是 病毒DNA序列的一部分，其中在生物試樣中之致病病毒的 存在與否和含量是希望被偵測到的。以人類之致病病毒爲 較佳；HBV或其他DNA病毒爲最佳；然而，預先挑選的 DNA序列可以是任何來源和得自任何疑有預先挑選之DNA 序列停駐之生物體試樣。該試樣可爲體液如全血、尿液、 原生質、血淸、腦脊髓液或含有細胞的切片試樣。利用雜 交方法的DNA偵測方法學較好是用分子浮標或任何其他形 式之以螢光染劑標記的探針之真實時間PCR。該內部標準 可爲經改造而含有單一複本可偵測序列的具感染性噬菌體 。外部標準則可爲具感染性噬菌體，其經改造而包含至少 單一複本之欲偵測之先前挑選的DNA。對於利用分子浮標 法之真實時間PCR而言，係採用經設計以放大和偵測內部 200302275 標準序列，和經設計以放大和偵測試樣和外部標準中預先 挑選的DNA序列之引子和分子浮標。該雜交方法學釋出經 改造噬菌體中的DNA，在本說明書中將之稱爲嵌合噬菌體 ，能從其內部釋出DNA。 [005] —種藉著從其製備嵌合噬菌體而可用作內部和外 部標準之較佳但並不具限制性之噬菌體，其能保留感染性 且包含單一複本之可偵測序列者爲M13,但其並非那麼具 有限制性。其他的噬菌體，較好是那些具有單股圓形DNA 者可被使用，但並非那麼具有限制性，並且可使用雙股 DNA病毒，如爛他（lambda)病毒。 [006] 用於內部和外部標準之DNA序列經改造成爲對應 的噬菌體以產生嵌合噬菌體。因爲插入序列不會影響噬菌 體的感染性，因此可藉由感染性檢驗很容易地絕對定量出 標準物中之目標DNA的量。 [007] 該內部標準之嵌合噬菌體含有未出現在生物試樣 中之可容易偵測的DNA序列，使得在作業進行前把已知量 的內部標準嵌合噬菌體添加到試樣中時，該內部標準嵌合 噬菌體DNA的回收程度可用於測知包含於其中之預先挑選 DNA的回收量。較好是在試樣中該預先挑選的DNA得自病 毒，如致病病毒的顆粒，使得再與任何試樣中的病毒顆粒 和添加的嵌合噬菌體顆粒一起加工的期間，在試樣加工和 分離DNA的期間兩者的處理條件相同，使得內部標準DNA 的回收情形能完全一致地反應出任何存在於原始試樣中的 預先挑選之DNA的回收情形。雖然本發明之嵌合噬菌體的 200302275 用途較好是用於偵測生物試樣中的病毒dna，但並非那@ 有限，其可用於偵測生物試樣中的其他DNA，如細菌的、 寄生蟲的、或甚至是試樣中得自宿主的DNA。 [008] 在一項較佳的具體實例中，內部標準之嵌合[(遼旨 體含有部分人類CCR5 DNA序列的一個複本。這個內部標 準物可用於任何檢驗，其中人類DNA並不存在於從試樣中 抽取出的DNA之中。若人類的DNA可能存在，則可使用 不存在於人體基因組或在人體DNA試樣中藉由DNA雜交 方法學無法偵測到的內部標準DNA序列。在一項不具限制 性的具體實例中，使用一種人類CCR5基因的對應部分， 從胺基酸142延伸到224(SEQ ID N〇:5)。PCR引子可偵測 SEQ ID N〇:6和SEQ ID NO:7。該實例使用一種能偵測先前 提到過之CCR5序列之分子浮標，如SEQ ID NO:8所顯示的 序列。在另一項具體實例中，內部標準之嵌合噬菌體包括 人類CD4 DNA之部分，與對應的探針與分子浮標一起使用 〇

[009] 在實行本發明所使用之定量從人類取得之全血試 樣中HBV病毒之一項非限制性實施例中，將藉由本說明書 之方法定量的DNA從全血試樣的原生質中分離出來，其本 質上不含人類DNA。內部標準爲具感染性的嵌合M13噬菌 體，其經修改而具有單一複本之人類CCR5 DNA序列的部 分，如以上所提到過的，但不限於此；而外部標準則是具 感染性的嵌合M13噬菌體，其經修改而具有單一複本之 HBV DNA序列的部分。再兩種嵌合噬菌體標準物中之DNA 200302275 的定量是藉由測量菌斑形成單位（PFU)來測量的；這些穩定 的標準物可以冷凍貯存。經設計以放大和偵測內部標準序 列的引子和分子浮標，以及經設計以放大和偵測試樣中預 先挑選之DNA序列和外部標準序列的引子和分子浮標被採 用於如以上提到的非限制性的實施例中。 [010]包含與試樣中同樣之可偵測的預先挑選之DNA序 列的外部標準物在病毒待定量的情形下可爲病毒基因組的 部分，其可用與偵測試樣中病毒相同的DNA定量方法來偵 測。因此PCR引子和分子浮標放大並可再試樣中辨認之單 一複本的序列可經修改至噬菌體的基因組中。在一項非限 制性的實施例中，噬菌體科例如用作HBV外部標準之M13 噬菌體顆粒可包含編碼HBV S基因之胺基酸127至164的 單一複本DNA，該DNA序列描述於SEQ ID N〇:l中。用於 放大和定量外部標準和在試樣中之這項序列的PCR引子和 分子浮標很容易就可以準備好。在此情形中，準備能與 SEQ ID N〇:2和SEQ ID N〇:3雜交的引子。一種有用於偵測 本序列之分子浮標能辨認SEQ ID ΝΟ··4中描述的序列。 [011 ]如先前之說明，內部標準物可爲經修改之具感染 性的噬菌體，其包括非預先挑選之DNA序列之任何序列， 並且不是附屬在試樣之中的。 [012]包含內部標準和外部標準序列之經修改的噬菌體 顆粒提供高度穩定的試劑，其可輕而易舉的用於實行高敏 感度的檢驗。由於噬菌體的存活不受插入該序列影響，因 此噬菌體PFU的檢驗能提供對於標準物中DNA序列之數目 10 200302275 的定量，因此這些試劑的標準化很容易。 [013]爲了實行本發明的方法，在偵測人類全血中之 HBV的非限制性實例中，將全血試樣離心並取出100微升 的原生質部分，添加已知量之外部標準含CCR5基因片段 的嵌合噬菌體，並抽取DNA。對HBV和CCR5片段進行的 真實時間PCR是使用外部標準在經加工的樣品上進行的， 該標準利用含有HBV序列部分的嵌合噬菌體，可被用於該 試樣之同樣的引子和分子浮標所偵測。試樣中CCR5的回 收和偵測到的HBV量被用於計算原始試樣中真確的HBV 含量。 [013] 本發明亦引出包含插入內部標準序列或外部標準 序列之噬菌體顆粒，尤其是其中此種插入作用對於病毒不 具有破壞性作用，因此能確切定量病毒試樣中特殊DNA的 複本數目。因此試樣之PFU數目等於存在於噬菌體標準物 中之內部標準物序列或外部標準物序列之數目。在非限制 性的實例中，具有SEQ ID NO: 1插在其6247位置的Ml3噬 菌體以及具有SEQ ID NO:5插在其6247位置的M13噬菌體 被包括於本說明書中。這些只是本發明之經修改噬菌體的 範例。 [014] 從以下的圖式簡單說明和詳細說明可以瞭解到本 發明的這些和其他方面。 【實施方式】 本發明的詳細說明 [023]在本方法說明之前，吾人必須瞭解本發明並不限 11 200302275 於所說明的特別方法和實驗條件，因爲這些方法和條件可 以改變。吾人亦應瞭解本說明書中所使用的名詞學只是爲 了說明特別的具體實例，並非意圖作限制，因爲本發明的 範疇只受附加的申請專利範圍所限。 [024] 如本說明書和附加的申請專利範圍中所使用的， 單數形式的”a”、”an”和”the’’包括複數參考，除非上下文有 淸楚的指不。因此例如提到”a method( —種方法）”包括一種 或多於一種本說明的該種型式和/或對於熟習本技藝者在閱 讀本專利說明書時顯然易知的方法和/或步驟等等。 [025] 除非另有定義，否則所有用於本說明書之技術和 科學名詞具有同於具本技藝之一般技巧者普遍瞭解的意義 。雖然任何相似或相等於本說明書所說明之方法和材料可 用於實行或試驗本發明，但是現在要說明較佳的方法和材 料。所有在本說明書中提到的出版品以參考文獻的形式並 於本說明書中以說明與引用的出版品關聯的方法和/或材料 〇 [026] 本發明的檢驗提供高度精確和敏感的方法用於定 量試樣中預先挑選之DNA序列的濃度。該檢驗較好是適用 於偵測生物試樣中病毒顆粒數目但並非如此受限，其採用 的標準物是包含適當DNA序列的活噬菌體顆粒：對於內部 標準而言，當輸入DNA的回收率經測知並且所得到的偵測 濃度從而經過校正時，使用含有與輸入DNA完全不同之 DNA序列的噬菌體，使得內部標準的可測性不受任何試樣 或檢驗成分的影響。用於產生標準曲線或單點校正之外部 12 200302275

標準是至少包含與試樣中偵測到相同DNA之活噬菌體顆粒 ，因而用於定量試樣中預先挑選之DNA的試劑被用於得到 外部標準。利用根據雜交作用的DNA偵測檢驗，添加到檢 驗之標準物噬菌體中的DNA 在第一個融化循環中即從噬菌體釋放出來。 [027] 本發明之利用包含外部和內部標準物DNA序列的 活噬菌體棊因組檢驗由於數個理由提供了高度精確和敏感 的檢驗。首先，該噬菌體顆粒很容易產生（大約i〇9pFU/微 升）。其次，該噬菌體即噬菌體中的DNA很容易藉由PFU 測量而定纛，定量結果與使用限制性稀釋作用PCR 一致。 第三，維持和轉移噬菌體很容易，因爲它們對Dnase處理 和溫度變化有抗性。最後，其很容易精確，因爲不需要 DNA抽取：PCR條件會使標準物的DNA從其菌體顆粒包 裝中釋出。在M13的情形中，單股的、圓型的DNA在初段 的溫度變性期間一旦被加熱到95°C即自動釋入到PCR反應 混合物中。本發明的經修改之噬菌體顆粒在本說明書中稱 爲嵌合噬菌體’以反映菌體基因組中存在的非11筮菌體 DNA。 [028] 在以下的實例中將會看到本發明之經修適用於偵 測HBV的檢驗具有6-l〇g動態學範圍’並且可偵測少至10 個HBV複本’且高達⑽〇,⑻〇個複本。相對的’羅氏 HBV監測檢驗（R〇che HBV Monitor assay)具有200個複本的 敏感度，操作超過3-l〇gs且因而能偵測2⑻到個複 本；拜耳的HBV bDNA檢驗操作超過4-logs，並且敏感達 13 200302275 到 0.7mEQ(xl06)，因而可偵測 〇·7 至 5,000Meci(xl06)。 [029] 嵌合噬菌體是用以下的標準重組DNA技術製備的 。簡言之，用PCR放大目標序列並利用T4連接酶藉 (Gibco)由隔夜連接作用將其插入Smal或Xmal切位。因爲 DNA片段插入Smal或Xmal切位會破壞α-肽序列，因此喪 失β-半乳糖酶活性是預料中的，其會以白色斑塊替代藍色 斑塊反應出來。藉著挑出多重白色斑塊，接著一系列定序 鑑認特徵，吾人因而可以挑選帶有所需目標序列的Μ13噬 菌體。Μ13噬菌體序列的長度是7250bp，且其完整序列與 限制和酸內切酶的資訊可在網址www.lifetech.com上找到。 本說明書的目標序列是不可變得並且被插入多重轉殖部位 的Smal或Xmal切位。 [030] 除了以上提到的目標序列，吾人可將任何與待偵 測的基因組序列完全相同的DNA序列插入M13噬菌體中。 然而，爲了防止偵測到試樣中摻雜的基因組DNA，吾人總 是可將cDNA序列插入M13噬菌體，沒有任何基因組DNA 會從M13放大，因爲其在不同的表現序列之間存在有很大 的插入序列。因此在本發明的這項具體實例的實施例中， 人類CD4基因的引子和游標以根據本說明書所教示的方法 準備好。而且有許多單股和雙股的DNA噬菌體可以相同的 形式用作定量標準物。在單股DNA的情形之中，M13無疑 地是最方便且可靠的選擇，對於該載體的許多知識及其生 物學是可獲得的。對於雙股噬菌體而言，λ系列如同以上的 理由是較佳的選擇。所有這些重組噬菌體極爲容易生產、 14 200302275 純化和藉由測羹PFU來定量。 實施例 [031] 以下實施例被提出以提供熟習本技藝者完整的揭 不與P兌明如何製造和使用本發明的方法與組合物，其並非 意圖限制發明省認爲是其發明之範疇。吾人已盡力確保所 使用的數字精確（例如含量、溫度等），但是某些實驗性的誤 差和偏差應該由此解釋。除非另有指示，否則比例是重量 比’分子量是平均分子量，溫度是攝氏度數，且壓力是一 大氣壓或接近〜大氣壓。 [032] M13噬菌體DNA標準物製造如下：利用檢驗用之 適當引子和產生鈍端產物用的Pfu聚合酶以產生有興趣的 放大序列。將產物在1%瓊脂膠體上純化並且連接到M13mp 18RF DNA(Gibco出品）之中。使用連接作用產物使DHa5F’ 勝任細胞（Gibco出品）轉型。利用藍白挑選不含β-半乳糖酶 活性者以鑑認含有插入序列之噬菌體所產生的斑塊。藉由 PCR法利用引子1^13邛11(：不（5’· CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3，)(SEQ ID Ν〇··9)和 M13/pUC-b(5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，)（ SEQ ID N〇:10)在30循環（95°C經30秒，55°C經30秒，72°C經1 分鐘）的PCR中篩選陽性斑塊。這些是M13噬菌體的一般 引子，位在插入區域的兩側。因此它們可以用於篩選是否 噬菌體有插入序列。正確大小的片段進一步以序列分析法 篩選。滴定噬菌體並將之在不含Rnase的水中進行一系列 稀釋。將噬菌體直接放入反應中，因爲95°C經10分鐘的 15 200302275 變性步驟足以使噬菌體的DNA暴露出來。 [033] 對每一利用最少6個範圍自2·5χ106至2.5X101複 製序列所進行的真實時間PCR檢驗做出外部標準曲線。因 爲噬菌體是單股，所以在真實時間PCR檢驗中一個顆粒相 當於0.5個雙股DNA複本。噬菌體標準物在室溫和4°C下 是穩定的，雖然貯存物是保持在-20°C下。 [034] 本發明的方法顯示於圖1中，用以正確地定量生 物試樣中的HBV基因組，其中內部標準之噬菌體-CCR5在 DNA抽取和HBV的真實時間PCR前被添加到試樣中，並 且與得自利用噬菌體之外部標準的標準曲線比較。圖2顯 示用以測定HBV基因組之部分的分子浮標（A)，且圖（B)顯 示該浮標雜交至目標序列，造成浮標末端的螢光團與退火 劑分離，結果造成螢光。圖3顯示含有浮標之目標序列的 DNA之PCR放大作用之作圖，以及得自添加至試樣中之增 加含量的噬菌體-HBV的標準曲線。圖4顯示用於本發明之 HBV檢驗的引子和浮標之基因組的位置。圖5顯示用於 CCR5檢驗的引子和浮標位置。CCR5基因部分之5’和3’端 被陰影覆蓋的序列是PCR引子，而較暗位置居中的序列則 是浮標的辨識序列。 [035] 圖6顯示本發明之HBV檢驗之敏感度和動態學範 圍的兩個實施例。圖7描述在4°C、室溫，和37°C下貯存 3-4週之後包含HBV聚合苷酸之噬菌體的穩定度。圖8顯 示同步（多重）檢驗試樣中的HBV序列和CCR5序列，並且 在同一試管中進行HBV和CCR5的放大時兩者間並無干擾 16 200302275 。該結果顯示產生包含HBV基因或CCR5基因的M13噬菌 體極端有效率並且該具感染性之噬菌體的效價高達1〇9/每 微升培養旋浮液。而且，本發明的方法在包含HBV基因或 CCR5基因的具感染性之Ml3噬菌體的斑塊形成單位和以限 制性稀釋定量PCR測量到的複本數目之間有非常高度的相 關性。 【圖式簡單說明】 [015]圖1係描述本發明之精確定量生物試樣中HBV 基因組的方法之實例，其中噬菌體CCR5之內部標準物被 添加到試樣中，然後進行DNA抽取和HBV的真實時間 PCR，以及和利用噬菌體-HBV從外部標準物所得到之標準 曲線比較。 [016] 圖2係描述用於偵測HBV基因組（A)之部分的分 子浮標，以及顯示游標雜交至目標序列，造成浮標末端之 螢光團和退火劑分離而造成螢光的圖（B)。 [0017] 圖3A-C顯示以PCR放大含有游標之目標序列 DNA的作圖（圖3A)，以及得自添加至試樣的噬菌體_1«¥逐 漸增加之標準曲線（圖3B-C)。 [018] 圖4A-B顯示用於本發明之HBV檢驗的引子和游 標的基因組位置。編碼胺基酸127至164之序列的之5’和 3’端被陰影覆蓋的序列是PCR引子，而較暗位置居中的序 列則是浮標的辨識序列。 [019] 圖5顯示用於CCR5檢驗的引子和浮標的位置。 編碼CCR5基因之5’和3’端之被陰影覆蓋的序列是PCR引 17 200302275 子，而較暗位置居中的序列則是浮標的辨識序列。 [020] 圖6A-B顯示本發明之HBV檢驗的敏感度和動態 學範圍的兩個實例。 [021] 圖7A-F描述包含一種HBV聚核苷酸之噬菌體在 貯存於4QC (圖7A-B)、室溫（圖7C-D)、和37QC(圖7E-F)經 3-4週之後的穩定度。 [022] 圖8A-D顯示對試樣中的HBV序列（圖8A-B)和 CCR5(圖8C-D)兩者同步（多重）進行的檢驗，並且在同一試 管中HBV和CCR5的放大作用不受干擾。

18 200302275 序列表 <11〇> Zhang，Linqi (章林西）

Ho, David A.(何大衛） <120>使用嵌合噬菌體之高敏感性基因體檢驗 <130> 2570-1-002 <150> US 60/337,930 <151> 2001-12-06

<160〉 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> Γ12 <212〉 DNA <213>噬菌體M13 <400〉1 tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctctgc atcctgctgc tatgcctcat 60 cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc gtttgtcctc ta 12

<210> 2 <211> 27 <212〉 DNA <21：3>人工合成序列 <220〉 引子 <400> 2 tcgctggatg tgtctgcggc gttttat 27 <210> 3 <211> 24 200302275

<212> DNA <213>人工合成序列 <220> 引子 <400> 3

ggtatgttgc ccgtttgtcc tcta 24 <210〉 4 <211> 29 <212> DNA <21人工合成序列

<220> <223〉浮標 <400〉 4 cctgctgcta tgcctcatct tcttgttgg 29 <210〉 5 <211> 239 <212> DNA <21：3>人類 <400> 5 gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat 60

tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca 1 20 ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg 1 80 ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgag 2 39

<210> 6 <211> 24 <212> DNA <213>人工合成序列 <220〉 <223>引子 2 200302275 <400> 6 gctgtgtttg cgtctctccc agga 24

<210> 7 <211> 24 <212> DNA <213>人工合成序列 <220> <：22：3> 引子 <400> 7 gaagaagagg cacagggctg tgag 24 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213〉人類 <400> 8 gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtc 28

<210> 9 <211> 23 <212> DNA <213〉人工合成序列 <220〉 <22：3>引子 <400〉 9 cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210> 10 <211> 23 <212> DNA <21人工合成序列 <220> 200302275 <223〉引子 <400〉 10 agcggataac aatttcacac agg 23

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Claims (1)

1. 200302275 拾、申請專利範圍 1. 一種利用雜交作用方法學定量生物試樣中至少一種預 先挑選之DNA序列的方法，其中該方法採用的內部標準是 一種具感染性的M13噬菌體顆粒，該顆粒包含除了存在於 預先選定之DNA序列或由生物試樣中經定量的DNA以外 之可偵測到的目標DNA序列；該方法採用的外部標準是一 種具感染性的M13噬菌體顆粒，其包含預先挑選之DNA序 列。 2. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該雜交作用方 法學係利用分子浮標之真實時間PCR放大作用。 3. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該內部標準是 包含人類CCR5基因之一部份之具感染性M13噬菌體。 4. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中該人類CCR5 基因之部份爲SEQ ID N〇:5。 5. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該預先挑選之 DNA序列是B型肝炎病毒的一部份。 6. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該外部標準是 包含B型肝炎病毒基因組之一部份之具感染性的M13顆粒 〇 7. 根據申請專利範圍第5項的方法，其中該外部標準是 包含B型肝炎病毒基因組之一部份之具感染性的M13顆粒 〇 8. 根據申請專利範圍第7項的方法，其中B型肝炎基 因組之部份是B型肝炎蛋白質S的一部份。 19 200302275 9. 根據申請專利範圍第8項的方法，其中該部分爲SEQ ID N〇:l。 10. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該試樣係選 自全血、尿液、原生質、血淸、腦脊髓液或含有細胞的切 片試樣所組成之群組。 11. 一種包含SEQ ID ΝΟ:1之具感染性之嵌合M13噬菌 體。 12. —種包含SEQ ID NO:5之具感染性之嵌合M13噬菌 拾壹、圖式 如次頁

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