CN1612940A

CN1612940A - 利用嵌合噬菌体标准物的高灵敏基因组检测

Info

Publication number: CN1612940A
Application number: CNA028268415A
Authority: CN
Inventors: 张林琦; D·D·霍
Original assignee: Aaron Diamond AIDS Research Center
Current assignee: Aaron Diamond AIDS Research Center
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2022-12-04
Also published as: AU2002351221A1; US20080318204A1; JP2005514012A; CN1311084C; TW200302275A; WO2003050308A1

Abstract

本发明提供了使用杂交方法学灵敏地定量生物样品中至少一种预选择DNA序列的方法，该方法使用感染性噬菌体颗粒体作为内标物，该噬体菌体颗粒包含可检测的靶DNA序列而不含存在于预检测DNA序列或生物样品中定量的DNA中的DNA序列，本方法并使用至少包含预选择DNA序列的噬菌体颗粒作为外标物。

Description

利用嵌合噬菌体标准物的高灵敏基因组检测

相关申请的陈述

本申请根据35USC§119(e)要求2001年12月6日申请的USSN60337,930的优先权，该申请此处被特别完全引入作为参考。

背景技术

为了定量基因组靶物质如DNA靶物质，准确而可靠的标准物是必须的。在DNA标准物的实例中，通常，质粒DNA和PCR产物因为容易产生而被首选。通过利用质粒DNA或PCR产物的分子量分离它们，检测质粒DNA或PCR产物的光密度可提供标准物的粗略估计的拷贝数量。但是，这种方法有一些缺点，主要由于光密度仪器(分光计)在定量质粒和PCR产物时的不稳定性，它不仅随着实验室与实验室的不同而改变，也随着同一实验室的不同人而改变。此外，质粒DNA和PCR产物倾向于不稳定，因为发现它们对多次反复冻融和偶然的脱氧核糖核酸酶污染很敏感。

发明概述

总的来说，本发明涉及利用杂交方法学灵敏地定量生物样品中至少一种预选择的DNA序列的方法，该方法利用感染性噬菌体颗粒用作内标物(internal standard)，该噬菌体颗粒包含可检测的靶DNA序列，而不是那些存在于预选择DNA序列中的或生物样品中被定量的DNA中的，该方法使用至少包含预选择DNA序列的感染性噬菌体颗粒作为外标物(external standard)。

在前述的方法中，预选择DNA序列可以是病毒DNA序列的部分，其中生物样品中的致病病毒的存在和数量期望被检测出。优选为人类致病病毒；最优选为HBV或其它DNA病毒；然而，预选择DNA序列可以是任何来源的，并且该样品来自任何怀疑带有预选择DNA序列的生物体。该样品可以是体液，如全血，尿液，血浆，血清，脑脊液或含有细胞的活检样品。该利用杂交方法的DNA检测方法学优选可以是使用分子标志或荧光染料标记的任何其它形式探针的实时PCR(real-time PCR)。该内标物可以是感染性噬菌体，其被改造含有可检测序列的单拷贝。外标物可以是感染性噬菌体，其被改造至少含有期望被检测的预选择DNA的单拷贝。对于利用分子标志的实时PCR方法，使用被设计为扩增和检测内标物序列以及扩增和检测在样品和在外标物中的预选择DNA序列的引物和分子标志。杂交方法学释放了在改造的噬菌体中的DNA，此处指嵌合噬菌体(释放其中的DNA)。

一种优选的，但并不局限的可以被用作内标物和外标物的噬菌体可以是M13但并不是非常局限的，通过制备嵌合噬菌体，从中保留其感染力并包含可检测序列的单拷贝。可以使用但不局限于其它噬菌体，优选那些具有单链环状DNA的噬菌体，双链DNA病毒也可以使用，如λ。

用于内标物和外标物的DNA序列被改造引入到相应的噬菌体中以生产嵌合噬菌体。由于插入序列并不影响噬菌体的感染力，标准物中的靶DNA的绝对数量可以通过感染检测容易地确定。

内标物嵌合噬菌体包含易于检测出的DNA序列，该序列在生物样品中不存在，因此当已知数量的内标物嵌合噬菌体在处理之前被加入到样品中时，内标物嵌合噬菌体DNA的收获(recovery)程度可以被用于评价其中含有的预选择DNA的收获率。优选地，样品中的预选择DNA来自病毒颗粒，如致病病毒，这样，在与样品中的任何病毒颗粒和加入的嵌合噬菌体颗粒一起处理的过程中，二者在样品处理和分离DNA的过程中都接受同样的处理条件，从而，内标物DNA的收获率精确地反映了存在于原始样品中的任何预选择DNA的收获率。虽然本发明中嵌合噬菌体的使用优选用于在生物样品中检测病毒DNA，但是它不仅限于此，它可被用于检测生物样品中其它DNA，如细菌，寄生物，或甚至是样品中的宿主衍生的DNA。

在优选的实施方案中，内标物嵌合噬菌体包含人CCR5 DNA序列的一部分的一个拷贝。这种内标物可以被用于人DNA不存在于从样品中提取出的DNA中的任何检测中。如果存在人DNA，那么可以使用一种不存在于人类基因组或通过DNA杂交方法在人DNA样品中可以检测出的内标物DNA序列。在一个非限制的实施方案中，使用人CCR5基因从氨基酸132延伸至224的相应部分(SEQ ID NO：5)。该PCR引物可以检测SEQID NO：6和SEQ ID NO：7。一种能够检测上述CCR5序列(如在SEQ ID NO：8中所显示的序列)的分子标志被使用。在另一个实例中，内标物嵌合噬菌体包含人CD4 DNA序列的一部分，使用相应的探针和分子标志。

在一个非限定的实例中，本发明实践使用的用于在来自人类个体的全血样品中定量HBV病毒的试剂；通过此方法用来定量的DNA从全血样品的血浆中分离出来，并基本不含人DNA。内标物是一种感染性的嵌合M13噬菌体，其通过改造含有人CCR5 DNA序列一部分的单拷贝，例如但不限于如上所述；外标物是一种感染性的嵌合M13噬菌体，具通过改造含有HBV DNA序列一部分的单拷贝。前述两种嵌合噬菌体标准物的DNA的数量的确定通过测定噬菌斑形成单位(PFU)完成；这些稳定的标准物可以冷冻贮藏。如上所述，在该非限制性实施例中使用被设计来扩增和检测内标物序列以及被设计来扩增和检测些在样品中和在外标物中预选择DNA的引物和分子标志。

例如如果预定量一种病毒，包含与样品中相同的可检测的预选择DNA序列的外标物可以是通过与样品中的病毒相同的DNA定量方法可检测的病毒基因组的一部分。这样，PCR引物和分子标志在样品中扩增并识别的该序列的单拷贝可以通过改造引入到噬菌体基因组中。在非限定的实施例中，被用作HBV外标物的噬菌体颗粒(如M13噬菌体颗粒)可以包含HBVS基因的编码氨基酸127至164的DNA的单拷贝，该DNA序列描述于SEQ ID NO：1中。在外标物中和在样品中扩增和检测该序列的PCR引物和分子标志是容易制备的。在该实例中，制备与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3杂交的引物。一种有用的用来检测该序列的分子标志识别描述于SEQ ID NO：4的序列。

如上所述，内标物可以是一种感染性噬菌体，通过改造含有任何非预选择DNA序列，且不偶然存在于样品中的DNA序列。

含有内标物和外标物序列的工程噬菌体颗粒提供了在进行高灵敏检测中容易使用的高稳定性试剂。由于噬菌体的存活力不受插入序列的影响，因而对于噬菌体PFU的检测提供了在标准物中存在的DNA序列数目的准确的定量，因而这些试剂的标准化是简单的。

为了实现本发明的方法，在检测人全血中的HBV的非限定的实施例中，离心全血样品，取100微升等分的血浆，加入已知数量的内标物含CCR5基因片段的嵌合噬菌体，提取该DNA。在处理后的样品中对HBV和CCR5片段进行实时PCR，连同使用含有部分HBV序列的嵌合噬菌体的HBV外标物通过与用于样品中的相同的引物和分子标志检测出。样品中CCR5的收获率和检测出的HBV的数量被用来计算原始样品中实际的HBV数量。

本发明也涉及含有插入的内标物序列和外标物序列的噬菌体颗粒，尤其是这种插入对于病毒的生存力没有有害的影响，从而正确定量出病毒样品中特定DNA的拷贝数。因此，样品中PFU的数量与存在于噬菌体标准物中的内标物序列和外标物序列相等。在非限制的实例中，SEQ IDNO：1插入到位置6247的M13噬菌体包括在此，还包括SEQ ID NO：5插入到位置6247的M13噬菌体。这些仅仅是本发明典型的工程噬菌体。

本发明的这些和其它方面将通过以下附图的简要说明和发明详述来说明。

附图简述

图1描述了用本发明的方法准确定量生物样品中的HBV基因组的实例，其中在DNA提取和对HBV进行实时PCR之前，将噬菌体-CCR5内标物加入到该样品中，并与利用噬菌体-HBV的外标物产生的标准曲线比较。

图2显示一种检测一部分HBV基因组的分子标志(A)，示意图(B)显示标志与靶序列的杂交，导致荧光团与标志末端的淬灭剂分离和随之产生的荧光。

图3A-C显示PCR扩增含有标志的靶序列的DNA的示意图，以及由加入样品中的不断增长的数量的噬菌体-HBV产生的标准曲线(图3B-C)。

图4A-B显示在本发明的HBV检测中使用的引物和标志的基因组定位。在编码氨基酸127-164的序列的5’和3’末端阴影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是标志的识别序列。

图5显示用于CCR5检测的引物和标志的位置。在CCR5基因部分的5’和3’末端的阴影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是标志的识别序列。

图6A-B显示本发明HBV检测的灵敏性和动态范围的两个实例。

图7A-F描述了在4℃(图7A-B)、室温(图7C-D)和37℃(图7E-F)贮藏3-4周后，含有HBV多核苷酸的噬菌体的稳定性。

图8A-D显示对样品中的HBV序列(图8A-B)和CCR5(图8C-D)序列的同时(多元)检测，并且在同一试管中HBV和CCR5的扩增互不干涉。

发明详述

在描述本方法之前，应该理解本发明并不仅限于所描述的特定方法和实验条件，因为这种方法和条件可以改变。也应当理解，这里使用的术语仅用来描述特定的实施方案，并不用于限制，因为本发明的范围仅由附加的权利要求所限定。

正如在说明书和附加的权利要求中所用的，单一形式的“一个”和“这个”包括复数，除非上下文中有清楚的指示。因而例如，涉及“一种方法”包括一种或多种方法，和/或这里描述类型的步骤，和/或对于阅读了本公开的本领域技术人员来说变得明显的方法等。

除非另有定义，这里使用的所有的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员理解的意义相同。虽然任何与这里描述相似或相同的方法和材料可以用于本发明实践或检验，但优选的方法和材料在这里描述。这里涉及的所有出版物被引入作为参考，用来描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。

本发明的检测提供了准确和灵敏定量样品中预选择DNA序列的水平的方法。该检测方法优选适于检测生物样品中病毒颗粒的数量，但并不仅限于此，检测使用的标准物是活的含有适当DNA序列的噬菌体颗粒：对于内标物，插入的DNA的收获率被评价，并且从而校正得到的检测水平，利用含有与插入DNA完全不同的DNA序列的噬菌体，以使内标物的检测能力不受样品或检测中的任何成分的影响。用于产生标准曲线或单点校准器(Single-point calibrator)的外标物，是一种至少包含与样品中检测的相同的DNA序列的活噬菌体颗粒，因此用定量在样品中预选择DNA的试剂可以用作外标物。使用一种基于杂交的DNA检测方法，加入到检测中的标准物噬菌体中的DNA在第一次融解循环中从噬菌体中释放。

由于一些原因，利用活的含有外标或内标DNA序列的噬菌体的本发明基因组检测提供了一种高度准确和灵敏性的检测。首先，噬菌体颗粒容易产生(将近10⁹PFU/ul)。其次，通过测定与有限稀释PCR检测相匹配的PFU，该噬菌体和在噬菌体中的DNA因而容易被定量。第三，保存和转移噬菌体颗粒是容易的，因为它们能抵抗脱氧核糖核酸酶的处理和温度的变化。最后，它很容易达到精确，因为不必提取DNA:PCR条件使标准物的DNA从它们的噬菌体颗粒包装中释放出来。在M13的实例中，一旦被加热到95℃时，在模板的初始片段变性期间，单链环形的DNA自动地释放到PCR反应混合物中。本发明的工程噬菌体颗粒在此处是指嵌合噬菌体，以反映在噬菌体基因组中非噬菌体DNA的存在。

正如在下面实施例中所示，本发明的检测适合具有6-log动态范围的HBV的检测，并且可以检测到从小到10个至10,000,000个HBV拷贝。相比之下，Roche HBV Monitor检测具有200个拷贝的灵敏度，操作范围3log并从而可检测200至200,000个拷贝；Bayer的HBV bDNA检测操作范围4log，灵敏度为0.7Meq(×10⁶)，从而可以检测0.7至5000Meq(×10⁶)。

嵌合噬菌体按照如下标准重组DNA技术制备。简单地说，靶序列通过PCR扩增并用T4(Gibco)连接酶过夜连接插入到SmaI或XmaI位点。由于将DNA片段插入到SmaI或XmaI位点会中断α-肽序列，因而β-半乳糖苷酶活性丧失，它通过白色的噬斑取代了蓝色的噬斑反映出来。通过挑选多个白色噬斑，之后进行一系列序列鉴定，我们从而可以选择那些带有符合需要的靶序列的M13噬菌体。M13噬菌体序列长为7250个bp，并且它的全序列和限制性核酸内切酶信息可以在Internet上找到，网址为 www.lifetech.com。这里的靶序列是不变的，并且在多克隆位点插入到SmaI或XmaI位点。

除了上述的靶序列，任何与检测基因组序列相同的DNA序列可以被插入到M13噬菌体中。然而为了避免在测试样品中检测到污染的基因组DNA，通常可以将cDNA序列插入到M13噬菌体中，由于一个大的内含子存在于不同的外显子之间从中不会扩增到基团组DNA。因此，在本发明的这种实施方案的一个实例中，人CD4基因的引物和标志根据此处的教导制备而成。而且，许多单链和双链DNA噬菌体可以被用作同样形式的定量性标准物。在单链DNA的实例中，M13无疑是最方便和可靠的选择，已有许多关于这种载体和它生物学的知识。至于双链噬菌体，λ系列因为上述同样的原因是一种优选。通过测定PFU，所有的这些重组噬菌体都非常容易生产、纯化和定量。

实施例

为了向本领域普通技术人员提供完全的公开和说明怎样制备和使用本发明的方法和合成物，公开以下实施例，但是并不是有意限定发明者认为的其发明的范围。虽然已经努力确保关于所使用数量的准确性(如数量，温度等)，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。除非已经指出，否则，部分是指按重量计的部分，分子量是指平均分子量，温度是用摄氏度表示，压力是指等于或接近大气压。

M13噬菌体DNA标准物制备如下：用适当的检测引物和产生平端产物的Pfu多聚酶产生目的扩增子。该产物在1％的琼脂糖凝胶中纯化，并根据制造商的说明书连接到M13mp 18RF DNA(Gibco)上。连接产物用于转化DHα5F’感受态细胞(Gibco)。由于缺少β-半乳糖苷酶活性，含有插入片段的噬菌体产生的噬斑用蓝/白选择进行识别。通过在一个30循环的PCR中(90℃进行30秒，55℃进行30秒，72℃进行1分钟)，用引物M13-pUC-F(5’CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)(SEQ ID NO：9)和M13/pUC-b(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)(SEQ ID NO：10)，筛选阳性噬斑。这些是插入区域侧翼的M13噬菌体的通用引物。因此它们可用于筛选噬菌体是否有任何插入。正确大小的片段进一步通过序列分析进行筛选。噬菌体被滴定，且系列稀释在无核糖核酸酶的水中进行。由于10分钟95℃的变性步骤足够使噬菌体DNA暴露，因此噬菌体被直接放入PCR反应中。

使用最小2.5×10⁶至2.5×10¹的6次复制，对每个实时PCR检测产生一个外标物曲线。由于噬菌体为单链，在实时PCR检测中，一个颗粒相当于0.5个双链DNA的拷贝。噬菌体标准物在室温和4℃下稳定，虽然它的贮藏维持在-20℃。

本发明的方法示于图1，为准确定量生物样品中的HBV基因组，其中将噬菌体-CCR5内标物在DNA提取和对HBV进行实时PCR之前加入到样品中，并与利用噬菌体-HBV的外标物产生的标准曲线比较。图2显示-种检测HBV基因组的一部分的分子标志(A)，示意图(B)显示了标志与靶序列的杂交，导致荧光团与标志末端的淬灭剂分离和随之产生的荧光。图3显示PCR扩增含有标志的靶序列的DNA的示意图，以及由加入样品中的不断增长的数量的噬菌体-HBV产生的标准曲线。图4显示在本发明的一个HBV检测中使用的引物和标志的基因组位置。在编码氨基酸127-164的序列的5’和3’末端的阴影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是标志的识别序列。图5表示用于CCR5检测的引物和标志的位置。在CCR5基因部分的5’和3’末端的阴影序列是PCR引物，更暗的位于中央的序列是标志的识别序列。

图6显示本发明HBV检测的灵敏性和动态范围的两个实例。图7描述了在4℃，室温和37℃贮藏3-4周后，含有HBV多核苷酸的噬菌体的稳定性。图8表示对样品中的HBV序列和CCR5序列的同时(多元的)检测，并且在同一试管中HBV和CCR5的扩增互不干涉。结果显示，含有HBV基因或CCR5基因的M13噬菌体的产生是非常有效的，并且感染噬菌体的效价高达每微升培养上清液10⁹。进一步，本发明的方法在含有HBV基因或CCR5基因的感染性M13噬菌体的噬斑形成单位与通过有限稀释定量PCR测定的拷贝数之间获得了非常高的相关性。

序列表

<110>Zhang，Linqi

Ho，David A.

<120>使用嵌合噬菌体的高灵敏性基因组检测

<130>2570-1-002

<150>US 60/337,930

<151>2001-12-06

<160>10

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>112

<212>DNA

<213>噬菌体M13

<400>1

tcgctggatg tgtctgc9gc gttttatcat cttcctctgc atcctgctgc tatgcctcat 60

cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc gtttgtcctc ta 112

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

tcgctggatg tgtctgcggc gttttat 27

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

ggtatgttgc ccgtttgtcc tcta 24

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>标志

<400>4

cctgctgcta tgcctcatct tcttgttgg 29

<210>5

<211>239

<212>DNA

<213>人类

<400>5

gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat 60

tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca 120

ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg 180

ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgag 239

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gctgtgtttg cgtctctccc agga 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gaagaagagg cacagggctg tgag 24

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人类

<400>8

gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtc 28

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

agcggataac aatttcacac agg 23

Claims

1、一种利用杂交方法学在生物样品中定量至少一种预选择DNA序列的方法，其中该方法利用一种感染性M13噬菌体颗粒作为内标物，该噬菌体颗粒包含可检测的靶DNA序列，所述的靶DNA序列不是存在于预选择DNA序列中的或生物样品中被定量的DNA中的那些，该方法并利用包含预选择DNA序列的感染性的M13噬菌体颗粒作为外标物。

2、如权利要求1所述的方法，其中所述杂交方法学是使用分子标志的实时PCR扩增。

3、如权利要求1所述的方法，其中内标物是包含人CCR5基因一部分的感染性M13噬菌体。

4、如权利要求3所述的方法，其中所述的人CCR5基因部分是SEQID NO：5。

5、如权利要求1所述的方法，其中预选择DNA序列是乙型肝炎病毒的一部分。

6、如权利要求1所述的方法，其中外标物是包含乙型肝炎病毒基因组的一部分的感染性M13颗粒。

7、如权利要求5所述的方法，其中外标物是包含乙型肝炎病毒基因组的一部分的感染性M13颗粒。

8、如权利要求7所述的方法，其中所述乙型肝炎基因组部分是乙型肝炎S蛋白的一部分。

9、如权利要求8所述的方法，其中所述的部分是SEQ ID NO：1。

10、如权利要求1所述的方法，其中所述样品选自全血、尿、血浆、血清、脑脊髓液或含有细胞的活检样品。

11、一种包含SEQ ID NO：1的感染性嵌合M13噬菌体。

12、一种包含SEQ ID NO：5的感染性嵌合M13噬菌体。