TR201802923T4 - Kansere, otoimmün ve enfeksiyöz hastalıklara karşı immünoterapi geliştirmek için doğal biçimde işlenmiş hla kısıtlı peptitlerin diferansiyel kantifikasyonuna yönelik yöntem. - Google Patents

Kansere, otoimmün ve enfeksiyöz hastalıklara karşı immünoterapi geliştirmek için doğal biçimde işlenmiş hla kısıtlı peptitlerin diferansiyel kantifikasyonuna yönelik yöntem. Download PDF

Info

Publication number
TR201802923T4
TR201802923T4 TR2018/02923T TR201802923T TR201802923T4 TR 201802923 T4 TR201802923 T4 TR 201802923T4 TR 2018/02923 T TR2018/02923 T TR 2018/02923T TR 201802923 T TR201802923 T TR 201802923T TR 201802923 T4 TR201802923 T4 TR 201802923T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
peptide
sample
peptides
mhc
tumor
Prior art date
Application number
TR2018/02923T
Other languages
English (en)
Inventor
Weinschenk Toni
fritsche Jens
Original Assignee
Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immatics Biotechnologies Gmbh filed Critical Immatics Biotechnologies Gmbh
Publication of TR201802923T4 publication Critical patent/TR201802923T4/tr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Buluş primer doku numunelerinden ilgili HLA-bağlı peptit antijenlerinin işaretleme yaklaşımları kullanılmadan büyük ölçekte kantitatif olarak tanımlanmasıyla ilişkilidir. Bu yöntem yalnızca peptit aşılarının geliştirilmesinde kullanılmaya yönelik olmayıp, HLA kısıtlı antijenik belirteçlerin hedef işlevi gördüğü, örneğin kansere veya otoimmün ve enfeksiyöz hastalıklara karşı çeşitli alt birim aşıları veya adoptif T hücresi aktarımları gibi yaklaşımları kapsayan herhangi bir immünoterapötik stratejide moleküler tanımlı immün gözetim ve yeni antijenler tanımlama amacıyla kullanılmak için de çok uygundur.

Description

TARIFNAMEKANSERE, OTOIMMUN VE ENFEKSIYOZ HASTALIKLARA KARSI IMMUNOTERAPI GELISTIRMEK ICIN DOGAL BICIMDE ISLENMIS HLA KISITLI PEPTITLERIN DIFERANSIYEL KANTIFIKASYONUNA YONELIK YONTEMMevcut bulus, bir veya birden fazla primer doku nuinunesinde büyük ölçekli olarak en az bir MHC ligand peptidinin tanimlanmasina ve isaret kullanilmadan kantifikasyonuna yönelik bir yöntemle ilgilidir.
Bu yöntem yalnizca peptit asilarinin gelistirilmesinde kullanilmaya yönelik olmayip, HLA kisitli antijenik belirteçlerin hedef islevi gördügü, örnegin kansere veya otoimmün ve enfeksiyöz hastaliklara karsi çesitli alt birim asilari veya adoptif T hücresi aktarimlari gibi yaklasimlari kapsayan herhangi bir immünoterapötik stratejide moleküler tanimli immün gözetim ve yeni antijenler tanimlamaamaciyla kullanilmak için de çok uygundur.Bulusun alani Primer malign dokularda insan lökosit antijenine (HLA) baglanmis peptit sunum düzeylerinin derinlemesine bilinmesi, immün sistemin sahip oldugu T hücresi silahinin indüklenmesi yoluyla kanser immünoterapötikleri ve otoimmün ve enfeksiyöz hastaliklara karsi inunünoterapiler gelistirme çalismalarina büyük bir ivme kazandirabilir. Bu bilgi özellikle peptit asilari için önemli olmaklabirlikte, protein, DNA veya RNA gibi moleküler unsurlari baz alan diger T hücresi asi tipleri için de önein tasimaktadir. Bu zainana kadar bu tür kantitatif bilgilere "oinik bilimler" ölçeginde sahip olmainamizin nedeni, siindiye kadarki klasik kantitasyon yöntemlerinin genellikle karsilastirilinak istenen tüm numunelerin tek bir deney kapsaininda isleiiinesini gerektiren diferansiyel kiinyasal isaretleme esasina dayaninasi ve buna bagli olarak bu tür incelemelerin olasi ölçekboyutunun çok sinirli olmasidir."Revers immünoloji" ile iliskili sorunlardan kaçininaya olanak veren bir peptit taniinlaina yönteini EP l 508047B 1'de açiklanmistir. Yukarida belirtildigi gibi, bu yöntem söz konusu peptitlerin kantitasyonu için kullanilamamaktadir. Bir isaretleme yönteminden yararlanarak belli ölçüde bir kantitasyona olanak veren, ancak büyük ölçekte kullanilamayan diger bir yöntem WO 2005/076009'da ifsa edilmistir.
Diger isaretler, örnegin WO 03/025576'da ya da Martin ve ark. tarafindan Proteomics 2003, 3, 2208-2220 makalesinde ifsa edilmistir.Diger bir yöntem Fortier ve ark. tarafindan açiklanmistir (The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome, JEM, Vol. 205, No. 3, March 17, 2008 595-610). Bu yöntemin dezavantaji, asit elüsyonuna bagli olarak MHC'ye baglanan peptitlerin MHC'ye baglanmayan peptitlerden diseksiyonunu gerektirmesidir. Bunun için b2m- susturulmus hücre hatlari kullanilir. Dolayisiyla, bu yönteinin priiner hasta tüinör materyallerinde uygulanmasi mümkün degildir.
Yöntemde primer muriii timositleri murin EL4 hücre hattiyla karsilastirilmistir. Baslangiç miktarlari MHC I molekülleri ölçülerek ayarlanmistir. Yalnizca bu dahi Fortier ve ark. tarafindan açiklananyönteine güçlü bir kisit getirmektedir. Ayrica, aslinda büyüklügü ve doku kökeni farkli olan primer dokular için gerekli olan norinalizasyon islemi de uygulanmamistir. Bunun yerine, normalizasyonu gereksiz kilmak için dengeleninis baslangiç materyalleri kullanilmistir. Ancakprimer (hasta) materyalleri için normalizasyon kesinlikle sarttir.Bir immün yanitin tesviki konagin immün sistemi tarafiiidan yabanci olarak algilanan anti jen mevcudiyetine baglidir. Tümör iliskili anti jenlerin ve hastalik anti jenlerinin varliginin kesfedilmesi konagin iminün sistemini kullanarak tümör büyümesine müdahale etme olanagi saglamaktadir. Immün sisteminin hem salgisal hem de hücresel kollarinin çesitli kosum mekanizmalari bugün kanser iminünoterapisiaçisindan arastirilmaktadir.Hücresel immün yanitin spesifik unsurlari spesifik olarak tümör hücrelerini tanima ve yok etme gücüne sahiptir. Sitotoksik T hücreleriiiin (STL) tümör iiifiltre eden hücre popülasyonlarindan veya periferik kandan izole edilmesi bu tip hücreleriii kansere karsi dogal immün savunmada Önemli bir rol oynadigini düsündürmektedir. Basta majör histokompatibilite kompleksinin (MHC) klas I moleküllerine bagli peptitleri taniyanlar olmak üzere, CD8-pozitif T hücreleri (T-CDS'). Sitosolde yer alan proteinlerden veya defektif ribozoiiial ürünlerden (DRIPS) türetileii ve genellikle 8 ila 10 amino asit kalintisindaii olusan bu peptitler bu yanitta önemli bir rol oynar. Insan MHC molekülleri insaii lökosit antijenleri (HLA) olarak daadlandirilmaktadir.Iki MHC molekül sinifi mevcuttur: MHC klas I molekülleri çoguçekirdekli hücrenin üzeriiide bulunur. MHC molekülleri sirasiyla bir agir alfa zincir ile beta 2-inikroglobülinden (M HC klas l reseptörleri) veya bir alfa ve bir beta Zincirden (MHC klas II reseptörleri) olusurlar.
Uç boyutlu konformasyonlari, peptitlerle non-kovalent etkilesim amaciyla kullanilan bir baglayici oluk olusturur. MHC klas I, agirlikli olarak endojen proteinlerin, DRIP'lerin ve büyükçe peptitlerin proteolitik yarilmasi sonucunda ortaya çikan peptitleri sunar. MHC klas lI-molekülleri ise agirlikli olarak profesyonel anti jen sunan hücrelerde (APC'ler) bulunur ve öncelikle endositoz süreci içerisinde APC'ler tarafindan içeri alinarak islenen hücre disi veya transinembran proteinlerin peptitlerini sunarlar. Peptit ve MHC klas l moleküllerinden olusan kompleksler, uygun TCR (T hücresi reseptörü) içeren CD8-pozitif sitotoksik T-lenfositler tarafindan, peptit ve MHC klas ll moleküllerinden olusan kompleksler ise uygun TCR içeren CD4-pozitif yardimci T hücreleri tarafindan taiiinir. Burada TCR, peptit ve MHC'nin 1:1:1 stokiyometrik oraninda yer aldigi iyi bilinmektedir.Bir peptidin hücresel bir immün yaniti tetikleyebilinesi (olusturmasi) için bir MHC-molekülüne baglanmasi gerekmektedir. Bu süreç MHC molekülünün aleline ve peptidin ainino asit dizinindeki spesifik polimorfizmlere baglidir. MHC klas I'e baglanan peptitler genellikle 8-12 amino asit kalintisi uzunlugunda olup normal olarak MHC molekülünün karsilik gelen baglayici olugu ile etkilesimde bulunan dizinlerinde iki muhafaza edilmis kalinti ("çipa") içerirler. Böylelikle, her MHC aleli, baglanma oluguna hangi peptidin spesifik olarakbaglanacagini belirleyen bir "baglayici motife" sahiptir.
MHC klas l bagimli iminün reaksiyonda peptitlerin yalnizca tüinör hücreleri tarafindan ifade edilen belli MHC klas I moleküllerine baglanmasi yeterli degildir, ayni zamanda spesifik T hücre reseptörleri(TCR) içeren T hücreleri tarafindan da taninmalari gerekir.Tümör spesifik sitotoksik T-lenfositler tarafindan taninan anti jenler, yani bunlarin epitoplari, ilgili tümörde ifade edilen ve ayni kökenden gelen degisime ugrainamis hücrelere kiyasla yukari regüle edilmis her siniftan protein molekülleri, örnegin enzimler, reseptörler,transkripsiyon faktörleri vs. olabilir.Su anda kullanilan siniflandirmaya göre tümör iliskili veya hastalik iliskili anti jenler baslica su gruplardan olusmaktadir:Kanser testis anti jenleri: T hücreleri tarafindan tanindigi kesfedilen ilk TIA'lar [tümör iliskili antijenler; hastalik iliskili antijenler HIA seklinde kisaltilir] ilk basta kanser testis (CT) anti jenleri adi verilen bu sinifa dahildir. Bu adin verilmesinin nedeni, bu sinifin üyelerinin histolojik açidan farkli insan tümörlerinde ifade edilmesi, normal dokularda ise yalnizca testiste, spermatosit/spermatogoniada ve ara sira plasentada ifade edilinesidir. Testis hücreleri klas I ve II HLA molekülü. üretinediginden bu antijenlerin normal dokulardaki T hücreleri tarafindan taninmasi mümkün degildir, bundan dolayi immünolojik açidan tümör spesifik olarak kabul edilmektedirler. CT antijenlerinin taninmis örnekleri MAGE ailesinin üyeleri veya NY-ESO-l 'dir.
Diferansiyasyon anti jenleri: Bu TIA'lar tümör ile tümörün köken aldigi normal doku tarafindan paylasilir; en sik olarak melanomlarda ve normal melanositlerde görülürler. Melanosit kökenli bu proteinlerinçogu inelanin biyosentezinde rol oynamaktadir, dolayisiyla tümör spesifik degillerdir, ancak buna ragmen kanser iminünoterapisinde yaygin biçimde kullanilmaktadirlar. Örnekler, yalnizca bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, melanom için tiroziiiaz ve Melan-A/MART-l veya prostat kanseri için PSA'dir. Asiri ifade edilen TIA'lar: Histolojik açidan farkli tümör tiplerinde genis çapli olarak, bir çok norinal dokuda ise daha düsük düzeylerde ifade edilen TlA'lari kodlayaii genler bulunmustur. Normal dokular tarafindaii islenen ve potansiyel olarak sunulan epitOplarin çogunun T hücresi tarafindan taninina esiginin altinda olmasi, ancak tümör hücrelerinde gerçeklesen asiri ifadenin daha önce olusmus toleransi yikarak bir anti-kanser yanit tetiklemesi mümkündür. Bu TIA sinifinin tanininis `Örnekleri Her-2/neu, SurViVin, Telomeraz veya WT] 'dir.Tümör spesifik antijenler: Bu benzersiz TIA'lar normal genlerin (örnegin ß-katenin, CDK4 vs.) mutasyonu sonucunda meydana gelir.
Bu moleküler degisimlerin bazilari neoplastik transformasyoii ve/veya progresyonla iliskilidir. Tümör spesifik antijenler genellikle normal dokulara karsi otoimmün reaksiyon riskine yol açmadan güçlü iniinün reaksiyonlar indüklemektedir. Öte yandan, bu TIA'lar çogu kez kesinlikle yalnizca tanimlandiklari tümörle iliskili olup normal olarak birçok bireysel tümör tarafiiidan paylasilmamaktadir.Anormal posttranslasyonel modifikasyonlardaii kaynaklanan TIA'lar: Bu TIA'lar ne tümörler için spesifik olan ne de tümörlerde asiri ifade edilen, ancak 'Öncelikle tümörlerde aktif olan posttranslasyonel süreçler sonucunda tümör iliskili hale gelen proteinlerden olusabilir. Bu sinifa ait örnekler, glikolizasyon pateriilerindeki degisimler nedeniyle tümörlerde MUCl gibi yeni epitoplarin olusmasi ya da bozunum sirasinda protein uçbirlestirmesi gibi, tümör Spesifik olabilen ya daolmayan olgulardir.
Onkoviral proteinler: Bu TIA'lar, olasilikla onkojenik süreçte kritik rol oynamis viral proteinler olup yabanci kökenli olduklarindan (insan kökenli degil) bir T hücresi yaniti olusturabilirler. Bu proteinlerin bazi örnekleri, servikal karsinomda ifade edilen insan papilloma tip 16virüsü proteinleri E6 ve E7'dir.Proteinlerin sitotoksik T-lenfositler tarafiiidan tümör spesifik veya iliskili antijen ya da hastalik spesifik veya iliskili antijen olarak taninmasi ve bir tedavide kullanilabilmesi için özel ön kosullariii yerine getirilmesi gerekmektedir. Anti jen agirlikli olarak tümör hücreleri veya enfekte hücreler tarafindan ifade edilmeli, normal saglikli hücreler tarafindan ise hiç ifade edilmemeli ya da çok küçük miktarlarda,örnegin 5, 10 veya daha fazla kat daha az ifade edilmelidir.Enfeksiyöz hastaliklarda iki olasilik mevcuttur: Ya enfekte hücreler saglikli hücreler tarafindan ifade edilmeyen -enfeksiyon ile dogrudan iliskili- bir antijeni ifade ederler, ya da enfekte hücreler saglikli hücreler tarafindan yalnizca çok küçük miktarlarda ifade edilen bir antijeni asiri ifade ederler - Normal olarak saglikli bir hücreninpeptidomunda bulunan bir anti jenin asiri ifadesi.Ayrica bir tümör, enfeksiyon veya sus tipinde ilgili anti jenin yalnizca varligi degil, konsantrasyonunun da (örnegin ilgili peptidin hücre basina kopya sayisi) yüksek olmasi arzu edilir. Tümör spesifik ve tümör iliskili antijenler ve hastalik spesifik veya hastalik iliskili anti jenler çogu kez, sahip oldugu, örnegin hücre döiigüsü kontrolü veya apoptoz baskilama gibi bir fonksiyon nedeniyle normal bir hücrenintümör hücresine/enfekte hücreye dönüsmesinde dogrudan etkili olan proteinlerden olusur.Kanser olgularinda transformasyonla dogrudan nedensel iliskisi olan proteinlerin ek akis asagi hedefleri de yukari regüle edilerek dolayli yoldan tümör iliskili hale gelebilir. Bu dolayli tümör iliskili anti jenler de bir asi yaklasiininin hedefi olabilir (Singh-Jasuja H., Eininerich N.
P., Rainmensee H. G., Cancer Immunol. Iminunother. 2004 Mar; 453 (3): 1557-95). Her iki durumda da anti jenin amino asit dizinine sahip olan epit0plarin buluninasi zorunludur, çünkü bir tümör iliskili veya hastalik iliskili anti jenden türeyen bu tür bir peptidin ("immünojenik peptit") bir in vitro veya in vivo T hücresi yanitina yol açmasigereklidir.Ilke olarak, bir MHC inolekülüne baglanabilen her peptit bir T hücresi epitopu olarak görev yapabilir. Bir in vitro veya in Vivo T hücresi yanitinin indüklenmesi için gereken `Ön sartlar karsilik gelen TCR'ye sahip bir T hücresinin bulunmasi ve bu özel epitopa karsi immünolojiktolerans olinainasidir.Dolayisiyla, bir tümör asisi gelistirmek için çikis noktasi TIA'lar ve HIA'lardir. TIA'larin ve HIA'larin tanimlanmasina ve karakterizasyonuna yönelik yöntemler, hastalardan veya saglikli bireylerden izole edilen STL'lerin kullanimini esas alir, ya da tümörler ve normal dokular arasinda diferansiyel transkripsiyon profilleri veyadiferansiyel peptit ifade 'Örnekleri olusturulmasina dayanir.Ancak, tümör dokularinda veya insan tümör hücre çizgilerinde asiri ifade edilen ya da bu tür dokularda veya hücre çizgilerinde seçili olarakifade edilen genlerin tanimlanmasi, bu genlerin transkripsiyonundan kaynaklanan anti jenlerin bir iinmünoterapide kullanilmasiyla ilgili kesin bilgi saglamaz. Bunun nedeni, bu antijenler içinde yalnizca bireysel bir epitop alt popülasyonunun böyle bir uygulama için uygun olacagidir, çünkü bunun için karsilik gelen TCR'ye sahip bir T hücresinin bulunmasi ve bu 'Özel epitopa yönelik immünolojik tolerans olmamasi ya da asgari düzeyde olmasi gerekmektedir. Dolayisiyla, MHC molekülleriyle baglantili olarak sunulan asiri ifade edilinis veya seçili ifade edilmis proteinlerin içinden yalnizca T hücreleri arasinda fonksiyonel karsiligi olanlarin seçilmesi önemlidir. Böyle bir T hücresi, spesifik antijenle uyarildiktan sonra klonal olarak çogaltilabilen ve efekt'or islevleri yerine getiren ("efektör T hücresi") bir T hücresi olaraktanimlanir.T yardimci hücreleri anti-tümör immünitesinde STL'lerin efektör islevini yönetmede 'onemli bir rol oynar. TH. tipinde bir T yardimci hücresi yanitini tetikleyen T yardimci hücre epitoplari, hücre yüzeyleri üzerinde tümör iliskili peptit/MHC kompleksleri sergileyen tümör hücrelerine karsi yönlendirilmis sitotoksik fonksiyonlar içeren CDS-pozitif katil T hücrelerinin efektör fonksiyonlarini destekler.
Böylece, tümör iliskili T yardimci hücre peptit epitoplari, tek baslarina ya da tümör baglantili peptitler ile birlestirilerek anti-tümör immün yanitlari tesvik eden asi kompozisyonlarinin aktif farmasötikbilesenleri olarak kullanilabilirler.Felix Klug ve arkadaslarinin makalesi: "Characterization of MHC Ligands for Peptide Based Tumor Vaccination", CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, vol. 15, no. 28, 1 October pages 3221-3236) peptit bazli tümör asilari için MHC ligandlariiiinkarakterizasyonuyla ilgilidir. Makalede Sekil 2'de ana hatlariyla diferansiyel isaretleme yaklasimlari açiklanmakta, ancak 3226. sayfanin s01 koloiiunun 4. paragrafinda isaret kullanilmayan yaklasimlarin tercih edilecegi belirtilmektedir. Ayrica, 3225. sayfanin sag kolonunda kesin göreli veya mutlak kantifikasyona yönelik çesitli uygulanabilir yöntemler açiklanmaktadir. Makalede alel spesifik altgruplarin kullanildigi analizler açiklanmamaktadir.Noelle M Griffin VE ARK.: "Label-free, normalized quantification of complex mass spectroinetry data for proteomic analysis", Nature Biotechnology, vol. 28, no. '1, pages 83-89 makalesinin 84. sayfa, sag kolon birinci paragrafinda normalizasyon sorunu kabul edilmekte ve ifadesi degismeyen temel proteinlere yönelik basit normalizasyon yaklasimlariiia yer verilmektedir. Sayfa 85, sag kolon, 2. paragrafta norinalizasyon ortalama protein yogunlugu seklinde açiklanmaktadir.
Farkli parametreleri baz alan baska iiormalizasyon faktörleri ifsa edilmis, ancak tüm esansiyel parametreler tekrarli deneyler kapsamindabelirleninistir.Dolayisiyla, yukaridaki bilgiler isiginda mevcut bulusun ainaci kismen de olsa:- miktarlari ve MHC ifade düzeyleri farkli (insan) doku numunelerinin islenmesine olanak veren, yani primer doku nuinunelerine kolayca uygulanabilen;- yalnizca, örnegin beta2m-susturulmus karsiliklari olusturularak kullanilabilen hücrelerle sinirli olmayan, yani primer (insan) doku numunelerine de uygulanabilen;"yüksek isleme kapasitesi" düzeyinde icra edilebilen; ve 11- arttirilarak, yani kantitatif verilerden olusan mevcut bir veri kümesi yillar içinde yeni numunelerin verileriyle genisletilerek uygulanabilenbir yöntem saglamaktir.Asagida belirtilen açiklamalar deneyimli kisiler tarafindan incelendiginde, mevcut bulusun diger amaçlari ve avantajlari hemenbelirgin hale gelecektir.Asagidaki açiklamada bulus kanser örneginde açiklanmaktadir. Ancak, ilgili immün yanit MHC klas I iliskili bir yanit oldugu sürece bulus konusu yöntem, enfeksiyöz hastaliklara, otoimmün hastaliklara ve parazit kökenli enfeksiyonlara da uygulanabilir. Bulus yalnizca insan hastaliklariyla sinirli olmayip, ayrica inemelilerde, örnegin sigir, domuz, at, kedi, köpeklerde, siçan, fare gibi kemirgenlerde, keçilerde ve diger evcil hayvanlarda ve Tasmanya seytani gibi, kanseröz bir hastalik nedeniyle nesli tükenme tehlikesiyle karsi karsiya olanhayvanlarda da kullanilabilir.TanimlarBurada kullanilan "sunum profili" ya da "sunum grafigi" terimleri farkli numunelerde bir peptidin çubuk diyagram seklinde görsellestirilmis ortalama sunumunu gösterir. Sunum maksimum alana göre bolluk yüzdesi seklinde ifade edilir. Varyasyon, ölçülen esleineler bazinda %95 güven araliklari seklinde görüntülenir. Eger peptit numunede tespit edilmisse, ancak kantifikasyonu mümkün degilse, NA (uygundegil/alan yok) ibaresiyle isaretlenir.0 ile 1 arasinda degerler alan "sunum skoru" bir doku grubundaki asiri 12peptit sunumunun baska bir grupla karsilastirilmis ölçüsüdür. Sunum skoru ne kadar küçükse, asiri sunum olasiligi o kadar yüksektir.
Herhangi bir normal veya hastaliksiz numunede bulunmayan bir peptit için skor hesaplanamaz ve dolayisiyla degeri sifir olarak belirlenir.Anlainli biçimde asiri sunulan bir TUMAP setini belirleinek için bir anlamlilik esigi (örn. 0.05) seçilmeli ve sunum skoru bu esigin altinda olan tüm TUMAP'lar kapsama dahil edilmeli/alinmalidir. Dolayisiyla, sunuin skoru bir TUMAP'm tesadüfen asiri sunuluyormus gibigörünme olasiligini yansitmaktadir.Sunum skoru istatistiksel açidan bir dogrusal karma modelin p-degeri olabilir. Bu durumda skor, numunelerin arasindaki ve bünyesindeki varyasyonlari rastgele efektler, örnegin bir tümör unsuru ile normal doku arasindaki farki ise sabit efekt olarak kapsama alarak sunuin verilerini (TUMAP özellikli alanlar) biçimlendirir. Dahabasitlestirilmis bir yaklasimda sunuin skoru bir t-testinin p-degeridir.Sunum skoru tekrarli deneyler için FDR (yanlis bulgu orani)kullanilarak ayarlanir.Burada kullanilan "kalite kontrolü" terimi mevcut yöntemde kullanilan verilerin, mevcut yöntemde kullanilmalarina olanak verecek düzeyde yeterli kriterleri karsiladiginin dogrulanmasina iliskindir. Buna bir örnek, tanimlanmis toplam dizin sayisi ile analiz edilen her numune için peptit miktari tekrarlanabilirligi bazinda alanlarinda küçük varyans olan dizinlerin sayisidir, bu, bir numunede kaç peptit dizininin tanimlanabilecegi (tercihen güvenli biçimde tanimlanabilecegi) vetanimlanan bu peptitlerin yüzde kaçinin (örnegin %25, %30, %50 veya 13hatta %75) küçük varyansli (örn. %20 veya alti CV), güvenli alanlara atanabilecegi anlamina gelmektedir. Bu, farkli numuneler arasinda güvenilir bir normalizasyon için bir ön kosuldur. Genellikle, güvenilir biçiinde tanimlanan peptit dizinlerinin sayisi ne kadar yüksekse, veri kalitesi 0 kadar "iyidir". Diger bir örnek, tanimlamalarin ve alan hesaplarinin, örnegin peptit tanimlama sonuçlarinin ve alan tekrarlanabilirliklerinin "klasik" görsel denetimle ya da istatistikselanalizle kontrol edilmesidir.Bulusun ayrintili açiklamasiMevcut bulusun bir ilk yönünde en az bir memeliden alinan bir veya birden fazla primer doku numunesinde en az bir MHC ligand peptidinin tanimlanmasini ve isaret kullanilmadan kantifikasyonunu saglayan bir yöntemle bulusun amacina ulasilmis olup, söz konusu yöntem asagidakilerden olusmaktadir:a) en az bir saglikli doku numunesinden ve söz konusu primer hastalikli dokuyla iliskili ikinci bir hastalikli doku numunesinden en az bir MHC ligand peptidinin izole edilmesi,b) söz konusu MHC ligand peptitlerinden peptit sinyalleri olusturmak amaciyla bunlarin YBSK-KS analizine tabi tutulmasi,c) söz konusu MHC li gand peptitlerinin her biri için öncü] iyon sinyal alaninin belirlenmesi,d) fragman spektrumlarinin kümelenmesi ve/veya veri tabani arastirmasi yöntemiyle söz konusu MHC ligand peptitlerinin her birinin dizininin belirlenmesi,e) farkli deneylerde bulunan alanlar gruplandirilarak ve her birnumune için ortalama bir deger elde etmek amaciyla söz konusu alanlar 14tekrarli deneyler kapsaminda normalize edilerek MHC ligand peptitlerinin ortalama miktarlarinin belirlenmesi,f) MHC ligand peptitlerinin numuneler arasinda karsilastirilabilir göreli miktarlarinin asagidaki yöntemle belirlenmesi:fl) farkli nuinuneler arasinda karsilastirma yapmak amaciyla, MHC ligand peptidinin baglanmasi beklenen en az bir MHC alelinin tanimlanmasi ve MHC ligand peptidinin alel spesifik bir alt gruba atanmasi, ve'(2) numune büyüklüklerindeki ve/Veya MHC ifade düzeylerindeki farklari hesaba katinak amaciyla alel spesifik alt gruplar kullanilarak farkli numuneler arasinda norinalizasyon yapilmasi; vef3) her bir numune için peptit tekrarlanabilirligi bazinda veri kalite kontrolü yapilmasi,g) söz konusu ortalama ve göreli MHC ligand peptit miktarlari bazinda söz konusu hastalikli numune ile söz konusu saglikli numunenin MHC ligand peptidi için sunum profilinin ve/veya sunum skorunun hesaplanmasi yoluyla MHC ligand peptidinin asiri sunumunun belirlenmesi, veh) MHC ligand peptidinin isaret kullanilmadan kantifikasyonu.Mevcut bulusa göre bir yöntem tercih edilmekte olup, burada tanimlanan dizinlerin toplam sayisi ile alanlarinda küçük varyans olan dizinlerin sayisi karsilastirmali kantitatif analize dahil edilen diger numunelerden anlamli derecede az (%20'den az, örn. %10 veya hatta %1 gibi) degildir.Mevcut bulusa göre bir yöntem tercih edilmekte olup, burada sözkonusu MHC ligand peptidi bir tümör iliskili peptitten (TIA) veya 15hastalik iliskili peptitteri (HIA) seçilmistir. Mevcut bulusa göre tercih edilen diger bir yöntem, ayrica, asiri sunulan ve/veya tümör spesifikMHC ligand peptitlerinden seçilmis bir yelpaze içermektedir.Yine mevcut bulusa göre diger bir yöntem tercih edilinekte olup, burada söz konusu hastalikli numune bir tümör numunesi ya da bir enfekte doku numunesidir. Mevcut bulus baglaminda, yerlesik tümör hücre hatlari gibi hücre hatti nuinunelerinin aksine, dogrudan deneklerden, örnegin hastalardan türetilen nuinuneler "primer" numuneler olarak adlandirilmistir. Numuneler bulusa uygun yöntem için kullanisli oldugu sürece taze veya korunmus (örn. dondurulmusveya prepare edilmis) olabilir.Tercih edilen bir örnekte HLA peptit havuzlari sok dondurulinus (primer) doku nuinunelerinden, örnegin CNBr ile aktive edilinis sefaroza bagli HLA-A, -B, -C-spesifik antikor W6/32 veya HLA-A*02-spesifik antikor BB7.2 kullanilarak ve ardindan asit islemi ve ultrafiltrasyondan geçirilerek kati dokulardan immün çöktürme yoluyla elde edilebilir. Farkli HLA alelleri için teknolojide bilinen diger spesifik antikorlar, örnegin A*O3 için GAP-A3 ve B-alelleri için Bl.23.2 kullanilabilir. Diger inemelilerden MHC klas l peptitleri eldeetmek için teknolojide iyi bilinen ilgili yöntemler mevcuttur.Iinrnün yanit bir MHC klas 1 yanit oldugu sürece bulusa uygun yöntem viral veya bakteriyel enfeksiyonlar gibi enfeksiyöz hastaliklar baglaminda da, örnegin dang hummasi, Ebola, Marburg virüsü, tüberküloz (TBC), menenjit veya frengiye karsi kullanilabilir, yöntemtercihli olarak enfeksiyöz organizmalarin antibiyotiklere karsi dirençli 16suslarina, artrit gibi otoimmün hastaliklara, sitina (malarya) gibi parazitkökenli enfeksiyonlara ve MS ve Morbus Parkinson gibi digerhastaliklara karsi kullanilir.Tablo 1'de insana yönelik parazit kökenli enfeksiyonlar için tercihliörnekler gösterilmektedir: Protozoa koluorgan izinalar Organizmanin veya Latince adi Etkilenen Vücut Prevalans Kaynak/ Geçis hastaligin yaygin bölümleri (Rezervuar/ Vektör) adi Babeziyoz Babesia B. kirniizi kan New York, Martha*s kene isirmasi divergens, B. hücreleri Vineyard, Nantucket bigemina, B. equi, B. microfti, (degisik türleri dünya B. duncaiii genelinde yaygindir) Balantidiyaz Balantidium coli Intestinal mukoza Blastosistoz Blastocystis intestinal popülasyonun % 2 - enfekte insan veya 'si hayvan diskisiyla kirlenmis gida yenmesi Koksidiyumlar Cryptosporidium bagirsaklar Yaygin Dientamoebiasis Dientamoeba bagirsaklar sanayilesmis `ülkelerde diskiyla kirlenniis su fragilis %lO'a kadar veya gida alininii Amibiazis Entamoeba bagirsaklar sanitasyonun zayif, fekal-oral geçis histolytica nüfus yogunlugununyüksek oldugu bölgeler, tropikalbölgeler Giyardiya Giardia lamblia ince bagirsak Yaygin diskiyla kirleninis su li'imeni veya gidada bulunan dorinant kistlerin alinimi Isosporiazis lsospora belli ince bagirsagin dünya genelinde - fekal-oral yol epitelyzil hücreleri Toksoplazina veya Cryptosporidium'dan daha az yaygindir Laysmanyaz Leislimania kütanöz, Viseral laysmanyaz - Flebotomus (tatarcik niukokütaiiöz Dünya genelinde; huininasi) - Çesitliveya viseralKütanöz laysmanyaz - Eski dünyada; Mukok'ûtanöz laysmanyaz - Yenidünyadagececil tlebotom (tatarcik sinegi)türlerinin isirmasi Primer amibikmeningoensefalitNaegleria fowleribeyinnadir ancak ölümcülKirlenmis sicak tatli suyun nazal insüilasyoiiu, az klorlanmis yüzme havuzlari, kaplicalar,toprak Sitma (malarya)Plasmodium falciparuni (olgularin %803).
Plasmodium vivax, Plasniodiuin ovale, Plasmodiummalariaekirmizi kanhücreleritropikal - 250 milyon olgu/yilAnopheles sivrisinegi,geceleri isirir Rinosporidiyoz Rhinosporidiumseeberi burun,nazofarenks Hindistan ve Sri Lanka Göletlerde birlikte yikaiima sirasinda nazal mukozanincnfcktc matcryallctemas etmesi Toksoplazmozis -Parazitik pnömoniToxoplasma gondiigözler, beyin,kalp, karacigeryaygin - tüm insanlarin üçte birinekadarToxoplasma bradyzoites içeren çig/az pismis doinuz/kuzu/keçi eti yenmesi, Toxoplasma tachyzoites içeren çig süt içilmesi, bir günden eski kedi diskisindan oositlerle kirlenmis su, gidaveya toprak alinirniTrikomoniyaz Triehomonas kadin ürogenital 7,4 milyon Amerikali cinsel yolla geçen vaginalis sistemi enfeksiyon(erkeklerde asemptomatiktir)Uyku hastaligi Trypanosoma brucei kan, lenf ve 50.000 ilâ 70.000 kisi çeçe sinegi, geceleri merkezi sinir isirir sistemiSagaz hastaligi Trypanosoma cruzi kolon, özofagus, Meksika, Orta Triatoma/Reduviidaekalp, sinirler,kaslar ve kanAmerika, Güney Amerika - 16-18böcek vektörleri,geceleri isirirmilyon Helinint organizmalar (kurt ve solucanlar) Organizmanin veya Latince adi Etkilenen vücut Prevalans Geçis/ Vektör hastaligin yaygin bölümleri adi Ankilostomiazis/ Ancylostoma akcigerler, ince tropikal, sicak, nemli L3 Iarvasinin deriyi Kancali kurt duodenale, Necator bagirsak, kan iklimlerde yaygindir penetrasyonu americanus Anisakiazis Anisakis alerjik reaksiyon rastlantisal konak çig balik, kalaniar. mürekkep baligi,ahtapot yenmesi Yuvarlak solucan - Ascaris sp. Ascaris bagirsaklar, tropikal ve subtropikal Parazitik pnömoni lumbricoides karaciger, bölgelerde yaygindir apendiks, pankreas, akcigerler, Löffler sendromu Yuvarlak solucan Baylisascaris Türe bagli olarak Baylisascaris rakun, porsuk, ayi, procyonis, kunduz, sansarBaylisascaris melis , Baylisascaris transfuga,Bay] isascaris coluinnaris, Baylisascaris devosi,Baylisascaris Iaevisdiskisiyla kirlenmismateryal aliiiimiBrugia malayi, lenf nodlari Asya'nin tropikal Artropodlar Brugia timori bölgeleri Tenya - Tenya Cestoda bagirsak Nadir enfeksiyonu Klonorsiazis Clonorchis sinensis; C lonorchis viverrini Dicrocoelium safra kesesi Nadir karinca alinimi dendriticum Dioctophyme Dioctophyine renale bbbrekler (tipik Dünya genelinde az pismis ya da çig renalis iiifection olarak sagdaki) tatli su baligi alinimi Difillobotriazis Diphyllobothrium bagirsaklar, kan Avrupa, Japonya, çig tatli su baligi Tenya latuin Uganda, Peru, Sili aliminiGine kurdu - Dracunculus subkütanöz SudanDracunculiasis medinensis dokular, kaslarEkinokokkozis - Echinococcus karaciger, Akdeniz ülkeleri ara konak olarak birTenya granulosus, akcigerler, etoburun diskilariyla Echinococcus böbrekler, dalak kirlenmis materyalin multilocularis, E. alinimi; kesin konak vogeli, E. olarak bir otoburun oligarthrus pismemis etinin(sakatatin) alinimiEchinostoma ince bagirsak Uzak Dogu çig balik, yumusakça, echinatum salyangoz aliniiniKilkurdu Enterobius bagirsaklar, anüs yaygin; ilimanEnterobiasis vermicularis , bölgelerEiiterobius gregorii Karaciger kelebegiFasciola hepatica,karaciger, safraFasciola hepaticatatli su salyangozlai'i Fasciolozis Fasciola gigantica kesesi Avrupa, Afrika, Avustralya, Amerikalar ve Okyanusya'da; Fasciola gigantica yalnizca Afrika ve Asya'da görülür, her iki türün enfekte ettigi kisi sayisi 2,4 Fasciolopsiasis - Fasciolopsis buski bagirsaklar Dogu Asya - 10 etken istilasina Bagirsak kelebegi milyon kisi ugramis su bitkilerinin veya suyun alinimi (ara konak: amfibik salyangozlar) Gnatostomiyaz Gnathostoma subk'ütanöz nadir - Güneydogu çig veya az pismis et spinigerum, dokular (deri alti) Asya (örn, tatli su baligi, Gnathostonia tavuk, salyangoz, hispidum kurbaga, domuz) veya kontamine su alimini Himenolepiyaz Hymenolepis nana, un böcegi, un kurdu veHyinenolepisdiminutahamam böcegi ile kirlenmis inateryalalinimi Loa loa hastaligi,Calabar sisleri Loa loa filaria Bag dokusu`akcigerler, gözler Bati Afrika'nin yagmur ormanlari - 12- 13 inilyon kisi Tabanidae - at sinegi,gündüz isirir 21 Mansonelliazis, Mansonella derinin Böcek Filariazis streptoeerca subk'ütanöz katmanlari Metagonimiyaz - Metagoniinus Sibirya, Mançurya, az pismis ya da tuzlu Bagirsak kelebegi yokogaWai Balkan Ülkeleri, balik aliniini Israil, Ispanya Nehir körlügü Onchoeerca deri, gözler, doku Afrika, Yemen, Orta Siinulium/karasinek, volvulus, ve Güney Amerika'da gündüz isirir Onchocerciasis serin, hizli akan nehirlerin yakininda Çin Karaciger Opisthorchis safra yolu Rusya'da 1,5 milyon çig, az tuzlanmis veya Kelebegi viven'ini, kisi dondurulmus enfekte Opisthorchis balik alinimi felineus,Clonorchis sinensisParagonimiyaz, Paragoniinus akcigerler Dogu Asya çig veya az pismis tatliAkciger Kelebegi westerinani; su yengeci, kerevit ve Paragonimus diger kabuklularin africanus; alinimi Paragonimus ealiensis;Paragonimus kellieotti;Parag0nim us skrjabini; Paragonimus uterobilateralisSistozomiyaz - Schistosoina sp. Afrika, Karayiplei', enfekte tatli suBilharziya` Güney Amerika'nin salyangozlariylabilharzioz veya dogusu, Dogu Asya, kirlenmis suya maruzsalyangoz hummasi Ortadogu - 200 kalan deri(tüm milyon kisirînlpriiBagirsak Schistosoma bagirsaklar, Afrika, Karayipler, enfekte Biomphalariasistozomiyazi mansoni karaciger, dalak, Güney Amerika, tatli suakcigerler, deri Asya, Ortadogu - 83 salyangozlariyla mi lyon kisi kirlenmis suya maruzkalan deri 22 üriner sistozomiyaz Schistosoma böbrekler, Afrika, Ortadogu enfekte Bulinus sp. haematobium mesane, üreterler, salyangozlariyla akcigerler, deri kirlenmis suya maruz kalan deri Schistosoina Schistosonia bagirsaklar, Çin, Dogu Asya, enfekte Onconielania japonicum kökenli japonicum karaciger, dalak, Filipinler sp. salyangozlari ile sistozomiyaz akcigerler, deri kirlenmis suya maruz kalan deri Asya bagirsak Schistosoma Güneydogu Asya enfekte Neotrieula sistozomiyazi mekongi aperta tatli su salyangozlari ile kirlenmis suya maruz kalan deri Spargarioz Spirometra enfekte köpek veya eriiiaceieuropaei kedi diskilariyla kirlenmis materyal alimi (insan: son konaktir) Strongiloidiyaz - Strongyloides bagirsaklar, deri penetrasyonu Parazitik pnömoni stercoralis akcigerler, deri(Larva currens) Sigir tenyasiTaenia saginataBagirsaklarDünya genelindeyayilimaz pismis sigir etialinimi Domuz teiiyasiTaenia soliumaz pismis domuz eti alinimi Toksokariyazis Toxocara canis, karaciger, beyin, Dünya genelinde pika, Toxocara Toxocara cati gözler (Toxocara yayilim yumurtalariylacanis - Viseral kirlenmis,larva migrans, yikanmamisOk'ûler larva yiyecekler, az pismismi grans) tavuk karacigeri Trisinoz Trichinella spiralis, kaslar, periorbital gelismis ülkelerde az pismis domuz eti Trichinella bi'itovi, Trichinella nelsoni,Trichinella nativa bölge, incebagirsak yemleme uygulamalari daha ileri oldugundan daha çok gelismekte olanülkelerde yaygindir. alinimi 23 Yüzücü kasintisiTrichobilharzia regenti,SchistosomatidaeKirlenmis suya (salyangozlar ve omurgalilar) maruzkalan deri Kirbaç kurdu (kamçi kurdu)Trichuris trichiura,Trichuris vulpiskalin bagirsak,anüsDünya genelindeyaygiiidirfasulye, pirinç ve çesitli tahillarda bulunaii yumurtalarin veya insan diskilariyla kirlenmis topraginyanlislikla aliniiiii Elefantiyazis Wuchereria Lenfalik sistem Tropikal ve sivrisinek, geceleri Leiifatik filariazis baiicrofti subtropikal isirir Diger organizmalar Organizmaniii veya Latince adi (sirali) Etkilenen vücut Prevalans Geçis/ Vektör hastaligin yaygin bölümleri adi parazitik kurt Ai'chiacanth ocephala Halzoun Sendromu Linguatula serrata nazofarenks Ortadogu çig veya az pismis lenfiiodlarinin aliiiimi (örn. enfekte deveveya manda eti) Miyaz Oestroidea, ölü veya canli Calliphoridae, doku Sai'cophagidae Sinek Dermatobia hominis subkütanöz doku Orta ve Güney Sivrisinek ve isiran Amerika siiiekler Kandiru Triclioiiiycteridae idrar yolu Amazon Nehri Baliklarin yasadigi Havzasi suyun içinde uygun korunma olmadanidrar yapilmasi 24Otoimmün hastaliklara örnekler (resmen otoimmün hastalik olarak kabul edilmis olmayan hastaliklar dahil olmak üzere) Kronik obstri'iktif akciger hastaligi, Ankilozan spondilit, Crohn Hastaligi (iki idiyopatik intlamatuar bagirsak hastaligi “IBH” tipinden biri), Dermatomiyozit, Diabetes mellitus tip 1, Endometriyozis, Goodpasture sendromu, Graves hastaligi, Guillain-Barre sendromu (GBS), Hasimoto hastaligi, Hidradenitis supurativa, Kawasaki hastaligi, IgA nefropatisi, IdiyOpatik trombositOpenik purpura, Interstisyel sistit, Lupus eritematozus, Karisik Bag Doku Hastaligi, Morfea, Miyastenya gravis, Narkolepsi, Nöromiyotoni, Pemfigus vulgaris, Pernisiyöz anemi, Psoriasis, Psoriatik Artrit, Polimiyozit, Primer biliyer siroz, Tekrarlayan polikondrit, Romatoid artrit, Sizofreni, Skleroderma, S jogren sendromu, Kati kisi sendromu, Temporal arterit ("dev hücreli arterit" olarak da bilinir), Ulseratif Kolit (iki idiyopatik inflamatuar bagirsak hastaligi “IBH” tipinden biri), Vaskülit, Vitiligo ve Wegenergranülomatozudur.Mevcut bulus insan hastaliklariyla sinirli olmayip, ayrica memelilerde, örnegin inek, domuz, at - tercihen yaris atlari, kedi, köpeklerde, siçan, fare gibi kemirgenlerde, keçi ve diger evcil hayvanlarda ve Tasmanya seytani gibi, kanseröz bir hastalik nedeniyle nesli tükenme tehlikesiylekarsi karsiya olan memelilerde de kullanilabilir.Yine, mevcut bulusa göre yöntemin tercih edilen diger bir somut örneginde kalite kontrolü, en azindan kismen, bir otomatla ve/veyamanuel ya da görsel olarak yapilan denetimi kapsamaktadir.Mevcut bulusa göre yöntemin tercih edilen diger bir yönünde söz 25konusu yöiitem ayrica söz konusu tanimlanmis ve/veya kantifiye edilmis en az bir MHC ligand peptidinin söz konusu yöntemle bir sentezleyicide veya manuel olarak sentezlenme kademesini deiçermektedir.Mevcut bulusa göre tercih edilen bir yöntem ayrica söz konusu MHC ligand peptidinin sentezlenmis peptit ya da saflastirilmis peptit olarak immünojenesitesinin test edilme kadeinesini de içermektedir. Ilgili yöntemler deneyimli kisiler tarafiiidan bilinmekte olup gerek ilgililiteratürde, gerek burada tarif edilmektedir.Mevcut bulusa göre yöntemin tercih edilen diger bir yönünde söz konusu yöntem kisisellestirilmis tedavi ve taniyla iliskilidir. Bunun için, söz konusu numune(ler) bir bireyden alinir. Ayni sekilde, burada tarif edilen mevcut bulusa uygun yönteme dayanarak söz konusu tanimlanmis ve/veya kantifiye edilmis MHC ligand peptitleri bazinda kisisellestirilmis bir MHC ligand profili, tercihen hastaliga özgü kisisellestirilmis bir MHC ligand profili de olusturulabilir.Mevcut bulusa göre yöntemin tercih edilen diger bir yönünde söz konusu tanimlanan diziiilerin toplam sayisi ile alanlarinda küçük varyaiis olan dizinlerin sayisi 5'ten büyük, tercihen 25'ten büyük, daha da tercihli olarak 50'den büyük ve en çok tercihli olarak lOO'den büyüktür.Bulusu yapanlar sasirtici bir sekilde mevcut bulus baglaminda bir ifade analizinin izole ve analiz edilmis antijenik tümör peptitlerinin kantifikasyonu ile kombine edilmesiyle bireysel bir asi için spesifikadaylarin kolayca tanimlanabilecegini bulmuslardir. Bulusu yapanlar 26tarafindan saglanan bu yeni yaklasim ilk kez asiri sunulan ilgili asi adayi peptitlerin kanserli veya diger enfekte dokularda MHC, tercihen HLA, kisitli peptit düzeylerinin, kanseröz veya enfekte olmayan birçok farkli doku ve organla karsilastirmali olarak dogrudan göreli kantifikasyonu araciligiyla taniinlaninasina ve seçilmesine olanak saglamaktadir. Bu, dizin tanimlama, spektrum kümeleine, iyon sayimi ve norinalizasyona yönelik algoritmalar kombine edilerek ve SlVl kromatografi ile akuple edilmis kütle Spektrometrisiyle elde edilen ve kuruma özgü, ardisik düzenli bir veri analizi yöntemiyle islenen veriler kullanilarak gerçeklestirilen isaretsiz bir diferansiyel kantifikasyonun gelistirilinesiyle basarilmistir. Yaklasim tüm HLA klas I alel peptitlerine uygulanabilir, rutin kantitasyon halihazirda örneksel olarak çok yaygin iki alel ile birçok farkli tümör unsuruna uygulaninistir.
Kapsamli validasyon deneyleri soiiuçlariinizin dogrulugunu onaylamistir. Afinite kromatografisi elüsyonlarinda western blotting yöntemiyle yapilan beta-2 mikroglobülin ölçümleri normalizasyonstratejisini desteklemektedir.Yaygin bir sekilde kullanilan ve bir protein dizininden HLA baglayan peptitleri seçmeye yönelik tahmini algoritnialara dayanan "ters immünoloji" yaklasimlarinda engelleyici faktör bu yaklasimlarin önemli antijen isleme kadeinesini gözardi etmeleridir. Bu sekilde seçilen peptitlerin çogu fizyolojik olarak primer dokularin veya hücre hatti hücrelerinin üzerinde sunulmamaktadir, çünkü bunlar HLA'yabaglansa da, proteinden islenerek elde edilmemektedir.Mevcut bulusa göre yöntein isaretsizdir, yani örnegin analiz edilecekpeptitler için isaret, özellikle kimyasal isaret kullanilmasi gibi bir islem 27içerniez.Yine, mevcut bulusa göre yöntemin tercih edilen diger bir somut örneginde söz konusu yöntem susturulmus hücrelerin, hücre hatlarininveya hayvanlarin kullanimini da kapsam disinda tutmaktadir.Bulusa göre yöntemin tercih edilen diger bir yönünde izole edilen MHC/HLA ligandlari ters faz kromatografi (öm. nanoAcquity UPLC system, Waters) kullanilarak hidrofobisitelerine göre ayrilmakta ve ardindan bir LTQ- Orbitrap hibrit kütle Spektrometresinde (ThermoElectron) belirlenmektedir. Her bir numune isaret kullanilmadan bes kez tekrar edilen SKKS ölçümü alinarak analiz edilmektedir. SKKS verileri gerek SKKS incelemesinin, gerek Tandem Kütle Spektrometrisinin (KS/KS) verileri analiz edilerek islenir. Veri analizi artirimli ve tekrarli numune ölçümlerine uygulanacak sekildeoptimize edilmistir.Olusturulan Tandem KS spektrumlari msn_extract (ThermoScientific) kullanilarak ekstre edilir ve Sequest kullanilarak bir protein veri tabani, örnegin IPI veri tabani ile karsilastirilir. Ardindan protein veri tabaninda tespit edilen isabetler HLA peptidoinik verileri için optimize edilmis esikler kullanan otoinatize kalite filtreleme yöntemiyledegerlendirilir.Tanimlama hassasiyetini arttirmak amaciyla kurum içinde gelistirilmis olan ve spektrumlari IFL'de (Immatics Fragment Spectra Library = Immatics Fragman spektrumlari Kütüphanesi) toplanmis bilinen peptit KS/KS'leri ile baglantilandiran özel bir kümeleme algoritmasikullanilmaktadir. Yeni SKKS deneylerinin KS/KS taramalari kademeli 28olarak ayri ayri lFL'ye eklenir. Küinelemede, spektral verilere uyarlanmis, büyüyerek artan bir k-ortalamalari kümeleme algoritmasikullanilmaktadir.Dizin tanimi ve fragman spektrumlarinin kümelenmesi sayesinde ayni dizin veya küme için farkli deneylerden ve numunelerden elde edilenyogunluk degerlerini (alanlari) gruplandirmak mümkündür.Farkli numuneler arasinda ayni HLA aleline kisitli peptit gruplarinin karsilastirilabilirligi, eger varsa, saflastirma amaciyla kullanilan ortak bir alel-spesifik antikor bazinda ya da alternatif olarak dizinlerin çipa amino asit örnekleri araciligiyla ortak HLA alellerine ataninasi bazindamümkündür.Her yeni veri seti bir veri tabanina (örnegin MySQL) entegre edilmekte ve mevcut proteomik, genomik veriler ve literatür verileriyle çaprazreferanslandirilmaktadir.SKKS inceleme verileri bagimsiz olarak iyon sayimi kullanilarak ve yüksek kütle hassasligindaii yararlanilarak analiz edilmektedir. SKKS sinyallerini ve entegresi alinan alanlari ekstre etmek için , 'Örnegin SupcrHim programi (L. N, Mueller, O. Rinncr, A. Schmidt, S. Lctartc, B. Bodcnmillcr, M. Y. Brusniak, O. Vitek, R. Aebersold, and M.
Muller. SuperHim - a novel tool for high resolution LC-MS-based peptide/protein profiling. Proteomics. 7 (l9):3470-3480, 2007.)tarafindan uygulanan bir özellik bulma algoritinasi kullanilabilir.Tanimlanan her bir peptit için bu iki veri setinin kombine edilmesiyle,elde edilen kantitatif veriler daha sonra, teknik tekrarlar (SK-KS 29deneyleri) arasindaki farkliliklar ile tümör ve saglikli dokular gibi (bakiniz yukarida) farkli dokulardan köken alan numuiieler arasindaki farkliliklari dikkate almak için merkezi egilim norinalizasyonuna dayanan iki kademeli bir yaklasimda normalize edilebilirler. Sözü edilen farkliliklardan ikincisi, örn. MHC ifade düzeylerinin farkli olmasindan ya da farkli miktarlarda baslangiç materyallerindentüretilmis olmasindan kaynaklanabilir.En üst düzey güvenilirlik için, tercih edilen bir somut örnekte, ilk norinalizasyoii asamasinda yalnizca tekrarli alanlarinin degiskenlik katsayilari (CV) %25'in, tercihen %20'nin altinda olan peptitler dikkatealinmaktadir.Asiri sunulan peptitleri ekstre etmek amaciyla ortalama numune sunumunu ve tekrarlanan deneylerdeki degiskenligi gösteren bir sunum profili hesaplanmaktadir. Profil, ilgi konusu tümör biriminin iiuinunelerini karsilastirma amaciyla normal bir doku numunesinin taban çizgisiyle yan yana göstermektedir. Bu profillerin her biri daha sonra, bir Dogrusal Karisik Etkiler Modelinden hesaplanan p-degeriyle (J. Pinheiro, D. Bates, S. DebRoy, Sarkar D., R Core team, nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. 2008), Yanlis Bulgu Orani kullanilarak (Y. Benjamini and Y. Hochberg. Controlling the False Discovery Rate: A Practical aiid Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), V01.57 (No.l):289-300, 1995) çoklu deneyler içinayarlanmis bir asiri sunum skoru seklinde konsolide edilebilir.Dizin atamalari ve potansiyel asi adayi olarak seçilen peptitlerin 30alanlari manuel denetim yoluyla onaylanmaktadir.Mevcut bulusun tercih edilen diger bir opsiyonel kademesi, ilk normalizasyon kademesinde dizinlerin sinyallere atanmasi gereksiniminden kaçinmak için tekrarli SK-KS deneyleri arasindakialikonma sürelerinin uyumlandirilmasidir.Mevcut bulusun tercih edilen diger bir opsiyonel kadeinesi, ikinci iiorinalizasyon kademesinde dizinlerin sinyallere atanmasi gereksiniminden kaçinmak için farkli numuneler arasindaki alikonmasürelerinin uyumlandirilmasidir.Mevcut bulusun tercih edilen diger bir Opsiyonel kademesi, ayni genden birden fazla peptidin tanimlandigi durumlarda tekil peptit asiri sunuin skorlarinin kombine edilerek gen merkezli bir asiri sunuinskorunun hesaplanmasidir.Mevcut bulusun tercih edilen diger bir opsiyonel kademesi, çoklu norinalizasyonlarin kalitesinin, numunelere önceden belirlenmis miktarlarda moleküller katilmasi yöntemiyle, otomatik olarak kontroledilmesidir.Anti jenik peptitlerin izole edilmesi ve gen ifadesiyle eslestirilmesi ve tümöröz doku profillerine öncülük eden hücrelerin üzerinde sunulmasiyla, asiri sayida olasi immünoreaktif peptit elde etmekten kacinilabilir. Mevcut bulusa göre bunun yerine, MHC molekülleri tarafindan fiilen sunulan ve dolayisiyla immünoreaktif peptit olarakuygun olan Spesifik peptitler tanimlanmaktadir. 31Bulusa göre yöntemle ayrica hastaya özgü peptitler tanimlamak mümkündür, yani peptitleri spesifik bir iinmün yanit indüklemek amaciyla asi olarak kullanilmak üzere hastayla kesin bir sekildeeslestirme olanagi bulunmaktadir.Örnegin endüstriyel laboratuvarlar - hasta numunelerini aldiktan sonra - mevcut yöntemi sistematik ve etkin biçimde uygulayabilir ve - uygun immünoreaktif peptitleri tanimladiktan sonra - sorumlu kliniklere peptit dizinlerini tedarik edebilirler; klinikler de peptitleri sentezleyerek uygulayabilirler. Bununla birlikte, bir laboratuvarin ilgili hasta için uygun peptitlerin hem tanimlanmasini, hem üretiminiüstlenmesi de mümkündür.Dolayisiyla, mevcut bulusun yeni yöntemi yalnizca hizmet kapsamli olabilecegi gibi, tanimlanan immünoreaktif peptitlerin tedarikinikapsayacak sekilde de uygulanabilir.Bulusun diger yaklasimlari bulusa ait yöntem araciligiyla tanimlanan ve/veya hazirlanan immünoreaktif peptitlerdir. Bu peptitler tanimlandiktan sonra seçili ve spesifik olarak hastanin tedavisi içinhazirlanabilir.Bulusun diger yaklasimlari bulusa ait yöntem araciligiyla tanimlanan ve/veya hazirlanan bir veya birden fazla peptitten olusan bir faimas'otikbilesimle ilgilidir.Bilesim formülasyona ve hedef alinan hastaliga bagli olarak `Örnegin parenteral, 'Örnegin subkutan, intradermal veya intramüsküleruygulanabilir ya da agiz yoluyla alinabilir. Bunun için peptitler 32farmas'otik açidan kabul edilebilir bir tasiyicida, tercihen sulu bir tasiyicida çözündürülür veya süspanse edilir; bilesim ayrica katki maddeleri, 'Örnegin tamponlar, baglayicilar vs. içerebilir. Peptitler ayni zamanda immün uyarici maddelerle, `Örnegin sitokinlerle birlikte deuygulanabilir.Bulusun bir yaklasimina göre peptitler tümöröz hastaliklarin tedavisinde ve tümör hastaliklarinin tedavisi için bir ilacinhazirlanmasinda kullanilabilir.Tedavi edilecek tümöröz hastaliklar böbrek, meme, pankreas, mide, testis ve/veya deri kanseri gibi solid tümörlerden ya da AML gibi kan kanserlerinden olusur. Bu tümör hastaliklari listesi 'orneksel olupuygulama alanini sinirlama amaci tasimamaktadir.Peptitler ayrica tümör hastaligi tedavisinin gidisini degerlendirmek içinde kullanilabilir.Peptitler diger asilarin veya terapilerin uygulandigi tedavileri izlemek için de kullanilabilir. Dolayisiyla, peptit yalnizca tedavi amaciyla degil,tanisal amaçlarla da kullanilabilir.Bulusun diger bir yaklasimi peptitlerin bir antikor olusturmak amaciyla kullanilmasiyla ilgilidir. Poliklonal antikorlar genel anlamda hayvanlarin peptit enjekte edilerek immünize edilmesi ve ardindan immünoglobulinin saflastirilmasi yoluyla elde edilmektedir.
Monoklonal antikorlar ise teknolojide bilinen standardize protokolleregöre olusturulabilir. 33Yine diger bir yaklasimda, bulusa uygun yöntein periferik lökositlerin, tercihen T-lökositlerinin reaktivitesinin izole anti jenik peptitlere karsitest edildigi bir baska kademe daha içermektedir.Diger bir yaklasimda, bulusa uygun yönteinin içerdigi, periferik lökositlerin reaktivitesinin izole antijenik peptitlere karsi test edilme kademesi, lökositler tarafindan sentezlenen y-Interferon-mRNAve/Veya sitokin-mRNA'nin ölçülmesi yoluyla yerine getirilmektedir.y-Interferon veya sitokin-mRNA'nin belirlenmesi lökositlerin, tercihen T-lenfositlerin aiitijenik peptitlere karsi spesifik reaktivitesini kesin olarak kanitlamaya olanak saglar. Her iki madde, karsilik gelen antijenik peptitlerle aktivasyonu müteakiben aktiflestirilmisT-lenfositler tarafindan salgilanir.Yine diger bir yaklasimda bulusa uygun yöntemde T-lenfositlerin varliginin belirlendigi daha baska bir kademe icra edilmektedir. Bu yöntem araciligiyla hastada önceden var olan, izole edilmis ve tanimlanmis peptitlere karsi yönlendirilmis ne kadar T-lenfosit bulundugunu Spesifik olarak belirlemek mümkündür. Bu adimin icrasi, yalnizca hastada önceden T-lenfosit karsiligi bulunan peptitleri asi olarak uygulama olanagi sunmaktadir. Bu durumda, peptitler buspesifik T-lenfositleri aktiflestirmek için kullanilabilir.Diger bir yaklasimda, bulusa uygun yöntemde, önceden var olan spesifik T-lenfositlerin tespiti lökositlerin anti jen sunan moleküllerin Ve antijenik peptidin rekonstitüye kompleksleriyle isaretlenmesiyoluyla icra edilir. 34Simdiye kadar arastirmacilar tarafindan 70'i kanser ve 401 kanser olmayan nuniunede 11.000'i askin farkli peptit kantifiye edilmistir.
Bireysel kanser unsurlari kapsaminda her bir peptit ve numune için asiri sunuma yönelik anlamlilik skorlari ve, güven araliklari dahil olmak üzere, ortalama sunum düzeyleri olusturulmustur. Yalnizca tümör dokularinda bulunan peptitler ile kanseröz olmayan doku veorganlara kiyasla tüinörlerde asiri sunulan peptitler tanimlanmistir.Burada "polipeptit" kavrami, bitisik amino asitlerin alfa-amino ve karbonil gruplari arasinda olusan tipik peptit baglariyla birbirlerine baglanmis olan bir dizi amino asit kalintisini tanimlamak için kullanilmaktadir. Dogru epitopu ya da epitoplari içerdigi sürece polipeptidin uzunlugu bulus açisindan kritik degildir. Peptit veya oligopeptit kavramlarinin tersine, polipeptit kavrami ile yaklasik 30'unüzerinde amino asit kalintisi içeren moleküller kastedilmektedir.Eger bir peptit, oligopeptit, protein, ya da bu tür bir molekülü kodlayan bir polinükleotid bir immün yanit indükleme yetenegine sahipse, 0 zaman "immünojeniktir" (yani mevcut bulus kapsaminda bir "immünojendir"). Mevcut bulus kapsaminda immünojenisite daha spesifik bir anlamda, T hücresi aracili bir yanit indükleme yetenegi seklinde tanimlanmaktadir. Yani bir "immünojen", bir immün yanit indükleme yetenegine sahip olan bir moleküldür, mevcut buluskapsaminda ise bir T hücresi yaniti indükleyen bir moleküldür.Bir T hücresi "epitopunun", bir klas I MHC reseptörüne baglanarak üçül bir kompleks olusturan kisa bir peptide (MHC klas I alfa zinciri, beta-Z-mikroglobülin ve peptit) ihtiyaci vardir. Bu MHC/peptit 35koinpleksine karsi uygun egiliiiili ve uyumlu bir T hücre reseptörü içeren bir T hücresi bu kompleksi taniyabilir. MHC klas I moleküllerine baglanan peptitler tipik olarak 8-14 amino asituzunlugunda, en tipik sekliyle de 9 amino asit uzunlugundadir.Insanda MHC klas I moleküllerini kodlayan üç farkli genetik lokus bulunmaktadir (insan MHC molekülleri ayni zamanda insan lökosit antijenleri (HLA) olarak da belirlenmistir): HLA-A, HLA-B, ve HLA-C. HLA-A*Ol, HLA-A*02 ve HLA-A*024 bu lokuslardan ifade edilebilen degisik MHC klas I alellerine örnektir.Tedaviye yönelik immünoterapötik yaklasimlarBir iinmün yanitin tesviki konagin iinmün sistemi tarafindan yabanci olarak algilanan anti jen mevcudiyetine baglidir. Tümör iliskili antijenlerin varliginin kesfedilmesi artik konagin immün sisteinini kullaiiarak tümör büyümesine müdahale etme olanagi saglamaktadir.
Halihazirda, immün sistemin hem salgisal hem de hücresel kollariiiin çesitli kosum mekanizmalari kanser immünoterapisi açisindanarastirilmaktadir.Hücresel immün yanitin spesifik unsurlari spesifik olarak tümör hücrelerini tanima ve yok etmeye gücüne sahiptir. Sitotoksik T hücrelerinin (STL) tümör infiltre eden hücre popülasyonlarindan veya periferik kandan izole edilmesi bu tip hücrelerin kansere karsi dogal inimüii savunmada önemli bir rol oynadigini düsündürmektedir.
Sitozollerde lokalize proteinlerden veya kusurlu ribozomal ürünlerden(DRIPS) türeyen genellikle 8 ilâ 12 amino asit kaliiitili büyük histo 36uyumlu kompleks (MHC) tasiyan peptitlerin klas l moleküllerini taniyan CD8-pozitif T hücreleri bu yanitta önemli bir rol oynar. Insanin MHC molekülleri de insan lökosit antijenler (HLA) seklindetanimlanmaktadir.MHC klas I-molekülleri, agirlikli olarak hücre içi sitozolik veya nükleer proteinlerin, DRIPS'in ve büyükçe peptitlerin proteolitik yarilmasi sonucunda meydana gelen peptitleri sunan çogu çekirdekli hücrenin üzerinde bulunur. Öte yandan, MHC klas I moleküllerin üzerinde endozomal kompartimandan veya hücre disi kaynaklardan türeyen peptitlere de sik sik rastlanmaktadir. Klasik sunum tarzindan farkli olan bu klas I sunumu literatürde çapraz sunuin olarakadlandirilmaktadir.Proteinlerin sitotoksik T-lenfositler tarafindan tümör spesifik veya iliskili antijen olarak taniiimasi ve bir tedavide kullanilabilmesi için özel ön kosullarin yerine getirilmesi gerekmektedir. Anti jen esas olarak tümör hücreleri tarafindaii ifade edilmeli, normal saglikli dokular tarafindan edilmemeli ya da nISpeten küçük miktarlarda edilmelidir.
Ayrica, ilgili antijenin bir tümör tipinde yalnizca varligi degil, konsaiitrasyonunun da (örnegin ilgili peptidin hücre basina kopya sayisi) yüksek olmasi arzu edilir. Tümör spesifik ve tümör iliskili anti jenler çogu kez sahip oldugu, örnegin hücre döngüsü kontrolü veya apoptoz gibi bir fonksiyon nedeniyle normal bir hücrenin tümör hücresine dönüsmesinde dogrudan etkili olan proteinlerdeii olusur.
Buna ek olarak, transformasyonla dogrudan nedensel iliskisi olan proteinlerin asagi yöndeki hedefleri de yukari regüle edilerek dolayliyoldan tümör iliskili hale gelir. Bu tür dolayli tümör iliskili anti jenler 37de asi yaklasimin hedefi olabilir. Bir tümör iliskili antijenden veya hastalik iliskili antijendeii türeyen böyle bir peptidin ("immünojenik peptit") bir in vitro veya in Vivo T hücresi yanitina yol açmasi gerektiginden, her iki durumda da anti jenin amino asit dizininde epitopbulunmasi zaruridir.Ilke olarak, bir MHC molekülüne baglanabilen her peptit bir T hücresi epitopu olarak görev yapabilir. Bir in vitro veya in Vivo T hücresi yanitinin indükleninesi içiii gereken 'Ön sartlar karsilik gelen TCR'ye sahip bir T hücresinin buluninasi ve bu özel epitopa karsi immünolojik tolerans olmamasidir. Dolayisiyla, bir tümör asisi gelistirmek içiii çikis noktasi TIA'lardir. TIA'larin tanimlanmasina ve karakterizasyonuna yönelik yöntemler, hastalardan veya saglikli bireylerden izole edilen STL'lerin kullanimini esas alir, ya da tümörler ve normal dokular arasinda diferansiyel transkripsiyon profilleri veya diferansiyel peptit ifade 'Örnekleri olusturulmasina dayanir (Lemmel et al. 450-54; Weinschenk et al. 5818-27). Ancak, tümör dokularinda veya insan tümör hücre çizgilerinde asiri ifade edilen ya da bu tür dokularda veya hücre çizgilerinde seçili olarak ifade edilen genlerin tanimlanmasi, bu genlerin transkripsiyonundan kaynaklanan anti jeiileriii bir immünoterapide kullanilmasiyla ilgili kesin bilgi saglamaz. Bunun nedeni, bu anti jenler içinde yalnizca bireysel bir epitop alt popülasyonunun böyle bir uygulama için uygun olacagidir, çünkü bunun için karsilik gelen TCR'ye sahip bir T hücresiiiin buluninasi ve bu 'Özel epitopa yönelik immünolojik tolerans olmainasi ya da asgari düzeyde olmasi gerekmektedir. Dolayisiyla, MHC inolekülleriyle baglantili olarak sunulan asiri ifade edilmis veya seçili ifade edilmisproteinlerin içinden yalnizca T hücreleri arasinda fonksiyonel karsiligi 38olanlarin seçilmesi önemlidir. Böyle bir T hücresi, spesifik antijenle uyarildiktan soiira klonal olarak çogaltilabilen ve efektör islevleriyerine getiren ("efektör T hücresi") bir T hücresi olarak tanimlanir.T yardimci hücreleri anti-tümör immünitesinde STL'lerin efektör islevini yönetinede öneinli bir rol oynar. THl tipte bir T yardiiiici hücre yanitini tetikleyen T yardiinci hücre epitoplari, CD8-pozitif katil T hücrelerinin hücre yüzeyleri üzerinde tüinör iliskili peptit/MHC koinpleksleri sergileyen tümör hücrelerine karsi yönlendirilen sitotoksik fonksiyonlari da içeren efektör fonksiyonlarini desteklemektedir. Böylelikle, tümör iliskili T yardiinci hücre peptit epitoplari, tek baslarina ya da tümör baglantili peptitler ile birlestirilerek anti-tümör immün yanitlarini tesvik eden asikompozisyonlarinin aktif farmasötik bilesenleri olarak kullanilabilirler.Gerek CDS, gerek CD4 baglantili olinak üzere her iki yanit tipi birlikte ve sinerjik olarak anti-tümör etkiye katki sagladigindan, hem CD8+ STL'ler (MHC klas I molekülü), hein de CD4-pozitif STL'ler (MHC klas II rnolekülü) tarafindan taninan tüinör iliskili antijenlerin tanimlanmasi ve karakterizasyonu tümör asilarinin gelistirilmesi açisindan önemlidir. Dolayisiyla, mevcut bulusun bir amaci, MHC koinplekslerinin her iki klasina baglanan peptitler içeren peptitbilesiinleri saglamaktir.Kanser tedavisiyle iliskili agir yan etkiler ve maliyetler göz önünde bulunduruldugunda, prognoza ve taniya yönelik yöntemlerin gelistirilmesine acilen ihtiyaç oldugu görülmektedir. Bu nedenle, genelolarak kanser ve özel olarak gastrik kanser içiii biyobelirteç görevi 39yapacak baska faktörlerin tanimlanmasina gerek vardir. Ayrica, genel olarak kanser ve özel olarak gastrik kanser tedavisinde kullanilacakfaktörlerin tanimlanmasina da gerek duyulmaktadir.Öte yandan, radikal prostatektomi sonrasinda, ilerleinis lokal tümör büyümesi nedeniyle in-situ tümör kalintisi bulunan ve bu nedenle biyokimyasal relapsa maruz kalan gastrik kanser hastalari için yerlesmis bir tedavi tasarimi yoktur. Mevcut terapötik yaklasimlara göre karsilastirilabilir bir terapötik etkinlikle daha düsük birmorbiditeyi birlestiren yeni terapötik yaklasimlar arzu edilmektedir.Mevcut bulus, gastrik kanserin ve bulusa ait peptitleri asiri sunan diger tümörlerin tedavisinde yararli olan peptitler saglamaktadir. Bu peptitlerin HLA molekülleri tarafindan primer insan gastrik kanser numuneleri üzeriiide dogal olarak sunuldugu kütle spektrometrisiylegösterilmistir (bakiniz Ornek 1 ve Sekil 1).Peptitlerin türetildigi kaynak genin gastrik kanserde, renal hücre kanserinde, kolon kanserinde, küçük hücreli olmayan akciger kanserinde, adenokarsinomada, prostat kanserinde, benign neoplazmlarda ve malign melanomda normal dokuya kiyasla yüksek düzeyde asiri ifade edildigi gösterilmis (bkz. Örnek 2 ve Sekil 2), dolayisiyla peptidin yüksek ölçüde tümör iliskili oldugu, yani bu peptitlerin tümör dokusunda güçlü bir sekilde sunuldugu, normaldokularda ise sunulmadigi kanitlanmistir.Simdi mevcut bulus asagidaki, ancak bunlarla sinirli olmayan, örneklerle daha kapsamli biçimde açiklanacaktir. Ilisikteki Sekiller veDizinler Listesinde, 40Sekil 1: CDC2-001'in primer tümör numunesi GC2464 üzerinde sunuldugunu gösteren örnek niteligindeki kütle spektrumunu göstermektedir. NanoESI-SKKS, 2464 no'lu GC numunesinden elue edilen peptit havuzuyla gerçeklestirildi. Burada, in/z 597,3501 ± 0,001 Da, z : 2 için alinan kütle spektrumu 151,63 dk alikonina süresinde bir peptit piki gösterdi. B) Kütle kromatograminda 151,63 dk'de tespit edilen pik MS spektruinunda bir m/z 597,3501 sinyali olusturdu. C) Seçilen in/z 597,3501 prekürsörüyle gerçeklestirilen ve verilen alikonma süresinde nanoESI-SKKS deneyinde kaydedilen bir çarpismayla indüklenen parçalanmali kütle spektrumuyla GC2464 tümör numunesinde CDC2-001'in varligini onaylandi. D) Sentetik CDC2-001 referans peptidinin parçalanma örnegi kaydedildi ve dizini onaylamak amaciyla, C'de gösterilen, dogal TUMAP'inparçalanmasiyla olusturulmus örnek ile karsilastirildi.Sekil 2: Normal dokuda ve 25 gastrik kanser numunesinde seçili proteinlerin mRNA'larinin ifade profillerini göstermektedir; CDC2 (Probeset ID: 203213_at); ASPM (Probeset ID: 219918_s_at).Sekil 3: Klas I TUMAP'larin peptit spesifik in Vitro immünojenesitesinin örnek niteligindeki sonuçlarini göstermektedir.
CD8+ T hücreleri, sirasiyla ilgili (sol pano) ve ilgisiz (sag pano) peptitler yüklenmis yapay APC'ler kullanilarak hazirlandi. Uç uyarma döngüsünün ardindan peptit reaktif hücreler ilgili arti ilgisiz A*2402 multimerleri ile çifte boyama uygulanarak tespit edildi. Gösterilen hücreler canli CD8+ lenfositlerin üzerine geçitlendirildi; grafiklerdekisayilar multimer pozitif hücrelerin yüzdesini temsil etmektedir. 41Sekil 4: PTPRZl'e (tirozin fosfataz, reseptör-tipi, Z polipeptidi l) aitbir HLA klas I peptidinin sunuin profilini göstermektedir.Sekil 5: CDKl'e (siklin bagimli kinaz l) ait bir HLA klas I peptidininsunuin profilini göstermektedir.Sekil 6: ASPM'ye (asp (anormal spindle) homolog, mikrosefali iliskili (Drozofila)) ait bir HLA klas l peptidinin sunum profilinigöstermektedir.Sekil 7: farkli doku alt tiplerinde göreli b2m protein ifadesinin baskinbir biçimde degismedigini göstermektedir.Sekil 8: katilan sentetik maya alkol dehidrogenaz l peptidinin islenmemis ve normalize edilmis sinyal alanlarini göstermektedir.
Kalite kontrolü için, alikonma süreleri, yük durumlari ve dizin uzunluklari farkli olan yedi katki peptidi kullanildi. islenmemis alanlar numune içi ve numuneler arasi degiskenlikleri dikkate alan, örnegin kütle spektrometresinin ayarlarindaki degisikliklerden kaynaklanan sapmalari ortadan kaldiran iki kademeli bir yaklasimla normalize edildi. Tekrarli deneyler arasindaki farkliliklar normal akcigerdokusundan alinan 969 no'lu numune ömeginde gösterildi.Sekil 9: cerrahiyle çikarilmis normal dokular ve tümör dokulari ile saglikli donörlerden alinmis kan numunelerinin kademeli bir yaklasiinla analiz edilmesini göstermektedir:l. Malign ve saglikli dokulardan elde edilen HLA ligandlari asiri sunulan TUMAP'lari (tümör iliskili peptitler) belirlemek amaciylaisaret kullanilmadan sivi kromatografi ile akuple kütle spektrometrisi 42(SKKS) araciligiyla tanimlandi ve diferansiyel olarak kantifiye edildi. 2. Bir dizi normal organ ve dokuya kiyasla malign dokuda asiri ifade edilen genleri belirlemek amaciyla mikrodizi yöntemiyle genom çapinda bir mesajci ribonükleik asit (mRNA) ifadesi analizi gerçeklestirildi.3. Tanimlanan HLA ligandlari gen ifadesi verileriyle karsilastirildi.
Ikinci adimda seçili olarak ifade edildigi veya asiri olarak ifade edildigi teSpit edilen genlerin kodladigi asiri sunulan TUMAP'lar bir çoklu peptit asisi için uygun TUMAP adaylari olarak dikkate alindi.4. Tanimlanan peptitlerin TUMAP olarak uygunluguna yönelik daha fazla kanit saptamak ve proteinin baska bir yolakta çok önemli bir rol oynama olasiligini dislamak için literatür arastirmasi yapildi.5. Çesitli immünoassay yöntemleri (in Vitro T hücre deneyleri) kullanilarak, saglikli bireylerin kanindan elde edilmis periferik Thücrelerinin TUMAP adaylarina karsi reaktivitesi test edildi.Sekil 10: OpenMS ile çizilmis kismi bir SKKS haritasini göstermektedir (M. Sturm and 0. Kohlbacher. TOPPView: Kütle spektrometresi verileri için bir açik kaynak görüntüleyicisidir. J Proteoine.Res 8 (7):3760-3763, 2009) 122 dk'de YLLPAIVHI peptidinin sinyaliyle.SEQ ID No. 1 ilâ 27 Tablo 3'ün peptitlerini ve örnekleri göstermektedir.Ornekler: Asagidaki örneklerde bulus konusu. yöntem TIA'lar/kanser baglaminda açiklanmaktadir. Örnekler bulusun tercih edilen yalnizca biruygulamasini olusturdugundan bulus bu örneklerle sinirli degildir. 43Yöntemler:Doku numuneleriTümörlü ve normal hasta dokulari analiz edilen tümör unsurlarina bagli olarak birçok degisik hastaneden saglandi. Tüm hastalardan ameliyat öncesinde yazili aydinlatilmis onain alindi. Dokular ameliyatin hemen ardindaii sivi nitro jenle sok donduruldu ve TUMAPlar izole edilinceyekadar -80°C'de saklandi.HLA peptitlerinin doku numunelerinden izole edilmesiHLA peptit havuzlari sok dondurulmus doku numunelerinden küçük çapta degistirilmis bir protokol dogrultusunda (Falk, K.1991; Seeger, F.H.T1999} HLA-A, -B, -C-spesifik antikor W6/32, HLA-A*02-spesifik antikor BB7.2 kullanilarak kati dokudan immün çöktürme, CNBr ile aktive edilmis sefaroz, asit islemi ve ultrafiltrasyon yöntemleriyle elde edildi. Farkli HLA alelleri için teknolojide bilinen diger spesifik antikorlar, 'Örnegin A*O3 için GAP-A3 ve B-alelleri için Bl.23.2 kullanilabilir.K'ûtle spektrometresiElde edilen HLA peptit havuzlari ters faz kromatografi (nanoAcquity UPLC system, Waters) kullanilarak hidrofobisitelerine göre ayrildi ve elüe olan peptitler ESI kaynagiyla donatilmis bir LTQ- Orbitrap hibrit kütle spektrometresinde (ThermoElectron) analiz edildi. Peptit havuzlari dogrudan, 1,7 um C18 ters faz materyaliyle (Waters) doldurulmus, analitik, kaynasmis silika mikro kapiller kolona (75 um iç çap x 250 mm) yüklendi ve dakikada 400 nl akis hizi uygulandi.
Ardindan peptitler %10 ilâ %33 B arasinda, iki kademeli 180 dakikalik ikili gradient ile dakikada 300 nl akis hiziyla ayristirildi. Gradient, 44Solvent A (su içinde %0,1 formik asit) ve Solvent B'den (asetonitril içinde %0,l forinik asit) olusuyordu. Numunelerin nanoESI kaynagina uygulanmasi altin kaplamali bir cain kapiller (PicoTip, New Objective) ile gerçeklestirildi. LTQ-Orbitrap kütle spektrometresi veri bagiinli modda, bir TOP5 ve bir TOP3 stratejisi uygulanarak çalistirildi.
Kisaca, Orbitrap'ta (TOP3 için R = 30 000, TOP5 için R = 60 000) yüksek kütle hassasliginda tam taramali bir tarama döngüsü baslatildi, bunu, ya Orbitrap'ta (R = 7500) gerçeklestirilen, `onceden seçilen iyonlarin dinamik olarak dislandigi en bol 5 prekursör iyonuna yönelik (TOP5), ya da LTQ'da gerçeklestirilen, önceden seçilen iyonlarin dinamik olarak dislandigi en bol 3 prekursör iyonuna yönelik (TOP3) bir KS/ KS taramasi izledi.Veri analiziHer numune için, ikisi TOP5 modunda, üçü TOP3 modunda olinak üzere isaret kullanilmadan bes SKKS deneyi icra edildi. SKKS verileri gerek SKKS incelemesinin, gerek Tandem Kütle Spektrometrisinin (KS/KS) verileri, kurum içinde gelistirilinis olan ardisik düzenli bir yöntemle analiz edilerek islendi. Kuruma özgü veri analizi artirimli ve tekrarli ölçüm ayarlarimiza ve standart proteomik yazilimlari tarafindan tatmin edici bir sekilde islenemeyen peptidoinik verilerine uygulanacak sekilde optimize ve adapte edilmistir Her bir yeni veri seti Immatics Discovery veri tabanina (MySQL) entegre edilmektedir. Tüm veriler mevcut proteomik, genomik verileri ve literatür verileriyleçapraz referanslandirilmaktadir.Dizin TanimiTandem KS spektrumlari msnextract (ThermoScientific) kullanilarak 45ekstre edildi ve Sequest kullanilarak IP] veri tabani ile karsilastirildi.
Ardindaii protein veri tabaninda tespit edilen isabetler HLA peptidoniik verileri için optimize edilmis esikler kullanan otomatize kalite filtreleine yöntemiyle degerlendirildi. Ilginç peptit asisi adaylari ayricamanuel denetimle onaylandi.Tanimlanan peptit dizini, olusturulan dogal peptit parçalanma paterni ile es dizinli sentetik peptidin parçalanma paterni karsilastirilarak dogrulandi. Sekil 1'de `Örnek niteligindeki MHC klas I iliskili CDCZ-OOl peptidi için tümör dokusundan elde edilen bir spektrum ve peptidin UPLC sistemindeki elüsyon profili gösterilmektedir.Tanimlama hassasiyetini arttirmak amaciyla kuruin içinde gelistirilmis olan ve spektrumlari IFL'de (Immatics Fragiiieiit Spectra Library = Iinmatics Fragman spektrumlari Kütüphanesi) toplanmis, bilinen peptit KS/KS ile baglantilandiran özel bir kümeleme algoritmasi kullanildi.
Yeiii SKKS deneylerinin KS/KS taramalari kademeli olarak ayri ayri IFL'ye eklenmektedir. Kümelemede, spektral verilere uyarlanmis büyüyerek artan bir k-ortalamalari kümeleme algoritmasi kullanilmaktadir. Taramalar arasindaki ikili benzerlikler MuQest (TherinoScientific) ile ölçüldü. Her bir küme bir uzlasi spektrumu tarafindan temsil edildi. Bu uzlasi spektrumu spektral tekrarlamalari ortadan kaldirarak akis asagi analizleri hizlandirmak için kullanilabilir.
Uzlasi spektrumlari ortalama deneysel KS/KS spektrumlarindan elde edildiginden prekürsor kütleleri daha kesin olup spektrumlar daha azgürültülüdür. 46Göreli TUMAP kantifikasyonuSKKS arastirma verileri Tandem-KS'den bagimsiz olarak yüksek kütle hassasligindan yararlanilarak analiz edildi. SKKS sinyallerini ve sinyal alanlarini (iyon sayimi) ekstre etmek için SuperHirn (ETH Zurich) programi kullanildi. Böylece, tanimlanan her peptit kantitatif verilerle iliskilendirilebilinekte ve numunelerle dokular arasinda görelikantifikasyona olanak saglaninaktadir.Teknik ve biyolojik tekrarlar arasindaki farkliliklari hesaba katmak için merkezi egilim normalizasyonuna dayanan iki kademeli bir norinalizasyon semasi kullanildi. Normalizasyonda, ölçülen sinyallerin çogunun temel peptitlerden kaynaklandigindan ve asiri sunulan küçük fraksiyonun verilerin genel egilimini önemli ölçüde etkilemeyeceginden hareket edilmektedir. Ilk normalizasyon kademesinde ayni numunenin tekrarlari, her bir peptit için ilgili tekrar setinde ortalama sunum hesaplanarak norinalize edilir. Bu ortalama her bir peptit ve SK-KS deneyi, için norinalizasyon faktörlerini hesaplamak amaciyla kullanilir. Tüm peptitlerin ortalamasi alindiginda, deneye özgü iiormalizasyoii faktörleri elde edilir ve bunlar belli bir SKKS deneyinin tüm peptitlerine uygulanir. Bu yaklasim, örnegin deney tekrarlarinda farkli enjeksiyon haciinlerinden kaynaklanan sistematik numune içi farkliliklarin ortadan kalkmasinisaglar.Bir sonraki normalizasyon asamasinda yalnizca tekrarli deney alanlarinin degiskenlik katsayilari %25'in altinda olan peptitler dikkate alinir. Bu kez tanimli bir preparasyon antikorunun (örn. BB7.2) tümnumunelerini kapsamak üzere, her bir peptidin ortalama sunumu 47hesaplanir. Ortalama, her bir peptit ve numune için norinalizasyon faktörlerini hesaplamak amaciyla kullanilir. Tüm peptitlerin ortalamasi alindiginda, numuneye özgü normalizasyon faktörleri elde edilir ve bunlar belli bir nuinunenin tüm peptitlerine uygulanir. Böylece, farkli doku agirliklarindan veya MHC ifade düzeylerinden kaynaklanansapmalar ortadan kalkmis olur.Asiri sunulan peptitleri ekstre etmek amaciyla her bir peptit için ortalama numune sunumunu ve deney tekrarlari arasindaki degiskenlikleri gösteren bir sunuin profili hesaplandi. Profil, ilgi konusu tümör biriminin nuinunelerini karsilastirma amaciyla normal bir doku numunesinin taban çizgisiyle yan yana göstermektedir. Bu profillerin her biri, bir Dogrusal Karisik Etkiler Modelinden (GNU R) hesaplanan p-degeriyle, Yanlis Bulgu Orani kullanilarak tekrarli denemeler için ayarlanmis bir asiri sunum skoru seklinde konsolide edildi. Tüin peptitlerin p-degerlerine göre siralaninasi sunuinbakirriindan en umut verici asi adaylarini ortaya çikarir.BetaZm-mikroglobülinin kantifikasyonu BetaZm-mikroglobülin (b2m) western blotting yöntemiyle kantifiye edildi, jellere yüklenen protein miktarlarini normalize etmek amaciylareferans proteini olarak beta-aktin kullanildi.SonuçlarHücre hatlari kullanilarak TUMAP kantitasyonii gelistirilmesi Ardisik düzenli kantitasyon olusturinak amaciyla çesitli yöntemler uygulandi. Once, numune degiskenligini simüle etmek için %2 ve 20seyreltilmis J Y hücre hatti kullanilarak bir seyreltme deneyi icra edildi. 48Seyreltilmis her numune için üç deney tekrari yapildi. Deney içi ve numuneler içi degiskenligin normalizasyonunun ardindan iki numunearasindaki normalizasyon faktörü 9.95 olarak bulundu.Ikinci bir deneyde diger bir JY numunesine 100, 10 ve 1 fmol'lük seyreltiler halinde tripsin ile hidrolize edilmis MassPREPTM (Waters) protein karisimi (Fosforilaz B, BSA, Bovin Hemoglobin, Enolasc, ADH) katildi. Yine her konsantrasyon için 'üç deney tekrari yapildi.
Veri analizinin ardindan bilinen katilmis peptitlerin ortalama oranlari, sirasiyla l fmol'e karsi 100 fmol nuinunesi için, lOO'e karsi 10 fmol için ve lO'a karsi 1 fmol için olinak üzere 90, 8 ve ll olarak bulundu.Buna ek olarak, peptit tanimlarinin sayisini ve dogrulugunu ve ayarlarimizin kantitatif kesinligini en üst düzeye çikarmak farkli ölçüm yöntemlerini karsilastirdik. Bu amaçla degisik KS/KS modlarinda birJ Y numunesinin yaklasik 50 tekrarli deneyini icra ettik.Primer t'i'imör dokulari ve normal dokularAsagida göreli olarak kantifiye edilmis TUMAP'lara örneklergösterilinektedir.Ornek 1:Glioblastoma asi kokteylinin bir parçasi olan PTPRZl'e (tirozin fosfataz, reseptör-tipi, Z polipeptidi l) ait bir HLA klas I peptidinin sunum profili. Çesitli organlardan elde edilen normal doku numunelerine göreli tümör numuneleri kirmizi renkte gösterilmistir.
Her bir çubuk bu peptidin normalize edilmis ortalama alanini, hata çubuklari ise ölçüm degiskenliginin göstergesi olarak tekrarlideneylerde bulunan minimum ve maksimum alanlari göstermektedir. 49Ornek 2: CDC2-001 CDKl tarafindan kodlanan gastrik kanser iliskili bir TUMAP'a iliskinsunum profili için, Sekil 5 referans alinmistir.Ornek 3: ASPM-002 ASPM tarafindan kodlanaii gastrik kanser iliskili bir TUMAP'a iliskinsunum profili için, Sekil 6 referans alinmistir.Çesitli tümör 'ögelerinde MHC protein ifadesiBulusu yapanlar MHC ifade düzeylerinin araligini belirlemek amaciyla, üçlü MHC alfa zinciri/beta-Z- mikroglobülin/peptit kompleksini temsilen beta-Z-mikroglobülini kullanarak çesitli doku ögelerinde MHC moleküllerinin ifadesini analiz ettiler (bakiniz Sekil7).Göreli MHC ifadesi (b2m/beta aktin) ortalama deger b2m/beta actin : 0.52'nin çevresinde yalnizca 5 faktöründe bir degiskenlik gösterdi, yani çesitli doku unsurlari arasinda oldukça sabitti. Bu aralik kütle spektrometrisi verilerine dayanan bir normalizasyon için yeterincedardi.Western blotting (WB) ile karsilastirmali olarak kütle spektrometrisiverileri bazli MHC miktarlarinin normalizasyonu. 50 Tablo 2: WB bazli ve KS bazli MHC norinalizasyonunun karsilastirilmasiTC001T RCC2216N RCC2216T RCC2223N RCC2223T Göreli WB normaliz. faktörü 0.07 2.03 2.58 1.00 0.17 Göreli KS normaliz. faktörü 0.05 2.53 1.11 1.00 0.30 suanDokLi agirligi [g] 3.56 0.29 0.89 0.65 1.54119 540 47 908 877MS normali-zasyonu lD'leri Özetle, KS ve WB bazli normalizasyonlarinin birbiriylekiyaslanabililigi çok iyidir; bu iki normalizasyon yöntemi arasindakidegiskenlik yalnizca faktör 2 civarindadir.KS normalizasyonfaktörünün hesaplanmasinda kullanilan tanimli öge sayisi arttikçakesinligi de artmaktadir. Dolayisiyla, KS bazli normalizasyon primerdoku immün çöktürme islemlerinden elde edilen degisken MHCmolekül miktarlarini dengelemek için güvenilir bir yöntemdir.Kalite güvencesiKantitatif performansi sürekli olarak denetleinek amaciyla alikoninasüresinin ve sinyal alaninin kalite kontrolü için insan kökenli olmayanyedi sentetik peptit belirledik ve uygulamaya koyduk. 51Her numune bes kez tekrarlanan deneylerle Ölçüldü, Ölçüm sorunlarini tespit etmek için peptit kantitasyonlari degiskenlik tahmini esliginde icra edildi. Buna paralel olarak, degerlendirmeye alinan peptitlere ait verilerin tutarliligini ve dogrulugunu güvence altina alinak için birmanuel kalite kontrol prosedürü olusturduk.Peptitleriii immünojenesitesinin belirlenmesine ve ifade profiliçikarmaya yönelik `ornekIi'sa edildigi sekliyle peptitleri kodlavan genlerin ifade profilinin _çikarilmasiMHC molekülleri tarafindan tümör hücrelerinin yüzeyinde sunuldugu tespit edilen her peptit immünoterapi için uygun degildir, çünkü bu peptitlerin çogunlugu birçok hücre tipi tarafindan ifade edilen normal hücre proteinlerinden kaynaklanmaktadir. Bu peptitlerin yalnizca birkaçi tümör iliskilidir ve olasilikla türedikleri tümörü yüksek ölçüde spesifik olarak taniyacak T hücrelerini indükleme yetenegine sahiptir.
Bulusu yapanlar, bu tür peptitleri tespit etmek ve asidan kaynaklanabilecek otoimmünite riskini en aza indirgemek için normal dokularin çogunlugunun aksine tümör hücrelerinde asiri ifade edilenproteinlerden elde edilen peptitlere odaklanmislardir.Ideal peptit, tümöre mahsus olan ve baska dokularda bulunmayan bir proteinden elde edilen bir peptit olacaktir. Ifade profilleri ideal peptidinkiiie benzer genlerden kaynaklanan peptitleri tespit etmek için, tanimlanan peptitler proteinlere ve bunlarin kaynaklandigi genlereatanmis ve bu genlerin ifade profilleri çikartilmistir. 52RNA kaynaklari ve preparasyonHer hastadan yazili aydinlatilmis onain alindiktan sonra cerrahiyle çikarilan doku numuneleri iki ayri klinik merkezden (bkz. Örnek 1) saglandi. Tümör dokusu numuneleri aineliyatin hemen ardindan sivi nitro jenle sok donduruldu ve daha sonra sivi nitrojen altinda havanda homojeiiize edildi. Total RNA bu iiumunelerden TRI Reagent reaktifi (Ambion, Darinstadt, Almanya) kullanilarak hazirlandi, bunu RNeasy (QIAGEN, Hilden, Almanya) ile bir saflastirma adimi izledi; her ikiislem üreticilerin protokolüne göre gerçeklestirildi.Saglikli insan dokusundan total RNA piyasadan temin edildi (Ambion, Huntingdon, Ingiltere; Clontech, Heidelberg, Almanya; Stratagene, Amsterdam, Hollanda; BioChain, Hayward, CA, ABD). Degisik bireylerin (2 ilâ 123 arasinda birey) RNA'lari her bireyin RNA'si esit agirlikli olacak sekilde karistirildi. Lökositler dort saglikli gönüllüdenegin kan numunelerinden izole edildi.Tüm RNA numuneleriiiin kalite ve miktari, RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent) kullanilarak bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent,Waldbronn, Germany) analizör'ûyle onaylandi.Mikrodizi deneyleriTüm tümör ve normal doku RNA numunelerinin gen ifadesi analizleri Affymetrix Human Genome (HG) U133A veya HG-Ul33 Plus 2.0 oligonükleotid mikrodizileriyle (Affymetrix, Santa Clara, CA, ABD) gerçeklestirildi. Tüm adimlar Affymetrix el kitabi dogrultusunda uygulandi. Kisaca, çift Zincirli cDNA, 5-8 ug total RNA'dan Superscript RTII (Invitrogen) ve oligo-dT-T7 primer (MWG Biotech, 53Ebersberg, Almanya) kullanilarak kilavuzda tarif edildigi gibi sentezlendi. In vitro transkripsiyon U133A dizilerinde BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, ABD) veya U133 Plus 2.0 dizilerinde GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) kullanilarak gerçeklestirildi, bunu cRNA fragmentasyonu, hibridizasyon, streptavidin-fikoeritrin ve biotinlenmis anti-streptavidin antikoru (Molecular Probes, Leiden, Hollanda) ile boyama islemleri izledi. Görüntüler Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) veya Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U 1 33 Plus 2.0) ile tarandi ve veriler GCOS yaziliini (Affymetrix) ile, tüm parametreler varsayilan degerlere ayarlanarak analiz edildi.
Normalizasyon için Affymetrix tarafindan tedarik edilen 100 referans gen kullanildi. Göreli ifade degerleri yazilimin sagladigi sinyal günlügü oranlarindan hesaplandi ve normal böbrek numunesi istege göre 1.0degerine ayarlandi.Ifsa edildigi sekliyle gastrik kanserde yüksek düzeyde asiri ifade edilen kaynak genlerin ifade profilleri Sekil 2'de gösterilmistir.ORNEK 3:IMA941 MHC klas I sunumlu peptitlerin in vitro immîinojenesitesiIfsa edildigi sekliyle TUMAP'larin immünojenesitesi hakkinda bilgi edinmek için asagidaki kaynakta daha önce tanimlanmis yerlesik bir in vitro uyarim platformunu kullandik (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wemet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CDZS-coated microspheres, J. 54Iinmunol., 171, 4974-4978). Böylece, ifsa edildigi sekliyle 32 HLA-A*2402 kisitli TUMAP için immünojenesite bulduk ve bu peptitlerin insanda kendilerine karsiCD8+ öncül T hücreleri bulunan T hücre epitoplari oldugunu gösterdik (Tablo 3).CD8+ T hücrelerinin in vitro kosullarda hazirlanmasi (priming)Peptit-MHC kompleksi (pMHC) ve anti-CD28 antikoru yükleninis yapay anti jen sunan hücrelerin (aAPC) in vitro kosullarda uyarilmasiiii gerçeklestirmek için önce Tübingen Kan Bankasindan temin ettigimiz, saglikli donörlerden elde edilmis taze HLA-A*24 lökaferezürünlerinden CD8 T hücreleri izole ettik.Cd8 T hücreleri ya dogrudan lökaferez ürününden zenginlestirildi ya da önce standart gradient ayirma ortami (PAA, Colbe, Alinanya) kullanilarak PBMC'ler (periferik kari mononükleer hücreleri) izole edildi. Izole edilen CD8 lenfositleri veya PBMC'ler, %10, isiyla inaktive edilinis, insan AB seruinu (PAN Biotech, Aidenbach, Almanya), 100 U/inl penisilin / 100 tig/ml streptomisin (Cambrex, Köln, Almanya), 1 mM sodyum piruvat (CC Pro, Oberdorla, Almanya), 20 tig/ml gentamisin (Cambrex) katkili RPMI-Glutamax'tan (Invitrogen, Karlsruhe, Gerinany) olusan T hücresi ortaminda (TCM) kullanilincaya kadar inkübe edildi. Bu kültür kademesinde TCM'ye 2,5 ng/ml lL-7 (ProinoCell, Heidelberg, Alinanya) ve 10 U/ml lL-Z de (Novartis Pharma, Nürnberg, Almanya) katildi. CD8+ lenfositlerinin izolasyonu CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach,Almanya) kullanilarak pozitif seçim yöntemiyle gerçeklestirildi.pMHC/anti-CD28 kapli boncuklarin olusturulmasi, T hücresi 55stimülasyonlari ve disa okuma küçük degisikliklerle daha önce tarif edildigi sekilde (Walter et al. 4974-78) gerçeklestirildi. Kisaca, transmembran domainleri olmayan, agir zincirlerinin karboksil ucu biotinlenmis, biotinli peptit yüklü rekombinant HLA-A*2402 molekülleri üretildi. Saflastirilmis es uyarici fare IgGZa anti insan CD28 Ab 9.3 (Juiig, Ledbetter, and Muller-Eberhard 4611-15) Sulfo-N-hydroxysuccinimidobiotin kullanilarak üretici tarafindan (Perbio, Bonn, Almanya) önerildigi sekilde kimyasal olarak biotinlendi. Boncuk olarak 5,6 pm büyüklügünde, streptavidin kapli polistren parçaciklar kullanildi (Bangs Laboratories, lllinois, ABD).
Kontrol olarak sirasiyla A*0201/MLA-001 (modifiye edilmis Melan-A/MART-l'den elde edilmis ELAGIGILTV peptidi (SEQ lD No. 26)) ve A*0201/DDX5-001 (DDX5'ten YLLPAIVHI (SEQ ID No. 27)) pMHC'leri kullanildi.800.000 boncuk / 200 yil, 96 kuyucuklu plakalarda 600 ng biotin anti-CD28 arti 200 ng etkili biotin-pMHC (yüksek yogunluklu boncuklar) ile kaplandi. Stimülasyonlar, 96 kuyucuklu plakalarda lXlO6 CD8+ T hücresinin 200 ul, 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) katkili TCM'de, 2xio5 yikanmis kapli boncukla birlikte 37°C'de 3-4 gün iiikübe edilmesiyle baslatildi. Ardindan, ortamin yarisi, 80 U/nil IL-2 katkili taze TCM ile degistirildi ve inkübasyona 37°C'de 3-4 gün devam edildi. Uyarim döngüsü toplam olarak üç kez uygulandi. Son olarak, multimer analizleri hücreler Live/dead-Aqua boyasi (Invitrogen, Karlsruhe, Almanya), CD8-FITC antikor kloiiu SKl (BD, Heidelberg, Almanya) ve PE veya APC ile akuple A*2402 HLA multimerleriyle boyanarak icra edildi. Analiz için, uygun lazer vefiltrelerle donatilmis bir BD LSRII SORP sitometresi kullanildi. Peptit 56spesifik hücreler toplam CD8+ hücrelerinin yüzdesi olarak hesaplandi.
Multiinerik analizler FlowJo yazilimi (Tree Star, Oregon, ABD) kullanilarak degerlendirildi. Spesifik mültimer+ CD8+ lenfositlerinin in vitro hazirlanmasi (priming) uygun bir geçitleme ve negatif kontrol stiinülasyonlariyla karsilastirma yoluyla belirlendi. Belli bir anti jeiile ilgili olarak immünojenesiteden bahsetmek için in vitro uyarimin ardindan, degerlendirilebilir bir in vitro uyarim görülen, saglikli bir doiiöre ait en az bir kuyucukta Spesifik bir CD8+ T hücre hatti buluninasi (yani bu kuyucugun CD8+ T hücreleri arasinda en az %1 spesifik multimer+ hücre bulunmasi ve spesifik multimer+ hücre yüzdesinin negatif kontrol uyarimlarinin ortalamasinin en az 10 katiolmasi) gerekiyordu.Peptitlerinin in vitro immünojenesitesiIncelenen HLA klas I peptitleri için peptit spesifik T hücre hatlari olusturularak 25 peptitte in vitro iinmünojenesite gösterildi. Ifsa edildigi sekliyle iki peptit için TUMAP spesifik inultimer boyaina sonrasi akis sitometrisi sonuçlari ilgili negatif kontrol ile birlikte Sekil 3'te gösterilmistir. Ifsa edildigi sekliyle 25 peptidinin sonuçlari Tablo3'te özetlenmistir.Tablo 3: Ifsa edildigi sekliyle HLA klas l peptitlerinin in vitro irnmünojenesitesiBulusu yapanlar tarafindan yürütülen in vitro inimünojenesite deneylerinin sonuçlari, degerlendirilebilir sonuçlar arasinda pozitif test edilen donör ve kuyucuklarin yüzdesini göstermektedir. Her bir peptitiçin en az iki donör ve 24 kuyucuk degerlendirilebilir bulunmustur. 57

Claims (10)

    ISTEMLER
  1. l. En az bir memeliden alinan bir veya birden fazla primer doku numunesinde en az bir MHC ligand peptidinin tanimlanmasi ve isaret kullanilmadan kantifikasyonuna yönelik bir yöntem olup yöntem sunlardan olusinaktadir: en az bir saglikli doku numunesinden ve söz konusu primer hastalikli dokuyla iliskili ikinci bir hastalikli doku numunesinden en az bir MHC ligand peptidinin izole edilmesi, söz konusu MHC ligand peptitlerinden peptit sinyalleri olusturmak airiaciyla bunlarin YBSK-KS analizine tabi tutulmasi, söz konusu MHC ligand peptitlerinin her biri için öncül iyon sinyal alaninin belirlenmesi, fragman spektrumlarinin kümelenmesi ve/Veya veri tabani arastirmasi vasitasiyla söz konusu MHC ligand peptitlerinin her birinin dizininin belirlenmesi, farkli deneylerde bulunan alanlar gruplandirilarak ve her bir numune için ortalama bir deger elde etmek ainaciyla söz konusu alanlar tekrarli deneyler kapsaminda normalize edilerek MHC ligand peptitlerinin ortalama miktarlarinin belirlenmesi, MHC ligand peptitlerinin numuneler arasinda karsilastirilabilir göreli miktarlarinin belirlenmesi bunun: fl) MHC ligand peptidinin baglanmasi beklenen en az bir MHC alelinin tanimlanmasi vasitasiyla farkli nuinuneler arasinda karsilastirma yapmak amaciyla, MHC ligand peptidinin alel spesifik bir alt gruba atanmasi, ve f2) farkli numune büyüklüklerini ve/veya MHC ifade düzeylerini hesaba katmak amaciyla alel spesifik alt gruplar kullanilarak farkli numuneler arasinda normalizasyon yapilmasini; ve f3) her bir numune için peptit tekrarlanabilirligi bazinda veri kalite kontrolü yapilmasini içermesi, g) söz konusu ortalama ve göreli MHC ligand peptit miktarlari bazinda söz konusu hastalikli numune ile söz konusu saglikli nuinunenin MHC ligand peptidi için sunuin profilinin ve/Veya sunuin skoruiiun hesaplanmasi yoluyla MHC ligand peptidinin asiri sunumunun belirlenmesi, ve h) MHC ligand peptidinin isaret kullanilmadan kantifikasyonu.
  2. 2. Istem l'deki yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin miktarlari ve MHC ifade düzeyleri farkli doku numunelerinin islenmesine olanak saglamasidir.
  3. 3. Istem 1”e veya 2'ye uygun bir yöntem olup, özelligi söz konusu hastalikli numunenin bir tümör nuinunesi veya enfekte bir doku numunesi olmasidir.
  4. 4. Istem 1 ilâ 3'teki yöntemlerden herhangi biri olup, özelligi yöntemin yüksek isleme kapasitesi düzeyinde icra edilebilmesidir.
  5. 5. Istem l ilâ 4'teki yöntemlerden herhangi biri olup, özelligi söz konusu yöntemin daha önce test edilmis numunelerden olusan bir veri setine yeni numunelerin verilerinin eklenmesi yoluyla arttirilarak icra edilme olanagina sahip olmasidir.
  6. 6. Istem l ilâ 5'teki yöntemlerden herhangi biri olup, Özelligi her numune için isaret kullanilmadan en az bes tekrarli SK-KS deneyi icra edilmesidir.
  7. 7. Istein 6'daki yöntein olup, özelligi tekrarli deneyler kapsaminda alanlarin asagidakilerden olusan bir yöntemle normalize edilmesidir: (el) her bir peptit için her bir numuneye ait tüm tekrarli deneylerin sunum degerlerinden ortalama bir sunum degerinin hesaplanmasi; ve (e2) söz konusu ortalama sunum degeri kullanilarak her bir peptit ve her bir tekrarli deney için bir normalizasyon faktörünün hesaplanmasi; ve (e3) tüm peptit sonuçlarinin ortalamasi alinarak deneye özgü norinalizasyon faktörlerinin elde edilmesi; ve (e4) deneye özgü normalizasyon faktörleriiiin belli bir tekrarli deneyin tüm peptitlerine uygulanmasi.
  8. 8. Istem l'deki yöntein olup, özelligi farkli numuneler arasiiidaki iiorinalizasyonun asagidakilerden olusan bir yöntemle icra edilmesidir: (f201) tanimli bir preparasyon antikorunuii tüm numuneleri için her bir peptidin ortalama sunum degerinin hesaplanmasi; (f2ß) (f2a) kademesinde hesaplanan ortalama sunum degeri kullanilarak her bir peptit ve numune için bir normalizasyon faktörünün hesaplanmasi; ve (ny) tüm peptit sonuçlarinin ortalamasi alinarak numuneye özgü normalizasyon faktörleri elde edilmesi, ve (f28) numuneye özgü normalizasyon faktörlerinin belli bir numunenin tüm peptitlerine uygulanmasi.
  9. 9. Istem l ilâ 8'deki yöntemlerden herhangi biri olup, Özelligi sunum skorunun bir dogrusal karma inodelin p-degeri veya bir t-testinin p-degeri olmasidir.
  10. 10. Istem 9'daki yöntem olup, özelligi tekrarli deneyler için sunum skorunun yanlis bulgu orani kullanilarak ayarlanmasidir.
TR2018/02923T 2010-04-16 2011-04-15 Kansere, otoimmün ve enfeksiyöz hastalıklara karşı immünoterapi geliştirmek için doğal biçimde işlenmiş hla kısıtlı peptitlerin diferansiyel kantifikasyonuna yönelik yöntem. TR201802923T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32494110P 2010-04-16 2010-04-16
GBGB1006360.0A GB201006360D0 (en) 2010-04-16 2010-04-16 Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802923T4 true TR201802923T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=42245305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02923T TR201802923T4 (tr) 2010-04-16 2011-04-15 Kansere, otoimmün ve enfeksiyöz hastalıklara karşı immünoterapi geliştirmek için doğal biçimde işlenmiş hla kısıtlı peptitlerin diferansiyel kantifikasyonuna yönelik yöntem.

Country Status (24)

Country Link
US (2) US9791443B2 (tr)
EP (1) EP2558867B1 (tr)
JP (1) JP6010019B2 (tr)
KR (1) KR101602010B1 (tr)
CN (1) CN102939540B (tr)
AU (1) AU2011239959B2 (tr)
CA (1) CA2793490C (tr)
CY (1) CY1119861T1 (tr)
DK (1) DK2558867T3 (tr)
ES (1) ES2658268T3 (tr)
GB (1) GB201006360D0 (tr)
HR (1) HRP20180240T1 (tr)
HU (1) HUE036833T2 (tr)
IL (1) IL221860A (tr)
LT (1) LT2558867T (tr)
ME (1) ME03054B (tr)
NO (1) NO2558867T3 (tr)
PL (1) PL2558867T3 (tr)
PT (1) PT2558867T (tr)
RS (1) RS57042B1 (tr)
SG (1) SG183814A1 (tr)
SI (1) SI2558867T1 (tr)
TR (1) TR201802923T4 (tr)
WO (1) WO2011128448A1 (tr)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
CN103180730B (zh) 2010-05-14 2016-03-02 综合医院公司 鉴定肿瘤特异性新抗原的组合物和方法
CN105999250B (zh) 2011-05-24 2020-03-10 生物技术Rna制药有限公司 用于癌症的个体化疫苗
WO2013081721A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Battelle Memorial Institute Biomarkers for lymphoma
US10501801B2 (en) 2012-09-28 2019-12-10 University Of Connecticut Identification of tumor-protective epitopes for the treatment of cancers
TWI777198B (zh) 2013-08-05 2022-09-11 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（七）
ES2900004T3 (es) 2013-08-05 2022-03-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Nueva inmunoterapia contra diversos tumores como el cáncer de pulmón, incluido el carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC)
GB201319446D0 (en) * 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
GB201408255D0 (en) 2014-05-09 2014-06-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
GB201411037D0 (en) 2014-06-20 2014-08-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL)
CA2960834A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Genentech, Inc. Immunogenic mutant peptide screening platform
US11338026B2 (en) 2014-09-10 2022-05-24 The University Of Connecticut Identification of immunologically protective neo-epitopes for the treatment of cancers
WO2016100977A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
GB201501017D0 (en) 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
GB201423361D0 (en) * 2014-12-30 2015-02-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
GB201507030D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
US10568948B2 (en) 2015-05-13 2020-02-25 Agenus Inc. Vaccines for treatment and prevention of cancer
MX2017014700A (es) 2015-05-20 2018-08-15 Broad Inst Inc Neoantigenos compartidos.
ZA201707555B (en) 2015-06-25 2018-11-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel cell epitopes and combination of cell epitopes for use in the immuno-therapy of myeloma and other cancers
GB201511191D0 (en) 2015-06-25 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh T-cell epitopes for the immunotherapy of myeloma
EP3919507A3 (en) 2015-07-01 2022-01-12 Immatics Biotechnologies GmbH Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MA51531A (fr) 2015-07-06 2020-11-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et nouvelle combinaison de peptides à utiliser dans l'immunothérapie du cancer de l' oesophage et d'autres cancers
GB201511792D0 (en) 2015-07-06 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esopageal cancer and other cancers
GB201512369D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
US20170136108A1 (en) 2015-08-28 2017-05-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
TWI794761B (zh) 2015-08-28 2023-03-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架
GB201517538D0 (en) 2015-10-05 2015-11-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
MY198087A (en) 2015-10-05 2023-07-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
EP3362929B1 (en) * 2015-10-12 2020-08-12 Nantomics, LLC Viral neoepitopes and uses thereof
IL258688B2 (en) 2015-10-12 2023-04-01 Nantomics Llc Compositions and methods for cancer viral neoepitopes
GB201522667D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
CN114028549A (zh) 2016-02-19 2022-02-11 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
GB201602918D0 (en) 2016-02-19 2016-04-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers
IL302705A (en) 2016-03-01 2023-07-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides, combinations of peptides, cell-based drugs for use in immunotherapy against bladder cancer and other types of cancer
CN109071605A (zh) 2016-04-06 2018-12-21 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于aml和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
WO2017184590A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Improved hla epitope prediction
TWI796299B (zh) 2016-08-26 2023-03-21 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架
EP4317432A3 (en) 2016-12-08 2024-04-17 Immatics Biotechnologies GmbH T cell receptors with improved pairing
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
WO2018140391A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
AR110857A1 (es) 2017-01-27 2019-05-08 Immatics Biotechnologies Gmbh Péptidos y combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer
WO2018138257A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
RS64217B1 (sr) * 2017-01-27 2023-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka jajnika i drugih malignih tumora
US10899819B2 (en) 2017-04-10 2021-01-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against leukemias and other cancers
MA49122A (fr) 2017-04-10 2021-03-24 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides et combinaisons de peptides destinés à être utilisés en immunothérapie anticancéreuse
TW201841934A (zh) 2017-04-10 2018-12-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於治療癌症免疫治療的新穎肽及其肽組合物
JP2020530759A (ja) 2017-07-07 2020-10-29 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｎｓｃｌｃ、ｓｃｌｃ、およびその他のがんをはじめとする肺がんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびペプチド併用
US10800823B2 (en) 2017-07-07 2020-10-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including NSCLC, SCLC and other cancers
US11793867B2 (en) 2017-12-18 2023-10-24 Biontech Us Inc. Neoantigens and uses thereof
DE102018107224A1 (de) 2018-02-21 2019-08-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
MA52363A (fr) 2018-04-26 2021-03-03 Agenus Inc Compositions peptidiques de liaison à une protéine de choc thermique (hsp) et leurs méthodes d'utilisation
TW202016131A (zh) 2018-05-16 2020-05-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於抗癌免疫治療的肽
US10925947B2 (en) 2018-06-29 2021-02-23 Immatics Biotechnologies Gmbh A*03 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
CN109002689B (zh) * 2018-07-23 2020-10-09 西安交通大学医学院第一附属医院 T细胞数据处理方法及装置
TW202019955A (zh) 2018-07-31 2020-06-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法
DE102018122546B3 (de) 2018-09-14 2019-12-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Verfahren zum Hochdurchsatz-Peptid-MHC-Affinitätsscreening für TCR-Liganden
US11945850B2 (en) 2018-09-17 2024-04-02 Immatics Biotechnologies Gmbh B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
TW202024121A (zh) 2018-09-18 2020-07-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 A*01 限制肽和肽組合物在抗癌免疫治療中的用途和相關方法
TW202039535A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法
WO2020245839A1 (en) * 2019-06-06 2020-12-10 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for identification and absolute quantification of product-related impurities in a protein using high-resolution mass spectrometry
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
CA3150197A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Immatics US, Inc. Methods for peptide mass spectrometry fragmentation prediction
US20210048442A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the characterization of peptide:mhc binding polypeptides
US11920202B2 (en) 2020-04-09 2024-03-05 University Of Connecticut Unbiased identification of tumor rejection mediating neoepitopes
CA3183756A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Amgen Inc. Mageb2 binding constructs
TW202229312A (zh) 2020-09-29 2022-08-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 由非ｈｌａ－ａ*０２顯露以用於不同類型癌症之免疫治療的醯胺化肽及其脫醯胺化對應物
DE102020125457A1 (de) 2020-09-29 2022-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
DE102020125465A1 (de) 2020-09-29 2022-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch nicht-HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
US11161892B1 (en) 2020-12-07 2021-11-02 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
TW202241925A (zh) 2021-01-15 2022-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於不同類型癌症免疫治療的ｈｌａ展示肽
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
JP2024518378A (ja) 2021-05-05 2024-05-01 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質
KR20240038028A (ko) 2021-07-27 2024-03-22 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 Ct45에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60223696T2 (de) 2001-09-14 2009-01-29 Electrophoretics Ltd., Cobham Massenmarker
DE10225139A1 (de) 2002-05-29 2004-02-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Verfahren zur Identifizierung von immunreaktiven Peptiden
EP1714157A2 (en) 2004-01-28 2006-10-25 Immatics Biotechnologies GmbH Method for identifying and quantifying of tumour-associated peptides
ES2330013T3 (es) * 2005-09-05 2009-12-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidos asociados a tumores unidos a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase i o ii y vacunas contra el cancer relacionadas.
GB0611669D0 (en) * 2006-06-13 2006-07-19 Astrazeneca Uk Ltd Mass spectrometry biomarker assay
PL2113253T3 (pl) 2008-04-30 2010-09-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowa postać leku - preparat zawierający peptydy nowotworowe wiążące się z antygenami ludzkich leukocytów klasy I i II, zastosowany w szczepionce

Also Published As

Publication number Publication date
JP6010019B2 (ja) 2016-10-19
WO2011128448A1 (en) 2011-10-20
US9791444B2 (en) 2017-10-17
NO2558867T3 (tr) 2018-05-05
GB201006360D0 (en) 2010-06-02
AU2011239959B2 (en) 2015-04-16
ES2658268T3 (es) 2018-03-09
PL2558867T3 (pl) 2018-04-30
AU2011239959A1 (en) 2012-08-09
LT2558867T (lt) 2018-02-12
SG183814A1 (en) 2012-11-29
DK2558867T3 (da) 2018-01-29
US20130096016A1 (en) 2013-04-18
RS57042B1 (sr) 2018-05-31
CY1119861T1 (el) 2018-06-27
US9791443B2 (en) 2017-10-17
KR20130095186A (ko) 2013-08-27
EP2558867B1 (en) 2017-12-06
KR101602010B1 (ko) 2016-03-09
CA2793490C (en) 2017-09-12
JP2013525759A (ja) 2013-06-20
PT2558867T (pt) 2018-02-08
ME03054B (me) 2018-10-20
SI2558867T1 (en) 2018-04-30
IL221860A (en) 2017-09-28
CN102939540A (zh) 2013-02-20
HRP20180240T1 (hr) 2018-03-09
US20110257890A1 (en) 2011-10-20
HUE036833T2 (hu) 2018-08-28
CA2793490A1 (en) 2011-10-20
EP2558867A1 (en) 2013-02-20
CN102939540B (zh) 2014-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201802923T4 (tr) Kansere, otoimmün ve enfeksiyöz hastalıklara karşı immünoterapi geliştirmek için doğal biçimde işlenmiş hla kısıtlı peptitlerin diferansiyel kantifikasyonuna yönelik yöntem.
JP6435286B2 (ja) 癌ワクチン組成物
ES2443582T3 (es) Método para diagnosticar el cáncer que comprende la medición de las células precursoras de CTL específicos de WT1
TW202012619A (zh) 獲得腫瘤特異性ｔ細胞受體之方法
KR102158225B1 (ko) 헬퍼 t세포의 활성화 방법
TWI608844B (zh) Ｎｅｉｌ３胜肽及其疫苗
Zeng et al. Gamma delta T cells recognize haptens and mount a hapten-specific response
US11767352B2 (en) Histone anti-cancer vaccines
JP6960179B2 (ja) 腫瘍抗原ペプチド
KR20120073199A (ko) 면역 유도제
Philip et al. Shared immunoproteome for ovarian cancer diagnostics and immunotherapy: potential theranostic approach to cancer
TW201138806A (en) CDCA5 peptides and vaccines including the same
JP5281515B2 (ja) 腫瘍抗原タンパク質及びその利用
TW201636370A (zh) 腫瘤抗原胜肽
EP2363468B1 (en) Tumor antigen peptide and use thereof
KR101323192B1 (ko) 면역 유도제 및 암의 검출 방법
EA028216B1 (ru) Пептиды tomm34 и содержащие их вакцины
CN110582701A (zh) 检查癌症治疗效果的方法和用于诱导免疫应答的组合物
TWI565473B (zh) Ｈｊｕｒｐ胜肽與含此胜肽之疫苗
US20220008528A1 (en) Composition for preventing or treating benign tumor
Nepom Tetramer analysis of human autoreactive CD4‐positive T cells
JP5648261B2 (ja) 癌の検出方法
TW201512223A (zh) Ｓｍｙｄ３胜肽及含此之疫苗
Altmann British Society for Immunology 5–8 December 2011 Liverpool, UK
TW201134480A (en) CLUAP1 peptides and vaccines including the same