ES2658268T3

ES2658268T3 - Método para la cuantificación diferencial de péptidos restringidos a HLA procesados de forma natural que están destinados al desarrollo de inmunoterapias contra el cáncer y contra enfermedades autoinmunitarias e infecciosas

Info

Publication number: ES2658268T3
Application number: ES11714563.1T
Authority: ES
Inventors: Toni Weinschenk; Jens Fritsche
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2018-03-09
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: IL221860A; CA2793490C; SI2558867T1; CN102939540A; US20110257890A1; JP2013525759A; AU2011239959B2; NO2558867T3; US9791443B2; TR201802923T4; RS57042B1; KR20130095186A; PT2558867T; KR101602010B1; US20130096016A1; HUE036833T2; GB201006360D0; HRP20180240T1; US9791444B2; ME03054B

Abstract

Método para la identificación y la cuantificación sin marcaje de al menos un ligando peptídico del MHC en una o más muestras de tejido primario procedentes de al menos un mamífero, en que dicho método comprende: a) Aislamiento de al menos un ligando peptídico del MHC a partir de como mínimo una primera muestra de tejido sano y de una segunda muestra de tejido enfermo correspondiente a dicho tejido enfermo primario, b) Realización de un análisis por HPLC-EM de dichos ligandos peptídicos del MHC con el fin de generar una señal de tales péptidos c) Determinación del área de la señal del ión precursor para cada una de dichas señales de ligandos peptídicos del MHC d) identificación de las secuencias de cada uno de los citados ligandos peptídicos del MHC, mediante el agrupamiento de los espectros de fragmentación y/o la búsqueda en base de datos e) Determinación de una cantidad promedio del ligando peptídico del MHC mediante la agrupación de las áreas obtenidas en diferentes series de análisis repetidos y la normalización de dichas áreas dentro de cada una de las series de análisis, con el fin de crear un valor promedio para cada muestra f) Determinación de cantidades relativas del ligando peptídico del MHC que sean comparables entre las muestras, la cual comprende f1) Asignación del ligando peptídico del MHC a un subgrupo de secuencias específicas de alelo para efectuar una comparación entre distintas muestras mediante la identificación de al menos un alelo del MHC al cual se prevé que el ligando peptídico del MHC se uniría, y f2) Normalización entre diferentes muestras por medio de los subgrupos específicos de alelo para tener en cuenta los distintos tamaños de muestra y/o niveles de expresión del MHC; y f3) Ejecución de un control de calidad de los datos basado en la reproducibilidad del péptido en cada muestra g) Determinación de la sobrepresentación del ligando peptídico del MHC mediante el cálculo de un perfil de presentación y/o de una puntuación de presentación correspondientes al ligando peptídico del MHC de la citada muestra de tejido enfermo y de la citada muestra de tejido sano basados en el citado promedio y en las cantidades relativas del ligando peptídico del MHC, y h) Cuantificación sin marcaje del ligando peptídico del MHC.

Description

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La Tabla 1 muestra ejemplos preferidos de parasitosis humanas:

Protozoos

Nombre vulgar del organismo o la enfermedad: Nombre científico Partes del cuerpo afectadas Prevalencia Origen y transmisión (Reservorio y vector)

Babesiosis: Babesia B. divergens, B. bigemina Hematíes Nueva York, Martha's Vineyard, Nantucket Picaduras de garrapatas

B. equi, B. microti, B. duncani: (varias especies tienen distribución cosmopolita)

Balantidiasis: Balantidium coli Mucosa intestinal

Blastocistosis: Blastocystis intestinal 2 a 20% de la población Ingesta de alimentos contaminados por heces de un ser humano o un animal infectados

Coccidiosis: Cryptosporidium Intestinos Generalizada

Dientamebiasis: Dientamoeba fragilis Intestinos Hasta el 10% en países industrializados Ingesta de agua o de alimentos contaminados con heces

Amebiasis: Entamoeba histolytica Intestinos Zonas insalubres, alta densidad de población y regiones tropicales Transmisión orofecal

Giardiasis: Giardia lamblia Luz del intestino delgado Generalizada Ingesta de quistes quiescentes en agua o alimentos contaminados por heces

Isosporiasis: Isospora belli Células epiteliales del intestino delgado Cosmopolita – menos común que Toxoplasma o Cryptosporidium Vía orofecal

Leishmaniasis: Leishmania Cutánea, mucocutánea o visceral Leishmaniasis visceral -Cosmopolita; Leishmaniasis cutánea – Viejo Mundo; Leishmaniasis mucocutánea – Nuevo Mundo Picaduras de varias especies nocturnas de mosquitos Phlebotomus

Meningoencefalitis amebiana primaria: Naegleria fowleri Encéfalo Rara pero mortal Aspiración por la nariz de agua dulce templada contaminada, piscinas con aguas no cloradas, aguas termales, suelo

Paludismo: Plasmodium falciparum (80% de los casos), P. vivax, P. ovale, P. malariae Hematíes Tropical -250 millones de casos al año Picaduras del mosquito Anopheles por la noche

(continuación)

Protozoos

Rinosporidiosis: Rhinosporidium seeberi Nariz, rinofaringe India y Sri Lanka La mucosa nasal entra en contacto con material infectado durante el baño en balsas o charcas comunitarias

Toxoplasmosis – Neumonía parasitaria: Toxoplasma gondii Ojos, encéfalo, corazón, hígado Generalizada – hasta un tercio de la humanidad Ingesta de carne cruda o poco cocinada de cerdo/cordero/cabra infestada por bradizoítos de Toxoplasma, ingesta de leche cruda infestada por taquizoítos de Toxoplasma, ingesta de agua, alimentos o suelo infestados por ooquistes presentes en heces de gato de más de un día

Tricomoniasis: Trichomonas vaginalis Vías urogenitales femeninas (asintomática en varones) 7,4 millones de estadounidenses Infección de transmisión sexual (ITS)

Tripanosomiasis africana o enfermedad del sueño: Trypanosoma brucei Sangre, linfa y sistema nervioso central 50.000 a 70.000 personas Mosca tsetsé (Glossina), picaduras nocturnas

Tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas: Trypanosoma cruzi Colon, esófago, corazón, nervios, músculos y sangre México, Centroamérica y Sudamérica – 16 a 18 millones Chinches triatominos de la familia Reduviidae, picaduras nocturnas

Helmintos (vermes parásitos)

Nombre vulgar del organismo o la enfermedad: Nombre científico Partes del cuerpo afectadas Prevalencia Transmisión/Vector

Anquilostomiasiso uncinariasis: Ancylostoma duodenale, Necator americanus Pulmones, intestino delgado, sangre Frecuente en climas tropicales, cálidos y húmedos Penetración cutánea de la larva L3

Anisakiasis: Anisakis Reacción alérgica Hospedador accidental Ingesta de pescado, calamar, sepia o pulpo crudos

Ascariasis – Neumonía parasitaria: Ascaris sp. Ascaris lumbricoides Intestinos, hígados, apéndice, páncreas, pulmones, síndrome de Löffler Común en regiones tropicales y subtropicales

(continuación)

Protozoos

Baylisascarosis: Baylisascaris procyonis, B. melis, B. transfuga, B. columnaris, B. devosi, B. laevis Depende de la especie: ingesta de material contaminado con heces de mapache, tejón, oso, nutria o marta

Brugia malayi, B. timori: Ganglios linfáticos Regiones tropicales de Asia Artrópodos

Tenia -Infestación por tenias: Cestodos Intestino Rara

Clonorquiasis (Distomatosis hepática): Clonorchis sinensis, C. viverrini

Dicrocoelium dendriticum: Vesícula biliar Rara Ingesta de hormigas

Dioctofimosis: Dioctophyma renale Riñones (normalmente el derecho) Cosmopolita Ingesta de pescado de agua dulce crudo o semicrudo

Difilobotriosis -Cestodo: Diphyllobothrium latum Intestino, sangre Europa, Japón, Uganda, Perú, Chile Ingesta de pescado de agua dulce crudo

Dracunculosis – Filaria de Medina: Dracunculus medinensis Tejidos subcutáneos, músculo Sudán

Equinococosis-Cestodo: Echinococcus granulosus, E. multilo-cularis, E. vogeli, E. oligarthrus Hígado, pulmones, riñón, bazo Cuenca mediterránea Como hospedador intermedio, ingesta de material contaminado por heces de un carnívoro; como hospedador definitivo, ingesta de carne cruda (despojos) de un herbívoro

Echinostoma echinatum: Intestino delgado Oriente Lejano Ingesta de carne cruda de pescado, moluscos y caracoles

Enterobiosis u oxiurosis -Oxiuro: Enterobius vermicularis, E. gregorii Intestino, ano Generalizada; regiones templadas

Fasciolosis; Duela hepática: Fasciola hepatica, F. gigantica Hígado, vesícula biliar Fasciola hepatica en Europa, África, Australia, América y Oceanía; Fasciola gigantica solo en África y Asia, 2,4 millones de personas infectadas por ambas especies Caracoles de agua dulce

(continuación)

Protozoos

Fasciolopsiosis – Duela intestinal: Fasciolopsis buski Intestino Asia oriental – 10 millones de personas Ingesta de agua o de plantas acuáticas infestadas (hospedador intermediario: caracoles anfibios)

Gnatostomiosis: Gnathostoma spinigerum, G. hispidum Tejidos subcutáneos (bajo la piel) Rara – Sudeste asiático Ingesta de carne cruda o poco cocinada (p. ej., pescado de agua dulce, pollo, caracoles, ranas, cerdo) o de agua contaminadas

Himenolepiosis: Hymenolepis nana, H. diminuta Ingesta de material contaminado por gorgojos de la harina, larvas de tenebrios, cucarachas

Loiasis (filariosis por Loa o edema de Calabar): Filaria Loa Tejido conectivo, pulmones, ojo Selva tropical deÁfrica occidental – 12 o 13 millones de personas Dípteros Tabanidae – Picaduras de tábanos durante el día

Mansonelosis, Filariosis: Mansonella streptocerca Capa subcutánea de la piel Insectos

Metagonimosis – duela intestinal: Metagonimus yokogawai Siberia, Manchuria, Balcanes, Israel, España Ingesta de pescado semicrudo o en salazón

Ceguera o filariosis de los ríos: Onchocerca volvulus, oncocercosis Piel, ojos, tejidos África, Yemen, Centroamérica y Sudamérica en las cercanías de ríos de aguas rápidas y frías Moscas negras (Simúlidos), picadura durante el día

Distomatosis hepática (duela hepática china): Opisthorchis viverrini, O. felineus Clonorchis sinensis Vías biliares Rusia; 1,5 millones de personas Ingesta de pescado infectado crudo, poco salado o mal congelado

Paragonimosis, duela pulmonar: Paragonimus westermani, P. africanus, P. caliensis, P. kellicotti, P. skrjabini, P. uterobilateralis Pulmones Asia oriental Ingesta de cangrejos de agua dulce u otros crustáceos crudos o semicrudos

Esquistosomiosis o bilharziosis (todas sus formas): Schistosoma spp. África, Antillas, este de Sudamérica, Asia oriental, Oriente Próximo – 200 millones de personas Contacto de la piel con agua contaminada que alberga caracoles dulceacuícolas infestados

(continuación)

Protozoos

Esquistosomiosis o bilharziosis intestinal: Schistosoma mansoni Intestino, hígado, bazo, pulmones, piel África, Antillas, Sudamérica, Asia, Oriente Próximo – 83 millones de personas Contacto de la piel con agua contaminada que alberga caracoles dulceacuícolas infestados del género Biomphalaria

Esquistosomiosis o bilharziosis urinaria: Schistosoma haematobium Riñón, vejiga urinaria, uréteres, pulmones, piel África, Oriente Próximo Contacto de la piel con agua contaminada que alberga caracoles infestados del género Bulinus

Esquistosomiosis o bilharziosis por Schistosoma japonicum: Schistosoma japonicum Intestino, hígado, bazo, pulmones, piel China, Asia oriental, Filipinas Contacto de la piel con agua contaminada que alberga caracoles infestados del género Oncomelania

Esquistosomiosis o bilharziosis intestinal asiática: Schistosoma mekongi Sudeste asiático Contacto de la piel con agua contaminada que alberga caracoles dulceacuícolas infestados de la especie Neotricula aperta

Esparganosis: Spirometra erinacei-europaei Ingesta de material contaminado con heces de perros o gatos infestados (ser humano: hospedador terminal)

Estrongiloidosis – Neumonía parasitaria: Strongyloides stercoralis Intestino, pulmones, piel (larva currens) Penetración cutánea

Tenia bovina: Taenia saginata Intestino Cosmopolita Ingesta de carne bovina poco cocinada

Tenia del cerdo: Taenia solium Ingesta de carne porcina poco cocinada

Toxocariosis: Toxocara canis, T. cati Hígado, encéfalo, ojos (Toxocara canis -larva migrans visceral, larva migrans ocular) Cosmopolita Pica, alimentos no lavados y contaminados con huevos de Toxocara, hígados semicrudos de pollo

Triquinosis: Trichinella spiralis, T. britovi, T. nelsoni, T. nativa Músculo, región periorbital, intestino delgado Más común en países en vías de desarrollo debido a la mejora de la higiene alimentaria en los países desarrollados Ingesta de carne porcina poco cocinada

(continuación)

Protozoos

Prurito del nadador: Trichobilharzia regenti y otros esquistosomas (Schistosomatidae) Contacto de la piel con agua contaminada (caracoles y vertebrados)

Tricocéfalo: Trichuris trichiura, T. vulpis Intestino grueso, ano Cosmopolita Ingesta accidental de huevos en alimentos secos como judías, arroz y diversos cereales o de suelo contaminado con heces humanas

Elefantiasis, filariosis linfática: Wuchereria bancrofti Sistema linfático Tropical y subtropical Mosquito, picaduras nocturnas

Otros parásitos

Nombre vulgar del organismo o la enfermedad: Nombre científico (ordenado) Partes del cuerpo afectadas Prevalencia Transmisión/Vector

Verme parásito: Arqueoacantocéfalos (Archiacanthocephala)

Síndrome de Halzoun o Marrara: Linguatula serrata Rinofaringe Oriente Próximo Ingesta de ganglios linfáticos crudos o semicrudos (p.ej., carne de camellos y búfalos infestados)

Miasis: Oestroidea, Calliphoridae, Sarcophagida Tejido necrosado o vivo

Rezno o tórsalo: Dermatobia hominis Tejido subcutáneo Centroamérica y Sudamérica Mosquitos y otros dípteros picadores

Candirú (pez): Trichomycteridae Uretra Cuenca del Amazonas Orinar en aguas pobladas por el pez sin protección adecuada

Algunos ejemplos de enfermedades autoinmunitarias (incluidas enfermedades que no han sido declaradas oficialmente como tales) son: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn (uno de los dos tipos de la enfermedad inflamatoria intestinal idiopática, «EII»), dermatomiositis, diabetes 5 mellitus de tipo 1, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (SGB), enfermedad de Hashimoto, hidrosadenitis supurativa, enfermedad de Kawasaki, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, cistitis intersticial, lupus eritematoso, enfermedad mixta del tejido conectivo, morfea, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, psoriasis, artritis psoriásica, polimiositis, cirrosis biliar primaria, policondritis recidivante, artritis reumatoide, esquizofrenia, esclerodermia,

10 síndrome de Sjögren, síndrome de la persona rígida, arteritis de la temporal (también llamada «arteritis de células gigantes»), colitis ulcerosa (uno de los dos tipos de la enfermedad inflamatoria intestinal idiopática, «EII»), vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

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las señales medidas proceden de los péptidos constitutivos y la pequeña fracción de péptidos sobrepresentados no influye sustancialmente en la tendencia central de los datos. En el primer paso de normalización las réplicas de la misma muestra se normalizan calculando la presentación media de cada péptido en la respectiva serie de muestras replicadas. Esta media se usa para calcular los factores de normalización correspondientes a cada péptido y a cada serie de análisis por CL-EM. El promediado de todos los péptidos da como resultado factores de normalización para cada serie de análisis repetidos de muestras que se aplican a todos los péptidos que conforman una serie de análisis por CL-EM concreta. Este método asegura la eliminación de la variación sistemática intra-muestra, como, por ejemplo, la generada por distintos volúmenes de inyección entre los análisis repetidos de una muestra.

Solo los péptidos que presentan un coeficiente de variación inferior a 25% entre sus áreas replicadas son aptos para el siguiente paso de normalización. De nuevo se calcula la presentación media de cada péptido, esta vez para todas las muestras de un anticuerpo concreto de la preparación (p. ej., el BB7.2). Esta media se usa para calcular los factores de normalización para cada péptido y cada muestra. El promediado de todos los péptidos da como resultado factores de normalización aplicables a cada muestra que se aplican a todos los péptidos de la muestra en concreto. De ese modo se elimina el sesgo sistemático provocado por los distintos pesos del tejido de muestra o los diferentes niveles de expresión de MHC en su seno.

Para extraer los péptidos sobrepresentados se calcula un perfil de presentación para cada péptido que muestra la presentación media de la muestra, así como la variación en los replicados analizados de la misma. El perfil superpone muestras de la entidad tumoral de interés con muestras de tejido normal de referencia. Cada uno de esos perfiles se consolidó en una puntuación de sobrepresentación calculando el valor p de un modelo lineal de efectos mixtos (GNU R) ajustando para el análisis múltiple con la tasa de falsos descubrimientos (False Discovery Rate). Con la ordenación de todos los péptidos en función de sus valores p se obtienen los candidatos que son más prometedores para la vacuna desde el punto de vista de la presentación.

Cuantificación de la beta2m-microglobulina

La beta-2-microglobulina (b2m) se cuantificó por electroinmunotransferencia (Western blotting), empleando la betaactina como proteína de referencia para normalizar las cantidades de proteína cargadas en los geles.

Resultados

Desarrollo de la cuantificación de los TUMAP con estirpes celulares

Para establecer el proceso de cuantificación se han aplicado diferentes métodos. En primer lugar, se llevó a cabo un experimento de dilución con la estirpe celular JY en sendas diluciones del 2% y el 20% para simular la variación de la muestra. De cada muestra diluida se tomaron tres duplicados. Una vez normalizada la variación dentro de cada serie de análisis y dentro de cada muestra, el factor de normalización entre las dos muestras ascendió a 9,95.

En un segundo experimento a otra muestra de JY se le añadió una mezcla de proteínas (fosforilasa b, seroalbúmina bovina, hemoglobina bovina, enolasa y ADH) MassPREP™ (Waters) digerida con tripsina, en diluciones de 100, 10 y 1 fmol. De nuevo, se hicieron tres duplicados de cada concentración. Efectuado el análisis de los datos, la razón media entre los péptidos añadidos conocidos ascendió a 90 cuando se comparó la muestra de 1 fmol con la de 100 fmol, de 8 al comparar la muestra de 100 con la de 10 fmol y de 11 en la comparación de la de 10 con la de 1 fmol.

Asimismo, comparamos distintos métodos de adquisición a fin de maximizar el número y la exactitud de las identificaciones de los péptidos, así como la precisión cuantitativa de nuestro ajuste. Con ese propósito, examinanos unas 50 réplicas de una muestra de JY con distintos modos de EM/EM.

Tumor primario y tejidos normales

A continuación, se muestran ejemplos de TUMAP cuantificados en términos relativos.

Ejemplo 1:

Perfil de presentación correspondiente a un péptido de HLA de clase I de PTPRZ1 (tirosina fosfatasa, de tipo receptor, polipéptido Z 1) que forma parte de un cóctel vacunal contra el glioblastoma. En rojo se muestran las muestras tumorales con respecto a las muestras de tejido normal procedentes de diversos órganos. Cada barra representa la mediana del área normalizada de la muestra correspondiente a ese péptido, mientras que las barras de error muestran el área mínima y máxima de las réplicas a modo de indicadores de la variación de la medición.

Ejemplo 2: CDC2-001

Para el perfil de presentación del TUMAP asociado al cáncer gástrico que es codificado por el gen CDK1, véase la Figura 5.

Ejemplo 3: ASPM-002

Para el perfil de presentación del TUMAP asociado al cáncer gástrico que es codificado por el gen ASPM, véase la

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Figura 6.

Expresión de proteínas del MHC en distintas entidades tisulares

Los inventores analizaron la expresión de las moléculas del MHC en diferentes entidades tisulares para conocer detalles sobre el intervalo de niveles de expresión del MHC utilizando la beta-2-microglobulina como compuesto representativo del complejo ternario formado por la cadena alfa de la molécula del MHC, la beta-2-microglobulina y el péptido (véase la Figura 7).

La expresión relativa del MHC (b2m/beta-actina) únicamente varía en un factor de 5 en torno al valor mediano de la b2m/beta-actina = 0,52, por lo que permanece relativamente constante en las diferentes entidades tisulares. Dicho intervalo es lo bastante estrecho para posibilitar la normalización a partir de los datos suministrados por la espectrometría de masas.

Normalización de las cantidades del MHC basadas en la espectrometría de masas en comparación con la electroinmunotransferencia (Western blotting, WB).

Tabla 2: Comparación de la normalización del MHC efectuada con WB con la basada en la EM

TC001T RCC2216N RCC2216T RCC2223N RCC2223T

Factor de normalización: 0,07 2,03 2,58 1,00 0,17

relativo, WB

Factor de normalización relativo, EM: 0,05 2,53 1,11 1,00

Peso del tejido [g] 3,56 0,29 0,89 0,65 1,54 ID para la normalización por

119 540 47 908 877EM

En suma, la normalización por EM y por WB resultan muy comparables; la variación entre ambos métodos de normalización apenas ronda un factor de 2. La exactitud del factor de normalización por EM mejora si en su cálculo se incluye un mayor número de identificaciones. Así pues, la normalización mediante la EM supone un método fiable para compensar las diversas cantidades de moléculas del MHC que se obtienen a partir de las inmunoprecipitaciones del tejido primario.

Garantía de calidad

Con el fin de comprobar de modo continuo el rendimiento de la cuantificación, escogimos e introdujimos siete péptidos sintéticos no humanos como control de calidad del tiempo de retención y del área de la señal.

Puesto que cada muestra es analizada por quintuplicado con cinco réplicas, a la cuantificación del péptido le acompaña una estimación de la variación para detectar problemas de medición.

Simultáneamente, hemos establecido un procedimiento manual de control de calidad que asegura la uniformidad y la corrección de los datos correspondientes a los péptidos que pasan a la fase de validación.

A continuación, se expone un ejemplo de la determinación de la inmunogenicidad de los péptidos y de su perfil de expresión.

Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos dados a conocer

No todos los péptidos identificados como presentes en la superficie de las células tumorales a través de las moléculas de MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayoría de ellos proceden de proteínas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de células. Muy pocos de esos péptidos están asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrirlos y de minimizar el riesgo de que la vacuna genere autoinmunidad los inventores se centraron en los péptidos derivados de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.

El péptido ideal sería el derivado de una proteína que sea exclusiva del tumor y no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos procedentes de genes dotados con un perfil de expresión similar al ideal, los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y después a los genes originarios, y se generaron los perfiles de expresión de dichos genes.

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lecturas se llevaron a cabo del modo descrito por otros (Walter et al., 4974-78) con pequeñas modificaciones. En suma, se sintetizaron moléculas recombinantes HLA-A*2402 cargadas con el péptido y biotiniladas desprovistas del dominio transmembrana y biotiniladas en el extremo carboxi de la cadena pesada. El anticuerpo coestimulador purificado Ab 9.3 (Jung Ledbetter, and Muller-Eberhard 4611-15), una IgG2a de ratón anti-CD28 humano se biotiniló químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas utilizadas consistían en partículas grandes de poliestireno de 5,6 µm recubiertas de estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE. UU.). Los complejos pMHC usados como controles fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV (SEQ ID N.º 26) de Melan-A modificado/MART-1) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI (SEQ ID N.º 27) de DDX5), respectivamente.

Se tapizaron placas de 96 pocillos con 800.000 microperlas/200 µl en presencia de 600 ng de anti-CD28 biotinilado más 200 ng de pMHC-biotinilado relevante (microperlas de alta densidad). Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocillos en las que se incubaron simultáneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas recubiertas y lavadas en 200 µl de TCM suplementado con IL-12 5 ng/ml (PromoCell) durante 3 o 4 días a 37 °C. La mitad del medio se renovó con TCM fresco suplementado con IL-2 80 U/ml y la incubación continuó otros 3 o 4 días a 37 °C. Este ciclo de estimulación se efectuó en total tres veces. Por último, los análisis de los multímeros se llevaron a cabo tiñendo las células con el colorante Live/dead-Aqua® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), con anticuerpo anti-CD8-FITC clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) y multímeros MHC A*2402 acoplados con PE o APC. Para el análisis se equipó un citómetro BD LSRII SORP con los filtros y láseres adecuados. Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluación del análisis multimérico se efectuó con el software FlowJo (Tree Star, Oregón, EE. UU.). La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8+ multímero+ específicos se detectó aplicando el acotamiento de subpoblaciones (gating) adecuado y comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antígeno dado quedaba confirmada si al menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contenía una estirpe de linfocitos T CD8+ específica después de la estimulación in vitro (esto es, el pocillo contenía al menos un 1% de multímero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células multímero+ específicas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones del control negativo).

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos

En el caso de los péptidos de HLA de clase I analizados, se puede demostrar la inmunogenicidad in vitro de los 25 péptidos con la generación de estirpes de linfocitos T específicos de tales péptidos. En la Figura 3 se muestran a modo de ejemplo los resultados de la citometría de flujo de dos péptidos de la invención tras la tinción de multímeros específicos de TUMAP junto con la del control negativo correspondiente. Los resultados de los 25 péptidos dados a conocer se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Inmunogenicidad in vitro de los péptidos HLA de clase I dados a conocer

Los resultados de los experimentos de inmunogenicidad in vitro llevados a cabo por los inventores presentan el porcentaje de donantes y de pocillos que dieron positivo entre los evaluables. Como mínimo resultaron evaluables dos donantes y 24 pocillos de cada péptido.

SEQ ID N.º: Antígeno Secuencia Donantes positivos / donantes analizados [%] Pocillos positivos / pocillos analizados [%]

1: CDC2-001 FYQIFQGIVF 88 28

2: ASPM-002 SYNPLWLRI 63 31

3: MMP3-001 VFIFKGNQF 13 1

4: MET-006 SYIDVFPEF 63 22

5: UCHL5-001 NYEPFIMEE 75 14

6: MST1R-001 NYFFYVSNF 50 14

7: KIF2C-001 IYNGKEFDEE 13 2

8: SMC4-001 HYKPTPFYF 75 9

9: PROM 1-001 VWSD VTPFTF 83 26

10: MMP11-001 NYFFYVSNF 33 11

11: NFYB-001 VYTTSYQQI 50 7

Claims

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