SU1712410A1

SU1712410A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к антигену @ -клеток поджелудочной железы с мол.м. 64 КД

Info

Publication number: SU1712410A1
Application number: SU884395435A
Authority: SU
Inventors: Елена Николаевна Злобина
Original assignee: Институт Иммунологии Минздрава Ссср
Priority date: 1988-02-03
Filing date: 1988-02-03
Publication date: 1992-02-15
Also published as: FI894652A0; FI894652A; DK483489A; DK483489D0; WO1989007134A1; EP0382848A1; JPH02503513A; EP0382848A4

Abstract

Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть использовано вмедицине дл изучени патогенеза инсу- линзависимого сахарного диабета и иммунодиагностики. Цель изобретени - повышение специфичности моноклонально- го антитела. Полученный штамм гибридрмы C10G7 депонирован под номером ВСКК (П) Ns 251D. Штамм продуцирует моноклональ- ное антитело изотипа УдС 2, при этом продукци антител сохран етс в течение 30 пассажей в культуре и 20 пассажей In vtvo. Антитело обладает специфичностью к антй- гену /8-клето1$. поджелудочной железы с мол.м. 64 КД. С антителом св зываетс 76±6,1% "культивируемы)? островковых клеток..

Description

Изобретение относитс к гибридной технологий и может быть использовано в медицине дл изучени патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета и иммунодиагностики .

Цель изобретени - повышение специфичности моноклонального антитела.

Штамм получают следующим образом.

; ..

Мышей линии BALB/C иммунизируют вНутрибрюшйнно 2-10 островковых клеток , полученных при переваривании коллагеназой-трипсином поджелудочных желез новорожденных крас т Вистар. Через 24 дн иммунизацию повтор ют аналогичным способом , а через 14 дней ввод т те же клетки внутривенно. Спуст еще 4 дн клетки селезенки иммунных мышей сливают с клетками мышиной миеломы РЗ-Х6Х-Ад8.653 с помощью 50%-ного полиэтиленгликол с

мол.м. 1500. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5:1. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные пластинки по 10 клеток на лунку, в которую предварительно были высе ны перитониальные макрофаги мыши BALB/C по 10 клеток на лунку. Селекцию гибридомы ведут в минимальной среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 10 М гипоксантиг5

v7

на, 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М тимидина. Гибридому дважды клонируют из расчета 1 1слетки на лунку. Дол клонов, сохран вших продукцию антител заданной специфичности, не ниже 90% при обоих клонировани х .

Штамму дано условное название C10G7, депонирован под номером ВСКК(П) Nfe 251D и характеризуетс следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда дл культивировани - минимальна среда Игла, модифицированна Дульбекко, содержаща 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 2тМ L-глютамина, 100 ед/мл гентамицина и 5 10 М 2-меркаптоэтанола . Оптимальна концентраци клеток при культивировании 510 клеток/мл. Посевна доза 10 клеток в мл. Врем субкультивировани 3-4 дн . Гибридома хорошо живет и размножаетс в стандартных услови х дл культивировани исходной миеломы . Клетки выдерживают семидневное культивирование без смены питательной среды при исходном засеве 50-10 клеток/мл с постепенным снижением жизнеспособности до 20-30% после периода максимального нарастани . Врем удвоени культуры, определенное путем пр мого подсчета количества клеток в 1 мл суспензии , мен етс от 24 до 78 ч в зависимости от условий культивировани .

Культивирование In vivo,

При пассировании гибридомы на мышах BALB/сдоза клеток при прививкебЮ клеток. .Врем образовани ацита 8-12 дней. Гибридома сохран ет продукцию антител в течение 30 пассажей в культуре и 20 пассажей на мышах BALB/c, обработанных пристаном за 10 дней до введени гибридомы ...

Морфологи клеток штамма C10G7.

Клетки однородны по размерам, округлой формы. Большинство клеток имеет округлое дро. Ядра крупные, располагаютс преимущественно h центре клеток или несколько смещены к периферии. Ядра занимают большую часть объема клеток. Цитоплазма узким ободком располагаетс вокруг дра. При окраске по РомановскомуГимза дро имеет красновато-фиолетовую окраску цитоплазма - голубую окраску. Включений в цитоплазме не наблюдаетс .

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела (монАТ), продуцируемые штаммом C10G7, специфически реагируют с антигеном/ клеток поджелудочно железы с мол.м. 64 КД; монАТ не реагируют с клетками крови, тимоцитами , спленоцитами, клетками щитовидной и слюнной железы, ацйнарной тканью поджелудочной железы, клетками печени. Изотип антитела - YgG2b.

Контаминаци . Контаминации бактери ми , грибками и микоплазмами не обнаружено .

Консерваци клеток.

Гибридому криоконсервируют в | ультуральной среде, содержащей 50% эмбриональной тел чьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида . Режим замораживани : 1 градус в мин, до -70°С, далее клетки перенос т в жидкий азот. Размораживают гибридому при переносе ампулы с клетками из жидкого азота в вод ную баню при 37°С.

Жизнеспособность клеток после хранени в жидком азоте около года не ниже 70%, суд по включению красител зозина и трипанового синего.

Использование штамма иллюстрируетс следующими примерами.

П р и м е р 1. Гибридому высевают при плотности 510 клеток/мл в пластиковый флакон с минимальной средой Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 2тМЬ-г ютамина, 100 ед/мл гентамицина и 5-10 М 2-меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3-4 дн при в атмосфере с 5% С02. Далее культуральную жидкость собирают , центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин, а супернатант используют в качестве источника антител.

Поджелудочные железы 40 новорожденных крыс т Вистар обрабатывают коллагеназой-трипсином, затем трипсином-ЭДТА-ДНКазой . Клетки помещают в среду Игла в модификации Дульбекко с 10% тел чьей сыворотки эмбриональной и культивируют при 37°С 24 ч в атмосфере с 5% СОа на пластиковых чашках Петри. Затем клетки снимают с чашек Петри и отмывают буфером без кальци и магни . Клетки подсчитывают в камере Гор ева. 10 клеток инкубируют 30 мин при 37°G в среде, из которой затем берут пробу на продукцию инсулина. Уровень базальной секреции инсулина на 10 островковых клеток составит 560±65 мкг/мл. После контрол на активность , 0,510 островковых клеток инкубируют 30 мин при 4°С в 50 мкл раствора монАТ. Клетки 2 раза отмывают, центрцфугиру при 1000 об/мин 10 и суспендируют в 50 мкл кроличьих антимышиных антител, конъюгированных с изотиоцианатом флуоресцеина. Через 30 мин инкубации при А°С клетки отмывают, суспендир|уют в 100 мкл 1% параформальдегида. Флуоресценцию регистрируют с помощью проточного цитометра. Долю свет щихс клеток определ ют при просчёте 20000 островковых клеток.

При 30 кратном скриннинге на культивируемых островковых клетках обнаружено; св зывание 7б±6,1 % клеток с монАТ, продуцируемого гибридомой ciOG7.

Claims

П р и м е р 2. Фрагмент поджелудочной железы 0,5x0,5 см замораживают в жидком азоте. Затем перенос т в охлажденную камеру криостата при 20°С и изготавливают криосрезы толщиной 6-8 мкм. Каждый срез нанос т на стекло с 50 у поли-1-лизина и фиксируют в течение 1 с нагреванием до 36°С. Срезы фиксируют в безводном ацетоне 7-10 мин. Зате|уг перенос т в раствор Трис-NaCI и инкубируют 5 мин. Срезы перенос т во влажную камеру, нанос т по 50 мкл супернатанта гибридом C10G7 и инкубируют 60 мин при комнатной температуре . Затем трижды отмывают по 5 мин погружением в сосуд с Трис-NaCI. После этого на срезы нанос т по 50 мкл кроличьих антимышиных антител, конъюгйрованных с пероксидазой, и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. Повтор ют отмывку указанным способом. Провод т под контролем зрени докраскудиаминобензидином . Продукт иммунопероксидазного окрашивани островковых клеток с монАТ учитывают на световом микроскопе. При 20 кратном скриннинге на. срезах поджелудочной железы обнаружено окрашивание кЛеток, наход щихс в зоне расположени / -клето к. П р и м е р 3. Срезы поджелудочной железы получают как описано в примере 2. Срезы обрабатывают монАТ к инсулину, и монАТ, полученными из штамма C10G7. Далее срезы отмывают, обрабатывают кроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой, и регистрируют окрашивание/б-клетрк так же, как в примере
2. В результате проведенных опытов показано , что монАТ, продуцируемое гибридомой C10G7, специфически реагируют с мембранным антигеном с мол.м. 64 КД островксвых клеток поджелудочной железы крысы и человека. Дл вы снени природы островковь1х клеток, несущих антиген с мол.м. 64 КД проведено сопоставление окрашивани клеток мои AT к инсулину. В. результате показано, что MOHAJ к инсулину и монАТ к антигену реагируют с одними и теми же клетками островков Лан-герганса: монАТ к антигену с поверхностью, а мЬнАТ к инсулину - с цитоплазмой уЗ клеток. Антиген, вы вл емый антителом, секретируемым штаммом G10G7, обнаруживаетс только на инсулинпродуцирующих клетках поджелудочной железы как человека, так и крысы. Данный антиген имеет мол.м. 64 КД. Известно, что в сыворотке больных сахарным диабетом I типа присутствуют антителак этому антигену и антиген вл етс органоспецкфическим и патогенетическим маркером этого заболевани . Таким образом, штамм секретирует моноклональное антитело, вы вл ющее антиген с мол.м. 64 КД, имеющий решающее значение в развитии аутоиммунного компонента при заболевании инсулинЗависимым сахарным диабетом, с помощью продуцируемого штаммом монАТ удаетс выделить антиген, сферический дл инсулинпродуцирующих клеток поджелудочной железы, и тем самым в дальнейшем проводить иммунодиагностику сахарного диабета I типа. Формула изобретение Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus ВСКК(П) № 251D - продуцент моноклонального антитела к антигену клеток поджелудочйой 1 елезы с мол.м. 64 КД.