SU1433979A1

SU1433979A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к кератину N17 человека

Info

Publication number: SU1433979A1
Application number: SU874253164A
Authority: SU
Inventors: Сергей Маркович Трояновский; Владимир Андреевич КРУТОВСКИХ; Вита Иделевна Гельштейн; Тамара Адольфовна Чипышева; Григорий Андреевич Банников
Original assignee: Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1987-03-31
Publication date: 1988-10-30

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл изучени механизмов цитодиффереНци- ровки в норме и паталогии. Целью изобретени вл етс получение штамма гибридных культивируемых клеток жи- вотних MUS musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к кератину № 17 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии BALB/C, иммунизированных фракцией промежуточных филаментов, с клетками миеломы X 63-Ag 8.653. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% эмбриональной тел чьей сыворотки. Секреци МКА на 5-й день культивировани составл ет 5-10 мкг/мл. МКА относ тс к классу IgG2b(H). В реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток HeLa и срезов органов человека МКА реагируют одной полосой с кератином м.м. 46 КД(№ 17). ф (Л

Description

00 00

со

Изобретение относитс к биотехно- логин и может бытьь использовано дл изучени механизмов цитодифференци- ровки в норме и патологии.

Цель изобретени - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирую- ,щего моноклональные антитела (МКА) к кератину № 17 человека,

Штамм получают следующим образом.

Фракцию промежуточных филаментов вьщел ют из толстой кишки крыс путем последовательной экстракции буфером низкой ионной силы (140 ral i NaCl) и буфером высокой ионной, силы (1,5 М КС1) в присутствии 1%-ного тритона Х100. Мьшей BALB/C иммунизируют общей дозой антигена 0,5 мг на мышь, Перва инъекци : внутрибрюшинно смес равных (по 0,2 мл) объемов антигена адъюванта Фрейнда. Последующие п ть внутрибрюшинных инъекций провод т с рнтервалом в 10 дней с неполным адъI ювантом. Последнюю внутривенную инъ- екцию провод т за 4 суток до гибри- дизации. Далее 10 клеток селезенки ; иммунных мышей гибридизуют с 4x10 клеток миеломы X 63 - Ag 8.653 с по- мощью 45%-ного раствора полиэтилен- j гликол с м.м. 1000, Культивирование I гибридных клеток провод т в 96-луноч I ных платах на питательном слое пери- 1 тонеальных макрофагов мьшей (10 гиб : ридных клеток на 10 макрофагов, вы- i се нных накануне). Питательна среда i ДМЕМ с 10% эмбриональной тел чьей сы ; воротки, 10% лошадиной сыворотки, пируват (1мМ), 10 М гипоксантина, i 4 10 М аминоптерина и 1,6 10 М ; тимидина. Гибридомы клонируют 4 раза высева по 1 клетке на лунку, содержащую 10 макрофагов. Отбор клонов осуществл ют по иммунофлуоресцентно- му окрашиванию культуры клеток крыси ной гепатомы 27. Супернатант одного из 800 положительных кланов реагирует в реакции иммуноблоттинга с кератином № 17 человека.

Полученный штамм гибридных клеток обозначают ЕЗ. Штамм хранитс в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером 135D и характеризуетс следующи- ми признаками.

Культуральные признаки. Среда культивировани - среда Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ) с

Q

15 0 з5 : 40 , 45 „ 55

792

20% эмбриональной тел чьей сьпифотки (или 10% эмбриональной тел чье й сыворотки и 10% лошадиной сыворотки), 1 мМ глубамина, 100 ед. гентамицина в 1 мл.

Дл выращивани штамма используют стекл нную или пластиковую посуду. Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды засевают 2-5 х 10 клеток. Пассаж - 1 раз в 4-5 дней той же дозой клеток. Без подсчета клеток - 1:3. Клетки культивируют при З7 с в атмосфере 5%. СО. Культивирование гибридом возможно в мышах линии BALB/c.

Продуктивность штамма.

Секреци МКА на п тый день культи- дзировани составл ет 5-10 мкг/мл. Стабильна секреци продукта сохран етс до 30 пассажей в культуре.

Кариологические признаки.

Модальное число хромосом - 51.

Характеристика полезного продукта.

МКА относ тс к классу IgG 2b(H).

В реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток HeLa и срезов органов человека МКА реагируют одной полосой с кератином м.м. 46KD (№ 17).

Контаминаци .

бактерии и грибы в.культуре при длительном наблюдении и посевах на питательные среды не обнаружены.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной тел чьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида в концентрации 1-3x10 клеток в 1 мл, разливают в стерильные пластиковые ампулы при 4 и замораживают в жидком азоте по программе со снижением температуры на 1 С в минуту с последующим переносом в жидкий азот., Размораживание: 1 мин при 37°С.Клетки развод т в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре 5 мин при 1000 об/ /мин, сливают среду, заливают 10 мл свежей среды и перенос т в лунки 24- луночной пластины с макрофагами. Жизнеспособность клеток по включению три- панового синего составл ет 50-90%.

Пример. Использование штамма ЕЗ t

Кусочек ткани молочной железы, удаленной при биопсии не позже 1 ч после операции, заливают в 7%-ный раствор , желатины на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и замораживают в жидком, азоте. Срезы толщиной

1

5 мкм. готовл ют на криотомо. и фиксируют 4 мин в А%-ном растворе формалина на ЗФР. После отмывани в трех сменах ЗФР став т реакцию непр мой иммунофлуоресценции при комнатной температуре. Перва инкубаци - куль- туральна надосадочна жидкость гибридных клеток ЕЗ (30 мин), втора инкубаци - кроличь антисыворотка про- тив гамма-глобулинов мыши, меченна флуоресценизоцианатом в разведении 1:20 (30 мин). Инкубации перемежаютс отмыванием в ЗФР. Перед заключением в глицерин (1: 1 на ЗФР) - окраска гематоксилином 10 с. Контроль - пер- ва инкубаци ЗФР,

Препарат исследуют в микроскопе с флуоресцентной насадкой. В резуль- тате обнаруживают свечение базально расположенных миоэпителиальных клеток междолькового протока молочной железы человека, что свидетельствует о содержании в этих клетках кератина № 17. Клетки, выстилающие просвет протока , не окрашены и, следовательно, не содержат кератин № 17.

Дальнейшие исследовани показывают , что в иммуноморфологических ре-

79.

акци х непр мой иммуиофлуоресцешиш МКЛ избирательно реагируют с белками промежуточных филаментов (кератинов) культивируемых клеток человека линии HeLa, но не реагируют с клетками НТ29 На крностатных резах из органов человека МКА избирательно реагируют с кератином базальных слоев клеток переходного эпители мочевого пузыр , мкогор дного эпители гортани, бронхов , трахеи, с клетками миоэпите- ли в железах: слюнных, потовых, молочных; железах подслизистой трахеи , бронхов, пищевода;с камбиальными клетками придатков эпидермиса - сальных желез и волос ных фолликулов. В реакции иммуноблоттинга с препаратами цитоскелета культивируемых клеток HeLa и слюнной железы человека антитела ЕЗ реагируют одной полосой с кератином м.м1 46 КД(№ 17).

Claims

Формула изобретени

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 135D, используемый дл получени моноклональных антител к кератину № 17 человека.