SU1458385A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных RаттUS NoRVeGIcUS, используемый дл получени моноклональных антител к гликопротеиду базальных мембран энтактину - Google Patents

Abstract

Изобретение.относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  диагностики и исследовани  патологических состо ний. Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран энтакти ну . Штамм получают гибрид из ацией спленоцитов крысы, иммунизированных препаратом ламинина из мьш1иной опухоли , с клетками мьпииной миеломы X 8.653. Продукци  МКА на 5-й день культивировани  составл ет 10- 20 мкг/мл. МКА относ тс  к классу Ig G у 2 а(Н)., Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином м.м. 150 kD. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% эмбриональной тел чьей сыворотки, модальное число хромосом в клетках штамма 86. I (Л

Description

J

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  диагностики и исследовани  патологических состо ний..

Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран знтактину.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена Используют частично очищенный препарат ламинина из мышиной опухоли EHS, в котором энтактин присутствует в виде примеси. Схема иммунизации: крысы линии Фишер получают 4 инъекции по 150 мкг белка кажда . Перва  инъекци  - внутрибрю .

шинно в полном адьюванте Фрейнда, через 1 мес ц - две внутрибргапинных инъекции в неполном адьюванте Фрейнда с интервалом 10 дней между инъекци -, ми, через 10 дней - внутривенна  инъекци  без адьюванта (в переднюю к амеру глаза). Объем раствора антигена 0,15 мл, адьювант добавл ют в равном . Гибридизацию провод т на 4 день после 4-й иммунизации. Дп  этого клетки селезенки иммунных крыс (ЮЪ гибридизуют с 5-10 клеток мышиной миеломы X63-Ag 8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликол  с мол. мае. 1500. Культивирование гибридных клеток ведут в 96-луночных платах на предварительно посаженных перитонеальных макрофагах мыши .(5-8

ел

00 00 00

ел

lO клеток на лунку). Питательна  среда: среда Игла в модификации Дуль- бекко (даЕМ) с 20% эмбриональной тел чьей сыворотки или 10% эмбрио- с нальиой тел чьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, мМ пирувата, гипоксантина, аминопте- рина и 1,6-10-- М тимидина, 100 ед/мл гентамицина. Гибридомы клонируют 10 2 раза, высева  на лунку .с макрофагами по 1 клетке. Отбор клонов осуществл ют иммунофлуоресцентным окрашиХарактеристика полезного продук МКА относ тс  к классу 1 g Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран э тактином. Метод оценки сохранени  специфичности: непр ма  иммунофлуоI ванием криостатных срезов почки мьши. Из 500 проверенных клонов культураль- 15 ресценци  (окрашиваютс  базальные на  жидкость (КЖ) одного из них pea- мембраны на срезах) и радиоиммуно- гирует в иммунофлуоресценции с базапь преципитаци .: антитела св зывают с ными мембранами почки, причем,особен- но сильно с базалый1ми мембранами

сефарозой с пришить1ми иммуноглобули нами кролика против иммyнoг loбyлинo

20

нрысы, инкубируют с меченным аминокислотами или I - лизатом мьшиной тератобластомы ТБ-24 или мышиной опухоли EHS, преципитат подвергают электрофорезу в градиентном полиакклубочковых капилл ров. В-радиоимму- нопреципитационном тесте с лизатом мышиной тератобластомы ТБ 24 КЖ этого клона реагирует с сульфатированным гликопротеидом энтактином (мол. мае.

150 кД). Данный клон вывод т в массо-25 риламидном геле (5-15/5) в присутствую культуру и обозначают ЗАМ. Штамм и додецилсульфата натри  и высу- хранитс  в Специализированной кол- шенныи гель подвергают авторадиогра- лекции перевиваемых соматических кле- фии. Положительна  реакци  про вл ет- ток позвоночных Всесоюзной коллекции присутствием на автографах меченой клеточных культур (Институт цитоло- 30 полосы 150 КД.

гии АН СССР) под номером ВСКК (П) Контаминаци . Бактерии и грибы 124 D. н культуре не обнаружены при длительЫтамм характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивировани  - среда . ресуспендируют в эмбриональной Игла в модификации Дульбекко (ДНЕМ) тел чьей сыворотке, содержащей 10% с 0% эмбриональной тел чьей сыворот- диметилсульфоксида, и концентрации ки (или 10% эмбриональной тел чьей 1-3-10 клеток в 1 мл, разливают в сыворотки и 10% лошадиной сыворотки), 40 стерильные пластиковые ампулы при 1 мМ глутамина, 100 ед. гентамицина в 1 мл. Клетки выращивают при 37°С и 5% углекислоты в атмосфере. Дц  выращивани  штамма можно использо45

ном наблюдении и посевах на питательные среды. 25 Криоконсервирование. Клетки штамвать стекл нную или пластиковую посуду . Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды засевают 2-5-10 клето.к ЗАМ. Пассаж - 1 раз в 4-5 дней той же дозой клеток. Без подсчета клеток - 1:3. Культивирование in vivo. Так как гибридома получена при сли нии клеток крысы и мыши, культивирование in vivo в обычных животных невозможно .

Кариологические признаки.

Модальное число хромосом - 86 (в 50% метафаз двойные микрохромосомы ). Продуктивность штамма.

и за,мораживают-в ;кидком азоте по программе со снижением температуры на в минуту с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин. при . Клетки развод т в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре

5мин при 1000 об/мин,, сливают.среду , заливают 1 мл свежей среды и пеgQ ренос т в лунку 24-луночной платы с предварительно посаг-сенными перито- неальными макрофагами мьши (25-40 1-10 клеток на лунку). Жизнеспособность клеток по включению трипаиового

gg синего составл е г 50-90%.

Пример. Кусочки почки, полученной от свежезабитой мыши, помещают в 7%-ный раствор желатина в а- буференном физрастворе (ЗФР) и неСекреци  МКА на 5-й день культивировани  составл ет 10-20 мкг/мл куль- туральиой жидкости. Стабильна  секреци  продукта сохра}иетс  до 35 пассажей в куль туре. При регуллрном тестировании не отмечено снижени  выработки антител.

Характеристика полезного продукта МКА относ тс  к классу 1 g (H) Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран эн- тактином. Метод оценки сохранени  специфичности: непр ма  иммунофлуоресценци  (окрашиваютс  базальные мембраны на срезах) и радиоиммуно- преципитаци .: антитела св зывают с

ресценци  (окрашиваютс  базальные мембраны на срезах) и радиоиммуно- преципитаци .: антитела св зывают с

сефарозой с пришить1ми иммуноглобулинами кролика против иммyнoг loбyлинoв

нрысы, инкубируют с меченным аминокислотами или I - лизатом мьшиной тератобластомы ТБ-24 или мышиной опухоли EHS, преципитат подвергают электрофорезу в градиентном полиак . ресуспендируют в эмбриональной тел чьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида, и концентрации 1-3-10 клеток в 1 мл, разливают в 40 стерильные пластиковые ампулы при

ном наблюдении и посевах на питательные среды. 25 Криоконсервирование. Клетки штам . ресуспендируют в эмбриональной тел чьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида, и концентрации 1-3-10 клеток в 1 мл, разливают в 0 стерильные пластиковые ампулы при

5

и за,мораживают-в ;кидком азоте по программе со снижением температуры на в минуту с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин. при . Клетки развод т в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре

5мин при 1000 об/мин,, сливают.среду , заливают 1 мл свежей среды и пеQ ренос т в лунку 24-луночной платы с предварительно посаг-сенными перито- неальными макрофагами мьши (25-40 1-10 клеток на лунку). Жизнеспособность клеток по включению трипаиового

g синего составл е г 50-90%.

Пример. Кусочки почки, полученной от свежезабитой мыши, помещают в 7%-ный раствор желатина в а- буференном физрастворе (ЗФР) и немедленно замораживают в жидком азоте Блоки хран т при -70°С. Срезы толщиной 5 мкм готов т на криотоме, фиксируют 5 мин в 10%-ном формалине и тщательно отмывают в ЭФР. Далее став т реакцию непр мой иммунофлуоресценцйи при комнатной температуре. Перва  инкубаци  (I ч) - КЖ клеток штамма ЗАМ. После отмывки в ЗФР - втора  ин- кубаци  (1 ч) - кроличь  антисыворотка ,к иммуноглобулинам крысы, меченна  флуоресцеинизотиоцианатом в разведении I:20 после предварительного истощени  сыворотки печеночным порошком мыши. Отмытые в ЗФР заключают ,в глицерин на ЗФР (1:1), Контроль - перва  инкубаци  с ЗФР вместо МКА,

Препарат исследуют в микроскопе с флуоресцентной приставкой. Отмечают свечение базальных мембран почки. Особенно  рко окрашены базальные мембраны клубочковых капилл ров. Клетки канальцев, эндотелий сосудов, строма не окрашены, следовательно, не содержат энтактина. Таким образом, полученные МКА специфически вы вл ют гликопротеид базальных мембран энтак

тин и не взаимодействуют с другими белками клетки.

П р и м е р 2. Отмытые ,в ЗФР эмб- риоидные тельца тератобластомы ТБ-24 заливают в желатин и сразу же замораживают в жидкой азоте. материал обрабатывают, как описано в примере 1, и исследуют в микроскопе с флуоресцентной приставкой. Отмечают положительную реакцию с. матриксом внутри змбриовдного тельца ТБ-24. Окраска фибрилл рна . Скоплени  клеток в ч матриксе не окраше ны, следовательно, не содержат внутриклеточного энтактина .

Таким образом, полученные МКА дают возможность детально исследовать изменение базальных мембран в экспериментальных опухол х животных в пропл - цессе инвазии И метаста.зировани .

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых 25 клеток животных Rattus norvegicus

   ВСКК (П) 124D, используемый дл  получени  моноклональных антител к гли- копротеиду базальных мембран энтакт тину.

   Редактор А. Лежнина

   Составитель М. Серова

   Техред М.Дндык Корректор М. Демчи

   Заказ 326/29

   Тираж 500

   ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

   Подписное