JPH02503513A - ６４‐６９ｋＤの分子量を有する膵臓のβ細胞の抗原ファミリーに対するモノクローナル抗体の生産者であるハイブリドーマＣ１０Ｇ７株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６４−６９ｋＤの分子量を有する膵臓のβ細胞の抗原ファミリーに対するモノク ローナル抗体の生産者であるハイブリドーマＣｌ０Ｇ７株 発明の分野 本発明は医学の分野に関し、より詳しくは、６４−６９ｋＤの分子量を有する膵 臓のβ細胞の抗原ファミリーに対するモノクローナル抗体の生産者である新規ハ イブリドーマＣｌ０Ｇ７株に関する。

技術の現状 臨床的および実験的免疫学においてモノクローナル抗体は特定の病理学的過程と 関連がある種々の器官および組織の抗原標識の同定のために非常に重要である。

タイプ１の糖尿病にかかっている患者の血清中に含まれる自己抗体の組成物の中 で最も興味深いものは、６４ｋＤの分子量を有する膵臓の島細胞の抗原を標識す る抗体である。この遺伝子の発現は、タイプＩの糖尿病の進行と厳密に関連があ る。

このため、糖尿病の研究およびそれの診断における重大な意義は、この抗原を標 識するモノクローナル抗体の調製およびそれらモノクローナル抗体による膵臓の β細胞上の島細胞の集団におけるこの抗原の発現の確認にある。

当業界で既知のものは、２１　、２７および６６ｋＤの分子量を存する島細胞の 抗原に対する抗体を産生ずるハイブリドーマ２Ｇ３゜３Ｇ３およびＢ】株である （Ｈ，Ｖｉｓｓｉｎｇ、Ｇ、Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｉｓ　＆　Ｌｅｒｎｍａｒ ｋ。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｐａｎｃｒｅ ａｔｉｃ　１ｓｌｅｔ−Ｃｅｌｌ−Ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　５ｅｌｅ ｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏ＋ｏｅｔｒｙ、５ｃａｎｄ。

Ｊ、Ｉ＋＋ｕ＋＋ｕｎｏ１．．１９Ｂ６．２３，４２５−４３３）　、　しかし ながら、これらの株のいずれもβ細胞に厳密に特異的な抗原を摘発しない、何故 ならモノクローナル抗体が多数の別の器官の表皮細胞と反応し、即ち、複数の器 官反応性を有するからである。ＨＩＳＬ−１９株も当業界で既知であり（Ｓ、５ ｒｉｋａｎｔａ、　Ｋ、Ｋｒ１ｓｃｈおよびＧ、Ｓ。

Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、ｌ５ｌｅｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｄｅｆｉｎ ｅｄ　ｂｙ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＩｓｌｅｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄ ｙ　　ＨＩＳＬ−１９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８６．Ｖｏｌ、３５．ｐｐ。

３００−３０４）、この株は１２０　、６９　、６７および５６ｋＤの分子量を 有する島細胞の種々のタンパク質の全グループを摘発する。しかしながら、島細 胞とは別に、これらのモノクローナル抗体は別の内分泌器官（甲状腺、下垂体の 前葉など）の細胞と反応する。更に、膵臓の島細胞の集団の範囲内でも、モノク ローナル抗体とβ細胞との密接な関連性が示されなかった。

従って、インスリン産生細胞に特異的な抗原標識を暴露することは不可能である 。

６４および２８ｋＤの分子量を有する膵臓の島細胞上の２種のポリペプチドに対 して同時にモノクローナル抗体を産生ずる３Ａ４株もまた当業界において知られ ている（Ｊ、Ｈａｒｉら、Ｉｍａ＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ａ＋ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＩＣ５Ａ＋Ｄｉａｂｅｔｅｓ 、１９８６．ｖｏｌ、３５．ｐ、５１７−５２２；Ｆｏｌｉａ　ｅｎｄｃｒｉｎ ｏｌ、、Ｊａｐａｎ。

１９Ｂ５．６１．５６−６８）。

しかしながら３Ａ４株により生産されるモノクローナル抗、　　体は、６４ｋＤ の分子量を有する純粋な抗原を単離することはできない、何故なら、それらは膵 臓の島細胞の２つの決定基−６４ｋＤの分子量を有する表面上のものと２８ｋＤ の分子量を有する細胞内のもの−と同時に関連があり、即ち、それらはタイプＩ の糖尿病の病原の抗原標識である６４ｋＤの分子量を有する抗原について全く特 異性を持たない。

このため、それらは糖尿病の免疫診断に利用することはできない。

前糖尿病状態の患者のリンパ球から得られそしてエプスタイン−バーウィルスに より形質転換されたＭＣ４Ｅ４細胞系もまた当業界で知られている（Ｃ，Ｒ，Ａ ｃａｄ、　Ｓｃ、　Ｐａｒｉｓ、　１９８５．　ｔ、３０１　。

Ｓｅｒｉｅｍ、ｎ”　１３．６１１−６１５）、それにより産生されるモノクロ ーナル抗体が５６ｋＤＯ共沈物と共に６４ｋＤの分子量を有する抗原を摘発した という事実にもかかわらず、それらは膵臓のβ細胞に対して厳密に特異的ではな く、そして別の内分泌腺細胞並びに線繊芽細胞およびラットのインスリノーマＲ ＩＮｓ＊５Ｆの系列と反応した。

現時点では、膵臓のβ細胞の抗原について厳密に特異的なモノクローナル抗体を 産生ずるハイブリッド培養細胞株は当業界において全く知られていない。

発明の開示 本発明は、膵臓のβ細胞の抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生じそ して糖尿病の免疫診断および予防のための医学において有用である新規ハイプリ ドーマ株、並びに遺伝子操作合成のための基盤を提供することに向けられる。

この目的は、６４−６９ｋＤの分子量を有する膵臓のβ細胞の抗原ファミリーに 対するモノクローナル抗体を産生ずる新規ハイプリドーマ株により達成され得、 この株は１９８８年１月２８日にＡ１１−Ｕｎｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（νＮＩＩＡ）に寄託され、そ してＮｏ、　ＢＣ［（ＩＩ　）２５１０のちとに登録された。

本発明に係る株は、膵臓のβ細胞に特異的な６４−６９ｋＤの分子量を有しイン スリン依存性の糖尿病における自己抗体成分の発生にとって決定的に重要である 異種抗原ファミリーを摘発するモノクローナル抗体の分泌を提供する。この抗体 により、人間やラットの膵臓のインスリン産生細胞に特異的な６４−６９ｋＤの 異種抗原ファミリーを摘発することが可能であり、そしてそれをタイプｌの糖尿 病の免疫診断において及び新しい種類の免疫診断用剤の準備のためのタイプ■の 糖尿病のタンパク質標識の遺伝子操作合成に利用することが可能である。

モノクローナル抗体はまた、人間の病気の新しい治療方法の精巧な考藁および病 因の解明の目的で、タイプＩの糖尿病の実験的自己免疫の適切なモデルの用意の ためにも使われる。

発明を実施するための最良の形式 本発明に係るＣｌ０Ｇ７と命名されたハイプリドーマ株は、膵臓のβ細胞を標識 する６４−６９ｋＤの分子量を存する抗原ファミリーに対するモノクローナル抗 体を産生ずる。

前記Ｃｌ０Ｇ７ハイプリドーマにより産生されそしてＩＣＡ−Ｉと命名されたモ ノクローナル抗体は、膵臓の豚房組織とは反応せず、且つ肝臓、血液、十二指腸 、胸腺、膵臓、下垂体、甲状腺および唾液腺の細胞とも反応しない。

ｌ０Ａ−１抗体は、膵臓の島（ランゲルハンス島）のインスリン含有β細胞のゾ ーンをもっばら標識する。

本発明に係る株は、次のようにして調製される。

ＢＡＬＢ／ｃ系列のマウスを、ν１ｓｔａｒ系列の新生ラットの膵臓のコラ−ゲ ナーゼ−トリプシン消化により得られた２Ｘ１０’個の島細胞で腹腔内的に免疫 処置する。免疫処置の２４日後、同じ方法を繰り返し、そしてそれから１４日後 に同じ細胞を静脈内投与する。４日後、免疫マウスの膵臓細胞を、５０％のポリ エチレングリコール（分子ｔｌ、５００）を用いてマウスのミエローマ細胞Ｐ３ −Ｘ６Ｘ−Ａｇ８．６５３と融合する。膵臓細胞とミエローマ細胞との比は５： １である。ハイブリダイゼーション後、該細胞を１穴あたり１０５細胞数の割合 で９６穴のプレートに接種し、その中に腹膜のマウスマクロファージＢＡＬＢ／ ｃを１穴あたり１０４細胞数の割合で接種する。ハイブリドーマの選択は、１０ ％の牛胎児血清、１０−’Ｍのヒボキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍのアミノプテリ ンおよび１．６　Ｘｌ０−’Ｍのチミジンを含有するイーグル最少培地（ダルベ ンコ改良後）中で行う。ハイブリドーマを、ｌ穴あたりｌ細胞数の割合で２回ク ローニングにかける。予め決められた特異性の抗体の産生を保持してい　”るク ローンの比率は、両方のクローニングにおいて少なくとも９０％のレベルである 。

本発明に係る株は次のような特徴を有する。

培養の特徴 培養用の培地は、１０％の牛脂児血清、２ＩＩＩＭのし一グルタミンおよび５　 Ｘｌ０−’Ｍのメルカプトエタノールを含有するイーグル最少培地（ダルベツコ 改良後）である。培養の際の最適細胞濃度は５Ｘ１０’細胞数／ｄである。接種 量はｌｄあたり１０’細胞数である。該ハイブリドーマは、出発のミエローマに ついての標準培養条件下で良好に生存できそして増殖する。

この細胞は、５ＱＸ１０’細胞数／−の最初の接種量にて栄養培地を交換するこ となく７日間の培養によく耐えるが最高増殖期間後は２０−３０％まで生存率の 徐々の低下を伴う、懸濁液ｌｄ中の細胞の数を直接カウントすることにより決定 される培養複製時間は、培養条件に依存して２４〜７２時間の範囲内である。

細胞の形態学 該細胞は、寸法が均一でありそして丸い形である。核は大きく、細胞の中心に主 として位置するかまたは周辺の方にわずかに片寄っている。核は細胞容積の大部 分を占める。細胞質は狭い周縁で核の周りに位置する。ロマノフスキーーギムザ に従って染色すると、核は赤味がかった紫色を呈し、細胞質は青色を呈する。細 胞質中には全く封入体が観察されない。

生体内での培養 マウスＢＡＬＢ／ｃにおけるハイブリドーマの継代の際の予防接種の細胞投与量 は５ＸＩＯｂ細胞数である。腹水の形成時間は８−１２日である。

有用な生産物の細胞特異性の特徴 本発明に係る株により産生されるモノクローナル抗体は、６４−６９ｋＤの分子 量を有する膵臓のβ細胞の表面抗原ファミリーと特異的に反応し、そして血球、 胸腺細胞、牌細胞、甲状腺、唾液腺および下垂体の細胞、膵臓の豚房細胞、肝細 胞の膜とは反応しない。

モノクローナル抗体の免疫化学的特徴 モノクローナルＩＣＡ−Ｔ抗体は、免疫グロブリンクラスＧ、イソタイプＩｇＧ ２ｂに属する。

汚染 細菌、真菌およびマイコプラズマによる汚染は全く認められなかった。

細胞の保存 該ハイブリドーマは、５０％の牛脂児血清および１０％のジメチルスルホキシド を含有する培地中で凍結保存される。凍結条件ニー７０°Ｃまで１°／分、その 後細胞を液体窒素中に置く。

細胞の入ったアンプルを液体窒素から３７°Ｃの温度の水浴上に移すことにより 該ハイブリドーマを解凍する。

約１年間液体窒素中で保存後の細胞の生存率は、色素：エオシンとトリパン青の 取込みにより判断すると最小で７０％である。

本発明のより良い理解のために、クレームされる株を説明する幾つかの特定の例 を下に示す。

例１ 該ハイブリドーマを５Ｘ１０’細胞数の割合で、１０％の牛脂児血清、２−のし −グルタミン、１００μ／ｄのゲンタマイシンおよび５　Ｘｌ０−’Ｍの２−メ ルカプトエタノールを含有するイーグル最少培地（ダルベツコ改良後）の入った プラスチック製フラスコに接種した。該細胞を５％のＣｏｔを含む大気中で３７ °Ｃの温度にて３−４日間培養した０次いで培養液を集め、３．０ＯＯｒ、ｐ、 ｍ、での２０分間の遠心にかけ、そして上清を抗体源として使用した。

Ｖｉｓｔａｒ系列の３０匹の新生ラットからのｗｉ臓検体をコラ−ゲナーゼ−ト リプシンで処理し、次いでトリプシン−エチレングリコール−ビス−（β〜ルア ミノエチルエーテル　−Ｎ　、　Ｎ。

Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸−デオキシリボヌクレアーゼで処理した。同様にして、 ヒト胎児（妊＠１８−２４週間、自然流産）の島細胞の培養物を得た。この細胞 を、１０％の牛脂児血清を含むダルベツコ改良のイーグル培地中に置き、プラス チック製ベト９皿中で５％Ｃ（ｈを含む大気中３７゛Ｃの温度にて１８時間培養 した０次いで細胞をペトリ皿から取り出し、そして０．１５ＭのＮａＣｆ　、０ ．ＯＩＭのリン酸ナトリウムを含む溶液（ｐ）Ｉ＝７．２）で洗浄した。次に細 胞をカウントした。１０６個の細胞を前記培地中３７°Ｃにて３０分間のインキ ュベーションにかけ、そこからインスリン産生用試料を取った。１０６個の島細 胞当りのインスリンの基礎分泌は５６０±６５μＵ　／ｄであった。

０．５ＸＩＯ’個の島細胞を、モノクローナル抗体を含む上滑５０Ｉ中４°Ｃの 温度での３０分間のインキュベーションにかけた。

０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．ＯＩＭのリン酸ナトリウムおよび０．０１％ のアジ化ナトリウムを含む溶液ＣｐＨ＝　７．２　）を用いて１．００Ｏｒ、ｐ 、ｍ、での１０分間の遠心により細胞を洗浄し、そしてフルオレセインイソチオ シアネートと接合されたマウスのＩｇＧに対する抗体５０ｔｔ！中に懸濁した。

４°Ｃでの３０分間のインキュベーション後、細胞を上記のようにして洗浄し、 そして１％バラホルムアルデヒド１００ｍ中に懸濁した。流動型サイトメーター により蛍光を回収した。蛍光細胞の比率は、２０、０００個の島細胞をカウント することにより測定された。

同じイソタイプ（１ｇＧ２１））であるが別の特異性（白血球共通抗原に対する ）のモノクローナル抗体との島細胞の反応性の測定値を負の対照として使った。

負の対照として使った白血球共通抗原に対するＩｇＧ２ｂイソタイプのモノクロ ーナル抗体は島細胞と反応しなかった。

１８時間培養されたラットの島細胞の３０倍のスクリーニングの際の本発明に係 るハイプリドーマ株により生産されたモノクローナル抗体と細胞の結合率が７６ ±６．１％であることがわかった。１８時間培養されたヒトの島細胞の３倍のス クリーニングでは該モノクローナル抗体と細胞の結合率が５４±５％であること がわかった。

対照として、前記モノクローナル抗体と別の内分泌腺細胞との反応を行った。

モノクローナル抗体ＩＣＡ−１は別の内分泌腺細胞（唾液腺、甲状腺および下垂 体）、並びに非内分泌腺由来の細胞−胸腺細胞、牌細胞、末梢血球とも反応しな かった。これらの抗体は、ラットのインスリン抗体ＲＬＮｍ５Ｆの系列とも反応 しなかった。

例２ ０、５　Ｘ　０．５　ｃｍの大きさのヒトまたはＶｉｓｔａｒ系列のラットの膵 臓の断片を液体窒素中で凍結した６次いでそれを一２０°Ｃの温度のクリオスタ ットの冷却チャンバー中に置き、そして６−３４の厚さの凍結切片（ｃｒｙｏｔ ｏｏ＋ｅ）を作製した。各凍結切片（スライス）を５０１のポリーＬ−リジンと 共にガラス上に適用し、そして３６°Ｃに加熱することにより１秒間固定した。

該凍結切片を無水アセトン中で７−１０分間固定した。次にそれらをＴｒｉｓ− ＮａＣＩ！溶液中に置き、５分間インキュベートした。

凍結切片を湿潤チャンバー中に移し、５０ＩＪ！の上清のハイブリドーマＣｌ０ Ｇ７でコートし、そして室温にて６０分間のインキュベーションにかけた０次い でそれらをＴｒｉｓ−ＮａＣ／！の入った容器中に浸すことにより各回５分間で ２回洗浄した。その後、ペルオキシダーゼと接合されたマウスのＩｇＧに対する 抗体５０１１！を該凍結切片に通用し、そして後者を室温での６０分間のインキ ュベーションにかけた。次いでそれらを前記の手順に従って洗浄した。ジアミノ ベンジジンでの後染色を視覚コントロール下で行った。モノクローナル抗体によ る島細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色の生成物を光学顕微鏡において調べた。Ｖ ｉｓｔａｒ系列のラットの膵臓の凍結切片における１５倍のスクリーニングおよ びヒトの膵臓の凍結切片の５倍のスクリーニングの際、島細胞の着色はβ細胞の 膜の性質であった場所の周辺において認められた。別の内分泌腺の凍結切片、並 びに腸、膵臓、胸腺の凍結切片においては、前記モノクローナル抗体との反応性 が全く検出されなかった。

例３ 膵臓のβ細胞に対するモノクローナル抗体ＩＣＡ−Ｉの特異性を証明するために 、モノクローナル抗体ＩＣＡ−Ｉおよびインスリンに対するモノクローナル抗体 による島細胞の二重染色を行った。上記の例１において記載したようにして細胞 の培養物を得た。免疫蛍光反応は次の４つの連続的段階において行われた： １、　インスリンに対するモノクローナル抗体（マウス由来）とのインキュベー ション。

２　フルオレセインで標識されたマウスＩｇＧに対する抗血清とのインキュベー ション。

３、　モノクローナル抗体ＩＣＡ−１（あらかじめビオチニル化されている）と のインキュベーション。

４、　ストレプトアビジン−藻紅素とのインキュベーション。

制限時間、インキュベーションおよび洗浄条件は上記の例１のものと同様であっ た。

蛍光は、赤（５６０−５７６ｎｍ）と緑（５１０５３０ｎｍ）の蛍光の別々の評 価を可能にする２枚の狭帯域フィルターを有する流動型サイトメーターにおいて 測定した。結果として、５０％の細胞がモノクローナル抗体ＩＣＡ−１と反応し 、一方７０％が抗−インスリン抗体と反応したことがわかった；　ＩＣＡ弓の抗 原ファミリーを表す細胞全てが抗−インスリン抗体と陽性に反応した。

従って、モノクローナル抗体ＩＣＡ−Ｉは膵臓のβ細胞と特異的に反応した。

例４ モノクローナル抗体ＩＣＡ−１と反応する抗原ファミリーの分子量を決定するた めに、アフィニティ・−クロマトグラフィーの方法によるラットの島細胞溶解物 からの単離を利用した。

非イオン系洗剤ＮＰ−４０中の溶解物１成を調製するために、上記の例１におい て記載したのと同様にして得られた２０Ｘ１０’個の培養された島細胞を使った 。モノクローナル抗体ＩＣＡ−１をプロティンＡ−セファロースのカラム中で精 製した。

免疫吸着剤（プロティンＡで精製され臭化シアン−セファロースと接合されたモ ノクローナル抗体ＩＣＡＩ）１ｍ当り溶解物２０ｄを使った。このカラムに通過 させた後、タンパク質を溶出させ、これをＳＤＳ電気泳動および二次元ＳＤＳ電 気泳動により分析した。

結果として、１つの等電点（ｐＩ６．５）を有する分子量６９゜６７および６４ ｋＤの３つの密接に関連したタンパク質が決定付けられ、このタンパク質を統一 された抗原ファミリーｐ６４−６９と名付けることが可能になった。

産業上の利用可能性 膵臓のβ細胞の抗原ファミリーに対するモノクローナル抗体の生産者−新規ハイ プリドーマ株Ｃｌ０Ｇ７は、タイプＩの糖尿病の免疫診断のための医学において 有用であり；それはインスリン依存性糖尿病の病因の研究に利用可能である。本 発明に係る株により生産されるモノクローナル抗体は、新しい種類の免疫診断用 剤を開発する目的でのタイプＩの糖尿病のタンパク質標識の遺伝子操作合成にお いて利用可能である。

回収された抗原ファミリーはタイプＩの糖尿病の免疫診断において通用を見出し た；それはまた、対策の考案および糖尿病の進行を防ぐ治療方法において利用す ることも可能である。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ６４−６９ｋＤの分子量を有する膵臓のβ細胞の抗原ファミリーに対するモノク ローナル抗体の生産者であって、１９８８年１月２８日にＡ１１−Ｕｎｉｏｎ　 Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（ＶＮ ＩＩＡ）に寄託されそしてＮｏ．ＢＣＫｋ（ＩＩ）２５１Ｄ　のもとに登録され た、ハイプリドーマＣＩＯＧ７　株。