SK9592002A3

SK9592002A3 - A method for reduction or elimination of the incidence of menopausal symptoms, method of treatment or decreasing the risk of an acquiring disease, a pharmaceutical composition and a kit

Info

Publication number: SK9592002A3
Application number: SK959-2002A
Authority: SK
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorech Inc
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2003-12-02
Also published as: AR035564A1; IL149990A0; HUP0204211A2; CN1400904A; JP2003520817A; RU2342145C2; NZ534348A; ZA200205926B; US20020198179A1; US20030040510A1; US20030065008A1; WO2001054699A1; HUP0204211A3; KR20020073566A; RU2002123047A; CA2395730A1; BR0108107A; NO20023484D0; CZ20022401A3; HK1048761A1

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa vzťahuje k novej kombinácii fyziologicky aktívnych látok. Táto kombinácia konkrétne zahŕňa selektívny modulátor estrogénového receptora (ŠERM) v kombinácii s estrogénom. V niektorých uskutočneniach kombinácia zahŕňa selektívny modulátor estrogénového receptora (ŠERM), estrogén a prekurzor pohlavných steroidov alebo androgénové zlúčeniny. Vynález tiež poskytuje súpravy a farmaceutické prostriedky určené na praktické použitie tejto kombinácie. Uvedená kombinácia je pacientom podávaná s cieľom znížiť alebo eliminovať rozsah návalov horúčavy, vazomotorických symptómov, vaginálnej suchoty alebo iných symptómov menopauzy. Predpokladá sa, že riziko vzniku karcinómu prsníka a/alebo karcinómu endometria bude u pacientov, ktorí dostávajú túto kombinovanú terapiu, znížené. Tiež sú poskytované spôsoby liečby alebo spôsoby zníženia pravdepodobnosti vzniku osteoporózy, hypercholesterolémie, hyperlipidémie, aterosklerózy, hypertenzie, Alzheimerovej choroby, nespavosti, kardiovaskulárnych ochorení, inzulínovej odolnosti, diabetes a obezity (najmä brušnej obezity).

Doterajší stav techniky

Je známe, že rôzne ochorenia, stavy a nežiadúce príznaky sú odozvou na podanie exogénnych pohlavných steroidov alebo ich prekurzorov. U estrogénov sa napríklad predpokladá, že znižujú rýchlosť úbytku kostí, zatiaľ čo u androgénov bolo zistené, že kostnú hmotu vytvárajú a to tým, že stimulujú tvorbu kosti. Hormonálnu substitučnú terapiu (napríklad podávanie estrogénov) je možné použiť na liečbu príznakov menopauzy. Progestíny sa často používajú na zabránenie tvorby endometria a na zníženie rizika karcinómu endometria, ktoré je indukované estrogénmi. Použitie estrogénov a/alebo progestínov na liečbu radu rôznych symptómov a ochorení alebo na profylaktické účely má rad slabých miest. Liečba žien androgénnymi zlúčeninami môže mať nežiaduci vedľajší účinok a to taký, že spôsobuje určité maskulinizačné vedľajšie účinky. Podávanie pohlavných steroidov môže tiež zvýšiť riziko výskytu určitých ochorení u týchto pacientov. Napríklad karcinóm prsníka u žien je zhoršovaný vplyvom aktivity estrogénov. Karcinóm prostaty ¹ a benígna hyperplazia prostaty sú zhoršované aktivitou androgénov.

Je potrebné aplikovať účinnejšie hormonálne terapie a znížiť vedľajšie účinky a riziká.

Predpokladá sa, že kombinované terapie podľa predloženého vynálezu, farmaceutické prostriedky a súpravy, ktoré sa môžu v týchto terapiách použiť, by mohli byť pre tieto potreby užitočné.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob liečby alebo spôsob zníženia výskytu alebo rizika vzniku návalov horúčavy, vazomotorických príznakov, osteoporózy, kardiovaskulárnych ochorení, hypercholesterolémie, hyperlipidémie, aterosklerózy, hypertenzie, inzulínovej odolnosti, diabetes, obezity (najmä brušnej obezity), nepravidelnej menštruácie a vaginálnej suchosti.

Ďalším predmetom je poskytnúť spôsoby liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku vyššie uvedených ochorení a súčasne minimalizovať nežiadúce vedľajšie účinky.

Ďalším predmetom je poskytnúť prostriedky vhodné na použitie vyššie súpravy a farmaceutické uvedených postupov.

V jednom uskutočnení predkladaný vynález poskytuje spôsob ako znížiť alebo úplne eliminovať výskyt príznakov menopauzy.

Uvedený spôsob zahŕňa, v prípade potreby uvedeného zníženia alebo eliminácie, podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prolieku spolu s podaním terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového modulátor je zlúčenina odlišná od uvedeného estrogénu.

receptora alebo jeho prolieku pacientovi, pričom uvedený

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku stavu, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí osteoporóza, hypercholesterolémia, hyperlipidémia, ateroskleróza, hypertenzia, Alzheimerova choroba, inzulínová odolnosť, diabetes, úbytok svalovej hmoty, obezita, vaginálne krvácanie spôsobené substitučnou terapiou a bolestivosť prsníkov spôsobená hormonálnou substitučnou terapiou. Uvedený spôsob zahŕňa, v prípade potreby uvedenej eliminácie alebo zníženia, podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prolieku spolu s podaním terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prolieku pacientovi, pričom uvedený modulátor je zlúčenina odlišná od uvedeného estrogénu.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutický prostriedok, ktorý zahŕňa:

a) farmaceutický prijateľnú pomocnú látku, riedidlo alebo nosič;

b) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného estrogénu alebo jeho prolieku; a

c) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prolieku, pričom uvedený modulátor je zlúčenina odlišná od uvedeného estrogénu.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje súpravu obsahujúcu jednu nádobku s farmaceutickou formuláciou, ktorá obsahuje terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného estrogénu alebo jeho prolieku; a uvedená súprava ďalej obsahuje druhú nádobku, ktorá obsahuje farmaceutickú formuláciu obsahujúcu terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prolieku.

V jednom uskutočnení sa vynález vzťahuje k spôsobu liečby alebo spôsobu zníženia rizika vzniku osteoporózy. Spôsob sa skladá z podania terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku kardiovaskulárnych ochorení. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku hypercholesterolémie. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku hyperlipidémie. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku aterosklerózy. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku hypertenzie. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika rozvoja nespavosti. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vývoja straty rozpoznávacích funkcií. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku Alzheimerovej choroby. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku diabetes. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika rozvoja príznakov menopauzy. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku obezity (najmä brušnej obezity). Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vývoja bolestivosti prsníkov spôsobenej hormonálnou substitučnou terapiou. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vývoja vaginálneho krvácania spôsobeného hormonálnou substitučnou terapiou. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva estrogénu pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení sa vynález vzťahuje k spôsobu liečby alebo spôsobu zníženia výskytu osteoporózy, ktorý zvyšuje hladiny prekurzoru pohlavných steroidov vybraných zo skupiny, ktorú tvoria dehydroepiandrosterón (DHEA), dehydroepiandrosterónsulfát (DHEA-S), androstendión a androst-5-én-3fi,17B-diol (5-diol), u pacientov a to v prípade potreby dosiahnuť uvedenú liečbu alebo zníženie rizika. Spôsob ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) a terapeuticky účinného množstva estrogénu ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení sa vynález vzťahuje k spôsobu liečby alebo spôsobu zníženia výskytu návalov horúčavy a potenia a to tým, že príde k zvýšeniu hladiny prekurzoru pohlavných steroidov vybraných zo skupiny, ktorú tvoria dehydroepiandrosterón (DHEA), dehydroepiandrosterónsulfát (DHEA-S), androstendión a androst-5-én-3E,17B-diol (5-diol), u pacientov a to v prípade potreby dosiahnuť uvedenú liečbu alebo zníženie rizika. Spôsob ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) a terapeuticky účinného množstva estrogénu ako súčasti kombinovanej terapie.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku vyššie uvedených ochorení. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva agonistu/antagonistu estrogénu (zmesný ŠERM) pacientovi a ďalej zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva čistého selektívneho modulátora estrogénového receptora (čistý-SERM) alebo estrogénu ako súčasti kombinovanej terapie. Termín zmesný ŠERM, ktorý je tu používaný, znamená, že pri fyziologických alebo farmakologických koncentráciách má ŠERM určitú estrogénovú aktivitu u tkanív endometria a prsníkov.

Tu používaný termín čistý ŠERM znamená, že pri fyziologických alebo farmakologických koncentráciách nemá ŠERM žiadnu estrogénovú aktivitu u tkanív endometria a prsníka.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje súpravu, ktorá obsahuje jednu nádobku s terapeuticky účinným množstvom aspoň jedného estrogénu a ďalej obsahuje druhú nádobku s terapeuticky účinným množstvom aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutický prostriedok, ktorý zahŕňa: a) farmaceutický prijateľnú pomocnú látku, riedidlo alebo nosič; b) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného estrogénu; a c) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora.

Tu používané spojenie zlúčeniny podávanej pacientovi spolu s ďalšími zlúčeninami znamená, že zlúčeniny sú podávané dostatočne blízko k podávaniu uvedených ďalších zlúčenín a to tak, že pacient získa fyziologické účinky obidvoch zlúčenín súčasne a to aj napriek tomu, že zlúčeniny nie sú podávané v blízkych časových intervaloch. Ak sú zlúčeniny podávané ako súčasť kombinovanej terapie, sú podané obidve naraz.

Estrogénová substitučná terapia je bežne používaná u žien po menopauze s cieľom predchádzať ochoreniam, ktoré sú dôsledkom menopauzy, najmä osteoporóza, návaly horúčavy, koronárne srdcové ochorenia (Cummings 1991) a liečiť ich. Táto terapia však spôsobuje určité nežiadúce účinky spojené s dlhodobým podávaním estrogénov. Hlavnou nevýhodou tejto terapie je konkrétne vnímané zvýšené riziko karcinómu prsníka a/alebo maternice (Judd, Meldrum a kol., 1983; Colditz, Halkinson a kol. 1995) spôsobené estrogénom. Autori predloženého vynálezu zistili, že prídavok selektívneho modulátora estrogénového receptora (ŠERM) k podávanému estrogénu tieto nežiadúce účinky potláča.

Predkladaný vynález poskytuje spôsob liečby alebo spôsob zníženia rizika vzniku bolestivosti prsníkov spôsobenej hormonálnou substitučnou terapiou (HRT). Pretože ŠERM spôsobuje atrofiu etiťelu prsníka namiesto stimulácie, ktorú spôsobuje HRT, bolestivosť prsníkov sa zníži alebo bude úplne eliminovaná.

Vynález tiež poskytuje spôsob prevencie a spôsob liečby vaginálneho krvácania spôsobeného hormonálnou substitučnou terapiou (HRT). Pretože ŠERM spôsobuje atrofiu endometria, nebude k vaginálnemu krvácaniu dochádzať.

Na druhej strane SERMy majú veľmi malé alebo nemajú žiadne pozitívne účinky na určité príznaky menopauzy ako sú návaly horúčavy a potenia. Autori vynálezu veria, že prídavok estrogénu do liečby príznakov menopauzy pomocou SERMu návaly horúčavy a potenia zníži alebo úplne eliminuje. Je dôležité vedieť, že návaly horúčavy a potenia sú prvým ukazovateľom menopauzy a kladná alebo záporná odozva pacientiek na liečbu závisí obvykle na úspechu či neúspechu znižovania návalov horúčavy a potenia.

Tu používaný selektívny modulátor estrogénového receptora (ŠERM) je zlúčenina, ktorá buď priamo alebo prostredníctvom svojich aktívnych metabolitov pôsobí ako antagonista estrogénového receptora (antiestrogén) v tkanive prsníka a tiež poskytuje estrogénový alebo estrogénu podobný účinok na kostné tkanivo a na hladiny cholesterolu v sére (t.j. znižuje cholesterol v sére). Nesteroidné zlúčeniny, ktoré pôsobia ako antagonisty estrogénového receptora in vitro alebo v ľudských prsníkových tkanivách alebo v prsníkových tkanivách potkana (najmä vtedy, ak pôsobí zlúčenina ako antiestrogén na bunky ľudského karcinómu prsníka), budú pravdepodobne pôsobiť ako SERMy. Naopak steroidné antiestrogény, pretože nemajú žiadny pozitívny vplyv na cholesterol v sére, nemajú tendenciu pôsobiť ako SERMy. Medzi nesteroidné antiestrogény, ktoré sme testovali a u ktorých sme zistili, že pôsobia ako SERMy, patria EM-800,

EM-652.HC1, ralofixén, tamoxifén, 4-hydroxy-tamoxifén, toremifén, 4-hydroxt-toremifén, droloxifén, LY 353 381, LY 335 563, GW-5638, lazofoxifén, TSE 424 a idoxifén. Toto sú však len príklady.

Tiež sme však zistili, že všetky SERMy nereagujú rovnakým spôsobom a že môžu byť rozdelené do dvoch podtried: čisté SERMy a zmesné SERMy. U potkanov niektoré SERMy ako EM-800 a EM-652.HC1 nemajú pri fyziologických alebo farmakologických koncentráciách žiadnu estrogénovú aktivitu v prípade tkaniva prsníka alebo endometria a majú hypocholesterolemické a hypotroglyceridemické účinky. Tieto SERMy môžu byť označené ako čisté SERMy. Ideálnym SERMom je čistý ŠERM typu EM-652.HC1 a to z dôvodu jeho veľkej a čisto antiestrogénovej aktivity u prsnikovej žľazy. Ostatné ako raloxifén, tamoxifén, droloxifén, 4-hydroxy-tamoxifén (1-(4-dimetylaminoetoxyfenyl)-1-(4-hydroxyfenyl)-2-fenyl-but-l-én), toremifén, 4-hydroxy-toremifén [ (Z) — (2)-2-[4-(4-chlór-l-(4-hydroxyfenyl)-2-fenyl-l-butenyl)fenoxy]N,N-dimetyletánamín], LY 353 381, LY 335 563, GW-5638 a idoxifén vykazujú u prsníka a endometria určitú estrogénovú aktivitu. Táto druhá skupina SERMov môže byť nazývaná zmesné SERMy. Nežiadúce estrogénové aktivity týchto zmesných SERMov” môžu byť inhibované prídavkom čistých SERMov, čo je pre in vitro testy ukázané na obr. 6 a 7 a pre in vivo testy karcinómu prsníka na obr. 9. Pretože xenoimplantáty ľudského karcinómu prsníka u holých myši sú najbližším dostupným modelom ľudského karcinómu prsníka, porovnali sme účinok samotného EM-800 a tamoxifénu a ich kombinácie na rast xenoimplantátu karcinómu prsníka ZR-75-1 u holých myší.

Pokiaľ nie je stanovené inak, predpokladá sa u všetkých tu uvedených kombinácií podávanie rôznych zlúčenín. Teda napríklad podávanie SERMu a estrogénu sa vzťahuje k podávaniu dvoch odlišných zlúčenín - nie k podávaniu jedinej zlúčeniny, ktorou je ŠERM s určitými estrogénovými vlastnosťami.

Autor vynálezu sa domnieva, že je veľmi dôležité, že SERMy podľa predmetného vynálezu pôsobia u tkaniva prsníka, maternice a endometria ako čisté antiestrogény, pretože SERMy musia pôsobiť proti potenciálnym vedľajším účinkom estrogénov, ktoré môžu zvyšovať riziko karcinómu týchto tkanív. Autori vynálezu sa domnievajú, že konkrétne benzopyranové deriváty podľa vynálezu, ktoré majú v pozícii 2 absolútnu konfiguráciu 2S, sú vhodnejšie ako ich racemická zmes. V US 6 060 503 sú uvedené opticky aktívne benzopyranové antiestrogény, ktoré majú 2S konfiguráciu, s cieľom použiť ich pri liečbe estrogénom zhoršovaného karcinómu prsníka a endometria. Tieto zlúčeniny sú významne účinnejšie ako ich racemické zmesi (viď. obr. 1 až 5 v US 060 503).

Enantiomér s 2S konfiguráciou v čistej forme je veľmi obtiažne priemyselne získať. Autor vynálezu sa domnieva, že výhodnejšia je kontaminácia menej ako 10 % hmotn., výhodnejšie menej ako 5 % hmotn. a ešte výhodnejšie menej ako 2 % hmotn. 5R enantioméra.

Z obr. 9 je zrejmé, že približne 100 % stimulačný účinok tamoxifénu na rast nádoru bol úplne blokovaný súčasným pôsobením EM-652.HC1. EM-652.HC1 v súlade so svojou čisto antiestrogénovou aktivitou nemá žiadny stimulačný vplyv na rast xenoimplantátov ľudského karcinómu prsníka ZR-75-1 u holých myší (obr. 9).

Testovali sme steroidný antiestrogén ICI 182,780 a zistili sme, že nepôsobí ako ŠERM. SERMy môžu byť v súlade s predmetným vynálezom podávané v rovnakej dávke ako je známe v stave techniky a to tam, kde sú používané ako antiestrogény namiesto ako SERMy.

Tiež sme uviedli vzájomný vzťah medzi pozitívnymi účinkami SERMov na cholesterol v sére a pozitívnymi estrogénovými a estrogénu podobnými účinkami na kosti. SERMy majú kladný vplyv tiež na hypertenziu, inzulínovú odolnosť, diabetes a obezitu (najmä brušnú obezitu) . Bez toho, že by sme boli viazaní na teóriu, predpokladáme, že SERMy, z ktorých rad má výhodnejšie dva aromatické kruhy spojené jedným alebo dvomi atómami uhlíka, budú interagovať s estrogénovým receptorom prostredníctvom časti molekuly, ktorá je receptorom najlepšie rozpoznávaná. Výhodnejšie SERMy majú také postranné reťazce, ktoré môžu selektívne pôsobiť ako antagonisty v prsníkových a obvykle tiež maternicových tkanivách bez toho, že by však mali antagonistické vlastnosti v iných tkanivách. SERMy môžu teda pôsobiť ako antiestrogény v prsníku, zatiaľ čo prekvapujúco pôsobia ako estrogény (alebo poskytujúce estrogénu podobnú aktivitu) v kostiach a v krvi (kde sú ovplyvňované najmä koncentrácie lipidov a cholesterolu), čo je žiaduce. Žiaduci účinok na cholesterol a lipidy sa prevádza na žiaduci účinok proti ateroskleróze, o ktorej je známe, že je nepriaznivo ovplyvnená nesprávnymi hladinami cholesterolu a lipidov.

Na druhej strane osteoporóza, hypercholesterolémia, hyperlipidémia, vedomie a ateroskleróza reagujú na estrogénovú a estrogénu podobnú aktivitu žiaducim spôsobom. Použitím estrogénov v kombinácii so SERMami podľa vynálezu sú v cieľových tkanivách poskytované žiadúce účinky bez toho, že by dochádzalo k nežiadúcim vplyvom v určitých iných tkanivách. Napríklad kombinácia estrogénu a SERMu môže mať žiaduci estrogénový účinok na kosti (alebo lipidy alebo cholesterol), zatiaľ čo nežiaduci estrogénový účinok u prsníka a maternice sa nevyskytuje a to z toho dôvodu, že SERMy, ako antagonisty estrogénu, budú účinne blokovať vplyv estrogénu u prsníka a endometria, čo je zrejmé z obr. 10 a 11.

Ako je ukázané na obr. 10, aj keď hladiny cirkulujúceho 17h-estradiolu boli zvýšené z 95,9 ± 32,4 pg/ml u zdravých zvierat na 143,5 ± 7,8 pg/ml (50 % zvýšenie u zvierat ošetrených EM-800, 0,5 mg/kg, denne orálne počas 12 týždňov), bola pozorovaná zrejmá atrofia mliečnej žľazy. Podobne na obr. 11 bola u zvierat, ktoré dostávali EM-800 (0,5 mg/kg), zistená zrejmá atrofia endometria. U týchto zdravých zvierat dostávajúcich čistý antiestrogén EM-800 bol inhibičný účinok estrogénov v hypotalamo-hypofyzárnej hladine eliminovaný, čím bol zvýšený LH a potom sekundárne vylučovanie 17B-estradiolu vaječníkmi.

V 6 mesačnej štúdii, ktorá sa uskutočnila u zdravých potkanov, ktorí dostávali EM-652 v rovnakých denných dávkach 0,5 mg/kg, bola zmeraná koncentrácia antiestrogénu EM-652 0,4 ng/ml v cirkulácii (URMA-05-011-94) . Pretože priemerná koncentrácia EM-652 v sére žien, ktoré dostávali orálne dennú dávku EM-800 20 mg, bola zmeraná 7,3 ± 0,77 ng/ml, je zrejmé, že aplikácia estrogénovej substitučnej terapie u žien po menopauze neovplyvňuje nežiaducim spôsobom silný inhibičný vplyv EM-652 a jeho schopnosť pôsobiť preventívne proti karcinómu prsníka a endometria. Štúdie fázy I ukázali, že EM800 a EM-652.HCl poskytujú väčšinou zvýšené hladiny EM-652 v sére.

Nežiadúce účinky sú tiež zmierňované prostredníctvom kombinácie použitej vo vynáleze. V prípade všetkých tu diskutovaných ochorení, je akýkoľvek ďalší účinok na prsníkové tkanivo, ktorý by mohol inak byť výsledkom pôsobenia estrogénu podaného pri substitučnej dávke, účinne blokovaný antiestrogénovým účinkom SERMu, čo je zrejmé z obr. 2 a 3. Rovnaký záver je možné urobiť z obr. 10.

V uprednostňovaných uskutočneniach sú pridávané prekurzory pohlavných steroidov (dehydroepiandrosterón, dehydroepiandrosterónsulfát, androst-5-én-3ň,17E-diol, 4-androstén-3,17-dión a ich prolieky) alebo androgénne činidlá. Cieľom je poskytnúť pozitívne androgénne účinky, konkrétne zníženie rizika vzniku ochorení kostí alebo jeho liečby. Kombinácia SERMu a estrogénu pri liečbe osteoporózy rozpad kostí znižuje alebo úplne eliminuje. Ale ďalší prídavok androgénu alebo DHEA (a iných prekurzorov pohlavných steroidov) umožňuje obnovu porušených kostných tkanív. Prekurzory pohlavných steroidov, ktoré majú ďalšie pozitívne účinky pri liečbe hypercholesterolémie, hyperlipidémie, syndrómov menopauzy, Alzheimerovej choroby, kardiovaskulárnych ochorení, karcinómu prsníka, karcinómu maternice a karcinómu vaječníkov, môžu spolu s kombináciou SERMu a estrogénu zlepšovať liečbu vyššie uvedených ochorení. Tento synergický účinok je dôsledkom faktu, že androgény (alebo prekurzory pohlavných steroidov metabolizovaných na androgény v periférnych tkanivách) a estrogény alebo SERMy pracujú rôznymi mechanizmami.

V niektorých uskutočneniach sú pridávané progestiny, ktorých cieľom je poskytnúť ďalší androgénový účinok. Progestiny môžu byť použité v nízkych dávkach, ktoré sú v danom stave techniky známe bez toho, že by dochádzalo k nežiadúcemu ovplyvneniu iných receptorov ako sú adrogénové receptory (napríklad receptory glukokortikoidov). Progestíny tiež nemusia mat nežiadúce androgénové vedľajšie účinky (ako je ochlpenie tváre u žien).

Návaly horúčavy, kardiovaskulárne syndrómy, Alzheimerova choroba, strata rozpoznávacích funkcii a nespavosť používajú určité estrogénové receptory, ktoré sú situované v centrálnom nervovom systéme. Tieto ochorenia je možné aspoň čiastočne vysvetliť nízkymi hladinami estrogénov v mozgu. Exogénne estrogény a konkrétne estradiol môžu prechádzať cez mozgovú bariéru a viazať sa na estrogénové receptory s cieľom obnoviť normálnu estrogénovú aktivitu. Na druhej strane SERMy podľa predkladaného vynálezu a konkrétnejšie tie, ktoré patria do skupiny EM-652.HCI, nemôžu prechádzať cez mozgovú bariéru, čo je ukázané v príklade 9. Nemôžu teda mať antagonistický účinok na pozitívne účinky estrogénov v mozgu, ale majú antagonistický účinok na negatívne účinky estrogénov v tkanive prsníka, maternice a endometria. Toto robí danú kombináciu (ŠERM + estrogény) zaujímavú konkrétne pre liečbu alebo zníženie rizika vzniku vyššie uvedených stavov. .

Ďalšie pozitívne účinky kombinácie estrogénu a SERMu

Hlavným dôvodom, prečo ženy konzultujú svoj fyzický stav po menopauze, je výskyt návalov horúčavy, problém, o ktorom je známe, že môže byť eliminovaný estrogénovou substitučnou terapiou. Pretože miestom zodpovedným za návaly horúčavy je centrálna nervová sústava (CNS) a pretože EM-652 má do CNS veľmi ťažký prístup (dáta sú priložené), predpokladá sa, že podávanie estrogénu bude regulovať návaly horúčavy bez súčasného zásahu SERMu. Na druhej strane ŠERM bude eliminovať všetky negatívne účinky estrogénov v iných miestach, najmä riziko karcinómu prsníka a maternice. Prídavok EM-652 k estrogénom blokuje stimulačný účinok estrogénov na mliečnu žľazu a maternicu, zatiaľ čo v iných tkanivách môže EM-652 uplatňovať svoj vlastný pozitívny vplyv napríklad na kosti, kde čiastočne zabraňuje vplyvu ovariektómie na minerálnu hustotu kostí.

Nebol pozorovaný nežiadúci účinok EM-652 na žiadny parameter, ale mali by sa uplatniť pozitívne účinky súvisiace s prevenciou a liečbou karcinómu prsníka a maternice.

Predpokladané dáta ukazujú, že zatiaľ čo prídavok EM-652 blokuje stimulačný účinok estrogénu na mliečnu žľazu a maternicu (príklady 4, 8 a 10), v iných tkanivách sa uplatňujú pozitívne účinky EM-652.HCI. Napríklad u kostí (príklad 5) zlúčenina EM-652 čiastočne eliminuje vplyv ovariektómie na minerálnu hustotu kostí. Tento účinok viedol ku komercializácii raloxifénu s cieľom liečby osteoporózy u žien po menopauze. U raloxifénu bolo zistené, že z hľadiska prevencie straty BMD u potkanov je 3 až 10-krát menej účinný ako EM-652 (Martel a kol., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 2000: 74, 45 až 56) . Aj keď účinok SERMu na BMD, ktorý je ukázaný pre ďalšie SERMy typu raloxifénu, nie je taký ako účinok, ktorý sa dosiahne s estrogénmi, bolo zistené, že vplyv na zlomeniny kostí pozorovaný u žien po menopauze je rovnaký ako u estrogénov a SERMu raloxifénu. Predpokladá sa teda, že aj keď pomocou EM-652 alebo iných SERMov nie je BMD úplne obnovená, vplyv na zlomeniny kostí, čo je najdôležitejší parameter odozvy, je rovnako významný ako vplyv pozorovaný pri použití estrogénov. Okrem toho je možné, a predpokladá sa to, že meranie BMD neposkytuje úplný obrázok o vplyve zlúčeniny na fyziológiu kostí.

Významným aspektom je to, že SERMu vykazuje pozitívne účinky na estrogénom, poskytovaná najmä s zatiaľ čo liečba pomocou kosti, kombinácia SERMu s cieľom zabrániť návalom horúčavy, umožňuje znížiť riziko karcinómu prsníka a maternice, ktoré súvisí s použitím samotných estrogénov.

Uprednostňované SERMy, ktoré sú tu diskutované, sa

vzťahujú k:

(1) všetkým ochoreniam, ktoré je možné ovplyvniť

pomocou vynálezu; (2) terapeutickým aj profylaktickým

aplikáciám;

a (3) výhodnejším farmaceutickým prostriedkom a

súpravám.

Pacientom, ktorý potrebuje liečbu alebo u ktorého je potrebné znížiť riziko nástupu daného ochorenia je taký pacient, u ktorého buď bolo toto ochorenie diagnostikované alebo ktorý je náchylný k vzniku tohto ochorenia.

Ak nie je uvedené inak je výhodnejšia dávka aktívnych zlúčenín (koncentrácia a spôsoby podania) podľa vynálezu rovnaká pre terapeutické aj profylaktické účely. Dávka pre každú tu uvedenú aktívnu zložku je rovnaká bez ohľadu na ochorenie, ktoré má byť liečené (alebo bez ohľadu na to, či ide o ochorenie, ktorého pravdepodobnosť nástupu má byť znížená).

Ak nie je uvedené inak alebo to nie je zrejmé z kontextu, vzťahujú sa tu uvedené dávky k hmotnosti aktívnych zlúčenín, ktoré nie sú ovplyvnené farmaceutickými pomocnými látkami, riedidlami, nosičmi a inými prísadami, ktoré sú však žiaducou súčasťou, čo je uvedené v príkladoch. Akékoľvek formy dávky (kapsula, tableta, injekcia a iné), ktoré sú vo farmaceutickom priemysle bežne používané, je možné použiť aj tu a termíny pomocná látka, riedidlo alebo nosič zahŕňajú také neaktívne prísady, ktoré sú v daných formách dávky a vo farmaceutickom priemysle spolu s aktívnymi zložkami bežne používané. Napríklad môžu byť použité kapsule, pilule, poťahové vrstvy, tuhé alebo kvapalné riedidlá alebo prídavné látky, ochucovadlá, konzervačné prostriedky a podobne.

Všetky aktívne prísady, ktoré sú použité v ľubovoľnej terapii, ktorá je tu diskutovaná, môžu byť formulované do farmaceutických prostriedkov, ktoré tiež zahŕňajú jednu alebo viacero ďalších aktívnych zlúčenín. Môžu byť tiež podávané každá samostatne, ale v dostatočne blízkych časových intervaloch a to preto, aby mal pacient zvýšené krvné hladiny alebo aby sa inak súčasne uplatnili pozitívne účinky každej aktívnej prísady (alebo stratégie). V niektorých výhodnejších uskutočneniach vynálezu je napríklad do jediného farmaceutického prostriedku formulovaná jedna alebo viacero aktívnych prísad. V inom uskutočnení vynálezu je poskytovaná súprava, ktorá obsahuje aspoň dve samostatné nádoby, kde sa z pohľadu aktívnej prísady nachádzajúcej sa v nádobe obsahy aspoň jednej nádoby čiastočne alebo úplne líšia od obsahu aspoň jednej inej nádoby.

Kombinované terapie, ktoré sú tu diskutované, zahŕňajú tiež použitie jednej aktívnej prísady (z kombinácie) pri výrobe lieku určeného na liečbu (alebo zníženie rizika) takého ochorenia, ktorého liečba alebo prevencia zahŕňajú ešte inú aktívnu prísadu kombinácie podľa vynálezu. V jednom uskutočnení vynález napríklad poskytuje použitie SERMu pri príprave lieku, ktorý je určený na použitie v kombinácii s estrogénom in vivo, určeného na liečbu ľubovoľného ochorenia, u ktorého sa predpokladá, že bude predložená kombinovaná terapia účinná (t.j. osteoporóza, kardiovaskulárne ochorenia, hypercholesterolémia, hyperlipidémia, ateroskleróza, hypertenzia, inzulínová odolnosť, diabetes, obezita, návaly horúčavy, potenie, nepravidelná menštruácia, Alzheimerova choroba, problémy s rozpoznávaním, akékoľvek symptómy súvisiace s menopauzou a vaginálna suchota). V inom uskutočnení vynález poskytuje použitie estrogénu, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorá sa skladá zo 17E-estradiolu, esterov 17b-estradiolu (t.j. benzoátu, cypionátu, dietanátu, valerátu a pod.), 17aestradiolu, esterov 17a-estradiolu, estriolu, esterov estriolu, estrónu, esterov estrónu, konjugovaného estrogénu, ekvilínu, esterov ekvilínu, 17a-etynylestradiolu, esterov 17aetynylestradiolu, dienestrolu, mestranolu, esterov mestranolu, DES, fytoestrogénu (ov), tibolónu, etyndiolu, pri príprave lieku určeného v kombinácii so SERMom na použitie pri liečbe akéhokoľvek z týchto ochorení.

estrogénoch je známe, že stimulujú množenie epitelových buniek prsníka a predpokladá sa, že samotné množenie buniek tým, že akumuluje náhodné genetické chyby, ktoré môžu viesť k nádorovému ochoreniu, zvyšuje riziko karcinómu (Preston Martin a kol., Cancer. Res. 50: 7415 až 7421, 1990). Na základe tohto konceptu boli antiestrogény zahrnuté do prevencie karcinómu prsníka prostredníctvom zníženia rýchlosti bunkového delenia stimulovaného estrogénmi.

Strata cyklu vaječníkov, ktorá bola zistená u samíc Sprague-Dawley potkana po 10 mesiacoch života, je sprevádzaná zvýšením estrogénu v sére a hladín prolaktínu a zníženín androgénu v sére a koncentrácií progesterónu (Lu a kol, 61^3tAnnual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. tt 134),

1979) Táng a kol., Biol. Reprod. 31: 399 až 413, 1984; Russo a kol., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Intergument and Mammary Glands 252 až 266, 1989; Sortino a

Wise, Endocrinology 124: 90 až 96, 1989; Cardy, Vet. Pathol.

28: 139 až 145, 1991). Tieto hormonálne zmeny, ktoré sa spontánne vyskytujú u stárnucich samíc potkana, sú spojené s multiohniskovým množením a so zvýšením vylučovanej aktivity acino/alveolárnych tkanív a s rozšírením kanálika mliečnej žľazy a s tvorbou cýst (Boorman a kol., 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139 až 145, 1991). Je potrebné uviesť, že hyperplastické a neoplastické zmeny mliečnej žľazy samice potkana, sú často sprevádzané zvýšenými hladinami estrogénov a prolaktínu (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25 až 42, 1980). Liečba pomocou EM-800, čo je ŠERM podľa predkladaného mliečnej vynálezu, indukuje atrofiu charakterizované znížením veľkosti a štruktúr a nulovou vylučovacou aktivitou, antiestrogénovú aktivitu EM-800 v prípade žľazy, čo je počtu lobulárnych čo naznačuje silnú mliečnej žľazy (Luo a kol. Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

O estrogénoch je známe, že znižujú cholesterol v sére,ale zvyšujú alebo nemajú žiadny vplyv na hladiny triglyceridov v sére (Love a kol., Ann. Intern. Med. 115: 860 až 864, 1991; Waľsch a kol., New Engl. J. med. 325: 1196 až 1209, 1991; Barrett-Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl. 5A) : 40S až 43S, 1993; Russell a koľ., Atherosclerosis 100: 113 až 122, 1993; Black a koľ., J. Clin. Invest. 93: 63 až 69, 1994; Dipippo a koľ., Endocrinology 136: 1020 až 1033, 1995; Ke a koľ., Endocrinology 136: 2435 až 2441, 1995). Obr. IA a IB ukazujú, že EM-800 vykazuje ako hypocholesterolemické tak aj hypotriglyceridemické účinky u potkanov, čím ukazuje svoj jedinečný účinok na profil lipidov v sére, ktorý je značne odlišný od iných SERMov ako je tamoxifén (Bruning a kol., Br.J.Cancer 58: 497 až 499, 1988; Love a kol., J.Natl.Cancer Inst. 82: 1327 až 1332, 1990; Dipippo a kol., Endocrinology 136: 1020 až 1033, 1995; Ke a kol., Endocrinology 136: 2435 až 2441, 1995), droloxifén (Ke a kol., Endocrinology 136:2435 až 2441, 1995) a raloxifén (Black a kol., J. Clin. Invest. 93: 63 až 69, 1994). Predpokladá sa teda, že kombinácia estrogénu a EM-800 by mala zabrániť hypocholesterolemickým a hypotriglyceridemickým účinkom EM-800, a teda sa predpokladá, že táto kombinácia by mohla mať pozitívny vplyv na lipidy v sére.

Je potrebné uviesť, že profil sérových lipidov u potkanov a ľudí je značne odlišný. Avšak pretože mechanizmus sprostredkovaný estrogénovým receptorom je súčasťou hypocholesterolemického vplyvu estrogénov aj antiestrogénov (Lundeen a kol., Endocrinology 138: 1552 až 1558, 1997), zostávajú potkany modelom, ktorý je možné použiť na štúdium vplyvov estrogénov a antiestrogénov na zníženie cholesterolu u ľudí.

Prostredníctvom podávania kombinácie dvoch liekov sme tiež študovali potenciálnu interakciu inhibičného účinku nového antiestrogénu (EM-800) s účinkom prekurzora pohlavného steroidu (DHEA) na rast xenoimplantátov ľudského karcinómu prsníka ZR75-1 u holých myší. Obr. 2 a 3 ukazujú, že DHEA v daných používaných dávkach spôsobuje 50 až 80 % inhibíciu rastu nádora, zatiaľ čo takmer úplnú inhibíciu rastu nádora, ktorá sa dosiahne pri nízkej dávke antiestrogénu, DHEA neovplyvňoval. Podobný účinok bol pozorovaný u EM-800 a progesterónu, MPA na rast stimulovaný E₂ karcinómu mliečnej žľazy, ktorý bol indukovaný DMBA u potkana po ovariektómii, čo je ukázané na obr. 4.

Určité obmedzenia pri meraní minerálnej hustoty kostí (BMD) sú dobre známe. Ako príklad je možné uviesť, že zatiaľ čo meranie BMD nevykazuje žiadnu zmenu u potkanov liečených steroidným antiestrogénom ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1 až 9, 1993), inhibičné zmeny boli pomocou histomorfometrie pozorované (Gallagher a kol., Endocrinology 133: 2787 až 2791, 1993). Podobné odlišnosti boli zistené u tamoxifénu (Jordán a kol., Breast Cancer Res. Treat. 10: 31 až 35, 1987; Sinouga a kol., Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71 až 79, 1996) .

Je potrebné uviesť, že znížená minerálna hustota kostí nie je abnormalitou spojenou len so zníženou silou kosti (návody pre preklinické a klinické hodnotenie činidiel používaných pri prevencii alebo na liečbu postmenopauzálnej osteoporózy,

Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, máj 1994). Je teda dôležité analyzovať zmeny biochemických parametrov metabolizmu kostí, ktoré sú indukované rôznymi zlúčeninami a liečbu s cieľom získania lepších znalostí o ich pôsobení.

Konkrétne je dôležité uviesť, že kombinácia DHEA a EM-800

I vykazovala neočakávane pozitívne účinky na doležíte biochemické parametre metabolizmu kostí. DHEA samotný neovplyvňuje pomer hydroxyprolín/kreatinín v moči, čo je znak resorpcie kostí. Okrem toho nebol detegovaný žiadny účinok DHEA na denné vylučovanie vápnika alebo fosforu do moču (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997). Zlúčenina EM-800 znížila pomer hydroxyprolín/kreatinín o 48 %, ale podobne ako DHEA nebol pozorovaný žiadny účinok EM-800 na vylučovanie vápnika a fosforu do moču. Okrem toho EM-800 nevykazovala žiadny vplyv na aktivitu alkalickej fosfatázy, čo je znak tvorby kostí, ale DHEA zvýšil hodnotu tohto parametra o asi 75 % (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

Jeden z neočakávaných účinkov kombinácie DHEA a EM-800 sa vzťahuje k pomeru hydroxyprolín/kreatinín v moči, znaku resorpcie kostí. Tento pomer bol v prípade, keď boli kombinované DHEA a EM-800 znížený o 69 %. Táto hodnota je štatisticky odlišná (p < 0,01) od 48 % inhibície dosiahnutej pomocou samotného EM-800, samotný DHEA nevykazoval žiadny účinok. Prídavok DHEA k EM-800 teda zvyšuje o 50 % inhibičný vplyv EM-800 na reabsorpciu kostí. Najdôležitejšia je skutočnosť, že ďalším neočakávaným účinkom prídavku DHEA k EM800 bol približne 84 % pokles obsahu vápnika v moči (z 23,17 +

1,55 na 3,71 ± 0,75 mikrpmol/24 hod/100 g (p < 0,01) a 55 % pokles obsahu fosforu v moči (zo 132,72 ± 6,08 na 59,06 ± 4,76 mikromol/24 h/100 g (p < 0,01) (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

Tabuľka 1

MOČ	SÉRUM tALP (KJ/I)
SKUPINA	VÁI’NÍK (μιηοΙ/24 h/100 g)	FOSFOR (pmol/24 h/100 g)	HP/Cr (pmol/mtnol)
kontrola	23,17 ± 1,55	132.72 ± 6.08	13,04 ±2,19	114,25 ± 14,04
DHEA (10 mg)	25,87 ± 3,54	151,4 1 + 14,57	14,02 ± 1,59	198,38 ± 30,76*
EM-800 (75 pg)	17,44 ± 4,5	102,03 ±25,13	6,81 ± 0,84“	1 14,1 1 ± 1 \|,26
DHEA + Ľ M-800	3,71 ±0,75“	59,06 ± 4,76“	4,06 ± 0,28“	204,38 ± 14,20“

Je zaujímavé tiež uviesť, že silnému inhibičnému účinku EM-800 na cholesterol v sére nie je možné súčasnou liečbou DHEA zabrániť (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

Aj keď raloxifén a podobné zlúčeniny zabraňujú úbytku kostí a znižujú hladinu cholestorolu v sére (ako estrogény), malo by byť uvedené, že ak by bol raloxifén porovnávaný s premarínom z pohľadu BMD, bol účinok raloxifénu na BMD oveľa menší ako účinok premarínu (Minutes of Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Commitee, FDA Thursday, Meeting #68, 20. novembra 1997) .

Úbytok kostí, ktorý je pozorovaný u žien po menopauze, je pravdepodobne spojený so zvýšením rýchlosti resorpcie kosti, ktorá nie je úplne kompenzovaná sekundárnym zvýšením tvorby kostí. Parametre tvorby kostí aj resorpcia kostí sú pri osteoporóze zvýšené a ako resorpcia tak aj tvorba kostí sú inhibované estrogénovou substitučnou terapiou. U inhibičného účinku estrogénovej substitučnej terapie na tvorbu kostí sa teda očakáva, že je výsledkom spojeného mechanizmu resorpcie a tvorby kostí, keď primárne estrogénom indukované zníženie resorpcie kostí sleduje zníženie tvorby kostí (Parfitt, Calcified Tissue International 36 Suppl. 1: S37 až S45, 1984).

Sila pórovitej kosti a následná odolnosť voči zlomeniu nezávisí len na celkovom množstve pórovitej kosti, ale tiež natrámovitej mikroštruktúre, čo je stanovené počtom, veľkosťou a distribúciou trámov. Strata funkcie vaječníkov u žien po menopauze je sprevádzaná významným znížením celkového objemu trámovitých kostí (Melsen a kol., Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70 až 81, 1978; Vakamatsou a kol., Calcified Tissue International 37: 594 až 597, 1985), najmä vo vzťahu k zníženiu počtu a nižšiemu stupňu dĺžky trámu (Weinstein a Hutson, Bone 8: 137 až 142, 1987).

Na uľahčenie kombinovanej terapie podľa vynálezu, berie vynález do úvahy pre všetky tu diskutované indikácie také farmaceutické prostriedky, ktoré zahŕňajú ŠERM a estrogén v jedinom prostriedku určenom na simultánne podávanie. Prostriedok môže byť vhodný na podávanie tradičným spôsobom, kam patrí orálna aplikácia, subkutánna injekcia, intramuskulárna injekcia alebo perkutánna aplikácia. Tieto príklady však nie sú obmedzujúce. V inom uskutočnení je poskytovaná súprava, ktorá zahŕňa jeden alebo viacero SERMov a estrogén buď v oddelených nádobách alebo v jedinom zásobníku. Vyššie opísané farmaceutické prostriedky a súpravy môžu v prípade, že sú použité na liečbu alebo prevenciu osteoporózy, ďalej obsahovať bisfosfonátovú zlúčeninu. Súprava môže zahŕňať zodpovedajúce materiály a to na orálnu aplikáciu, napríklad tablety, kapsule, sirupy a podobné a na transdermálnu aplikáciu, napríklad masti, mlieka, gély, krémy, náplasti uvoľňujúce látku a podobné.

Autori vynálezu predpokladajú, že podanie estrogénov, SERMov a prekurzorov pohlavných hormónov má svoje využitie pri vývoji osteoporózy, hypercholesterolémie, hyperlipidémie, aterosklerózy, hypertenzie, inzulínovej odolnosti, diabetes, obezity, Alzheimerovej choroby a pri liečbe a/alebo znížení výskytu návalov horúčavy a potenia. Aktívne zložky podľa vynálezu (estrogén, ŠERM alebo prekurzor alebo iné) môžu byť formulované a podávané rôznymi spôsobmi. Ak sú aktívne zložky podávané v súlade s predkladaným vynálezom, môžu byť podávané súčasne alebo samostatne.

Aktívna zložka určená na transdermálnu alebo svalovú aplikáciu je výhodnejšie prítomná v množstvách od 0,01 % do 20 % hmotn. celkovej hmotnosti farmaceutického prostriedku, ešte výhodnejšie medzi 2 a 10 %. V prípade perkutánnej aplikácie by mali byť 17B-estradiol, estrón, konjugované estrogénmi v množstvách pohybujúcich sa v rozsahu 0,01 % až 1 %, DHEA alebo 5-diol by mali byť v koncentráciách aspoň 7 %. Aktívna zložka môže byť umiestnená v náplasti, ktorá má určitú štruktúru známu v danej oblasti techniky, napríklad štruktúru uvedenú v EP č. 0 279 982.

Ak je aktívna zložka formulovaná ako masť, mlieko, gél alebo krém, je zmiešaná s vhodným nosičom, ktorý je zlučiteľný s ľudskou pokožkou alebo svalmi a ktorý zvyšuje prenos zlúčeniny kožou alebo svalom. Vhodné nosiče sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú Klucel HF a Glaxal base. Tieto nosiče však nie sú obmedzujúce. Niektoré sú komerčne dostupné, napríklad Glaxal base je dostupný od Glaxal Canada Limited Company. Ďalšie vhodné pomocné látky (vehikulá) je možné nájsť v Koller a Búri, S.T.P. Pharma 3(2), 115 až 124, 1987. Nosičom je výhodne taký nosič, ktorý je(sú) aktívna(e) zložka(y) v danej použitej koncentrácii rozpustná(é) pri teplote okolia. Nosič musí byť dostatočne hustý, aby udržal inhibítor na určitom mieste kože alebo svalu, kam je prostriedok aplikovaný. Nesmie dochádzať k pohybu alebo odpareniu a to počas obdobia, ktoré je dostatočne dlhé na to, aby bolo umožnené preniknutie prekurzoru cez danú určitú oblasť kože alebo svalu do krvi, kde bude spôsobovať žiadúci klinický účinok. Typickým nosičom je zmes niekoľkých zložiek napríklad farmaceuticky prijateľných rozpúšťadiel a zahusťovadiel. Zmes organických a anorganických rozpúšťadiel napríklad voda a alkohol ako je etanol môže ovplyvniť hydrofilnú a lipofilnú rozpustnosť.

Výhodnejšími prekurzormi pohlavných steroidov sú dihydroepiandrosterón (DHEA) (dostupný od Diosynth Inc., Chigaco, Illinois, USA).

Nosič môžu tiež zahŕňať rôzne aditíva, ktoré sú bežne používané u mastí a mliek a ktoré sú dobre známe v kozmetike a lekárstve. Prítomné môžu byť napríklad vône, antioxidanty, parfémy, gélové činidlá, zahusťovadlá ako sú karboxymetylcelulóza, povrchovo aktívne činidlá, stabilizátory, zmäkčovadlá, farbivá a iné podobné činidlá, ak ide o použitie pri liečbe systémových ochorení, na kožu také, aby bolo možné koncentrácii aktívnej zložky a pokožky aktívnou zložkou.

malo by byť miesto aplikácie vyhnúť sa nadmernej lokálnej prípadne nadmernej stimulácii

Liečba v súlade s vynálezom môže trvať neobmedzene dlho.

Estrogénová zlúčenina, steroidu a/alebo bifosfonát a môžu byť formulované s látkami napríklad vysušenou celulózou a stearátom horečnatým určených na orálnu aplikáciu.

ŠERM a/alebo prekurzor pohlavného môžu byť aplikované orálnou cestou vhodnými farmaceutickými pomocnými laktózou, mikrokryštalickou do tabliet alebo kapsúl

Aktívna látka môže že je zmiešaná citrát sodný, a väzbovými alebo deriváty ako je byť spracovaná do tabliet alebo s tuhými práškovými nosičovými uhličitan činidlami celulózy.

dražé a látkami vápenatý alebo fosforečnan ako je polyvinylpyrolidón, Niekedy môžu byť pridané tiež lubrikanty ako je stearát horečnatý, laurylsíran sodný, Carbowax alebo polyetylénglykol. v prípade orálnej aplikácie je možné samozrejme pridať látky to tak, ako j e vápenatý želatína zlepšujúce chuť.

použiť uzavretú tuhú kapsulu, aj mäkké želatínové kapsule napríklad glycerín, látku výhodnejšie vo plnidlami ako je manitol, škroby ako je zemiakový škrob deriváty celulózy alebo vysoko dispergované U mäkkých želatínových kapsúl je aktívna rozpustená alebo sú

Ako ďalšiu formu je možné napríklad tvrdú želatínu, ale obsahujúce zmäkčovadlo alebo plastifikátor, Uzavreté tuhé kapsule obsahujú aktívnu forme granulátu napríklad vo forme zmesi s laktóza, sacharóza, manitol, škroby ako je alebo amylopektín, kyseliny kremičité, látka výhodnejšie kvapalinách ako polyetylénglykoly.

rastlinné suspendovaná vo oleje alebo vhodných kvapalné do kože

Mlieko, masť, tak, aby nebol zreteľne nemala byť v tejto oblasti umývaná tak dlho pokiaľ neprenikne takmer celé množstvo cez kožu t.j. výhodnejšie aspoň 4 hodiny a ešte výhodnejšie aspoň 6 hodín.

gél alebo krém by vidieť žiadny mali byť votrené zvyšok a pokožka by potom

Náplasť na pokožku môže byť použitá na dopravenie prekurzora v súlade so známymi technikami. Je väčšinou aplikovaná oveľa dlhšie, napríklad 1 až 4 dni, ale aktívna zložka je väčšinou v kontakte s menším povrchom, čo umožňuje pomalé a konštantné uvoľňovanie aktívnej zložky.

Veľa transdermálnych systémov na dopravenie liekov, ktoré boli vyvinuté a ktoré sa používajú, sú tiež vhodné na dopravenie aktívnej zložky podľa predkladaného vynálezu. Rýchlosť uvoľňovania je väčšinou regulovaná difúziou matrice alebo prechodom aktívnej zložky cez regulačnú membránu.

Mechanické aspekty prostriedkov určených na transdermálny prenos sú dobre známe u potkana a sú vysvetlené napríklad v US patentoch 5 162 037, 5 154 922, 5 135 480, 4 666 441, 4 624 665, 3 742 951, 3 797 444, 4 568 343, 5 064 654, 5 071 644, 5 071 657, ktoré sú tu začlenené ako odkaz. Ďalšie informácie sú poskytnuté v EP 0 279 982 a v britkej patentovej prihláške 2 185 187.

Prostriedky môžu byť ľubovoľného typu, ktorý je známy v danej oblasti techniky a medzi ne patrí adhezívna matrica a prostriedky zásobníkového typu. Prostriedok môže obsahovať matrice s liekom začlenené do vlákien, ktoré absorbujú aktívnu zložku a/alebo nosič. U zariadenia zásobníkového typu môže byť zásobník definovaný polymérovou membránou, ktorá je nepriepustná pre nosič a aktívnu zložku.

Prostriedok na transdermálny prenos udržiava aktívnu zložku v kontakte so žiaducim povrchom pokožky. U tohto prostriedku je viskozita nosiča aktívnej zložky menej dôležitá ako u krému alebo gélu. Rozpúšťadlový systém na transdermálny postup môže zahŕňať napríklad kyselinu olejovú, lineárny alkoholový laktát a dipropylénglykol alebo ďalšie rozpúšťadlá, ktoré sú v danej oblasti techniky známe. Aktívna zložka môže byť rozpustená alebo suspendovaná v nosiči.

Na pripojenie na kožu môže byť náplasť pripevnená na adhezívnu pásku, ktorá má uprostred dierkovanú časť. Adhezívna časť je výhodne pokrytá pásikom, ktorý sa pri aplikácii odstráni a ktorého cieľom je chrániť lepivú časť predtým, ako bude použitá. Typickým materiálom, ktorý je vhodný na následné odstránenie je polyetylén alebo polyetylénom potiahnutý papier a výhodnejšie silikónom potiahnutý papier, ktorý sa ľahko odstraňuje. Pri aplikácii náplasti je pásik, ktorý sa odstráni jednoducho stiahnutý a adhezivna časť je priložená na pokožku pacienta. V US patente 5 135 480, ktorý je tu zahrnutý ako odkaz, Bannon a kol. opisujú alternatívny prostriedok, ktorý zahŕňa nelepivý spôsob pripevnenia na pokožku. Len je nevyhnutné, aby ŠERM, estrogén a prípadne prekurzor pohlavného steroidu boli podané takým spôsobom a v takej dávke, ktoré sú dostatočné na to, aby bolo možné dosiahnuť žiadúce koncentrácie v krvnom sére. V súlade s kombinovanou terapiou podľa predkladaného vynálezu je koncentrácia SERMu udržiavaná v rozsahu žiaducich parametrov rovnako ako je udržiavaná v žiaducich parametroch koncentrácia estrogénu.

Ak je použitý estradiol, mala by byť koncentrácia estradiolu v sére udržiavaná medzi 50 a 300 ng/1, výhodnejšie medzi 100 a 200 ng/1 a najvýhodnejšie medzi 150 a 175 ng/1. Ak je použitý iný estrogén, môže sa koncentrácia v sére líšiť, čo je známe a z to toho dôvodu, aby bol zahrnutý rozdiel v estrogénovej aktivite vo vzťahu k estradiolu a aby boli dosiahnuté bežné hladiny estrogénu pred menopauzou. Nižšia koncentrácia je potrebná napríklad v prípade použitia Mestranolu. Zodpovedajúce hladiny estrogénu v sére môžu byť určené tiež prostredníctvom straty výskytu symptómov menopauzy. Koncentrácia druhej zlúčeniny danej kombinovanej terapie (napríklad EM-652.HC1) v sére je väčšinou udržiavaná medzi 1 a 15 mikrog/1, v niektorých uskutočneniach medzi 2 a 10 mikrog/1 alebo medzi 5 a 10 mikrog/1.

Estrogénom je výhodnejšie estradiol, ale môže to byť estrónsulfát sodný alebo akákoľvek iná zlúčenina, ktorá pôsobí ako antagonista estrogénového receptora. V prípade, že ide o oddelené podávanie zlúčenín, je možné použiť komerčne dostupné doplnky estrogénu, napríklad PREMARIN dostupný od Ayerst (St.-Laurent, Quebec, Kanada). Jedným výhodnejším prekurzorom pohlavného steroidu je DHEA, aj keď DHEA-S a analógy, ktoré budú uvedené nižšie, sú na účely definované nižšie tiež účinné. U bežných pacientov sa dávka estrogénu, potrebná na dosiahnutie žiadúcich koncentrácií v sére, pohybuje medzi 0,3 a 2,5 mg

PREMARINu za deň a na 50 kg telesnej hmotnosti a to v prípade, že je podávaný orálne. V určitých uskutočneniach vynálezu môže byť estrogénom 17h-estradiol aplikovaný perkutánne formou náplasti, ktorá je dostupná od CIBA pod názvom ESTRADERM, kde sa denná dávka pohybuje medzi 0,05 a 0,2 mg/1 deň a 50 kg telesnej hmotnosti. Valerianát 17E-estradiolu, ktorý je dostupný od Squibb pod obchodným názvom DELESTOGEN, je podávaný formou injekcie.

Ďalšími výhodnejšími produktmi estrogénového lieku podía vynálezu sú: náplasti obsahujúce 17B-estradiol dostupné od Berlex Canada pod obchodným názvom CLIMARA alebo od Novartis Pharma pod obchodným názvom VIVELLE; vaginálny prostriedok obsahujúci 17B-estradiol dostupný od Pharmacia & Upjohn pod obchodným názvom ESTRING; gél obsahujúci 17B-estradiol dostupný od Schering pod obchodným názvom ESTROGEL; krém obsahujúci dienoestrol dostupný od JANSSEN-ORTHO pod obchodným názvom ORTHO DINESTROL.

V niektorých výhodnejších uskutočneniach je estrogén podávaný orálne. Napríklad rozmelnený 17B-estradiol dostupný od Roberts pod obchodným názvom ESTRACE; etinylestradiol od Schering Canada pod obchodným názvom ESTINYL; estrónsulfát (estropipát) dostupný od PHARMACIA-UPJOHN pod obchodným názvom OGEN.

V niektorých uskutočneniach je namiesto estrogénu uprednostňovaná zmesná zlúčenina estrogén/androgén. Jednou z uvedených zlúčenín je Tibolone [(7a, (7a)-17hydroxy-7-metyl19-norpregn-5(10)-én-20yn-3-ón; č. patentu US 3 340 279 (1967); US 3 475 465 (1969) a Endocrinological profile opísaný v J. de Visser a kol., Alzneimittel-Forsch, 34, 1010, 1984], dostupný od ORGANON (Holandsko) pod obchodným názvom LIVIAL.

Liekové výrobky obsahujúce zmes estrogénu a progestínu alebo androgénu sú tiež výhodné. Uvedené lieky sú dostupné od Novaris Pharma pod obchodným názvom ESTRACOM, od Sabex pod obchodným názvom CLIMACTERON.

Systém dopravujúci aktívnu látku podľa vynálezu prekutánne alebo svalovo môže byť použitý tiež ako nový a zlepšený systém určený na prevenciu a/alebo liečbu osteoporózy alebo iných ochorení.

Je možné použiť akýkoľvek estrogén použitý spôsobom, ktorý odporúča výrobca. Príslušné dávky sú v danej oblasti známe. Podľa vynálezu môže byť použitá akákoľvek zlúčenina alebo zmes zlúčenín, ktoré majú estrogénovú aktivitu alebo podobnú aktivitu alebo agonistickú aktivitu voči estrogénovým receptorom (fytoestrogény, syntetické estrogény a pod.).

Selektívny modulátor estrogénového receptora podľa vynálezu má molekulárny vzorec s nasledujúcimi znakmi: a) dva aromatické kruhy spojené 1 alebo 2 atómami uhlíka, obidva aromatické kruhy sú buď nesubstituovaná alebo substituované hydroxyskupinou alebo skupinou premenenou in vivo na hydroxyl; a b) postranný reťazec s aromatickým kruhom a funkciou terciárneho amínu alebo jeho soli.

Jedným výhodným SERMom podľa vynálezu je zlúčenina EM-800 uvedená v PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Molekula EM-800 má štruktúru podľa vzorca ľ:

(D

Ďalším výhodným SERMom podľa vynálezu je EM-01538 podľa vzorca II:

a (II)

EM-1538 (tiež nazývaný EM-652.HC1) je hydrochloridová soľ silného antiestrogénu EM-652, v porovnaní s EM-800, a je jednoduchšia a ľahšie pripraví teľná soľ. Je tiež ľahké ju izolovať, prečistiť, je kryštalizovateľná a v tuhej fázy vykazuje dobrú stabilitu. Čo sa týka podávania EM-800 aj EM1538, predpokladá sa, že výsledkom in vivo je rovnaká aktívna zlúčenina.

Medzi ďalšie výhodnejšie SERMy podľa vynálezu patria tamofixén ((Z)-2-[4- (1,2-difenyl-l-butenyl)fenoxy]-N,N-dimetyletánamín) dostupný od Zeneca (VB), toremifén ((Z)-2-[4-(4chlór-1,2-difenyl-l-butenyl)fenoxy]-N,N-dimetyletánamín) dostupný od Orion-Farmos Pharmaceutical, Fínsko alebo ScheringPlough, droloxifén ( (E)-3-[1-[4-[2-(dimetylamino)etoxy]fenyl]2-fenyl-l-butenyl]fenyl) a CP-336 156 (lazofoxifén) (cis-lR[4 '-pyrolidín-etoxyfenyl]-2S-fenyl-6-hydroxy-l, 2,3,4-tetrahydronaftalén D-(-)-vinánová soľ (Pfizer Inc., USA), raloxifén ( [2- (4-hydroxyfenyl)-6-hydroxybenzo[b]tien-3-yl] [4-[2- (1piperidinyl)etoxy]fenyl]-metanón hydrochlorid) (Eli Lilly and Co., USA), LY-335 563 (6-hydroxy-3-[4-[2-(1-piperidinyl)etoxy]fenoxy]-2-(4-hydroxyfenyl)benzo[b]tiofénhydrochlorid) a LY 353 381 (arzoxifén, 6-hydroxy-3-[4-[2-(l-piperidinyl)etoxy]fenoxyl]-2-(4-metoxyfenyl)benzo[b]tiofén hydrochlorid) (Eli Lilly and Co., USA), idoxifén ((E)-1-[2-[4-[1-(4-jódfenyl)-2-fenyl-lbutenyl] fenoxy]etyl]pyrolidín (SmithKline Beecham, USA), levormeloxifén (3,4-trans-2,2-dimetyl-3-fenyl-4-[4-(2- (2-pyrolidin-l-yl)etoxy)fenyl]-7-metoxychroman (Novo Nordisk, A/S, Dánsko), ktoré sú uvedené v Shalmi a kol., WO 97/25 034, WO 97/25 035, WO 97/25 037, WO 97/25 038); a Korsgaard a kol., WO 97/25 036, GW 5 638 (opísané Wilsonom a kol., Endocrinology, 138(9), 3901 až 3911, 1997) a indolové deriváty (vynájdené

Millerom a kol. EP 0 802 183 Al) a zlúčenina TSE 424 vyvinutá Wyeth Ayers (USA) a vynájdená v JP10036347 (Američan horne^ products corporation) a nesteroidné estrogénové deriváty opísané vo WO 97/32837. Tiež sem patria iroxifén (TAT 59; (E) —

- [1- [4-[2-(dimetylamino)etoxy] fenyl]-2-[4-(1-metyletyl)fenyl]1-butenyl]fenoldihydrogénfosfát od Taiho (Japonsko), FC 1271 ( (Z)-2-[4-(4-chlór-l,2-difenyl-l-butenyl)fenoxy]etanol) od

Orión (Fínsko), HMR 3339 a HMR 3656 od Hoechts Marion Roussel, SH 646 od Schering AG, Nemecko, ERA 923 od Wyeth Ayerst (USA), LY 335 124 a LY 326 315 od Eli Lilly (USA).

Je možné použiť akýkoľvek ŠERM používaný na daný účinok a to spôsobom, ktorý je odporúčaný výrobcom. Príslušné dávky sú v danej oblasti techniky známe. Akýkoľvek iný nesteroidný komerčne dostupný antiestrogén môže byť tiež použitý podľa vynálezu. Môže byť použitá akákoľvek zlúčenina, ktorá má podobnú aktivitu ako ŠERM (napríklad: raloxifén).

SERMy podávané v súlade s vynálezom sú výhodnejšie podávané v dávkach, ktoré sa pohybujú v rozsahu 0,01 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti za deň (výhodnejšie 0,05 až 1,0 mg/kg), s dávkou 5 mg za deň, najmä 10 mg/deň, v dvoch rovnakých dávkach, ktoré sú výhodnejšie pre osoby s priemernou telesnou hmotnosťou a to vtedy, keď sú podávané orálne alebo v dávkach pohybujúcich sa medzi 0,003 až 3,0 mg/kg telesnej hmotnosti za deň (výhodnejšie 0,015 až 0,3 mg/ml), s 1,5 mg/deň, najmä 3,0 mg/deň, v dvoch rovnakých dávkach v prípade osôb s priemernou telesnou hmotnosťou a to vtedy, keď sú podávané parenterálne (t.j. intramuskulárne, subkutánne alebo perkutánne). Výhodnejšie sú SERMy podávané spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom, čo je opísané nižšie.

Medzi výhodné bifosfonáty podľa vynálezu, ktoré sú podávané ako aktívna zložka kombinovanej terapie určenej na liečbu osteoporózy, patria alendronat [kyselina (4-amino-lhydroxybutylidénôbifosfónová, sodná soľ, hydrát] dostupný od

Merck Shape and Dohme pod obchodným názvom Fosamax, [kyselina bisetanol] názvami (1-hydroxyetylidén) bis fosfónová], 2, dostupný od Procter and Gambie pod Didrocal a Didronel, Clodronat soľ] dostupný Benefos alebo

Didronel, (dichlórmetylén)bifosfónová, sodná Poulenc Rorer pod obchodným názvom Boehringer Mannheim pod obchodným (kyselina soľ) dostupný od Geigy pod obchodným názvom (kyselina (l-hydroxy-2-(3-pyridinylôetylidén soľ) je vo fáze klinického vývoja. Podľa názvom (3-amino-l-hydroxypropylidén)bis etidronat [2'-iminoobchodnými [kyselina od Rhonedostupný od

Ostac a Pamidronat fosfónová, sodná Aredia. Rizedronat bifosfónová, sodná vynálezu sa môžu použiť akékoľvek ďalšie komerčne dostupné bisfosfonáty, všetky v dávkach odporúčaných výrobcom. Podobne prekurzory pohlavných steroidov môžu byť využité v dávkach, ktoré sú odporúčané v stave techniky, výhodnejšie v dávkach, ktoré obnovujú cirkulujúce hladiny na hladiny, ktoré majú zdraví muži vo veku 20 až 30 rokov alebo dospelé ženy pred menopauzou.

Z pohľadu všetkých tu odporúčaných dávok by však mal lekár odozvu u jednotlivých pacientov sledovať a podľa toho dávkovanie upraviť.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje účinok 9 mesačnej liečby DHEA (10 mg, perkutánne, jedenkrát denne) alebo EM-800 (75 mikrog, orálne, jedenkrát denne) samostatnými alebo v kombinácii na hladiny triglyceridov (A) a cholesterolu (B) v sére potkana. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SEM. p < 0,01 experimentálna vs. zodpovedajúca kontrola.

Obr. 2 ukazuje: A) Vplyv zvýšenia dávok DHEA (0,3 mg, 1,0 mg alebo 3,0 mg) podávaných perkutánne dvakrát denne na priemernú veľkosť nádora ZR-75-1 u holých myší po ovariektómii (OVX) , ktoré sú substituované estrónom. Ako ďalšie kontroly boli použité kontrolné OVX myši, ktoré dostávali len samotné vehikulum. Počiatočná veľkosť nádora sa uvažovala ako 100 %. DHEA bol podávaný perkutánne (p. c.) do chrbtovej kože vo forme 0,02 ml roztoku 50 % etanol - 50 % propylénglykol. B) Vplyv 9,5 mesačnej liečby zvýšenými dávkami DHEA alebo EM-800 samotného alebo v kombinácii na hmotnosť nádora ZR-75-1 u OVX holých myší substituovaných estrónom. “, p < 0,01, liečené vs. kontrolné OVX myši substituované estrónom.

Obr. 3 ukazuje vplyv zvyšujúcich sa orálnych dávok antiestrogénu EM-800 (15 mikrog, 50 mikrog alebo 100 'mikrog) alebo vplyv perkutánne aplikovaných dávok DHEA (0,3, 1,0 alebo 3,0 mg) kombinovaných s EM-800 (15 mikrog) alebo vplyv samotného EM-800 (A) aplikovaných počas 9,5 mesiaca na priemernú veľkosť nádora ZR-75-1 u OVX holých myší po ovariektómii substituovaných estrónom. Počiatočná veľkosť nádora sa uvažovala ako 100 %. Kontrolné OVX myši, ktoré dostávali samotné vehikulum, boli použité ako ďalšie kontroly. Estrón bol podávaný jedenkrát denne subkutánne v dávke 0,5 mikrog, zatiaľ čo DHEA bol rozpustený v roztoku 50 % etanol 50 % propylénglykol a bol aplikovaný dvakrát denne v objeme 0,02 ml do chrbtovej kože. Porovnanie sa uskutočnilo tiež s OVX zvieratami, ktoré dostávali samotné vehikulum.

Obr. 4 ukazuje vplyv 65 dennej liečby antiestrogénom EM800 v dávkach 0,25 a 2,5 mg na kg telesnej hmotnosti (orálne, jedenkrát denne) alebo medroxyprogesterónacetátom (MPA, 1 mg s.c.; dvakrát denne) alebo kombináciou EM-800 (0,25 mg/kg telesnej hmotnosti) a MPA na rast karcinómu prsnikovej žľazy indukovaný DMBA, ktorý je stimulovaný pomocou Ei (1,0 mikrog, s.c., dvakrát denne) u potkanov po ovariektómii. Zmena veľkosti nádora je vyjadrená ako % pôvodnej veľkosti. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SEM.

Obr. 5 ukazuje vplyv 37 týždennej liečby zvyšujúcimi sa dávkami (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 a 1 mg/kg) EM-800 alebo raloxifénu na hladiny celkového cholesterolu v sére u potkana po ovariektómii. Porovnanie sa uskutočnilo so zdravými krysami a so zvieratami po ovariektómii, ktoré boli nositeľmi implantátu 175-estradiolu (E₂); p < 0,01, experimentálne vs. OVX kontrolné krysy.

Obr. 6 ukazuje vplyv zvyšujúcich sa koncentrácií EM-800, (Z)-4-OH-tamoxifénu, (Z)-4-OH-toremifénu a raloxifénu na aktivitu alkalickej fosfatázy u ľudských buniek Ishikawa. Aktivita alkalickej fosfatázy bola meraná po 5 dennom pôsobení zvýšených koncentrácií uvedených zlúčenín v prítomnosti alebo neprítomnosti 1,0 nM E₂. Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SEM štyroch jamiek. Ak sa SEM prekrýva s použitými symbolmi, je uvedený len symbol (Simard, Sanchez a kol., 1997).

Obr. 7 ukazuje blokovanie stimulačného účinku (Z)-4-OHtamoxifénu, (Z)-4-OH-toremifénu, droloxifénu a raloxifénu na aktivitu alkalickej fosfatázy prostredníctvom antiestrogénu EM800 u ľudských karcinómových buniek Ishikawa. Aktivita alkalickej fosfatázy bola meraná po 5 dennom pôsobení koncentrácií indikovaných zlúčenín 3 alebo 100 nM v prítomnosti alebo neprítomnosti 30 alebo 100 nM EM-800. Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SD ôsmich jamiek s výnimkou kontrolných skupín, kde sú dáta získané zo 16 jamiek (Simard, Sanchez a kol., 1997) .

Obr. 8 ukazuje porovnanie vplyvu štandardnej HRT (estrogén) a ŠERM (EM-652) na parametre menopauzy. Prídavok ŠERM k štandardnej HRT bude pôsobiť proti potenciálnym negatívnym účinkom estrogénov.

Obr. 9 ukazuje, že stimulačný účinok tamoxifénu na rast xenoimplantátov ľudského karcinómu prsníka ZR-75-1 je súčasným podávaním EM-652.HC1 úplne blokovaný. Zlúčenina EM-652.HC1 nemá v neprítomnosti tamoxifénu samotná, v súlade so svojou čisto antiestrogénovou aktivitou, na rast nádora žiadny vplyv.

Obr. 10 ukazuje rezy pršníkovou žľazou potkana.

A. Neliečené zviera. Lalôčiky (L) sa skladajú z niekoľkých alveol. Inzert. Alveoly vykazujúce vysoký stupeň zväčšenia.

B. Zviera liečené EM-800 (0,5 mg/kg, b w za deň) počas 12 týždňov. Veľkosť lalôčikov (L) je znížená. Inzert. Atrofické alveolárne bunky vykazujúce vysoký stupeň zväčšenia.

Obr. 11 ukazuje rezy endometriom potkana.

A. Neliečené zviera. Luminálne epitelium (LE) je charakterizované stĺpcovitými epitelovými bunkami, zatiaľ čo žľazovité epitelium (GE) je skôr kvadrovité. Stroma obsahuje niektoré bunkové elementy a kolagénové vlákna.

B. Zviera liečené EM-800 (0,5 mg/kg, b w za deň) počas 12 týždňov. Výška luminálneho epitelu je viditeľne zmenšená. Žľazovité epitelové bunky majú cytoplazmu bez škvŕn, bez príznakov aktivity. Stroma je, vzhľadom na zníženie intracelulárnych prvkov stromy, vysoko celulárna.

Obr. 12 ukazuje vplyv zvyšujúcich sa koncentrácií EM652.HC1, lazofoxifénu (voľná zásada; aktívne a inaktívne enantioméry) a raloxifénu podávaných orálne počas 9 dní myšiam po ovariektómii, ktoré sú súčasne liečené estrónom, na hmotnosť maternice. * p < 0,05, p < 0,01 vs. kontroly liečené Ei.

Obr. 13 ukazuje vplyv zvyšujúcich sa koncentrácii EM652 .'HCI, lazofoxifénu (voľná zásada; aktívne a inaktivne enantioméry) a raloxifénu podávaných orálne počas 9 dní myšiam po ovariektómii, ktoré sú súčasne liečené estrónom, na hmotnosť vagíny. p < 0,01 vs. kontroly liečenej Ei.

Obr. 14 ukazuje vplyv 1 mikrog a 10 mikrog EM-652.HC1, lazofoxifénu (voľná zásada; aktívne a inaktivne enantioméry) a raloxifénu podávaných orálne počas 9 dní myšiam po ovariektómii na hmotnosť maternice. p < 0,01 vs. OVX kontrola.

Obr. 15 ukazuje vplyv 1 mikrog a 10 mikrog EM-652.HC1, lazofoxifénu (voľná zásada; aktívne a inaktivne enantioméry) a raloxifénu podávaných orálne počas 9 dní myšiam po ovariektómii na hmotnosť vagíny. p < 0,01 vs. OVX kontrola.

Obr. 16 ukazuje vplyv 26 týždennej liečby pomocou E₂, EM652. HCI, E₂ + EM-652. HCI, DHEA, DHEA + EM-652.HC1 a DHEA + EM652.HCI + E₂ na BMD bedernej chrbtice u OVX potkanov, ktorí majú diagnostikovanú osteopeniu. Zdravé kontrolné a kontrolné OVX zvieratá boli zahrnuté ako kontrolné skupiny.

Obr. 17 ukazuje vplyv 26 týždennej liečby pomocou E₂, EM652. HCI, E₂ + EM-652. HCI, DHEA, DHEA + EM-652. HCI a DHEA + EM652.HCI + E₂ na BMD stehennej kosti u OVX potkanov, ktorí majú diagnostikovanú osteopeniu. Zdravé kontrolné a kontrolné OVX zvieratá boli zahrnuté ako kontrolné skupiny.

Obr. 18 ukazuje vplyv 26 týždennej liečby pomocou E₂, EM652. HCI, E₂ + EM-652. HCI, DHEA, DHEA + EM-652. HCI a DHEA + EM652.HCI +.E₂ na celkový telesný tuk u OVX potkanov, ktorí majú diagnostikovanú osteopeniu. Zdravé kontrolné a kontrolné OVX zvieratá boli zahrnuté ako kontrolné skupiny.

Obr. 19A ukazuje vplyvy antiestrogénov na rast nádora ZR75-1. Vplyv liečby 7 antiestrogénmi počas 161 dní na rast ľudských nádorov prsníka ZR-75-1, ktorý je indukovaný estrónom, u holých myší po ovariektómii. Veľkosť nádora je vyjadrená ako percento pôvodnej plochy nádora (deň 1 = 100 %) . Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SEM (n = 18 až 30 nádorov/skupinu; ## p < 0,01 vs. EM-652.HC1; p < 0,01 vs. OVX. Antiestrogény boli podávané orálne jedenkrát denne v dávke 50 mikrog/myš za súčasnej stimulácie estrónom, ktorá sa dosiahla pomocou subkutánnych 0,5 cm silastických implantátov obsahujúcich estrón a cholesterol v pomere 1 : 25.

Obr. 19B ukazuje vplyvy antiestrogénov na rast nádora ZR75-1. Je ukázaný vplyv liečby 7 antiestrogénmi počas 161 dní na rast ľudských nádorov prsníka ZR-75-1 u holých myší po ovariektómii. Veľkosť nádora je vyjadrená ako percento pôvodnej plochy nádora (deň 1 = 100 %). Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SEM (n = 18 až 30 nádorov/skupinu; ## p < 0,01 vs. EM-652.HC1;

p < 0,01 vs. OVX. Antiestrogény boli podávané orálne jedenkrát denne v dávke 100 mikrog/myš a bez súčasnej stimulácie estrogénom.

Obr. 19C ukazuje účinky antiestrogénov na rast nádora ZR75-1. Je uvedený vplyv liečby 7 antiestrogénmi počas 161 dní na rast ľudských nádorov prsníka ZR-75-1 u holých myší po ovariektómii. Veľkosť nádora je vyjadrená ako percento pôvodnej plochy nádora (deň 1 = 100 %). Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SEM (n = 18 až 30 nádorov/skupinu; ## p < 0,01 vs. EM-652.HC1;

p < 0,01 vs. OVX. Antiestrogény boli podávané orálne jedenkrát denne v dávke 200 mikrog/myš a bez súčasnej stimulácie estrogénom.

Obr. 20A ukazuje účinky antiestrogénov na klasifikáciu odozvy. Je uvedený vplyv 161 dennej liečby 7 antiestrogénmi na klasifikáciu odozvy ľudských nádorov prsníka ZR-75-1 u holých myší po ovariektómii. Úplná regresia identifikuje tie nádory, ktoré nebolo možné na konci liečby detegovať; čiastočná regresia zodpovedá tým nádorom, ktoré sa zmenšili o > 50 % svojej pôvodnej veľkosti; stabilná odozva sa vzťahuje k nádorom, ktoré sa zmenšili o < 50 % alebo ktoré sa zväčšili o < 50 %; a progresia naznačuje, že sa nádory zväčšili v porovnaní so svojou pôvodnou veľkosťou o viac ako 50 %. Antiestrogény boli podávané orálne jedenkrát denne v dávke 50 mikrog/myš pri stimulácii estrónom, ktorá sa dosiahla pomocou subkutánnych 0,5 cm silastických implantátov obsahujúcich estrón a cholesterol v pomere 1 : 25.

Obr. 20B ukazuje účinky antiestrogénov na klasifikáciu odozvy. Je uvedený vplyv 161 denného podávania 7 antiestrogénov na klasifikáciu odozvy ľudských nádorov prsníka ZR-75-1 u holých myši po ovariektómii. Úplná regresia identifikuje tie nádory, ktoré nebolo možné na konci liečby detegovať; čiastočná regresia zodpovedá tým nádorom, ktoré sa zmenšili o > 50 % svojej pôvodnej veľkosti; stabilná odozva sa vzťahuje k nádorom, ktoré sa zmenšili o < 50 % alebo ktoré sa zväčšili o 50 %; a progresia naznačuje, že sa nádory v porovnaní so svojou pôvodnou veľkosťou zväčšili o viac ako 50 %. Antiestrogény boli podávané orálne jedenkrát denne v dávke 200 mikrog/myš bez stimulácie estrogénom.

Obr. 20C ukazuje účinky antiestrogénov na klasifikáciu odozvy. Je uvedený vplyv 161 denného podávania 7 antiestrogénov na klasifikáciu odozvy ľudských nádorov prsníka ZR-75-1 u holých myši po ovariektómii. Úplná regresia identifikuje tie nádory, ktoré nebolo možné na konci liečby detegovať; čiastočná regresia zodpovedá tým nádorom, ktoré sa zmenšili o > 50 % svojej pôvodnej veľkosti; stabilná odozva sa vzťahuje k nádorom, ktoré sa zmenšili ’o < 50 % alebo ktoré sa zväčšili o < 50 %; a progresia naznačuje, že sa nádory v porovnaní so svojou pôvodnou veľkosťou zväčšili o viac ako 50 %. Antiestrogény boli podávané orálne jedenkrát denne v dávke 200 mikrog/myš bez stimulácie estrogénom.

Obr. 21 ukazuje účinok EM-652.HC1, podávaného počas 2 týždňov prostredníctvom zvyšujúcich sa denných dávok pohybujúcich sa v rozsahu od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na hmotnosť maternice u potkanov po ovariektómii, ktorí sú denne substituovaní orálne podávanou dávkou 17B-estradiolu (2 mg/kg). Ako ďalšie kontroly sú používané zdravé zvieratá.

Obr. 22 ukazuje vplyv EM-652.HC1, podávaného počas 2 týždňov prostredníctvom zvyšujúcich sa denných dávok pohybujúcich sa v rozsahu od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na výšku epitelu endometria u potkanov po ovariektómii, ktorí sú denne substituovaní orálne podávanou dávkou 175-estradiolu (2 mg/kg). Ako ďalšie kontroly sú používané zdravé zvieratá.

Obr. 23. Hematoxylínom a eozínom fixované rezy maternicou krysy, ktoré ilustrujú bunky epitelovej výstelky získané zo zdravého kontrolného (A) , OVX kontrolného (B) , OVX + E₂ (2 mg/kg) (C) a OVX + E₂ + EM-652.HC1 (3 mg/kg) potkana liečeného počas 14 dní. Stimulačný účinok estradiolu na bunky epitelu endometria bol zrušený súčasným podávaním EM-652.HC1 (zväčšenie: X 700). BM: bazálna membrána.

Obr. 24 ukazuje vplyv EM-652.HC1, podávaného počas 2 týždňov prostredníctvom zvyšujúcich sa denných dávok pohybujúcich sa v rozsahu od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na hmotnosť vagíny u potkanov po ovariektómii, ktorí sú denne substituovaní orálne podávanou dávkou 17fi-estradiolu (2 mg/kg). Ako ďalšie kontroly sú používané zdravé zvieratá.

Obr. 25 ukazuje vplyv EM-652.HC1, podávaného počas 2 týždňov prostredníctvom zvyšujúcich sa denných dávok pohybujúcich sa v rozsahu od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na hladinu cholesterolu v sére u potkanov po ovariektómii, ktorí sú denne substituovaní orálne podávanou dávkou 17B-estradiolu (2 mg/kg). Ako ďalšie kontroly sú používané zdravé zvieratá.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

U mliečnej žľazy sú androgény tvorené z prekurzora steroidu dehydroepiandrosterónu (DHEA) . Klinický dôkaz naznačuje, že androgény majú inhibičné účinky na karcinóm prsníka. Estrogény naopak stimulujú vývoj a rast karcinómu prsníka. Sledovali sme vplyv samotného DHEA alebo v kombinácii s novoopísaným čistým antiestrogénom EM-800 na rast xenoimplantátov nádora tvoreného líniou buniek ľudského karcinómu prsníka ZR-75-1 u holých myší po ovariektómii.

Myši bola aplikovaná denná dávka 0,5 mikrog estrónu (estrogénový hormón) bezprostredne po ovariektómii subkutánne injekciou. EM-800 (15,50 alebo 100 mikrog) bolo aplikované orálne jedenkrát denne. DHEA bol aplikovaný dvakrát denne (celková dávka 0,3, 1,0 alebo 3,0 mg) do chrbtovej kože buď samostatne alebo v kombinácii s 15 mikrog dennou orálnou dávkou

EM-800. Zmeny veľkosti nádora ako odozva na podanie lieku, boli vyhodnocované pravidelne a boli vzťahované k meraniam, ktoré boli uskutočnené prvý deň. Na konci experimentov boli nádory vyrezané a odvážené.

U myši po ovariektómii, ktoré dostali samotný estrón, bolo po 9,5 mesiacoch zistené 9,4 násobné zvýšenie veľkosti nádora v porovnaní s myšami, ktoré estrón nedostávali. Aplikácia 15, 50 alebo 100 mikrog EM-800 myšiam po ovariektómii, ktoré boli substituované estrónom viedla k 88 %, 93 % a 94 % inhibíciám veľkosti nádora. Naopak DHEA v dávkach 0,3, 1,0 alebo 3,0 mg inhiboval konečnú hmotnosť nádora o 67 %, 82 % a 85 %. Porovnateľné inhibície veľkosti nádora sa dosiahli pri aplikácii dennej orálnej dávky EM-800 15 mikrog s rozdielnymi dávkami perkutánne aplikovaného DHEA alebo bez nich.

U holých myší zlúčeniny DHEA a EM-800 nezávisle na sebe potláčali rast estrónom stimulovaných xenoimplantátov nádorov ZR-75-1. Aplikácia DHEA v definovaných dávkach nemenila inhibičný účinok EM-800.

Materiály a metódy

Bunky ZR-75-1

Bunky ZR-75-1 ľudského karcinómu prsníka sa získali zo zbierky Američan Type Culture Collection (Rockville, MD) a boli kultivované vo forme monovrstvy v médiu RPMI 1640 obohatenom 2 mM L-glutamínom, 1 mM pyruvátom sodným, 100 IU penicilínu/ml, 100 mikrog streptomycínu/ml a 10 % zárodočným hovädzím sérom. Kultivácia prebiehala vo vlhčenej atmosfére 95 % vzduch / 5 % CO₂ pri teplote 37 °C. Podmienky sú opisované v Poulin a Labrie, Cancer Res. 46: 4933 až 4937, 1986; Poulin a kol., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213 až 225, 1988. Bunky boli pasážované jedenkrát týždenne po ošetrení roztokom 0,05 % trypsín : 0,02 % EDTA (hmotn./obj .) . Bunkové kultúry, ktoré boli použité na experimenty opísané v tejto prihláške, boli odvodené z pasáže 93 línie buniek ZR-75-1.

Zvieratá

Homozygotné samice atymické Harlan Sprague-Dawley (nu/nu) myši (28 až 42 dni staré) boli získané od HSD (Indianopolis,

Indiana, USA). Myši boli umiestnené do vinylových klietok s filtrom vzduchu umiestnenom na vrchu digestora s laminárnym prúdením vzduchu a bolo tu udržiavané prostredie bez patogénov. Klietka, prostriedky určené na spanie a potrava boli pred použitím autoklávované. Voda bola autoklávovaná, okyslená na pH 2,8 a poskytnutá myšiam ad libitum.

Inokulácia buniek

Myši boli podrobené obojstrannej ovariektómii (OVX) a to jeden týždeň predtým, ako sa v anestézii uskutočnila inokulácia nádorových buniek prostredníctvom intraperitonálnej injekcie Avertinu (amylakohol: 0,8 g/100 ml 0,9 % NaCl; a tribrometanol: 2 g/100 ml 0,9 % NaCl) v dávke 0,25 ml/zviera. Po ošetrení monovrstvy roztokom 0,05 % trypsín/0,02 % EDTA (hmotn./obj.) bolo 1,5 x 10⁶ buniek ZR-75-1 v logaritmickej fáze rastu zobratých, bunky boli suspendované do 0,1 ml kultivačného média s obsahom 25 % Matrigelu a boli prenesené subkutánne do obidvoch bokov zvierat. S týmto cieľom boli použité ihly s dĺžkou 2,54 cm (1 inch) a vnútorným priemerom 20 G, čo bolo opísané už skôr (Dauvois a kol., Cancer Res. 51: 3131 až 3135, 1991). Aby bol uľahčený rast nádorov, dostávalo každé zviera denne počas 5 týždňov subkutánnu injekciu 10 mikrog estradiolu (E₂) vo vehikule zloženom z 0, 9 % NaCl, 5 % etanolu a 1 % želatínu. Potom, ako boli zistené zjavné nádory ZR-75-1, bol priemer nádora zmeraný pomocou posuvného meradla. Na štúdium potom boli vybrané tie myši, ktoré mali priemer nádora medzi 0,2 a 0,7 cm.

Hormonálna liečba

Všetky zvieratá s výnimkou tých, ktoré patrili do kontrolnej OVX skupiny, dostali dennú subkutánne injekciou aplikovanú dávku 0,5 mikrog estrónu (E?) v 0,2 ml roztoku 0,9 % NaCl, 5 % etanol a 1 % želatína. V naznačených skupinách bol DHEA podávaný perkutánne dvakrát denne v dávkach 0,3, 1,0 alebo

3,0 mg/zviera, ktoré boli aplikované v objeme 0,02 ml do chrbtovej kože mimo oblasť rastu nádora. DHEA bol rozpustený v zmesi 50 % etanol, 50 % propylénglykol. EM-800, ((+)-7pivaloyloxy-3-(4'-pivaloyloxyfenyl)-4-mety1-2-(4''-(2’'-piperidinoetoxy)fenyl)-2H-benzopyrán), bol syntetizovaný postupom, ktorý bol opísaný už skôr (Gauthier a kol., J. Med. Chem. 40: 2117 až 2122, 1997) v divízii lekárskej chémie v Laboratory of Molecular Endocrinology of CHUL Research Center. EM-800 bol rozpustený v zmesi 4 % (obj.) etanol, 4 % (obj.) polyetylénglykol (PEG) 600, 1 % (hmotn./obj .) želatína a 0, 9 % (hmotn.) NaCI. Zvieratá daných skupín dostali orálne denné dávky 15 mikrog, 50 mikrog alebo 100 mikrog samotného EM-800 alebo v kombinácii s DHEA, zatiaľ čo zvieratá z OVX skupiny dostali len samotné vehikulum (0,2 ml zmesi 4 % etanol, 4 % PEG 600, 1 % želatína, 0,9 % NaCI). Nádory boli merané jedenkrát týždenne pomocou Vernierovho meradla. Boli odmerané dva kolmé priemery v cm (L a W) a plocha nádora (cm²) bola vypočítaná podľa vzorca: L/2 x W/2 x π (Dauvois a kol., Cancer Res. 51: 3131 až 3135, 1991). Plocha odmeraná prvý deň liečby bola uvažovaná ako 100 % a zmeny veľkosti nádora boli vyjadrené ako percento pôvodnej veľkosti nádora. V prípade podkožných nádorov nie je možné presne odčítať trojrozmerný objem nádora, preto boli teda merané len plochy nádorov. Po 291 dňoch (alebo 9,5 mesiacoch) liečby boli zvieratá usmrtené.

Klasifikácia odoziev sa uskutočnila už opísaným spôsobom (Dauvois a kol., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299 až 306, 1989; Dauvois a kol., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891 až 897, 1989, Labrie a kol., Breast Cancer Res. Treat. 33: 237 až 244, 1995). Skrátene, čiastočná regresia zodpovedá tým nádorom, ktoré sa zmenšili na 50 % alebo viac svojej pôvodnej veľkosti; stabilná odozva sa vzťahuje k nádorom, ktoré sa zmenšili o menej ako 50 % svojej pôvodnej veľkosti alebo ktoré sa zväčšili o menej ako 50 % svojej pôvodnej veľkosti, zatiaľ čo úplná regresia sa vzťahuje k tým nádorom, ktoré nebolo možné na konci liečby detegovať. Progresia sa vzťahuje k tým nádorom, ktoré sa v porovnaní so svojou pôvodnou veľkosťou zväčšili o viac ako 50 %. Na konci experimentu boli všetky zvieratá usmrtené dekapitáciou. Nádory, maternica a vagína boli bezprostredne odobraté, boli očistené od spojivových a tukových tkanív a boli odvážené.

Štatistická analýza

Štatistická významnosť účinkov liečby na veľkosť nádora bola určená pomocou variačnej analýzy (ANOVA), ktorá berie do úvahy účinky DHEA, EM-800, čas a opakované merania uskutočnené u rovnakých zvierat na začiatku a konci liečby (subjekty v rámci skupiny daného faktora). Opakované merania v čase 0 a po 9,5 mesiacoch liečby tvorili randomizované bloky zvierat. Čas je teda analyzovaný ako účinok vnútri tohto bloku, zatiaľ čo obidve liečby sú hodnotené medzi jednotlivými blokmi. Do modelu boli zahrnuté všetky interakcie medzi hlavnými účinkami. Význam liečebných faktorov a ich interakcii bol analyzovaný pomocou subjektov v rámci skupiny ako chybový člen. Dáta boli zlogaritmované. Hypotézy, ktoré sú na pozadí ANOVA predpokladali normálne rozdelenie rezudií a homogenitu rozptylu.

A posteriori párové porovnania sa uskutočnili s použitím Fischerovho testu pre najmenší významný rozdiel. Hlavné účinky na telesnú hmotnosť a hmotnosť orgánu a interakcie liečby boli analyzované pomocou štandardného dvojitého triedenia ANOVA s interakciami. Všetky ANOVA boli uskutočnené pomocou SAS programu (SAS Inštitúte, Čary, NC, USA) . Významnosť rozdielov bola deklarovaná pomocou 2-stranného testu s celkovou hladinou významnosti 5 %.

Kategorické dáta boli analyzované pomocou KruskallWallisovho testu pre poradové porovnanie meranej odozvy (celková odozva, čiastočná odozva, stabilná odozva a progresia nádora). Po celkovom ohodnotení účinkov liečby boli analyzované podsúbory výsledkov uvedených v tabuľke 4 určujúce kritickú phodnotu pre násobné porovnávanie. Presné p-hodnoty boli vypočítané pomocou programu StatXact (Cytel, Cambridge, MA, USA) .

Dáta sú vyjadrené ako stredná hodnota ± štandardná odchýlka (SEM) pre 12 až 15 myší v každej skupine.

Výsledky

Ako je uvedené na obr. 2A ľudské nádory ZR-75-1 sa u holých myší po ovariektómii, ktoré boli liečené dennou dávkou

0,5 mikrog estrónu aplikovanou podkožné, za 294 dní (9,5 mesiaca) zväčšili 9,4-krát, zatiaľ čo u kontrolných OVX myší, ktoré dostávali samotné vehikulum, sa veľkosť nádora počas štúdie znížila na 36,9 % svojej pôvodnej hodnoty.

Liečba zvyšujúcimi sa dávkami perkutánne aplikovaného DHEA spôsobila narastajúcu inhibíciu rastu nádora ZR-75-1 stimulovaného Εχ. Inhibícia 50,4 %, 76,8 % a 80,0 % sa dosiahla po 9,5 mesiacoch liečby dennými dávkami DHEA pripadajúcimi na jedno zviera 0,3 mg, 1,0 mg (obr. 2A) . V súlade s poklesom nástupu nádora viedla liečba pomocou DHEA k zreteľnému zníženiu priemernej hmotnosti nádora na konci experimentu. Priemerná hmotnosť nádora poklesla z 1,12 ± 0,26 g u kontrolných holých myší po ovariektómii substituovaných Εχ na 0,37 ± 0,12 g (P = 0, 005), 0,20 ± 0,06 g (P = 0,001) a 0,17 ± 0,06 g (P = 0, 0009) u skupín zvierat, ktoré denne dostávali 0,3, 1,0 a 3,0 mg DHEA (obr. 2B).

Pri denných dávkach 15 mikrog, 50 mikrog a 100 mikrog inhiboval po 9,5 mesiacoch antiestrogén EM-800 veľkosť estrogénom stimulovaného nádora o 87,5 % (P < 0,0001), 93,5 % (P < 0, 0001) a 94,0 % (P < 0, 0003) (obr. 3A) v porovnaní s veľkosťou nádora u kontrolných zvierat. Jednotlivé zníženia veľkosti nádora, ktoré sa dosiahli pri rôznych dávkach EM-800, sa významne nelíšia. Ako je ukázané obr. 2B, hmotnosť nádora na konci 9,5 mesačnej štúdie bola znížená z 1,12 ± 0,26 g u kontrolných OVX myší substituovaných Εχ na 0,08 + 0,3 g, 0,03 ± 0,01 g a 0,04 ± 0,03 g u zvierat liečených dennými dávkami EM800 15 mikrog, 50 mikrog a 100 mikrog (P < 0,0001 u všetkých dávok EM-800 vs. OVX substituované Εχ) .

Ako je uvedené vyššie, spôsoboval antiestrogén EM-800 v dennej orálne aplikovanej dávke 15 mikrog 87,5 % inhibíciu rastu nádora stimulovaného estrogénom. Meranie prebiehalo počas 9,5 mesiaca. Prídavok DHEA v troch použitých dávkach nemal na už zreteľnú inhibíciu veľkosti nádora, ktorá bola dosiahnutá s 15 mikrog dennou dávkou antiestrogénu EM-800, významný účinok (obr. 5B). Priemerná hmotnosť nádora bola podstatne znížená a to z 1,12 + 0,26 g u kontrolných myší substituovaných estrónom na 0, 08 + 0,03 g (P < 0, 0001), 0, 11 ± 0,04 g (P = 0,0002), 0,13 ± 0,07 g (P = 0,0004) a 0,08 ± 0,05 g (P < 0,0001) u zvierat, ktoré dostávali denne dávku 15 mikrog samotného antiestrogénu alebo v kombinácii s 0,3, 1,0 a 3,0 mg DHEA (medzi 4 skupinami nebol zistený významný rozdiel) (obr. 2B).

Predmetom záujmu bolo tiež otestovať kategórie odoziev, ktoré boli dosiahnuté pri vyššie uvedených liečbach. Liečba zvyšujúcimi sa dávkami DHEA znížila, aj keď nie až na hladinu štatistickej významnosti (P = 0,088), počet progresívnych nádorov, a to z 87,5 % u kontrolných OVX zvierat substituovaných estrónom na 50,0 %, 53,3 % a 66,7 % u zvierat liečených dennými dávkami 0,3, 1,0 a 3,0 mg DHEA (tab. 1). Úplné odozvy sa naopak zvýšili z 0 % u estrónom substituovaných myší na 28,6 %, 26,7 % a 20,0 % u zvierat, ktoré dostávali denne perkutánne aplikovanú dávku DHEA 0,3, 1,0 a 3,0 mg.

Stabilné odozvy 12,5 %, 21,4 %, 20,0 % a 13,3 % boli naopak odmerané u kontrolných myší substituovaných E} a u troch skupín zvierat, ktoré dostávali vyššie uvedené dávky DHEA. U kontrolných myší po ovariektómii bol podiel úplnej, čiastočnej a stabilnej odozvy odmeraný ako 68,8 %, 6,2 % a 18,8 %, zatiaľ čo progresia bola zistená len u 6,2 % nádorov (tab. 2) .

Úplná odozva alebo zmiznutie nádorov sa dosiahlo u 29,4 %, 33,3 %, 26,7 % a 35,3 % nádorov u zvierat, ktoré dostávali samotný antiestrogén EM-800 (P = 0,0006) (15 mikrog) alebo v kombinácii s 0,3 mg, 1,0 mg alebo 3,0 mg EDTA (tab. 2) . Progresia bola naopak pozorovaná u 35,3 %, 44,4 %, 53,3 % a

17,6 % nádorov rovnakej skupiny zvierat. Medzi skupinami liečenými samotným EM-800 alebo v kombinácii s DHEA nebol žiadny významný rozdiel.

Žiadny významný účinok DHEA alebo EM-800 nebol pozorovaný ani na telesnú hmotnosť upravenú na hmotnosť nádora. Liečba OVX myší estrónom zvyšovala hmotnosť maternice z 28 ± 5 mg u kontrolných OVX myší na 132 ± 8 mg (P < 0,01), ale zvyšujúce sa dávky DHEA spôsobili progresívnu, ale relatívne malú inhibíciu stimulačného účinku estrónu, ktorá dosiahla pri najvyššej použitej dávke DHEA 26 % (P = 0,0008). Z rovnakého obrázku je zrejmé, že hmotnosť estrónom stimulovanej maternice bola znížená zo 132 ± 8 mg u kontrolných estrónom substituovaných myší na 49 ± 3 mg, 36 ± 2 mg a 32 ± 1 mg (P < 0, 0001 vo všetkých dávkach vs. kontrola) u denných orálne podávaných dávok 15 mikrog, 50 mikrog alebo 100 mikrog EM-800 (celkové P < 0,0001). V prípade kombinácie 15 mikrog EM-800 s 0,3 mg, 1,0 mg alebo 3,0 mg dennou dávkou DHEA, bola hmotnosť maternice odmeraná ako 46 ± 3 mg, 59 ± 5 mg a 69 ± 3 mg.

Na druhej strane liečba estrónom zvyšovala hmotnosť vagíny zo 14 ± 2 mg u kontrolných OVX zvierat na 31 ± 2 mg (P < 0,01), ale prídavok DHEA nemal žiadny významný účinok. Hmotnosť vagíny bola po liečbe dennou dávkou 15 mikrog, 50 mikrog alebo 100 mikrog EM-800 znížená na 23 ± 1 mg, 15 ± 1 mg a 11 ± 1 mg (celkové p a párové P < 0,0001 pre všetky dávky vs. kontrola). U kombinácie s 0,3 mg, 1,0 mg alebo 3,0 mg dávkami DHEA a EM800 bola hmotnosť vagíny 22 ± 1 mg, 25 ± 2 mg a 23 + 1 mg (N.S. pre všetky skupiny vs. 15 mikrog EM-800). Je potrebné uviesť, že u najvyšších použitých dávok EM-800, najmä 100 mikrog denne, došlo k zníženiu hmotnosti maternice u estrónom substituovaných OVX zvierat na hodnotu, ktorá sa však žiadnym spôsobom nelíšila od hodnoty pre OVX' kontroly, zatiaľ čo hmotnosť vagíny bola znížená na hodnotu nižšiu ako bola· hodnota odmeraná u OVX kontrol (P < 0,05). DHEA pravdepodobne vďaka svojim androgénnym účinkom čiastočne pôsobí proti účinku EM-800 na hmotnosť maternice a vagíny.

Tabuľka 2

Vplyv perkutánne aplikovaného DHEA alebo orálne aplikovaného EM-800 podávaných počas 9,5 mesiaca samostatne alebo v kombinácii na odozvy (úplná, čiastočná, stabilná a progresia) u xenoimplantátov ľudského nádora prsníka ZR-75-1 u holých myší

SKUPINA	CELKOVÝ POČET ZVIERAT	úplná	KATEGÓRIA ODOZVY	progresia.
čiastočná	stabilná počet a (”/<>)
OVX		16	1 1 (68.8)	1 (6 2)	3 (18 8)	1 (6.2)
OVX < EI (0.5 pg)		16	0 (0)	0 (0)	2(120	14 (87.5)
()VX<E1 (0.5 ug)< DHEA	0 3 mg	14	4 (28.6)	0(0)	3(21.4)	7 (50.0)
	1 0 mg	15	4 (26.7)	d (0)	5 (20.0)	8 (54.3)
	3.0 mg	15	3 (20.0)	0 (0)	2(0 3)	10 (66.7)

OVX«I:I (0.5 pg)t EM-800	15 pg	17	5 (“29.4)	1 (5 9)	5 (29.4 j	6 (35.3)
	50 pg	16	4 (25.0)	3 (18.8)	5(3 1.2)	4 (25.0)
	100 pg	16	8 (50.0)	o (0)	3 (1X.8)	5(31.2)
OVX t EJ (O.Spg) 4	0 3 mg	18	(> ( V3.3)	0 (0)	4 (22.2)	8 (44.4)
EM-X00 'DHEA	1 0 mg	15	4 (26,7)	0(0)	3 (20 0)	8 (53.3)
	3.0 mg	17	6 (35.3)	0 (0)	8 (47 ])	3 (17.6)
			____________	I	...... 1

EI = estrón; DHEA = dehydroepiandrosterón; OVX = po ovariektómi i

Príklad 2

Androsten-3B-17B-diol (5-diol) vykazuje skutočnú estrogénovú aktivitu. Ďalej môže byť ako prekurzor pohlavného steroidu v periférnych intrakrinných tkanivách prevedený na aktívne androgény a/alebo iné prekurzory. S cieľom zhodnotenia relatívneho významu činnosti androgénových a estrogénových zložiek 5-diolu na kostnú hmotu boli potkany vo veku 21 týždňov podrobený ovariektómii a potom boli liečení perkutánne aplikovanou dennou dávkou 2, 5 alebo 12,5 mg samotného 5-diolu alebo v kombinácii s antiendrogénom Flutamid (FLU, 10 mg, s.c., jedenkrát denne) a/alebo antiestrogénom EM-800 (10 mikrog,

s.c., jedenkrát denne) počas 12 mesiacov. Minerálna hustota kostí (BMD) bola meraná po 11 mesiacoch liečby. Ovariektómia (OVX) viedla k 12,8 % poklesu BMD stehennej kosti (p < 0,01), zatiaľ čo liečba najvyššími dávkami 5-diolu obnovila 34,3 % stehennú BMD, k strate ktorej došlo počas 11 mesiacov po ovariektómii (p < 0,01). Súčasné podávanie FLU úplne zabránilo stimulačnému účinku 5-diolu na BMD stehennej kosti, ale výsledkom prídavku EM-800 bola v porovnaní s účinkom samotného 5-diolu ďalšia 28,4 % simulácia. Súčasné podávanie 5-diolu, FLU a EM-800 ukazovalo účinok len EM-800 (27 %), pretože účinok 5diolu zlúčenina FLU úplne blokovala. Porovnateľné výsledky boli získané u BMD bedrovej chrbtice, aj keď BMD bedernej chrbtice u OVX potkanov, ktorí dostávali 12,5 mg samotného 5-diolu, 12,5 mg 5-diolu + EM-800 alebo 5-diol + FLU + EM-800, bola obnovená späť na hodnoty, ktoré sa žiadnym spôsobom nelíšili od hodnôt zdravých zvierat. Histomorfometrická analýza ukázala, že stimulačné účinky 5-diolu na objem kosti, počet trámov a inhibičný účinok na separáciu trámov sekundárnej metafyzeálnej oblasti proximálnej holennej kosti boli účinkom FLU zrušené, zvyšované i fosfatázy po liečbe % vrátená naspäť

Liečba 5-diolom na pomer vápnika vplyvom EM-800. Zrejmá

5-diolom je (p < 0,01 vs.

nemala žiadny a kreatinínu ďalej alkalickej

FLU z 57 diolu). účinok dávka 5-diolu spôsobila významné 23 % (p stimulácia súčasným 12,5 mg významný moči .

ale boli aktivity podaním samotného inhibičný Najvyššia zníženie cholesterolu v sére, zatiaľ čo prídavok EM-800 hladinu cholesterolu v sére o 62 % (p < 0,01). Predložené dáta jasne ukazujú stimulačný účinok 5-diolu na tvorbu kostí a predpokladajú, že aj keď 5-diol je slabý estrogén, je jeho stimulačný účinok na tvorbu kostí sprostredkovaný prevažne androgénovým účinkom. Okrem toho ďalšie stimulačné účinky EM

800 a 5-diolu na kostnú hmotu ukazujú účinok vedúci k šetreniu kosti antiestrogénu EM-800 u potkanov. Aktivita 5-diolu a EM800, ktorá znižuje cholesterol, by mohla mať významné využitie pri prevencii kardiovaskulárnych ochorení.

Príklad 3

Syntéza výhodnej zlúčeniny podľa vynálezu

Syntéza hydrochloridu (S)-(+)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-metyl-2- (4''- (2'’-piperidínetoxy)fenyl)-2H-l-benzopyránu EM-01538 (EM-652.HCI)

Schéma 1

EM 4IS3J

Krok A: BF₃.Et₂O, toluén; 100 °C; 1 h.

Krok____C: 3,4-dihydropyrán, monohydrát kyseliny ptoluénsulfónovej, etylacetát; 25 °C pod dusíkom, 16 hodín, a potom kryštalizácia v izopropanole.

Kroky D, E a F:

(1) piperidín, toluén, pristroj Dean & Stark, reflux pod dusí kom;

(2) 1,8-diazabicyklo[5,4, 0]undek-7-én, DMF, reflux 3 h;

(3) CHjMgCl, THF, -20 až 0 °C a potom laboratórna teplota počas

h. .

Kroky G, H: kyselina (1S)- (+ )-10-gáforsulfónová, acetón, voda, toluén, laboratórna teplota, 48 hodín.

Krok HH: 95 % etanol, 70 °C, potom laboratórna teplota 3 dni.

Krok HHR: recyklovanie v pôvodnom destiláte a premytie podľa kroku HH kyselina (S)-10-gáforsulfónová, reflux; 36 hodín, potom laboratórna teplota počas 16 h.

Krok 1:

(1) DMF vodný, Na₂CO₃, etylacetát;

(2) Etanol, zriedená HCI;

(3) Voda.

Syntéza 2-tetrahydropyranyloxy-4-hydroxy-2'- (4''-tetrahydropyranyloxyfenyl)acetofenónu (4)

Suspenzia 2,4-dihydroxy-2(4''-hydroxyfenyl)acetofenónu 3 i (dostupný od Chemsyn Science Laboratories, v 3,4-dihydropyráne (218 ml, 3,39 mol) a ošetrená monohydrátom kyseliny p0,158 mmol) pri teplote 25 °C.

počas 16 h pod dusíkom a nebola (97,6 g, 0,4 mol) Lenexa, Kansas) etylacetáte (520 toluénsulfónovej zmes bola

Reakčná ml) bola (0,03 g, miešaná zahrievaná. Zmes bola potom premytá roztokom uhličitanu (1 g) a chloridu sodného (5 g) vo vode

Jednotlivé fázy boli oddelené a soľankou (20 ml). Každé premytie etylacetátu. Všetky organické fázy cez síran sodný.

externe sodného (5 g) vo vode (100 ml) . organická fáza bola premytá bolo opäť extrahované 50 ml boli spojené a prefiltrované bolo

Rozpúšťadlo (asi 600 ml) destilácie za atmosférického tlaku (250 ďalšie izopropanol oddestilované izopropanol oddestilované ml) .

rozpúšťadlo ml). Pri rozpúšťadlo (250 ml) . Roztok bol za

O

Potom bolo pri (asi 300 ml) a atmosférickom odstránené pomocou potom sa pridal atmosférickom tlaku (250 ďalšie pridaný izopropanol ochladený pri teplote asi 25 °C a po asi 12 h tuhá látka odfiltrovaná, premytá (116,5 g, 70 %) .

bol pridaný tlaku bolo (asi 275 ml) stáleho a opäť bol miešania bola kryštalická izopropanolom a vysušená

Syntéza 4-hydroxy-4-metyl-2-(4[2’'-piperidino]fenyl-3-(4’' tetrahydropyranyloxy)-fenyl-7-tetrahydropyranyloxychromanu (10)

Roztok 2-tetrahydropyranyloxy-4-hydroxy-2'-(4''-tetrahydropyranyloxyfenyl)acetofenónu 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-(2-(1piperidín)etoxy]benzaldehydu 5 (594 g, 2,55 mol) (dostupný od

Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) a piperidínu (82,4 g, 0,97 mol) (dostupný od Aldrich Chemical Company Inc.,

Milwaukee, Wisconsin) v toluéne (8 1) bol refluxovaný pod dusíkom s použitím prístroja Dean & Stark dovtedy, pokiaľ nebol získaný jeden ekvivalent vody (44 ml). Toluén (6,5 1) bol z roztoku odstránený destiláciou za atmosférického tlaku. Potom bol pridaný dimetylformamid (6,5 1) a 1, 8-diazabicyklo[5,4,0]undek-7-én (110,5 g, 0,726 mol). Roztok bol trepaný počas asi 8 h pri laboratórnej teplote s cieľom izomerizovať chalkón 8 na chromanón 9 a potom bol pridaný k zmesi vody a ľadu (8 1) a toluénu (4 1) . Jednotlivé fázy boli odseparované a toluénová vrstva bola premytá vodou ( 1). Spojené vodné fázy boli extrahované toluénom (3x4 1). Spojené toluénové extrakty boli nakoniec premyté soľankou (3 x 4 1) , zahustené za atmosférického tlaku na 5,5 1 a potom boli ochladené na -10 °C.

Za vonkajšieho chladenia a miešania pod dusíkom bol pridávaný 3 M roztok chloridu metylhorečnatého v THF (2,5 1, 7,5 mol) (dostupný od Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisc.). Teplota bola udržiavaná pod 0 °C. Po pridaní

Grignardovho činidla bolo odstránené vonkajšie chladenie a zmes sa nechala pri laboratórnej teplote, aby sa zahrievala. Zmes bola pri tejto teplote miešaná počas asi 24 h.

Zmes bola znova ochladená na asi -20 °C a za pokračujúceho vonkajšieho chladenia a miešania bol pomaly pridávaný nasýtený roztok chloridu amónneho (200 ml) , pričom teplota bola udržiavaná pod 20 °C. Zmes bola miešaná 2 h a potom bol pridaný nasýtený roztok chloridu amónneho (2 1) a toluénu (4 1) a zmes bola trepaná počas 5 minút. Jednotlivé fázy boli odseparované a vodná vrstva bola extrahovaná toluénom (2 x 4 1) . Spojené toluénové extrakty boli premývané zriedenou kyselinou chlorovodíkovou tak dlho, pokiaľ roztok nebol homogénny. Potom bol premytý solankou (3x4 1) . Toluénový roztok bol nakoniec zahustený pri atmosférickom tlaku na 2 1. Tento roztok bol použitý priamo v ďalšom kroku.

Syntéza (2R,S)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-metyl-2-(4 ' ' [2-piperidín]etoxy)fenyl)-2H-l-benzopyránovej soli kyseliny (1S)-10-gáforsulfónovej (± 12)

Do toluénového 4-hydroxy-4-metyl-2-(4’-[2''-piperidín]etoxy) fenyl-3-(4' ' '-tetrahydropyranyloxy)-fenyl-7-tetrahydropyranyloxychromanu (10) bol pridaný acetón (6 1), voda (0,3 1) a kyselina (S)-10-gáforsulfónová (561 g, 2,42 mol) (dostupný od Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisc.). Zmes bola trepaná pod dusíkom a potom bola tuhá látka (2R,S)-7-hydroxy-3(4'-hydroxyfenyl)-4-metyl-2-(4''-[2'''-piperidín]etoxy)fenyl)2H-l-benzopyránová sol kyseliny (1S)-10-gáforsulfónovej (12) prefiltrovaná, premytá acetónom a vysušená (883 g). Tento materiál bol použitý v ďalšom kroku (HH) bez ďalšieho prečisťovania.

Syntéza (2S)-7-hydroxy-3-(4’-hydroxyfenyl)-4-metyl-2-(4*'[2'''-piperidín]etoxy)fenyl)-2H-l-benzopyránovej soli kyseliny (1S)-10-gáforsulfónovej (13, (+)-EM-652(1S)-CSA sol)

Suspenzia (2R,S)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-metyl-2(4''-[2'''-piperidín]etoxy)fenyl)-2H-l-benzopyránovej soli kyseliny (1S)-10-gáforsulfónovej (± 12) (759 g) v 95 % etanole bola zahrievaná za stáleho miešania na teplotu asi 70 °C tak dlho, pokiaľ sa tuhá látka nerozpustila. Roztok bol nechaný za stáleho miešania, aby sa ochladil na laboratórnu teplotu, potom bolo pridaných niekoľko kryštálikov (2S)-7-hydroxy-3-(4' hydroxyfenyl)-4-metyl-2-(4''-[2'''-piperidín]etoxy)fenyl)-2H-1benzopyránovej soli kyseliny (1S)-10-gáforsulfónovej 13. Roztok bol miešaný pri laboratórnej teplote počas asi 3 dni. Potom boli kryštály odfiltrované, premyté 95 % etanolom a vysušené (291 g, 76 %). De produktu bolo 94,2 % a čistota 98,8 %.

Syntéza (S)-(+)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-metyl-2-(4' ' (2’’’-piperidínetoxy)fenyl)-2H-l-benzopyrán hydrochloridu EM01538 (EM-652.HCI)

Suspenzia zlúčeniny 13 (soľ EM-652-(+)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) ’v dimetylformamide (11 mikrol, 0,15 mmol) bola ošetrená 0,5 M vodným roztokom uhličitanu sodného (7,0 ml, 3,6 mmol) a bola miešaná počas 15 minút. Suspenzia bola ošetrená etylacetátom (7,0 ml) a bola miešaná 4 h. Organická fáza bola premytá vodným nasýteným roztokom uhličitanu sodného (2 x 5 ml) a soľankou (1 x 5 ml), bola vysušená cez síran horečnatý a zahustená. Roztok výslednej ružovej peny (EM-652) v etanole (2 ml) bol ošetrený 2 N kyselinou chlorovodíkovou (400 mikrol, 0,80 mmol), bol miešaný počas 1 h, ošetrený destilovanou vodou (5 ml) a miešaný 30 minút. Výsledná suspenzia bola prefiltrovaná, premytá destilovanou vodou (5 ml), vysušená na vzduchu a pod vysokým vákuom (65 ’C) s cieľom získať prášok s krémovou farbou (276 mg, 77 %): jemný prášok bielej farby;

skenovacia kalorimetria: nástup vrcholu topenia pri 219 °C, ΔΗ = 83 J/g; [a]²⁴D = 154° v metanole 10 mg/ml. ^JH NMR (300 MHz, CD3OD) δ (ppm) 1, 6 (široký, 2H, H-4' ' ') , 1,85 _; (široký, 4H, H3'' a 5''''), 2,03 (s, 3H, CH₃) , 3,0 a 3,45 (široký, 4H, H2”” a 6' ’ ’ 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-3”'), 4,26 (t, J =

4,9 Hz, 2H, H-2'”), 5,82 (s, 1H, H-2) , 6,10 (d, J = 2,3 Hz,

1H, H-8), 6,35 (dd, J = 8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6) , 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3’ a H-5'), 6,83 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3” a H5”), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2' a H-6'), 7,12 (d, J = 8,4

Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, J = 8, 6 Hz, 2H, H-2” a H-6”); ¹³C RMN (CD₃OD, 75MHz) δ ppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109, 11, 115, 35, 116, 01, 118, 68, 125, 78, 126, 33, 130, 26, 130, 72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158, 96, 159, 33. Elementárne zloženie: C, H, N, Cl: teoreticky: 70,51, 6, 53, 2, 84, 7,18 %. Zistené: 70, 31, 6, 75, 2,65, 6, 89 %.

Príklad 4

Materiál a metódy

Zvieratá

Samice myši BALB/c (BALB/cAnNCrlBR), ktorých hmotnosť bola 18 až 20 g, boli získané od Charles-River Inc. (St.-Constant, Quebec, Kanada) a boli umiestnené po 5 do jednej klietky, v ktorej boli regulované podmienky - teplota (23 ± 1 °C) a svetlo (12 h svetlo/deň, svetlo o 7:15). Myši dostávali potravu pre hlodavcov a bol im umožnený prístup k vode ad Ubítum. Zvieratá boli v anestézii Izofluranom podrobené ovariektómii (OVX) prostredníctvom rezu na obidvoch bokoch a boli náhodne rozdelené do skupín po 10 zvierat. Desať zdravých myší bolo nechaných ako kontrola.

Liečba

V prvom experimente (obr. 12 až 15) boli testované zlúčeniny, konkrétne EM-652.HCl, lazofoxifén (ako voľná zásada;

aktívne a inaktívne enantioméry) a raloxifén, podávané orálne prostredníctvom žalúdočnej sondy jedenkrát denne v dávkach 1, 3 alebo 10 mikrog/zviera. Zlúčeniny boli podávané počas 9 dní, počnúc 2 dňom po ovariektómii. V druhom experimente (tab. 3) bolo orálne podávané TSE 424 prostredníctvom žalúdočnej sondy jedenkrát denne v dávkach 1, 3, 10 alebo 30 mikrog/zviera.

Zlúčenina bola podávaná počas 9 dní, počnúc 2 dňom po ovariektómii. V obidvoch experimentoch, ktorých cieľom bolo zistiť antiestrogénovä aktivitu, bola liečba estrónom (E_lz 0,06 mikrog, s.c. injekcia, dvakrát denne) zahájená 5 dní po ovariektómii a trvala 6 dní. Zlúčeniny boli rozpustené v etanole (4 % konečná koncentrácia) a boli podávané v 0,4 % metylcelulóze. Myši v zdravej skupine a kontrolnej OVX skupine dostávali počas 9 dní samotné vehikulum (4 % etanol - 0,4 % metylcelulóza). Zvieratá boli usmrtené vykrvácaním z brušnej aorty 11 deň ráno po ovariektómii. Maternica a vagína boli ihneď rozrezané, odvážené a uchovávané v 10 % pufrovanom formalíne pre ďalšie histologické vyšetrenia.

Výsledky

Experiment 1

Ako je ukázané na obr. 12 spôsobila zlúčenina EM-652.HC1 podávaná orálne v denných dávkach 1 mikrog, 3 mikrog a 10 mikrog 24 %, 48 % a 72 % inhibíciu estrónom stimulovanej hmotnosti maternice (p < 0,01 pre všetky dávky vs. kontrola), zatiaľ čo raloxifén podávaný v rovnakých dávkach spôsobil 6 % (NS) , 14 % (p < 0,01) a 43 % (p < 0,01) inhibíciu tohto parametra. Na druhej strane lazofoxifén (ako voľná zásada) nemal v najnižšej použitej dávke žiadny inhibičný účinok, zatiaľ čo pri denných dávkach 3 mikrog a 10 mikrog spôsoboval % (p <

stimulovanej lazofoxifénu

0,01) a 44 hmotnosti nevykazoval % (p < 0,01) inhibíciu estrónom maternice. Inaktívny enantiomér v žiadnej použitej dávke žiadny inhibičný účinok na tento parameter.

U zlúčenín uvedených vyššie sa predpokladalo, že budú mať na hmotnosť vagíny podobné účinky. Denná orálna aplikácia EM652.HC1 v dávkach 1 mikrog, 3 mikrog a 10 mikrog (obr. 13) viedla k 10 % (NS), 25 % a 53 % inhibícii hmotnosti vagíny (p < 0,01 pre dve najvyššie dávky), zatiaľ čo raloxifén mal významný 24 % (p < 0,01) inhibičný účinok na tento parameter len v najvyššej dávke (10 mikrog). Podobne ako raloxifén, lazofoxifén (ako voľná účinok len enantiomér účinok na hmotnosť vagíny.

zásada) spôsobil významný 37 % (p < 0,01) v najvyššej použitej dávke, zatiaľ čo nemal v žiadnej použitej dávky žiadny inhibičný inaktívny inhibičný

Ak boli zlúčeniny podávané (bez prítomnosti estrónu) myšiam po ovariektómii samostatne v denných orálnych dávkach 1 mikrog a 10 mikrog, nemal EM-652.HC1 v obidvoch použitých dávkach žiadny významný stimulačný účinok na hmotnosť maternice, zatiaľ čo liečba 10 mikrog lazofoxifénu a raloxifénu spôsobila 93 % (p < 0,01) a 85 % (p < 0,01) stimuláciu hmotnosti maternice (obr. 14), čo naznačuje estrogénový vplyv týchto zlúčenín na daný parameter. Podobne tiež zlúčenina EM652. HC1 vykazovala len malý stimulačný účinok na hmotnosť vagíny (obr. 15), zatiaľ čo podávanie 10 mikrog lazofoxifénu a raloxifénu spôsobilo 73 % (p < 0,01) a 56 % (p < 0,01) stimuláciu hmotnosti vagíny. Naopak inaktívny enantiomér lazofoxifénu nemal na hmotnosť maternice a vagíny žiadny stimulačný vplyv.

Experiment 2

Ako je ukázané v tab. 3, spôsobil orálne aplikovaný TSE 424 podávaný v dennej dávke 1 mikrog, 3 mikrog, 10 mikrog alebo 30 mikrog, 12 % (NS) , 47 %, 74 % a 94 % inhibíciu estrónom stimulovanej hmotnosti maternice (p < 0,01 pre tri najvyššie dávky vs. Ei-kontrola). Naopak denná orálna aplikácia dávky 3 mikrog, 10 mikrog a 30 mikrog TSE 424 viedla k 16 % (NS), 56 % (p < 0,01) a 96 % (p < 0,01) inhibíciu hmotnosti vagíny.

Ak bola zlúčenina TSE 424 podávaná myšiam po ovariektómii samostatne (bez prítomnosti estrónu) v denných orálne aplikovaných dávkach 3 mikrog a 30 mikrog, nemala v obidvoch použitých dávkach na hmotnosť vagíny a maternice žiadny významný stimulačný vplyv (tab. 3).

Tabuľka 3

Vplyv zvyšujúcich sa koncentrácii TSE 424 podávaných orálne počas 9 dni myšiam po ovariektómi i, ktoré súčasne boli alebo neboli liečené estrónom, na hmotnosť maternice a vagíny, “p < 0,01 vs. kontrola liečená Ej

liečba	HMOTNOSŤ MATERNICE	HMOTNOSŤ VAGÍNY
	(mg)	____ (mg)
zdravé	54,6 + 12,5”	37,9 f 3 9”
ovx	15.6 + 1,3”	13,9 ' \|,5”
OVX + ĽI	1 18,3 f 6,0	53,4 2,8

OVX + E) 4 TSE 424 1 pg	105,5 '6,1	54,2 ' 3,0
OVX 4 Ľ, 1 TSE 424 3 pg	69,7 i 4,4	47,2 i 1,6
OVX 4 I.:_t 4 TSĽ 424 10 pg	42,1 ± 2,7”	31.1 ± 2,3”
OVX 4- E, + TSE 424 30 pg	21,7 ± 1,7”	16,7 + 1,8“
OVX r TSE 424 3 pg	18,3 1 1,2	14,1 ' 1,2
OVX r TSĽ 424 30 pg	17.7 1 1,6	1 5,3 t 2,0

Príklad 5

5A Preventívne účinky na úbytok kostnej hmoty, na lipidy v sére a na celkový telesný tuk

Zvieratá a liečba

Boli použité desať až dvanásť týždňov staré samice potkana Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St.Constant, Kanada) s hmotnosťou na začiatku liečby približne 220 až 270 g. Zvieratá boli aklimatizované na dané podmienky (teplota: 22+3 °C; vlhkosť: 50 ± 20 %, cyklus 12 h svetlo, 12 h tma, svetlo o 7:15) počas aspoň 1 týždňa pred začiatkom experimentov. Zvieratá boli umiestnené jednotlivo a bol im umožnený prístup k vode a granulovanej certifikovanej potrave pre hlodavcov (Lab Diét 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO) .

Experimenty boli uskutočňované vo veterinárnom zariadení povolenom Canadian Council on Animal Čare (CCAC) a Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Čare (AAALAC) v súlade s CCAC smernicami na ošetrovanie a použitie experimentálnych zvierat (Guide for Čare and Use of Experimental Animal).

V prvom experimente bolo 154 potkanov náhodne rozdelených do 11 skupín po 14 zvieratách: 1) zdravá kontrola; 2) OVX kontrola; 3) OVX + E₂ (1 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HC1 (2,5 mg/kg); 5) OVX + E₂ + EM-652.HC1; 6) OVX + dehydroepiandrosterón (DHEA; 80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + EM652. HCI; 8) OVX + DHEA + E₂; 9) OVX + DHEA + E₂ + EM-652.HC1; 10) OVX + GW 5638; 11) OVX + E₂ + GW 5638. Prvý deň štúdie boli zvieratá príslušnej skupiny podrobené obojstrannej ovariektómii (OVX) v anestézii izofluranom. DHEA bol aplikovaný topikálne do chrbtovej kože vo forme roztoku v 50 % etanol - 50 % propylénglykole, ostatné testované zlúčeniny boli podávané vo forme suspenzie v 0,4 % metylcelulóze prostredníctvom orálnej žalúdočnej sondy. Liečba bola zahájená druhý deň štúdie a bola uskutočňovaná jedenkrát denne počas 3 mesiacov.

V druhom experimente bolo 132 potkanov náhodne rozdelených do 9 skupín po 14 alebo 15 zvieratách: 1) zdravá kontrola; 2)

OVX kontrola;

3)

OVX + Premarin (0,25 mg/kg); 4)

652.HCI (2,5 mg/kg); 5) OVX + Premarin + EM-652.HC1; 6) OVX +

TSE 424 (2, 5 mg/kg); 7) OVX + Premarin + TSE 424; 8) OVX + lazofoxifén (vinanová soľ; racemát; 2,5 mg/kg); 9) OVX +

Premarin + lazofoxifén. Prvý deň štúdie boli zvieratá príslušných izofluranom.

skupín podrobené obojstrannej OVX v

Testované zlúčeniny boli podávané anestézii vo forme suspenzie v 0,4 % metylcelulóze orálne prostredníctvom žalúdočnej sondy. Liečba bola zahájená druhý deň štúdie a uskutočňovala sa jedenkrát denne počas 26 týždňov. V obidvoch experimentoch boli zvieratá, ktoré nedostávali testované prípravky, liečené rovnaký čas ale len zodpovedajúcim samotným vehikulom.

Meranie minerálnej hustoty kosti

Po 3 mesiacoch (experiment 1) alebo 26 týždňoch (experiment 2) liečby bol v izofluranovej anestézii u jednotlivých potkanov skenovaný celá ich telesná kostra a bederná chrbtica. Bolo použité meranie absorbancie pomocou duálneho RTG (DEXA; QDR 4 500 A, Hologic, Waltham, MA) a software Regional High Resolution Scan. Bola určená minerálna hustota kostí (BMD) bedernej chrbtice (stavce L2 až L4) a celkové telesné zloženie (percento tukov).

Analýza séra

Po 3 mesiacoch (experiment 1) alebo 26 týždňoch (experiment 2) liečby, boli zvieratám, ktorým nebola cez noc podaná potrava, odobraté z jugulárnej žily vzorky krvi (v izofluranovej anestézii). Vzorky boli spracované, bolo pripravené sérum, ktoré bolo dovtedy, pokiaľ bolo použité na meranie, zmrazené na teplotu -80 °C. Hladiny cholesterolu v sére a aktivita alkalickej fosfatázy (ALP) boli stanovené pomocou analyzátora Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems). Štatistická analýza

Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SEM. Štatistická významnosť bola stanovená podľa testu viacnásobných poradí podľa Duncan-Kramera (Kramer CY; Biometrics 1956; 12: 307 až

310) .

Výsledky

Ako je ukázané v tab. 4 bola po 3 mesiacoch od variektómii BMD bedernej chrbtice u OVX kontrolných zvierat o 10 % nižšia ako u zdravých kontrol (p < 0,01). V daných použitých dávkach zabraňovalo podávanie samotného estradiolu a EM-652.HC1 úbytku BMD bedernej chrbtice na 98 % (p < 0,01) a 65 % (p < 0,01), zatiaľ čo kombinovaná liečba E₂ a EM-652.HC1 zabránila poklesu BMD v bedernej chrbtici indukovanému po ovariektómii na 61 % (p < 0,005). Naopak zatiaľ čo podávanie samotného DHEA chránilo BMD bedernej chrbtice na 43 % (p < 0,05), kombinovaná liečba pomocou DHEA + E₂ + EM-652.HC1 zabránila poklesu BMD bedernej chrbtice indukovanému OVX na 91 % a viedla k hodnote BMD rovnakej ako u zdravých zvierat.

V tab. 5 je uvedené, že 26 týždňov po ovariektómii bola BMD bedernej chrbtice v porovnaní so zdravými kontrolami o 18 % nižšia (p < 0,01). Podávanie samotného Premarinu, EM-652.HC1, TSE 424 a lazofoxifénu zabraňovalo poklesu BMD na 54 %, 62 %, % a 61 % (všetky p < 0,01 vs. OVX kontroly) . Prídavok

Premarinu k EM-652.HC1, TSE 424 alebo lazofoxifénu viedol k takmer rovnakým hodnotám BMD bedernej chrbtice ako boli hodnoty získané pri podávaní každého SERMu samostatne (tab. 5) . Podobne prídavok DHEA k E₂ alebo k EM-652.HC1 úplne zabraňoval poklesu BMD bedernej chrbtice indukovanému OVX (tab. 4). Pozitívny účinok DHEA na BMD je tiež podporovaný vplyvom na aktivitu alkalickej fosfatázy (ALP), čo je znak tvorby a premeny kostí. Aktivita ALP bola zvýšená zo 73 ± 6 IU/1 u OVX kontrolných zvierat na 224 ± 18 IU/1, 290 ± 27 IU/1, 123 ± 8 IU/1 a 261 ± IU/1 (všetky p< 0,01) u zvierat liečených DHEA, DHEA + EM652.HC1, DHEA + E₂ a DHEA + E₂ + EM-652.HC1, na základe čoho sa predpokladá stimulačný vplyv DHEA na tvorbu kosti (tab. 6).

Okrem preventívnych účinkov na úbytok kostnej hmoty vykazuje aplikácia EM-652.HC1, TSE 424, lazofoxifénu, GW 5638, DHEA a E₂ určité pozitívne účinky na percento celkového telesného tuku a na lipidy v sére. 3 mesiace po ovariektómii bol celkový telesný tuk zvýšený o 22 % (p < 0,05, tab. 6) . Podávanie EM-652.HC1 úplne zabraňuje zvýšeniu percenta tuku indukovaného OVX, zatiaľ čo prídavok DHEA a/alebo E₂ k SERMu viedol k percentuálnym hodnotám tuku nižším ako boli hodnoty zistené u zdravých kontrolných zvierat. Po 26 týždňoch od ovariektómie bol 40 % nárast obsahu tuku indukovaný nedostatkom estrogénu po podaní Premarinu, EM-652.HC1, TSE 424 alebo lazofoxifénu vrátený na 74 %, 78 %, 75 % a 114 %, zatiaľ čo prídavok Premarinu ku každému SERMu úplne zabránil zvýšeniu percenta tuku indukovaného OVX (tab. 7.

Ako je uvedené v tab. 6 bolo tri mesiace po ovariektómii u OVX kontrolných potkanov pozorované v porovnaní so zdravými zvieratami 22 % zvýšenie hladín cholesterolu v sére (p < 0,01). Cholesterol v sére bol zvýšený z 2,01 ± 0,11 mmol/1 u zdravých zvierat na 2,46 ± 0,08 mmol/1 u OVX kontrol. Podávania samotného E₂ alebo DHEA znižujú hladiny cholesterolu v sére na 1,37 ± 0,18 mmol/1 a 1,59 ± 0,10 mmol/1, zatial čo aplikácia samotného EM-652.HC1 alebo v kombinácii s E₂ a/alebo DHEA viedla k významne nižším hladinám cholesterolu (medzi 0,65 a 0,96 mmol/1) v porovnaní s hladinami, ktoré boli získané u zdravých zvierat (2,01 ± 0,11 mmol/1). Podobne aplikácia samotného GW 5638, TSE 424 a lazofoxifénu alebo v kombinácii s E₂ alebo Premarinom úplne zabránila zvýšeniu hladín cholesterolu v sére indukovaného OVX a viedla k hodnotám nižším ako boli hodnoty zistené u zdravých zvierat (tab. 6 a 7).

Tabuľka 4

Vplyv 3 mesačnej liečby estradiolom, EM-652.HC1, GW 5638 alebo DHEA podávaných samostatne alebo v kombinácii samiciam potkana po ovariektómii na prevenciu úbytku kostí

Liečba	Bederná chrbtica
	BMD (g/cm²)	Prevencia úbytku kostí (%)
Zdravé	0,2461 ± 0,0049”	100
OVX	0,2214 ± 0,0044
OVX + E₂	0,2457 ± 0,0049”	98
OVX + EM-652.HC1	0,2374 ± 0,0027”	65
OVX + EM-652.HCI + E₂	0, 2364 + 0, 0037”	61
OVX + DHEA	0, 2321 ± 0, 0034”	43
OVX + DHEA + EM-652.HC1	0,2458 ± 0,0037”	⁹⁹
OVX + DHEA + E₂	0, 2496 ± 0, 0029*'	114
OVX + DHEA + E₂ + EM-652. HCI	0, 2439 ± 0, 0043”	91
OVX + GW 5638	0,2299 + 0,0060	34
OVX + GW 5638 + E₂	0,2344 ± 0,0054	53

Tabuľka 5

Vplyv 26 týždennej liečby premarinom, EM-652.HC1, TSE 424 alebo lazofoxifénom podávaných samostatne alebo v kombinácii s premarinom samiciam potkana po ovariektómii na prevenciu úbytku kosti

Liečba	Bederná chrbtica
	BMD (g/cm²)	Prevencia úbytku kosti (%)
Zdravé	0, 2482 ± 0, 0067**	100
OVX	0,2035 ± 0,0035	*-
OVX + premarin	0, 2277 ± 0, 0028**	54
OVX + EM-652.HCI	0,2311 ± 0,0040”	62
OVX + premarin + EM-652.HCI	0, 2319 ± 0, 0057’*	64
OVX + TSE 424	0,2252 ± 0,0058”	49
OVX + premarin + TSE 424	0,2223 ± 0,0046	42
OVX + lazofoxifén	0, 2307 ± 0, 0040’*	61
OVX + premarin + lazofoxifén	0,2357 ± 0,0035”	72

Tabuľka 6

Vplyv 3 mesačnej liečby estradiolom, EM-652.HCI, GW 5638 alebo DHEA podávaných samostatne alebo v kombinácii samiciam potkana po ovariektómii na percento celkového telesného tuku, na hladiny cholesterolu v sére a na aktivitu alkalickej fosfatázy

LIEČBA	CELKOVÝ TUK (%)	CHOLESTEROL (mmol/1)	Al.ľ (H J/l)
zdravá	24.0 ± 15’	2.01 ± 0.11“	39 ± 2*’
OVX	29.2 ± 15	2.46 ± 0.08	73 ± 6
OVX + L·	195 ±25**	137 ±0.18**	59 ±4
OVX + ΕΜ-652-Ηα	23.2 ± 1.4“	0.87 + 0.04 “	91 ±6*
OVX + EM-652.11a + &	20.4 ±1.4“	0.96+0.07“	92 ±5*
OVX 4 DIIEA	173 ± 1.5**	159 ±0.10*’	224 ± 18“
OVX + DHEA + EM-652.Ha	18.0 ±1.1“	0.65 ±0.06“	290 ±27“
OVX 4 DHEA + E2	15.8 + 13“	1.08 ±0.08“	123 ±8“
OVX 4 DHEA + Εζ + EM- 652.110	19.2 ±1.6**	0.71 ±0.08“	261 ±20“
OVX 4 GW 5638	21.9 + 1.4“	1.14 ±0.08“	71 ± 6
OVX 4 GW 5638 4 E?	23.2 ± 1.2**	0.91 ± 0.07“	80 ± 6

‘, ρ<ϋ.Ο5, p<0.0), experimentálne vs . OVX kontrolné potkany

Tabuľka 7

Vplyv 26 týždennej liečby premarinom, EM-652.HC1, TSE 424 alebo lazofoxifenom podávaných samostatne alebo v kombinácii s premarinom samiciam potkana po ovariektómii na percento celkového telesného tuku, na hladiny cholesterolu v sére a na aktivitu alkalickej fosfatázy

LIEČBA	CELKOVÝ TUK (%)	CHOLESTEROL (imnol/l)	ALP (IU/1)
zdravá	255 ± 1.8°	2.11 ± 011”	33 + 2'
OVX	35.7 ±1.6	251 ± 0.09	60 ±6
OVX a Preinarin	28.2 ±1.8”	1.22 ±0.07”	49 ±3
OVX + EM-652.HC]	27.7 ± 1.4”	0.98 ±0.06”	78 ±4
OVX 4 EM-652.HC1 4 Premaiín	25.7 ±2.2”	1.10 + 0.07”	81+6
OVX 4 TSE 424	28.0 ±1.8” ’	1.15 + 0.05”	85 + 6
OVX 4 TSE 424 4 premarin	25.7 ± 1.7”	1.26 + 0.14”	98 + 22”
OVX 4 Lazofoxifcn	24.1 ± 1.3”	0.60 + 0.02”	116 + 9”
OVX 4 Lazofoxifén + Prernarin	23.8 ±1.9”	0.81 +0.12”	107 ±6”

*. p<0,05, , p<0,0l, experimentálne vs . OVX kontrolné potkany

5Β: Liečebné účinky na stratu kostnej hmoty a celkový telesný tuk

Zvieratá a liečba

V tomto experimente boli použité osem až deväť mesiacov staré samice potkana Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St.-Constant, Kanada). Zvieratá boli aklimatizované na dané podmienky (teplota: 22 ± 3 °C; vlhkosť: 50 + 20 %, cyklus 12 h svetlo, 12 h tma, svetlo o 7:15) počas aspoň 1 týždňa pred ovariektómiou (OVX). Dvadsať zvierat bolo nechaných ako kontrola. Zvieratá boli umiestnené jednotlivo a bol im umožnený prístup k vode a ku granulovanej certifikovanej potrave pre hlodavce (Lab Diét 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO) . Experimenty boli uskutočňované vo veterinárnom zariadení povolenom Canadian Council on Animal Čare (CCAC) a Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Čare (AAALAC) v súlade s CCAC smernicami na ošetrovanie a použitie experimentálnych zvierat.

týždňov po OVX bolo 139 potkanov náhodne rozdelených do 8 skupín po 17 až 20 zvieratách: 1) zdravá kontrola; 2) OVX kontrola; 3) OVX + E₂ (1 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HC1 (2,5 mg/kg); 5) OVX + E₂ + EM-652.HC1; 6) OVX + dehydroepiandrosterón (DHEA; 80 mg/kg) ; 7) OVX + DHEA + EM652.HC1; 8) OVX + DHEA + EM-652.HC1 + E₂. DHEA bol aplikovaný topikálne do chrbtovej kože vo forme roztoku v 50 % etanol - 50 % propylénglykole, zatial čo E₂ a EM-652.HC1 boli podávané vo forme suspenzie v 0,4 % metylcelulóze orálne prostredníctvom žalúdočnej sondy. Liečba bola zahájená 10 týždňov po ovariektómii a bola uskutočňovaná jedenkrát denne počas 26 týždňov. Zvieratá, ktoré nedostávali testovaný prípravok, boli rovnaký čas liečené len príslušným samotným vehikulom.

Meranie minerálnej hustoty kostí

Pred OVX a pred prvým dňom liečby (10 týždňov po OVX) a po 26 týždňoch liečby bol u jednotlivých potkanov v izofluranovej anestézii skenovaný celá ich telesná kostra, bederná chrbtica a pravé stehno. Bolo použité meranie absorbancie pomocou duálneho RTG (DEXA; QDR 4 500 A, Hologic, Waltham, MA) a software

Regional High Resolution Scan software. Bola stanovená minerálna hustota kostí (BMD) bedernej chrbtice (stavce L2 až L4), stehna a celkové telesné zloženie (percento tukov).

Štatistická analýza

Dáta sú vyjadrené ako priemery ± SEM. Štatistická významnosť bola stanovená podľa testu viacnásobných poradí podlá Duncan-Kramera (Kramer CY; Biometrics 1956; 12: 307 až 310) .

Výsledky

V predchádzajúcich štúdiách, ktoré sú opísané vyššie (príklad 5A) , bolo podávanie testovaných zlúčenín zahájené v čase OVX s cieľom študovať preventívne účinky na úbytok kostí. V tejto štúdii bolo podávanie testovaných zlúčenín zahájené 10 týždňov po OVX s cieľom študovať možné liečebné účinky aplikovaných liečebných postupov. BMD bola meraná pred OVX (východiskové základné hodnoty) a pred zahájením liečby. Cieľom bolo určiť prítomnosť osteopénie pred zahájením liečby. Ako je ukázané na obr. 16, po 10 týždňoch od ovariektómie bola BMD bedernej chrbtice znížená o 8 % a ďalší pokles o 12 % nasledoval po ďalších 26 týždňoch OVX. Počas tohto obdobia zvieratá dostávali samotné vehikulum (kontrolná skupina) . Denná aplikácia zlúčenín E₂, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1, DHEA alebo DHEA + EM-652.HC1 zvieratám, ktoré mali diagnostikovanú osteopéniu, počas 26 týždňov, úplne zabránila ďalšiemu poklesu BMD bedernej chrbtice, ktorý bol pozorovaný u OVX kontrolných zvierat. Podávanie E₂ + EM-652.HC1 + DHEA naopak viedlo k hodnotám BMD, ktoré boli mierne vyššie ako hodnoty zistené pred začiatkom liečby. Na druhej strane, ako je uvedené na obr. 7, BMD stehennej kosti bola po 10 týždňoch od ovariektómie znížená o 4 % a po 26 týždennej liečbe samotným vehikulom bola znížená o ďalších 6 %. Podobne ako u BMD bedernej chrbtice denná aplikácia E₂, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1, DHEA alebo DHEA + EM652.HCI počas 26 týždňov úplne zabránila ďalšiemu poklesu BMD stehennej kosti, ktorý bol pozorovaný u OVX kontrolných zvierat. Na druhej strane podávanie zlúčenín E₂ + EM-652.HC1 + DHEA viedlo k hodnotám BMD stehennej kosti, ktoré boli len mierne vyššie ako hodnoty, ktoré boli zistené pre OVX. Toto naznačuje pozitívny účinok tejto kombinovanej liečby na tvorbu kostí. Kombinovaná liečba pomocou EM-652.HC1 + E₂ + DHEA úplne nezabránila u zvierat s osteopéniou len ďalšiemu úbytku kostnej hmoty indukovanému OVX, ale tiež vykazovala určité liečebné účinky.

Okrem vplyvu na kosti, čo je uvedené na obr. 18, zabránilo podávanie DHEA, E₂ a/alebo EM-652.HC1 zvýšeniu celkového telesného tuku, ktoré je indukované OVX. U OVX kontrolných zvierat bolo po 10 týždňoch od ovariektómie percento tuku zvýšené o 47 % a počas 26 týždňov liečby samotným vehikulum (kontrolná skupina) bolo ďalej zvýšené o 17 L Denná aplikácia E₂, DHEA, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1 alebo DHEA + EM-652.HC1 počas 26 týždňov zabránila 17 % zvýšeniu, ktoré bolo pozorované u OVX kontrolnej skupiny. Na druhej strane kombinovaná liečba EM-652.HC1 + E₂ + DHEA úplne odvrátila účinok OVX a viedla k podobnej percentuálnej hodnote tuku ako bola zistená pred ovariektómiou zvierat, čim bol naznačený liečebný účinok tejto liečby.

Príklad 6

Vplyv zlúčenín podľa vynálezu na aktivitu alkalickej fosfatázy u buniek Ishikawa ludského adenokarcinómu endometria

Materiál

Uchovávanie zásobných bunkových kultúr

Línie ľudských buniek Ishikawa odvodených z dobre diferencovaného adenokarcinómu endometria poskytol Dr. Erlio Gurpide, The Mount Sinai Medical Center, New York, NY. Ishikawa bunky boli uchovávané v minimálnom médiu Eagle's Minimum Essetial Médium (MEM) s obsahom 5 % (obj.) FBS (zárodočné hovädzie sérum) a obohatenom o 100 U/ml penicilínu, 100 mikrog/ml streptomycínu, 0,1 mM roztokom postrádateľných aminokyselín. Bunky boli pri teplote 37 °C umiestnené do baniek Falcon T75 s hustotou 1,5 x 10⁶buniek.

Experimenty s bunkovou kultúrou hodín pred zahájením experimentu bolo médium Ishikawa buniek v takmer 100 % konfluencii nahradené čerstvým základným médiom bez estrogénu (EFBM) s obsahom zmesi médií Ham's F-12 bez fenolovej červenej a Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) v pomere 1 : 1 (obj.), ktoré bolo obohatené 100 U/ml penicilínu, 100 mikrog/ml streptomycínu, 2 mM glutamínom a 5 % FBS a ktoré bolo dvakrát ošetrené aktívnym uhlím potiahnutým dextranom, ktorého úlohou bolo odstrániť endogénne steroidy. Bunky boli potom zobraté pomocou 0,1 % pankreatínu (Sigma) a 0,25 mM HEPESu, boli resuspendované v EFBM a umiestnené do mikrotitračných doštičiek Falcon 96 s plochým dnom jamiek s hustotou 2,2 x 10⁴ buniek/jamku s objemom 100 mikrol. Bunky boli nechané 24 h, aby došlo k ich naviazaniu na povrch doštičiek. Potom bolo médium nahradené čerstvým EFBM, ktoré obsahovalo naznačené koncentrácie zlúčenín s konečným objemom 200 mikrol. Bunky boli inkubované 5 dní, pričom médium bolo po 48 h vymenené.

Stanovenie alkalickej fosfatázy

Na konci inkubácie boli mikrotitračné doštičky obrátené a rastové médium bolo vyliaté. Každá jamka doštičky bola naplnená 200 mikrol PBS (0,15 M NaCl, 10 mM fosfát sodný, pH 7,4). PBS bol potom z doštičiek odstránený, pričom určité zvyškové množstvo v jamkách zostalo a premytie sa opakovalo ešte jedenkrát. Pufrovaná soľanka bolo potom vyliata a prevrátené doštičky boli mierne vysušené papierom. Po uzavretí boli doštičky umiestnené na 15 minút do -80 °C a potom boli nechané pri laboratórnej teplote počas 10 minút, aby sa roztopili. Doštičky boli potom umiestnené na ľad a bolo pridaných 50 mikrol ľadového roztoku s obsahom 5 mM p-nitrofenylfosfátu, 0,24 mM MgCl₂ a 1 M dietanolamínu (pH 9,8). Doštičky boli zahriaté na laboratórnu teplotu, čím bolo umožnené, aby vznikala žltá farba (8 minút), ktorá bola dôsledkom vzniku pnitrofenolu. Doštičky boli merané pri 405 nm na spektrofotometri určenom na meranie doštičiek pri enzymoimunoanalýze (Bio-RAD, model 2550 EIA Reader).

Výpočty

Krivky vyjadrujúce odozvy na dávku aj hodnoty IC$o boli vypočítané pomocou váhovej iteračnej nelineárnej štvorcovej regresie.

Tabuľka 8

D • r—4
N	υ 'r—1 J2 • r-4 X
<U	c
CQ	Ή

r4 r~4 í o Ch	s	1 85.14	r-*.
,87*0.07	s	CM	rM
r-<
a •š m	©	17.9	«—<
lÓ T—í

ô?	r i ω	<1>		r* 5
NJ o -o;	Σ	O •03		r S
73 <S	f—	C	o »(J	C
-X c/)		C	o	CL
	sp	, .	Q,	X
03 L—	O'	t/)		V

C

Pi O

H W

Otí E-> >cn

Q ’O 'Z ω S

o %

w s

C	C
r<	Ό	05	<ú
ίΠ	05	• iH
Φ	r—1	U
>υ		'05	N
	'05	^-4	<C
r-Η	N	OJ	r—1
N		c	>N
ΕΞ	E C	(D σ»	m
C			<u
	in	05	c
t_n	o	1—<	>u
O	’tr	U	<v
sr		<P	i r-4
Q	Q	c	r—4
O	O	L >	g

až 84 , 1999.

Príklad 7

Vplyv EM-652.HC1, TSE 424 a lazofoxifénu na proliferáciu buniek ľudského karcinómu prsníka MCF-7

Postupy

Uchovávanie zásobných bunkových kultúr

Bunky MCF-7 ľudského karcinómu prsníka boli získané zo zbierky Američan Type Culture Collection # HTB 22 z pasáže 147, ktoré boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagle-Ham F12 médiu bez fenolovej červenej, obohatenom o látky uvedené vyššie a 5 % FBS. Línie buniek ľudského adenokarcinómu prsníka MCF-7 pochádzali z pleurálneho výpotku 69 ročnej ženy. Bunky MCF-7 boli použité medzi pasážami 148 a 165 a boli preočkovávané jedenkrát týždenne.

Štúdia proliferácie buniek

Bunky v logaritmickej fáze rastu boli zobraté s pomocou 0,1 % pankreatínu (Sigma) a boli resuspendované vo vhodnom médiu, ktoré obsahovalo 50 ng hovädzieho inzulínu/ml a 5 % (obj.) FBS a ktoré bolo dvakrát ošetrené aktívnym uhlím potiahnutým dextranom. Cieľom bolo odstrániť endogénne steroidy. Bunky boli v naznačenej hustote umiestnené do 24 jamkovej plastovej kultivačnej doštičky Falcon (2 cm²/jamku) a boli nechané 72 h, aby sa naviazali na povrch doštičky. Potom bolo médium nahradené čerstvým médiom s obsahom naznačenej koncentrácie zlúčenín, ktoré boli nariedené z 1000 x koncentrovaných zásobných roztokov v 99 % redestilovanom etanole v prítomnosti alebo bez prítomnosti E₂. Kontrolné bunky dostávali len etanolové vehikulum (0,1 hmotn. Et-OH). Bunky boli inkubované počas určitých časových intervalov a médium bolo vymenené v 2 až 3 denných intervaloch. Počet buniek bol stanovený prostredníctvom stanovenia obsahu DNA.

Výpočty a štatistická analýza

Krivky vyjadrujúce odozvy na dávku aj hodnoty IC₅o boli vypočítané pomocou váhovej iteračnej nelineárnej metódy najmenších štvorcov. Všetky výsledky sú vyjadrené ako priemery ± SEM.

Tabuľka 9

Experiment 1

Meno	Kód mena	Maximálna stimulácia DNA testovanými zlúčeninami	Inhibícia 1 nM E₂ stimulácie DNA testovanými zlúčeninami
		% 1 nM E₂stimulácia*	IC₅₀ (nM)
EM-652.HC1	EM-652.HC1 EM-1538	N.S.	0, 796
TSE 424	EM-3527	N.S.	3, 68

Experiment 2

Meno	Kód mena	Maximálna stimulácia DNA testovanými zlúčeninami	Inhibícia 1 nM E₂ stimulácie DNA testovanými zlúčeninami
		% 1 nM E₂stimulácia*	IC₅₀ (nM)
EM-652.HC1	EM-652.HC1 EM-1538	N.S.	0, 205
Lazofoxifén (voľná zásada)	EM-3114	N.S.	0, 379

Príklad 8

Porovnanie vplyvu EM-652.HC1, tamoxifénu, toremifénu, droloxifénu, idoxifénu, GW-5638 a raloxifénu na rast ľudských nádorov prsníka ZR-75-1 u holých myší

Predmetom tohto príkladu bolo porovnať agonistické a antagonistické účinky EM-652.HC1 a 6 ďalších orálne podávaných antiestrogénov (SERMov) na rast dobre charakterizovaných xenoimplantátov karcinómu prsníka ZR-75-1 citlivých na estrogén u holých myší po ovariektómii.

ΊΟ

Materiál a metódy

Bunky ľudského karcinómu prsníka ZR-75-1

Bunky ľudského karcinómu prsníka ZR-75-1 boli získané zo. zbierky Američan Type Culture Collection (Rockville, MD) a boli kultivované v médiu RPMI-1640 bez fenolovej červenej . Bunky boli obohatené 2 mM L-glutamínom, 1 mM pyruvátom sodným, 100 IU penicilínu/ml, 100 mikrog streptomycínu/ml a 10 % (obj.) zárodočným hovädzím sérom. Boli inkubované v zvlhčenej atmosfére 95 % vzduch / 5 % C0₂ pri teplote 37 °C. Bunky boli pasážované jedenkrát týždenne a boli zobraté pri dosiahnutí 85 až 90 % konfluencie pomocou 0,083 pankreatinu/0,3 mM EDTA.

Zvieratá a inokulácia nádora

Homozygotné samice atymické nu/nu Br myši (28 až 42 dni staré) boli získané z Charles River, Inc. (Saint-Constant, Quebec, Kanada) . Myši (5 na 1 klietku) boli umiestnené vo vinylových klietkach, ktoré boli vybavené poklopom s filtrom vzduchu a ktoré boli uchovávané v digestoroch s laminárnym prúdením vzduchu a boli tu udržiavané podmienky bez výskytu patogénov. Fotoperióda bola 12 hodín a 12 hodín tma (svetlo o 7:15). Klietka, prostriedky určené na spanie a potrava (Agway Pro-Lab R-M-H Diét # 4018) boli pred použitím autoklávované. Voda bola autoklávovaná a bola poskytnutá ad libitum. Obojstranná ovariektómia sa uskutočnila v anestézii izofluranom. Po ovariektómii bol podkožné zavedený implantát estradiolu (E₂) , ktorého úlohou bolo stimulovať počiatočný rast nádora. E₂ implantáty boli pripravené v 1 cm skúmavkách Silastic (vnútorný priemer: 0,157 cm; vonkajší priemer: 0,241 cm) obsahujúcich 0,5 cm vrstvu estradiolu a cholesterolu v pomere 1 : 10 (hmotn.). Jeden týždeň po ovariektómii boli bunky ZR-75-1 (pasáž 93) s koncentráciou 2 x 10⁶ v 0,1 ml média RPMI1640 + 30 % Matrigel podkožné aplikované do obidvoch bokov každej myši po ovariektómii (OVX). K aplikácii bola použitá 2,5 cm dlhá ihla s vnútorným priemerom 22G. Po 4 týždňoch boli E₂implantáty u všetkých zvierat nahradené rovnako veľkými implantátmi obsahujúcimi estrón (EI : chol, 1 : 25, hmotn.). Randomizácia a liečba boli zahájené o jeden týždeň neskôr.

Liečby

Jeden deň pred zahájením liečby bolo 255 myší nesúcich nádory ZR-75-1 s priemernou plochou 24,4 ± 0,4 mm² (rozsah 5,7 až 50,7 mm²) náhodne rozdelených do 17 skupín (vzhľadom na veľkosť nádora) . Každá skupina zahŕňala 15 myší (celkovo 29 alebo 30 nádorov). Zo 17 skupín boli dve skupiny kontrolné (OVX a OVX + estrón), 7 skupín malo estrónový implantát a bolo liečených antiestrogénom a 8 skupín dostávalo samotný estrogén. Estrónové implantáty boli potom u zvierat z kontrolnej skupiny po ovariektómii (OVX) a u skupín, ktoré mali dostávať samotný antiestrogén, odstránené. U ďalších deviatich skupín boli implantáty obsahujúce estrón menené každých 6 týždňov. Zlúčeniny EM-652.HC1, raloxifén, droloxifén, idoxifén a GW 5638 boli syntetizované v divízii lekárskej chémie výskumného centra Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre. Tamoxifén bol získaný od Plantex (Netanya, Izrael) a citrát toremifénu bol získaný od Orión (Espoo, Fínsko). Pri stimulácii estrónom boli antiestrogény podávané v dennej orálnej dávke 50 mikrog (2 mg/kg, priemerne) suspendované v 0,2 ml 0,4 % (hmotn./obj.) metylcelulózy. Ak nebola aplikovaná stimulácia estrónom, boli zvieratá liečené 200 mikrog (8 mg/kg priemerne) každého antiestrogénu podávaného jedenkrát denne orálnou cestou. Zvieratá z obidvoch kontrolných skupín dostávali len 0,2 ml samotného vehikula. Suspenzie antiestrogénov s príslušnou koncentráciou boli pripravované každý mesiac, boli skladované pri teplote 4 °C a boli používané za stáleho miešania. Zásobný prášok bol skladovaný hermeticky uzavretý pri teplote 4 °C (idoxifén, raloxifén, toremifén, GW 5638, droloxifén) alebo pri laboratórnej teplote (tamoxifén, EM-652<HC1).

Meranie nádora a nekropsia

Na nádore boli vyznačené dva kolmé priemery a pomocou vzorca: L/2 x W/2 x π bola vypočítaná plocha nádora (mm²). Plocha odmeraná prvý deň liečby bola uvažovaná ako 100 %. Po 161 dňoch liečby boli zvyšné zvieratá uspané pomocou izofluranu a boli usmrtené vykrvácaním. Aby mohol byť ďalej charakterizovaný účinok estrogénu a antiestrogénov, boli tkanivá, vykazujúce odozvu na estrogén, ako je maternica a vagína, ihneď odobraté, boli z nich odstránené spojivové a tukové tkanivá a boli odvážené. Maternice boli pripravené na vyhodnotenie hrúbky endometria pomocou obrazovej analýzy uskutočnenej pomocou Image Pro-Plus (Média Cybernetics, Maryland, USA) . V stručnosti, maternice boli fixované v 10 % formalíne a boli uložené do parafínu. Rezy maternicou fixované hematoxylínom a eozínom boli podrobené analýze. Boli analyzované štyri obrazy maternice (2 na maternicový roh) . Priemerná výška epitelových buniek bola odmeraná u všetkých zvierat každej skupiny.

Kritériá odozvy

Odozva nádora bola hodnotená na konci štúdie alebo pri usmrtení každého zvieraťa, ak k nemu došlo počas experimentu. V tomto prípade boli pre analýzu odozvy nádora použité len dáta tých myší, ktoré prežili aspoň polovicu času štúdie (84 dní). Stručne, úplná regresia identifikovala tie nádory, ktoré nebolo možné na konci experimentu detegovať; čiastočná regresia zodpovedá tým nádorom, ktoré sa zmenšili > 50 % svojej pôvodnej veľkosti; stabilná odozva sa vzťahuje k tým nádorom, ktoré sa zmenšili < 50 % alebo ktoré sa zväčšili < 50 %; progresia sa vzťahuje k nádorom, ktoré sa v porovnaní so svojou pôvodnou veľkosťou zväčšili > 50 %.

Štatistická analýza

Zmena celkových plôch povrchu nádora medzi dňom 1 a 161 bola analyzovaná pomocou ANOVA pre opakované merania. Model zahŕňal liečbu, čas a vplyvy interakcie čas-liečba plus člen na výpočet strata pri randomizácii. Význam účinkov rôznych liečebných postupov po 161 dňoch bol testovaný prostredníctvom interakcie čas-liečba. Analýza rezudií naznačila, že merania v pôvodnej miere neboli vhodné ani pre analýzu pomocou ANOVA ani pre žiadne transformácie, ktoré boli testované. Preto teda boli pre analýzy vybrané rady. Účinok liečby na hrúbku epitelu bol určený pomocou jednoduchého triedenia ANOVA, ktorý zahŕňa tiež strata pri randomizácii. A posteriori párové porovnania boli uskutočnené pomocou štatistiky priemerov najmenších štvorcov. Celková chyba 1. typu (a) bola regulovaná na 5 % s cieľom určiť významnosť rozdielov. Všetky výpočty boli uskutočnené pomocou ProcMIXED na software SAS Software (SAS Inštitúte, Carry, NC).

Výsledky

Antagonistické účinky na rast nádora ZR-75-1

Samotný estrón (OVX + EJ spôsobil 707 % zvýšenie velkosti nádora ZR-75-1 počas 23 týždennej liečebnej periódy (obr. 19A). Podávanie čistého antiestrogénu EM-652.HC1 v dennej orálnej dávke 50 mikrog myšiam stimulovaným estrónom rastu nádora úplne zabránilo. Nedochádzalo len k zabráneniu rastu nádora, ale po 23 týždňoch liečby bola veľkosť nádora o 26 % nižšia v porovnaní s pôvodnou hodnotou na začiatku liečby (p < 0,04). Hodnota získaná po liečbe EM-652.HC1 nebola štatisticky odlišná od hodnoty získanej po samotnej ovariektómii (OVX), keď sa veľkosť nádora zmenšila o 61 % v porovnaní s pôvodnou veľkosťou nádora. Pri rovnakej dávke (50 mikrog) a rovnakej liečebnej perióde, 6 ďalších antiestrogénov pôvodnú priemernú veľkosť nádora neznižovalo. Nádory v týchto skupinách boli všetky významne vyššie ako u OVX kontrolnej skupiny a skupiny liečenej EM-652.HC1 (p < 0,01). V porovnaní s hodnotami pred liečbou viedla 23 týždenná liečba droloxifénom, toremifénom, GW 5638, raloxifénom a idoxifénom k priemerným veľkostiam nádorov 478 %, 230 %, 227 %, 191 %, 87 % a 86 % hodnôt pred liečbou (obr.

19A) .

Agonistické účinky na rast nádora ZR-75-1

Po 161 dňoch liečby dennou dávkou 200 mikrog tamoxifénu a v neprítomnosti substitúcie estrónom, sa priemerná veľkosť nádora zväčšila na 196 % nad východiskovú hodnotu (baseline) (p < 0,01 vs. OVX). Na druhej strane priemerná veľkosť nádora myší liečených idoxifénom sa zvýšila (125 %) (p < 0,01), ale veľkosť nádora u myší liečených toremifénom sa zvýšila o 86 % (p < 0,01) (obr. 19 B). Prídavok 200 mikrog EM-652.HC1 k 200 mikrog tamoxifénu úplne inhiboval proliferáciu, ktorá bola pozorovaná u samotného tamoxifénu (obr. 19C). Na druhej strane liečba samotnými EM-652.HC1 (p = 0,44), raloxifénom (p = 0,11), droloxifénom (p = 0,36) alebo GW 5638 (p = 0,17) veľkosť nádora ZR-75-1 v porovnaní s OVX kontrolnou skupinou na konci experimentu významne nemenila (obr. 19B).

Vplyv na jednotlivé kategórie odozvy

Vplyv 50 mikrog antiestrogénu na stimuláciu estrónom

Okrem vplyvu na veľkosť nádora je dôležitým parametrom účinnosti liečby kategorizácia odozvy, pre každý jednotlivý nádor na konci experimentu. U myší po ovariektómii bola dosiahnutá úplná, čiastočná a stabilná odozva u 21 %, 43 % a 38 % nádorov a žiadny nádor sa nezväčšil. Na druhej strane u OVX zvierat substituovaných estrónom sa 100 % nádorov zväčšilo (obr. 20A) . U skupiny OVX zvierat substituovaných estrónom a liečených EM-652.HCl boli pozorované úplná, čiastočná a stabilná odozva u 17 %, 17 % a 60 % nádorov a len 7 % (2 nádory z 30) sa zväčšilo. Za rovnakých podmienok stimulácie estrónom nedochádzalo počas liečby dennou dávkou akéhokoľvek ďalšieho antiestrogénu 50 mikrog k zníženiu percenta zväčšujúcich sa nádorov pod 60 %. 65 % nádorov (17 z 26) sa zväčšilo u skupiny liečenej tamoxifénom, zatiaľ čo 89 % (25 z 28) sa zväčšilo u toremifénu, 81 % (21 z 26) sa zväčšilo u raloxifénu, 100 % (23 z 23) sa zväčšilo u droloxifénu, 71 % (20 z 28) sa zväčšilo u idoxifénu a 77 % (20 z 26) sa zväčšilo u GW 5638 (obr. 20A).

Vplyv 200 mikrog antiestrogénu v neprítomnosti stimulácie estrónom na jednotlivé kategórie odozvy

Ako je uvedené na obr. 20B, v neprítomnosti stimulácie estrónom viedli tamoxifén, idoxifén a toremifén k vyšším podielom zväčšujúcich sa nádorov, v porovnaní s inými antiestrogénmi. 62 % (16 z 26), 33 % (8 z 24) a 21 % (6 z 28) nádorov bolo po liečbe dennou dávkou 200 mikrog tamoxifénu, idoxifénu a toremifénu v kategórii progresie. Ako je zrejmé z obr. 20C, prídavok 200 mikrog EM-652.HCl k tamoxifénu znížil percento zväčšujúcich sa nádorov u samotného tamoxifénu zo 62 % (16 z 26) na 7 % (2 z 28) .

Vplyv antiestrogénu na hrúbku epitelových buniek maternice

Výška epitelových buniek endometria bola meraná ako najpriamejší parameter agonistického a antagonistického účinku každej zlúčeniny.

Je uvedený účinok dennej dávky 50 mikrog antiestrogénu v prítomnosti stimulácie estrónom na hrúbku epitelových buniek maternice.

Pri dennej orálnej dávke EM-652.HC1 50 mikrog inhibovala zlúčenina stimulačný účinok estrónu na výšku epitelu o 70 L Účinnosť šiestich ďalších testovaných antiestrogénov bola podstatne nižšia (p < 0,01). Droloxifén, GW 5638, raloxifén, tamoxifén, toremifén a idoxifén inhibovali stimuláciu estrónom o 17 %, 24 %, 26 %, 32 %, 41 % a 50 % (tab. 10).

Je uvedený tiež účinok dennej dávky 200 mikrog antiestrogénu v neprítomnosti stimulácie estrónom na hrúbku epitelových buniek maternice.

V neprítomnosti stimulácie estrónom z testovaných zlúčenín len EM-652.HC1 a droloxifén podstatne nezvyšovali výšku epitelových buniek (114 % a 101 % hodnôt OVX kontrolnej skupiny). Tamoxifén (155 %), toremifén (135 %) a idoxifén (176 %) vykazovali významnú stimuláciu výšky epitelu maternice (p < 0,01 vs. OVX kontrolná skupina). Raloxifén (122 %) a GW 5638 (121 %) tiež vykazovali štatisticky významnú stimuláciu výšky epitelu maternice (p < 0,05 vs. OVX kontrolná skupina (tab. 10)). Agonistické a antagonistické účinky každého meraného antiestrogénu na hmotnosť maternice a vagíny boli v súlade s tým, čo bolo pozorované v prípade hrúbky epitelu maternice (dáta nie sú uvedené).

- 76 Tabuľka 10 ονχ

OVX 4 E,

OVX 4 B,

OVX 4 E) OVX + B, OVX 4 E, OVX 4 Ľ, OVX 4 Ej

OVX

OVX OVX OVX OVX OVX OVX OVX

HRÚBKA

I PI Γ1ΙA) ENDOMl l'RIA

SKUPINA	n	Qzni)	i	SEM
KONTROLA	14	1831	-♦·	004
KONTROLA	8	40.58 ^K4	i	0.63
4 ΕΜ-652-ΠΟ	14	25.06 ^k	i	0.07
+ TAMOXIFEN	10	33.44	±	0.04
+ TOREMIFEN	13	31.47 ^K4	±	0.04
4 RAI jOXIFEN	12	34.72 ^K4	±	0.06
4 DROCOXIFBN	12	36.71 ^K4	±	0.12
4 IDOXTFEN	12	2935 ·	±	0.05
4 GW 5638	12	3530 ^{K 4}	i	0.07
+ ΕΜ-652·Ηα	12	20.79	±	0.10
+ TAMOXIFEN	11	28.47 ^K4		005
₄ EM-652*IIC3 4 TAMOXIFEN	13	27.95 ^K4	±	0.06
4 TOREMIFEN	13	24.75 ^bt		0.04
+ RALOXTFGN1	12	2233 *	±	0.05
4 DROLOXIFEN	13	1850	í	0.07
4 IDOXIFEN'	11	32.14 ^⁴	±	0.05
4 OW5638	13	22.22*	dt	0.05

^3,ι? experimentálne vs. OVX kontrolné myši: ^ap < 0,05; ^bp < 0,01.

^:,d experimentálne vs. myši liečené EM-652.HC1: ^cp < 0,05; 'p < 0,01.

Príklad 9

Rádioaktivita v mozgu samíc potkana po jednej orálnej dávke ¹⁴C-EM-800 (20 mg/kg)

Príklad 9 ukazuje rádioaktivitu v mozgu potkanov zistenú po jednej orálnej dávke ^C-EM-800 (20 mg/kg). Na účely porovnávania boli zahrnuté hodnoty pre krv, plazmu, pečeň a maternicu každého zvieraťa. Tieto výsledky sú zo štúdie LREM č. 1129 Tissue Distribution and Excretion of Rádioaktivity Following a Single Oral Dose ¹⁴C-EM-800 (20 mg/2 ml/kg) to Malé and Female Long-Evants Rats. Tieto čísla naznačujú, že množstvá celkovej rádioaktivity v mozgu samíc potkana Long-Evans dodanej prostredníctvom lieku boli veľmi nízke (ng ekv./g tkaniva) a neboli detegované už 12 h po dávke. Po 2 h bola rádioaktivita v mozgu 412-krát nižšia ako v pečeni, 21-krát nižšia ako v maternici, 8,4-krát nižšia ako v krvi a 13-krát nižšia ako v plazme. Vzhľadom na to, že neznámy podiel celkovej rádioaktivity v mozgu je dôsledkom kontaminácie rádioaktivitou z krvi, sú hodnoty pre mozog uvedené v tab. 1 precenené hladiny rádioaktivity ¹⁴C (EM-800) vzťahujúce sa k samotnému mozgovému tkanivu. Tieto dáta predpokladajú, že hladina antiestrogénu v mozgu je natoľko nízka, pokiaľ vôbec existuje, aby pôsobila proti účinku exogénneho estrogénu. Je dôležité upozorniť na to, že určité rádioaktivity, detegované v mozgovom tkanive, môžu byť dôsledkom zvyškovej krvi v tkanive. Okrem toho rádiochemická čistota ¹⁴C-EM-800 použitá pre túto štúdiu bola minimálne 96,25 %.

Tabuľka 11

Priemerná koncentrácia rádioaktivity pochádzajúcej z lieku (ng ekv. ΕΜ-800/g tkaniva) u vybraných tkanív samice potkana Long-Evans po jednej orálnej dávke ^:lC-EM-800 (20 mg/kg)

Čas	Mozog	Krv	Plazma
(h)	priemer^b (%CV)	priemer⁰ (%CV)	priemer (%CV)
2	17.6 (29)	1487 (22)	224.6 (20)
4	17.1 (29)	669 (45)	103.2 (39)
6	15.6 (8)	483 (29)	74.1 (31)
8	16.8 (31)	41.1 (12)	64.1 (14)
12	10.0^c (87)	28.7 (54)	407 (55)
24	0 (NC)	4.7 d (173)	10.1 (86)
36	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
48	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
72	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
96	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
168	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)

a: Hodnoty z tabuliek pre LREM 1129 (EM-800; Distribúcia v tkanivách a exkrécia rádioaktivity po jednej orálnej dávke ^UCEM-800 (20 mg/2 ml/kg) samcom a samiciam potkana Long-Evans

b:	Limit kvantifikácie (LOQ) 1,2 ng ekvivalentu EM-800
c:	Jedna vzorka pod .LOQ; 0 použitá pri výpočte priemeru
d:	Dve vzorky pod LOQ; 0 použitá pri výpočte priemeru

?,CV: Koeficient rozptylu vyjadrený ako percento, kde n = 3 NC: Nevypočítané

- 79 Tabuľka 12

___

____

---—

-=rxi.-

—-

-— -

—

>

u

<A°

nJ β

(J

Ú

u

U

u

-Q P

o CM

co

r~4 cn

xT r—«

m m

o CQ^

δ

z

ä

N «5

Φ e

·—«

r-·

rH

φ r|

M*

co

x*

o

O

o.

n

o r~«

r^ o

Uľ> O

xi· O

O

o

—

tí

ô

O

o

O

o

O

X > Š

a

‘Z °^c

>

rt S •í o cm OC

u o\°

H

K* xT

ch CM

f? r-4

M** Ä

R ·—4

u &

σ δ

o o

>

tí

s °? Š g ω t .. O

M

Φ e φ Ή tí ft

3 «—4 ô

Ch Ό *O O Ô

S xi* O O

r+ T“< xT O Ó

8 o o

X, tx O O o

o

Ό

o

ox>

z—

O Ό ·—-> — Φ γ__5

<tí u

> u o\°

xo ro.

co* eo.

o-T rH

xo'

§

x? <a.

G- V“4

g

σ δ

u δ

σ δ

*rt — u

tí

jQ

N ° ·—> o •—x «<. <3j u *□ •rt o

tí Φ U nJ S

tí Φ β Φ •H

R xO n o

Ό xo OO CM O

m Ia CM O

CM CO R O

§ CM O

b. s o o

w-< \O CM O o

OO a o o

o

.—, ·—->

tí

S ° ±í Q.

a

.^3 v>

, rt C

z—.

o rt o > cu ω >. i“ > x uZ « rt c O rt S ~

>tí Φ >u Φ d

> o □\° jQ tí Φ β Φ •H

7.2547 (30)

f r~4 O CO

S CM 3 b> c4

s k e4

1.8232 (38)

cT »—4 Ch 2 o

§ xl» ΓΛ O X o

ŕ? co XO Ch v4 <Ί •o

Ό CM CO r-< O

0.0944 (15)

X? r-4^ 3 8 O

•n o

tí

^u CL rt · — Cj

0.

‘rt rt

C <υ > u —

> o o\°

CM

5? d

§

r~4 co

R

u δ

σ δ

u

u δ

σ δ

u δ

O rt

0)

n

0

M

•rt jz

Φ

c u

0

β

v

i> C

s

Φ

\O

o

CO

O

rt rt .5 ±

•H tí Q<

ίγ o o

e <-« o o

tr> »“< O o

o _T—4 o o

C3> _r-4 O o

o

·““ **

\

<r>

ω

_f j

Cŕi

< 4

r 4

>r

νΓ>

ÍIJ

r 4

r·»

'Γ

• «

OJ

-tí

>u

a: Hodnoty z tabuliek pre LREM 1129 (EM-800; Distribúcia v tkanivách a exkrécia rádioaktivity po jednej orálnej dávke ¹⁴CEM-800 (20 mg/2 ml/kg) samcom a samiciam potkana Long-Evans b: Limit kvantifikácie (LOQ) 1,2 ng ekvivalentu EM-800 c: Jedna vzorka pod LOQ; 0 použitá pri výpočte priemeru d: Dve vzorky pod LOQ; 0 použitá pri výpočte priemeru %CV: Koeficient rozptylu vyjadrený ako percento, kde n = 3

NC: Nevypočítané

Príklad 10

Materiál a metódy

Zvieratá a liečba

Boli použité desať až dvanásť týždňov staré samice potkana Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St.Constant, Kanada) s hmotnosťou v čase, keď sa uskutočnila ovariektómia 215 až 265 g. Zvieratá boli umiestnené jednotlivo do prostredia s regulovanými podmienkami (teplota: 22 ± 3 °C; vlhkosť: 50 ± 20 %, cyklus 12 h svetlo, 12 h tma, svetlo o 7:15). Zvieratám bol umožnený voľný prístup k vode a certifikovanej potrave pre hlodavce (Lab Diét 5002 (granulovaná), Ralston Purina, St-Louis, MO) . Experiment bol uskutočňovaný vo veterinárnom zariadení povolenom Canadian Council on Animal Čare (CCAC) a Association for Assessment and Accreditation of Laboratory /Vnímal Čare (AAALAC) v súlade s CCAC smernicami na ošetrovanie a použitie experimentálnych zvierat.

137 potkanov bolo náhodne rozdelených do 10 skupín po 13 až 14 zvieratách: 1) zdravá kontrola; 2) kontrolná skupina po ovariektómii OVX; 3) OVX + 176-estradiol (E₂; 2 mg/kg); skupiny 4) až 10) OVX + E₂ + EM-652.HCI (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 alebo 10 mg/kg) . Prvý deň štúdie boli zvieratá príslušnej skupiny podrobené obojstrannej ovariektómii (OVX) v anestézii izofluranom. Testované zlúčeniny boli aplikované jedenkrát denne 1. až 14. deň štúdie orálnou cestou prostredníctvom žalúdočnej sondy vo forme suspenzie v 0,4 % metylcelulóze (0,5 ml/potkana). Zvieratá zo skupín 1 a 2 dostávali rovnako dlho len samotné vehikulum. V deň 15 boli 4 zvieratá z každej skupiny premyté 10 % pufrovaným roztokom formalinu a tkanivá boli spracované na histologické vyšetrenie. Ostatné zvieratá boli v izofluranovej anestézii usmrtené vykrvácaním z brušnej aorty. Maternica a vagína boli odstránené, boli zbavené zvyšného tuku a boli odvážené. Kúsok každej maternice bol fixovaný v 10 % formalíne, aby bol ďalej použitý na určenie výšky epitelových buniek endometria s pomocou programu (Software Image-Pro Plus),

Hladiny cholesterolu v sére

Celkový cholesterol bol meraný vo vzorkách séra získaných od zvierat, ktoré cez noc neprijímali potravu. Na meranie bol použitý analyzátor Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems). Štatistická analýza

Dáta sú vyjadrené ako stredná hodnota ± SEM. Štatistická významnosť bola stanovená podlá testu viacnásobných poradí podlá Duncan-Kramera (Kramer, Biometrics, 12: 307 až 310,

1956).

Výsledky % zníženie hmotnosti maternice, ktoré bolo pozorované 2 týždne po ovariektómii, bolo po dennom podávaní 17B-estadiolu (E₂) orálnou cestou v dávke 2 mg/kg (490 ± 26 mg vs. 480 ± 17 mg; N.S.) úplne vrátené späť (obr. 21) . Ako je uvedené na rovnakom obrázku, so zvyšujúcimi sa dávkami EM-652.HC1 bola pozorovaná progresívna inhibícia stimulačného účinku E₂ na hmotnosť maternice. 84 % a 87 % vrátenie účinku E₂ bolo pozorované pri dávkach antiestrogénu 3 mg/kg a 10 mg/kg. Porovnateľné výsledky boli získané v prípade výšky epitelu endometria (obr. 22) . Výška epitelu endometria stimulovaná E₂bola na 83 % a 93 % chránená dávkami antiestrogénu 3 mg/kg a 10 mg/kg. Výška epitelu endometria bola v porovnaní so zdravými kontrolnými zvieratami (31,1 ± 0,7 mm) v skupine OVX zvierat liečených E₂ (41,9 ± 1,2 mikrom) vyššia (37,7 %, p < 0,01) (obr. 23) .

Substitúcia E₂ OVX zvierat viedla k podobným hmotnostiam vagíny ako mali zdravé zvieratá (149,9 ± 9,0 mg vs. 145 + 5,3 mg, N.S.). Z obr. 24 je zrejmé, že inhibícia hmotnosti vagíny bola pozorovaná pri vyšších dávkach EM-652.HC1 ako bolo pozorované v prípade hmotnosti maternice. Do dávky 1 mg/kg zlúčeniny nebol zistený žiadny významný inhibičný účinok antiestrogénu na hmotnosť vagíny. Dávka 3 mg/kg EM-652.HC1 však spôsobila štatisticky nevýznamnú 50 % inhibíciu stimulačného účinku E₂, u dávky 10 mg/kg antiestrogénu bolo pozorované úplné vrátenie účinku E₂ na hmotnosť vagíny.

Po 2 týždňoch po OVX bolo pozorované 37 % (p < 0,01) zvýšenie cholesterolu v sére. Liečba OVX zvierat zlúčeninou E₂však spôsobila 53 % (p < 0,01) inhibíciu hladín cholesterolu v sére (obr. 25). Prídavok EM-652.HC1 v denných dávkach 0,01 mg/kg až 0,3 mg/kg nemal žiadny štatisticky významný vplyv na inhibičný účinok E₂. Na druhej strane dávky EM-652.HC1 1,0, 3,0 a 10 mg/kg znížili účinok E₂ o 36 %, 30 % a 50 %.

Predložené dáta jasne ukazujú, že antiestrogén EM-652.HC1 neutralizuje stimulačný účinok E₂ na hmotnosť maternice a výšku epitelu endometria, čo sú dva dobre rozoznateľné parametre činnosti estrogénu v periférnych tkanivách. Tieto dáta jasne ukazujú, že súčasné podávanie EM-652.HC1 u žien po menopauze, ktoré dostávajú estradiol s cieľom zníženia vazomotorických symptómov, bude zabraňovať stimulačnému účinku estrogénov na endometrium.

%, 30 % a 50 % vrátenie inhibičného účinku dávok 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg a 10 mg/kg EM-652.HC1 je možné pravdepodobne vysvetliť prevládajúcim účinkom antiestrogénu, ktorý pokiaľ by bol použitý samostatne, by pravdepodobne viedol k rovnakému stupňu inhibície. EM-652.HC1 má afinitu pre ER maternice potkana približne 5-krát vyššiu ako samotný E₂ (Martel a kol., J. Steroid. Molec. Biol., 64: 199 až 205, 1998).

Príklady farmaceutických prostriedkov a súprav

Nižšie sú formou príkladov, ktoré však nie sú v žiadnom prípade obmedzujúce, uvedené niektoré farmaceutické prostriedky a súpravy využívajúce aktívny ŠERM EM-800 alebo EM-652.HC1 (EM1538) a výhodnejšie aktívny estrogén 176-estradiol, etinylestradiol alebo konjugované estrogény. Ostatné zlúčeniny podía vynálezu alebo ich kombinácie môžu byť použité namiesto (alebo okrem) EM-800 alebo EM-652.HC1 alebo 17b-estradiolu alebo etinylestradiolu. Koncentrácia aktívnej zložky sa môže pomerne značne líšiť, čo je tu tiež diskutované Množstvo a typy ďalších prísad, ktoré môžu byť použité, sú v danej oblasti dobre známe.

Príklad A

Farmaceutický prostriedok určený na orálnu aplikáciu (kapsula)

Prísada	Hmotnosť (%) (na hmotnosť celkového prostriedku)
EM-652.HC1	5, 0
Etinylestradiol	0, 02
Laktóza vodná	79, 98
Škrob	4,8
Mikrokryštalická celulóza	9, 8
Stearát horečnatý	0,4

alebo

Prísada	Hmotnosť (%) (na hmotnosť celkového prostriedku)
EM-652.HC1	5, 0
Konjugované estrogény	0, 02
Laktóza vodná	79, 8
Škrob	4, 8
Mikrokryštalická celulóza	9,8
Stearát horečnatý	0,4

Príklad B

Súprava

ŠERM a estrogén sú podávané orálne

Nesteroidný antiestrogénový prostriedok určený na orálne podávanie (kapsula)

Prísada	Hmotnosť (%) (na hmotnosť celkového prostriedku)
EM-652.HCI	5, 0
Laktóza vodná	80, 0
Škrob	4,8
Mikrokryštalická celulóza	9, 8
Stearát horečnatý	0,4

Estrogénový prostriedok určený na orálnu aplikácie (želatínová kapsula)

Prísada	Hmotnosť (%) (na hmotnosť celkového prostriedku)
Etinylestradiol	Ó, 02
Laktóza vodná	84,98
Škrob	4,8
Mikrokryštalická celulóza	9,8
Stearát horečnatý	0,4

Vo vyššie uvedených prostriedkoch je možné ostatnými SERMami nahradiť zlúčeniny EM-800 alebo EM-652.HC1. Ďalšími estrogénmi môžu byť tiež nahradené 17B-estradiol, etinylestradiol alebo konjugované estrogény. Môže byť začlenený viac ako jeden ŠERM alebo viac ako jeden estrogén. V tomto prípade je kombinované hmotnostné percento výhodnejšie ako je hmotnostné percento jednotlivého estrogénu alebo jednotlivého SERMu podávaného vo vyššie uvedených príkladoch.

- 85 Tento vynález je opísaný v zmysle výhodnejších uskutočnení a príkladov, ale nie je nimi žiadnym spôsobom obmedzený. Odborníci v danej oblasti techniky istotne lahko nájdu širšie možnosti aplikácie rozsahu vynálezu, ktorý je obmedzený len patentovými nárokmi, ktoré sú tu uvedené.

Claims

selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, pričom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu a modulátor nie je derivát benzotiofénu, derivát naftalénu, derivát izochinolínu alebo enantiomérna zmes derivátov 3fenylchinolínu, derivát 3-fenyltiochromanu, derivát 3-fenylchromanu, ktorá má viac ako 10 % enantioméra s 2R konfiguráciou.
2. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

a) farmaceutický prijateľnú pomocnú látku, riedidlo alebo nosič;

b) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného estrogénu alebo jeho prelieku;

c) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, pričom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu; a

d) terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného doplnkového činidla vybraného zo skupiny, ktorú tvorí bifosfonát, androgénne činidlo, testosterón, dehydro-epiandrosterón, dehydroepiandrosterónsulfát, androst-5-én-3ft,17b-diol, 4-androstén-3,17-dión a preliek ktoréhokoľvek uvedeného doplnkového činidla.
3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora má vzorec s nasledujúcimi znakmi:

a) dva aromatické kruhy spojené 1 až 2 atómami uhlíka, pričom obidva aromatické kruhy sú buď nesubstituované alebo substituované hydroxylovou skupinou alebo skupinou premenenou in vivo na hydroxyl;

b) postranný reťazec s aromatickým kruhom a funkciou terciárneho aminu alebo jeho soli;

a kde uvedený modulátor nie je derivátom benzotiofénu, derivátom naftalénu, derivátom izochinolínu alebo enantiomérnou zmesou derivátov 3-fenylchinolínu, derivátov 3-fenyltiochromanu, derivátov 3-fenylchromanu, ktorá má viac ako 10 % enantioméra s 2R konfiguráciou.

Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že postranný reťazec je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí:
5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí derivát trifenyletylénu, derivát indolu, derivát benzopyránu, HMR 3339, HMR 3656, LY 335124, LY 326315, SH 646, ERA 923 a derivát centchromanu.
6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je derivát benzotiofénu všeobecného vzorca III:

III kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí vodík, hydroxyl a skupina premenená in vivo na hydroxylovú;

kde R³ a R⁴ sú buď a) nezávisle Ci až C₄ alkyl alebo b) skupina, ktorá v kombinácii s dusíkom, na ktorý sa viaže, je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí pyrolidínová, dimetyl1-pyrolidínová, metyl-l-pyrolidínová, piperidínová, hexametyléniminová a morfolínová skupina;

kde A je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí -C0-, -CHOH- a CH₂-;

kde B je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí fenylén, pyridylidén a -cykloC₄H₂N₂-.
7. Farmaceutický prostriedok pódia nároku 6, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí raloxifén, LY 353381 a LY 335563.
8. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je trifenyletylén alebo di'f enýlhydronaf talénový derivát všeobecného vzorca IV:

kde D je -OCH₂CH₂N (R³) R⁴, -OCH2CH2OH alebo -CH=CH-COOH (R³ a R⁴ sú buď nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí Ci až C4 alkyl, alebo R³, R⁴ a atóm dusíka, na ktorý sú viazané, spolu tvoria kruhovú štruktúru vybranú zo skupiny, ktorú tvoria pyrolidínová, dimetyl-l-pyrolidinová, metyl-1pyrolidinová, piperidinová, hexametyléniminová a morfolínová skupina);

kde E a K sú nezávisle vodík alebo hydroxyl, ester fosfátu alebo nižší alkyl, kde J je hydrogén alebo ha 1ogén.
9. Farmaceutický prostriedok podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je 0H-, tamoxifén, droloxifén, toremifén, iodoxifén, lazofoxifén, iprox.·· fén, FC 1271 a GW 5638.
10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je derivát indolu všeobecného vzorca V:

kde D je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí -OCH₂CH₂N (R⁷) R⁸, CH=CH-CON (R⁷) R⁸, -CC- (CH₂) _n-N (R⁷) R⁸ (R⁷ a R⁸ sú buď nezávisle ktorú tvorí Ci až C6 alkyl, alebo R⁷, na ktorý sú viazané, vybranú zo skupiny, dimetyl-1-pyrolidínová, spolu tvoria ktorú tvoria metyl-1pyrolidínová, piperidinová, hexametyléniminová a vybrané zo skupiny

R⁸ a atóm dusíka, kruhovú štruktúru pyrolidínová, morfolínová skupina);

kde X je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí: vodík, a C_x až C₆ alkyl;

kde R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí: vodík, hydroxyl, C_x až C₆ alkyl a skupina premenená in vivo na hydroxyl.
11. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je TSE 424 (2-(4-hydroxyfenyl)-3-metyl-l-[[4-[2-(1piperidinyl)etoxy]fenyl]metyl]-lH-indol-5-ol).
12. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je derivát centchromanu všeobecného vzorca VI:

kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí: vodík, hydroxyl a skupina premenená in vivo na hydroxyl;

kde R⁵ a R⁶ sú nezávisle vodík alebo C_x až C₆ alkyl;

kde D je -OCH2CH2N (R³) R⁴ (R₃ a R₄ sú buď nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí C_x až C₄ alkyl, alebo R³, R⁴ a atóm dusíka, na ktorý sú viazané, spolu tvoria kruhovú štruktúru vybranú zo skupiny, ktorú tvoria pyrolidinová, dimetyl-l-pyrolidínová, metyl-1-pyrolidinová, piperidínová, hexametyléniminová a morfolínová skupina).
13. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 12, vyznačujúci sa tým, že centchromanovým derivátom je (3,4-trans-2,2- dimetyl-3-fenyl-4-[4-(2-(2-pyrolidin-l-yl)etoxy)fenyl]-7metoxychroman).
14 . Farmaceutický prostriedok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je zlúčenina všeobecného vzorca VII:

kde R¹ a R² sú nezávisle vodík, hydroxyl alebo skupina, ktorá je premenená in vivo na hydroxyl;

kde Z buď nie je. prítomné vôbec alebo je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí -CH₂-, -0-, -S- a NR³-, kde R³ je vodík alebo nižší alkyl;

kde R¹⁰⁰ je dvojmocná skupina, ktorá oddialuje L od B-kruhu prostredníctvom 4 až 10 atómov;

kde L je dvojmocná alebo trojmocná skupina, vybraná zo skupiny -S0-, -CON-, -N< a -SON<;

kde G¹ je vybrané zo skupiny, ktorú tvoria vodík, Ci až C5 uhľovodík, dvojmocná skupina, ktorá v kombinácii s G₂ a L tvorí 5 až 7 členný heterocyklický kruh a halogén alebo nenasýtené deriváty predchádzajúcich zlúčenín;

kde G² buď nie je prítomné vôbec alebo je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí vodík, Ci až C₅ uhľovodík, dvojmocná skupina, ktorá v kombinácii s G¹ a L tvorí 5 až 7 členný heterocyklický kruh a halogén alebo nenasýtené deriváty predchádzajúcich zlúčenín;

kde G³ je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí vodík, metyl a etyl.
15. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je derivátom benzopyránu všeobecného vzorca VIII:

alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, kde D je -OCH2CH2N (R³) R⁴ (R³ a R⁴ sú buď nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí Ci až C₄ alkyl, alebo R³, R⁴ a atóm dusíka, na ktorý sú viazané, spolu tvoria kruhovú štruktúru vybranú zo skupiny, ktorú tvoria pyrolidínová, dimetyl-l-pyrolidínová, metyl-l-pyrolidínová, piperidínová, hexametyléniminová a morfolínová skupina);

kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí vodík, hydroxyl a skupina premenená in vivo na hydroxyl.
16. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že derivát benzopyránu je, vzhľadom na prevahu svojho stereoizoméru, ktorý má absolútnu konfiguráciu S na 2. uhlíku, opticky aktívny, pričom uvedená zlúčenina má všeobecný vzorec IX kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny, ktorú tvorí hydroxyl a skupina premenená in vivo na hydroxyl;

kde R³ je kruh vybraný zo skupiny, ktorú tvorí nasýtený, nenasýtený alebo substituovaný pyrolidinyl, nasýtený, nenasýtený alebo substituovaný piperidinyl, nasýtený, nenasýtený alebo substituovaný morfolinyl, cyklická skupina obsahujúca dusík, polycyklická skupina obsahujúca dusík, a NR^aR^b , kde R^a a R^b sú nezávisle vodík, nevetvený alebo vetvený Ci až C₆ alkyl, nevetvevený alebo vetvený C₂až C6 alkenyl a nevetvený alebo vetvený C₂ až C6 alkinyl.
17. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že zlúčenine IX alebo jej soli chýba (2R)-enantiomér.
18. Farmaceutický prostriedok podía nároku 16, vyznačujúci sa tým, že selektívny modulátor estrogénového receptora je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí:

EM-1520

EM-1872

EM· 1900

- 9'1 EM] 90]

ĽM-1903

EM-1533

EM-1518

EM-652.110 (EM-1538) a

kde všetky uvedené molekulové štruktúry, ktorých stechiometria je uvedená, sú vzhladom na prevahu stereoizomérov s 2S konfiguráciou opticky aktívne.
19. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že benzopyránovým derivátom je soľ kyseliny, vybranej zo skupiny, ktorú tvorí kyselina octová, kyselina adipová, kyselina benzénsulfónová, kyselina benzoová, kyselina gáforsulfdnová, kyselina citrónová, kyselina fumarová, kyselina jodovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina chlorovodíková, kyselina hydrochlorotiazidová, kyselina hydroxynaftoová, kyselina mliečna, kyselina maleínová, kyselina metánsulfónová, kyselina metylsírová, kyselina 1,5-naftaléndisulfónová, kyselina dusičná, kyselina palmitová, kyselina pivalová, kyselina fosforečná, kyselina propiónová, kyselina jantárová, kyselina sírová, kyselina vínna, kyselina tereftalová, kyselina ptoluénsulfónová a kyselina valerová.
20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že kyselinou je kyselina chlorovodíková.
21. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokľvek z nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že selektívnym modulátorom estrogénového receptora je

EM-652.HC1 (EM-1538) a je vzhľadom na prevahu stereoizomérov s konfiguráciou 2S opticky aktívny a kde estrogén je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí 17βestradiol, estery 17B-estradiolu, 17a-estradiol, estery 17a-estradiolu, estriol, estery estriolu, estrón, estery estrónu, konjugovaný estrogén, ekvilín, estery ekvilínu,

17a-etynylestradiol, estery 17a-etynylestradiolu, mestranol a estery mestranolu.
22. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že estrogén je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí 17B-estradiol, estery 17ft-estradiolu, estriol, estery estriolu, estrón, estery estrónu, konjugovaný estrogén, ekvilín, estery ekviľinu, 17a-etynylestradiol, estery 17aetynylestradiolu, mestranol a estery mestranolu, chemestrogén, DES, fytestrogén, tibolón, 2' etylestrogenoxazol a etyndiol.
23. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že estrogén je zmesnou zlúčeninou estrogén/androgén.
24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že zmesnou estrogén/androgénovou zlúčeninou je tibolón.
25. Súprava, vyznačujúca sa tým, že prvá nádoba obsahuje farmaceutický prostriedok s obsahom terapeuticky účinného množstva aspoň jedného estrogénu alebo jeho prelieku a súprava ďalej obsahuje druhú nádobu, v ktorej sa nachádza farmaceutický prostriedok obsahujúci terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, pričom modulátor nie je derivátom benzotiofénu.
26. Súprava, vyznačujúca sa tým, že prvá nádoba obsahuje farmaceutický prostriedok s obsahom terapeuticky účinného množstva aspoň jedného estrogénu alebo jeho prelieku a súprava ďalej obsahuje druhú nádobu, v ktorej sa nachádza farmaceutický prostriedok obsahujúci terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku a ďalej obsahuje aspoň jednu ďalšiu nádobu, ktorá obsahuje terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného doplnkového činidla vybraného zo skupiny, ktorú tvorí dehydroepiandrosterón, dehydroepiandrosterónsulfát, androst-5-én-3ú,17B-diol, androgénne činidlo, testosterón,

-97-4-androstén-3,17-dión a preliek ktoréhokoľvek uvedeného doplnkového činidla.
27. Súprava podľa nároku 25 alebo 26, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jednu ďalšiu nádobu, ktorá obsahuje farmaceutickú formuláciu obsahujúcu terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného bifosfonátu. ,
28. Použitie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prelieku a terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, v ktorom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu a nie je derivátom benzotiofénu, na prípravu kombinovaného farmaceutického prostriedku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24 na redukciu alebo elimináciu výskytu symptómov menopauzy.
29. Použitie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prelieku a terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, v ktorom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu a nie je derivátom benzotiofénu, na prípravu kombinovaného farmaceutického prostriedku podľa nárokov 1 až 24 na liečenie alebo zníženie rizika vzniku stavu vybraného zo skupiny, ktorá zahŕňa osteoporózu, hypercholesterolémiu, hyperlipidémiu, aterosklerózu, hypertenziu, Alzheimerovu chorobu, inzulínovú odolnosť, diabetes, úbytok svalovej hmoty, obezitu, vaginálne krvácanie indukované hormonálnou substitučnou terapiou, a bolestivosť prsníkov indukovanú hormonálnou substitučnou terapiou.
30. Použitie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prelieku a terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, v ktorom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu a je to zlúčenina odlišná od derivátu benzotiofénu, derivátu naftalénu, derivátu izochinolínu alebo enantiomérnej zmesi derivátov 3-fenylchinolínu, derivátov 3-fenyltiochromanu, derivátov 3-fenylchromanu, ktorá má viac ako 10 % enantioméra s 2R konfiguráciou na prípravu kombinovaného farmaceutického prostriedku podlá nárokov 1 až 24 na liečenie alebo zníženie rizika vzniku osteoporózy.
31. Použitie podľa nároku 29, kde kombinovaný farmaceutický prostriedok ďalej zahŕňa terapeuticky účinné množstvo bifosfonátu. >
32. Použitie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prelieku a terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, pričom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu, a terapeuticky účinného množstvo aspoň jedného doplnkového činidla vybraného zo skupiny, ktorú tvorí dehydroepiandrosterón, dehydroepiandrosterónsulfát, androgénne činidlo, testosterón, androst-5-én-3ň,17B-diol, 4androstén-3,17-dión a preliek ktoréhokoľvek doplnkového činidla na prípravu kombinovaného farmaceutického prostriedku podľa ktoréhokľvek z nárokov 1 až 24 na redukciu alebo elimináciu výskytu symptómov menopauzy.
33. Použitie terapeuticky účinného množstva estrogénu alebo jeho prelieku a terapeuticky účinného množstva selektívneho modulátora estrogénového receptora alebo jeho prelieku, pričom modulátor je zlúčenina odlišná od estrogénu, a terapeuticky účinného množstvo aspoň jedného doplnkového činidla vybraného zo skupiny, ktorú tvorí dehydroepiandrosterón, dehydroepiandrosterónsulfát, androst-5-én-3ft,17ft-diol, androgénne činidlo, testosterón, 4-androstén-3,17-dión a preliek ktoréhokoľvek doplnkového činidla na prípravu kombinovaného farmaceutického prostriedku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24 na liečenie alebo zníženie rizika výskytu stavu vybraného zo skupiny, ktorá zahŕňa osteoporózu, hypercholesterolémiu, hyperlipidémiu, aterosklerózu, hypertenziu, Alzheimerovu chorobu, inzulínovú odolnosť, diabetes, úbytok svalovej hmoty, obezitu, vaginálne krvácanie indukované hormonálnou substitučnou terapiou a bolestivosť prsníkov indukovanú hormonálnou substitučnou terapiou.
34. Použitie podľa nároku 28, v ktorom kombinovaný farmaceutický prostriedok ďalej zahŕňa terapeuticky účinné množstvo androgénneho činidla.
35. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28, 29, 30, 32 a 33, v ktorom selektívny modulátor estrogénového receptora nemá estrogénovú aktivitu v tkanive prsníka alebo endometria.
36. Použitie podľa nárokov 28 a 32, v ktorom symptómy menopauzy sú vybrané zo skupiny, ktorú tvoria návaly horúčavy, vazomotorické symptómy, nepravidelná menštruácia, vaginálna suchota, bolesti hlavy a poruchy spánku.
37. Použitie podľa nároku 28, v ktorom liečba znižuje riziko vzniku karcinómu prsníka a endometria.