CZ20022401A3

CZ20022401A3 - Farmaceutický prostředek a souprava pro snížení nebo eliminaci výskytu symptomů menopauzy

Info

Publication number: CZ20022401A3
Application number: CZ20022401A
Authority: CZ
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorecherche, Inc.
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2003-10-15
Also published as: RU2002123047A; NZ534348A; HK1048761A1; SK9592002A3; AU2991301A; ZA200205926B; CN1400904A; HUP0204211A2; MXPA02007165A; JP2003520817A; PL357163A1; IL149990A0; HUP0204211A3; CA2395730A1; WO2001054699A1; BR0108107A; NO20023484L; NO20023484D0; EP1251855A1; US20030065008A1

Description

FARMACEUTICKY PROSTŘEDEK A SOUPRAVA (z^zZí4>

Oblast techniky

Otyji ΊΑ-'Ιί-'ί

Předmětný vynález se vztahuje k nové kombinaci fyziologicky aktivních látek. Tato kombinace konkrétně zahrnuje selektivní modulátor estrogenového receptoru (ŠERM) v kombinaci s estrogenem. V některých provedeních kombinace zahrnuje selektivní modulátor estrogenového receptoru (ŠERM), estrogen a prekursor pohlavních steroidů nebo androgenové sloučeniny. Vynález také poskytuje soupravy a farmaceutické prostředky určené pro praktické použití této kombinace. Uvedená kombinace je pacientům podávána s cílem snížit nebo eliminovat rozsah návalů horka, vasomotorických symptomů, vaginální suchosti nebo jiných symptomů menopauzy. Předpokládá se, že riziko vzniku karcinomu prsu a/nebo karcinomu endometria bude u pacientů, kteří dostávají tuto kombinovanou terapii, sníženo. Rovněž jsou poskytovány způsoby léčby nebo způsoby snížení pravděpodobností vzniku osteoporózy, hypercholesterolemie, hyperlipidemie, aterosklerózy, hypertenze, Alzheimerovy choroby, nespavosti, kardiovaskulárních onemocnění, insulinové rezistence, diabetů a obezity (zejména břišní obezity).

Dosavadní stav techniky

Je známo, že různá onemocnění, stavy a nežádoucí příznaky jsou odezvou na podání exogenních pohlavních steroidů nebo jejich prekursorů. U estrogenů se například předpokládá, že snižují rychlost úbytku kostí, zatímco u androgenů bylo zjištěno, že kostní hmotu vytvářejí a to tím, že stimulují tvorbu kostí. Hormonální substituční terapii (např. podávání estrogenů) je možno použít pro léčbu příznaků menopauzy. Progestiny jsou často používány k zabránění tvorby endometria a ke snížení rizika karcinomu endometria, které je indukováno estrogeny. Použití estrogenů, androgenních sloučenin a/nebo progestinů k léčbě řady různých symptomů a onemocnění nebo k profylaktickým účelům má řadu slabých míst. Léčba žen androgenními sloučeninami může mít nežádoucí vedlejší účinek a to takový, že způsobuje určité maskulinizační vedlejší účinky. Podávání pohlavních steroidů může také zvýšit riziko výskytu určitých onemocnění u těchto pacientů. Například karcinom prsu u žen je zhoršován vlivem aktivity estrogenů. Karcinom prostaty a benigní hyperpiazie prostaty jsou zhoršovány aktivitou androgenů.

• · • · · · • · · · • ······ · * • · · · · · ·· ·· ·· ····

Je třeba aplikovat účinější hormonální terapie a snížit vedlejší účinky a rizika.

Předpokládá se, že kombinované terapie podle předmětného vynálezu, farmaceutické prostředky a soupravy, které mohou být v těchto terapiích použity, by mohly tyto potřeby oslovit.

Podstata vynálezu

Předmětem předmětného vynálezu je poskytnout způsob léčby nebo způsob snížení výskytu nebo rizika vzniku návalů horka, vasomotorických příznaků, osteoporózy, kardiovaskulárních onemocnění, hypercholesterolemie, hyperlipidemie, aterosklerózy, hypertenze, insulinové rezistence, diabetů, obezity (zejména břišní obezity), nepravidelné menstruace a vaginální suchosti.

Dalším předmětem je poskytnout způsoby léčby nebo způsob snížení rizika vzniku výše uvedených onemocnění a současně s tím minimalizovat nežádoucí vedlejší účinky.

Dalším předmětem je poskytnout soupravy a farmaceutické prostředky vhodné pro použití výše zmíněných postupů.

V jednom provedení předmětný vynález poskytuje způsob jak snížit nebo zcela eliminovat výskyt příznaků menopauzy. Zmíněný způsob zahrnuje, v případě potřeby zmíněného snížení nebo eliminace, podání terapeuticky účinného množství estrogenů nebo jeho proléku spolu s podáním terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů nebo jeho proléku pacientovi, přičemž zmíněný modulátor je sloučenina odlišná od uvedeného estrogenů.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku stavu, který je vybrán ze skupiny, kterou tvoří osteoporóza, hypercholesterolemie, hyperlipidemie, ateroskleróza, hypertenze, Alzheimerova choroba, insulinová rezistence, diabetes, úbytek svalové hmoty, obezita, vaginální krvácení způsobené hormonální substituční terapií a bolestivost prsů způsobená hormonální substituční terapií. Zmíněný způsob zahrnuje, v případě potřeby zmíněné eliminace nebo snížení, podání terapeuticky účinného množství estrogenů nebo jeho proléku spolu s podáním terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů nebo jeho proléku pacientovi, přičemž zmíněný modulátor je sloučenina odlišná od uvedeného estrogenů.

V dalším provedení vynález poskytuje farmaceutický prostředek, který zahrnuje:

a) farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, ředidlo nebo nosič;

b) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenů nebo jeho proléku; a

c) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptorů nebo jeho proléku, přičemž zmíněný modulátor je sloučenina odlišná od uvedeného estrogenů.

V dalším provedení vynález poskytuje soupravu, obsahující jednu nádobku s farmaceutickou formulací, která obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenů nebo jeho proléku; a zmíněná souprava dále obsahuje druhou nádobku, která obsahuje farmaceutickou formulaci obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptorů nebo jeho proléku.

V jednom provedení se vynález vztahuje ke způsobu léčby nebo způsobu snížení rizika vzniku osteoporózy. Způsob se skládá z podání terapeuticky účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku kardiovaskulárních onemocnění. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku hypercholesterolemie. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku hyperlipidemie. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku aterosklerózy. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptorů (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

• ·

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku hypertenze. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika rozvoje nespavosti. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vývoje ztráty rozpoznávacích funkcí. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku Alzheimerovy choroby. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku diabetů. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožot součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika rozvoje příznaků menopauzy. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku obezity (zejména břišní obezity). Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenu pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vývoje bolestivosti prsů způsobené hormonální substituční terapií. Způsob zahrnuje podání terapeuticky >

« · • · • · · 4 4 • · · · 4 « · • ····*« « _e• · · · · · ·· ·· · · · « · · účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vývoje vaginálního krvácení způsobeného hormonální substituční terapií. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství estrogenů pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení se vynález vztahuje ke způsobu léčby nebo způsobu snížení výskytu osteoporózy, který zvyšuje hladiny prekurzoru pohlavních steroidů vybraných ze skupiny, kterou tvoří dehydroepiandrosteron (DHEA), dehydroepiandrosteronsulfát (DHEA-S), androstendion a androst-5-en-3P,17p-diol (5-diol), u pacientů a to v případě potřeby dosáhnout zmíněné léčby nebo snížení rizika. Způsob dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) a terapeuticky účinného množství estrogenů jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení se vynález vztahuje ke způsobu léčby nebo způsobu snížení výskytu návalů horka a pocení a to tím, že dojde ke zvýšení hladin prekurzoru pohlavních steroidů vybraných ze skupiny, kterou tvoří dehydroepiandrosteron (DHEA), dehydroepiandrosteronsulfát (DHEA-S), androstendion a androst-5-en-3p,17P-diol (5-diol), u pacientů a to v případě potřeby dosáhnout zmíněné léčby nebo snížení rizika. Způsob dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) a terapeuticky účinného množství estrogenů jakožto součásti kombinované terapie.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku výše uvedených onemocnění. Způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství agonisty/antagonisty estrogenů (směsný ŠERM) pacientovi a dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství čistého selektivního modulátoru estrogenového receptoru (čistý-SERM) nebo estrogenů jakožto součástí kombinované terapie. Termín směsný ŠERM, který je zde používán, znamená, že při fyziologických nebo farmakologických koncentracích má ŠERM určitou estrogenovou aktivitu u tkání endometria a prsu.

Zde používaný termín čistý ŠERM znamená, že při fyziologických nebo farmakologických koncentracích nemá ŠERM žádnou estrogenovou aktivitu u tkání endometria a prsu.

* • ·

V dalším provedení vynález poskytuje soupravu, která obsahuje jednu nádobku s terapeuticky účinným množstvím alespoň jednoho estrogenů a dále obsahuje druhou nádobku s terapeuticky účinným množstvím alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptoru.

a) farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, ředidlo nebo nosič: b) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenů; a c) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptoru.

Zde používané spojení -sloučeniny podávané pacientovi spolu s dalšími sloučeninamiznamená, že sloučeniny jsou podávány dostatečně blízko k podávání zmíněných dalších sloučenin, a to tak, tak, že pacient získá fyziologické účinky obou sloučenin současně a to i přesto, že sloučeniny nejsou podávány v blízkých časových intervalech. Jsou-li sloučeniny podávány jakožto součást kombinované terapie, jsou podány obě najednou.

Estrogenová substituční terapie je běžně používána u žen po menopauze s cílem předcházet onemocněním, která jsou důsledkem menopauzy zejména osteoporóza, návaly horka, koronární srdeční onemocnění (Cummings 1991) a léčit je. Tato terapie však způsobuje určité nežádoucí účinky spojené s dlouhodobým podáváním estrogenů. Hlavní nevýhodou této terapie je konkrétně vnímané zvýšené riziko karcinomu prsu a/nebo dělohy (Judd, Meldrum a kol., 1983; Colditz, Hankinson a kol. 1995) způsobené estrogenem. Autoři předmětného vynálezu zjistili, že přídavek selektivního modulátoru estrogenového receptoru (ŠERM) k podávanému estrogenů tyto nežádoucí účinky potlačuje.

Předmětný vynález poskytuje způsob léčby nebo způsob snížení rizika vzniku bolestivosti prsů způsobené hormonální substituční terapií (HRT). Protože ŠERM způsobuje atrofíi epitelu prsu namísto stimulace, kterou působí HRT, bolestivost prsů se sníží nebo bude zcela eliminována.

Vynález také poskytuje způsob prevence a způsob léčby vaginálního krvácení způsobeného hormonální substituční terapií (HRT). Protože ŠERM způsobuje atrofíi endometria, nebude k vaginálnímu krvácení docházet.

Na druhé straně samotné SERMy mají velmi malé nebo nemají žádné pozitivní účinky na určité příznaky menopauzy jako jsou návaly horka a pocení. Autoři vynálezu věří, že přídavek estrogenů do léčby příznaků menopauzy pomocí SERMu návaly horka a pocení sníží nebo zcela eliminuje. Je důležité vědět, že návaly horka a pocení jsou prvním ukazatelem menopauzy a kladná nebo záporná odezva pacientek na léčbu závisí obvykle na úspěchu či neúspěchu snižováni návalů horka a pocení.

fc

Zde používaný selektivní modulátor estrogenového receptorů (ŠERM) je sloučenina, která buď přímo nebo prostřednictvím svých aktivních metabolitů působí jako antagonista estrogenového receptorů (antiestrogen) v tkáni prsu a také poskytuje estrogenový nebo estrogenů podobný účinek na kostní tkáň a na hladiny cholesterolu v séru (tzn. snižuje cholesterol v séru). Nesteroidní sloučeniny, které působí jako antagonisty estrogenového receptorů in vitro nebo v lidských prsních tkáních nebo v prsních tkáních potkana (zejména tehdy, působí-li sloučenina jako antiestrogen na buňky lidského karcinomu prsu), budou pravděpodobně působit jako SERMy. Naopak steroidní antiestrogeny, protože nemají žádný pozitivní vliv na cholesterol v séru, nemají tendenci působit jako SERMy. Mezi nesteroidní antiestrogeny, které jsme testovali a u kterých jsme zjistili, že působí jako SERMy, patří EM-800, EM-652.HC1, Raloxifen, Tamoxifen, 4-hydroxy-Tamoxifen, Toremifen,

4-hydroxy-Toremifen, Droloxifen, LY 353 381, LY 335 563, GW-5638, Lasofoxifen, TSE 424 a Idoxifen. Toto jsou však pouze příklady.

Rovněž jsme však zjistili, že všechny SERMy nereagují stejným způsobem a že mohou být rozděleny do dvou podtříd: čisté SERMy a směsné SERMy. U potkanů některé SERMy jako EM-800 a EM-652.HC1 nemají při fyziologických nebo farmakologických koncentracích žádnou estrogenovou aktivitu v případě tkáně prsu nebo endometria a mají hypocholesterolemické a hypotriglyceridemické účinky. Tyto SERMy mohou být označeny jako čisté SERMy. Ideálním SERMem je čistý ŠERM typu EM-652.HC1 a to z důvodu jeho velké a čistě antiestrogenové aktivity u prsní žlázy. Ostatní jako Raloxifen, Tamoxifen, Droloxifen,’4-hydroxy-Tamoxifen (l-(4-dimethylaminoethoxyfenyl)-l-(4-hydroxyfenyl)-2-fenyl-but-l-en), Toremifen, 4-hydroxy-Toremifen [(Z)-(2)-2-[4-(4-chloro-l-(4-hydroxyfenyl)-2-fenyl-l-butenyl)fenoxy]-N,N-dimethylethanamin), LY 353 381, LY 335 563, GW-5638 a Idoxifen vykazují u prsu a endometria určitou estrogenovou aktivitu. Tato druhá skupina SERMů může být nazývána směsné SERMy. Nežádoucí estrogenové aktivity těchto směsných SERMů mohou být inhibovány přídavkem čistých SERMů, což je pro in vitro testy ukázáno na obr. 6 a 7 a pro in vivo testy karcinomu prsu na obr. 9. Protože xenoimplantáty lidského karcinomu prsu u nahých myší jsou nejbližším dostupným modelem lidského karcinomu prsu, porovnali jsme účinek samotného EM-800 a Tamoxifenu a jejich kombinace na růst xenoimplantátu karcinomu prsu ZR-75-1 u nahých myší.

Pokud není stanoveno jinak, předpokládá se u všech zde zmíněných kombinací podávání různých sloučenin. Tedy například podávání SERMu a estrogenů se vztahuje k podávání dvou odlišných sloučenin - nikoliv k podávání jediné sloučeniny, kterou je ŠERM s určitými estrogenovými charakteristikami.

• 4

44

Autor vynálezu se domnívá, že je velice důležité, že SERMy podle předmětného vynálezu působí u tkáně prsu, dělohy a endometria jako čisté antiestrogeny, protože SERMy musí působit proti potenciálním vedlejším účinkům estrogenů, které mohou zvyšovat riziko karcinomu těchto tkání. Autoři vynálezu se domnívají, že konkrétně benzopyranové deriváty podle vynálezu, které mají v pozici 2 absolutní konfiguraci 2S, jsou vhodnější než jejich racemická směs. V US 6 060 503 jsou uvedeny opticky aktivní benzopyranové antiestrogeny, které mají 2S konfiguraci, za účelem použít je při léčbě estrogenem zhoršovaného karcinomu prsu a endometria. Tyto sloučeniny jsou významně účinnější než jejich racemické směsi (viz obr. 1 až 5 v US 060 503).

Enantiomer s 2S konfigurací v čisté formě je velmi obtížné průmyslově získat. Autor vynálezu se domnívá, že výhodnější je kontaminace méně než 10 hmotn. %, výhodněji méně než 5 hmotn. % a ještě výhodněji méně než 2 hmotn. % 5R enantiomerů.

Z obr. 9 je patrné, že přibližně 100% stimulační účinek Tamoxifenu na růst nádoru byl zcela blokován současným působením EM-652.HC1. EM-652.HC1 v souladu se svou čistě antiestrogenovou aktivitou nemá žádný stimulační vliv na růst xenoimplantátů lidského karcinomu prsu ZR-75-1 u nahých myší (obr. 9).

Testovali jsme steroidní antiestrogen ICI 182,780 a zjistili jsme, že nepůsobí jako ŠERM. SERMy mohou být v souladu s předmětným vynálezem podávány ve stejné dávce jako je známo ve stavu techniky, a to tam, kde jsou používány jako antiestrogeny místo jako SERMy.

Také jsme uvedli vzájemný vztah mezi pozitivními účinky SERMů na cholesterol v séru a pozitivními estrogenovými a estrogenů podobnými účinky na kosti. SERMy mají kladný vliv také na hypertenzi, insulinovou resistenci, diabetes a obezitu (zejména břišní obezitu). Aniž bychom byli vázáni teorií, přdpokládáme, že SERMy, z nichž řada má výhodněji dva aromatické kruhy spojené jedním nebo dvěma atomy uhlíku, budou interagovat s estrogenovým receptorem prostřednictvím části molekuly, která je receptorem nejlépe rozpoznávána. Výhodnější SERMy mají takové postranní řetězce, které mohou selektivně působit jako antagonisty v prsních a obvykle také děložních tkáních, aniž by však měly antagonistické vlastnosti v jiných tkáních. SERMy mohou tedy působit jako antiestrogeny v prsu, zatímco překvapivě působí jako estrogeny (nebo poskytují estrogenů podobnou aktivitu) v kostech a v krvi (kde jsou ovlivňovány zejména koncentrace lipidů a cholesterolu), což je žádoucí. Žádoucí účinek na cholesterol a lipidy se převádí na žádoucí účinek proti ateroskleróze, o níž je známo, že je nepříznivě ovlivněna nesprávnými hladinami cholesterolu a lipidů.

··· · fl ·· ·· · · • ⁹ · · · 9 · · * * «

O ···· flfl·· · 4 ·

S · ·♦·♦··· · ·«· · · · * • · · ·· ···· • · · ·· ·· ·· ····

Na druhé straně osteoporóza, hypercholesterolemie, hyperlipidemie, vědomí a ateroskleróza reagují na estrogenovou a estrogenů podobnou aktivitu žádoucím způsobem. Použitím estrogenů v kombinaci se SERMy podle vynálezu jsou v cílových tkáních poskytovány žádoucí účinky, aniž by však docházelo k nežádoucím vlivům v určitých jiných tkáních. Například kombinace estrogenů a SERMu může mít žádoucí estrogenový účinek na kosti (nebo lipidy nebo cholesterol), zatímco nežádoucí estrogenový účinek u prsu a dělohy se nevyskytuje a to z toho důvodu, že SERMy, jakožto antagonisty estrogenů, budou účinně blokovat vliv estrogenů u prsu a endometria, což je patrné z obr. 10 a 11.

Jak je ukázáno na obr. 10, ačkoliv hladiny cirkulujícího 17P-estradíolu byly zvýšeny z

95,9 ± 32,4 pg/ml u zdravých zvířat na 143,5 ± 7,8 pg/ml (50% zvýšení u zvířat ošetřených EM-800, 0,5 mg/kg, denně orálně / po dobu 12 týdnů), byla pozorována patrná atrofie mléčné žlázy. Podobně na obr. 11 byla u zvířat, která dostávala EM-800 (0,5 mg/kg), zjištěna patrná atrofie endometria. U těchto zdravých zvířat dostávajících čistý antiestrogen EM-800 byl inhibiční efekt estrogenů v hypotalamo-hypofyzární hladině eliminován, čímž byl zvýšen LH a poté sekundárně sekrece 17β-estradiolu vaječníky.

V 6 měsíční studii, která proběhla u zdravých potkanů, kteří dostávali EM-652 ve stejných denních dávkách 0,5 mg/kg, byla změřena koncentrace antiestrogenů EM-652 0,4 ng/ml v cirkulaci (URMA-05-011-94). Protože průměrná koncentrace EM-652 v séru žen, které dostávaly orálně denní dávku EM-800 20 mg, byla změřena 7,3 ± 0,77 ng/ml, je zřejmé, že aplikace estrogenové substituční terapie u žen po menopauze neovlivňuje nežádoucím způsobem silný inhibiční vliv EM-652 a jeho schopnost působit preventivně proti karcinomu prsu a endometria. Studie fáze I ukázaly, že EM-800 a EM-652.HCl poskytují většinou zvýšené hladiny EM-652 v séru.

Nežádoucí účinky jsou také zmírňovány prostřednictvím kombinace použité ve vynálezu. V případě všech zde diskutovaných onemocnění, je jakýkoliv další účinek na prsní tkáně, který by mohl jinak být výsledkem působení estrogenů podaného při substituční dávce, účinně blokován antiestrogenním účinkem SERMu, což je patrné z obr. 2 a 3. Stejný závěr je možno učinit z obr. 10.

V upřednostňovaných provedeních jsou přidávány prekursory pohlavních steroidů (dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfát, androst-5-en-3p,17P-diol, 4-androsten-3,17-dion a jejich proléky) nebo androgenní činidla. Cílem je poskytnout pozitivní androgenní účinky, konkrétně snížení rizika vzniku onemocnění kostí nebo jeho léčby. Kombinace SERMu a estrogenů při léčbě osteoporózy rozpad kostí snižuje nebo zcela eliminuje. Ale další přídavek androgenu nebo DHEA (a jiných prekursorů pohlavních steroidů) umožňuje obnovu porušených ♦ ♦ * · • · 0 • · »· · • · · • 1 · · · · · · « ·· · ·· ·· ·· kostních tkání. Prekursory pohlavních steroidů, které mají další pozitivní účinky při léčbě hypercholesterolemie, hyperlipidemie, syndromů menopauzy, Alzheimerovy choroby, kardiovaskulárních onemocnění, karcinomu prsu, karcinomu dělohy a karcinomu vaječníků, mohou spolu s kombinací SERMu a estrogenu zlepšovat léčbu výše uvedených onemocnění. Tento synergistický účinek je důsledkem faktu, že androgeny (nebo prekursory pohlavních steroidů metabolizovaných na androgeny v periferních tkáních) a estrogeny nebo SERMy pracují různými mechanismy.

V některých provedeních jsou přidávány progestiny, jejichž cílem je poskytnout další androgenovy účinek. Progestiny mohou být použity v nízkých dávkách, které jsou v daném stavu techniky známé aniž by docházelo k nežádoucímu ovlivnění jiných receptorů než jsou androgenové receptory (např. receptory glukokortikoidů). Progestiny také nemusí mít nežádoucí androgenové vedlejší účinky (jako je ochlupení tváře u žen).

Návaly horka, kardiovaskulární symptomy, Alzheimerova choroba, ztráta rozpoznávacích funkcí a nespavost používají určité estrogenové receptory, které jsou situovány v centrálním nervovém systému. Tato onemocnění lze pravděpodobně alespoň částečně vysvětlit nízkými hladinami estrogenu v mozku. Exogenní estrogeny a konkrétně estradiol mohou procházet přes mozkovou barieru a vázat se na estrogenové receptory s cílem obnovit normální estrogenovou aktivitu. Na druhé straně SERMy podle předmětného vynálezu a konkrétněji ty, které patří do skupiny EM-652.HC1, nemohou procházet přes mozkovou bariéru, což je ukázáno v příkladu 9. Nemohou tedy mít antagonistický účinek na pozitivní účinky estrogenů v mozku, ale mají antagonistický účinek na negativní účinky estrogenů v tkáni prsu, dělohy a endometria. Toto činí danou kombinaci (ŠERM + estrogeny) atraktivní konkrétně pro léčbu nebo snížení rizika vzniku výše uvedených stavů.

Další pozitivní účinky kombinace estrogenu a SERMu

Hlavním důvodem, proč ženy konzultují svůj fyzický stav při menopauze, je výskyt návalů horka, problému, o němž je známo, že může být eliminován estrogenovou substituční terapií. Protože místem odpovědným za návaly horka je centrální nervová soustava (CNS) a protože EM-652 má do CNS velmi těžký přístup (data jsou přiložena), předpokládá se, že podávání estrogenu bude regulovat návaly horka bez současného zásahu SERMu. Na druhé straně ŠERM bude eliminovat všechny negativní účinky estrogenů v jiných místech, zejména riziko karcinomu prsu a dělohy. Přídavek EM-652 k estrogenům blokuje stimulační účinek estrogenů na mléčnou žlázu a dělohu, zatímco v jiných tkáních může EM-652 uplatňovat svůj • 000 0 ♦ * ; · • · 0 0 0 0 vlastní pozitivní vliv například na kosti, kde částečně zabraňuje vlivu ovariektomie na minerální hustotu kostí.

Nebyl pozorován nežádoucí účinek EM-652 na žádný parametr, ale měly by se uplatnit pozitivní účinky související s prevencí a léčbou karcinomu prsu a dělohy.

Předkládaná data ukazují, že zatímco přídavek EM-652 blokuje stimulační efekt estrogenu na mléčnou žlázu a dělohu (příklady 4, 8 a 10), v jiných tkáních se uplatňují pozitivní účinky EM-652.HCl. Například u kostí (příklad 5) sloučenina EM-652 částečně eliminuje vliv ovariektomie na minerální hustotu kostí. Tento účinek vedl ke komercializaci raloxifenu za účelem léčby osteoporózy u žen po menopauze. U raloxifenu bylo zjištěno, že z hlediska prevence ztráty BMD u potkanů je 3 až 10 krát méně účinný než EM-652 (Martel a kol., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 2000:74, 45 až 56). Ačkoliv účinek SERMu na BMD, který je ukázán pro další SERMy typu raloxifenu, není takový jako je účinek, kterého je dosahováno s estrogeny, bylo zjištěno, že vliv na zlomeniny kostí pozorovaný u žen po menopauze je stejný jako u estrogenů a SERMu raloxifenu. Předpokládá se tedy, že ačkoliv pomocí EM-652 nebo jiných SERMů není BMD zcela obnovena, vliv na zlomeniny kostí, což je nejdůležitější parametr odezvy, je stejně významný jako vliv pozorovaný při použití estrogenů. Kromě toho je možné, a předpokládá se to, že měření BMD neposkytuje úplný obrázek o vlivu sloučeniny na fyziologii kostí.

Významným aspektem je to, že zatímco léčba pomocí SERMu vykazuje pozitivní účinky na kosti, kombinace SERMu s esťrogenem, poskytovaná zejména s cílem zabránit návalům horka, umožňuje snížit riziko karcinomů prsu a dělohy, které souvisí s použitím samotných estrogenů.

Upřednostňované SERMy, které jsou zde diskutovány, se vztahují k: (1) všem onemocněním, které je možno ovlivnit pomocí vynálezu; (2) terapeutickým i profylaktickým aplikacím; a (3) výhodnějším farmaceutickým prostředkům a soupravám.

Pacientem, který potřebuje léčbu nebo u něhož je třeba snížit riziko nástupu daného onemocnění je takový pacient, u něhož buď bylo toto onemocnění diagnostikováno nebo který je náchylný ke vzniku tohoto onemocnění.

Není-li uvedeno jinak je výhodnější dávka aktivních sloučenin (koncentrace a způsoby podání) podle vynálezu stejná pro terapeutické i profylaktické účely. Dávka pro každou zde uvedenou aktivní složku je stejná bez ohledu na onemocnění, které má být léčeno (nebo bez ohledu na to, jedná-li se o onemocnění, jehož pravděpodobnost nástupu má být snížena).

0

Ne-lí uvedeno jinak nebo není-li to zřejmé z kontextu, vztahují se zde uvedené dávky k hmotnosti aktivních sloučenin, které nejsou ovlivněny farmaceutickými pomocnými látkami, ředidly, nosiči a jinými přísadami, které jsou však žádoucí součástí, což je uvedeno v příkladech. Jakékoliv formy dávky (kapsle, tableta, injekce a jiné), které jsou ve farmaceutickém průmyslu běžně používány, je možno použít i zde a termíny „pomocná látka“, „ředidlo“ nebo „nosič“ zahrnují takové neaktivní přísady, které jsou v daných formách dávky a ve farmaceutickém průmyslu spolu s aktivními složkami běžně používány. Například mohou být použity kapsle, pilule, potahové vrstvy, pevná nebo kapalná ředidla nebo přídavné látky, ochucovadla, konzervační prostředky a podobné.

Všechny aktivní přísady, které jsou použity v libovolné terapii, která je zde diskutována, mohou být formulovány do farmaceutických prostředků, které rovněž zahrnují jednu nebo více dalších aktivních sloučenin. Mohou být také podávány každá samostatně, ale v dostatečně blízkých časových intervalech a to proto, aby měl pacient zvýšené krevní hladiny nebo aby se jinak současně uplatnily pozitivní účinky každé aktivní přísady (nebo strategie). V některých výhodnějších provedeních vynálezu je například do jediného farmaceutického prostředku formulována jedna nebo více aktivních přísad. V jiném provedení vynálezu je poskytována souprava, která obsahuje alespoň dvě samostatné nádoby, kde se z pohledu aktivní přísady obsažené v nádobě obsahy alespoň jedné nádoby částečně nebo zcela liší od obsahu alespoň jedné jiné nádoby.

Kombinované terapie, které jsou zde diskutované, zahrnují také použití jedné aktivní přísady (z kombinace) při výrobě léku určeného pro léčbu (nebo snížení rizika) takového onemocnění, jehož léčba nebo prevence zahrnují ještě jinou aktivní přísadu kombinace podle vynálezu. V jednom provedení vynález například poskytuje použití SERMu při přípravě léku, který je určen k použití v kombinaci s estrogenem in vivo, určeného k léčbě libovolného onemocnění, u něhož se předpokládá, že bude předložená kombinovaná terapie účinná (tzn. osteoporóza, kardiovaskulární onemocnění, hypercholesterolemie, hyperlipidemie, ateroskleróza, hypertenze, insulinová rezistence, diabetes, obezita, návaly horka, pocení, nepravidelná menstruace, Alzheimerova choroba, problémy s rozpoznáváním, jakékoliv symptomy související s menopauzou a vaginální suchost). V jiném provedení vynález poskytuje použití estrogenu, který je vybrán ze skupiny skládající se z 17P-estradiolu, esterů 17P~estradiolu (tzn. benzoátu, cypionátu, diethanátu, valerátu apod.), 17a-estradiolu, esterů 17a-estradiolu, estriolu, esterů estriolu, estronu, esterů estronu, konjugovaného estrogenu, ekvilinu, esterů ekvilinu,

17a-ethynylestradiolu, esterů 17a-ethynylestradiolu, dienestrolu, mestranolu, esterů mestranolu, «Α * AA AA AA ♦ · • · · AAAA A A A · η· · · · · · A · A ♦ · • tt AAAA A A A AAA «ΑΑ A •AA A· AAAA ·· · AA AA A A A·· tt

DES, fytoestrogenu (ů), tibolonu, ethyndiolu, při přípravě léku určeného v kombinaci se SERMem k použití při léčbě jakéhokoliv z těchto onemocnění.

O estrogenech je známo, že stimulují množení epitelových buněk prsu a předpokládá se, že samotné množení buněk tím, že akumuluje náhodné genetické chyby, které mohou vést k nádorovému onemocnění, zvyšuje riziko karcinomu (Preston Martin a kol., Cancer. Res. 50:7415 až 7421, 1990). Na základě tohoto konceptu byly antiestrogeny zahrnuty do prevence karcinomu prsu prostřednictvím snížení rychlosti buněčného dělení stimulovaného estrogeny.

Ztráta cyklu vaječníků, která byla zjištěna u samic Sprague-Dawley potkana po 10 měsících života, je doprovázena zvýšením estrogenu v séru a hladin prolaktinu a snížením androgenu v séru a koncentrací progesteronu (Lu a kol., 61^st Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. # 134), 1979; Tang a kol., Biol. Reprod. 31: 399 až 413, 1984; Russo a kol., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Intergument and Mammary Glands 252 až 266, 1989; Sortino a Wise, Endocrinology 124: 90 až 96, 1989; Cardy, Vet, Pathol. 28: 139 až 145, 1991). Tyto hormonální změny, které se spontánně vyskytují u stárnoucích samic potkana, jsou spojeny s multiohniskovým množením a se zvýšením sekreční aktivity acino/alveolárních tkání a s rozšířením kanálku mléčné žlázy a s tvorbou cyst (Boorman a kol., 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139 až 145, 1991). Je třeba zmínit, že hyperplastické a neoplastické změny mléčné žlázy samice potkana, jsou často doprovázeny zvýšenými hladinami estrogenu a prolaktinu (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25 až 42, 1980). Léčba pomocí EM-800, což je ŠERM podle předmětného vynálezu, indukuje atrofii mléčné žlázy, což je charakterizováno snížením velikostí a počtu lobulárních struktur a nulovou sekreční aktivitou, což naznačuje silnou antiestrogenovou aktivitu EM-800 v případě mléčné žlázy (Luo a kol. Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

O estrogenech je známo, že snižují cholesterol v séru, ale zvyšují nebo nemají žádný vliv na hladiny triglyceridů v séru (Love a kol., Ann. Intern. Med. 115: 860 až 864, 1991; Walsh a kol., New Engl. J. med. 325: 1196 až 1209, 1991; Barrett -Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl 5A): 40S až 43S, 1993; Russell a kol., Atherosclerosis 100: 113 až 122, 1993; Black a kol., J. Clin. Invest. 93:63 až 69, 1994; Dipippo a kol., Endocrinology 136: 1020 až 1033, 1995; Ke a kol., Endocrinology 136: 2435 až 2441, 1995). Obr. 3 ukazuje, že EM-800 vykazuje jak hypocholesterolemické tak i hypotriglyceridemické účinky u potkanů, čímž ukazuje svůj jedinečný účinek na profil lipidů v séru, který je znatelně odlišný od jiných SERMů jako je tamoxifen (Bruning a kol., Br. J. Cancer 58: 497 až 499, 1988; Love a kol., J. Nati. Cancer Inst. 82: 1327 až 1332, 1990; Dipippo a kol., Endocrinology 136: 1020 až 1033, 1995; Ke a kol. Endocrinology 136: 2435 až 2441, 1995), droloxifen (Ke a kol. Endocrinology 136: 2435 až

0 ·· ·· ·· ·· ··* 0090 00··

0··· · · · · · · · • 9 0009 · 9 9 090 « · · · •00 90 · ··· ·* · 00 ·· ······

2441, 1995) a raloxifen (Black a kol., J. Clin. Invest. 93: 63 až 69, 1994). Předpokládá se tedy, že kombinace estrogenů a EM-800 by měla zabránit hypocholesterolemickým a hypotriglyceridemickým účinkům EM-800, a tudíž se předpokládá, že tato kombinace by mohla mít pozitivní vliv na lipidy v séru.

Je třeba zmínit, že profil sérových lipidů u potkanů a lidí je znatelně odlišný. Avšak protože mechanismus zprostředkovaný estrogenovým receptorem je součástí hypocholesterolemického vlivu estrogenů i antiestrogenů (Lundeen a kol., Endocrinology 138: 1552 až 1558, 1997), zůstávají potkani modelem, který je možno použít ke studiu vlivů estrogenů a „antiestrogenů“ na snížení cholesterolu u lidí.

Prostřednictvím podávání kombinace dvou léků jsme rovněž studovali potenciální interakci inhibičního účinku nového antiestrogenů (EM-800) s účinkem prekursoru pohlavního steroidu (DHEA) na růst xenoimplantátů lidského karcinomu prsu ZR-75-1 u nahých myší. Obr. 2 a 3 ukazují, že DHEA v daných používaných dávkách způsobuje 50 až 80% inhibici růstu nádoru, zatímco téměř úplnou inhibici růstu nádoru, které je dosaženo při nízké dávce antiestrogenů, DHEA neovlivňoval. Podobný účinek byl pozorován u EM-800 a progesteronu, MPA na růst stimulovaný E₂ karcinomu mléčné žlázy, který byl indukován DMBA u potkana po ovariektomii, což je ukázáno na obr. 4.

Určitá omezení při měření minerální hustoty kostí (BMD) jsou dobře známá. Jako příklad je možno uvést, že zatímco měření BMD nevykazuje žádnou změnu u potkanů léčených steroidním antiestrogenem ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25:

až 9, 1993), inhibiční změny byly pomocí histomorfometrie pozorovány (Gallagher a kol., Endocrinology 133: 2787 až 2791, 1993). Podobné odlišnosti byly zjištěny u Tamoxifenu (Jordán a kol., Breast Cancer Res. Treat. 10: 31 až 35, 1987; Sibonga a kol., Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71 až 79, 1996).

Je třeba zmínit, že snížená minerální hustota kostí není abnormalitou spojenou pouze se sníženou silou kosti (Návody pro preklinické a klinické hodnocení činidel používaných při prevenci nebo k léčbě postmenopauzální osteoporózy, Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FD A, květen 1994). Je tedy důležité analyzovat změny biochemických parametrů metabolismu kostí, které jsou indukovány různými sloučeninami a léčbu za účelem získání lepších znalostí o jejich působení.

Konkrétně je důležité uvést, že kombinace DHEA a EM-800 vykazovala neočekávané pozitivní účinky na důležité biochemické parametry metabolismu kostí. DHEA sám o sobě neovlivňuje poměr hydroxyprolin/kreatinin v moči, což je znak resorpce kostí. Kromě toho nebyl detekován žádný účinek DHEA na denní vylučování vápníku nebo fosforu do moči (Luo a kol., ·· · ·

• · • · · ·♦ 4 ·4 • 4 4 · » « » * • 4 · β » • · · »

4444

Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997). Sloučenina EM-800 snížila poměr hydroxyprolin/kreatinin o 48 %, ale podobně jako DHEA nebyl pozorován žádný účinek EM-800 na vylučování vápníku a fosforu do moči. Kromě toho EM-800 nevykazovala žádný vliv na aktivitu alkalické fosfatasy, což je znak tvorby kostí, ale DHEA zvýšil hodnotu tohoto parametru o asi 75 % (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

Jeden z neočekávaných účinků kombinace DHEA a EM-800 se vztahuje k poměru hydroxyprolin/kreatinin v moči, znaku resorpce kostí. Tento poměr byl v případě, že byly kombinovány DHEA a EM-800 snížen o 69 %. Tato hodnota je statisticky odlišná (p<0,01) od 48% inhibice dosažené pomocí samotného EM-800, samotný DHEA nevykazoval žádný efekt. Přídavek DHEA k EM-800 tedy zvyšuje o 50 % inhibiční vliv EM-800 na reabsorpci kostí. Nejdůležitější je fakt, že dalším neočekávaným účinkem přídavku DHEA k EM-800 byl přibližně 84% pokles obsahu vápníku v moči (z 23,17 ± 1,55 na 3,71 ± 0,75 gmol/24 h/100 g (p< 0,01) a 55% pokles obsahu fosforu v moči (z 132,72 ± 6,08 na 59,06 ± 4,76 gmol/24 h/100 g (p< 0,01) (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

Tabulka 1

SKUPINA	MOČ	SÉRUM
VÁPNÍK (gmol/24 h/100 g)	FOSFOR (gmol/24 h/100 g)	HP/Cr (gmol/mmol)	tALP (IU/1)
kontrola	23,17+1,55 '	132,72 + 6,08	13,04 + 2,19	114,25 + 14,04
DHEA (10 mg)	25,87 + 3,54	151,41 ± 14,57	14,02 ± 1,59	198,38 ± 30,76*
EM-800 (75 gg)	17,44 + 4,5	102,03 +25,13	6,81 ±0,84**	114,11 ±11,26
DHEA + EM-800	3,71 ±0,75**	59,06 ± 4,76**	4,06 ± 0,28**	204,38 ± 14,20**

Je zajímavé také uvést, že silnému inhibičnímu účinku EM-800 na cholesterol v séru nelze současnou léčbou DHEA zabránit (Luo a kol., Endocrinology 138: 4435 až 4444, 1997).

Přestože Raloxifen a podobné sloučeniny zabraňují úbytku kostí a snižují hladinu cholesterolu v séru (jako estrogeny), mělo by být uvedeno, že byl-li Raloxifen porovnán sPremarinem z pohledu BMD, byl účinek Raloxifenu na BMD mnohem menší než účinek Premarinu (Minutes of Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee, FDA Thursday, Meeting # 68, 20. listopad 1997).

• · · · · *♦ ·· «9

9 9 9 V 9 · ·

ΦΦΦΦ 99·· >9 ·

9 999« 9 9 9 999 9 9 9 9

9 9 99 9 999 ·♦ · ·· 99 99 9999

Úbytek kostí, který je pozorována u žen po menopauze, je pravděpodobně spojen se zvýšením rychlosti resorpce kostí, která není zcela kompenzována sekundárním zvýšením tvorby kostí. Parametry tvorby kostí i resorpce kostí jsou při osteoporóze zvýšeny a jak resorpce tak i tvorba kostí jsou inhibovány estrogenovou substituční terapií. U inhibičního účinku estrogenové substituční terapie na tvorbu kostí se tedy očekává, že je výsledkem spojeného mechanismu resorpce a tvorby kostí, kdy primární estrogenem indukované snížení resorpce kosti sleduje snížení tvorby kostí (Parfitt, Calcifíed Tissue International 36 Suppl. 1: S37 až S45, 1984).

Síla pórovité kosti a následná odolnost vůči zlomení nezávisí pouze na celkovém množství pórovité kosti, ale také na trámčité mikrostruktuře, což je stanoveno počtem, velikostí a distribucí trámců. Ztráta funkce vaječníků u žen po menopauze je doprovázena významným snížením celkového objemu trámčitých kostí (Melsen a kol., Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70 až 81, 1978; Vakamatsou a kol., Calcifíed Tissue International 37: 594 až 597, 1985), zejména ve vztahu ke snížení počtu a nižšímu stupni délky trámce (Weinstein a Hutson, Bone 8: 137 až 142, 1987).

Pro usnadnění kombinované terapie podle vynálezu, bere vynález v úvahu pro všechny zde diskutované indikace takové farmaceutické prostředky, které zahrnují ŠERM a estrogen v jediném prostředku určeném pro simultánní podávání. Prostředek může být vhodný pro podávání tradičním způsobem, kam patří orální aplikace, subkutánní injekce, intramuskulámí injekce nebo perkutánní aplikace. Tyto příklady však nejsou limitující. V jiném provedení je poskytována souprava, která zahrnuje jeden nebo více SERMů a estrogen buď v oddělených nádobách nebo v jediném zásobníku. Výše popsané farmaceutické prostředky a soupravy mohou v případě, že jsou použity pro léčbu nebo prevenci osteoporózy, dále obsahovat bisfosfonátovou sloučeninu. Souprava může zahrnovat odpovídající materiály a to pro orální aplikaci, např. tablety, kapsle, sirupy a podobné a pro transdermálni aplikaci např. masti, mléka, gely, krémy, náplasti uvolňující látku a podobné.

Autoři vynálezu předpokládají, že podání estrogenů, SERMů a prekursorů pohlavních hormonů má své využití při vývoji osteoporózy, hypercholesterolemie, hyperlipidemie, aterosklerózy, hypertenze, insulinové rezistence, diabetů, obezity, Alzheimerovy choroby a při léčbě a/nebo snížení výskytu návalů horka a pocení. Aktivní složky podle vynálezu (estrogen, ŠERM nebo prekursor nebo jiné) mohou být formulovány a podávány různými způsoby. Jsou-li aktivní složky podávány v souladu s předmětným vynálezem, mohou být podávány současně nebo samostatně.

Aktivní složka určená pro transdermálni nebo svalovou aplikaci je výhodněji přítomna v množstvích od 0,01 % do 20 % (hmotn.) celkové hmotnosti farmaceutického prostředku, ještě *

4 4 • ···

4«

4« 4 • 4 44 *♦ 44 ···· » · 4 4

4 4 4 4 · 4

4 ·«· 4 4« «

4 « 4 4 4

44 44 4444 výhodněji mezi 2 a 10 %. V případě perkutánní aplikace by měly být 170-estradiol, estron, konjugované estrogeny v množstvích pohybujících se v rozmezí 0,01 % až 1 %, DHEA nebo

5-diol by měly být v koncentracích alespoň 7 %. Aktivní složka může být umístěna v náplasti, která má určitou strukturu známou v dané oblasti techniky, například strukturu uvedenou v EP č. 0 279 982.

Je-li aktivní složka formulována jako mast, mléko, gel nebo krém, je smíchána s vhodným nosičem, který je slučitelný s lidskou pokožkou nebo svaly a který zvyšuje přenos sloučeniny kůží nebo svalem. Vhodné nosiče jsou známé v dané oblasti techniky a zahrnují Klucel HF a Glaxal base. Tyto nosiče však nejsou limitují. Některé jsou komerčně dostupné např. Glaxal base je dostupný od Glaxal Canada Limited Company. Další vhodné pomocné látky (vehikula) je možno najít vKoller a Buri, S.T.P. Pharma 3(2), 115 až 124, 1987. Nosičem je výhodně takový nosič, ve kterém je(jsou) aktivní složka(y) vdané použité koncentraci rozpustná(é) při teplotě okolí. Nosič musí být dostatečně hustý, aby udržel inhibitor v určitém místě kůže nebo svalu, kam je prostředek aplikován. Nesmí docházet k pohybu nebo odpaření a to po dobu, která je dostatečně dlouhá k tomu, aby bylo umožněno proniknutí prekursoru přes danou určitou oblast kůže nebo svalu do krve, kde bude působit žádoucí klinický účinek. Typickým nosičem je směs několika složek např. farmaceuticky přijatelných rozpouštědel a zahušťovadel. Směs organických a anorganických rozpouštědel např. voda a alkohol jako je ethanol může ovlivnit hydrofilní a lipofilní rozpustnost.

Výhodnějšími prekursory pohlavních steroidů jsou dihydroepiandrosteron (DHEA) (dostupný od Diosynth lne., Chicago, Illinois, USA).

Nosič může také zahrnovat různá aditiva, která jsou běžně používána u mastí a mlék a která jsou dobře známá v kosmetice a lékařství. Přítomny mohou být například vůně, antioxidanty, parfémy, gelová činidla, zahušťovadla jako jsou karboxymethylcelulosa, povrchově aktivní činidla, stabilizátory, změkčovadla, barviva a jiná podobná činidla. Jedná-li se použití při léčbě systémových onemocnění, mělo by být místo aplikace na kůži takové, aby bylo možno se vyvarovat nadměrné lokální koncentrace aktivní složky a případné nadměrné stimulaci pokožky aktivní složkou.

Léčba v souladu s vynálezem může trvat neomezeně dlouho.

Estrogenová sloučenina, ŠERM a/nebo prekursor pohlavního steroidů a/nebo bisfosfonát mohou být aplikovány orální cestou a mohou být formulovány s vhodnými farmaceutickými pomocnými látkami např. vysušenou laktosa, mikrokrystalickou celulosou a stearátem hořečnatým do tablet nebo kapslí určených pro orální aplikaci.

0* ·0 • 0 0 *

0 0

0 0 ♦ 0 ·♦!· «

0 0 • 0 0 ·

0

0» «0 •

·0· 0

0 · 0 >00

0 0000 0 0 0 • 0 t

Aktivní iátka může být zpracována do tablet nebo dražé a to tak, že je smíchána s pevnými práškovými nosičovými látkami jako je citrát sodný, uhličitan vápenatý nebo fosforečnan vápenatý a vazebnými činidly jako je polyvinylpyrrolidon, želatina nebo deriváty celulosy. Někdy mohou být přidány také íubrikanty jako je stearát hořečnatý, laurylsíran sodný, „Carbowax“ nebo polyethylenglykol. V případě orální aplikace je možno samozřejmě přidat látky zlepšující chuť.

Jako další formy je možno použít uzavřené pevné kapsle, např. tvrdé želatiny, ale i měkké želatinové kapsle obsahující změkčovadlo nebo plastifíkátor např. glycerin. Uzavřené pevné kapsle obsahuji aktivní látku výhodněji ve formě granulátu např. ve formě směsi s plnidly jako je laktosa, sacharosa, manitol, škroby jako je bramborový škrob nebo amylopektin, deriváty celulosy nebo vysoce dispergované kyseliny křemičité. U měkkých želatinových kapslí je aktivní látka výhodněji rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalinách jako jsou rostlinné oleje nebo kapalné polyethylenglykoly.

Mléko, mast, gel nebo krém by měly být vetřeny do kůže tak, aby nebyl zřetelně vidět žádný zbytek a pokožka by pak neměla být v této oblasti umývána tak dlouho dokud nepronikne téměř celé množství přes kůži tj. výhodněji alespoň 4 hodiny a ještě výhodněji alespoň 6 hodin.

Náplast na pokožku může být použita k dopravení prekursoru v souladu se známými technikami. Je většinou aplikována mnohem déle např. 1 až 4 dny, ale aktivní složka je většinou v kontaktu s menším povrchem, což umožňuje pomalé a konstantní uvolňování aktivní složky.

Mnoho transdermálních systémů pro dopravení léků, které byly vyvinuty a které se používají, jsou rovněž vhodné pro dopravení aktivní složky podle předmětného vynálezu. Rychlost uvolňování je většinou regulována difúzí matrice nebo přechodem aktivní složky přes regulační membránu.

Mechanické aspekty prostředků určených pro transdermální přenos jsou dobře známé u potkana a jsou vysvětleny např. v US patentech 5 162 037, 5 154 922, 5 135 480, 4 666 441,

624 665, 3 742 951, 3 797 444, 4 568 343, 5 064 654, 5 071 644, 5 071 657, jejichž odhalení jsou zde začleněna jako odkaz. Další informace jsou poskytnuty vEP 0 279 982 a v britské patentové přihlášce 2 185 187.

Prostředky mohou být libovolného typu, který je známý v dané oblasti techniky a mezi něž patří adhesivní matrice a prostředky zásobníkového typu. Prostředek může obsahovat matrice s lékem začleněné do vláken, která absorbují aktivní složku a/nebo nosič. U zařízení zásobníkového typu může být zásobník definován polymerovou membránou, která je nepropustná pro nosič a aktivní složku.

• · · · · « · ···· 0 • 0 ·

4* · ·· • 0 0 • · 0

000 0

0 ·· •

0 Φ 0 0 0 0 0 0

0000

Prostředek pro transdermální přenos udržuje aktivní složku v kontaktu se žádoucím povrchem pokožky. U tohoto prostředku je viskozita nosiče aktivní složky méně důležitá než u krému nebo gelu. Rozpouštědlový systém pro transdermální postup může zahrnovat například kyselinu olejovou, lineární alkoholový laktát a dipropylenglykol nebo další rozpouštědla, která jsou v dané oblasti techniky známá. Aktivní složka může být rozpuštěna nebo suspendována v nosiči.

Pro připojení na kůži může být náplast připevněna na adhesivní pásku, která má uprostřed dírkovanou část. Adhesivní část je výhodně pokryta páskem, který se při aplikaci odstraní a jehož cílem je chránit lepivou část před tím, než bude použita. Typickým materiálem, který je vhodný pro následné odstranění je polyethylen nebo polyethylenem potažený papír a výhodněji silikonem potažený papír, který se snadno odstraňuje. Pri aplikaci náplasti je proužek, který se odstraní, jednoduše sloupnut a adhesivní část je přiložena na pokožku pacienta. V US patentu 5 135 480, jehož odhalení je zde zahrnuto jako odkaz, Bannon a kol. popisují alternativní prostředek, který zahrnuje nelepivý způsob připevnění na pokožku. Pouze je nezbytné, aby ŠERM, estrogen a eventuelně prekursor pohlavního steroidu byly podány takovým způsobem a v takové dávce, které jsou dostatečné pro to, aby bylo možno dosáhnout žádoucích koncentrací v krevním séru. V souladu s kombinovanou terapií podle předmětného vynálezu je koncentrace SERMu udržována v rozsahu žádoucích parametrů stejně jako je udržována v žádoucích parametrech koncentrace estrogenu.

Je-li použit estradiol, měla by být koncentrace estradiolu v séru udržována mezi 50 a 300 ng /1, výhodněji mezi 100 a 200 ňg/1 a nejvýhodněji mezi 150 a 175 ng/1. Je-li použit jiný estrogen, může se koncentrace v séru lišit, což je známé a to z toho důvodu, aby byl zahrnut rozdíl v estrogenové aktivitě ve vztahu k estradiolu a aby bylo dosaženo běžných hladin estrogenu před menopauzou. Nižší koncentrace je třeba například v případě použití Mestranolu. Odpovídající hladiny estrogenu v séru mohou být určeny také prostřednictvím ztráty výskytu symptomů menopauzy. Koncentrace druhé sloučeniny dané kombinované terapie (např. EM-652.HC1) v séru je většinou udržována mezi 1 a 15 gg/l, v některých provedeních mezi 2 a 10 pg/l nebo mezi 5 a 10 gg/l.

Estrogenem je výhodněji estradiol, ale může to být estronsulfát sodný nebo jakákoliv jiná sloučenina, která působí jako antagonista estrogenového receptoru. V případě, že se jedná o oddělené podávání sloučenin, je možno použít komerčně dostupné doplňky estrogenu např. „PREMARIN“ dostupný od Ayerst (St-Laurent, Quebec, Kanada). Jedním výhodnějším prekursorem pohlavního steroidu je DHEA ačkoliv DHEA-S a analogy, které budou diskutovány níže, jsou pro účely definované níže rovněž účinné. U běžných pacientů se dávka ·»· 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · 9 9 9 9 · • · 9999 99 · 999 999 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 estrogenů, potřebná k dosažení žádoucích koncentrací v séru, pohybuje mezi 0,3 a 2,5 mg PREMARINu za den a na 50 kg tělesné hmotnosti a to v případě, že je podáván orálně. V určitých provedeních vynálezu může být estrogenem 17p-estradiol aplikovaný perkutánně formou náplasti, která je dostupná od CIBA pod názvem „ESTRADERM“, kde se denní dávka pohybuje mezi 0,05 a 0,2 mg /1 den a 50 kg tělesné hmotnosti. Valerianát 173-estradiolu, který je dostupný od Squibb pod obchodním názvem „DELESTOGEN“, je podáván formou injekce.

Dalšími výhodnějšími produkty estrogenového léku podle vynálezu jsou: náplasti obsahující 170-estradÍol dostupné od Berlex Canada pod obchodním názvem CLIMARA nebo od Novartis Pharma pod obchodním názvem VTVELLE; vaginální prostředek obsahující 17P-estradiol dostupný od Pharmacia & Upjohn pod obchodním názvem ESTRING; gel obsahující 173-estradiol dostupný od Schering pod obchodním názvem ESTROGEL; krém obsahující dienoestrol dostupný od JANSSEN-ORTHO pod obchodním názvem ORTHO DINESTROL.

V některých výhodnějších provedeních je estrogen podáván orálně. Například rozmělněný 17P~estradiol dostupný od Roberts pod obchodním názvem ESTRACE; ethinylestradiol od Schering Canada pod obchodním názvem ESTINYL; estronsulfát (estropipát) dostupný od PHARMACIA-UPJOHN pod obchodním názvem OGEN.

V některých provedením je místo estrogenů upřednostňována směsná sloučenina estrogen/androgen. Jednou ze zmíněných sloučenin je Tibolone [(7a, (7a)-17-hydroxy-7-methyl-19-norpregn-5(10)-en-20-yn-3-on; č patentu US 3 340 279 (1967); US 3 475 465 (1969) a Endocrinological profile popsaný v J. de Visser a kol., Arzneimittel-Forsch, 34, 1010, 1984] dostupný od ORGANON (Holandsko) pod obchodním názvem LIVIAL.

Lékové výrobky obsahující směs estrogenů a progestinu nebo androgenu jsou rovněž výhodné. Zmíněné léky jsou dostupné od Novartis Pharma pod obchodním názvem ESTRACOM, od Sabex pod obchodním názvem CLIMACTERON.

Systém dopravující aktivní látku podle vynálezu perkutánně nebo svalově může být použit rovněž jako nový a zlepšený systém určený k prevenci a/nebo léčbě osteoporózy nebo jiných onemocnění.

Je možno použít jakýkoliv estrogen použitý způsobem, který doporučuje výrobce. Příslušné dávky jsou vdané oblasti známé. Podle vynálezu může být použita jakákoliv sloučenina nebo směs sloučenin, které mají estrogenovou nebo podobnou aktivitu nebo agonistickou aktivitu vůči estrogenovým receptorům (fytoestrogeny, syntetické estrogeny apod.).

·· · ·· · · ······

Selektivní modulátor estrogenového receptoru podle vynálezu má molekulární vzorec s následujícími znaky: a) dva aromatické kruhy spojené 1 nebo 2 atomy uhlíku, oba aromatické kruhy jsou buď nesubstituované nebo substituované hydroxyskupinou nebo skupinou přeměněnou in vivo na hydroxyl; a b) postranní řetězec s aromatickým kruhem a funkcí terciárního aminu nebo jeho soli.

Jedním výhodným SERMem podle vynálezu je sloučenina EM-800 uvedená v PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Molekula EM-800 má strukturu podle vzorce I:

Dalším výhodným SERMem podle vynálezu je EM-01538 podle vzorce II:

(Π)

EM-1538 (také nazývaný EM-652.HC1) je hydrochloridová sůl silného antiestrogenu EM-652, v porovnání s EM-800, a je jednodušší a snadněji připravitelná sůl. Je také snadné ji izolovat, přečistit, je krystalizovatelná a v pevné fázi vykazuje dobrou stabilitu. Co se týká podávání EM-800 i EM-1538 předpokládá se, že výsledkem in vivo')Q stejná aktivní sloučenina.

Mezi další výhodnější SERMy podle vynálezu patří Tamoxifen ((Z)-2-[4-(l,2-defenyl-l-butenyl)fenoxy]-N,N-dimethylethanamin) dostupný od (Zeneca, VB), Toremifen ((Z)-2-[4-(4-chlor-l,2-difenyl-l-butenyl)fenoxy]-N,N-dimethylethanamin) dostupný od Orion-Farmos Pharmaceutical, Finsko nebo Schering-Plough), Droloxifen ((E)-3-[l-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]fenyl]-2-fenyl-l-butenyl]fenoí) a CP-336 156 (Lasofoxifen) (cis-lR-[4'-pyrrolidin-ethoxyfenyl]-2S-fenyl-6-hydroxy-l,2,3,4,-tetrahydronaftalen D-(-)-vinanová sůl (Pfizer lne., USA), Raloxifen ([2-(4-hydroxyfenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl] [4-(2-(1-piperidinýl)ethoxy]fenyl]-methanon hydrochlorid) (Eli Lilly and Co., USA), LY 335 563 (6— • 9 • 9 9 9 9 ···<

• 9 9 ♦

9 · • · · *

9 9

9 9 9 9 9 hydroxy-3-[4-[2-(l-piperidinyl)ethoxy]fenoxy]-2-(4-hydroxyfenyl)benzo[b]thiofenhydrochlorid) a LY 353 381 (Arzoxifen, 6-hydroxy-3-[4-[2-(l-piperidinyl) ethoxy] fenoxy 1]-2-(4-methoxyfenyl)benzo[b]thiofen hydrochlorid) (Eli Lilly and Co., USA), Idoxifen ((E)-l-[2-[4-[l-(4-jodofenyl)-2-fenyl-l-butenyl]fenoxy]ethyl]pyrrolidin) (SmithKline Beecham, USA), Levormeloxifen (3,4-trans-2,2-dimethyl-3-fenyl-4-[4-(2-(2-(pyrrolidin-l-yl)ethoxy)fenyl]-7-methoxychroman) (Novo Nordisk, A/S, Dánsko), které jsou uvedeny v Shalmi a kol., WO 97/25 034, WO 97/25 035, WO 97/ 25 037, WO 97/25 038); a Korsgaard a kol. WO 97/25 036, GW 5 638 (popsáno Willsonem a kol., Endocrinology, 138(9), 3901 až 3911, 1997) a indolové deriváty (odhalené Millerem a kol. EP 0 802 183 Al) a sloučenina TSE 424 vyvinutá Wyeth Ayers (USA) a odhalená vJP10036347 (American home products Corporation) a nesteroidní estrogenové deriváty popsané v WO 97/32 837. Rovněž sem patří Iproxifen (TAT 59; (E)-4-[l-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]fenyl]-2-[4-( 1 -methy lethyl)fenyl]-1 butenyl]fenoldihydrogenfosfát od Taiho (Japonsko), FC 1271 ((Z)-2-[4-(4-chlor-l,2-difenyl-l-butenyl)fenoxy]ethanol) od Orion (Finsko), HMR 3339 a HMR 3656 od Hoechst Marion Roussel, SH 646 od Schering AG, Německo, ERA 923 od Wyeth Ayerst (USA), LY 335 124 a LY 326 315 od Eli Lilly (USA).

Je možno použít jakýkoliv ŠERM používaný pro daný účinek a to způsobem, který je doporučován výrobcem. Příslušné dávky jsou v dané oblasti techniky známé. Jakýkoliv jiný nesteroidní komerčně dostupný antiestrogen může být rovněž použit podle vynálezu. Jakákoliv sloučenina, která má podobnou aktivitu jako ŠERM (příklad: Raloxifen) může být také použita.

SERMy podávané v souladu s vynálezem jsou výhodněji podávány v dávkách, které se pohybují v rozmezí 0,01 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den (výhodněji 0,05 až 1,0 mg/kg), s dávkou 5 mg za den, zejména 10 mg/den, ve dvou stejných dávkách, které jsou výhodnější pro osoby s průměrnou tělesnou hmotností a to tehdy jsou-li podávány orálně nebo v dávkách pohybujících se mezi 0,003 až 3,0 mg/kg tělesné hmotnosti za den (výhodněji 0,015 až 0,3 mg/ml), s 1,5 mg/den, zejména 3,0 mg/den, ve dvou stejných dávkách v případě osob s průměrnou tělesnou hmotností a tehdy, jsou-li podávány parenterálně (tzn. intramuskulárně, subkutánně nebo perkutánně). Výhodněji jsou SERMy podávány spolu s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem což je popsáno níže.

Mezi výhodné bisfosfonáty podle vynálezu, které jsou podávány jako aktivní složka kombinované terapie určené pro léčbu osteoporózy, patří Alendronat [(4-amino-l-hydroxybutyliden)bisfosfonová kyselina, sodná sůl, hydrát] dostupný od Merck Shape and Dohme pod obchodním názvem Fosamax, Etidronat [(l-hydroxyethyliden)bis fosfonová kyselina, 2, [2'-iminobisethanol] dostupný od Procter and Gamble pod obchodními názvy Didrocal a Didronel, Clodronat [(dichlormethylen)bisfosfonová kyselina, sodná sůl] dostupný od • · • 4 ·· 44 44 • · 4 · 4 · 4 4

4 4 4 4 · · • φ····· · * • 4 4 4 4 · • · Μ· · · 4444

Rhone-Poulenc Rorer pod obchodním názvem Benefos nebo dostupný od Boehringer Mannheim pod obchodním názvem Ostac a Pamidronat (3-amino-l-hydroxypropyliden)bis fosfonová kyselina, sodná sůl) dostupný od Geigy pod obchodním názvem Aredia. Risedronat (1-hydroxy-2-(3-pyridinyl)ethyliden bifosfonová kyselina, sodná sůl) je ve fázi klinického vývoje. Podle vynálezu mohou být použity jakékoliv další komerčně dostupné bisfosfonáty, všechny v dávkách doporučených výrobcem. Podobně prekursory pohlavních steroidů mohou být využity v dávkách, které jsou doporučovány ve stavu techniky, výhodněji v dávkách, které obnovují cirkulující hladiny na hladiny, které mají zdraví muži ve věku 20 až 30 let nebo dospělé ženy před menopauzou.

Z pohledu všech zde doporučených dávek by však měl lékař odezvu u jednotlivých pacientů sledovat a podle toho dávkování upravit.

Přehled obrázků ve výkresech

Obrázek 1 ukazuje účinek 9 měsíční léčby DHEA (10 mg, perkutánně, jednou denně) nebo EM-800 (75 pg, orálně, jednou denně) samotnými nebo v kombinaci na hladiny triglyceridů (A) a cholesterolu (B) v séru potkana. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. **: P< 0,01 experimentální versus odpovídající kontrola.

Obrázek 2 ukazuje: A) Vliv zvýšení dávek DHEA (0,3 mg, 1,0 mg nebo 3,0 mg) podávaných perkutánně dvakrát denně na průměrnou velikost nádoru ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii (OVX), které jsou substituovány estronem. Jako další kontroly byly použity kontrolní OVX myši dostávající pouze samotné vehikulum. Počáteční velikost nádoru byla brána jako 100 %. DHEA byl podáván perkutánně (p.c.) do hřbetní kůže ve formě 0,02 ml roztoku 50% ethanol-50% propylenglykol. B) Vliv 9,5 měsíční léčby zvýšenými dávkami DHEA nebo EM-800 samotného nebo v kombinaci na hmotnost nádoru ZR-75-1 u OVX nahých myší substituovaných estronem. **, p< 0,01, léčené versus kontrolní OVX myši substituované estronem.

Obrázek 3 ukazuje vliv zvyšujících se orálních dávek antiestrogenu EM-800 (15 pg, 50 pg nebo 100 pg) nebo vliv perkutánně aplikovaných dávek DHEA (0,3, 1,0 nebo 3,0 mg) kombinovaných s EM-800 (15 pg) nebo vliv samotného EM-800 (A) aplikovaných po dobu 9,5 měsíců na průměrnou velikost nádoru ZR-75-1 u OVX nahých myší po ovariektomii substituovaných estronem. Počáteční velikost nádoru byla brána jako 100 %. Kontrolní OVX myši dostávající samotné vehikulum byly použity jako další kontroly. Estron byl podáván jednou denně subkutánně v dávce 0,5 pg, zatímco DHEA byl rozpuštěn v roztoku 50% ethanol-50% * · • · · • φ φ Φ « φ · φ φ « ♦ · ♦ φφφφ · · * • «·«··· · * • φ φ φ φ · •φ ·· φ · φφ·· propylenglykol a byl aplikován dvakrát denně v objemu 0,02 ml do hřbetní kůže. Srovnání bylo provedeno také s OVX zvířaty, která dostávala samotné vehikulum.

Obrázek 4 ukazuje vliv 65 denní léčby antiestrogenem EM-800 v dávkách 0,25 a 2,5 mg na kg tělesné hmotnosti (orálně, jednou denně) nebo medroxyprogesteronacetátem (MPA, 1 mg s.c.; dvakrát denně) nebo kombinací EM-800 (0,25 mg/kg tělesné hmotnosti) a MPA na růst karcinomu prsní žlázy indukovaný DMBA, který je stimulován pomocí E_t (1,0 pg, s.c., dvakrát denně) u potkanů po ovariektomii. Změna velikosti nádoru je vyjádřena jako % původní velikosti. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM.

Obrázek 5 ukazuje vliv 37 týdenní léčby zvyšujícími se dávkami (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 a 1 mg/kg) EM-800 nebo Raloxifenu na hladiny celkového cholesterolu v séru u potkana po ovariektomii. Srovnání bylo provedeno se zdravými krysami a se zvířaty po ovariektomii, která byla nositeli implantátu 17(3-estradiolu (E₂); ** p<0,01, experimentální versus OVX kontrolní krysy.

Obrázek 6 ukazuje vliv zvyšujících se koncentrací EM-800, (Z)-4-OH-Tamoxifenu, (Z)-4-OH-Toremifenu a Raloxifenu na aktivitu alkalické fosfatasy u lidských buněk Ishikawa. Aktivita alkalické fosfatasy byla měřena po 5 denním působení zvýšených koncentrací uvedených sloučenin v přítomnosti nebo nepřítomnosti 1,0 nM E2. Data jsou vyjádřena jako průměry ± SEM čtyř jamek. Jestliže se SEM překiývá s použitými symboly, je uveden pouze symbol (Simard, Sanchez a kol., 1997).

Obrázek 7 ukazuje blokování stimulačního účinku (Z)-4-OH-Tamoxifenu, (Z)-4-OH-Toremífenu, Droloxífenu a Raloxifenu na aktivitu alkalické fosfatasy prostřednictvím antiestrogenu EM-800 u lidských karcinomových buněk Ishikawa. Aktivita alkalické fosfatasy byla měřena po 5 denním působení koncentrací indikovaných sloučenin 3 nebo 100 nM v přítomnosti nebo nepřítomnosti 30 nebo 100 nM EM-800. Data jsou vyjádřena jako průměry ± SD osmi jamek s výjimkou kontrolních skupin, kde jsou data získána ze 16 jamek (Simard, Sanchez a kol. 1997).

Obrázek 8 ukazuje srovnání vlivu standardní HRT (estrogen) a ŠERM (EM-652) na parametry menopauzy. Přídavek ŠERM ke standardní HRT bude působit proti potenciálním negativním účinkům estrogenů.

Obrázek 9 ukazuje, že stimulační efekt Tamoxifenu na růst xenoimplantátů lidského karcinomu prsu ZR-75-1 je současným podáváním EM-652.HCI zcela blokován. Sloučenina EM-652.HC1 nemá v nepřítomnosti Tamoxifenu sama o sobě, v souladu se svou čistě antiestrogenovou aktivitou, na růst nádoru žádný vliv.

Obrázek 10 ukazuje řezy prsní žlázou potkana.

·

• · • · · • · · · · ·

A. Neléčené zvíře. Lalůčky (L) se skládají z několika alveol. Insert. Alveoly vykazující vysoký stupeň zvětšení.

B. Zvíře léčené EM-800 (0,5 mg/kg, b w za den) po dobu 12 týdnů. Velikost lalůčků (L) je snížena. Insert. Atrofícké alveolární buňky vykazující vysoký stupeň zvětšení.

Obrázek 11 ukazuje řezy endometriem potkana:

A. Neléčené zvíře. Luminální epithelium (LE) je charakterizováno sloupcovitými epitelovými buňkami, zatímco žlázovité epitelium (GE) je spíše kvádrovité. Stroma obsahuje některé buněčné elementy a kolagenová vlákna.

B. Zvíře léčené EM-800 (0,5 mg/kg, b w za den) po dobu 12 týdnů. Výška luminálního epitelu je znatelně zmenšena. Žlázovité epitelové buňky mají cytoplasmu beze skvrn, bez příznaků aktivity. Stroma je, vzhledem ke snížení intracelulárních prvků stromy, vysoce celulámí.

Obrázek 12 ukazuje vliv zvyšujících se koncentrací EM-652..HC1, lasofoxifenu (volná base; aktivní a inaktivní enantiomery) a raloxifenu podávaných orálně po dobu 9 dnů myším po ovariektomii, které jsou současně léčeny estronem, na hmotnost dělohy. * p< 0,05, ** p< 0,01 versus kontroly léčené Ei.

Obrázek 13 ukazuje vliv zvyšujících se koncentrací EM-652.HC1, lasofoxifenu (volná base; aktivní a inaktivní enantiomery) a raloxifenu podávaných orálně po dobu 9 dnů myším po ovariektomii, které jsou současně léčeny estronem, na hmotnost vagíny. ** p< 0,01 versus kontroly léčené Ej.

Obrázek 14 ukazuje vliv 1 pg a 10 pg EM-652.HC1, lasofoxifenu (volná base; aktivní a inaktivní enantiomery) a raloxifenu podávaných orálně po dobu 9 dnů myším po ovariektomii na hmotnost dělohy. ** p< 0,01 versus OVX kontrola.

Obrázek 15 ukazuje vliv 1 pg a 10 pg EM-652.HC1, lasofoxifenu (volná base; aktivní a inaktivní enantiomery) a raloxifenu podávaných orálně po dobu 9 dnů myším po ovariektomii na hmotnost vagíny. ** p< 0,01 versus OVX kontrola.

Obrázek 16 ukazuje vliv 26 týdenní léčby pomocí E₂, EM-652.HCl, E2 + EM-652.HC1, DHEA, DHEA + EM-652.HC1 a DHEA + EM-652.HC1 + E₂ na BMD bederní páteře u OVX potkanů, kteří mají diagnostikovanou osteopenii. Zdravá kontrolní a kontrolní OVX zvířata byla zahrnuta jako kontrolní skupiny.

Obrázek 17 ukazuje vliv 26 týdenní léčby pomocí E₂, EM-652.HCl, E₂ + EM-652.HCl, DHEA, DHEA + EM-652.HC1 a DHEA + EM-652.HC1 + E₂ na BMD stehenní • · « · · ·· ·· ·· • t · · ♦ · ♦ · ·♦ * ♦ • · · · · · · · · · « ««····· · · · ♦ · · · · • ·· ·· 0 · · · «» « · · ·· ····♦· kosti u OVX potkanů, kteří mají diagnostikovanou osteopenii. Zdravá kontrolní a kontrolní OVX zvířata byla zahrnuta jako kontrolní skupiny.

Obrázek 18 ukazuje vliv 26 týdenní léčby pomocí E₂, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1, DHEA, DHEA + EM-652.HC1 a DHEA + EM-652.HC1 + E₂ na celkový tělesný tuk u OVX potkanů, kteří mají diagnostikovanou osteopenii. Zdravá kontrolní a kontrolní OVX zvířata byla zahrnuta jako kontrolní skupiny.

Obrázek 19A ukazuje vlivy antiestrogenů na růst nádoru ZR-75-1. Vliv léčby 7 antiestrogeny po dobu 161 dnů na růst lidských nádorů prsu ZR-75-1, který je indukován estronem, u nahých myší po ovariektomii. Velikost nádoru je vyjádřena jako procento původní plochy nádoru (den 1 = 100 %). Data jsou vyjádřena jako průměry ± SEM (n=18 až 30 nádorů/skupinu; ## p< 0,01 versus EM-652.HC1; ** p< 0,01 versus OVX. Antiestrogeny byly podávány orálně jednou denně v dávce 50 pg/myš za současné stimulace estronem, které bylo dosaženo pomocí subkutánních 0,5 cm silastických implantátů obsahujících estron a cholesterol v poměru 1:25.

Obrázek 19B ukazuje vlivy antiestrogenů na růst nádoru AR-75-1. Je ukázán vliv léčby 7 antiestrogeny po dobu 161 dnů na růst lidských nádorů prsu ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii. Velikost nádoru je vyjádřena jako procento původní plochy nádoru (den 1 =100 %). Data jsou vyjádřena jako průměry ± SEM (n=18 až 30 nádorů/skupinu); ## p<0,01 versus EM-652.HC1; ** p<0,01 versus OVX. Antiestrogeny byly podávány orálně jednou denně v dávce 100 pg/myš a bez současné stimulace estrogenem.

Obrázek 19C ukazuje účinky antiestrogenů na růst nádoru ZR-75-1. Je uveden vliv léčby 7 antiestrogeny po dobu 161 dnů na růst lidských nádorů prsu ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii. Velikost nádoru je vyjádřena jako procento původní plochy nádoru (den 1 = 100 %). Data jsou vyjádřena jako průměry ± SEM (n=18 až 30 nádorů/skupinu); ## p<0,01 versus EM-652.HC1; ** p<0,01 versus OVX. Antiestrogeny byly podávány orálně jednou denně v dávce 200 pg/myš bez současné stimulace estrogenem.

Obrázek 20A ukazuje účinky antiestrogenů na klasifikaci odezvy. Je uveden vliv 161 denní léčby 7 antiestrogeny na klasifikaci odezvy lidských nádorů prsu ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii. Úplná regrese identifikuje ty nádory, které nebylo možno na konci léčby detekovat; částečná regrese odpovídá těm nádorům, které se zmenšily o > 50 % své původní velikosti; stabilní odezva se vztahuje k nádorům, které se zmenšily o < 50 % nebo které se zvětšily o < 50 %; a progrese naznačuje, že se nádory zvětšily ve srovnání se svou původní velikostí o více než 50 %. Antiestrogeny byly podávány orálně jednou denně v dávce 50 pg/myš ·♦ · · • «. · ♦ • * · • * · • · « • · · · · · při stimulaci estronem, které bylo dosaženo pomocí subkutánních 0,5 cm silastických implantátů obsahujících estron a cholesterol v poměru 1:25.

Obrázek 20B ukazuje účinky antiestrogenů na klasifikaci odezvy. Je uveden vliv 161 denního podávání 7 antiestrogenů na klasifikaci odezvy lidských nádorů prsu ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii. Úplná regrese identifikuje ty nádory, které nebylo možno na konci léčby detekovat; částečná regrese odpovídá těm nádorům, které se zmenšily o > 50 % své původní velikosti; stabilní odezva se vztahuje k nádorům, které se zmenšily o < 50 % nebo které se zvětšily o < 50 %; a progrese naznačuje, že se nádory ve srovnání se svou původní velikostí zvětšily o více než 50 %. Antiestrogeny byly podávány orálně jednou denně v dávce 200 pg/myš bez stimulace estrogenem.

Obrázek 20C ukazuje účinky antiestrogenů na klasifikaci odezvy. Je uveden vliv 161 denního podávání 7 antiestrogenů na klasifikaci odezvy lidských nádorů prsu ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii. Úplná regrese identifikuje ty nádory, které nebylo možno na konci léčby detekovat; částečná regrese odpovídá těm nádorům, které se zmenšily o > 50 % své původní velikosti; stabilní odezva se vztahuje k nádorům, které se zmenšily o < 50 % nebo které se zvětšily o < 50 %; a progrese naznačuje, že se nádory ve srovnání se svou původní velikostí zvětšily o více než 50 %. Antiestrogeny byly podávány orálně jednou denně v dávce 200 pg/myš bez stimulace estrogenem.

Obrázek 21 ukazuje účinek EM-652.HC1, podávaného po dobu 2 týdnů prostřednictvím zvyšujících se denních dávek pohybujících se v rozmezí od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na hmotnost dělohy u potkanů po ovariektomii, kteří jsou denně substituováni orálně podávanou dávkou 173-estradiolu (2 mg/kg). Jako další kontroly jsou používána zdravá zvířata.

Obrázek 22 ukazuje vliv EM-652.HC1, podávaného po dobu 2 týdnů prostřednictvím zvyšujících se denních dávek pohybujících se v rozmezí od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na výšku epitelu endometria u potkanů po ovariektomii, kteří jsou denně substituováni orálně podávanou dávkou 173-estradiolu (2 mg/kg). Jako další kontroly jsou používána zdravá zvířata.

Obrázek 23. Hematoxylinem a eosinem fixované řezy dělohou krysy, které ilustrují buňky epitelové výstelky získané ze zdravého kontrolního (A), OVX kontrolního (B), OVX + E2 (2 mg/kg) (C) a OVX + E2 + EM-652.HC1 (3 mg/kg) potkana léčeného po dobu 14 dnů. Stimulační účinek estradiolu na buňky epitelu endometria byl vyrušen současným podáváním EM-652.HC1 (zvětšení: X 700). BM: basální membrána.

Obrázek 24 ukazuje vliv EM-652.HC1, podávaného po dobu 2 týdnů prostřednictvím zvyšujících se denních dávek pohybujících se v rozmezí od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na

²⁸ : :

·« hmotnost vagíny u potkanů po ovariektomii, kteří jsou denně substituováni orálně podávanou dávkou 17P-estradiolu (2 mg/kg). Jako další kontroly jsou používána zdravá zvířata.

Obrázek 25 ukazuje vliv EM-652.HC1, podávaného po dobu 2 týdnů prostřednictvím zvyšujících se denních dávek pohybujících se v rozmezí od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, na hladinu cholesterolu v séru u potkanů po ovariektomii, kteří jsou denně substituováni orálně podávanou dávkou 17P~estradiolu (2 mg/kg). Jako další kontroly jsou používána zdravá zvířata.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

U mléčné žlázy jsou androgeny tvořeny z prekursoru steroidu dehydroepiandrosteronu (DHEA). Klinický důkaz naznačuje, že androgeny mají inhibiční účinky na karcinom prsu. Estrogeny naopak stimulují vývoj a růst karcinomu prsu. Sledovali jsme vliv samotného DHEA nebo v kombinaci s nově popsaným čistým antiestrogenem EM-800 na růst xenoimplantátů nádoru tvořeného linií buněk lidského karcinomu prsu ZR-75-1 u nahých myší po ovariektomii.

Myši byla aplikována denní dávka 0,5 pg estronu (estrogenový hormon) bezprostředně po ovariektomii subkutánně injekcí. EM-800 (15,50 nebo 100 pg) bylo aplikováno orálně jednou denně. DHEA byl aplikován dvakrát denně (celková dávka 0,3, 1,0 nebo 3,0 mg) do hřbetní kůže bud’ samostatně nebo v kombinaci s 15 pg denní orální dávkou EM-800. Změny velikosti nádoru jakožto odezva na podání léku, byly vyhodnocovány pravidelně a byly vztahovány k měřením, která byla provedena první den. Na konci experimentů byly nádory vyříznuty a zváženy.

U myší po ovariektomii, které dostaly samotný estron, bylo po 9,5 měsících zjištěno 9,4 násobné zvýšení velikosti nádoru v porovnání s myšmi, které estron nedostávaly. Aplikace 15, 50 nebo 100 pg EM-800 myším po ovariektomii, které byly substituovány estronem, vedla k 88%, 93% a 94% inhibicím velikosti nádoru. Naopak DHEA v dávkách 0,3, 1,0 nebo 3,0 mg inhiboval konečnou hmotnost nádoru o 67 %, 82 % a 85 %. Srovnatelných inhibici velikosti nádoru bylo dosaženo při aplikaci denní orální dávky EM-800 15 pg s rozdílnými dávkami perkutánně aplikovaného DHEA nebo bez nich.

U nahých myší sloučeniny DHEA a EM-800 nezávisle na sobě potlačovaly růst estronem stimulovaných xenoimplantátů nádorů ZR-75-1. Aplikace DHEA v definovaných dávkách neměnila inhibiční účinek EM-800.

• « • · « · « ·

Materiály a metody

Buňky ZR-75-1

Buňky ZR-75-1 lidského karcinomu prsu byly získány ze sbírky American Type Culture Collection (Rockville, MD) a byly kultivovány ve formě monovrstvy v médiu RPMI 1640 obohaceném 2 mM L-glutaminem, 1 mM pyruvátem sodným, 100 IU penicilinu/ml, 100 pg streptomycinu/ml a 10% zárodečným hovězím sérem. kultivace probíhala ve vlhčené atmosféře 95% vzduch / 5% CO2 při teplotě 37 °C. Podmínky jsou popisovány v Poulin a Labrie, Cancer Res. 46: 4933 až 4937, 1986; Poulin a kol., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213 až 225, 1988. Buňky byly pasážovány jednou týdně po ošetření roztokem 0,05% trypsin : 0,02 % EDTA (hmotn./obj.). Buněčné kultury, které byly použity pro experimenty popsané v této přihlášce, byly odvozeny z pasáže 93 linie buněk ZR-75-1.

Zvířata

Homozygotní samice atymické Harlan Sprague-Dawley (nu/nu) myši (28 až 42 dní staré) byly získány od HSD (Indianopolis, Indiana, USA). Myši byly umístěny do vinylových klecí s filtrem vzduchu umístěném na vrchu digestoři s íaminárním prouděním vzduchu a bylo zde udržováno prostředí bez patogenů. Klece, prostředky určené ke spaní a potrava byly před použitím autoklávovány. Voda byla autoklávována, okyselena na pH 2,8 a poskytnuta myším ad libitum.

Inokulace buněk

Myši byly podrobeny oboustranné ovariektomii (OVX) a to jeden týden před tím, než byla v anestézii provedena inokulace nádorových buněk prostřednictvím intraperitonální injekce Avertinu (amylalkohol: 0,8 g/100 ml 0,9% NaCl; a tribromethanol: 2 g /100 ml 0,9% NaCl) v dávce 0,25 ml/zvíře. Po ošetření monovrstvy roztokem 0,05% trypsin/0,02% EDTA (hmotn./obj.) bylo 1,5 x 10⁶ buněk ZR-75-1 v logaritmické fázi růstu sklizeno, buňky byly suspendovány do 0,1 ml kultivačního media obsahujícího 25% Matrigel a byly přeneseny subkutánně do obou boků zvířat. Za tímto účelem byly použity jehly o délce 2,54 cm (1 inch) a vnitřním průměru 20G, což bylo popsáno již drive (Dauvois a kol., Cancer Res. 51: 3131 až 3135, 1991). Aby byl usnadněn růst nádorů, dostávalo každé zvíře denně po dobu 5 týdnů subkutánní injekci 10 gg estradiolu (E₂) ve vehikulu složeném z 0,9% NaCl, 5% ethanolu a 1% želatiny. Poté co byly zjištěny patrné nádory ZR-75-1, byl průměr nádoru změřen pomocí posuvného měřidla. Pro studii pak byly vybrány ty myši, které měly průměr nádoru mezi 0,2 a

0,7 cm.

Hormonální léčba

Všechna zvířata s výjimkou těch, která patřila do kontrolní OVX skupiny, obdržela denní subkutánně injekcí aplikovanou dávku 0,5 gg estronu (Ej) v 0,2 ml roztoku 0,9% NaCl, 5% ethanol a 1% želatina. V naznačených skupinách byl DHEA podáván perkutánně dvakrát denně v dávkách 0,3, 1,0 nebo 3,0 mg/zvíře, které byly aplikovány v objemu 0,02 ml do hřbetní kůže mimo oblast růstu nádoru. DHEA byl rozpuštěn ve směsi 50% ethanol, 50% propylenglykol. EM-800, ((+)-7-pivaloyloxy-3-(4'-pivaloyloxyfenyl)-4-methyl-2-(4-(2'-piperidinoethoxy)fenyl)-2H-benzpyran), byl syntetizován postupem, který byl popsán již dříve (Gauthier a kol., J. Med. Chem. 40: 2117 až 2122, 1997) v divizi lékařské chemie v Laboratory of Molecular Endocrinology of CHUL Research Center. EM-800 byl rozpuštěn ve směsi 4% (obj.) ethanol, 4% (obj.) polyethylenglykol (PEG) 600, 1% (hmotn./obj.) želatina a 0,9% (hmotn.) NaCl. Zvířata daných skupin obržela orálně denní dávky 15 gg, 50 gg nebo 100 gg samotného EM-800 nebo v kombinaci s DHEA zatímco zvířata z OVX skupiny obdržela pouze samotné vehikulum (0,2 ml směsi 4% ethanol, 4% PEG 600, 1% želatina, 0,9% NaCl). Nádory byly měřeny jednou týdně pomocí Vernierova měřidla. Byly změřeny dva kolmé průměry v cm (L a W) a plocha nádoru (cm²) byla vypočítána podle-vzorce: L/2 x W/2 x π (Dauvois a kol., Cancer Res. 51: 3131 až 3135, 1991). Plocha změřená první den léčby byla brána jako 100 % a změny velikosti nádoru byly vyjádřeny jako procento původní velikosti nádoru. V případě podkožních nádorů není možné přesně odečíst trojrozměrný objem nádoru, proto tedy byly měřeny pouze plochy nádorů. Po 291 dnech (nebo 9,5 měsících) léčby byla zvířata usmrcena.

Klasifikace odezev byla provedena způsobem již popsaným (Dauvois a kol., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299 až 306, 1989; Dauvois a kol., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891 až 897, 1989; Labrie a kol., Breast Cancer Res. Treat. 33: 237 až 244, 1995). Krátce, částečná regrese odpovídá těm nádorům, které se zmenšily na 50 % nebo více své původní velikosti; stabilní odezva se vztahuje k nádorům, které se zmenšily o méně než 50 % své původní velikosti nebo které se zvětšily o méně než 50 % své původní velikosti, zatímco úplná regrese se vztahuje k těm nádorům, které nebylo možno na konci léčby detekovat. Progrese se vztahuje k těm nádorům, které se ve srovnání se svou původní velikostí zvětšily o více než 50 %. Na konci experimentu byla všechna zvířata usmrcena dekapitací. Nádory, děloha a vagína byly bezprostředně odebrány, byly očištěny od pojivových a tukových tkání a byly zváženy.

Statistická analýza

Statistická významnost účinků léčby na velikost nádoru byla určena pomocí variační analýzy (ANOVA), která bere v úvahu účinky DHEA, EM-800, čas a opakovaná měření uskutečněná u stejných zvířat na počátku a na konci léčby (subjekty v rámci skupiny daného faktoru). Opakovaná měření v čase 0 a po 9,5 měsících léčby tvořila randomizované bloky zvířat. Čas je tedy analyzován jako účinek uvnitř tohoto bloku, zatímco obě léčby jsou hodnoceny mezi jednotlivými bloky. Do modelu byly zahrnuty všechny interakce mezi hlavními účinky. Význam léčebných faktorů a jejich interakcí byl analyzován pomocí subjektů v rámci skupiny jako chybový člen. Data byla zlogaritmována. Hypotézy, které jsou na pozadí ANOVA předpokládaly normální rozdělení reziduí a homogenitu rozptylu.

A posteriori párová porovnání byla provedena použitím Fischerova testu pro nejmenší významný rozdíl. Hlavní účinky na tělesnou hmotnost a hmotnost orgánu a interakce léčby byly analyzovány pomocí standardního dvojného třídění ANOVA s interakcemi. Všechny ANOVA byly provedeny pomocí SAS programu (SAS Institute, Cary, NC, USA). Významnost rozdílů byla deklarována pomocí 2-stranného testu s celkovou hladinou významnosti 5 %.

Kategorická data byla analyzována pomocí Kruskall-Wallisova testu pro pořadové porovnání měřené odezvy (celková odezva, částečná odezva, stabilní odezva a progrese nádoru). Po celkovém zhodnocení účinků léčby byly analyzovány podsoubory výsledků uvedených v tab.

určující kritickou p-hodnotu pro násobné porovnávání. Přesné p-hodnoty byly vypočítány pomocí programu StatXact (Cytel, Cambridge, MA, USA).

Data jsou vyjádřena jako střední hodnota ± standardní odchylka (SEM) pro 12 až 15 myší v každé skupině.

• # ♦ · • * · • · · 4 • · ··♦· » · * • · *

Výsledky

Jak je uvedeno na obr. 2A lidské nádory ZR-75-1 se u nahých myší po ovariektomii, které byly léčeny denní dávkou 0,5 gg estronu aplikovanou podkožně, za 294 dní (9,5 měsíce) zvětšily 9,4x, zatímco u kontrolních OVX myší, které dostávaly samotné vehikulum, se velikost nádoru v průběhu studie snížila na 36,9 % své původní hodnoty.

Léčba zvyšujícími se dávkami perkutánně aplikovaného DHEA způsobila vzrůstající inhibici růstu nádoru ZR-75-1 stimulovaného Ei. Inhibici 50,4 %, 76,8 % a 80,0 % bylo dosaženo po 9,5 měsících léčby denními dávkami DHEA připadajícími na jedno zvíře 0,3 mg, 1,0 mg a 3,0 mg (obr. 2A). V souladu s poklesem nástupu nádoru vedla léčba pomocí DHEA ke zřetelnému snížení průměrné hmotnosti nádoru na konci experimentu. Průměrná hmotnost nádoru poklesla z 1,12 ± 0,26 g u kontrolních nahých myší po ovariektomii substituovaných Ei na 0,37 ± 0,12 g (P = 0.005), 0,20 ± 0,06 g (P = 0.001) a 0,17 ± 0,06 g (P = 0.0009) u skupin zvířat, které denně dostávaly 0,3, 1,0 a 3,0 mg DHEA (obr. 2B).

Při denních dávkách 15 pg, 50 pg a 100 pg inhiboval po 9,5 měsících antiestrogen EM-800 velikost estrogenem stimulovaného nádoru o 87,5 % (P<0,0001), 93,5 % (P<0,0001) a 94,0 % (P<0,0003) (obr. 3A) ve srovnání s velikostí nádoru u kontrolních zvířat. Jednotlivá snížení velikosti nádoru, kterých bylo dosaženo při třech různých dávkách EM-800, se významně neliší. Jak je doloženo obr. 2B hmotnost nádoru na konci 9,5 měsíční studie byla snížena z 1,12 ± 0,26 g u kontrolních OVX myší substituovaných Ei na 0,08 ± 0,03 g, 0,03 ± 0,01 g a 0,04 ± 0,03 g u zvířat léčených denními dávkami EM-800 15 pg, 50 pg a 100 pg (P<0,0001 u všech dávek EM-800 versus OVX substituované Ei).

Jak je uvedeno výše způsoboval antiestrogen EM-800 v denní orálně aplikované dávce 15 pg 87,5% inhibici růstu nádoru stimulovaného estronem. Měření probíhalo po dobu 9,5 měsíců. Přídavek DHEA ve třech použitých dávkách neměl na již zřetelnou inhibici velikosti nádoru, které bylo dosaženo s 15 pg denní dávkou antiestrogenu EM-800, významný účinek (obr. 5B). Průměrná hmotnost nádoru byla podstatně snížena a to z 1,12 ± 0,26 g u kontrolních myší substituovaných estronem na 0,08 ± 0,03 g (P<0,0001), 0,11 ± 0,04 g (P=0,0002), 0,13 ± 0,07 g (P=0,0004) a 0,08 ± 0,05 g (P<0,0001) u zvířat, která dostávala denně dávku 15 pg samotného antiestrogenu nebo v kombinaci s 0,3, 1,0 a 3,0 mg DHEA (mezi 4 skupinami nebyl zjištěn významný rozdíl) (obr. 2B).

• ·· ·· · ·»· • W · ·* »· ·* *··*

Předmětem zájmu bylo také otestovat kategorie odezev, kterých bylo dosaženo při výše naznačených léčbách. Léčba zvyšujícími se dávkami DHEA snížila, ačkoliv ne až na hladinu statistické významnosti (P=0,088), počet progresivních nádorů a to z 87,5 % u kontrolních OVX zvířat substituovaných estronem na 50,0 %, 53,3 % a 66,7 % u zvířat léčených dennimi dávkami 0,3, 1,0 a 3,0 mg DHEA (tab. 1). Úplné odezvy se naopak zvýšily z 0 % u estronem substituovaných myší na 28,6 %, 26,7 % a 20,0 % u zvířat, která dostávala denně perkutánně aplikovanou dávku DHEA 0,3, 1,0 a 3,0 mg. Stabilní odezvy 12,5 %, 21,4 %, 20,0 % a 13,3 % byly naopak změřeny u kontrolních myší substituovaných Ej a u třech skupin zvířat, které dostávaly výše uvedené dávky DHEA. U kontrolních myší po ovariektomii byl podíl úplné, částečné a stabilní odezvy změřen jako 68,8 %, 6,2 % a 18,8 %, zatímco progrese byla zjištěna pouze u 6,2 % nádorů (tab. 2).

Úplné odezvy nebo vymizení nádorů bylo dosaženo v 29,4 %, 33,3 %, 26,7 % a 35,3 % nádorů u zvířat, která dostávala samotný antiestrogen EM-800 (P=0,0006) (15 pg) nebo v kombinaci s 0,3 mg, 1,0 mg nebo 3,0 mg DHEA (tab. 2). Progrese byla naopak pozorována u

35,3 %, 44,4 %, 53,3 % a 17,6 % nádorů stejné skupiny zvířat. Mezi skupinami léčenými samotným EM-800 nebo v kombinaci s DHEA nebyl žádný významný rozdíl.

Žádný významný účinek DHEA nebo EM-800 nebyl pozorován ani na tělesnou hmotnost upravenou na hmotnost nádoru. Léčba OVX myší estronem zvyšovala hmotnost dělohy z 28 ± 5 mg u kontrolních OVX myší na 132 ± 8 mg (P<0,01), ale zvyšující se dávky DHEA způsobily progresivní, ale relativně malou inhibici stimulačního účinku estronu, která dosáhla při nejvyšší použité dávce DHEA 26 % (P=0,0008). Ze stejného obrázku je patrné, že hmotnost estronem stimulované dělohy byla snížena ze 132 + 8 mg u kontrolních estronem substituovaných myší na 49 ± 3 mg, 36±2mga32±l mg (P<0,0001 ve všech dávkách versus kontrola) u denních orálně podávaných dávek 15 pg, 50 pg nebo 100 pg EM-800 (celkové P<0,0001). V případě kombinace patnácti mikrogramů (15 pg) EM-800 s 0,3 mg, 1,0 mg nebo 3,0 mg denní dávkou DHEA, byla hmotnost dělohy změřena jako 46 ± 3 mg, 59 ± 5 mg a 69 ± 3 mg.

Na druhé straně léčba estronem zvyšovala hmotnost vagíny ze 14 ± 2 mg u kontrolních OVX zvířat na 31 ± 2 mg (P<0,01), ale přídavek DHEA neměl žádný významný efekt. Hmotnost vagíny byla po léčbě denní dávkou 15 pg, 50 pg nebo 100 pg EM-800 snížena na 23 ± 1 mg, 15 ± 1 mg a 11 ± 1 mg (celkové p a párové P <0,0001 pro všechny dávky versus kontrola). U kombinace s 0,3 mg, 1,0 mg nebo 3,0 mg dávkami DHEA a

EM-800 byla hmotnost vagíny změřena jako 22 ± 1 mg, 25 ± 2 mg a 23 ± 1 mg (N.S. pro všechny skupiny versus 15 pg EM-800). Je třeba uvést, že u nejvyšších použitých dávek • 9 ♦ · • · ♦ « >··♦ *

EM-800, zejména 100 gg denně, došlo ke snížení hmotnosti dělohy u estronem substituovaných

OVX zvířat na hodnotu, která se však nijak podstatně nelišila od hodnoty pro OVX kontroly, zatímco hmotnost vagíny byla snížena na hodnotu nižší než byla hodnota změřená u OVX kontrol (P<0,05). DHEA pravděpodobně díky svým androgenovým účinkům částečně působí proti účinku EM-800 na hmotnost dělohy a vagíny.

« · · » ♦ 0 ♦ * • · * · • * »*· • w · «·

Tabulka 2 Vliv perkutánně aplikovaného DHEA nebo orálně aplikovaného EM-800 podávaných po dobu 9,5 měsíce samotně nebo v kombinaci na odezvy (úplná, částečná, stabilní a progrese) u xenoimplantátů lidského nádoru prsu ZR-75-1 u nahých myší

SKUPINA	CELKOVÝ POČET ZVÍŘAT	KATEGORIE	ODEZVY
úplná	částečná	stabilní	progrese
					počet a (%)
OVX		16	11 (68,8)	1 (6,2)	3 (18,8)	1 (6,2)
OVX + El (0,5 gg)		16	0(0)	0(0)	2(12,5)	14 (87,5)
OVX+E1 (0,5 gg)+DHEA	0,3 mg	14	4 (28,6)	0(0)	3(21,4)	7 (50,0)
	1,0 mg	15	4 (26,7)	0 (0)	3 (20,0)	8 (53,3)
	3,0 mg	15	3 (20,0)	0(0)	2 (13,3)	10 (66,7)
OVX+E1 (0,5 gg)+EM-800	15 gg	17	5 (29,4)	1 (5,9)	5 (29,4)	6 (35,3)
	50 gg	16	4 (25,0)	3 (18,8)	5(31,2)	4 (25,0)
	100 gg	16	8 (50,0)	0(0)	3 (18,8)	5(31,2)
0VX+E1 (0,5gg) +	0,3 mg	18	6 (33,3)	0(0)	4 (22,2)	8 (44,4)
EM-800 +DHEA	1,0 mg	15	4 (26,7)	0(0)	3 (20,0)	8 (53.3)
	3,0 mg	17	6 (35,3)	0(0)	8(47.1)	3 (17,6)

El = estron; DHEA = dehydroepiandrosteron; OVX = po ovariektomii

Příklad 2

Androsten-33-173-diol (5-diol) vykazuje pravou estrogenovou aktivitu. Dále může být jakožto prekurzor pohlavního steroidu v periferních intrakrinních tkáních převeden na aktivní androgeny a/nebo jiné estrogeny. Za účelem zhodnocení relativního významu činnosti androgenových a estrogenových složek 5-diolu na kostní hmotu byly potkani staří dvacet jeden týden podrobeny ovariektomii a poté byly léčeni perkutánně aplikovanou denní dávkou 2, 5 nebo

12,5 mg samotného 5-diolu nebo v kombinaci s antiandrogenem Flutamid (FLU, 10 mg, s.c.

«< · ·· · . . . » «»* ».»♦ « »· » «·*» · * * · 4» · • » ···· ♦. « » ·«· · » · · ··« «» · »·» jednou denně) a/nebo antiestrogenem EM-800 (10 gg, s.c., jednou denně) po dobu 12 měsíců. Minerální hustota kostí (BMD) byla měřena po 11 měsících léčby. Ovariektomie (OVX) vedla ke 12,8% poklesu BMD stehenní kosti (p<0,01), zatímco léčba nejvyššími dávkami 5-diolu obnovila 34,3 % stehenní BMD, k jejíž ztrátě došlo v průběhu 11 měsíců po ovariektomii (p<0,01). Současné podávání FLU zcela zabránilo stimulačnímu účinku 5-diolu na BMD stehenní kosti, ale výsledkem přídavku EM-800 byla v porovnání s účinkem samotného 5-diolu další 28,4% stimulace. Současné podávání 5-diolu, FLU a EM-800 ukazovalo účinek pouze EM-800 (27 %), protože účinek 5-diolu sloučenina FLU zcela blokovala. Srovnatelné výsledky byly získány u BMD bederní páteře, ačkoliv BMD bederní páteře u OVX potkanů, kteří dostávali 12,5 mg samotného 5-diolu, 12,5 mg 5-diolu + EM-800 nebo 5-diol + FLU + EM-800, byla obnovena zpět na hodnoty, které se nijak významně nelišily od hodnot zdravých zvířat. Histomorfometrická analýza ukázala, že stimulační účinky 5-diolu na objem kosti, počet trámců a inhibiční účinek na separaci trámců sekundární spongiosy metaíyzeální oblasti proximální holenní kosti byly účinkem FLU zrušeny, ale byly dále zvyšovány vlivem EM-800. Znatelná stimulace aktivity alkalické fosfatasy po léčbě 5-diolem je současným podáním FLU z 57 % vrácena zpět (p<0,01 versus 12,5 mg samotného 5-diolu). Léčba 5-diolem neměla žádný významný inhibiční účinek na poměr vápníku a kreatininu v moči. Nejvyšší dávka 5-diolu způsobila významné 23% (p<0,01) snížení cholesterolu v séru, zatímco přídavek EM-800 snížil hladinu cholesterolu v séru o 62 % (p<0,01). Předložená data jasně ukazují stimulační účinek 5-diolu na tvorbu kostí a předpokládají, že ačkoliv 5-diol je slabý estrogen, je jeho stimulační účinek na tvorbu kostí zprostředkován převážně androgenovým účinkem. Kromě toho další stimulační účinky EM-800 a 5-diolu na kostní hmotu ukazují účinek vedoucí k šetření kosti antiestrogenu

EM-800 u potkanů. Aktivita 5-diolu a EM-800, která snižuje cholesterol, by mohla mít významné využití při prevenci kardiovaskulárních onemocnění.

• * ·*

Příklad 3 Syntéza výhodné sloučeniny podle vynálezu

Syntéza hydrochloridu (S)-(+)-7-hydroxy-3-(4 -hydroxyfenyl)-4-methyl-2-(4' '-(2' -piperidinethoxy)fenyl)-2H-l-benzpyranu EM-01538 (EM-652.HC1).

Schéma 1

Krok A: BF3.EÍ2O, toluen; 100 °C; 1 h.

Krok C: 3,4-dihydropyran, monohydrát kyseliny p-toluensulfonové, ethylacetát; 25 °C pod dusíkem, 16 hodin, a poté krystalizace v isopropanolu.

Kroky D. EaF:

(1) piperidin, toluen, aparatura Dean & Stark, reflux pod dusíkem;

(2) l,8-diazabicyklo[5,4,0]undek-7-en, DMF, reflux 3 h, (3) CH₃MgCl, THF, -20 až 0 °C a poté laboratorní teplota po dobu 24 h;

Kroky G, H: (lS)-(+)-10-kafrosulfonová kyselina, aceton, voda, toluen, laboratorní teplota, 48 hodin.

Krok HH: 95% ethanol, 70 °C, poté laboratorní teplota 3 dny.

Krok HHŘ: recyklování v původním destilátu a promytí podle kroku HH • 4 ♦

·»··

4 (S)- 10 kafrosulfonová kyselina, reflux; 36 hodin, poté laboratorní teplota po dobu 16 h.

Krok 1:

(1) DMF vodný, Na₂CO₃, ethylacetát;

(2) Ethanol, zředěná HCI;

(3) Voda.

Syntéza 2-tetrahydropyranyloxy-4-hydroxy-2'-(4-tetrahydropyranyloxyfenyI)acetofenonu (4).

Suspenze 2,4-dihydroxy-2'-(4-hydroxyfenyl)acetofenonu 3 (97,6 g, 0,4 mol) (dostupný od Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) v 3,4-dihydropyranu (218 ml, 3,39 mol) a ethylacetátu (520 ml) byla ošetřena monohy drátem kyseliny p-toluensulfonové (0,03 g, 0,158 mmol) při teplotě 25 °C. Reakční směs byla míchána po dobu 16 h pod dusíkem a nebyla externě zahřívána. Směs byla poté promyta roztokem uhličitanu sodného (1 g) a chloridu sodného (5 g) ve vodě (100 ml). Jednotlivé fáze byly odděleny a organická fáze byla promyta solankou (20 ml). Každé promytí bylo zpět extrahováno 50 ml ethylacetátu. Všechny organické fáze byly spojeny a zfíltrovány přes síran sodný.

Rozpouštědlo (asi 600 ml) bylo odstraněno pomocí destilace za atmosférického tlaku a poté byl přidán isopropanol (250 ml). Poté bylo při atmosférickém tlaku oddestilováno další rozpouštědlo (asi 300 ml) a byl přidán isopropanol (250 ml). Při atmosférickém tlaku bylo oddestilováno další rozpouštědlo (asi 275 ml) a opět byl přidán isopropanol (250 ml). Roztok byl za stálého míchání ochlazen při teplotě asi 25 °C a po asi 12 h byla krystalická pevná látka odfiltrována, promyta isopropanolem a vysušena (116,5 g, 70 %).

Syntéza 4-hydroxy-4-methyl-2-(4'-[2''-piperidino] fenyl-3-(4''tetrahydropy ranyloxy)fenyI-7-tetrahydropyranyIoxychromanu (10)

Roztok 2-tetrahydropyranyloxy-4-hydroxy-2 '-(4 -tetrahydropyranyloxyfenyl)acetofenonu 4(1 kg, 2,42 mol), 4-(2-(1-piperidin)ethoxy]benzaldehydu 5 (594 g, 2,55 mol) (dostupný od Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) a piperidinu (82,4 g, 0,97 mol) (dostupný od Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisconsin) v toluenu (8 1) byl refluxován pod dusíkem za použití Apparatury Dean & Stark do té doby, dokud nebyl získán jeden ekvivalent vody (44 ml). Toleuen (6,5 1) byl z roztoku odstraněn destilací za atmosférického tlaku. Poté byl přidán dimethylformamid (6,5 1) a l,8-diazabicyklo[5,4,0]undek-7-en (110,5 g, 0,726 mol).

• 9 • 9 · • ♦ 9

111 · 999

111

9

9 9 1

19 9

9 *99 • · · ·* 9« • r * • 9

9

9 1 »« ···♦

Roztok byl třepán po dobu asi 8 h při laboratorní teplotě s cílem izomerovat chalkon 8 na chromanon 9 a poté byl přidán ke směsi vody a ledu (8 1) a toluenu (4 1). Jednotlivé fáze byly odseparovány a toluenová vrstva byla promyta vodou (5 1). Spojené vodné fáze byly extrahovány toluenem (3x4 1). Spojené toluenové extrakty byty nakonec promyty solankou (3 x 4 1), zahuštěny za atmosférického tlaku na 5,5 1 a poté byty ochlazeny na -10 °C.

Za vnějšího chlazení a míchání pod dusíkem byl přidáván 3 M roztok chloridu methylhořečnatého v THF (2,5 1, 7,5 mol) (dostupný od Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisc.). Teplota byla udržována pod 0 °C. Po přidání Grignardova činidla bylo odstraněno vnější chlazení a směs byla ponechána při laboratorní teplotě, aby se zahřívala. Směs byla při této teplotě míchána po dobu asi 24 h.

Směs byla znovu ochlazena na asi -20 °C a za pokračujícího vnějšího chlazení a míchání byl pomalu přidáván nasycený roztok chloridu amonného (200 ml), přičemž teplota byla udržována pod 20 °C. Směs byla míchána 2 h a poté byl přidán nasycený roztok chloridu amonného (2 1) a toluenu (4 1) a směs byla třepána po dobu 5 min. Jednotlivé fáze byly odseparovány a vodná vrstva byla extrahována toluenem (2x4 L). Spojené toluenové extrakty byly pro mývány zředěnou kyselinou chlorovodíkovou tak dlouho, dokud roztok nebyl homogenní. Poté byl promyt solankou (3x4 1). Toluenový roztok byl nakonec zahuštěn při atmosférickém tlaku na 2 1. Tento roztok byl použit přímo v dalším kroku.

Syntéza (2R,S)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-methyl-2-(4'-[2-piperidin]ethoxy)fenyl)2H-l-benzpyranové soli (lS)-lO-kafrosulfonové kyseliny (± 12). Do toluenového roztoku 4-hydroxy-4-methy 1-2-(4 '-[-2' '-piperidin]-ethoxy)-fenyl-3-(4'' '-tetrahydropyranyloxy)fenyl-7-tetrahydropyranyloxychromanu (10) byl přidán aceton (6 1), voda (0,3 1) a (S)-lO-kafrosulfonová kyselina (561 g, 2,42 mol) (dostupná od Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wisc.). Směs byla třepána pod dusíkem po dobu 48 h a poté byla pevná látka (2R,S)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-methyl-2-(4' '-[2'' -piperidin]ethoxy)fenyl)-2H-1 -benzpyranová sůl (lS)-lO-kafrosulfonové kyseliny (12) zfiltrována, promyta acetonem a vysušena (883 g). Tento materiál byl použit v dalším kroku (HH) bez dalšího přečišťování.

Syntéza (2S)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4-methyl-2-(4-[2'-piperidin]ethoxy)-fenyI)-2H-l-benzpyranové soli (lS)-lO-kafrosulfonové kyseliny (13, (+)-EM-652(lS)-CSA sůl).

Suspenze (2R,S)-7-hydroxy-3-(4 '-hydroxyfenyl)-4-methyl-2-(4' '-[2'''- piperidin]ethoxy)fenyl)♦0 ·· • 00« • * * * *

0·0 0 ♦ 0

-2H-benzpyranové soli (lS)-lO-kafrosulfonové kyseliny (+ 12) (759 g) v 95% ethanolu byla zahřívána za stálého míchání na teplotu asi 70 °C tak dlouho, dokud se pevná látka nerozpustila. Roztok byl ponechán za stálého míchání, aby se ochladil na laboratorní teplotu, poté bylo přidáno pár krystalků (2S)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyfenyl)-4--methyl-2-(4-[2'piperidin]ethoxy)fenyl)-2H-l-benzpyranové soli (lS)-lO-kafrosulfonové kyseliny 13. Roztok byl míchán při laboratorní teplotě po dobu asi 3 dní. Poté byly krystaly odfiltrovány, promyty 95% ethanolem a vysušeny (291 g, 76 %). De produktu bylo 94,2 % a čistota 98,8 %.

Syntéza (S)-(+)-7-hydroxy-3-(4 -hydroxyfenyl)-4-methyI-2-(4''-(2 ' -piperidinethoxy)-fenyI)-2H-l-benzpyran hydrochloridu EM-01538 (EM-652.HC1). Suspenze sloučeniny 13 (sůl EM-652-(+)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) v dimethylformamidu (11 μΐ, 0,15 mmol) byla ošetřena 0,5 M vodným roztokem uhličitanu sodného (7,0 ml, 3,6 mmol) a byla míchána po dobu 15 min. Suspenze byla ošetřena ethylacetátem (7,0 ml) a byla míchána 4 h. Organická fáze byla promyta vodným nasyceným roztokem uhličitanu sodného (2x5 ml), a solankou (1 x 5 ml), byla vysušena přes síran hořečnatý a zahuštěna. Roztok výsledné růžové pěny (EM-652) v ethanolu (2 ml) byl ošetřen 2 N kyselinou chlorovodíkovou (400 μΐ, 0,80 mmol), byl míchán po dobu 1 h, ošetřen destilovanou vodou (5 ml) a míchán 30 min. Výsledná suspenze byla zfiltrována, promyta destilovanou vodou (5 ml), vysušena na vzduchu a pod vysokým vakuem (65 °C) s cílem získat prášek krémové barvy (276 mg, 77 %): jemný prášek bílé barvy; skenovaci kalorimetrie: nástup vrcholu tání při 219 °C, AH=83 J/g; [cc]²⁴d = 154 ⁰ v methanolu 10 mg/ml. ’H NMR (300 MHz, CD3OD) δ (ppm) 1,6 (široký, 2H, H-4), 1,85 (široký, 4H, H-3'' a 5), 2,03 (s, 3H, CH3), 3,0 a 3,45 (široký, 4H, H-2 a 6), 3,47 (t, >4,9 Hz, 2H, H-3 ), 4,26 (t, >4,9 Hz, 2H, H-2'), 5,82 (s, 1H, H-2), 6,10 (d, >2,3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, >8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, >8,6 Hz, 2H, H-3', a H-5), 6,83 (d, >8,7 Hz, 2H, H-3 a H-5), 7,01 (d, >8,5 Hz, 2H, H-2'a H-6), 7,12 (d, >8,4 Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, >8,6 Hz, 2H, H-2 a H-6); ¹³C RMN (CD3OD, 75 MHz) δ ppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33. Elementární složení: C, Η, N, Cl: teoreticky; 70,51, 6,53, 2,84, 7,18, %. Zjištěno: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89 %.

Φ · φ * φ φ φ φ*φ • ♦ ο *·» » · » «

Příklad 4

Materiál a metody

Zvířata

Samice myši BALB/c (BALB/cAnNCrlBR), jejichž hmotnost byla 18 až 20 g, byly získány od Charles-River lne. (St-Constant, Quebec, Kanada) a byly umístěny po 5 do jedné klece, ve které byly regulovány podmínky - teplota (23 ± 1 °C) a světlo (12 h světlo/den, světlo v 7:15). Myši dostávaly potravu pro hlodavce a byl jim umožněn přístup k vodě ad libitum. Zvířata byla v anestézii Tsofluranem podrobena ovariektomii (OVX) prostřednicvím řezu na obou bocích a byla náhodně rozdělena do skupin po 10 zvířatech. Deset zdravých myší bylo ponecháno jako kontrola.

Léčba

V prvním experimentu (obr. 12 až 15) byly testované sloučeniny, konkrétně EM-652.HCI, lasofoxifen (jako volná báze; aktivní a inaktivní enantiomery) a raloxifen podávány orálně prostřednictvím žaludeční sondy jednou denně v dávkách 1, 3 nebo 10 pg/zvíře. Sloučeniny byly podávány po dobu 9 dní, počínaje 2 dnem po ovariektomii. Ve druhém experimentu (tab. 3) bylo orálně podáváno TSE 424 prostřednictvím žaludeční sondy jednou denně v dávkách I, 3, 10 nebo 30 pg/zvíře. Sloučenina byla podávána po dobu 9 dní, počínaje 2 dnem po ovariektomii. V obou experimentech, jejichž cílem bylo zjistit antiestrogenovou aktivitu, byla léčba estronem (Ei, 0,06 pg, s.c. injekce, dvakrát denně) zahájena 5 dní po ovariektomii a trvala 6 dní. Sloučeniny byly rozpuštěny v ethanolu (4% konečná koncentrace) a byly podávány v 0,4% methylcelulose. Myši ve zdravé skupině a kontrolní OVX skupině dostávaly v průběhu 9 dní samotné vehikulum (4% ethanol-0,4% methylcelulosa). Zvířata byla usmrcena vykrvením z břišní aorty 11 den ráno po ovariektomii. Děloha a vagína byly ihned rozřezány, zváženy a uchovávány v 10% pufřovaném formalínu pro další histologická vyšetření.

*·*

fe* fe fe fe • fefe • ···· • fe ·« fe ·* • fe fe • fe fe fefe fefe

« *

Výsledky

Experiment 1

Jak je ukázáno na obr. 12 způsobila sloučenina EM-652.HCl podávaná orálně v denních dávkách 1 pg, 3 pg a 10 pg 24%, 48% a 72% inhibici estronem stimulované hmotnosti dělohy (p<0,01 pro všechny dávky versus kontrola), zatímco raloxifen podáváný ve stejných dávkách způsobil 6% (NS), 14% (p<0,01) a 43% (p<0,01) inhibici tohoto parametru. Na druhé straně Lasofoxifen (jako volná báze) neměl v nejnižší použité dávce žádný inhibiční účinek, zatímco při denních dávkách 3 pg a 10 pg způsoboval 25% (p<0,01) a 44% (p<0,01) inhibici estronem stimulované hmotnosti dělohy. Inaktivní enantiomer lasofoxifenu nevykazoval v žádné použité dávce žádný inhibiční účinek na tento parametr.

U sloučenin uvedených výše se předpokládalo, že budou mít na hmotnost vagíny podobné účinky. Denní orální aplikace EM-652.HC1 v dávkách 1 pg, 3 pg a 10 pg (obr. 13) vedla k 10% (NS), 25% a 53% inhibici hmotnosti vagíny (p<0,01 pro dvě nejvyšší dávky), zatímco raloxifen uplatnil významný 24% (p<0,01) inhibiční účinek na tento parametr pouze v nejvyšší dávce (10 pg). Podobně jako raloxifen, lasofoxifen (jako volná báze) způsobil významný 37% (p<0,01) inhibiční účinek pouze v nejvyšší použité dávce, zatímco inaktivní enantiomer neměl v žádné použité dávce žádný inhibiční účinek na hmotnost vagíny.

Jestliže byly sloučeniny podávány (bez přítomnosti estronu) myším po ovariektomii samostatně v denních orálních dávkách 1 pg a 10 pg, neměl EM-652.HC1 v obou použitých dávkách žádný významný stimulační efekt na hmotnost dělohy, zatímco léčba 10 pg lasofoxifenu a raloxifenu způsobila 93% (p<0,01) a 85% (p<0,01) stimulaci hmotnosti dělohy (obr. 14), což naznačuje estrogenový vliv těchto sloučenin na daný parametr. Podobně také sloučenina EM-652.HCl vykazovala pouze malý stimulační účinek na hmotnost vagíny (obr. 15), zatímco podávání 10 pg lasofoxifenu a raloxifenu způsobilo 73% (p<0,01) a 56% (p<0,01) stimulaci hmotnosti vagíny. Naopak inaktivní enantiomer lasofoxifenu neměl na hmotnost dělohy a vagíny žádný stimulační vliv.

Experiment 2

Jak je ukázáno v tab. 3, způsobil orálně aplikovaný TSE 424 podávaný v denní dávce 1 pg, 3 pg, 10 pg nebo 30 pg, 12% (NS), 47%, 74% a 94% inhibici estronem stimulované hmotnosti dělohy (p<0,01 pro tři nejvyšší dávky versus Ei-kontrola). Naopak denní orální aplikace dávky 3 pg, 10 pg a 30 pg TSE 424 vedla k 16% (NS), 56% (p<0,01) a 93% (p<0,01) inhibici hmotnosti vagíny.

Jestliže byla sloučenina TSE 424 podávána myším po ovariektomii samostatně (bez přítomnosti estronu) v denních orálně aplikovaných dávkách 3 pg a 30 pg, neměla v obou použitých dávkách na hmotnost vagíny a dělohy žádný významný stimulační vliv (tab. 3).

Tabulka 3 Vliv zvyšujících se koncentrací TSE 424 podávaných orálně po dobu 9 dní myším po ovariektomii, které současně byly nebo nebyly léčeny estronem, na hmotnost dělohy a vagíny. **p<0,01 versus kontrola léčená Ej.

LÉČBA	HMOTNOST DĚLOHY (mg)	HMOTNOST VAGÍNY (mg)
zdravé	54,6 ± 12,5**	37,9 ± 3,9**
OVX	15,6 ± 1,3**	13,9 ± 1,5**
OVX + El	118,3 ±6,0	53,4 ±2,8
OVX + Ei + TSE 424 1 pg	105,5 ±6,1	54,2 ± 3,0
OVX + Ej + TSE 424 3 pg	69,7 ± 4,4**	47,2 ± 1,6
OVX + Ei + TSE 424 10 pg	42,1 ±2,7**	31,1 ±2,3**
OVX + El + TSE 424 30 pg	21,7 ± 1,7**	16,7 ± 1,8**
OVX + TSE 424 3 pg	18,3 ± 1,2	14,1 ± 1,2
OVX + TSE 424 30 pg	17,7 ± 1,6	15,3 ±2,0

Příklad 5

5A Preventivní účinky na úbytek kostní hmoty, na lipidy v séru a na celkový tělesný tuk

Zvířata a léčba.

Byly použity deset až dvanáct týdnů staré samice potkan Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St.-Constant, Kanada) vážící na počátku léčby

00 · · « 0 0 ·

0

0 •0 0000 «000 0 • 0 přibližně 220 až 270 g. Zvířata byla aklimatizována na dané podmínky (teplota: 22 ± 3 °C; vlhkost: 50 ± 20 %, cyklus 12 h světlo, 12 h tma, světlo v 7:15 h) po dobu alespoň 1 týdne před začátkem experimentů. Zvířata byla umístěna jednotlivě a byl jim umožněn přístup k vodě a granulované certifikované potravě pro hlodavce (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Experimenty byly prováděny ve veterinárním zařízení povoleném Canadian Council on Animal Care (CCAC) a Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) v souladu s CCAC směrnicemi pro ošetřování a použití experimentálních zvířat (Guide for Care and Use of Experimental Animal).

V prvním experimentu bylo 154 potkanů náhodně rozděleno do 11 skupin po 14 zvířatech: 1) zdravá kontrola; 2) OVX kontrola; 3) OVX + E₂ (1 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HC1 (2,5 mg/kg); 5) OVX + E₂ + EM-652.HC1; 6) OVX + dehydroepiandrosteron (DHEA; 80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + EM-652.HC1; 8) OVX + DHEA + E₂; 9) OVX + DHEA + E₂ + EM-652.HC1; 10) OVX + GW 5638; 11) OVX + E₂ + GW 5638. První den studie byla zvířata příslušné skupiny podrobena oboustranné ovariektomii (OVX) v anestézii isofluranem. DHEA byl aplikován topikálně do hřbetní kůže ve formě roztoku v 50% ethanol - 50% propylenglykolu, ostatní testované sloučeniny byly podávány ve formě suspenze v 0,4% methylcelulose prostřednictvím orální žaludeční sondy. Léčba byla zahájena druhý den studie a byla prováděna jednou denně po dobu 3 měsíců.

Ve druhém experimentu bylo 132 potkanů náhodně rozděleno do 9 skupin po 14 nebo 15 zvířatech: 1) zdravá kontrola; 2) OVX kontrola; 3) OVX + Premarin (0,25 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HC1 (2,5 mg/kg); 5) OVX + Premarin + EM-652.HC1; 6) OVX + TSE 424 (2,5 mg/kg); 7) OVX + Premarin + TSE 424; 8) OVX + lasofoxifen (vinanová sůl; racemát; 2,5 mg/kg); 9) OVX + Premarin + lasofoxifen. První den studie byla zvířata příslušných skupin podrobena oboustranné OVX v anestézii isofluranem. Testované sloučeniny byly podávány ve formě suspenze v 0,4% methylcelulose orálně prostřednictvím žaludeční sondy. Léčba byla zahájena druhý den studie a byla prováděna jednou denně po dobu 26 týdnů. V obou experimentech byla zvířata, která nedostávala testované přípravky, léčena stejnou dobu ale pouze odpovídajícím samotným vehikulem.

Měření minerální hustoty kostí

Po 3 měsících (experiment 1) nebo 26 týdnech (experiment 2) léčby byl v isofluranové anestézii u jednotlivých potkanů skenován celý jejich tělesný skelet a bederní páteř. Bylo použito měření absorbance pomocí duálního RTG (DEXA; QDR 4 500 A, Hologic, Waltham, MA) a <··· ···· ·· · • · ···· · · · ··· · · · · ··· *· · · · · •4 · «« «r «· ··»· software Regional High Resolution Scan. Byla určena minerální hustota kostí (BMD) bederní páteře (obratle L2 až L4) a celkové tělesné složení (procento tuků).

Analýza séra

Po 3 měsících (experiment 1) nebo 26 týdnech (experiment 2) léčby, byly zvířatům, kterým nebyla přes noc podána potrava, odebrány z jugulární žíly vzorky krve (v isofluranové anestézii). Vzorky byly zpracovány, bylo připraveno sérum, které bylo do doby, než bylo použito k měření zmraženo na teplotu -80 °C. Hladiny cholesterolu v séru a aktivita alkalické fosfatasy (ALP) byly stanoveny pomocí analyzátoru Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems).

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměry ± SEM. Statistická významnost byla stanovena podle testu vícenásobných pořadí podle Duncan-Kramera (Kramer CY; Biometrics 1956; 12: 307 až 310).

Výsledky

Jak je ukázáno v tab. 4 byla po 3 měsících od ovariektomie BMD bederní páteře u OVX kontrolních zvířat o 10% nižší než u zdravých kontrol (p<0,01). V daných použitých dávkách zabraňovalo podávání samotného estradiolu a EM-652.HC1 úbytek BMD bederní páteře z 98 % (p<0,01) a 65 % (p<0,05), zatímco kombinovaná léčba E₂ a EM-652.HC1 zabránila poklesu BMD v bederní páteři indukovanému ovariektomii z 61 % (p<0,005). Naopak zatímco podávání samotného DHEA chránilo BMD bederní páteře z 43 % (p<0,05), kombinovaná léčba pomocí DECEA + E₂ + EM-652.HC1 zabránila poklesu BMD bederní páteře indukovanému OVX z 91 % a vedla k hodnotě BMD stejné jako u zdravých kontrol.

V tab. 5 je uvedeno, že 26 týdnů po ovariektomii byla BMD bederní páteře ve srovnání s zdravými kontrolami o 18 % nižší (p<0,01). Podávání samotného Premarinu,

EM-652.HC1, TSE 424 a lasofoxifenu zabraňovalo poklesu BMD z 54 %, 62 %, 49 % a 61 % (všechny p<0,01 versus OVX kontroly). Přídavek Premarinu k EM-652.HC1, TSE 424 nebo lasofoxifenu vedl k téměř stejným hodnotám BMD bederní páteře jako byly hodnoty získané při podávání každého SERMu samostatně (tab. 5). Podobně přídavek DHEA k E₂ nebo k ··

• · • · • · t· ···· • · · • · >·

EM-652.HC1 zcela zabraňoval poklesu BMD bederní páteře indukovanému OVX (tab. 4). Pozitivní účinek DHEA na BMD je také podporován vlivem na aktivitu alkalické fosfatasy (ALP), což je znak tvorby a přeměny kostí. Aktivita ALP byla zvýšena ze 73 ± 6 IU/1 u OVX kontrolních zvířat na 224 ± 18 RJ/l, 290 ± 27 IU/1, 123 ± 8 IU/1 a 261 ± IU/1 (všechny p<0,01) u zvířat léčených DHEA DHEA + EM-652.HC1, DHEA + E₂ a DHEA + E₂ + EM-652.HC1, na základě čehož se předpkládá stimulační vliv DHEA na tvorbu kostí (tab. 6).

Kromě preventivních účinků na úbytek kostní hmoty vykazuje aplikace EM-652.HC1, TSE 424, lasofoxifenu, GW 5638, DHEA a E₂ určité pozitivní účinky na procento celkového tělěsného tuku a na lipidy v séru. 3 měsíce po ovariektomii byl celkový tělesný tuk zvýšen o 22 % (p<0,05, tab. 6). Podávání EM-652.HC1 zcela zabraňuje zvýšení procenta tuku indukovaného OVX, zatímco přídavek DHEA a/nebo E₂ k SERMu vedl k procentuálním hodnotám tuku nižším než byly hodnoty zjištěné u zdravých kontrolních zvířat. Po 26 týdnech od ovariektomie byl 40% nárůst obsahu tuku indukovaný nedostatkem estrogenů po podání Premarinu, EM-652.HC1, TSE 424 nebo lasofoxifenu navrácen ze 74 %, 78 %, 75 % a 114 %, zatímco přídavek Premarinu ke každému SERMu zcela zabránil zvýšení procenta tuku indukovaného OVX (tab. 7).

Jak je uvedeno v tab. 6 bylo tři měsíce po ovariektomii u OVX kontrolních potkanů pozorováno v porovnání se zdravými zvířaty 22% zvýšení hladin cholesterolu v séru (p<0,01). Cholesterol v séru byl zvýšen z 2,01 ±0,11 mmol/1 u zdravých zvířat na 2,46 ± 0,08 mmol/1 u OVX kontrol. Podávání samotného E₂ nebo DHEA snižují hladiny cholesterolu v séru na 1,37 ± 0,18 mmol/1 a 1,59 ± 0,10 mmol/1, zatímco aplikace samotného EM-652.HC1 nebo v kombinaci s E₂ a/nebo DHEA vedla k významně nižším hladinám cholesterolu (mezi 0,65 a 0,96 mmol/1) v porovnání s hladinami, ktreé byly získány u zdravých zvířat (2,01 ± 0, 11 mmol/1). Podobně aplikace samotného GW 5638, TSE 424 a lasofoxifenu nebo v kombinaci s E₂ nebo Premarinem zcela zabránila zvýšení hladin cholesterolu v séru indukovaného OVX a vedla k hodnotám nižším než byly hodnoty zjištěné u zdravých zvířat (tab. 6 a 7).

• · • ·

Tabulka 4 Vliv 3 měsíční léčby estradiolem, EM-652.HCI, GW 5638 nebo DHEA podávaných samostatně nebo v kombinaci samicím potkana po ovariektomii na prevenci úbytku kostí

LÉČBA	BEDERNÍ PÁTEŘ
BMD (g/cm²)	prevence úbytku kostí (%)
zdravé	0,2461 ± 0,0049**	100
OVX	0,2214 + 0,0044	-
OVX + e₂	0,2457 ± 0,0049**	98
OVX + EM-652.HCI	0,2374 ±0,0027**	65
OVX + EM-652.HCI + E₂	0,2364 ± 0,0037**	61
OVX + DHEA	0,2321 ± 0,0034**	43
OVX + DHEA + EM-652.HCI	0,2458 ± 0,0037**	99
OVX + DHEA+ E₂	0,2496 ± 0,0029**	114
OVX + DHEA + E₂+ EM-652.HCI	0,2439 ± 0,0043**	91
OVX+ GW 5638	0,2299 ± 0,0060	34
OVX + GW 5638 +E₂	0,2344 ± 0,0054	53

, p< 0,05; **, p< 0,01, experimentální versus OVX kontrolní potkani • · « ·

Tabulka 5 Vliv 26 týdenní léčby premarinem, EM-652.HC1, TSE 424 nebo lasofoxifenem podávaných samostatně nebo v kombinaci s premarinem samicím potkana po ovariektomii na prevenci úbytku kostí

LÉČBA	BEDERNÍ PÁTEŘ
BMD (g/cm²)	prevence úbytku kostí (%)
zdravé	0,2482 ± 0,0067**	100
OVX	0,2035 ± 0,0035	-
OVX + Premarin	0,2277 ± 0,0028**	54
OVX + EM-652.HC1	0,2311 ±0,0040**	62
OVX + Premarin + EM-652.HC1	0,2319 + 0,0057**	64
OVX + TSE 424	0,2252 ± 0,0058**	49
OVX + Premarin + TSE 424	0,2223 ± 0,0046**	42
OVX + Lasofoxifen	0,2307 ± 0,0040**	61
OVX + Premarin + Lasofoxifen	0,2357 ± 0,0035**	72

**, p< 0,01, experimentální versus OVX kontrolní potkani • ·

Tabulka 6 Vliv 3 měsíční léčby estradiolem, EM-652.HC1, GW 5638 nebo DHEA podávaných samostatně nebo v kombinaci samicím potkana po ovariektomii na procento celkového tělesného tuku, na hladiny cholesterolu v séru a na aktivitu alkalické fosfatasy

LÉČBA	CELKOVÝ TUK (%)	CHOLESTEROL (mmol/1)	ALP (IU/1)
zdravá	24.0 ±15*	2.01 ±0.11**	39 ±2**
OVX	295 ±15	2.46 ±0.08	73 ±6
OVX + Ez	195 ±25**	157 ±0.18**	59 ±4
OVX + EM-652HC1	23.2 ±1.4**	0.87 ±0.04**	91 ±6*
OVX + EM-652HC1 + Ez	20.4 ±1.4**	0,96 ±0.07**	92 ±5*
OVX+DHEA	175 ±1.5**	159 ±0.10**	224 ±18**
OVX + DHEA + EM-652JÍC1	18.0 ±1.1**	0.65 ±0.06**	290 ±27**
OVX + DHEA + Ez	155 ±15**	1.08 ±0.08**	123 ±8**
OVX + DHEA + Ez + EM- 652.HC1	195 ±1.6**	0.71 ±0.08**	261 ±20**
OVX+ GW 5638	215 ±1.4**	1.14 ±0.08**	72±6
OVX + GW 5638 + Ez	23.2 ±1.2**	0.91 ±0.07**	80 + 6

*, p<0,05; **, p<0,01, experimentální versus OVX kontrolní potkani • · · • ·

Tabulka 7 Vliv 26 týdenní léčby premarinem, EM-652.HC1, TSE 424 nebo lasofoxifenem podávaných samostatně nebo v kombinaci s premarinem samicím potkana po ovariektomii na procento celkového tělesného tuku, na hladiny cholesterolu v séru a na aktivitu alkalické fosfatasy «· · ·· .·· • · · 4 ♦ · • ··· · · · „ • ······· · ·· • 44 4 · • 4 ♦ ·· ··

LÉČBA	CELKOVÝ TUK (%)	CHOLESTEROL (mmol/1)	ALP (IU/1)
zdravá	255 ±1.8**	2.11 ±0.11**	33 ±2*
OVX	35.7 ±1.6	251 ±0.09	60±6
OVX + Premarin	28.2 ±1.8**	1.22 ±0.07**	49±3
OVX + EM-652.HC1	27.7 ±1.4**	0.98 ±0.06**	78 ±4
OVX + EM-652.HC1 + Premarin	25.7 + 2.2**	1.10 ±0.07**	81 + 6
OVX + TSE 424	. 28.0 ±1.8** ’	1.15 ±0.05**	85±6
OVX + TSE 424 + Premarin	25.7 ±1.7**	1.26 ±0.14**	98 ±22**
OVX + Lasofoxifen	24.1 ±1.3**	0.60 ±0.02**	116 + 9**
OVX + Lasofoxifen + Premarin	23.8 ±1.9**	0.81 ±0.12**	107 ±6**

*, p<0,05; **, p<0,01, experimentální versus OVX kontrolní potkani ·

• · · • · · · · ·

5B: Léčebné účinky na ztrátu kostní hmoty a celkový tělesný tuk

Zvířata a léčba

V tomto experimentu byly použity osm až devět měsíců staré samice potkana Sprague-Dawley (Crl.CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St.-Constant, Kanada). Zvířata byla aklimatizována na dané podmínky (teplota: 22 ± 3 °C; vlhkost: 50 ± 20 %, cyklus 12 h světlo, 12 h tma, světlo v 7:15 h) po dobu alespoň 1 týdne před ovariektomii. Zvířata byla podrobena v anestézii isofluranem oboustranné ovariektomii (OVX). Dvacet zvířat bylo ponecháno jako kontrola. Zvířata byla umístěna jednotlivě a byl jim umožněn volný přístup k vodě a ke granulované certifikované potravě pro hlodavce (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Experimenty byly prováděny ve veterinárním zařízení povoleném Canadian Council on Animal Care (CCAC) a Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) v souladu s CCAC směrnicemi pro ošetřování a použití experimentálních zvířat.

týdnů po OVX bylo 139 potkanů náhodně rozděleno do 8 skupin po 17 až 20 zvířatech: 1) zdravá kontrola; 2) OVX kontrola; 3) OVX + E₂ (1 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HC1 (2,5 mg/kg); 5) OVX + E₂ + EM-652.HC1; 6) OVX + dehydroepiandrosteron (DHEA; 80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + EM-652.HC1; 8) OVX + DHEA + EM-652.HC1 + E₂. DHEA byl aplikován topikálně do hřbetní kůže ve formě roztoku v 50% ethanol - 50% propylenglykolu, zatímco E₂ a EM-652.HC1 byly podávány ve formě suspenze v 0,4% methylcelulose orálně prostřednictvím žaludeční sondy. Léčba byla zahájena 10 týdnů po ovariektomii a byla prováděna jednou denně po dobu 26 týdnů. Zvířata, která nedostávala testovaný preparát, byla stejnou dobu léčena pouze příslušným samotným vehikulem.

Měření minerální hustoty kostí

Před OVX a před prvním dnem léčby (10 týdnů po OVX) a po 26 týdnech léčby byl u jednotlivých potkanů v isofluranové anestézii skenován celý jejich tělesný skelet, bederní páteř a pravé stehno. Použito bylo měření absorbance pomocí duálního RTG (DEXA; QDR 4 500 A, Hologic, Waltham, MA) a softwaru Regional High Resolution Scan software. Byla stanovena minerální hustota kostí (BMD) bederní páteře (obratle L2 až L4), stehna a celkové tělesné složení (procento tuků).

• ·

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměry ± SEM. Statitická významnost byla stanovena podle testu vícenásobných pořadí podle Duncan-Kramera (Kramer CY; Biometrics 1956; 12: 307 až

310).

Výsledky

V předcházejících studiích, které jsou popsány výše (příklad 5A), bylo podávání testovaných sloučenin zahájeno v době OVX s cílem studovat preventivní účinky na úbytek kostí. V této studii bylo podávání testovaných sloučenin zahájeno 10 týdnů po OVX s cílem studovat možné léčebné účinky aplikovaných léčeb. BMD byla měřena před OVX (výchozí základní hodnoty) a před zahájením léčby. Cílem bylo určit přítomnost osteopenie před zahájením léčby. Jako je ukázáno na obr. 16, po 10 týdnech od ovariektomie byla BMD bederní páteře snížena o 8 % a další pokles o 12 % následoval po dalších 26 týdnech OVX . Během této doby zvířata dostávala samotné vehikulum (kontrolní skupina). Denní aplikace sloučenin E₂, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1, DHEA nebo DHEA + EM-652.HC1 zvířatům, která měla diagnostikovanou osteopenii, po dobu 26 týdnů, zcela zabránila dalšímu poklesu BMD bederní páteře, který byl pozorován u OVX kontrolních zvířat. Podávání E₂ + EM-652.HC1 + DHEA naopak vedlo k hodnotám BMD, které byly lehce vyšší než hodnoty zjištěné před začátkem léčby. Na druhé straně jak je uvedeno na obr. 7 BMD stehenní kosti byla po 10 týdnech od ovariektomie snížena o 4 % a po 26 týdenní léčbě samotným vehikulem byla snížena o dalších 6 %. Podobně jako u BMD bederní páteře denní aplikace sloučenin E₂, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1, DHEA nebo DHEA + EM-652.HC1 po dobu 26 týdnů zcela zabránila dalšímu poklesu BMD stehenní kosti, který byl pozorován u OVX kontrolních zvířat. Na druhé straně podávání sloučenin E₂ + EM-652.HC1 + DHEA vedlo k hodnotám BMD stehenní kosti, které byly pouze lehce vyšší než hodnoty, které byly zjištěny před OVX. Toto naznačuje pozitivní účinek této kombinované léčby na tvorbu kostí. Kombinovaná léčba pomocí EM-652.HC1 + E₂ + DHEA zcela nezabránila u zvířat s osteopenii pouze dalšímu úbytku kostní hmoty indukovanému OVX, ale také vykazovala určité léčebné účinky.

Kromě vlivu na kosti, což je uvedeno na obr. 18, zabránilo podávání DHEA, E₂ a/nebo EM-652.HC1 zvýšení celkového tělesného tuku, které je indukované OVX. U OVX kontrolních zvířat bylo po 10 týdnech od ovariektomie procento tuku zvýšeno o 47 % a v průběhu 26 týdnů léčby samotným vehikulem (kontrolní skupina) bylo dále zvýšeno o 17 %. Denní aplikace E₂,

9

0

0 4

DHEA, EM-652.HC1, E₂ + EM-652.HC1 nebo DHEA + EM-652.HCÍ po dobu 26 týdnů zabránila 17% zvýšení, které bylo pozorováno u OVX kontrolní skupiny. Na druhé straně kombinovaná léčba EM-652.HC1 + E₂ + DHEA zcela zvrátila účinek OVX a vedla k podobné procentuální hodnotě tuku jako byla zjištěna před ovariektomii zvířat, čímž byl naznačen léčebný účinek této léčby.

Příklad 6 Vliv sloučenin podle vynálezu na aktivitu alkalické fosfatasy u buněk Ishikawa lidského adenokarcinomu endometria

Materiál

Uchovávání zásobních buněčných kultur

Linie lidských buněk Ishikawa odvozených z dobře diferencovaného adenokarcinomu endometria laskavě poskytl Dr. Erlio Gurpide, The Mount Sinai Medical Center, New York, NY, Ishikawa buňky byly uchovávány v minimálním médiu Eagle s Minimum Essential Medium (MEM) obsahujícím 5% (obj.). FBS (zárodečné hovězí sérum) a obohaceném o 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 0,1 mM roztokem postradatelných aminokyselin. Buňky byly při teplotě 37 °C umístěny do baněk Falcon T75 v hustotě 1,5 x 10⁶ buněk.

Experimenty s buněčnou kulturou hodin před zahájením experimentu bylo médium Ishikawa buněk v téměř 100% konfluenci nahrazeno čerstvým základním médiem bez estrogenů (EFBM) obsahujícím směs médií Ham s F-12 bez fenolové červeně a Dulbeccova modifikovaného Eaglova média (DMEM) v poměru 1:1 (obj.), které bylo obohaceno 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml sterptomycinu, 2 mM glutaminem a 5% FBS a které bylo dvakrát ošetřeno aktivním uhlím potaženým dextranem, jehož úkolem bylo odstranit endogenní steroidy. Buňky byly poté sklizeny pomocí 0,1% pankreatinu (Sigma) a 0,25 mM HEPESu, byly resuspendovány v EFBM a umístěny do mikrotitračních destiček Falcon 96 s plochým dnem jamek v hustotě 2,2 x 10⁴ buněk/jamku v objemu 100 pl. Buňky byly ponechány 24 h, aby došlo k jejich navázání na povrch destiček. Poté bylo médium nahrazeno čerstvým EFBM, které obsahovalo naznačené koncentrace sloučenin v konečném objemu 200 pl. Buňky byly inkubovány 5 dní, přičemž médium bylo po 48 h vyměněno.

« · « ·

Stanovení alkalické fosfatasy

Na konci inkubace byly mikrotitrační destičky obráceny a růstové médium bylo vylito. Každá jamka destičky byla naplněna 200 μΐ PBS (0,15 M NaCl, 10 mM fosfát sodný, pH 7,4). PBS byl poté z destiček odstraněn, přičemž určité zbytkové množství v jamkách zůstalo a promytí bylo opakováno ještě jednou. Pufrovaná solanka byla poté vylita a převrácené destičky byly lehce osušeny papírem. Po uzavření byly destičky umístěny na 15 min. do -80 °C a poté byly ponechány při laboratorní teplotě po dobu 10 min, aby roztály. Destičky byly poté umístěny na led a bylo přidáno 50 μΐ na ledového roztoku obsahujícího 5 mM p-nitrofenylfosfát, 0,24 mM MgCl₂ a 1 M diethanolamin (pH 9,8). Destičky byly zahřátý na laboratorní teplotu čímž bylo umožněno, aby vznikala žlutá barva (8 min.), která byla důsledkem vzniku p-nitrofenolu. Destičky byly měřeny při 405 nm na spektrofotometru určeném k měření destiček při enzymoimunoanalýze (Bio-RAD, model 2550 EIA Reader).

Výpočty

Křivky vyjadřující odezvy na dávku i hodnoty IC50 byly vypočítány pomocí vážkové iterační nelineární čtvercové regrese.

• fl ····

Tabulka 8

Maximální inhibice ' lnME2-	indukované stimulace	alkalické fosfatasy	(počet experimentů)	ř* r-l g cr> oó O\	cO* τΗ»	CM m K K	δ
									-
• i (U N > O Ixj O • τ—i ’-Μ L/ a 5 .a	stimulace alkalické	3?	0 s, tť *d		CM CM a	OO	\o r-l	s	0 O
43 cn ,y <88	v 51 · 0 K¹		«9		Fí		s\| co .S

'3 83 ε 43.2	K*-» 1Λ 3 43	W *_o S i	+-* α o 15 xj J> ° &	i	vO CM co oq	O? . CM>	r-l $ \q o\ CM		«o •á sj- ip GL r<
sil	£	A \p 0^ w	£> δ	i	τ~1
1		í			c	Q.	\		X 0 0 0
co						X	X	Z ’ θ	/==\	-
<1 qž < S		-			652.HC1;	OO* co 10 T*H » £	0 co co t		VO K r-l >
					S	w	w		w
					w
					,—»
					u				00
O					£			v m-m	co
Z					CM to vO		o	<3	10 £
					š w			0 H	O

·

0 0 0 »··» ·· » 0 0 · • · 0 * ; · ; · · ·· ♦·

-i> °-3 •3 Λ 1 8 >·. § \|«s\|gg\| O 11Ϊ3ίΙί	Ό Τ~Ι Λ o ct s
Inhibice lnME2- indukované stimulace alkalické fosfatasy IC₅₀(nM) (počet experimentů)	(I) WS
Maximální stimulace alkalické ¹ fosfatasy %lnME2 stimulace* (počet experimentů)	v? ÍT o í3
STRUKTURA	q X l
KÓD JMÉNA	ztse-m
JMÉNO	TSE424

<υ

Ο

CM w

-ρ cO £

>3 in

Ch <o pa

Ό e

tí

B <υ

Λ o

o

Ό

V S a <t>

_r t~~ <ň 'C

W β 6 §

Ά £

CM *>

\2 á fr & -kj

T* **<

>N -OJ tí >o

-4>

w ***» •s >-4

-<D cC

-4—>

•ΰ £

g

ÓO

O

Ή (Λ

O

Ch Ch Ch »—i

Příklad 7 Vliv EM-652.HC1, TSE 424 a lasofoxifenu na proliferaci buněk lidského karcinomu prsu MCF-7

Postupy:

Uchovávání zásobních buněčných kultur

Buňky MCF-7 lidského karcinomu prsu byly získány ze sbírky American Type Culture Collection # HTB 22 z pasáže 147, které byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle-Ham F12 médiu bez fenolové červeni, obohaceném o látky uvedené výše a 5% FBS. Linie buněk lidského adenokarcinomu prsu MCF-7 pocházela z pleurálního výpotku 69 leté ženy. Buňky MCF-7 byly použity mezi pasážemi 148 a 165 a byly přeočkovávány jednou týdně.

Studie proliferace buněk

Buňky v logaritmické fázi růstu byly sklizeny za pomoci 0,1% pankreatinu (Sigma) a byly resuspendovány ve vhodném médiu, které obsahovalo 50 ng hovězího insulinu/ml a 5% (obj.) FBS a které bylo dvakrát ošetřeno aktivním uhlím potaženým dextranem. Cílem bylo odstranit endogenní steroidy. Buňky byly v naznačené hustotě umístěny do 24 jamkové plastové kultivační destičky Falcon (2 cm²/jamku) a byly ponechány 72 h, aby se navázaly na povrch destičky. Poté bylo médium nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím naznačené koncentrace sloučenin, které byly naředěny z 1000 x koncentrovaných zásobních roztoků v 99% redestilovaném ethanolu v přítomnosti nebo bez přítomnosti E2. Kontrolní buňky dostávaly pouze ethanolové vehikulum (0,1% hmotn. Et-OH). Buňky byly inkubovány po určité časové intervaly a médium bylo vyměňováno ve 2 až 3 denních intervalech. Počet buněk byl stanoven prostřednictvím stanovení obsahu DNA.

Výpočty a statistická analýza

Křivky vyjadřující odezvy na dávky i hodnoty IC50 byly vypočítány pomocí vážkové iterační nelineární metody nej menších čtverců. Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako průměry ± SEM.

• v ·· • · · · • » * · • · ··* ·« ·>« • · · * • t ·♦*·

Tabulka 9

Experiment 1

JMÉNO	KÓD JMÉNA	Maximální stimulace DNA testovanými sloučeninami	Inhibice 1 nM E₂stimulace DNA testovanými sloučeninami
		% 1 nM E₂stimulace*	IC₅₀ (nM)
EM-Ó52.HC1	EM-652.HC1 EM-153 8	N.S.	0,796
TSE 424	EM-3527	N.S.	3,68

Experiment 2

JMÉNO	KÓD JMÉNA	Maximální stimulace DNA testovanými sloučeninami	Inhibice 1 nM E₂stimulace DNA testovanými sloučeninami
		% 1 nM E₂stimulace*	IC₅₀ (nM)
EM-652.HC1	EM-652.HC1 EM-1538	N.S.	0,205
Lasofoxifen (volná base)	EM-3114	N.S.	0,379

Příklad 8 Porovnání vlivu EM-652.HC1, Tamoxifenu, Toremifenu, Droloxifenu, Idoxifenu, GW-5638 a Raloxifenu na růst lidských nádorů prsu ZR-75-1 u nahých myší

Předmětem tohoto příkladu bylo porovnat agonistické a antagonistické účinky EM-652.HC1 a 6 dalších orálně podávaných antiestrogenů (SERMů) na růst dobře charakterizovaných xenoimplantátů karcinomu prsu ZR-75-1 senzitivních vůči estrogenu u nahých myší po ovariektomii.

Materiál a metody

Buňky lidského karcinomu prsu ZR-75-1

Buňky lidského karcinomu prsu ZR-75-1 byly získány ze sbírky American Type Culture Collection (Rockville, MD) a byly kultivovány v médiu RPMI-1640 bez fenolové červeně. Buňky byly obohaceny 2 mM L-glutaminem, 1 mM pyruvátem sodným, 100 IU penicilinu/ml, 100 pg streptomycinu/ml a 10% (obj.) zárodečným hovězím sérem. Byly inkubovány ve vlhčené atmosféře 95% vzduch / 5% CO₂ při teplotě 37 °C. Buňky byly pasážovány jednou týdně a sklizeny byly při dosažení 85-90% konfluence pomocí 0,083% pankreatinu/0,3 mM EDTA.

Zvířata a inokulace nádoru

Homozygotní samice atymické nu/nu Br myši (28 až 42 dní staré) byly získány z Charles River, lne. (Saint-Constant, Quebec, Kanada). Myši (5 na 1 klec) byly umístěny ve vinylových klecích, které byly vybaveny poklopem s filtrem vzduchu a které byly uchovávány v digestořích s laminárním prouděním vzduchu a byly zde udržovány podmínky bez výskytu patogenů. Fotoperioda byla 12 hodin světlo a 12 hodin tma (světlo v 7:15). Klece, prostředky určené ke spaní a potrava (Agway Pro-Lab R-M-H Diet #4018) byly před použitím autoklávovány. Voda byla autoklávována a byla poskytnuta ad libitum. Oboustranná ovariektomie byla provedena v anestézii isofluranem. Po ovariektomii byl podkožně zaveden implantát estradiolu (E₂), jehož úkolem bylo stimulovat počáteční růst nádoru. E₂ implantáty byly připraveny v 1 cm zkumavkách Silastic (vnitřní průměr: 0,157 cm; vnější průměr: 0,241 cm) obsahujících 0,5 cm vrstvu směsi estradiolu a cholesterolu v poměru 1:10 (hmotn.). Jeden týden po ovariektomii byly buňky ZR-75-1 (pasáž 93) o koncentraci 2 x 10⁶ v 0,1 ml média RPMI-1640 + 30% Matrigel podkožně aplikovány do obou boků každé myši po ovariektomii (OVX). K aplikaci byla použita

2,5 cm dlouhá jehla o vnitřním průměru 22G. Po 4 týdnech byly E₂ implantáty u všech zvířat nahrazeny stejně velkými implantáty obsahujícími estron (El: chol, 1:25, hmotn.). Randomizace a léčba byly zahájeny o jeden týden později.

Léčby

Jeden den před zahájením léčby bylo 255 myší nesoucích nádory ZR-75-1 o průměrné ploše 24,4 ± 0,4 mm² (rozmezí 5,7 až 50,7 mm²) náhodně rozděleno do 17 skupin (s ohledem na

4« • · · · • · · · • · ·»·

Φ • · · • · · «* ····»

ΦΦ »· • · · Φ • · * • · · velikost nádoru). Každá skupina zahrnovala 15 myší (celkově 29 nebo 30 nádorů). Ze 17 skupin byly dvě skupiny kontrolní (OVX a OVX + estron), 7 skupin mělo estronový implantát a bylo léčeno antiestrogenem a 8 skupin dostávalo samotný antiestrogen. Estronové implantáty byly poté u zvířat z kontrolní skupiny po ovariektomii (OVX) a u skupin, které měly dostávat samotný antiestrogen, odstraněny. U dalších devíti skupin byly implantáty obsahující estron měněny každých 6 týdnů. Sloučeniny EM-652.HCI, raloxifen, droloxifen, idoxifen a GW 5638 byly syntetizovány v divizi lékařské chemie výzkumného centra Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre. Tamoxifen byl získán od Plantex (Netanýa, Izrael) a citrát toremifenu byl získán od Orion (Espoo, Finsko). Při stimulaci estronem byly antiestrogeny podávány v denní orální dávce 50 pg (2 mg/kg, v průměru) suspendované v 0,2 ml 0,4% (hmotn./obj.) methylcelulosy. Nebyla-li aplikována stimulace estronem, byla zvířata léčena 200 pg (8 mg/kg v průměru) každého antiestrogenu podávaného jednou denně orální cestou. Zvířata z obou kontrolních skupin dostávala pouze 0,2 ml samotného vehikula. Suspenze antiestrogenu o příslušné koncentraci byly připravovány každý měsíc, byly skladovány při teplotě 4 °C a byly používány za konstantního míchání. Zásobní prášek byl skladován hermeticky uzavřený při teplotě 4 °C (idoxifen, raloxifen, toremifen, GW 5638, droloxifen) nebo při laboratorní teplotě (tamoxifen, EM-652.HC1).

Měření nádoru a nekropsie

Na nádoru byly vyznačeny dva kolmé průměry a pomocí vzorce: L/2 x W/2 x π byla vypočítána plocha nádoru (mm²). Plocha změřena první den léčby byla brána jako 100 %. Po 161 dnech léčby byla zbývající zvířata uspána pomocí isofluranu a byla usmrcena vykrvením. Aby mohl být dále charakterizován účinek estrogenů a antiestrogenů, byly tkáně, vykazující odezvu na estrogen, jako je děloha a vagína, ihned odebrány, byly z nich odstraněny pojivové a tukové tkáně a byly zváženy. Dělohy byly připraveny ke zhodnocení tloušťky endometria pomocí obrazové analýzy provedené pomocí Image Pro-Plus (Media Cybernetics, Maryland, USA). V krátkosti, dělohy byly fixovány v 10% formalínu a byly uloženy do parafinu. Řezy dělohou fixované hematoxylinem a eosinem byly podrobeny analýze. Byly analyzovány čtyři obrazy dělohy (2 na děložní roh). Průměrná výška epitelových buněk byla změřena u všech zvířat každé skupiny.

· •

Kriteria odezvy

Odezva nádoru byla hodnocena na konci studie nebo při usmrcení každého zvířete, došloli k němu v průběhu experimentu. V tomto případě byla pro analýzu odezvy nádoru použita pouze data těch myší, které přežily alespoň polovinu doby studie (84 dní). Stručně, úplná regrese identifikovala ty nádory, které nebylo možno na konci experimentu detekovat; částečná regrese odpovídá těm nádorům, které se zmenšily > 50 % své původní velikosti; stabilní odezva se vztahuje k nádorům, které se zmenšily < 50 % nebo které se zvětšily < 50 %; progrese se vztahuje k nádorům, které se v porovnání se svou původní velikostí zvětšily > 50 %.

Statistická analýza

Změna celkových ploch povrchu nádoru mezi dnem 1 a 161 byla analyzována pomocí ANOVA pro opakovaná měření. Model zahrnoval léčbu, čas a vlivy interakce čas-léčba plus člen pro výpočet strata při randomizaci. Význam účinků různých léčeb ve 161 dnech byl testován prostřednictvím interakce čas-léčba. Analýza reziduí naznačila, že měření v původním měřítku nebyla vhodná ani pro analýzu pomocí ANOVA ani pro žádné transformace, které byly testovány. Proto tedy byly pro analýzy vybrány řady. Účinek léčby na tloušťku epitelu byl určen pomocí jednoduchého třídění ANOVA zahrnující také strata při randomizaci. A posteriori párová porovnání byla provedena pomocí statistiky průměrů nejmenších čtverců. Celková chyba

1. typu (a) byla regulována na 5% s cílem určit významnost rozdílů. Všechny výpočty byly provedeny pomocí ProcMIXED na softwaru SAS Software (SAS Institute, Carry, NC).

Výsledky

Antagonistické účinky na růst nádoru ZR-75-1

Samotný estron (OVX + Ei) způsobil 707% zvýšení velikosti nádoru ZR-75-1 v průběhu 23 týdenní léčebné periody (obr. 19A). Podávání čistého antiestrogenu EM-652.HC1 v denní orální dávce 50 pg myším stimulovaným estronem růstu nádoru zcela zabránilo. Nedocházelo pouze k zabránění růstu nádoru, ale po 23 týdnech léčby byla velikost nádoru o 26 % nižší v porovnání s původní hodnotou na počátku léčby (p<0,04). Hodnota získaná po léčbě EM-652.HC1 nebyla statisticky odlišná od hodnoty získané po samotné ovariektomii (OVX), kdy

0 0 4 · · 0 · ···· 0 0 0 0 · * 4

0 0000 00 0 040 000 0

000 00 0 000 se velikost nádoru zmenšila o 61 % pod původní velikost nádoru. Při stejné dávce (50 pg) a stejné léčebné periodě, 6 dalších antiestrogenu původní průměrnou velikost nádoru nesnižovalo. Nádory v těchto skupinách byly všechny významně vyšší než u OVX kontrolní skupiny a skupiny léčené EM-652.HC1 (p<0,01). Ve srovnání s hodnotami před léčbou vedla 23 týdenní léčba droloxifenem, toremifenem, GW 5638, raloxifenem, tamoxifenem a idoxifenem k průměrným velikostem nádoru 478 %, 230 %, 227 %, 191 %, 87 % a 86 % hodnot před léčbou (obr. 19A).

Agonistické účinky na růst nádoru ZR-75-1

Po 161 dnech léčby denní dávkou 200 pg tamoxifenu a v nepřítomnosti substituce estronem, se průměrná velikost nádoru zvětšila na 196 % nad výchozí hodnotu (baseline) (p<0,01 versus OVX). Na druhé straně průměrná velikost nádoru myší léčených Idoxifenem se zvýšila (125 %) (p<0,01), ale velikost nádoru u myší léčených toremifenem se zvýšila o 86 % (p<0,01) (obr. 19 B). Přídavek 200 pg EM-652.HCI ke 200 pg tamoxifenu zcela inhiboval proliferaci, která byla pozorována u samotného tamoxifenu (obr. 19C). Na druhé straně léčba samotnými EM-652.HC1 (p=0,44), raloxifenem (p=0,11), droloxifenem (p=0,36) nebo GW 5638 (p=0,17) velikost nádoru ZR-75-1 v porovnání s OVX kontrolní skupinou na konci experimentu významně neměnila (obr. 19B).

Vliv na jednotlivé kategorie odezvy

Vliv 50 pg antiestrogenu na stimulaci estronem

Kromě vlivu na velikost nádoru je důležitým parametrem účinnosti léčby kategorizace odezvy, pro každý jednotlivý nádor na konci experimentu. U myší po ovariektomii bylo dosahováno úplné, částečné a stabilní odezvy u 21 %, 43 % a 38 % nádorů a žádný nádor se nezvětšil. Na druhé straně u OVX zvířat substituovaných estronem se 100 % nádorů zvětšilo (obr. 20A). U skupiny OVX zvířat substituovaných estronem a léčených EM-652.HC1 byly pozorovány úplná, částečná a stabilní odezva u 17 %, 17 % a 60 % nádorů a pouze 7 % (2 nádory z 30) se zvětšilo. Za stejných podmínek stimulace estronem nedocházelo v průběhu léčby denní dávkou jakéhokoliv dalšího antiestrogenu 50 pg ke snížení procenta zvětšujících se nádorů pod 60 %. 65 % nádorů (17 z 26) se zvětšilo u skupiny léčené tamoxifenem, zatímco 89 % (25 z 28) se zvětšilo u toremifenu, 81 % (21 z 26) se zvětšilo u raloxifenu, 100 % (23 z 23) se zvětšilo ··· * · · · · · · · ··· · · · · · « · • · · · ···· ·· • · ···· · · · ··· · · · » • · · ·· · · 0 · • · · · · · 0 0···· u droloxifenu, 71 % (20 z 28) se zvětšilo u idoxifenu a 77 % (20 z 26) se zvětšilo u GW 5638 (obr. 20A).

Vliv 200 pg antiestrogenu v nepřítomnosti stimulace estronem na jednotlivé kategorie odezvy

Jak je uvedeno na obr. 20B, v nepřítomnosti stimulace estronem vedly tamoxifen, idoxifen a toremifen k vyšším podílům zvětšujících se nádorů, než tomu bylo u jiných antiestrogenů. 62 % (16 z 26), 33 % (8 z 24) a 21 % (6 z 28) nádorů bylo po léčbě denní dávkou 200 pg tamoxifenu, idoxifenu a toremifenu v kategorii progrese. Jak je patrné z obr. 20C, přídavek 200 pg EM-652.HC1 k tamoxifenu snížil procento zvětšujících se nádorů u samotného tamoxifenu z 62 % (16 z 26) na 7 % (2 z 28).

Vliv antiestrogenů na tloušťku epitelových buněk dělohy

Výška epitelových buněk endometria byla měřena jako nejpřímější parametr agonistického a antagonistického účinku každé sloučeniny.

Je uveden účinek denní dávky 50 pg antiestrogenu v přítomnosti stimulace estronem na tloušťku epitelových buněk dělohy.

Při denní orální dávce EM-652.HC1 50 pg inhibovala sloučenina stimulační účinek estronu na výšku epitelu o 70 %. Účinnost šesti dalších testovaných antiestrogenů byla podstatně nižší (p<0,01). Droloxifen, GW 5638, raloxifen, tamoxifen, toremifen a idoxifen inhibovaly stimulaci estronem o 17 %, 24 %, 26 %, 32 %, 41 % a 50 % (tab. 10).

Je uveden také účinek denní dávky 200 pg antiestrogenu v nepřítomnosti stimulace estronem na tloušťku epitelových buněk dělohy.

V nepřítomnosti stimulace estronem z testovaných sloučenin pouze EM-652.HC1 a droloxifen podstatně nezvyšovaly výšku epitelových buněk (114 % a 101 % hodnot OVX kontrolní skupiny). Tamoxifen (155 %), toremifen (135 %) a idoxifen (176 %) vykazovaly významnou stimulaci výšky epitelu dělohy (p<0,01 versus OVX kontrolní skupina). Raloxifen (122 %) a GW 5638 (121 %) rovněž vykazovaly statisticky významnou stimulaci výšky epitelu dělohy (p<0,05 versus OVX kontrolní skupina (tab. 10)). Agonistické a antagonistické účinky každého měřeného antiestrogenu na hmotnost dělohy a vagíny byly v souladu s tím, co bylo pozorováno v případě tloušťky epitelu dělohy (data nejsou uvedena).

·· ·· ·· ·· • · · · · · *

Tabulka 10

			TLOUŠŤKA
			EPITELU ENDOMETRIA
SKUPINA	n	Qan)	± SEM
OVX	CONTROL	14	1831	± 0.04
OVX+B,	CONTROL	8	40.58 ^M	± 0.63
OVX+E,	+ ΕΜ-652«Πα	14	25.06 ^k	± 0.07
OVX + B,	+ TAMOXIFEN	10	33.44	± 0.04
OVX+E,	+ TOREMIFEN	13	31.47 ^M	± 0.04
OVX+E,	+ RALOX3FEN	12	34.72^1,4	± 0.06
OVX+E,	+ droíjOXifen	12	36.71 ^Μ	± 0.12
OVX+E,	+ EDOXIFEN	12	2935 M	± 0.05
OVX+E,	+ GW 5638	12	3530	± 0.07
OVX	+ EM-652-IICI	12	20.79	± 0.10
ovx	+ TAMOXIFEN	11	28.47	± 0.05
OVX	+ EM-652»HCJ + TAMOXIFEN	Ϊ3	27.95 ^⁴	± 0.06
OVX	+ TOREMIFEN!	13	24.75 ^Kc	± 0.04
ovx	+ RALOXIFEN1	12	2233*	± 0.05
ovx	+ DROLOXIFEN	13	1830	± 0.07
ovx	+ EDOXIFEN'	11	32.14 ^⁴	± 0.05
ovx	+ GW5638	13	r> 22 »	± 0.05

experimentální versus OVX kontrolní myši ^c,d experimentální versus myši léčené EM-652 ^ap<0,05; ^bP<0,01.

HCl: °Ρ<0,05; ^dP<Q,01.

4 4 • 4

44 44 44 • ·4 4 4 · · 4 • 4 4 · 4 4 4 4 44 4

4 ···· *4 4 444 4 · 4 4 ·4φ 44 4 ··· • 4 4 44 44 444444

Příklad 9 Radioaktivita v mozku samic potkana po jedné orální dávce ^I4C-EM-800 (20 mg/kg)

Příklad 9 ukazuje radioaktivitu v mozku potkanů zjištěnou po jedné orální dávce ¹⁴C-EM-800 (20 mg/kg). Pro účely porovnání byly zahrnuty hodnoty pro krev, plasmu, játra a dělohu každého zvířete. Tyto výsledky jsou ze studie LREM č. 1129 Tissue Distribution and Excretion of Radiaktivity Following a Single Oral Dose ¹⁴C-EM-800 (20 mg/2 ml/kg) to Male and Female Long-Evans Rats. Tato čísla naznačují, že množství celkové radioaktivity v mozku samic potkana Long-Evans dodané prostřednictvím léku byla velmi nízká (ng ekviv/g tkáně) a nebyla detekována již 12 h po dávce. Po 2 h byla radioaktivita v mozku 412x nižší než v játrech, 21 krát nižší než v děloze, 8,4 x nižší než v krvi a 13 x nižší než v plasmě. Vzhledem k tomu, že neznámý podíl celkové radioaktivity v mozku je důsledkem kontaminace radioaktivitou z krve, jsou hodnoty pro mozek uvedené v tab. 1 přeceněné hladiny radioaktivity ¹⁴C (EM-800) vztahující se k samotné mozkové tkáni. Tato data předpokládají, že hladina antiestrogenu v mozku je natolik nízká, pokud vůbec existuje, aby působila proti účinku exogenního estrogenů. Je důležité upozornit na to, že určité radioaktivity, detekované v mozkové tkáni, mohou být důsledkem zbytkové krve v tkáni. Kromě toho radiochemická čistota ¹⁴C-EM-800 použitá pro tuto studii byla minimálně 96,25%.

• ·

Tabulka 11

Průměrná koncentrace radioaktivity pocházející z léku (ng ekv. EM-800/g tkáně) I u vybraných tkání samice potkana Long-Evans po jedné orální dávce ¹⁴C-EM-800 (20 mg/kg)

' Čas (h).	Mozek	'Krev	Plasma
průměr ^b (%CV)	průměr ^b(%CV)	průměr (%CV)
2	17.6 (29)	1487 (22)	224.6 (20)
4	17.1 (29)	663 (45)	1033 (39)
6	15.6 (8)	483 (29)	74.1 (31)
8 -	16.8 (31)	41.1 (12)	64.1 (14)
12	10.0^c (87)	28.7 (54)	407 (55)
24	0 (NC)	47^d (173)	10.1 (86)
36	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
48	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
72	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
96	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)
168	0 (NC)	0 (NC)	0 (NC)

a:

Hodnoty z tabulek pro LREM 1129 (EM-800; Distribuce v tkáních a exkrece radioaktivity po jedné orální dávce ¹⁴C-EM-800 (20 mg/2ml/kg) samcům a samicím potkana Long-Evans b: Limit kvantifikace (LOQ) 1,2 ng ekvivalentu EM-800 c: Jeden vzorek pod LOQ; 0 použitá při výpočtu průměru d: Dva vzorky pod LOQ, 0 použitá při výpočtu průměru %CV: Koeficient rozptylu vyjádřený jako procento, kde n=3 NC: Nespočteno

Tabulka 12

·· ·♦··

* 0 ·· * 0· ·· ·♦ «·« · · 0 0 · ···« 0 0 0 0 0« * • · 0000 · · · 0*0 · 0 0 · • •0 · · 0 000 «« · 00 00 00 0000

Příklad 10 Kombinace antiestrogenu EM-652.HC1 s estradiolem zabraňuje stimulaci dělohy

Materiál a metody

Zvířata a léčba

Byly použity deset až dvanáct týdnů staré samice potkana Sprague-Dawley (CrkCD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St -Constant, Kanada) vážící v době, kdy byla provedena ovariektomie, 215 až 265 g. Zvířata byla umístěna jednotlivě do prostředí s regulovanými podmínkami (teplota: 22 ± 3 °C; vlhkost: 50 ± 20 %, cyklus 12 h světlo, 12 h tma, světlo v 7:15 h.) Zvířatům byl umožněn volný přístup k vodě a certifíkované potravě pro hlodavce (Lab Diet 5002 (granulovaná), Ralston Purina, St-Louis, MO). Experiment byl prováděn ve veterinárním zařízení povoleném Canadian Council on Animal Care (CCAC) a Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) v souladu s CCAC směrnicemi pro ošetřování a použití experimentálních zvířat.

137 potkanů bylo náhodně rozděleno do 10 skupin po 13 až 14 zvířatech: i) zdravá kontrola; 2) kontrolní skupina po ovariektomii OVX; 3) OVX + 17P-estradiol (E₂; 2 mg/kg); skupiny 4) až 10) OVX + E₂ + EM-652.HC1 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 nebo 10 mg/kg). První den studie byla zvířata příslušné skupiny podrobena oboustranné ovariektomii (OVX) v anestézii isofluranem. Testované sloučeniny byly aplikovány jednou denně 1 až 14 den studie orální cestou prostřednictvím žaludeční sondy ve formě suspenze v 0,4% methylcelulose (0,5 ml/potkana). Zvířata ze skupin 1 a 2 dostávala stejně dlouho pouze samotné vehikulum. V den 15 byla 4 zvířata z každé skupiny promyta 10% pufrovaným roztokem formalínu a tkáně byly zpracovány pro histologické vyšetření. Ostatní zvířata byla v isofluranové anestézii usmrcena vykrvením z břišní aorty. Děloha a vagína byly odstraněny, byly zbaveny zbývajícího tuku a byly zváženy. Kousek každé dělohy byl fixován v 10% formalínu, aby byl dále použít pro určení výšky epitelových buněk endometria za pomoci programu (Software Image-Pro Plus).

Hladiny cholesterolu v séru

Celkový cholesterol byl měřen ve vzorcích séra získaných od zvířat, která byla přes noc nepřijímala potravu. K měření byl použit analyzátor Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems).

tttt tttt • * · · • ♦ · tt · tt · · • tttttt • tttttttt· • tttt ··· tt · • tttt • tt · tttt ·

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako střední hodnota ± SEM. Statistická významnost byla stanovena podle vícečetného testu podle Duncan-Kramera (Kramer, Biometrics, 12; 307 až 310, 1956).

Výsledky

65% snížení hmotnosti dělohy, které bylo pozorováno 2 týdny po ovariektomii, bylo po denním podávání 17P-estradiolu (E₂) orální cestou v dávce 2 mg/kg (490 ± 26 mg versus 480 ± 17 mg; N.S.) zcela navráceno zpět (obr. 21). Jak je uvedeno na stejném obrázku, se zvyšujícími se dávkami EM-652.HC1 byla pozorována progresivní inhibice stimulačního účinku E₂ na hmotnost dělohy. 84% a 87% navrácení účinku E₂ bylo pozorováno při dávkách antiestrogenu 3 mg/kg a 10 mg/kg. Srovnatelné výsledky byly získány v případě výšky epitelu endometria (obr. 22). Výška epitelu endometria stimulovaná E₂ byla z 83 % a 93 % chráněna dávkami antiestrogenu 3 mg/kg a 10 mg/kg. Výška epitelu endometria byla ve srovnání se zdravými kontrolními zvířaty (31,1 ± 0,7 mm) ve skupině OVX zvířat léčených E₂ (41,9 ± 1,2 pm) vyšší (37,7%, p< 0,01) (obr. 23).

Substituce E₂ OVX zvířat vedla k podobným hmotnostem vagíny jako měla zdravá zvířata (149,9 ± 9,0 mg versus 145 ± 5,3 mg, N.S.). Z obr. 24 je patrné, že inhibice hmotnosti vagíny byla pozorována při vyšších dávkách EM-652.HC1 než bylo pozorováno v případě hmotností dělohy. Do dávky 1 mg/kg sloučeniny nebyl zjištěn žádný významný inhibiční účinek antiestrogenu na hmotnost vagíny. Dávka 3 mg/kg EM-652.HC1 však způsobila statisticky nevýznamnou 50% inhibici stimulačního účinku E₂, u dávky 10 mg/kg antiestrogenu bylo pozorováno úplné navrácení účinku E₂ na hmotnost vagíny.

Po 2 týdnech po OVX bylo pozorováno 37% (p< 0,01) zvýšení cholesterolu v séru. Léčba OVX zvířat sloučeninou E₂ však způsobila 53% (p< 0,01) inhibici hladin cholesterolu v séru (obr. 25). Přídavek EM-652.HC1 v denních dávkách 0,01 mg/kg až 0,3 mg/kg neměl žádný statisticky významný vliv na inhibiční účinek E₂. Na druhé straně dávky EM-652.HC1 1,0, 3,0 a 10 mg/kg snížily účinek E₂ o 36 %, 30 % a 50 %.

Předložená data jasně ukazují, že antiestrogen EM-652.HC1 neutralizuje stimulační účinek E₂ na hmotnost dělohy a výšku epitelu endometria, což jsou dva dobře rozeznatelné parametry činnosti estrogenu v periferních tkáních. Tato data jasně ukazují, že současné podávání EM-652.HC1 u žen po menopauze, které dostávají estradiol za účelem snížení vasomotorických symptomů, bude zabraňovat stimulačnímu účinku estrogenů na endometrium.

♦ · · · • fcfcfcfc · ·

36%, 30% a 50% vrácení inhibičního účinku dávek 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg a 10 mg/kg

EM-652.HC1 je možno pravděpodobně vysvětlit převládajícím účinkem antiestrogenu, který, pokud by byl použit samostatně, by pravděpodobně vedl ke stejnému stupni inhibice.

EM-652.HC1 má afinitu pro ER dělohy potkana přibližně 5 krát vyšší než samotný E₂ (Martel a kol.., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 64: 199 až 205, 1998).

·· fc* fc· >· ·· • · · · fcfc fc • fcfc ·· · ······ · * • fcfcfcfc • fc fcfc fcfc fcfcfcfc

Příklady farmaceutických prostředků a souprav

Níže jsou cestou příkladů, které však nejsou v žádném směru limitující, uvedeny některé farmaceutické prostředky a soupravy využívající aktivní ŠERM EM-800 nebo EM-652.HC1 (EM-1538) a výhodnější aktivní estrogen 173-estradiol, ethinylestradiol nebo konjugované estrogeny. Ostatní sloučeniny podle vynálezu nebo jejich kombinace mohou být použity místo (nebo kromě) EM-800 nebo EM-652.HC1 nebo 173-estradiolu nebo ethinylestradiolu. Koncentrace aktivní složky se může poměrně značně lišit, což je zde také diskutováno. Množství a typy dalších přísad, které mohou být použity, jsou v dané oblasti dobře známé.

Příklad A Farmaceutický prostředek určený k orální aplikaci (kapsle)

přísada	hmotnost (%) (na hmotnost celkového prostředku)
EM-652.HC1	5,0
Ethinylestradiol	0,02
laktosa vodná	79,98
škrob	4,8
mikrokrystalická celulosa	9,8
stearát hořečnatý	0,4

nebo »

přísada	hmotnost (%) (na hmotnost celkového prostředku)
EM-652.HC1	5,0
konjugované estrogeny	0,2
laktosa vodná	79,8
škrob	4,8
mikrokrystalická celulosa	9,8
stearát hořečnatý	0,4

Příklad B Souprava

ŠERM a estrogen jsou podávány orálně

Nesteroidní antiestrogenový prostředek určený k orálnímu podávání (kapsle)

přísada	hmotnost (%) (na hmotnost celkového prostředku)
EM-652.HC1	5,0
laktosa vodná	80,0
škrob	4,8
mikrokrystalická celulosa	9,8
stearát horečnatý	0,4

44 ·· ··

4 · 4 4 4 4

4« 4 4 4 4

44444 4 4

4 4 4 4

44 44 4444

Estrogenový prostředek určený k orální aplikaci (želatinové kapsle)

přísada	hmotnost (%) (na hmotnost celkového prostředku)
ethinylestradiol	0,02
laktosa vodná	84,98
škrob	4,8
mikrokrystalická celulosa	9,8
stearát hořečnatý	0,4

Ve výše uvedených prostředcích je možno ostatními SERMy nahradit sloučeniny EM-800 nebo EM-652.HC1. Dalšími estrogeny mohou bý rovněž nahrazeny 170-estradiol, ethinylestradiol nebo konjugované estrogeny. Může být začleněn více než jeden ŠERM nebo více než jeden estrogen. V tomto případě je kombinované hmotnostní procento výhodnější než je hmotnostní procento jednotlivého estrogenů nebo jednotlivého SERMu podávaného ve výše uvedených příkladech.

Tento vynález byl popsán ve smyslu výhodnějších provedení a příkladů, ale není jimi nijak limitován. Odborníci v dané oblasti techniky jistě snadno rozpoznají širší možnosti aplikace a rozsah vynálezu, který je limitován pouze patentovými nároky, které jsou zde uvedeny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití estrogenů nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem, přičemž modulátor je sloučenina odlišná od estrogenů a není derivátem benzothiofenu, pro výrobu léčiva pro snížení nebo eliminaci výskytu symptomů menopauzy.
2. Použití estrogenů nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení nebo snížení rizika vzniku stavu vybraného ze skupiny, která zahrnuje osteoporózu, hyperchoiestrolemii, hyperlipidemii, aterosklerózu, hypertenzi, Alzheimerovu chorobu, insulinovou resistenci, diabetes, úbytek svalové hmoty, obezitu, vaginální krvácení indukované hormonální substituční terapií a bolestivost prsů indukovanou hormonální substituční terapií.
3. Použití estrogenů nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho proléku, kde modulátor je sloučenina odlišná od estrogenů a je to sloučenina odlišná od derivátu benzothiofenu, derivátu naftalenu, derivátu isochinolinu nebo enantiomerní směsi derivátů 3-fenylchinolinu, derivátů 3fenylthiochromanu, derivátů 3-fenylchromanu, která má více než 10 % enantiomeru 2R konfigurace, pro výrobu léčiva pro léčení nebo snížení rizika vzniku osteoporózy.
4. Farmaceutický prostředek vyznačující se t í m, že obsahuje:

a) farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, ředidlo nebo nosič;

b) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenů nebo jeho proléku; a

c) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptoru nebo jeho proléku, přičemž modulátor je sloučenina odlišná od estrogenů a modulátor není derivát benzothiofenu, derivát naftalenu, derivát isochinolinu nebo enantiomerní směs derivátů 3-fenylchinolinu, derivátů 3-fenylthiochromanu, derivátů 3-fenyl-chromanu, která má více než 10 % enantiomeru 2R konfigurace.
5. Souprava vyznačující se tím, že první nádoba obsahuje farmaceutickou formulaci obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenů nebo jeho proléku, a souprava dále obsahuje druhou nádobu, která obsahuje farmaceutickou formulaci obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního • 4 9 · modulátoru estrogenového receptoru nebo jeho proléku, přičemž modulátor není derivátem benzothiofenu.

• ·
6. Farmaceutický prostředek vyznačující setím, že obsahuje:

a) farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, ředidlo nebo nosič;

b) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenu nebo jeho proléku;

c) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptoru nebo jeho proléku, přičemž modulátor je sloučenina odlišná od estrogenu; a

d) terapeuticky účinné množství alespoň jednoho doplňkového činidla vybraného ze skupiny, kterou tvoří bifosfonát, adrogenní činidlo, testosteron, dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfát, androst-5-en-3p, 17β-όίοΙ, 4-androsten-3,17-dion a prolék kteréhokoliv uvedeného doplňkového činidla
7. Použití estrogenu nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem podle nároku 2 a dále bifosfonátu pro výrobu léčiva pro léčení nebo snížení rizika vzniku stavu vybraného ze skupiny, která zahrnuje osteoporózu, hypercholestrolemii, hyperlipidemii, aterosklerózu, hypertenzi, Alzheimerovu chorobu, insulinovou resistenci, diabetes, úbytek svalové hmoty, obezitu, vaginální krvácení indukované hormonální substituční terapií; a bolestivost prsů indukovanou hormonální substituční terapií.
8. Použití estrogenu nebo jeho proléku spolu se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem, přičemž modulátor je sloučenina odlišná od estrogenu, a dále alespoň jedno doplňkové činidlo vybraného ze skupiny, zahrnující dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfát, androgenní činidlo, testosteron, androst-5-en-3p, 17β-όΐοΙ, 4-androsten-3,17-dion a prolék kteréhokoliv uvedeného doplňkového činidla, pro výrobu léčiva ke snížení nebo eliminaci výskytu symptomů menopauzy.
9. Použití estrogenu nebo jeho proléku spolu se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem, přičemž modulátor je sloučenina odlišná od estrogenu, a dále alespoň jednoho doplňkového činidla vybraného ze skupiny, skládající se z dehydroepiandrosteronu, dehydroepiandrosteronsulfátu, androst-5-en-3p-u, 17p-diolu, androgenního činidla, testosteronu, 4-androsten-3,17-dionu a proléku kteréhokoliv uvedeného doplňkového činidla, pro výrobu léčiva k léčbě nebo snížení rizika výskytu stavu vybraného ze skupiny, která zahrnuje osteoporózu, hypercholestrolemii, • · · · ·· fe···

76 .......

hyperlipidemii, aterosklerózu, hypertenzi, Alzheimerovu chorobu, insulinovou resistenci, diabetes, úbytek svalové hmoty, obezitu, vaginální krvácení indukované hormonální substituční terapií a bolestivost prsů indukovanou hormonální substituční terapií.
10. Souprava vyznačující se tím, že první nádoba obsahuje farmaceutickou formulaci obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho estrogenu nebo jeho proléku; souprava dále obsahuje druhou nádobu, která obsahuje farmaceutickou formulaci obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho selektivního modulátoru estrogenového receptoru nebo jeho proléku a dále obsahuje alespoň jednu další nádobu soupravy, která obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho doplňkového činidla, vybraného ze skupiny, kterou tvoří dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteronsulfát, androst-5-en-33,173-diol, androgenní činidlo, testosteron, 4-androsten-3,17-dion a prolék kteréhokoliv uvedeného doplňkového činidla.
11. Souprava podle nároku 5 nebo 10 použitelná pro léčbu nebo snížení rizika výskytu osteoporózy, vyznačující se t í m, že obsahuje alespoň jednu další nádobu, která obsahuje farmaceutickou formulaci obsahující terapeuticky účinné množství alespoň jednoho bifosfonátu.
12. Použití estrogenu nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem podle nároku 1 a dále androgenního činidla pro výrobu léčiva pro snížení nebo eliminaci výskytu symptomů menopauzy.
13. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle jakéhokoliv z předcházejících nároků 1 až 12, v y z n a č u j í c í se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru má vzorec s následujícími znaky:

a) dva aromatické kruhy spojené 1 až 2 atomy uhlíku, přičemž oba aromatické kruhy jsou buď nesubstituované nebo substituované hydroxylovou skupinou nebo skupinou přeměňovanou in vivo na hydroxyl;

b) postranní řetězec s aromatickým kruhem a funkcí terciárního aminu nebo jeho soli;

a kde modulátor není derivátem benzothiofenu, derivátem naftalenu, derivátem isochinolinu nebo enantiomerní směsi derivátů 3-fenylchinolinu, derivátů 3-fenylthiochromanu, derivátů 3-fenylchromanu, která má více než 10 % enantiomerů 2R konfigurace.
14. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 13, vyznačující se t í m, že postranní řetězec je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

···· ·· • ·
15. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 13, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je vybrán ze skupiny, kterou tvoří derivát trifenylethylenu, derivát indolu, derivát benzpyranu, HMR 3339, HMR 3656, LY 335 124, LY 326315, SH 646, ERA 923 a derivát centchromanu.
16. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, způsob podle nároku 8 a 9 nebo souprava podle nároku 10, vyznačující se tím, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je derivát benzothiofenu obecného vzorce lil:

kde Ri a R₂jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří: vodík, hydroxyl a skupina přeměněná in vivo na hydroxylovou;

kde R₃ a R₄ jsou buď a) nezávisle C₁ až C₄ alkyl nebo b) skupina, která v kombinaci s dusíkem, na který se váže, je vybrána ze skupiny, kterou tvoří pyrrolidinová, dimethyl-1-pyrrolidinová, methyl-1 -pyrrolidinylová, piperidinová, hexamethyleniminová a morfolinová skupina;

kde A je vybráno ze skupiny, kterou tvoří -CO-, -CHOH, a CH₂-;

kde B je vybráno ze skupiny, kterou tvoří fenylen, pyridyliden a cykloC₄H₂N₂-.

• 4

4 4
17. Použití,, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 16, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je vybrán ze skupiny, kterou tvoří raloxifen, LY 353381 a LY 335563.
18. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 13, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je trifenylethylen nebo difenylhydronaftalenový derivát obecného vzorce IV:

kde D je -OCH₂CH₂N(R₃)R4, -OCH₂CH₂OH nebo -CH=CH-COOH (R₃ a R₄ jsou buď nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří CL až C₄ alkyl, nebo R₃, R₄ a atom dusíku, na který jsou vázány, spolu tvoří kruhovou strukturu vybranou ze skupiny, kterou tvoří pyrrolidinová, dimethyl-1-pyrrolidinová, methyl-1-pyrrolidinylová, piperidinová, hexamethyleniminová a morfolinová skupina;

kde E a K jsou nezávisle vodík nebo hydroxyl, ester fosfátu nebo nižší alkyl, kde J je hydrogen nebo halogen.
19. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle jakéhokoliv z předchozích nároků 1 až 14, v y z n a č u j í c í se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je OH-, tamoxifen, droloxifen, toremifen, iodoxifen, lasofoxifen, iproxifen, FC 1271 a GW 5638.
20. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 13, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je derivát indolu obecného vzorce V:

«0 0000

90 0000

D kde D je vybráno ze skupiny, kterou tvoří -OCH₂CH₂N(R7)R₈, -CH=CH-CON(R₇)R₈, -CC-(CH₂)_n-N(R₇)R₈ (R₇ a R₈ jsou buď nezávisle vybrány ze skupin, kterou tvoří C₁ až C₆alkyl nebo R₇, R₈ a atom dusíku, na který se váží a spolu tvoří kruhovou strukturu vybranou ze skupiny, kterou tvoří pyrrolidinová, dimethyl-1-pyrrolidinová, methyl-1pyrrolidinylová, piperidinová, hexamethyleniminová, morfolinová skupina);

kde X je vybráno ze skupiny, kterou tvoří: vodík, a (X až C₆ alkyl;

kde R_n R₂, R₃, R₄, R₅ a R₆ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří: vodík, hydroxyl, Cí až C₆ alkyl a skupina přeměněná in vivo na hydroxyl.
21. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 20, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je TSE 424 (2-(4-hydroxyfenyl)-3-methyl-1 -[[4-[2-(1 -piperidinyl)ethoxy]fenyl]methyl]-1 H-indol-5-ol).
22. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 13, vyznačující se t i m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je derivát centchromanu kde R! a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří: vodík, hydroxyl a skupina přeměněná in vivo na hydroxyl;

kde R₅ a R₆ jsou nezávisle vodík nebo Cí až C₆ alkyl;

44 4444

44 4444 •444 44

4 4 kde D je -OCH₂CH₂N(R3)R₄ (R₃ a R₄ jsou buď nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří

C! až C₄ alkyl nebo R_3> R₄ a atom dusíku, na který jsou vázány, spolu tvoří kruhovou strukturu vybranou ze skupiny, kterou tvoří pyrrolidinová, dimethyl-1-pyrrolidinová, methyl-1-pyrrolidinylová, piperidinové, hexamethyleniminová, morfolinová skupina).
23. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 22, vyznačující se t í m, že centchromanovým derivátem je (3,4-trans-2,2-dimethyl-3-fenyl-4-[4-(2-(2-pyrrolidin-1-yl)ethoxy)fenyl]-7methoxychroman).
24. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 13, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je sloučenina obecného vzorce VII:

(VII) kde Ri a R₂ jsou nezávisle vodík, hydroxyl nebo skupina, která je přeměněná in vivo na hydroxyl:

kde Z buď není přítomno vůbec nebo je vybráno ze skupiny, kterou tvoří -CH₂-, -O-, -S- a -NR₃- (R₃ je vodík nebo nižší alkyl);

kde R100 je bivalentní skupina, která oddaluje L od B-kruhu prostřednictvím 4 až 10 atomů;

kde L je bivalentní nebo trivalentní skupina, vybraná ze skupiny -SO-, -CON-, -N< a -SON<;

kde Gi je vybráno ze skupiny, kterou tvoří vodík, Cí až C₅ uhlovodík, bivalentní skupina, která v kombinaci s G₂ a L tvoří 5 až 7 členný heterocyklický kruh a halogen nebo nenasycené deriváty předešlých sloučenin;

kde G₂ buď není přítomno vůbec nebo je vybráno ze skupiny, kterou tvoří vodík, Cí až C₅ uhlovodík, bivalentní skupina, která v kombinaci s G, a L tvoří 5 až 7 členný heterocyklický kruh a halogen nebo nenasycené deriváty předešlých sloučenin; kde G₃ je vybráno ze skupiny, kterou tvoří vodík, methyl a ethyl.

,» 9999

9 99 9

9 9
25. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 24, vyznačující se t í m, že sloučenina je derivát benzpyranu obecného vzorce Vlil:

···· ·« • · ·

9 9 9

9 9 ♦

9 9 9

99 99 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde D je -OCH₂CH₂N(R₃)R₄ (R3 a R4 jsou buď nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří Ci až C₄ alkyl nebo R₃, R₄ a atom dusíku, na který jsou vázány, tvořící spolu kruhovou strukturu vybranou ze skupiny, kterou tvoří pyrrolidinová, dimethyl-1-pyrrolidinová, methyl-1-pyrrolidinylová, piperidinová, hexamethyleniminová, morfolinová skupina); kde Rt a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří: vodík, hydroxyl a skupina přeměňovaná in vivo na hydroxyl.
26. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 25, vyznačující se t í m, že derivát benzpyranu je, vzhledem k převaze svého stereoisomeru, který má absolutní konfiguraci S na 2. uhlíku, opticky aktivní, přičemž sloučenina má obecný vzorec IX:

kde Rt a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří: hydroxyl a skupina přeměnitelná in vivo na hydroxyl;

·· ·99 · «9 999* ··#· ·*

9 * * · • * * * • · Φ Φ * • 9 9 · ·

9« Φ* « 9

9 · • 9 9

9 Φ 9 • 9 kde R₃ je druh vybraný ze skupiny, kterou tvoří nasycený, nenasycený nebo substituovaný pyrrolidinyl, nasycený, nenasycený nebo substituovaný piperidinyl, nasycený, nenasycený nebo substituovaný morřolinyl, cyklická skupina obsahující dusík, polycyklická skupina obsahující dusík, a NRaRb (Ra a Rb jsou nezávisle vodík, nevětvený nebo větvený (ty až C₆ alkyl, nevětvený nebo větvený C₂ až C₆ alkenyl a nevětvený nebo větvený C₂ až C₆ alkynyl).
27. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku26, vy zn a čuj IcI se 11 m, že sloučenina nebo sůl podstatně postrádají 2R-enantiomer.
28. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 26, vyznačující se t í m, že selektivní modulátor estrogenového receptorů je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

EM-800

EM-1520

EM-1872

EM-1900

Ό

It 0000

0000

0 0 • 0 «000 00 • · 0

0 ♦ 0

0 0 « ♦ • 0 0 ·

99 9*

0 0

0 0 0 · • 0 t

EM-1518

EM-652.UC1 (EM-1538)

0 0

0 0 kde všechny uvedené molekulové struktury, jejichž stechiometrie je uvedena, jsou vzhledem k převaze stereoisomerů 2S konfigurace opticky aktivní.
29. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 26, vyznačující se t í m, že benzpyranovým derivátem je sůl kyseliny vybrané ze skupiny, kterou tvoří kyselina octová, kyselina adipová, kyselina benzensulfonová, kyselina benzoová, kyselina kafrsulfonová, kyselina citrónová, kyselina fumarová, kyselina jodovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina chlorovodíková, kyselina hydrochlorthiazidová, kyselina hydroxynaftoová, kyselina mléčná, kyselina maleinová, kyselina methansulfonová, kyselina methylsírová, kyselina 1,5-naftalendisulfonová, kyselina dusičná, kyselina palmitová, kyselina pivalová, kyselina fosforečná, kyselina propionová, kyselina jantarová, kyselina sírová, kyselina vinná, kyselina tereftalová, kyselina ptoluensulfonová a kyselina valerová.
30. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle nároku 29, vyznačující se t i m, že kyselinou je kyselina chlorovodíková.
31. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že selektivní modulátor estrogenového receptoru je :

EM-652.IIC1 (EM-1538) a je vzhledem k převaze stereoizomerů konfigurace 2S opticky aktivní a; kde estrogen je vybrán ze skupiny, kterou tvoří 17p-estradiol, estery 17p-estradiolu, 17 α-estradiol, estery 17a-estradiolu, estriol, estery estriolu, estron, estery estronu, konjugovaný estrogen, ekvilin, estery ekvilinu, 17a-ethynylestradiol, estery 17aethynylestradiolu, mestranol a estery mestranolu.
32. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 12, v y z n a č u j í c í se t í m, že estrogen je vybrán ze skupiny, kterou • · tvoří 17p-estradiol, estery 17p-estradiolu, estriol, estery estriolu, estron, estery estronu, konjugovaný estrogen, ekvilin, estery ekvilinu, 17a-ethynylestradiol, estery

17a-ethynylestradiolu, mestranol a estery mestranolu, chemestrogen, DES, fytestrogen, tibolon, 2'-ethylestrogenoxazol a ethyndiol.
33. Použití estrogenů nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem, podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1, 2, 3, 8 a 9 vyznačující se tím, že selektivní modulátor estrogenového receptoru nemá estrogenovou aktivitu u tkáně prsu nebo endometria.
34. Použití, farmaceutický prostředek nebo souprava podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že estrogen je směsnou sloučeninou estrogen/androgen.
35. Použití podle nároku 34, v y z n a č u j í c í se t í m, že směsnou estrogen/androgenovou sloučeninou je Tibolon.
36. Použití estrogenů nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem podle nároků 1 a 8, vyznačující se t í m, že symptomy menopauzy jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří návaly horka, vasomotorické symptomy, nepravidelná menstruace, vaginální suchost, bolesti hlavy a poruchy spánku.
37. Použití estrogenů nebo jeho proléku v kombinaci se selektivním modulátorem estrogenového receptoru nebo jeho prolékem podle nároku 1,vyznačující se t í m, že léčba snižuje riziko vzniku karcinomu prsu a endometria u pacientů.