KR20020073566A

KR20020073566A - 에스트로겐과 배합된 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자

Info

Publication number: KR20020073566A
Application number: KR1020027009728A
Authority: KR
Inventors: 라브리에페르난드
Original assignee: 앙도르쉐르슈 인코포레이티드
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2002-09-27
Also published as: NO20023484L; EP1251855A1; US20020198179A1; US20030040510A1; CA2395730A1; RU2342145C2; ZA200205926B; NZ534348A; AR035564A1; HUP0204211A2; US20030065008A1; CZ20022401A3; HUP0204211A3; BR0108107A; WO2001054699A1; SK9592002A3; IL149990A0; HK1048761A1; MXPA02007165A; AU2991301A

Abstract

선택적인 에스트로겐 수용체 조절자, 구체적으로 다음 일반식 (I)의 화합물과,

유효량의 에스트로겐 또는 에스트로겐성/안드로겐성 혼합 화합물을 투여하는 것으로 이루어지는, 인간을 포함하여 감염이 용이한 온-혈 동물에서, 고온 플래시와I폐경기 증상의 발생을 감소시키거나 배제시키는 신규한 방법, 한편 유방암 또는 자궁내막암의 획득 위험을 감소시키고 더욱이 골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 근육 질량의 손실, 비만, 불규칙한 월경, 알츠하이머병, 또는 질 건조를 치료 및/또는 그 발생을 억제한다. 추가로 상기-언급한 질병 중 몇몇을 의학적으로 치료 및/또는 그 발생을 억제하기 위해, 특히 비스포스포네이트 또는 성스테로이드 전구체가 투여된다. 또한, 활성 성분(들) 운반용 약리적 조성물 및 본 발명에 유용한 키트(들)를 기술한다.

Description

에스트로겐과 배합된 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자{SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR MODULATORS IN COMBINATION WITH ESTROGENS}

외생의 성 스테로이드 또는 그 전구체의 투여에 대해 유리하게 반응하는 수많은 질병, 건강상태 및 바람직하지 않은 징후들이 알려져 있다. 예를 들어, 에스트로겐은 뼈 손실률을 감소시키는 한편 안드로겐은 뼈의 형성을 촉진시켜 뼈 질량을 증강시키는 것으로 보인다. 호르몬 대체 치료 (예컨대, 에스트로겐의 투여)는 폐경기 증상의 치료에 이용된다. 프로게스틴은 종종 자궁내막의 증식과 에스트로겐에 의해 유발되는 자궁내막암을 억제하는데 이용된다. 에스트로겐, 안드로겐 화합물 및/또는 프로게스틴을, 치료 또는 예방을 목적으로 광범한 종류의 징후 및 질병에 이용하는 것은 수많은 결점을 갖는다. 여성을 안드로겐 화합물로 치료하는 것은 특정한 남성화 부작용을 야기시키는 바람직하지 않은 부작용을 가질 수 있다. 또한, 성 스테로이드를 환자에 투여함으로써 환자의 특정 질병 획득 위험성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 여성의 유방암은 에스트로겐 활성에 의해 악화된다. 전립선암과 양성의 전립선 과다형성은 모두 안드로겐 활성에 의해 악화된다.

보다 유효한 호르몬 치료 및 부작용과 위험의 감소가 요구되어왔다.

본 발명의 공동 치료와, 그 치료에 이용되는 약리적 조성물 및 키트가 이러한 요구를 처리할 것으로 여겨진다.

발명의 요약

본 발명은 고온 플래시, 혈관운동성 증후, 골다공증, 심장혈관 질병, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만(특히, 복부 비만), 불규칙한 월경 및 질 건조를 치료하거나 그 발생 또는 획득 위험을 감소시키는 것을 목적으로 한다.

또다른 목적은, 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서, 상기-지적한 질병을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

또다른 목적은 상기 방법에 사용하기 적절한 키트 및 약리적 조성물을 제공하는 것이다.

한 구체예에서, 본 발명은 폐경기 증상의 발병을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 제거 또는 감소가 필요한 환자에게 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에게 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지며, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 알츠하이머병, 인슐린 내성, 당뇨병, 근육의 질량감소, 비만, 호르몬 대체 치료에 의해 유발된 질 출혈, 및 호르몬 대체 치료에 의한 유방 압통으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 제거 또는 감소가 필요한 환자에게 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에게 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지며, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이다.

또다른 구체예에서, 본 발명은

a)약리적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체,

b)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐 또는 그 전구약물, 및

c)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 함유하는 약리적 조성물을 제공하고, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이다.

또다른 구체예에서 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐 또는 그 전구약물로 된 약리적 배합물을 함유하는 첫번째 용기로 이루어진 키트를 제공하고; 상기 키트는 추가로 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물로 된 약리적 배합물을 함유하는 두번째 용기를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 골다공증 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법에 관한 것이다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 심장혈관 질병의 획득 위험성의 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 고콜레스테롤혈증 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 고지혈증 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 죽상경화증 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 고혈압 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 불면증 악화의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 인식능의 손실 악화의 위험성 감소 또는 그 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 알츠하이머 질병 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 당뇨병 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 폐경기 증상의 악화 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 비만 (구체적으로 복부 비만) 획득의 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 호르몬 대체 치료에 의해 유발된 유방 압통의 악화 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 투여하고, 공동 치료의 일부로서, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 호르몬 대체 치료에 의해 유발된 질 건조의 악화 위험성 감소 또는 치료 방법을 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 치료 또는 상기 감소가 필요한 환자에서 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA), 디하이드로에피안드로스테론-술페이트(DHEA-S), 안드로스텐디온과 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올 (5-디올)로 구성된 군으로부터 선택되는 성 스테로이드 전구체의 수준을 증가시키고, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량과 공동 치료의 일부로서 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 골다골증을 치료하거나 그 발생을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 치료 또는 상기 감소가 필요한 환자에서 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA), 디하이드로에피안드로스테론-술페이트(DHEA-S)와 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올 (5-디올)로 구성된 군으로부터 선택되는 성 스테로이드 전구체의 수준을 증가시키고, 추가로 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)의 치료적 유효량과 공동 치료의 일부로서 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐을 상기 환자에 투여하는 것으로 이루어지는 고온 플래시와 발한을 치료하거나그 발생을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 촉진제/길항제 (혼합 SERM)를 투여하고 추가로, 공동 치료의 일부로서, 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 순수한 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(순수-SERM) 또는 에스트로겐을 투여하는 것으로 이루어지는, 이들 상기-언급한 질병의 획득 위험을 감소시키거나 치료하는 방법을 제공한다. 여기서 이용한 "혼합 SERM"은 유방과 자궁내막 조직에서 생리적 또는 약물적 농도로 상당한 에스트로겐 활성을 갖는 SERM을 의미한다. 여기서 "순수-SERM"은 유방과 자궁내막 조직에서 생리적 또는 약물적 농도로 어떠한 에스트로겐 활성도 갖지 않는 SERM을 의미한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 한가지 이상의 에스트로겐의 치료적 유효량을 함유하는 첫번째 용기를 포함하고, 추가로 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자의 치료적 유효량을 함유하는 두번째 용기를 포함하는 키트를 제공한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 a)약리적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체, b)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐, 및 c)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자를 포함하는 약리적 조성물을 제공한다.

여기서 이용한 대로, 그밖의 화합물과 "공동으로" 환자에 투여되는 화합물은 상기 다른 화합물의 투여와 충분히 근접하게 투여되고, 따라서 비록 화합물들을 아주 근접하게 투여하지 않아도 환자는 양자 화합물 모두의 생리적 효과를 동시에 얻는다. 공동 치료의 일부로서 화합물 투여시, 그들은 서로와 공동으로 투여된다.

에스트로겐 대체 치료는 폐경으로 인한 질병, 즉 골다공증, 고온 플래시, 관동맥 심질환(Cummings 1991)을 억제하고 치료하기 위해 폐경후 여성에 일반적으로 이용되나, 상습적인 에스트로겐 투여와 관련된 상당히 바람직하지 않은 효과가 존재한다. 특히, 에스트로겐에 의해 야기되는 자궁임 및/또는 유방암의 증가 위험은 (Judd, Meldrum 외, 1983; Colditz, Hankinson 외, 1005) 이 치료의 주요한 단점으로 지적된다. 본 발명자들은 에스트로겐 투여에 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)를 추가함으로써 이러한 바람직하지 않은 효과를 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명은, SERM이 호르몬 대체 치료(HRT)에 의해 야기되는 촉진 대신 유방 상피의 퇴화를 촉진하고 그에 따라 유방 압통을 감소 또는 제거하므로, HRT에 의해 유발되는 유방 압통의 획득 위험을 감소시키거나 또는 그 치료 방법을 제공한다.

본 발명은, 또한, 호르몬 대체 치료(HRT)에 의해 유발되는 질 건조를 억제하고 치료하는 방법을 제공한다. SERM이 자궁내막의 퇴화를 야기하므로 질 건조는 발생하지 않을 것이다.

반면, SERM 단독으로는 고온 플래시 및 발한과 같은 다수의 폐경기 증상에 이로운 효과를 거의 또는 전혀 줄 수 없다. 출원인은 폐경기 증상의 SERM 치료에 에스트로겐을 첨가시켜 고온 플래시와 발한을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있다고 믿었다. 고온 플래시와 발한은 폐경기의 첫번째 징후이며, 환자가 폐경기 치료에 순응하느냐 또는 순응하지 못하느냐는 일반적으로 고온 플래시와 발한 감소의성공 또는 실패에 좌우됨을 주목하는 것이 중요하다.

여기서 이용한 대로, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)는 유방 조직에서 직접적으로나 또는 그 활성 대사산물을 통해 에스트로겐 수용체 길항제("항에스트로겐")로서 기능하는 화합물이며, 여전히 뼈 조직과 혈청 콜레스테롤 수준 (즉, 혈청 콜레스테롤을 감소시킴으로써)에 대해 에스트로겐 또는 에스트로겐-같은 효과를 제공한다. 시험관에서 또는 인간이나 래트의 유방 조직에서 (구체적으로 본 화합물이 인간의 유방암 세포 중 항에스트로겐으로서 작용한다면) 에스트로겐 수용체 길항제로서 작용하는 비-스테로이드성 화합물은 SERM처럼 작용한다. 거꾸로, 스테로이드성 항에스트로겐은 그들이 혈청 콜레스테롤상에 어떠한 유리한 효과도 발휘하지 못하므로 SERM으로 작용하지 못하는 경향이 있다. 우리가 실험을 통해 SERM으로서의 작용을 발견한 비-스테로이드성 항에스트로겐으로는 EM-800, EM-652.HCl, 랄록시펜, 타목시펜, 4-히드록시-타목시펜, 토레미펜, 4-히드록시-토레미펜, 드롤록시펜, LY 353 381, LY 335 563, GW-5638, 라소폭시펜, TSE 424 및 이독시펜이 있으나, 이들 화합물에 제한하는 것은 아니다.

그러나 우리는 또한 모든 SERM이 동일한 방식으로 반응하는 것이 아님을 발견하고, 이를 두개의 하위분류로 구분한다: "순수 SERM"RHK "혼합 SERM". 따라서, EM-800 및 EM-652,HCl과 같은 몇몇 SERM은 유방과 자궁내막 중 생리적 또는 약물적 농도로 어떠한 에스트로겐 활성도 갖지 못하며, 래트에서 저콜레스테롤혈증 및 저트리글리세라이드 효과를 갖는다. 이들 SERM을 "순수 SERM"이라 칭한다. 유방선에서의 그 유력하고 순수한 항에스트로겐 활성으로 인해 이상적인 SERM은 EM-652.HCl타입의 순수한 SERM이다. 그밖에, 유사한 랄록시펜, 타목시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시-타목시펜 (1-(4-디메틸아미노에톡시페닐)-1-(4-히드록시페닐)-2-페닐-부트-1-엔), 토레미펜, 4-히드록시-토레미펜 [(Z)-(2)-2-[4-(4-클로로-1-(4-히드록시페닐)-2-페닐-1-부테닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민), LY 353 381, LY 335 563, GW-5638과 이독시펜이 유방과 자궁내막에서 상당한 에스트로겐 활성을 갖는다. SERM의 두번째 세트는 "혼합 SERM"이다. 이들 "혼합 SERM"의 불필요한 에스트로겐 활성은, 시험관내 실험인 도 6과 7 그리고 유방암의 생체 실험인 도 9에 표시된대로, "순수 SERM"을 첨가시킴으로써 억제된다. 누드마우스 중 인간 유방암종의 이종 이식편은 인간 유방암에 가장 근접한 유용한 모델이므로, 우리는 누드마우스에서 ZR-75-1 유방암 이식편의 생장과 관련하여 EM-800과 타목시펜 단독의 효과를 비교하였다.

여기에 교시된 모든 배합에서, 달리 언급하지 않는 한 배합의 각 일부로서 별개의 화합물을 투여하는 것이 고려된다. 따라서, 예컨대 SERM과 에스트로겐을 투여하는 것은 별개의 두 화합물을 투여하는 것에 속하며 - 몇몇 에스트로겐 특성을 갖는 SERM으로서 단일 화합물을 투여하는 것이 아니다.

본 출원인은, SERM이 하기 조직에서 암의 위험을 증가시킬 수 있는 에스트로겐의 잠재적인 부작용을 방해하기 때문에 본 발명의 SERM이 유방, 자궁 및 자궁내막 조직에서 순수 항에스트로겐으로서 작용하는 것을 매우 중요히 여겼다. 특히, 본 출원인은 위치 2에 완전한 배열 2S를 갖는 본 발명의 벤조피란 유도체가 그 라세미 혼합물보다 적절하다고 생각했다. 따라서 US 6,060,503호에서, 에스트로겐-악화성 유방암 및 자궁내막암을 치료하기 위해 2S 배열을 갖는 광학활성 벤조피란 항에스트로겐을 개시하였고, 이들 화합물은 라세미 혼합물보다 현저히 유효한 것으로 보인다 (US 6,060,503호의 도 1-5 참조).

2S 배열의 에난티오머는 순수 상태로서는 산업적으로 얻어지기 힘들며, 본 출원인은 5R 에난티오머에 의한 오염이 10 중량% 미만, 바람직하게는 5 중량% 미만 그리고 보다 바람직하게는 2 중량% 미만인 것이 바람직하다고 고려했다.

본 발명은 생리적으로 활성인 화합물의 신규한 배합물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 배합물은 에스트로겐과 함께 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 본 배합물은 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(SERM), 에스트로겐 및 성 호르몬의 전구체 또는 안드로겐 화합물을 함유한다. 본 발명은 또한 앞서 말한 배합물을 실용화한 키트 및 약리적 조성물을 제공한다. 상기 배합물을 환자에 투여시켜 고온 플래시, 혈관운동성 증후, 질 건조 또는 그밖의 폐경기 증상의 발생을 감소시키거나 제거시킨다. 이 공동 치료를 수용한 환자에서 유방암 및/또는 자궁내막암의 획득 위험이 감소되리라 여겨진다. 또한, 골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 알츠하이머병, 불면증, 심장혈관 질병, 인슐린 내성, 당뇨병 및 비만(특히, 복부 비만)을 치료하거나 그 발발 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다.

도 1은 9개월 동안의 래트 중 혈청 트리글리세라이드(A)와 콜레스테롤(B)에 대한 DHEA(10mg, 경피, 일당 1회) 또는 EM-800(75㎍, 경구, 일당 1회)의 단독 또는 공동치료에 대한 효과를 나타낸다. 수치는 평균치±SEM으로 표시한다. **: P<0.01 실험치 대 개별적인 대조군.

도 2는, A)에스트론이 보충된 난소절제(OVX) 누드마우스에서 일당 2회로 경피 투여되는 DHEA (0.3mg, 1.0mg 또는 3.0mg)의 분량을 증가시킴으로써 평균 ZR-75-1 종양의 크기에 미치는 효과를 표시한다. 단지 매체만을 수용한 대조군 OVX 마우스를 추가 대조군으로 이용한다. 초기 종양 크기를 100%로 한다. DHEA를, 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜의 0.02ml 용액으로 등쪽 피부상에 경피(p.c.) 투여하였다. B)에스트론이 보충된 OVX 누드마우스에서 DHEA 또는 EM-800 단독의 분량 또는 공동의 분량을 증가시킴으로써 9.5개월동안 ZR-75-1 종양의 중량에 미치는 치료 효과를 표시한다. **P<0.01, 치료군 대 에스트론이 보출된 대조군 OVX 마우스.

도 3은, 9.5개월 동안 에스트론이 보충된 난소절제(OVX) 누드마우스 중 평균 ZR-75-1의 종양 크기로, 항에스트로겐 EM-800 (15㎍, 50㎍ 또는 100㎍)(B)의 경구 투여량을 증가시키거나 EM-800(15㎍)과 겸하여 DHEA(0.3, 1.0 또는 3.0mg)의 경피 투여 분량을 증가시키는 효과 또는 EM-800 단독(A)의 효과를 표시한다. 초기 중량 크기는 100%로 한다. 단지 매체만을 수용한 대조군 OVX 마우스를 추가 대조군으로이용한다. 에스트론을 일당 1회 0.5㎍의 분량으로 피하 투여하는 한편, DHEA를 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜에 용해시켜 0.02ml 부피로 등쪽 피부상에 일당 2회 적용하였다. 또한 단지 매체만을 수용한 OVX 동물과 비교가 이루어졌다.

도 4는, 난소절제된 래트에서 DMBA-유발성 유방암종의 E₁(1.0㎍, s.c., 일당 2회)-자극성 생장에 대하여, 체중 Kg 당 0.25와 2.5mg 분량으로 항에스트로겐 EM-800(경구, 일당 1회) 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA, 1mg s.c.; 일당 2회) 또는 EM-800(0.25mg/체중 Kg)과 MPA를 이용한 65일-치료 효과를 표시한다. 종양 크기의 변화는 초기 종양 크기에 대한 %로서 표시한다. 수치는 평균치±SEM로서 표시한다.

도 5는 난소절제된 래트 중 투여되는 EM-800 또는 랄록시펜의 투여량을 증가시키면서(0.01, 0.03, 0.1, 0.3과 1mg/kg) 총 혈청 콜레스테롤에 대한 37-주 치료 효과를 표시한다. 무손상 래트 및 17β-에스트라디올(E2)의 이식편을 갖는 난소절제 동물과 비교가 이루어졌다; p<0.01, 실험치 대 OVX 대조군 래트.

도 6은 EM-800, (Z)-4-OH-타목시펜, (Z)-4-OH-토레미펜 및 랄록시펜의 농도 증가가 인간의 이시카와 세포 중 알칼리성 포스파타제에 미치는 영향을 표시한다. 알칼리성 포스파타제 활성은, 1.0nM E₂의 존재 또는 부재 중, 지시된 화합물의 증가된 농도에 5일간 노출 후 측정하였다. 수치는 평균치±SEM의 네개 웰(well)로서 표시된다. 이용된 기호와 SEM이 겹칠 때, 기호만이 보여진다 (Simard, Sanchez 외, 1997).

도 7은 인간의 이시카와 암종 세포 중 알칼리성 포스파타제 활성에 대해 항에스트로겐 EM-800이 야기하는 (Z)-4-OH-타목시펜, (Z)-4-OH-토레미펜, 드롤록시펜과 랄록시펜의 자극효과의 억제를 표시한다. 알칼리성 포스파타제 활성은, 30 또는 100nM EM-800의 존재 또는 부재 중, 지시된 화합물 3 또는 10nM에 5일간 노출 후 측정하였다. 대조군이 16 웰로부터 얻어진 수치인 것을 제외하고는 8개 웰의 평균치±SD로서 수치를 표시한다 (Simard, Sanchez 외, 1997).

도 8은 페경기의 변수에 대한 표준 HRT(에스트로겐)과 SERM(EM-652)의 효과 비교이다. 표준 HRT에 SERM을 첨가하는 것이 에스트로겐의 잠재적인 역효과를 상쇄시킬 것이다.

도 9는, 인간의 유방암 ZR-75-1 이종 이식편의 생장에 대한 타목시펜의 자극 효과가 EN-652.HCl의 동시 투여에 의해 완전히 억제되는 것을 보여준다. 그 순수 항에스트로겐 활성에 따라서 EN-652.HCl, 스스로는 타목시펜 부재하에 종양의 생장에 영향을 미치지 않는다.

도 10은 래트 유방선의 구획을 표시한다.

A. 비치료 동물. 소엽(L)은 소수의 폐포로 구성된다. 삽입. 폐포를 보여주는 고율 확대.

B. EM-800(0.5mg/kg, b w/일)으로 12주간 치료된 동물. 소엽(L)의 크기가 감소된다. 위축된 폐포 세포를 보여주는 고율 확대.

도 11은 래트의 자궁내막 구획을 표시한다.

A. 비치료 동물. 관상피(LE)는 원주형 상피 세포가 특징인 한편 선상피(GE)는 오히려 입방형이다. 간질은 수개의 세포 성분과 콜라겐 섬유를 함유한다.

B. EM-800(0.5mg/kg, b w/일)으로 12주간 치료된 동물. 관상피의 높이가 현저하게 감소된다. 선상피 세포는 활성이 없음 표시인 비염색 사이토파즘(cytophasm)을 갖는다. 간질은 간질의 세포간 성분 감소로 인해 고도로 다공질이다.

도 12는, 에스트론 치료와 동시에 난소절제 마우스에 경구 투여되는 EM-652.HCl, 라소폭시펜(무염기(free base); 활성과 불활성 에난티오머)과 랄록시펜이 농도를 증가시키며 9일 동안 자궁 중량에 대한 그 효과를 표시한다. *p<0.05, **p<0.01 대 E₁-치료 대조군.

도 13은, 에스트론 치료와 동시에 난소절제 마우스에 경구 투여되는 EM-652.HCl, 라소폭시펜(무염기(free base); 활성과 불활성 에난티오머)과 랄록시펜이 농도를 증가시키며 9일 동안 자궁 중량에 대한 그 효과를 표시한다. **p<0.01 대 E₁-치료 대조군.

도 14는, 9일 동안 난소절제 마우스에 경구 투여되는 1㎍과 10㎍의 EM-652.HCl, 라소폭시펜(무염기; 활성과 불활성 에난티오머) 및 랄록시펜의 자궁 중량에 대한 효과를 보여준다. **p<0.01 대 OVX 대조군.

도 15는, 9일 동안 난소절제 마우스에 경구 투여되는 1㎍과 10㎍의 EM-652.HCl, 라소폭시펜(무염기; 활성과 불활성 에난티오머) 및 랄록시펜의 질 중량에 대한 효과를 보여준다. **p<0.01 대 OVX 대조군.

도 16은 만성 골감소증을 갖는 OVX 래트 중 요추골 BMD에 대한 E₂, EM-652.HCl, E₂+EM-652.HCl, DHEA, DHEA+EM-652.HCl과 DHEA+EM-652.HCl+E₂를 이용한 26-주 치료 효과를 표시한다. 무손상 대조군과 OVX 대조군 동물을 대조군으로서 포함시켰다.

도 17은 만성 골감소증을 갖는 OVX 래트 중 대퇴부 BMD에 대한 E₂, EM-652.HCl, E₂+EM-652.HCl, DHEA, DHEA+EM-652.HCl과 DHEA+EM-652.HCl+E₂를 이용한 26-주 치료 효과를 표시한다. 무손상 대조군과 OVX 대조군 동물을 대조군으로서 포함시켰다.

도 18은 만성 골감소증을 갖는 OVX 래트 중 총 체지방에 대한 E₂, EM-652.HCl, E₂+EM-652.HCl, DHEA, DHEA+EM-652.HCl과 DHEA+EM-652.HCl+E₂를 이용한 26-주 치료 효과를 표시한다. 무손상 대조군과 OVX 대조군 동물을 대조군으로서 포함시켰다.

도 19A는 ZR-75-1 종양의 생장에 대한 항에스트로겐의 효과를 표시한다. 이것은 난소절제 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방 종양의 에스트론-유발성 생장에 대하여 이루어진 7 항에스트로겐을 이용한 161일간의 치료 효과이다. 종양 크기는 초기 종양 면적(1일째 = 100%)에 대한 백분율로 표시된다. 수치는 평균치±SEM으로 표시된다 (n=18-30종양/군); ##p<0.01 대 EM-652,HCl; **p<0.01 대 OVX. 에스트론과 콜레스테롤을 1:25 비율로 함유하는 피하 0.5-cm 실래스틱(silastic) 이식편으로써 얻은 에스트론 자극하에, 항에스트로겐을 50㎍/마우스의 분량으로 일당 1회 경구 투여하였다.

도 19B는 ZR-75-1 종양의 생장에 대한 항에스트로겐의 효과를 표시한다. 이것은 난소절제 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방 종양의 생장에 대하여 이루어진 7 항에스트로겐을 이용한 161일간의 치료 효과이다. 종양 크기는 초기 종양 면적(1일째 = 100%)에 대한 백분율로 표시된다. 수치는 평균치±SEM으로 표시된다 (n=18-30종양/군); ##p<0.01 대 EM-652,HCl; **p<0.01 대 OVX. 에스트로겐 자극 없이 항에스트로겐을 100㎍/마우스의 분량으로 일당 1회 경구 투여하였다.

도 19C는 ZR-75-1 종양의 생장에 대한 항에스트로겐의 효과를 표시한다. 이것은 난소절제 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방 종양의 생장에 대하여 이루어진 7 항에스트로겐을 이용한 161일간의 치료 효과이다. 종양 크기는 초기 종양 면적(1일째 = 100%)에 대한 백분율로 표시된다. 수치는 평균치±SEM으로 표시된다 (n=18-30종양/군); ##p<0.01 대 EM-652,HCl; **p<0.01 대 OVX. 에스트로겐 자극 없이 항에스트로겐을 200㎍/마우스의 분량으로 일당 1회 경구 투여하였다.

도 20A는 반응의 카테고리에 대한 항에스트로겐의 효과를 표시한다. 이것은 난소절제 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방 종양의 반응 카테고리에 대한 7 항에스트로겐의 161-일 투여 효과이다. 완전한(complete) 퇴화는 치료 종료시 종양을 탐지할 수 없는 것이다; 일부(partial) 퇴화는 그 최초 크기의 ≥50% 퇴화된 종양에 상응한다; 안정한(stable) 반응은 <50% 퇴화되거나 <50% 진행된 종양이다; 진행(progression)은 그 최초 크기와 비교하여 50% 이상으로 진행된 것을 가리킨다. 에스트론과 콜레스테롤을 1:25 비율로 함유하는 피하 0.5-cm 실래스틱(silastic) 이식편으로써 얻은 에스트론 자극하에, 항에스트로겐을 50㎍/마우스의 분량으로 일당 1회 경구 투여하였다.

도 20B는 반응의 카테고리에 대한 항에스트로겐의 효과를 표시한다. 이것은 난소절제 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방 종양의 반응 카테고리에 대한 7 항에스트로겐의 161-일 투여 효과이다. 완전한(complete) 퇴화는 치료 종료시 종양을 탐지할 수 없는 것이다; 일부(partial) 퇴화는 그 최초 크기의 ≥50% 퇴화된 종양에 상응한다; 안정한(stable) 반응은 <50% 퇴화되거나 <50% 진행된 종양이다; 진행(progression)은 그 최초 크기와 비교하여 50% 이상으로 진행된 것을 가리킨다. 에스트로겐 자극 없이, 항에스트로겐을 200㎍/마우스의 분량으로 일당 1회 경구 투여하였다.

도 20C는 반응의 카테고리에 대한 항에스트로겐의 효과를 표시한다. 이것은 난소절제 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방 종양의 반응 카테고리에 대한 7 항에스트로겐의 161-일 투여 효과이다. 완전한(complete) 퇴화는 치료 종료시 종양을 탐지할 수 없는 것이다; 일부(partial) 퇴화는 그 최초 크기의 ≥50% 퇴화된 종양에 상응한다; 안정한(stable) 반응은 <50% 퇴화되거나 <50% 진행된 종양이다; 진행(progression)은 그 최초 크기와 비교하여 50% 이상으로 진행된 것을 가리킨다. 에스트로겐 자극 없이, 항에스트로겐을 200㎍/마우스의 분량으로 일당 1회 경구 투여하였다.

도 21은, 경구로 17β-에스트라디올(2mg/kg)을 매일 보충시킨 난소절제 래트에서, EM-652.HCl의 일당 복용량 범위를 0.01mg/kg 내지 10mg/kg까지 증가시키며 2주 동안 자궁 중량에 미치는 효과를 표시한다. 부가의 대조군으로서 무손상 동물을 이용한다.

도 22는, 경구로 17β-에스트라디올(2mg/kg)을 매일 보충시킨 난소절제 래트에서, EM-652.HCl의 일당 복용량 범위를 0.01mg/kg 내지 10mg/kg까지 증가시키며 2주 동안 자궁내막 상피의 높이에 미치는 효과를 표시한다. 부가의 대조군으로서 무손상 동물을 이용한다.

도 23. 14일간 치료된 래트의 무손상 대조군(A), OVX 대조군(B), OVX+E₂(2mg/kg)(C) 및 OVX+E₂+EM-652.HCl(3mg/kg)에서 얻은 상피 내층 세포를 도해한 래트 자궁의 헤마톡실린과 에오신-염색 구획.

도 24는, 경구로 17β-에스트라디올(2mg/kg)을 매일 보충시킨 난소절제 래트에서, EM-652.HCl의 일당 복용량 범위를 0.01mg/kg 내지 10mg/kg까지 증가시키며 2주 동안 질의 중량에 미치는 효과를 표시한다. 부가의 대조군으로서 무손상 동물을 이용한다.

도 25는, 경구로 17β-에스트라디올(2mg/kg)을 매일 보충시킨 난소절제 래트에서, EM-652.HCl의 일당 복용량 범위를 0.01mg/kg 내지 10mg/kg까지 증가시키며 2주 동안 혈청 콜레스테롤에 미치는 효과를 표시한다. 부가의 대조군으로서 무손상 동물을 이용한다.

도 9에서 종양 생장에 대한 타목시펜의 약 100%의 자극 효과가 EM-652.HCl와의 동시 치료에 의해 완전히 억제된다. EM-652.HCl는 그 순수 항에스트로겐 활성에 따라 누드마우스에서 인간의 유방암 ZR-75-1 이종 이식편의 생장에 대하여 어떠한 자극 효과도 발휘하지 않았다.

우리는 스테로이드성 항에트스로겐 ICI 182,780을 실험하였고 이것이 SERM으로서 기능하지 않는 것을 발견하였다. 본 발명에 따라서 SERM은, 심지어 당해 분야에서 이들을 SERM으로서가 아니라 항에스트로겐으로서 이용해도, 당해 분야에 알려진 것과 동일한 복용량으로 투여될 것이다.

또한 우리는 혈청 콜레스테롤에 대한 SERM의 이로운 효과와 뼈에 대하여 이로운 에스트로겐 또는 에스트로겐-같은 효과간에 상관관계가 존재하는 것을 지적한다. SERM은 또한 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병 및 비만(특히 복부 비만)에 이로운 효과를 갖는다. 학설에 결부시키지 않고도, 그 SERM 중 다수가 바람직하게도 한개 내지 두개의 탄소 원자에 의해 연계되는 두개의 방향족 고리를 갖는 SERM은 수용체가 가장 잘 인식하는 상기 분자 부분에 의해 에스트로겐 수용체와 상호작용할 것으로 예상된다. 바람직한 SERM은 그밖의 조직에서 현저한 길항성을 갖지 않으며 유방 및 일반적으로 자궁 조직에서 선택적인 길항성을 야기하는 측쇄를 갖는다. 따라서, SERM은, 놀랍고도 바람직하게 뼈와 혈액에서 (지질과 콜레스테롤의 농도가 유리하게 영향을 받는) 에스트로겐으로서 기능하는 한편, 유방에서는 바람직하게 항에스트로겐으로서 작용할 수 있다. 콜레스테롤과 지질에 대한 유리한 효과란, 부적절한 수준의 콜리스테롤과 지질에 의해 불리하게 작용한다고 알려진 죽상경화증에 대항하는 유리한 효과로 해석된다.

반면, 골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 인식능과 죽상경화증은 에스트로겐 또는 에스트로겐-같은 활성에 유리하게 반응한다. 본 발명에 따라 SERM과 공동으로 에스트로겐을 이용함으로써 그밖의 특정 조직에 불리한 영향 없이 목표 조직에 소망하는 효과를 제공한다. 예를 들어, SERM은 에스트로겐 길항제로서 작용하면서, 도 10과 11에 표시한대로 유방과 자궁내막에서 에스트로겐의 효과를 효과적으로 억제하므로, 에스트로겐과 SERM의 배합은 유방과 자궁 중 불리한 에스트로겐 효과를 피하면서 뼈(또는 지질이나 콜레스테롤)에 대해 유리한 에스트로겐 효과를 가질 수 있다.

도 10에서 입증한대로, 17β-에스트라디올의 순환 정도가 무손상 동물에서 95.9±32.4pg/ml에서 143.5±7.8pg/ml까지 상승할지라도 (EM-800, 0.5mg/kg, 경구투여/12주 동안 치료된 동물에서 50% 상승) 유방선의 현저한 퇴화는 관찰되지 않았다. 유사하게 도 11에서, EM-800(0.5mg/kg)을 수용한 동물 중 자궁내막의 현저한퇴화가 관찰되었다. 순수 항에스트로겐 EM-800을 수용한 이들 무손상 동물 중, 시상하부-뇌하수 수준에서 에스트로겐의 저해 효과를 제거하였고, 따라서 LH가 증가하고 이차적으로 난소에 의해 17β-에스트라디올 구획이 증가한다.

일당 동일한 복용량인 0.5mg/kg의 EM-652를 수용하는 무손상 래트에서 6-개월의 연구 수행시, 순환하는 항에스트로겐 EM-652의 농도는 0.4ng/ml로 측정되었다 (URMA-05-011-94). EM-800의 일당 경구 복용량 20mg을 수용하는 여성에서 EM-652의 평균 혈청 농도가 7.3±0.77ng/ml이기 때문에, 폐경후 여성에서 에스트로겐 대체 치료를 적용하는 것이 EM-652의 잠재적인 억제 효과와 유방암 및 자궁내막암을 억제하는 그 능력에 악영향을 미치지 않는 것이 명백하다. 단계 I 연구에서, EM-800과 EM-652.HCl은 거의 중복되는 수준의 EM-652을 제공한다.

본 발명의 배합에 의한 시너지 방식으로 바람직하지 않은 효과들이 완화된다. 여기서 논의된 모든 질병에서, 대체 분량으로 주어진 에스트로겐으로부터 달리 야기될 수 있는 유방 조직에 대한 그밖의 모든 효과는, 도 2와 3에 보여지는대로, 유방 조직 중 SERM의 항에스트로겐 효과에 의해 유효하게 억제된다. 도 10에서도 동일한 결론에 도달할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 특히 획득 위험의 감소 또는 뼈 질병의 치료에 유리한 안드로겐 효과를 제공하기 위해 성 스테로이드의 전구체(디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-술페이트, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올, 4-안드로스텐-3,17-디온 및 그 전구약물) 또는 안드로겐제를 첨가한다. 골다공증의 치료에서 SERM과 에스트로겐의 배합은 뼈의 퇴화를 감소시키거나 심지어 정지시킨다.동시에 안드로겐 또는 DHEA (및 성스테로이드의 그밖의 전구체)를 추가로 첨가시켜 손상된 뼈 조직을 재건할 수 있다. 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 폐경기 증상, 알츠하이머병, 심장혈관 질병, 유방암, 자궁암 및 난소암을 치료하기 위해 그밖의 유리한 효과를 갖는 성스테로이드 전구체는 상기-언급한 질병의 보다 나은 치료를 위하여 SERM과 에스트로겐의 배합과 함께 시너지 작용할 수 있다. 이 시너지 효과는, 안드로겐(또는 말초 조직에서 안드로겐으로 대사되는 성스테로이드 전구체)과 에스트로겐 또는 SERM이 다른 메카니즘에 의해 작용한다는 사실에 기인한 것이다.

몇몇 구체예에서, 추가로 안드로겐 효과를 제공하기 위해 프로게스틴을 첨가한다. 안드로겐 수용체 이외의 수용체 (예컨대, 글루코코르티코이드 수용체)에 불리하게 작용하지 않도록 당해 분야에 알려진 저 투여량으로 프로게스틴을 이용한다. 이들은 또한 소망하지 않는 안드로겐 부작용이 비교적 없다 (예컨대, 여성 환자의 안면털).

고온 플래시, 심장혈관 징후, 알츠하이머병, 인식능의 감소 및 불면증은 신경 중추계에 위치하는 에스트로겐 수용체와 특정하게 관계한다. 아마도, 뇌 중 낮은 수준의 에스트로겐이 적어도 부분적으로나마 이들 질병을 설명할 수 있다. 외생 에스트로겐과 특히 에스트라디올은 뇌의 장벽을 통과하여 전형적인 에스트로겐 작용을 회복하기 위해 에스트로겐 수용체와 결합할 수 있다. 반면, 본 발명의 SERM과, 보다 구체적으로 EM-652.HCl족의 것들은, 실시예 9에 표시한대로 뇌의 장벽을 통과할 수 없다. 따라서, 이들은, 상기-언급한 질병을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는데 특히 유용한 이들 배합 (SERM+에스트로겐)을 분리시키며, 뇌 중 에스트로겐의 정효과는 반감시키지 않으나 유방, 자궁 및 자궁내막 조직내 에스트로겐의 역효과를 반감시킨다.

에스트로겐과 SERM을 배합시키는 총체적인 부가 이득

페경기 여성이 의사에게 호소하는 주된 증상은 고온 플래시의 발생에 관한 것이며, 이 문제는 잘 알려진대로 에스트로겐 대체 치료에 의해 해소된다. 고온 플래시의 원인이 되는 부위는 중추 신경계(CNS)이고 EM-652는 CNS에 매우 빈약한 접근성을 가지므로 (수치 첨부) 에스트로겐 적용은 SERM의 간섭없이 고온 플래시를 조절할 것으로 기대된다. 반면, SERM은 그밖의 부위에서 에스트로겐의 모든 역효과, 특히 유방암과 자궁암의 위험를 제거할 것이다. 실제로, 에스트로겐에 EM-652를 첨가시켜 유방선과 자궁에 대한 에스트로겐의 자극 효과를 억제하는 한편, 그밖의 조직에서 EM-652는, 예를 들어 뼈에 대한 그 고유의 유리한 효과를 발휘할 것이고, 이 때 이것은 뼈의 미네랄 농도에 대한 난소절제술의 효과를 부분적으로 역전시킨다.

EM-652는 유방암과 자궁암의 억제 및 치료에 현저한 유효성을 발휘하며 어떠한 변수에 대하여도 역효과를 나타내지 않았다.

본 수치는, EM-652의 첨가가 유방선과 자궁에 대한 에스트로겐의 자극 효과를 억제 (실시예 4, 8과 10)하는 한편, 그밖의 조직에서는 EM-652.HCl이 그 고유의 유리한 효과를 발휘하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 뼈에서(실시예 5) EM-652는 뼈의 미네랄 농도에 대한 난소절제술의 효과를 부분적으로 역전시킨다. 이러한 효과로 인해 페경-후 여성을 위한 골다공증 치료용 랄록시펜의 상업화가 전개됐다. 사실, 랄록시펜은 래트 중 BMD 손실 억제능이 EM-652보다 3 내지 10배 보다 작다고 알려져있다 (Martel 외, J Steroid Biochem Molec Biol 2000:74, pp45-56). 랄록시펜과 같은 그밖의 SERM에서 보여지는대로, BMD에 대한 SERM의 효과가 에스트로겐을 이용하여 얻어지는 것만큼 완전치 못할지라도 폐경-후 여성에서 관찰되는 뼈의 분열에 대한 효과는 에스트로겐과 SERM 랄록시펜에서 동일하다고 판명되었다. 따라서 EM-652나 그밖의 SERM에 의해 BMD가 완전히 역전되지 않아도, 반응의 가장 중요한 변수인 뼈의 파쇄에 대한 효과는 에스트로겐 이용 후 보여지는 것만큼이나 중요하다. 게다가, BMD 측정치가 뼈의 생리학에 대한 화합물의 효과를 반영하는 완전한 위상을 제공할 수 없음은 충분히 가능한 추측이다.

중요한 양상은, SERM을 이용한 치료가 뼈에 유리한 효과를 제공하는 한편, 고온 플래시를 억제하기 위해 주로 이용되는 에스트로겐과의 배합으로 에스트로겐을 단독 이용시 연상되는 유방암 및 자궁암의 위험을 감소시키는 것이다.

여기서 논의되는 바람직한 SERM은 (1)본 발명의 영향을 받기 쉽다고 언급된 모든 질병; (2)치료 및 예방 양자의 응용; 및 (3)바람직한 약리적 조성물 및 키트와 관련이 있다.

주어진 질병을 치료하거나 그 발병 위험을 감소시킬 필요가 있는 환자란 그러한 질병을 진단받았거나 그러한 질병을 획득할 가능성이 있는 사람이다.

달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따른 활성 화합물의 바람직한 투여량은 (농도 및 투여 방식) 치료 및 예방 양자에서 동일하다. 여기서 논의된 각 활성 화합물의 투여량은 치료되는 질병(또는 그 발병 가능성이 감소되는 질병)에 상관없이동일하다.

달리 지적하거나 문맥으로부터 명확하지 않다면, 여기서 투여량이란, 비록 하기 첨가제들이 실시예에 표시된대로 바람직하게 함유될지라도, 약리적 부형제, 희석제, 담체 또는 그밖의 성분들을 제외시킨 활성 화합물의 중량을 가리킨다. 제약업에 통상 이용되는 어떠한 투여 형태(캡슐, 정제, 주사 등)도 여기서 적절히 사용 가능하며, "부형제", "희석제" 또는 "담체"는 산업용 투여 형태 중에 활성 성분과 함께, 통상적으로 함유되는 이러한 비활성 성분들을 포함하는 용어이다. 예를 들어, 대표적인 캡슐, 알약, 장용코팅, 고체 또는 액체 희석제나 부형제, 향미제, 방부제 등을 포함한다.

여기서 논의된 어떠한 치료에 이용되는 모든 활성 성분들은, 또한 한가지 이상의 다른 활성 성분을 포함하는 약리적 조성물로 배합될 수 있다. 선택적으로, 이들은 각각 개별적으로 투여될 수 있으나, 환자가 동시에 상승된 혈중 수준을 갖거나 그렇지 않으면 동시에 각 활성 성분의 이득(또는 전략)을 누리도록 충분히 동시적이다. 본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서, 예를 들어, 한가지 이상의 활성 성분들을 단일한 약리적 조성물로 배합시켰다. 본 발명의 다른 구체예에서, 두개 이상의 별도의 용기를 포함하는 키트를 제공하고, 이 때 적어도 한개의 용기내 내용물은 그 안에 함유된 활성 성분에 있어서 한개 이상의 다른 용기내 내용물과 완전히 또는 부분적으로 다르다.

또한 여기서 논의된 공동 치료는 대상 질병의 치료(또는 위험 감소)용 약제 제조에서 (배합 중) 한가지의 활성 성분을 이용하고, 이 때 치료나 예방은 추가로본 발명에 따라서 배합 중에 또다른 활성 성분을 포함한다. 예를 들어 한 구체예에서, 본 발명은 본 공동 치료가 유효할 것이라 여겨지는, 생체내, 어떠한 질병(즉, 골다공증, 심장혈관 질병, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만, 고온 플래시, 발한, 불규칙한 월경, 알츠하이머병, 인식능 문제, 폐경과 관련된 어떠한 징후 및 질 건조)의 치료용 약제 제조에, 에스트로겐 및 에스트로겐으로 전환되는 전구-약물과 공동으로, SERM을 이용한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 어떠한 상기 동일 질병을 치료하기 위한 약제 제조에, SERM과 공동으로, 17β-에스트라디올, 17β-에스트라디올 에스테르(즉, 벤조에이트, 사이피오네이트, 디에난테이트, 발러레이트 등), 17α-에스트라디올, 17α-에스트라디올 에스테르, 에스트리올, 에스트리올 에스테르, 에스트론, 에스트론 에스테르, 컨쥬게이트 에스트로겐, 이퀼린, 이퀼린 에스테르, 17α-에티닐에스트라디올, 17α-에티닐에스트라디올 에스테르, 디에네스트롤, 메스트라놀, 메스트라놀 에스테르, DES, 피토에스트로겐(s), 티볼론, 에티네디올로 구성된 군으로부터 선택되는 에스트로겐을 사용한다.

에스트로겐은 유방 상피 세포의 증식을 촉진한다고 잘-알려져 있으며 세포 증식 자체는 종양을 야기할 수 있는 임의의 유전적 에러를 축적함에 의해 암의 위험을 증가시키는 것으로 고려된다 (Preston Martin 외, Cancer.Res. 50:7415-21, 1990). 이러한 발상을 기초로, 항에스트로겐은 에스트로겐이 촉진시키는 세포 분열률을 감소시킬 목적으로 유방암의 억제에 도입되었다.

10-개월령 이후 암컷 Sprague-Dawley 래트에서 발견된 난소 주기의 감소는혈청 에스트로겐과 프로락틴 수준의 증가 및 혈청 안드로겐과 프로게스테론 농도의 감소를 동반한다 (Lu 외, 61st Annual Meeting of the Endocrine Society 106(abst. #134), 1979; Tang 외, Biol.Resprod. 31:399-413, 1984; Russo 외, Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands 252-266, 1989; Sortino and Wise, Endocrinology 124: 90-96, 1989; Cardy, Vet. Pathol, 28: 139-145, 1991). 암컷 래트의 노화에 따라 자발적으로 발생하는 이러한 호르몬 변화는 유방선관의 비대 및 낭종의 형성뿐 아니라 포상/폐포 조직의 증가된 분비 활성 및 다중병소(multifocal) 증식과 관련된다 (Boorman 외, 433, 1990;Cardy, Vet.Pathol.28:139-145, 1991). 래트 유방선의 고소성(hyperplastic) 및 종양성 변화는 종종 에스트로겐 및 프로락틴의 수치 증가를 수반함을 언급해야 한다 (Meites, J.Neural. Transm.48:25-42, 1980). 본 발명의 EM-800, SERM을 이용한 치료는 소엽 구조의 크기와 수를 감소시킴을 특징으로 하고, 유방선 중 EM-800의 잠재적인 항에스트로겐 활성을 지적하는, 분비활성의 증거가 아니다 (Luo 외, Endocrionology 138:4435-4444, 1997).

에스트로겐은 혈청 콜레스테롤의 수치를 낮춘다고 알려져 있으나, 혈청 트리글리세라이드의 수치는 증가시키거나 그에 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있다 (Love 외, Ann.Intern.Med. 115:860-864, 1991; Walsh 외, New Engl.J.Med.325:1196-1204, 1991; Barrett-Connor, Am.J.Med. 95(Suppl.5A):40S-43S, 1993; Russell 외, Atherosclerosis 100:113-122, 1993; Black 외, J.Clin.Invest. 93:63-69, 1994; Dipippo 외, Endocrinology 136:1020-1033, 1995;Ke 외, Endocrionlogy 136:2435-2441, 1995). 도 3에서, EM-800은 래트 중 저콜레스테롤 효과 및 저트리글리세라이드 효과의 양자 모두를 소유하며, 따라서 혈청의 지질 프로파일에 대해 다른 SERM들, 예컨대 타목시펜(Bruning 외, Br.J.Cancer 58:497-499, 1998; Love 외, J.Natl. Cancer Inst. 82:1327-1332, 1990; Dipippo 외, Endocrinology 136:1020-1033, 1995; Ke 외, Endocrinology 136:2435-2441, 1995) 및 랄록시펜(Black 외, J.Clin.Invest. 93:63-69, 1994)과 명백하게 다른 그 독특한 작용을 나타낸다. 따라서, 에스트로겐과 EM-800의 배합으로 EM-800의 저콜레스테롤 효과 및 저트리글리세라이드 효과를 유지해야 하며, 이러한 배합은 혈청 지질에 유리한 효과를 발휘할 것으로 기대된다.

래트와 인간의 혈청 지질 프로파일이 명백하게 다르다는 것을 언급해야 한다. 그러나, 에스트로겐 수용체-조절 메카니즘은 항에스트로겐 뿐만 아니라 에스트로겐의 저콜레스테롤 효과에도 관련되므로 (Lundeen 외, Endocrinology 138:1552-1558, 1997), 인간 중 에스트로겐 및 "항에스트로겐"의 콜레스테롤-감소 효과 연구에서 래트는 유용한 모델로 취급된다.

우리는 또한 두개의 약물을 공동투여함으로써 누드마우스 중 인간의 ZR-75-1 유방암 이종이식편의 생장에 대한 신규한 항에스트로겐(EM-800)의 저해 효과와 성스테로이드 전구체(DHEA)의 저해 효과간의 잠재적인 상호 작용을 연구하였다. 도 2와 3에서, 적량으로 이용된 DHEA는, 스스로, 종양의 생장을 50 내지 80% 억제하는 한편, 저 투여량의 항에스트로겐을 이용해 달성된 종양 생장의 거의 완전한 억제는 DHEA에 의해 영향을 받지 않았다. 도 4에 표시한대로 난소절제 래트 중 DMBA-유발성 유방암종의 E₂-자극성 생장에 대하여 EM-800과 프로게스테론, MPA를 이용한 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다.

뼈의 미네랄 밀도(BMD)의 한정치 측정은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 스테로이드성 항에스트로겐 ICI 182780으로 치료한 래트에서 BMD 측정치의 변화가 없는 한편 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25:1-9, 1993), 조직 형태 측정에 의해 억제 변화가 관찰된다 (Gallagher 외, Endocrinology 133:2787-2791, 1993). 유사한 차이가 타목시펜에서 보고되었다 (Jordan 외, Breast Cancer Res. Treat. 10:31-35, 1987; Sibonga 외, Breast Cancer Res. Treat. 41:71-79, 1996).

뼈의 강도 감소와 관련된 이상이 뼈의 미네랄 밀도의 감소뿐만이 아님을 지적해야 한다 (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis, Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, May 1994). 따라서 이들 작용에 대한 보다 나은 정보를 얻기 위해 다양한 화합물 및 치료로 유발된 뼈 대사의 생화학적 변수들에서 그 변화를 분석하는 것이 중요하다.

특히, DHEA와 EM-800의 배합은 뼈 대사의 중요한 생화학적 변수들에 대해 예기치 않은 이로운 효과를 발휘함을 지적할 수 있다. 사실상, DHEA 단독으로는 뼈의 재흡수 지표인, 소변의 히드록시프롤린/크레아티닌 비율에 영향을 주지 못했다. 게다가, 일상의 소변내 칼슘 또는 인의 배설에 있어서도 DHEA의 효과는 탐지되지 않았다 (Luo 외, Endovrinology 138:4455-4444, 1997). EM-800은 소변의 히드록시프롤린/크레아티닌 비율을 48%까지 감소시키는 한편, DHEA와 유사하게, 소변의 칼슘 또는 인의 배설에 대하여는 어떠한 영향도 미치지 않았다. 게다가, EM-800은 뼈 형성의 지표인, 혈청 알칼린 포스파타제의 활성에 영향을 미치지 않는 한편, DHEA는 변수의 수치를 약 75%까지 증가시켰다 (Luo 외, Endocrinology 138:4435-4444, 1997).

DHEA와 EM-800 배합의 예기치 않은 효과 중 하나는 뼈 재흡수의 지표인, 소변내 히드록시프롤린/크레아티닌 비율에 관한 것이고, DHEA와 EM-800 두가지를 혼합시 이는 69%까지 감소하며, 이 수치는, DHEA 단독으로 어떠한 효과도 보이지 않고 EM-800 단독으로 48% 억제를 달성하는 것과 비교하여 통계적으로 별개이다 (p<0.01). 따라서, EM-800에 DHEA를 첨가하는 것은 뼈 재흡수에 대한 EM-800의 억제 효과를 50%까지 증가시킨다. 가장 중요하게도, EM-800에 DHEA를 첨가시켜 얻은 또하나의 예기치 않은 효과는,각각, 소변내 칼슘을 약 84% 감소(23.17±1.55 내지 3.7±0.75μmol/24시간/100g(p<0.01))시키고 소변내 인을 약 55% 감소(132.72±6.08 내지 59.06±4.76μmol/24시간/100g(p<0.01))시킨 것이다(Luo 외, Endocrinology 138:4435-4444, 1997).

또한 DHEA를 이용한 동시 치료는 혈청 콜레스테롤에 대한 EM-800의 유효한 억제 효과를 저해하지 않는다(Luo 외, Endocrinology 138:4435-4444, 1997).

랄록시펜과 유사 화합물이 뼈 손실을 억제하고 혈청 콜레스테롤(에스트로겐과 같은)을 감소시키는 한편, 랄록시펜을 BMD에 대하여 프레마린(Premarin)과 비교시, BMD에 대한 랄록시펜의 효과는 프레마린에 비해 덜 유효하다(Minutes of the Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee, FDA Thursday, Meeting #68, November 20th 1997).

폐경기 여성에서 관찰되는 뼈의 손실은, 이차적인 뼈 형성상의 증가가 뼈의 재흡수율 증가를 완전하게 보상하지 못하는 것과 관계된다. 사실상, 골다공증에서는 뼈 형성 및 뼈 재흡수의 두가지 변수가 모두 증가하고, 뼈 재흡수와 형성 양자는 에스트로겐 대체 치료에 의해 억제된다. 뼈 형성에 대한 에스트로겐 대체의 억제 효과는, 따라서, 뼈 재흡수와 뼈 형성간 협력 메카니즘에 기인하고, 그 결과 뼈 재흡수 중 일차적인 에스트로겐-유발성 감소가 뼈 형성의 감소를 동반할 것으로 예상된다 (Parfitt, Calcified Tissue International 36 Suppl. 1:S37-S45, 1984).

망상 조직상 뼈의 강도 및 후속의 파쇄에 대한 저항은 망상 조직상 뼈의 총량 뿐 아니라, 섬유주의 수, 크기 및 분포에 의해 결정되는 섬유주의 미세 구조에 따라 다르다. 폐경후 여성에서 난소 기능의 손실은 전체적인 섬유주의 뼈 부피에 있어서 상당한 감소를 수반하고(Melsen 외, Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86:70-81, 1987; Vakamatson 외, Calcified Tissue International 37:594-597, 1985), 주로, 보다 낮은 수준으로 섬유주의 수와 너비를 감소시킨다.

여기서 지적한 어떠한 질병에 대해 본 발명의 공동 치료 양상을 촉진하기 위하여, 본 발명은 동시 투여용 단일 조성물내에 SERM과 에스트로겐을 함유하는 약리적 조성물을 제공한다. 이 조성물은 관례적인 어떠한 수단, 예컨대 경구 투여, 피하내 주입, 근육내 주입 또는 경피 투여용으로 투여하는 것이 적절하나 이에 제한하는 것은 아니다. 다른 구체예에서, 키트가 제공되며, 이 키트는 한가지 이상의 SERM과 에스트로겐을 개별적으로 또는 하나의 용기안에 포함한다. 상기-기술한 약리적 조성물과 키트는 골다공증의 치료나 예방에 이용되는 비스포스포네이트 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 키트는, 예컨대 정제, 캡슐, 시럽 등의 적절한 경구 투여용 물질 및 예컨대 연고, 로션, 젤, 크림, 서방성 패치 등의 적절한 경피성 투여용 물질을 포함한다.

본 출원인은 에스트로겐, SERM과 성 스테로이드 전구체의 투여가, 골다공증,고콜레스테롤혈증, 고지질혈증, 죽상경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만, 알츠하이머병의 전개 및 고온 플래시와 발한의 치료 및/또는 발병 감소에 효용성이 있다고 믿었다. 본 발명의 활성 성분들(여기서 에스트로겐, SERM 또는 전구체 또는 이외의 것)은 다양한 방식으로 배합 및 투여가능하다. 본 발명에 따라 공동으로 투여시, 동시적으로나 따로따로 활성 성분들을 투여할 수 있다.

경피성 또는 경점막용 활성 성분은, 약리적 조성물 총 중량에 대해 0.01% 내지 20 중량%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2 내지 10 중량%이다. 17β-에스트라디올, 에스트론, 컨쥬게이트 에스트로겐은 0.01% 내지 1%이고, 경피 투여용 DHEA 또는 5-디올의 농도는 7% 이상이어야 한다. 선택적으로 활성 성분을, 종래에 알려진 구조의 경피성 패치, 예를 들어 유럽 출원 0279982호에 기술된 구조에 포함시킬 수 있다.

활성 성분을 연고, 로션, 젤 또는 크림 등으로 배합시, 인간의 피부 또는 점막에 적합하고(compatible) 피부 또는 점막을 통해 화합물의 경피성 통과를 향상시키는 적절한 담체와 혼합한다. 적절한 담체는 당해 분야에 알려져 있으며, 클루셀(Klucel) HF 및 글락살(Glaxal) 기재를 포함하나 이에 제한하는 것은 아니다. 몇몇은 시판되며, 그 예로써 Glaxal Canada Limited Company의 글락살 기재를 들 수 있다. 다른 적절한 매체가 Koller and Buri, S.T.P.Pharma 3(2), 115-124, 1987에서 제시된다. 담체는 주어진 활성 성분의 농도에서 주위 온도로 활성 성분(들)을 용해시킬 수 있는 것이 바람직하다. 담체는, 국소 영역의 피부 또는 점막을 통과하여 소망하는 임상 효과를 야기시킬 혈액까지 전구체가 실질적으로 침투할 수있는 충분한 시간 동안 흐르거나 기화되지 않고 조성물이 적용된 국소 영역의 피부 또는 점막상에서 억제능을 지속하도록 충분한 점도를 가져야 한다. 통상적으로 그 담체는 여러개의 성분, 예컨대 약리적으로 허용되는 용매와 농축제의 혼합물이다. 유기 및 무기 용매의 혼합물, 예컨대 물과 에탄올 등의 알코올이 친수성 및 친지성의 용해능을 보조할 수 있다.

바람직한 성 스테로이드 전구체로는 디하이드로에피안드로스테론(DHEA)(미국, 일리노이, 시카고, Diosynth Inc.에서 시판)이 있다.

또한 담체는 연고 및 로션에서 통상 이용되는 다양한 첨가제를 포함하고 이는 화장품 및 의약 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 방향제, 항산화제, 향료, 겔화제, 카르복시메틸셀룰로스와 같은 농축제, 계면 활성제, 안정화제, 연화제, 착색제 및 다른 유사한 약제를 포함할 수 있다. 전신적인 질병 치료시, 활성 성분의 과도한 부분적 집중과 피부에서 일어날 수 있는 활성 성분의 과자극을 피하기 위해 피부상 적용 부위를 변화시켜야 한다.

본 발명에 따른 치료는 한계가 없는 지속적인 치료에 적합하다.

또한, 에스트로겐 화합물, SERM 화합물 및/또는 성스테로이드 전구체 및/또는 비스포스포네이트를 경구 투여할 수 있고, 통상적인 약리적 부형제, 예컨대 분무건조된 락토오스, 미세 결정성 셀룰로스 및 마그네슘 스테아레이트와 함께 경구 투여용 정제 또는 캡슐로 배합할 수 있다.

활성 물질을 고체, 가루형 담체 물질, 예컨대 소듐 시트레이트, 칼슘 카르보네이트 또는 디칼슘 포스페이트, 그리고 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴 또는 셀룰로오스 유도체와 같은 결합제와 혼합하여 정제 또는 당의정 코어로 제조할 수 있고, 또한 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 술페이트, "카르보왁스(Carbowax)" 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제를 첨가할 수 있다. 물론, 경구 투여형일 경우 맛-개선 물질을 첨가할 수 있다.

추가 형태로서 이용할 수 있는 것이, 연화제 또는 글리세린과 같은 가소제를 포함하는 솔프(solf)-젤라틴에 근접한 캡슐 뿐 아니라, 예컨대 경질 젤라틴의 플러그 캡슐이다. 플러그 캡슐은 바람직하게도, 예컨대 락토오스, 이당류, 만니톨, 감자 전분 또는 아밀로펙틴과 같은 전분, 셀룰로오스 유도체 또는 고분산된 규산과 같은 충전재와 혼합시킨 과립 형태내에 활성 물질을 포함한다.

로션, 연고, 겔 또는 크림은 과량이 육안으로 뚜렷이 보이지 않도록 완전하게 문질러 발라져야 하고, 대부분의 경피 침투가 이루어질 때까지, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 6시간 이상 그 피부 부분을 씻어서는 안된다.

전구체를 전달하기 위한 경피성 패치는 종래의 기술에 따라 이용 가능하다. 통상적으로 상당히 긴 시간, 예컨대 1 내지 4일 동안 적용하나, 활성 성분의 느리고 지속적인 전달을 가능하게 하면서 보다 작은 표면상에 접촉되는 것이 퉁상적이다.

개발 및 이용되는 수많은 경피성 약물 전달계를 본 발명의 활성 성분을 전달하기 위해 적절히 이용할 수 있다. 방출율은 통상적으로 매트릭스 확산, 또는 조절막을 통한 활성 성분의 이동에 의해 조절된다.

경피성 장치의 기계적 양상이 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국특허 제 5,162,037, 5,154,922, 5,135,480, 4,666,441, 4,624,665, 3,472,951, 3,797,444, 4,568,343, 5,064,654, 5,071,644, 5,071,657호에서 설명된다. 이 기술 내용들이 여기서 참조로써 관계한다. 추가적인 배경 기술을 유럽 특허 제 0279982호 및 영국 특허출원 제 2185187호에서 제공한다.

장치는 점착성 매트릭스 및 저장-형 경피성 전달 장치를 포함하는 당해 분야의 일반적인 어떠한 타입일 수 있다. 이 장치는 활성 성분 및/또는 담체를 흡수하는 섬유와 병합된 약물-함유 매트릭스를 포함한다. 저장-형 장치에서 저장기는 담체 및 활성 성분에 불침투성인 폴리머 막으로 한정된다.

경피성 장치에서, 장치 자체는 소망하는 국소 피부 표면과 접촉한채로 활성 성분을 유지시킨다. 이러한 장치에서 활성 성분에 대한 담체의 점도는 크림 또는 겔보다 낮다. 경피성 장치용 용매계는 예를 들어, 올레산, 선형 알코올 락테이트 및 디프로필렌 글리콜을 포함하거나, 당해 분야에 알려진 그밖의 용매계일 수 있다. 활성 성분이 담체중에 용해되거나 현탁된다.

피부 부착을 위해, 경피성 패치는 중간에 구멍을 갖는 외과용 접착성 테입위에 고정되어 있다. 접착 테입은, 사용전 이를 보호하는 제거용 라이너로 덮혀 있는 것이 바람직하다. 방출에 적합한 통상의 물질은 폴리에틸렌 및 폴리에틸렌-코팅지를 포함하고, 바람직하게는 제거가 용이한 실리콘-코팅된 것이다. 장치를 사용하기 위해, 제거용 라이너를 간단하게 벗겨내고 접착물을 환자의 피부에 부착한다. 참조로써 관계하는 미국 특허 5,135,480에서, Bannon 등은 피부에 장치를 고정하기 위한 비-접착식 수단의 선택적인 장치를 기술한다.

결국, 단지 소망하는 수준의 각각의 혈중 혈청 농도를 얻기에 충분한 투여량과 방식으로 SERM, 에스트로겐과 성스테로이드 전구체를 투여하는 것이 필수적이다. 본 발명의 공동 치료에 따라, 에스트로겐의 농도가 소망하는 변수내에 유지되는 동시에 SERM의 농도 또한 소망하는 변수내에서 유지된다.

에스트라디올 사용시, 혈청 에스트라디올의 농도는 통상적으로 리터당 50 내지 300 나노그램, 바람직하게는 리터당 100 내지 200 나노그램, 가장 바람직하게는 리터당 150 내지 175 나노그램으로 유지되어야 한다. 또다른 에스트로겐을 사용하는 경우, 혈청 농도는 에스트라디올에 상대적인 에스트로겐의 활성상 차이를 설명하고 표준의 과(per)-폐경기의 에스트로겐 수준을 얻기 위하여 알려진 방식으로 다양해질 수 있다. 메스트라놀을 이용하면, 보다 낮은 농도가 요구된다. 또한 폐경기 증상의 소멸에 의해 적절한 혈청 에스트로겐 수준을 평가할 수 있다. 공동 치료 중 두번째 화합물(예컨대, EM-652.HCl)의 혈청 농도는 통상적으로 리터당 1 내지 15 마이크로그램으로 유지되며, 몇몇 구체예에서 리터당 2 내지 10 마이크로 그램, 또는 리터당 5 내지 10 마이크로그램이다.

에스트로겐은 에스트라디올인 것이 바람직하나, 소듐 에스트론 술페이트나 에스트로겐 수용체 촉진제로서 작용하는 어떠한 다른 화합물일 수 있다. 개별적으로 투여시, 시판되는 에스트로겐 보조제, 예컨대 Ayerst에서 시판되는 "프레마린(PREMARIN)" (St-Laurent, Quebec, Canada)을 이용할 수 있다. 바람직한 성스테로이드 전구체 중 한가지는, 비록 하기 논의되는 DHEA-S와 동족체가 또한 후술하는 이유로 특히 유효하긴 하나, DHEA이다. 대표적인 환자에서, 소망하는 혈청농도를 달성하는 에스트로겐의 적절한 투여량은, 경구 투여시, 체중 50kg당 일당 0.3 내지 2.5 밀리그램의 프레마린이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 에스트로겐은 "에스트라덤(ESTRADERM)"의 명칭하에 CIBA에서 시판되는 패치로써 경피 투여되는 17β-에스트라디올이고, 이 때 일당 투여량은 체중 50kg당 일당 0.05 내지 0.2 밀리그램이다. 상표명 "델레스토젠(DELESTOGEN)"으로 Squibb에서 시판되는 17β-에스트라디올 발레리아네이트는 주사로 투여된다.

본 발명에서 그밖의 바람직한 에스트로겐 약물 제품으로는 다음을 들 수 있다: 상표명 클리마라(CLIMARA)로 Berlex Canada에서 시판되거나 상표명 비벨레(VIVELLE)로 Novartis Pharma에서 시판되는 17β-에스트라디올 함유 패치; 상표명 에스트링(ESTRING)으로 Pharmacia & Upjohn에서 시판되는 17β-에스트라디올 함유 질 장치; 상표명 에스트로겔(ESTROGEL)로 Schering에서 시판되는 17β-에스트라디올 함유 겔; 상표명 오르쏘 디네스트롤(ORTHO DINESTROL)로 JANSSEN-ORTHO에서 시판되는 디에노에스트롤 함유 크림.

몇몇 구체예에서, 에스트로겐/안드로겐 혼합 화합물이 에스트로겐보다 바람직하다. 상기 화합물 중 한가지가, 상표명 리비알(LIVIAL)로 ORGANON(네덜란드)에서 시판되는, 티볼론 [(7α,(7α)-17-히드록시-7-메틸-19-노르프렌(norpregn)-5(10)-엔(en)-20-인(yn)-3-원; 미국 특허 제 3,340,279(1967); 미국 3,475,465(1969) 및 J.de Visser 외., Arzneimittel-Forsch, 34, 1010, 1984에 기술된 내분비학 프로파일]이다.

에스트로겐과 프로게스틴 또는 안드로겐의 혼합물을 함유하는 약물 제품이또한 바람직하다. 상기 약물은 Norvartis Pharma에서 상표명 에스트라콤(ESTRACOM)과 Sabex에서 상표명 클리막테론(CLIMACTERON)으로 시판된다.

본 발명의 경피성 또는 경점막성 전달계를 또한 골다공증이나 그밖의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 신규하고도 진보된 전달계로서 이용할 수 있다.

효능을 위해 제조자가 추천하는 요구대로 사용된 어떠한 에스트로겐도 이용가능하다. 적절한 투여량은 당해 분야에 알려져 있다. 에스트로겐 수용체 등에 대한 에스트로겐 활성 또는 촉진 활성을 갖는 어떠한 화합물 또는 화합물의 혼합물을 본 발명에서 이용할 수 있다 (파이토에스트로겐, 합성 에스트로겐 등).

본 발명의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자는 다음 특징의 분자식을 갖는다: a)1 내지 2개의 탄소 원자에 의해 격리된 두개의 방향족 고리, 두개의 방향족 고리 모두 히드록실기 또는 생체내에서 히드록실로 전환되는 작용기에 의해 비치환 또는 치환되며; b)방향족 고리와 삼차 아민의 관능기 또는 그 염을 포함하는 측쇄.

본 발명에서 바람직한 한 SERM이 PCT/CA96/00097(WO 96/26201)에서 보고된 EM-800이다. EM-800의 분자식이다:

본 발명의 또 다른 바람직한 SERM이 EM-01538이다:

EM-1538, (또는 소위 EM-652.HCl)은 EM-800에 비해 유력한 항에스트로겐 EM-652의 염산염이고, EM-1538은 간단하고 용이하게 염으로 합성된다. 또한 이것은 쉽게 분리, 정제, 결정화할 수 있고 우수한 고체상 안정성을 나타낸다. EM-800 또는 EM-1538을 투여할 때, 생체내에서 동일한 활성 화합물이 유발된다고 여겨진다.

본 발명에서 바람직한 다른 SERM으로는 타목시펜 ((Z)-2-[4-(1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민) (UK, Zeneca에서 시판), 토레미펜 ((Z)-2-[4-(4-클로로-1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, Finland, Orion-Farmos Pharmaceuticla, 또는 Schering-Plough에서 시판), 드롤록시펜 ((E-3-[1-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-2-페닐-1-부테닐]페놀) 및 CP-336,156(라소폭시펜) (시스-1R-[4'-피롤리디노-에톡시페닐]-2S-페닐-6-히드록시-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌 D-(-)-타르트레이트 염) (Pfizer Inc. 미국), 랄록시펜 ([2-(4-히드록시페닐)-6-히드록시벤조[b]티엔-3-일] [4-[2-(1-피페리디닐)에톡실]페닐]-메타논 히드로클로라이드 (Eli Lilly and Co., 미국), LY335563 (6-히드록시-3-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페녹실]-2-(4-히드록시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드) 및 LY353381 (아르족시펜, 6-히드록시-3-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페녹실]-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드) (Eli Lilly and Co., 미국), 요오독시펜 ((E-1-[2-[4-[1-(4-요오드페닐)-2-페닐-1-부테닐]페녹시]에틸]피롤리딘) (SmithKline Beecham, 미국), Shalmi 외, WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; Korsgaard 외, (WO 97/25036), GW5638(Willson 등이 Endocrinology, 138(9), 3901-3911, 1997에서 기술)에서 기술한 레보멜록시펜 (3,4-트랜스-2,2-디메틸-3-페닐-4-[4-(2-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐]-7-메톡시크로만) (Novo Nordisk, A/S, 덴마크)과 인돌 유도체(Miller 등이 EP 0802183A1에서 기술) 그리고 Wyeth Ayers(미국)가 개발하고 JP10036347(American home products corporation)에서 기술한 TSE 424와 WO 97/32837에서 제시한 비스테로이드성 에스트로겐 유도체가 있다. 또한, Taiho(일본)의 이프록시펜 (TAT 59; (E)-4-[1-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-2-[4-(1-메틸에틸)페닐]-1-부테닐]페놀 디히드로겐 포스페이트, Orion(핀랜드)의 FC 1271 ((Z)-2-[4-(4-클로로-1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시]에탄올), Hoechst Marion Roussel의 HMR 3339와 HMR 3656, Schering AG, 독일의 SH 646, Wyeth Ayerst (USA)의 ERA 923, Eli Lilly(USA)의 LY 335124와 LY 326315가 포함된다.

제조자가 추천하는대로, 효능상 요구에 따라 이용된 어떠한 SERM도 이용할 수 있다. 적절한 투여량은 당해 분야에 알려져 있다. 본 발명에 따라 시판되는 어떠한 다른 비스테로이드성 항에스트로겐을 이용할 수 있다. SERM과 유사한 활성을 갖는 어떠한 화합물, 예컨대 랄록시펜을 이용할 수 있다.

본 발명에 따라 일당 체중 kg당 0.01 내지 10mg (바람직하게는 0.05 내지 1.0mg/kg) 범위의 SERM 투여량, 일당 5mg, 특히 일당 10mg을, 경구 투여시 평균 체중의 사람에게 바람직하도록 2회 분량으로 동일하게 나누어 투여하거나, 일당 체중 kg당 0.003 내지 3.0mg (바람직하게는 0.015 내지 0.3mg/ml) 범위의 SERM 투여량, 일당 1.5mg, 특히 일당 3.0mg을, 비경구 투여시 (즉, 근육내, 피하내 또는 경피성 투여) 평균 체중의 사람에게 바람직하도록 2회 분량으로 동일하게 나누어 투여한다. 바람직하게도 SERM은 후술하는 약리적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 투여된다.

본 발명에서 골다공증을 치료하기 위한 공동 치료로써 활성 성분으로 투여된 바람직한 비스포스포네이트는 Fosamax라는 상표명으로 Merck Shape and Dohme에서 시판되는 알렌드로네이트 [(4-아미노-1-히드록시부틸리덴)비스 포스폰산, 디소듐염, 히드레이트], Didrocal 및 Didronel의 상표명으로 Procter and Gamble에서 시판되는 에티드로네이트 [(1-히드록시에틸리덴)비스 포스폰산, 2,2'-이미노비스 에탄올], Rhone-Poulenc Rorer 사에서 Bonefos라는 상표명으로 또는 Boehringer Mannheim에서 Ostac이라는 상표명으로 시판되는 클로드로네이트 [(디클로로메틸렌)비스 포스폰산, 디소듐염], 그리고 Aredia의 상표명으로 Geigy에서 시판되는 파미드로네이트 [(3-아미노-1-히드록시프로필리덴)비스 포스폰산, 디소듐염)]이 있다. 리세드로네이트 (1-히드록시-2-(3-피리디닐)에틸리덴 비스포스폰산 모노소듐염)은 임상 개발 중이다. 시판되는 어떠한 다른 비스포스포네이트를 제조자가 추천하는 복용량으로 모두 본 발명에 이용할 수 있다. 마찬가지로 성 스테로이드 전구체를 종래의 추천 복용량으로 이용하거나, 바람직하게는 건강한 20-30세의 남성 또는 폐경 전 성인 여성의 순환 수준을 복원시키는 복용량으로 이용할 수 있다.

여기서 추천하는 모든 복용량에 대하여, 해당 임상 학자가 개개 환자의 반응을 모니터링하고 그에 따라 복용량을 조절해야 한다.

실시예 1

유방선에서, 안드로겐은 전구체 스테로이드 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA)으로부터 생성된다. 임상학적 증거들로부터, 안드로겐이 유방암을 억제하는 효과를 갖는 것으로 나타났다. 반면에, 에스트로겐은 유방암의 발달 및 생장을 촉진시킨다. DHEA 단독 또는 새로 개시된 순수한 항에스트로겐, EM-800과의 배합 형태를 이용하여 난소절제 누드마우스에서 인간의 유방암 세포 라인 ZR-75-1에 의해 형성된 종양 이종이식편의 생장에 대한 효과를 연구하였다.

난소 절제 수술 직후부터 매일 0.5 ㎍ 에스트로겐(에스트로겐 호르몬)을 마우스에 피하 주입하였다. EM-800(15, 50 또는 100 ㎍)을 일당 1회 경구 투여하였다. DHEA를 등쪽 피부에 일당 2회(총 투여량 0.3, 1.0 또는 3.0 mg) 단독으로 투여하거나 일당 15 ㎍씩 경구 복용되는 EM-800과 함께 투여하였다. 치료에 반응하는 종양의 크기 변화를 첫날의 측정치와 비교하여 주기적으로 기록하였다. 실험 종료 시점에서, 종양을 절개하여 칭량하였다.

에스트론을 수용하지 않은 마우스와 비교하여, 에스트론을 단독으로 투여시킨 난소절제 마우스에서 9.5개월 동안 종양 크기의 9.4배 증가가 관찰되었다. 에스트로겐-보충된 난소절제 상태에서 15, 50 또는 100 ㎍의 EM-800을 투여시켜 각각, 88%, 93% 및 94%의 종양 크기 억제를 유도하였다. 반면에, 투여량 0.3, 1.0 또는 3.0 mg의 DHEA는 최종 종양 중량을 각각 67%, 82% 및 85% 억제하였다. 별개 투여량의 경피성 DHEA의 존재 또는 부재하에 일당 경구 투여량 15 ㎍의 EM-800을 이용하여 동등한 정도로 종양 크기를 억제시켰다.

DHEA와 EM-800은 독립적으로 누드 마우스 중 에스트론-자극성 ZR-75-1 마우스의 이종이식편 종양의 생장을 억제하였다. 소정의 투여량에 의한 DHEA의 투여는 EM-800의 억제 효과에 영향을 미치지 않는다.

물질 및 방법

ZR-75-1 세포

ZR-75-1 인간의 유방암 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)에서 얻었으며, 개시된 바와 같이 95% 공기/5% CO₂의 습윤 대기하 37℃에서, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 100 IU 페니실린/ml, 100㎍ 스트렙토마이신/ml, 및 10% 소태아혈청이 보충된 RPMI 1640 배지상에서 단층으로 통상 배양되었다 (Poulin and Labrie, Cancer REs. 46: 1933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer REs. TREat. 12, 213-225, 1988). 세포는 매주 0.05% 트립신; 0.02% EDTA(w/v) 처리 후 패시지된다(passaged). 본 보고서에 기재된 바, 본 실험에 사용되는 세포 배양물들은 세포 라인 ZR-75-1의 패키지 93으로부터 유래되었다.

동물

동형접합성의 암컷 Harlan Sprague-Dawley(nu/nu) 무흉선 마우스(28- 내지 42-일령)를 HSD(indianapolis, Indiana, USA)로부터 구입하였다. 마우스를 판상 에어 플로우 우드내 에어 필터가 장착된 비닐 우리안에서 기우며, 광원-한정 조건 하에 유지하였다. 우리, 깔개, 및 음식은 사용전 오토클레이브 처리하였다. 물은 오토클레이브 처리 및 pH 2.8로 산성화시켜, 임의 제공하였다.

세포 접종

마우스는 아베르틴(아밀 알콜: 0.8g/100 ml 0.9% NaCl; 및 트리브로모 에탄올: 2g/100 ml 0.9% NaCl) 0.25 ml/동물 중 복강내 주사에 의해 이루어진 마취 하에, 종양세포 접종 1주 전에 양측 난소 절제되었다(OVX). 대수적 생장 단계의 1.5 x 10⁶ZR-75-1 세포를 0.055% 트립신/0.02% EDTA (w/v)로 단층 처리한 후 회수하고, 25% 마트리겔을 함유한 0.1ml 배양 배지내에 현탁시켰으며, 전술한 바와 같이 1 인치-길이 20 게이지 바늘을 사용하여 동물의 양 옆구리상에 피하 접종하였다 (Dauvois et al., Cancer REs. 51: 3131-3135, 1991). 종양의 생장을 용이하게 하기 위하여, 각 동물들은 0.9% NaCl 5% 에탄올 1% 젤라틴으로 이루어진 매체 중 10㎍의 에스트라디올(E₂)을 5주 동안 매일 피하주사로 수용하였다. 촉진가능한 ZR-75-1 종양의 출현 후, 캘리퍼스로 종양의 직경을 측정하였고 본 연구용으로 0.2 내지 0.7cm의 종양 직경을 갖는 마우스를 선택하였다.

호르몬 치료

대조군 OVX군을 제외한 모든 동물은 0.9% NaCl 5% 에탄올 1% 젤라틴 0.2 ml 중 0.5㎍ 에스트론(E₁)을 매일의 피하주사로 수용하였다. 지시된 군에서, 종양 생장 영역 외부의 등쪽 피부 영역상에 0.3, 1.0 또는 3.0 mg/동물 투여량의 DHEA를 0.02ml 부피로써 일당 2회 경피 투여하였다. DHEA는 50% 에탄올 50% 프로필렌 글리콜에 용해되었다. EM-800, ((+)-7-피발로일옥시-3-(4'-피발로일옥시페닐)-4-메틸-2-(4''-(2'''-피페리디노에톡시)페닐)-2H-벤조피란)을 CHUL 리서치 센터의 분자 내분비학의 연구 중 의약화학 분야에서 종래 개시된 바에 따라 합성하였다 (Gauthier et al., J. Med. Chem. 40: 2117-2122, 1997). EM-800을 4%(v/v) 에탄올 4%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 600 1%(w/v) 젤라틴 0.9%(w/v) NaCl에 용해시켰다. 지시된 군의 동물에게 EM-800의 15 ㎍, 50 ㎍ 또는 100 ㎍을 단독으로 일당 경구 투여하거나 DHEA와 배합하여 투여하는 한편, OVX군의 동물에게는 매체(0.2 ml 4% 에탄올 4% PEG 600 1% 젤라틴 0.9% NaCl)만을 수용시켰다. 베르니에르(Vernier) 캘리퍼스를 이용하여 일주일에 1회 종양을 측정하였다. 두개의 수직 직경(L 및 W)을 cm로 기록하고, L/2xW/2xπ의 식(Dauvois et al., Cancer REs. 31: 3131-3135, 1991)을 이용하여 종양 면적(cm²)을 산측하였다. 치료 첫날 측정된 면적을 100%로 하고, 종양 크기상의 변화를 초기 종양 면적에 대한 백분율로써 표시하였다. 일반적으로 피하 종양일 경우, 3차원적 종양 부피를 정확하게 측정하는 것은 불가능하므로, 종양 면적만을 측정하였다. 291일(또는 9.5 개월)의 치료 후, 동물들을 치사시켰다.

반응의 카테고리들을 개시된 바와 같이 측정하였다 (Dauvois et al, Breast Cancer REs. Treat. 14, 299-306, 1989; DAuvois et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891-897, 1989; Labrie et al., Breast Cancer REs., Treat. 33; 237-244, 1995). 요컨대, 일부(partial) 퇴화라 함은 그 최초 크기의 50% 이상 퇴화된 종양에 해당하며; 안정한(stable) 반응은 최초 크기보다 50% 미만으로 퇴화되거나 최초 크기보다 50% 미만으로 진행된 종양들을 지칭하는 것이고, 완전(complete) 퇴화라 함은 치료 종료시 종양이 탐지되지 않는 것을 말한다. 진행(progression)이라함은 그 최초 크기에 비해 50% 이상 진행된 종양을 가리킨다. 실험 종료시, 단두형으로 모든 동물을 시차시켰다. 종양, 자궁, 및 질을 즉시 제거하고, 결합조직 및 지방조직들을 떼어낸 후 칭량하였다.

통계학적 분석

DHEA, EM-800 및 시간으로 인한 효과를 측정하는 변수 분석(ANOVA)을 이용하여 종양 크기에 대한 치료 효과의 통계적 유의성을 평가하고, 치료의 시작과 종료시, 동일 동물에서 반복된 산측을 수행하였다 (그룹 인자내 대상). 시점 0과 치료 후 9.5개월 시점에서의 반복된 산측으로 동물에 대한 임의의 블록을 형성한다. 따라서, 시간은 블록내 효과로서 분석되는 반면, 두가지 치료법은 블록간 효과로서 평가된다. 주요 효과들간 모든 상호작용을 본 모델내에 포함시켰다. 치료 인자 및 그 상호작용의 의미는 오차 단위로서 그룹내 대상을 이용하여 분석되었다. 수치는 로그 전환된다. ANOVA의 기초가 되는 가설은 오차 규정 및 변수의 동차성을 가정하였다.

최소 유의적 차이에 대한 피셔(Fisher's) 테스트를 이용하여 후위쌍 방식으로 비교하였다. 상호작용에 대한 표준 2-차원 ANOVA를 이용하여 체중과 조직 중량에 대한 치료의 주요한 효과 및 상호 작용을 분석하였다. 모든 ANOVA는 SAS 프로그램을 이용하여 수행한다 (SAS Institute, Cary, NC, USA). 2-말단(tailed) 분석을 이용하여 유의성은 총 5% 수준으로 진술되었다.

Kruskall-Wallis 실험의 순차적인 카테고리 반응 변수에 따라 카테고리 수치를 분석하였다 (완전한 반응, 일부 반응, 안정한 반응 및 종양의 진행). 치료 효과의 총체적인 평가 후, 복합 비교를 위하여 임계의 p-수치를 조절하면서 표 4에 표시된 결과들의 세부사항을 분석하였다. 완전한 p-수치는 StatXact 프로그램을 이용하여 계측된다 (Cytel, Cambridge, MA, USA).

수치는, 각 그룹에서 12 내지 15마리 생쥐의 평균(SEM)의 평균치±평균 표준 오차(SEM)로서 표현된다.

결과

도 2A에 표시한대로, 0.5㎍ 분량의 에스트론을 일당 피하내 투여시켜 치료한 난소절제 누드마우스에서 인간의 ZR-75-1 종양이 291일(9.5개월)에 걸쳐 9.4배 증가한 한편, 매체만을 수용한 대조군 OVX 마우스에서는 연구를 진행하는 동안 초기 수치의 36.9%까지 그 크기가 감소하였다.

DHEA의 경피성 투여를 증가시킨 치료는 E₁-자극성 ZR-75-1 종양의 생장을 점진적으로 억제한다. 0.3mg, 1.0mg 및 3.0mg 투여량의 DHEA를 매일 동물당 이용하여 9.5개월 동안 치료한 경우 각각 50.4%, 76.8% 및 80.0%의 억제를 달성하였다 (도 2A). 총 종양 부하의 감소에 따라서, DHEA를 이용한 치료는 실험 종료시 남아있는 종양의 평균 중량을 현저하게 감소시킨다. 실제적으로, 종양의 평균 중량은 E₁-보충 난소절제 누드마우스의 대조군에서 나타나는 수치 1.12±0.26g로부터, 매일 0.1, 1.0 및 3.0mg의 DHEA를 수용한 동물군에서, 각각 0.37±0.12g(P=.005), 0.20±0.06g(P=.001) 및 0.17±0.06g(P=.0009)까지 감소한다 (도 2B).

항에스트로겐 EM-800의 일당 복용량 15㎍, 50㎍ 및 100㎍에 대해, 9.5개월시점에 대조군 동물과의 종양 크기 비교시, 에스트로겐-자극성 종양 크기는 각각 87.5%(P<.0001), 93.5%(P<.0001) 및 94.0%(P<.0003)까지 억제되었다. 세가지의 EM-800 복용량으로 얻은 종양의 크기 감소는 상호간 상당한 차이를 갖지 않는다. 도 2B에 제시한대로, 9.5개월 연구 종료시 종양의 중량은, E₁-보충 OVX 마우스 대조군에서 나타나는 수치 1.12±0.26g로부터, 일당 15㎍, 50㎍ 및 100㎍ 분량의 EM-800으로 치료한 동물에서 각각 0.08±0.03g, 0.03±0.01g 및 0.04±0.03g까지 감소하였다 (모든 EM-800 분량 대 E₁보충 OVX에서 P<.0001).

전술한대로, 항에스트로겐 EM-800을 일당 15㎍ 분량으로 경구투여하면 9.5개월 시점에서 에스트론-자극성 종양 성장이 87.5% 억제된다. DHEA를 세가지의 별개 복용량으로 부가 투여하여도, 항에스트로겐 EM-800을 일당 15㎍ 분량으로 복용했을 때 얻어지는 종양 크기의 현저한 억제에는 상당한 영향이 없다 (도 5B). 따라서 항에스트로겐만을 일당 15㎍ 분량으로 수용하거나 0.3, 1.0 및 3.0mg 분량의 DHEA와 배합하여 수용한 동물은, 에스트론-보충 대조군 마우스에서 나타나는 평균 종양 중량 1.12±0.26g으로부터 각각 0.08±0.03g(P<.0001), 0.11±0.04g(P=.0002), 0.13±0.07g(P=.0004) 및 0.08±0.05g(P<.0001)까지 그 중량이 극적으로 감소한다 (4그룹간 현저한 차이가 없다) (도 2B).

또한 상기 지적한 치료로써 얻어지는 반응의 카테고리를 측정하였다. 따라서 비록 통계적으로 유의한 수치는 아니지만 (P=.088), 진행하는 종양의 수를, 에스트론 보충의 대조군 OVX 동물에서의 87.5%로부터 일당 DHEA 복용량 0.3, 1.0 또는3.0mg으로 치료한 동물에서 각각 50.0%, 53.3% 및 66.7%까지, DHEA의 분량을 증가시키는 치료료써, 감소시켰다 (표 4). 반면 완전한 반응에서는, 일당 0.3, 1.0 및 3.0mg의 DHEA를 경피투여시, 에스트론-보충 마우스의 0%로부터 각각 28.6%, 26.7% 및 20.0%까지 증가하였다. 안정한 반응에서는, 반면, E₁-보충 대조군 마우스와 상기 지적한 복용량의 DHEA를 수용한 세개의 동물군에서 각각 12.5%, 21.4%, 20.0% 및 13.3%로 측정되었다. 난소절제 대조군 마우스에서, 완전, 일부 및 안정한 반응의 비율은 각각 68.8%, 6.2% 및 18.8%로 측정된 한편, 진행은 단지 6.2%의 종양에서 관찰되었다(표 2).

항에스트로겐 EM-800(P=.0006)을 단독으로(15㎍) 수용하거나 0.3mg, 1.0mg 및 3.0mg의 DHEA와 배합하여 수용한 동물에서 각각 29.4%, 33.3%, 26.7% 및 35.3%의 완전한 반응 또는 종양의 소멸을 얻었다(표 4). 반면에 동일한 군의 동물에서 각각 35.3%, 44.4%, 53.3% 및 17.6%의 진행이 보인다. EM-800 단독으로 치료하거나 DHEA와 배합하여 치료한 군들간에 상당한 차이는 존재하지 않는다.

DHEA 또는 EM-800 치료로 인해 종양의 중량에 따른 체중상에는 상당한 효과가 없었다. 에스트론을 이용한 OVX 마우스의 치료가, OVX 대조군 마우스의 자궁 중량을 28±5mg에서 132±8mg(P<.01)까지 증가시킨 한편 DHEA 복용량의 증가는 종양의 진행을 야기하나 최고 복용량의 DHEA 사용시 26%(P=.0008)에 이르는 비교적 작은 에스트론의 자극 효과 억제를 야기시켰다. 동일한 도면을 통해, EM-800을 일당 각각 15㎍, 50㎍ 또는 100㎍으로 경구 투여시 (총 P<.0001) 에스트론-보충 대조군마우스의 132±8mg으로부터 에스트론-자극성 자궁 중량이 49±3mg, 36±2mg, 및 32±1mg (모든 투여량 대 대조군에서 P<.0001)으로 감소하는 것을 볼 수 있다. 15 마이크로그램(15㎍)의 EM-800을 DHEA의 일당 투여량 0.3mg, 1.0mg 또는 3.0mg과 배합시, 자궁 중량은 각각 49±3mg, 59±5mg, 및 69±3mg으로 측정되었다.

반면, 에스트론을 이용한 치료시, OVX 동물 중 증가된 질의 중량은 14±2mg에서 31±2mg(P<.01)로, DHEA의 첨가로 인한 영향은 없었다. 그리고 나서, EM-800을 일당 15㎍, 50㎍ 또는 100㎍로 투여시킨 치료에 따라, 질의 중량은 각각 23±1mg, 15±1mg, 및 11±1mg까지 감소하였다 (모든 투여량 대 대조군에서 모든 p와 쌍방식 P<.0001). 투여량 0.3mg, 1.0mg 또는 3.0mg의 DHEA와 EM-800을 배합시, 질의 중량은 각각 22±1mg, 25±2mg, 및 23±1mg로 측정되었다 (모든 그룹 대 15㎍ EM-800에 대해 N.S.). 가장 높은 투여량, 즉 일당 100㎍ 이용시, EM-800은 에스트론-보충 OVX 동물의 자궁 중량을 OVX 대조군과 다르지 않은 수치까지 감소시키는 한편, 질의 중량은 OVX 대조군(P<.05)에서 측정되는 수치 이하로 떨어졌다. DHEA는 아마도 그 에스트로겐 효과로 인해, 자궁과 질의 중량에 대한 EM-800의 효과를 부부분적으로 상쇄시킨다.

누드 마우스 중 인간 ZR-75-1 유방암종 이종이식편의 반응(완전, 부분, 안정 및 진행)에 대한, 9.5개월간 DHEA의 경피 투여 또는 EM-800 단독의 경구 투여 또는 그 배합물의 투여 효과.

E₁=에스트론; DHEA-디하이드로에피안드로스테론; OVX=난소절제

실시예 2

안드로스텐-3β,17β-디올 (5-디올)은 고유한 에스트로겐 활성을 갖는다. 게다가, 이것은 성스테로이드 전구체로서, 말초 인트라크린 (intracrine) 조직 내에서 활성 안드로겐 및/또는 그밖의 에스트로겐으로 전환될 수 있다. 뼈의 질량에 미치는 5-디올 작용 중 안드로겐 성분 및 에스트로겐 성분의 상대적인 중요성을 평가하기 위해, 21주령의 래트를 난소절제하고 2, 5 또는 12.5mg의 5-디올을 단독으로 이용하여 일당 1회 경피 치료하거나 또는 플루타미드 (FLU, 10mg, sc. 일당 1회)및/또는 항에스트로겐 EM-800 (100μg, s.c., 일당 1회)과 배합하여 12개월간 치료하였다. 치료 11개월 후 뼈의 미네랄 밀도 (BMD: bone mineral density)를 측정하였다. 난소절제된 (OVX) 쥐들에서는 대퇴부 BMD가 12.8% 감소된 반면 (p<0.01), 최고 투여량의 5-디올로 치료된 군에서는 OVX 후 11개월 동안 손실된 대퇴부 BMD의 34.3%가 복구되었다 (p<0.01). FLU를 동시에 투여한 경우 대퇴부 BMD에 미치는 5-디올의 자극 효과가 완전히 억제된 반면 EM-800을 추가한 경우에는 5-디올을 단독으로 투여시켜 얻은 효과에 비해 28.4%의 부가적인 촉진이 초래되었다. 5-디올, FLU, 및 EM-800을 동시에 투여한 경우에는 단지 EM-800 (27%)의 효과만을 나타내었는데 이는 5-디올의 효과가 FLU에 의해 완전히 차단되었기 때문이다. 비록 12.5mg의 5-디올 단독, 12.5mg 5-디올 + EM-800 또는 5-디올 + FLU + EM-800을 투여시킨 OVX 쥐들에 있어서 요추골 BMD가 무손상(intact) 동물의 그것과 크게 다르지 않은 값으로 복구되었지만, 요추골의 BMD에 대한 필적할만한 결과를 얻었다. 조직형태학적 분석결과 뼈의 부피, 결체조직 섬유주 (trabecular)의 수 및 기부경골 골간단 대역 (proximal tibia metaphyseal area)의 2차 해면상 골주 분리에 미치는 억제 효과에 대한 5-디올의 자극 효과는 FLU에 의해 폐지되나, EM-800에 의해서는 더 증강된 것으로 나타났다. 5-디올을 이용한 치료로써 얻은 혈청 알칼리성 포스파타제의 현저한 촉진은 FLU의 동시 투여에 의해 57% (p<0.01대 12.5mg 5-디올 단독) 역전된다. 5-디올에 의한 치료는 소변 중 칼슘 대 크레아티닌의 비율에 있어서는 통계적으로 유의적인 억제 효과를 나타내지 못하였다. 최고 복용량의 5-디올은 혈청 콜레스테롤을 현저하게 23% (p<0.01) 감소시킨 반면 EM-800을 첨가시킨 경우 혈청콜레스테롤은 62%까지 감소하였다 (p<0.01). 본 발명의 수치는 뼈 형성에 미치는 5-디올의 자극 효과를 명백하게 보여주며 이는 비록 5-디올이 약 에스트로겐이지만, 뼈 형성에 미치는 그의 자극 효과는 주로 안드로겐 효과에 의해 매개됨을 시사하는 것이다. 뿐만 아니라, EM-800과 5-디올의 뼈 질량에 미치는 부가적인 자극 효과는 래트 중 항에스트로겐 EM-800의 뼈-절약 효과를 입증하는 것이다. 5-디올과 EM-800 두가지 모두의 콜레스테롤 저하 활성은 심장혈관 질환을 예방하는데 이용될 수 있다.

실시예 3

본 발명의 바람직한 화합물의 합성예

(S)-(+)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-(2"'-피페리디노에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 하이드로클로라이드 EM-01538 (EM652, HCl)의 합성

단계 A: BF₃·Et₂O, 톨루엔 100℃; 1시간.

단계 C: 3,4-디하이드로피란, p-톨루엔술폰산 모노히드레이트, 에틸 아세테이트; 질소 하 25℃, 16시간 및 이어서 이소프로판올 중에서 결정화.

단계 D, E 및 F:

(1) 피페리딘, 톨루엔 Dean & Stark 장치, 질소 하 환류; (2) 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운덱-7-엔, DMF, 3시간 환류;

(3) CH₃MgCl, THF, -20 내지 0℃, 이어서 실온에서 24시간;

단계 G, H: (1S)-(+)-10-캠포술폰산, 아세톤, 물, 톨루엔, 실온, 48시간.

단계 HH: 95% 에탄올, 70℃, 이어서 실온 3일간.

단계 HHR: 모액 리사이클링 및 단계 HH (S)-10-캠포술폰산의 세정, 환류: 36시간, 이어서 실온에서 16시간.

단계 I:

(1) DMF 수성, Na₂CO₃, 에틸 아세테이트;

(2) 에탄올, 희석 HCl;

(3) 물.

2-테트라하이드로피라닐옥시-4-히드록시-2'-(4''-테트라히드로피라닐옥시페닐)아세토페논 (4)의 합성.3,4-디하이드로피란 (218ml, 3.39 mole)과 에틸 아세테이트 (520ml) 중 2,4-디히드록시-2'-(4"-히드록시페닐)아세토페논 3 (97.6g, 0.4mole) (Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas)의 현탁액을 약 25℃에서 p-톨루엔술폰산 모노하이드레이트 (0.03g, 0.158mmole)로 처리하였다. 반응 혼합물을 외부로부터 가열하지 않으면서 약 16시간 동안 질소 하에서 교반하였다. 이어서 혼합물을 물 (100ml) 중 중탄산나트륨(1g) 및 염화나트륨 (5g)으로 세정하였다. 상들을 분리하고 유기상을 식염수 (20ml)로 세정하였다. 각 세정물을 50ml 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 모든 유기상을 결합시켜 황산나트륨을 통해 여과시켰다.

용매 (약 600ml)를 대기압하에서 증류시켜 제거하고 이소프로판올 (250ml)을 첨가하였다. 부가적인 용매 (약 300ml)를 대기압 하에서 증류시키고 이소프로판올 (250ml)을 첨가하였다. 부가적인 용매 (약 275ml)를 대기압 하에서 증류시키고 이소프로판올 (250ml)을 첨가하였다. 이 용액을 약 25℃에서 교반하면서 냉각시킨 다음 약 12시간 후에, 결정화 고체를 여과하고 이소프로판올로 세척하여 건조시켰다 (116.5g, 70%).

4-히드록시-4-메틸-2-(4'-[2"-피페리디노]-에톡시)페닐-3-(4"'-테트라하이드로피라닐옥시)페닐-7-테트라하이드로피라닐옥시-크로메인 (10)의 합성.Dean & Stark 장치를 이용하여 톨루엔 (8L) 중 2-테트라하이드로피라닐옥시-4-히드록시-2'(4"-테트라히드로피라닐옥시페닐)아세토페논4(1kg, 2.42mole), 4-[2-(1-피페리디노)에톡시]벤즈알데하이드5(594g, 2.55mole) (Chemsyn Sceicne Laboratories, Lenexa, Kansas로부터 입수함) 및 피페리딘 (82.4g, 0.97mole) (Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis로부터 입수함) 용액을 물 1 당량 (44ml)이 수집될 때까지 질소하에서 환류시켰다.

대기압 하에서 증류시킴으로써 용액으로부터 톨루엔 (6.5L)을 제거하였다.디메틸포름아미드 (6.5L)와 1,8-디아자비시클로[5,4,0]-운덱-7-엔 (110.5g, 0.726 mole)을 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 약 8시간 교반하여 챨콘(chalcone)8을 크로마논(chromanone)9로 이성화시킨 다음 물과 얼음 (8L) 및 톨루엔 (4L)의 혼합물에 첨가하였다. 상들을 분리시키고 톨루엔층을 물 (5L)로 세척하였다. 배합 수성상을 툴루엔 (3x4L)으로 추출하였다. 배합 톨루엔 추출물을 염수 (3x4L)로 세척하고, 대기압하에 5.5L까지 농축시킨 다음 -10℃로 냉각하였다.

질소 하에 교반과 함께 계속해서 외부냉각시면서, THF (2.5L, 7.5mole) (Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.로부터 구입) 중 메틸마그네슘 클로라이드 (2.5L, 7.5mole)의 3M 용액을 첨가하고 0℃ 미만의 온도로 유지시켰다. Grignard 시약을 모두 첨가한 후, 외부 냉각을 중단하고 혼합물을 실온으로 상승시켰다. 이 혼합물을 이 온도에서 약 24시간 교반시켰다.

이 혼합물을 다시 약 -20℃까지 냉각시키고 교반과 함께 외부냉각시키며, 포화암모늄 클로라이드 용액 (200ml)을 서서히 첨가하여 온도를 20℃ 미만으로 유지시켰다. 이 혼합물을 2시간 교반한 다음 포화 암모늄 클로라이드 용액 (2L)과 톨루엔 (4L)을 첨가하여 5분간 교반하였다. 상들을 분리하고 수성층을 톨루엔으로 추출하였다 (2x4L). 용액이 균질해질 때까지 배합 톨루엔 추출물을 묽은 염산으로, 이어서 염수 (3x4L)로 세정하였다. 톨루엔 용액이 최종적으로 대기압 하에 2L가 될 때까지 농축시켰다. 이 용액을 다음 단계에 직접 사용하였다.

(2R,S)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-[2"'-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캠포술폰산염(±12)의 합성.

4-히드록시-1-메틸-2-(4'-[2"-피페리디노]-에톡시)-페닐-3-(4"-테트라하이드로피라닐옥시)페닐-7-테트라하이드로피라닐옥시크로만 (10)의 톨루엔 용액에 아세톤 (6L), 물 (0.3L), 및 (S)-10-캠포술폰산 (561g, 2.42mole) (Aldrich Chemical Company Inc, Milwaukee, Wis로부터 구입)을 첨가하였다. 이 혼합물을 질소 하 48시간 동안 교반 후 고체 (2R,S)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-[2"'-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캠포술폰산염 (12)를 여과하고 아세톤으로 세척한 다음 건조시켰다 (883g). 이 물질을 다음 (HH) 단계에서 추가 정제하지 않고 사용하였다.

(2S)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-[2"'-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캠포술폰산염 (13, (+)-EM-652 (1S)-CSA염)의 합성.95% 에탄올 중 (2R,S)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-[2"'-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-벤조피란 (1S)-10-캠포술폰산염 ±12 (759g)의 현탁액을 고체가 용해될 때까지 약 70℃로 교반가열시켰다. 이 용액을 교반하면서 실온으로 냉각시킨 다음 (2S)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-[2"'-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캠포술폰산염 13의 결정 몇개를 시드(seed)하였다. 이 용액을 총 약 3일간 실온에서 교반하였다. 결정을 여과하고 95% 에탄올로 세척한 다음 건조시켰다 (291g, 76%). 생성물의 de는 94.2%였고 순도는 98.8%였다.

(S)-(+)-7-히드록시-3-(4'-히드록시페닐)-4-메틸-2-(4"-(2"'-피페리디노에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 하이드로클로라이드 EM-01538 (EM-652, HCl)의 합성.디메틸포름아미드 (11μL, 0.15mmol) 중 화합물 13 (EM-652 (+)-CSA염, 500mg, 0.726mmol)의 현탁액을 0.5M의 탄산나트륨 수용액 (7.0ml, 3.6mmol)으로 처리하고 15분간 교반하였다. 현탁액을 에틸 아세테이트 (7.0ml)로 처리하고 4시간 동안 교반하였다. 이어서 유기상을 탄산나트륨 포화수용액 (2x5ml) 및 염수 (1x5ml)로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 에탄올 (2ml) 중 얻어진 분홍색 포말 (EM-652)을 2N 염산 (400μL, 0.80mmol)으로 처리하고 1시간 교반한 다음 증류수 (5ml)로 처리하고 30분간 교반하였다. 얻어진 현탁액을 여과하고, 증류수 (5ml)로 세척한 후, 공기 및 고진공 하에서 건조시켜 (65℃) 크림상 분말 (276mg, 77%)을 얻었다: 미세한 회백색 분말: 주사열량계: 용융 피크는 219℃에서 개시됨,

실시예 4

물질 및 방법

동물

18-20g의 암컷 BALB/c 마우스(BALB/cAnNCrlBR)를 Charles-River, Inc.(St-Constant, Quebec, Canada)에서 구입하고 조절된 환경 - 온도(23±1℃) 및 빛(12시간 일광/일, 일광 개시 7:15)으로 우리당 5마리씩 사육하였다. 마우스에게는 설치류 사료와 임의로 수돗물이 공급된다. 동물들을 이소플루란 마취하에 양측 절개를 거쳐 난소절제(OVX)하고 임의로 10마리 군으로 배분하였다. 10 마우스는 대조군으로서 무손상 유지시켰다.

치료

첫번째 실험에서 (도 12 내지 15), 실험 화합물, 즉 EM-652.HCl, 라소폭시펜(무염기(free base); 활성과 비활성 에난티오머)과 랄록시펜을, 난소절제 후 2일째를 시작으로, 일당 1회 1, 3 또는 10㎍/동물의 분량으로 9일간 위관 영양에 의해 경구 투여하였다. 두번째 실험에서 (표 3), TSE 424를, 난소절제 후 2일째를 시작으로, 일당 1회 1, 3, 10 또는 30㎍/동물의 분량으로 9일간 위관 영양에 의해 경구 투여하였다. 양 실험에서, 항에스트로겐 활성을 평가하기 위해 난소절제-후 5일째에 에스트론을 이용한 치료를 시작하였고 (E₁, 0.06㎍, s.c. 주사, 일당 2회) 6일-간 투여시켰다. 화합물을 에탄올에 용해시키고 (최종 농도 4%) 0.4% 메틸셀룰로스 중에 투여하였다. 무손상 마우스와 OVX 대조군은 9일간 매체 (4% ETOH-0.4% 메틸셀룰로스)만을 수용하였다. 난소절제 후 11일째 아침에 복부 대동맥 방혈에 의해 동물을 치사시켰다. 자궁과 질을 신속히 절개하고 칭량하였으며 추가의 조직학 연구를 위해 10% 완충 포르말린에 보관하였다.

결과

실험 1:

도 12에 묘사한대로, 일당 1㎍, 3㎍ 및 10㎍ 분량의 EM-652.HCl을 경구 투여하면 에스트론-자극성 자궁 중량의 억제 (모든 분량 대 대조군에서 p<0.01)가 각각 24%, 48% 및 72% 초래되는 한편 동일 분량의 랄록시펜 투여시 이 변수는 각각 6%(NS), 14%(p<0.01) 및 43%(p<0.01) 억제되었다. 라소폭시펜(무염기)은, 반면, 가장 낮은 분량으로 이용시 억제 효과가 없는 반면 3㎍과 10㎍을 일당 투여했을 때 에스트론-자극성 자궁 중량을 각각 25%(p<0.01)와 44%(p<0.01) 억제하였다. 라소폭시펜의 불활성 에난티오머는 어떠한 분량으로 이용해도 이 변수에 자극 효과를 발휘하지 않았다.

상기 언급한 화합물들은 질의 중량에 대해서도 유사한 효과를 나타내었다. EM-652.HCl의 일당 경구 투여는 복용량 1㎍, 3㎍ 및 10㎍에서 각각 질 중량의 10%(NS), 25% 및 53% 억제를 나타낸 한편 (도 13) 랄록시펜은 단지 가장 높은 복용량(10㎍)에서 이 변수에 대해 현저한 24%(p<0.01)의 억제 효과를 발휘하였다. 랄록시펜과 유사하게, 라소폭시펜(무염기)은 단지 가장 높은 복용량에서 현저한 37%(p<0.01)의 억제 효과를 초래한 반면 불활성 에난티오머는 어떠한 분량으로 이용해도 질의 중량에 자극 효과를 갖지 않았다.

난소절제 마우스에 일당 경구 투여량 1㎍과 10㎍의 화합물만을 (에스트론 부재) 투여시, EM-652.HCl은 양 복용량에서 모두 자궁 중량에 대한 현저한 자극 효과를 나타내지 못했고, 반면 10㎍의 라소폭시펜과 랄록시펜 치료는 각각 자궁 중량에 93%(p<0.01) 및 85%(p<0.01) 자극을 야기함으로써 (도 14) 이 변수에 대한 이들 후자 화합물들의 에스트로겐 효과를 표시하였다. 유사하게, EM-652.HCl은 질의 중량에 현저한 자극 효과를 내지 못한 (도 15) 반면 10㎍의 라소폭시펜과 랄록시펜의투여는 질의 중량에 각각 73%(p<0.01)와 56%(p<0.01)의 자극을 초래하였다. 반면, 라소폭시펜의 불활성 에난티오머는 자궁과 질의 중량에 자극 효과를 발휘하지 못했다.

실험 2:

표 3에 표시한대로, TSE 424를 일당 경구 복용량 1㎍, 3㎍, 10㎍ 또는 30㎍을 투여함으로써 각각 에스트론-자극성 자궁 중량의 12%(NS), 47%, 74% 및 94% 억제를 야기시켰다 (3개의 가장 높은 복용량 대 E₁-대조군에 대해 p<0.01). 반면 TSE 424를 3㎍, 10㎍ 또는 30㎍의 복용량으로 일당 경구 투여하면 질의 중량은 각각 16%(NS), 56%(p<0.01) 및 93%(p<0.01) 억제되었다.

난소절제 마우스에 일당 경구 투여량 3㎍과 30㎍의 화합물만을 (에스트론 부재) 투여시, TSE 424은 양 복용량에서 모두 자궁과 질의 중량에 대한 현저한 자극 효과를 나타내지 못했다 (표 3).

에스트론과의 동시 치료 또는 에스트론의 부재하에, 난소절제 마우스에 TSE 424의 농도를 증가시키며 9일간 경구 투여시킨 결과 자궁과 질의 중량에 미치는 효과.

실시예 5

5A: 뼈 손실, 혈청 지질 및 총 체지방에 대한 예방 효과

동물 및 치료

치료 시작 시점에서 약 220-270g으로 칭량된 10 내지 12주령의 암컷 Sprague-Dawley 래트(Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada)를 이용하였다. 실험을 시작하기 전 적어도 1주간 주위 조건 (온도: 22±3℃; 습도: 50±20%; 12-시간 광주기-12-시간 암주기, 일광 개시 07:15h)에 동물을 순응시켰다. 동물들을 개별적으로 수용하고, 수돗물과 공인된 펠릿화 설치류 사료 (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO)에의 자유로운 접근이 가능하도록 하였다. 실험용 동물의 보호와 이용에 관한 Canadian Council on Animal Care(CCAC) 가이드에 따라서, CCAC와 Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)가 승인한 동물 설비에서 실험을 수행하였다.

첫번째 실험에서, 154마리의 래트를 다음과 같이 14마리로 구성된 11군으로 무작위 분배하였다: 1)무손상 대조군; 2)OVX 대조군; 3)OVX + E₂(1mg/kg); 4)OVX + EM-652.HCl (2.5mg/kg); 5)OVX + E₂+ EM-652.HCl; 6)OVX + 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA; 80mg/kg); 7)OVX + DHEA + EM-652.HCl; 8)OVA + DHEA +E₂; 9)OVX + DHEA + E₂+ EM-652.HCl; 10)OVX + GW 5638; 11)OVX + E₂+ GW 5638. 연구 1일째, 적절한 군의 동물을 취해 이소플루란 마취하에 양측 난소절제(OVX)하였다. DHEA를 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜 용액으로 등쪽 피부에 국소 적용하는 한편, 그밖의 실험 화합물들은 0.4% 메틸셀룰로스 현탁액으로 경구 위관영양에 의해 투여하였다. 연구 2일째에 치료를 개시하고 3개월 동안 일당 1회 실행하였다.

두번째 실험에서, 132마리의 래트를 다음과 같이 14 또는 15마리로 구성된 9군으로 무작위 분배하였다: 1)무손상 대조군; 2)OVX 대조군; 3)OVX + 프레마린 (0.25mg/kg); 4)OVX + EM-652.HCl (2.5mg/kg); 5)OVX + 프레마린 + EM-652.HCl;6)OVX + TSE 424 (2.5mg/kg); 7)OVX + 프레마린 + TSE 424; 8)OVX + 라소폭시펜 (타르트레이트염; 라세메이트; 2.5mg/kg); 9)OVX + 프레마린 + 라소폭시펜. 연구 1일째, 적절한 군의 동물을 취해 이소플루란 마취하에 양측 OVX하였다. 실험 화합물들은 0.4% 메틸셀룰로스 현탁액으로 경구 위관영양에 의해 투여되었다. 연구 2일째에 치료를 개시하고 26주 동안 일당 1회 실행하였다. 양 실험에서, 실험물을 수용하지 않는 동물들은 동일 기간 동안 단지 적절한 매체만으로 치료되었다.

뼈의 미네랄 밀도 측정

치료 3개월(실험 1) 후 또는 26주(실험 2) 후에, 이중 에너지 X-레이 흡수기 (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA)와 Regional High Resolution Scan 소프트웨어를 이용하여, 이소플루란 마취하에, 개별적인 래트의 총 체골격 및 요추골을 스캔하였다. 요추골 (vertebrae L2 내지 L4)의 뼈의 미네랄 밀도(BMD)와 총 신체 조성 (지방 백분율)을 측정하였다.

혈청 분석

치료 3개월(실험 1) 후 또는 26주(실험 2) 후에, 1박 절식한 동물의 경정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다 (이소플루란 마취). 혈청 제조를 위해 샘플을 처리하고, 분석시까지 -80℃에서 냉동시켰다. Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 분석기 (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)를 이용하여 혈청 콜레스테롤 수치와 알칼리성 포스파타제 활성(ALP)을 측정하였다.

통계적 분석

수치는 평균치±SEM으로 표시하였다. Duncan-Kramer (Kramer CY; Biometrics1956; 12:307-310)의 다중-범위 시험에 따라서 통계적 유의성을 평가하였다.

결과

표 4에 표시한대로, 난소절제 3개월 후, OVX 대조군 동물 중 요추골의 BMD는 무손상 대조군보다 10% 낮아졌다 (p<0.01). 사용 분량에서 에스트라디올과 EM-652.HCl의 단독 투여가 요추골의 BMD 손실을 각각 98%(p<0.01) 및 65%(p<0.05)까지 억제한 한편, E₂와 EM-652.HCl의 공동 치료는 요추골 BMD의 OVX-유발성 감소를 61%(p<0.05)까지 억제하였다. 반면, DHEA의 단독 투여로 요추골 BMD가 43%(p<0.05)까지 억제된 한편, DHEA + E₂+ EM-652.HCl의 공동 치료는 요추골 BMD 중 OVX-유발성 감소를 91%까지 억제하며 BMD 수치가 무손상 대조군과 다르지 않게 하였다.

표 5에서, 난소절제 26주 후, 요추골의 BMD는 무손상 대조군과 비교하여 18% 낮아졌다 (p<0.01). 프레마린, EM-652.HCl, TSE 424와 라소폭시펜의 단독 투여는 요추골 BMD를 각각 54%, 62%, 49% 및 61% (모두 p<0.01 대 OVX 대조군)까지 억제하였다. EM-652.HCl, TSE 424 또는 라소폭시펜에 프레마린을 첨가시켜 얻은 요추골 BMD의 수치는, 각각의 SERM을 단독으로 투여시켜 얻은 수치와 현저하게 다르지 않다 (표 5). 유사하게, E₂또는 EM-652.HCl에 DHEA를 첨가하면 요추골 BMD 중 OVX-유발성 감소가 완전히 억제된다 (표 4). 또한 BMD에 대한 DHEA의 정효과는 혈청 알칼리성 포스파타제 활성(ALP), 뼈 형성의 지표 및 턴오버에 대한 그 효과에 의해 지속된다. ALP 활성은 OVX 대조군 동물의 73±6 IU/L로부터, DHEA-, DHEA + EM-652.HCl-, DHEA + E₂- 및 DHEA + E₂+ EM-652.HCl-처리 동물에서 각각 224±18IT/L, 290±27 IT/L, 123±8 IT/L 및 261±20 IT/L까지 증가하였고, 따라서 뼈 형성에 대한 DHEA의 자극 효과를 시사한다 (표 6).

뼈 손실에 대한 억제 효과에 추가하여, EM-652.HCl, TSE 424, 라소폭시펜, GW 5638, DHEA 및 E₂의 투여는 총 체지방의 비율과 혈청 지질상에 몇몇 이로운 효과를 발휘한다. 난소 절제 3개월 후, 총 체지방은 22%까지 증가하였다 (p<0.05; 표 6). EM-652.HCl의 투여로 OVX-유발성 지방 비율의 증가가 완전히 억제된 한편 SERM에 DHEA 및/또는 E₂를 첨가시켜 지방 비율 수치를 무손상 대조군 동물에서보다 낮출 수 있다. 난소절제 26주 후, 에스트로겐 결핍으로 유발된 40%의 지방 증가는, 프레마린, EM-652.HCl, TSE 424 또는 라소폭시펜의 투여로 각각 74%, 78%, 75% 및 114%까지 역전된 반면, 각 SERM에 프레마린을 첨가시키면 OVX-유발성 지방 비율의 증가를 완전히 억제할 수 있다 (표 7).

표 6에 표시된대로, 난소절제 3개월 후, 무손상 대조군과 비교하여 혈청 콜레스테롤 수치의 22% 증가가 OVX 대조군 래트에서 관찰되었다 (p<0.01). 사실상, 혈청 콜레스테롤은 무손상 동물의 2.01±0.11mmol/L에서 OVX 대조군의 2.46±0.08mmol/L까지 증가하였다. E₂또는 DHEA를 단독으로 투여시 혈청 콜레스테롤 수준은 각각 1.37±0.18mmol/L 및 1.59±0.10mmol/L까지 감소한 한편, EM-652.HCl을 단독으로 투여하거나 E₂및/또는 DHEA와 공동으로 투여시 무손상 동물에서 관찰된 것 (2.01±0.11mmol/L)보다 콜레스테롤 수준은 현저히 낮아졌다 (0.65 내지 0.96mmol/L). 유사하게, GW 5638, TSE 424 및 라소폭시펜을 단독으로 투여하거나 E₂또는 프레마린과 공동 투여한 경우 혈청 콜레스테롤 수준에 대한 OVX-유발성 증가를 완전히 억제하였으며, 무손상 동물에서 관찰된 것보다 그 수치를 낮추었다 (표 6과 7).

난소절제된 암컷 래트에 에스트라디올, EM-652.HCl, GW 5638 또는 DHEA을 단독으로 또는 공동 투여시, 3개월 치료 이후, 뼈 손실에 대한 억제 효과.

난소절제된 암컷 래트에 프레마린, EM-652.HCl, TSE 424 또는 라소폭시펜을 단독으로 또는 공동 투여시, 26주 치료 이후, 뼈 손실에 대한 억제 효과.

난소절제된 암컷 래트에 에스트라디올, EM-652.HCl, GW 5638 또는 DHEA을 단독으로 또는 공동 투여시, 3개월 치료 이후, 총 체지방 비율, 혈청 콜레스테롤 수준 및 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 효과.

난소절제된 암컷 래트에 프레마린, EM-652.HCl, TSE 424 또는 라소폭시펜을 단독으로 또는 공동 투여시, 26주 치료 이후, 총 체지방 비율, 혈청 콜레스테롤 수준 및 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 효과.

5B: 뼈 손실과 총 체지방에 대한 치료 효과

동물 및 치료

이 실험에 8 내지 9월-령의 암컷 Sprague-Dawley 래트(Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada)를 이용하였다. 난소절제에 앞서 적어도 1주간 주위 조건 (온도: 22±3℃; 습도: 50±20%; 12-시간 광주기-12-시간 암주기, 일광 개시 07:15h)에 동물을 순응시켰다. 이소플루란 마취하에 동물을 양측 난소절제(OVX)하였다. 20마리의 동물은 무손상 대조군으로서 남겨두었다. 동물들을 개별적으로 수용하고, 수돗물과 공인된 펠릿화 설치류 사료 (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO)에의 자유로운 접근이 가능하도록 하였다. 실험용동물의 보호와 이용에 관한 Canadian Council on Animal Care(CCAC) 가이드에 따라서, CCAC와 Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)가 승인한 동물 설비에서 실험을 수행하였다.

OVX 10주 후, 139마리의 래트를 다음과 같이 각 17 내지 20마리로 구성된 8군으로 무작위 분배하였다: 1)무손상 대조군; 2)OVX 대조군; 3)OVX + E₂(1mg/kg); 4)OVX + EM-652.HCl (2.5mg/kg); 5)OVX + E₂+ EM-652.HCl; 6)OVX + 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA; 80mg/kg); 7)OVX + DHEA + EM-652.HCl; 8)OVA + DHEA + EM-652.HCl + E₂. DHEA를 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜 용액으로 등쪽 피부에 국소 적용하는 한편, E₂와 EM-652.HCl은 0.4% 메틸셀룰로스 현탁액으로 경구 위관영양에 의해 투여하였다. 난소절제 10주 후 치료를 개시하고 26주 동안 일당 1회 실행하였다. 실험물을 수용하지 않는 동물들은 동일 기간 동안 단지 적절한 매체만으로 처리되었다.

뼈의 미네랄 밀도 측정

OVX 이전, 치료 1일째 이전과 (OVX 10주 후) 치료 26주 이후에, 이중 에너지 X-레이 흡수기 (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA)와 Regional High Resolution Scan 소프트웨어를 이용하여, 이소플루란 마취하에, 개별적인 래트의 총 체골격, 요추골 및 오른쪽 대퇴부를 스캔하였다. 요추골 (vertebrae L2 내지 L4)과 대퇴부의 뼈 미네랄 밀도(BMD)와 총 신체 조성 (지방 백분율)을 측정하였다.

통계적 분석

수치는 평균치±SEM으로 표시하였다. Duncan-Kramer (Kramer CY; Biometrics 1956; 12:307-310)의 다중-범위 시험에 따라서 통계적 유의성을 평가하였다.

결과

상기 기술한 이전 연구에서는 (실시예 5A), 뼈 손실에 대한 억제 효과를 연구하기 위해 OVX와 동시에 실험 화합물의 투여를 개시하였다. 본 연구에서는 투여 치료의 가능한 치료 효과를 연구하기 위해 실험 화합물의 투여를 OVX 10주 후에 개시하였다. 치료 개시 전 골감소증의 여부를 확인하기 위해, OVX (베이스라인 수치) 이전과 치료 시작 이전의 BMD를 측정하였다. 도 16에 표시한대로, 요추골의 BMD는 난소절제 10주 후 8%까지 낮아졌고, 추가로 동물이 매체(대조군)만을 수용하는 기간인 OVX 이후 추가의 26주에 이어 12%까지 떨어졌다. 26주간 골감소증이 확인된 동물에 E₂, EM-652.HCl, E₂+ EM-652.HCl, DHEA 또는 DHEA + EM-652.HCl를 일당 투여하면 OVX 대조군 동물에서 관찰되는 요추골 BMD의 추가적인 감소가 완전히 억제되는 한편, E₂+ EM-652.HCl + DHEA를 투여시킴으로써 BMD 수치는 치료 개시 이전에 관찰된 것보다 약간 높아졌다. 반면, 도 17에 묘사된대로, 대퇴부 BMD는 난소절제 10주 후 4%까지 낮아졌고, 매체만을 이용한 추가의 26주 치료에 이어서 추가로 6%까지 떨어졌다. 요추골 BMD와 유사하게, E₂, EM-652.HCl, E₂+ EM-652.HCl, DHEA 또는 DHEA + EM-652.HCl를 26주간 일당 투여하면, OVX 대조군 동물에서 관찰되는 대퇴부 BMD의 추가 감소가 완전히 억제되었다. 반면, E₂+ EM-652.HCl + DHEA의 투여로 인해 대퇴부 BMD 수치는 OVX 이전에 관찰된 것보다 오히려 약간 높아졌고, 이것은 뼈 형성에 대한 상기 공동 치료의 이로운 효과를 시사한다. E₂+ EM-652.HCl + DHEA를 이용한 공동 치료는 골감소증 동물에서 추가적인 OVX-유발성 뼈 손실을 완전히 억제할 뿐 아니라 상당한 치료 효과 또한 제공한다.

뼈에 대한 효과에 더하여, 도 18에 묘사된대로, DHEA, E₂및/또는 EM-652.HCl의 투여는 총 체지방의 OVX-유발성 증가를 억제하였다. 사실상, OVX 대조군 동물에서, 지방 백분율은 난소절제 10주 후 47%까지 증가하였고 매체 (대조군)만을 이용한 치료 26주 동안 추가로 17%까지 증가하였다. E₂, DHEA, EM-652.HCl, E₂+ EM-652.HCl 또는 DHEA + EM-652.HCl를 26주간 일당 투여함으로써 OVX 대조군에서 관찰된 17% 증가를 억제하였다. 반면, E₂+ EM-652.HCl + DHEA를 이용한 공동 치료는 OVX의 효과를 완전히 역전시키고 지방 백분율 수치를 난소절제 이전의 동물에서 발견된 수치와 유사하게 하였으며, 따라서 이는 상기 치료의 치료 효과를 보여주는 것이다.

실시예 6

인간 자궁내막의 선암종 이시가와 세포내에서 알칼리성 포스파타제의 활성에 대한 본 발명이 화합물의 효과

물질

보존 세포 배양액의 관리

잘 차별화된 자궁내막 선암종으로부터 유래되는 인간의 이시가와 세포 라인은 Dr. Erlio Gurpide, The Mount Sinai Medical Center, New York, NY에 의해 제공된다. 이시가와 세포는 통상적으로, 5%(vol/vol) FBS (소의 태아 혈청)를 포함하는 이글스 미니멈 에센셜 미디움(Eagle's Minimum Essential Medium(MEM))에 보존되고 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 0.1mM 비-필수 아미노산 용액이 보충된다. 37℃에서 1.5x10⁶세포의 농도로 팔콘(Falcon) T75 플라스크에 세포를 평판하였다.

세포 배양 실험

실험 개시 24시간 전에 유사 융합성 이시가와 세포의 배지를 페놀 레드-프리 햄즈(red-free Ham's) F-12와, 100U/ml 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민 및 내생성 스테로이드를 제거하기 위해 덱스트란-코팅된 챠콜로 두번 처리한 5% FBS를 보충시킨 둘벡코(Dulbecco's)의 변형된 이글스 배지(DMEM)의 1:1(v/v) 혼합물로 구성된 신선한 무-에스트로겐 기부 배지(EFBM)로 대신하였다. 그 다음 0.1% 판크레아틴(Sigma)과 0.25mM HEPES에 의해 세포를 회수하고 EFBM에 재현탁시킨 다음 100㎕의 부피로 2.2x10⁴세포/웰의 농도에서 팔콘 96웰의 바닥이 평평한 마이크로티터(microtiter) 플레이트에 평판시켜 24시간 동안 플레이트의 표면에 부착되게 하였다. 그 후에, 지시된 화합물의 농도를 포함하는 최종 부피 200㎕의 신선한 EFBM으로 배지를 교환하였다. 48시간 후 배지를 교환하고 5일동안 세포를 배양하였다.

알칼리성 포스파타제의 분석

배양 종료시, 마이크로티터 플레이트를 거꾸로 하여 성장 배지를 따라내었다. 플레이트를 충분한 PBS(0.15M NaCl, 10mM 소듐 포스페이트, pH 7.4) 200㎕로 세척하였다. 그 다음 약간의 잔여 PBS를 조심스럽게 남기면서 플레이트로부터 PBS를 제거하고 세척 공정을 한번 반복하였다. 완충 살린을 따라내고, 뒤집은 플레이트에서 종이 타월로 조심스럽게 빨아들였다. 커버를 교체한 다음, 플레이트를 -80℃에 15분간 두고 이어서 실온에서 10분간 해빙시켰다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 5mM p-니트로페닐 포스페이트, 0.24mM MgCl₂및 1M 디에탄올아민(pH 9.8)을 포함하는 50㎕의 빙-냉 용액을 첨가시켰다. 그 다음 플레이트를 실온까지 가온하고, p-니트로페닐로 인한 노란색이 전개되도록 하였다(8분). 효소 면역 측정의 플레이트 리더(BIO-RAD, 모델 2550 EIA Reader) 중 405nm에서 플레이트를 모니터링하였다.

계산

가중평균 반복의 비선형 제곱 회귀(weighted interative nonlinear squares regression)를 이용하여 IC₅₀과 복용량-반응 곡선을 산출하였다.

^*1nM E₂의 자극 % =

OD 405nm 화합물-OD 405nm 기부/OD 405nm 1nM E₂-OD 405nm 기부

또한 Labrie 외 참조, EM-652(SCH 57068), 유방선과 자궁내막에서 순수한 항에스트로겐으로서 작용하는 3차 발생 SERM, J.Steroid Biochem and Mol. Bio. 69, 51-84, 1999.

실시예 7

인간의 유방암 MCF-7 세포의 증식에 대한 EM-652.HCl, TSE 424 및 라소폭시펜의 효과

방법:

보존 세포 배양액의 관리

패시지(passage) 147에서 American Type Culture Collection #HTB 22으로부터 인간의 MCF-7 유방암 세포를 얻었고 레드-프리 둘벡코(Dulbecco's)의 변형된 이글스-햄즈(Eagle's-Ham's) F12 배지, 상기 언급한 보충물과 5% FBS에서 통상적으로 성장시켰다. 코카서스 69-연령 여성 환자의 늑막 유출물로부터 인간의 MCF-7 유방 선암종 세포 라인을 유래시켰다. MCF-7 세포는 패시지 148 내지 165에서 이용하였으며 매주 2차 배양하였다.

세포의 증식 실험

늦은 대수증식기상의 세포를 0.1% 판크레아틴(Sigma)을 이용하여 회수하고 50ng 소의 인슐린/ml과 내생성 스테로이드를 제거하기 위해 덱스트란-코팅된 챠콜로 2회 처리한 5%(v/v) FBS를 포함하는 적절한 배지에 재현탁시켰다. 세포를 지시된 농도로 24-웰 팔콘 플라스틱 배양 플레이트(2cm²/웰)에 평판시켜 24시간 동안 플레이트의 표면에 부착되게 하였다. 그 다음 E₂의 존재 또는 부재하에 99% 재증류된 에탄올 중 1000 x 보관 용액으로부터 희석시켜 얻은 지시된 농도의 화합물을 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. 대조군 세포는 단지 에탄올 매체 (0.1% EtOH, v/v)만을 수용한다. 2- 또는 3-일 간격으로 배지를 교환하면서 특정한 기간동안 세포를 배양하였다. DNA 함량을 측정하여 세포의 수를 결정하였다.

계산 및 통계적 분석

가중평균 반복의 비선형 제곱 회귀를 이용하여 IC₅₀수치와 복용량-반응 곡선을 산출하였다. 모든 결과는 평균치±SEM으로 표현한다.

실험 1

명	코드명	실험 화합물에 의한 DNA의 최대 자극	실험 화합물에 의한 DNA의 1nM E₂자극의 억제
		1nM E₂자극 %^*	IC₅₀(nM)
EM-652.HCl	EM-652.HCl;EM-1538	N.S.	0.796
TSE 424	EM-3527	N.S.	3.68

실험 2

명	코드명	실험 화합물에 의한 DNA의 최대 자극	실험 화합물에 의한 DNA의 1nM E₂자극의 억제
		1nM E₂자극 %^*	IC₅₀(nM)
EM-652.HCl	EM-652.HCl;EM-1538	N.S.	0.205
라소폭시펜(무염기)	EM-3114	N.S.	0.379

실시예 8

누드 마우스에서 인간의 ZR-75-1 유방암종의 생장에 대한 EM-652.HCl, 타목시펜, 토레미펜, 드롤록시펜, 이독시펜, GW-5638 및 랄록시펜의 효과 비교

이 실시예의 목적은, 잘-특성화된 에스트로겐-감응성 ZR-75-1 유방암 이종이식편의 생장에 대한, 난소절제 누드 마우스 중 EM-652.HCl과 그밖의 6개 경구용 항에스트로겐(SERMs)의 촉진 효과 및 길항 효과를 비교하기 위한 것이다.

물질 및 방법

인간의 ZR-75-1 유방암 세포

인간의 ZR-75-1 유방암 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD)로부터 구입하였으며, 무-페놀 레드 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. 이 세포에 2mM L-글루타민, 1mM 소듐 피루베이트, 100 IU 페니실린/ml, 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml, 및 10% 소태아혈청을 보충시켜 95% 공기/5% CO₂의 습윤 대기 하 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 매주 이송하여 0.083% 판크레아틴/0.3mM EDTA를 이용한 85-90% 융합으로 회수하였다.

동물 및 종양 접종

호모 접합체성의 암컷 nu/nu Br 무흉선 마우스(28- 내지 42-일령)를 Charles River, Inc.(Saint-Constant, Quebec, Canada)로부터 구입하였다. 마우스(우리 당 5마리)를 에어필터 덮개가 있는 비닐 우리 안에 수용하였고, 이것을 판상 에어 플로우 후드내 광원-한정적 조건 하에서 유지시켰다. 광주기는 광주기 12시간과 암주기 12시간이다 (일광 개시 7:15). 우리, 깔개, 및 사료 (Agway Pro-Lab R-M-H Diet #4018)는 사용 전에 오토클레이브 처리되었다. 물은 오토클레이브 처리하여 임의 제공한다. 이소플루란-유발성 마취하에 양측 난소절제를 수행하였다. 난소절제시, 초기 종양 생장을 촉진하기 위해 에스트라디올(E₂)의 이식편을 피하로 삽입하였다. E₂이식편은, 에스트라디올과 콜레스테롤의 1:10(w/w) 혼합물의 0.5cm를 포함하는 1cm-길이 실래스틱 튜브 (내부직경: 0.062인치; 외부직경: 0.095인치)로 제조되었다. 난소절제 1주일 후, 2 x 10 6 ZR-75-1 (패시지 93) 세포를 RPMI-1640 배지 + 30% 마트리겔로 2.5cm-길이 20-게이지 바늘을 통해 각 난소절제(OVX) 마우스의 양옆구리상에 피하 접종하였다 4주 후, 모든 동물에서 E₂이식편을 동일한 크기의 에스트론-함유 이식편으로 대신하였다 (E1:chol, 1:25, w/w). 1주 후 임의화 및 치료를 시작하였다.

치료

치료 개시 하루 전날, 평균 면적 24.4±0.4mm²(범위 5.7 내지 50.7mm²)의 ZR-75-1 종양을 갖는 마우스 255마리를 17군(종양 크기에 따라서)으로 임의 할당하였고, 이 때 각 군은 15마리로 구성된다 (총 29 또는 30 종양). 17군은 두개의 대조군 (OVX와 OVX + 에스트론), 에스트론 이식편을 추가하고 항에스트로겐으로 치료한 7개군 및 항에스트로겐만을 수용한 그밖의 8개군을 포함한다. 그 다음 난소절제 대조군(OVX)과 항에스트로겐만을 수용한 군의 동물로부터 에스트론 이식편을 제거하였다. 그 후 매 6주마다 다른 9개군의 에스트론-함유 이식편을 교환하였다.Oncology and Molecular Endocrinology Research Center의 의약화학부에서 EM-652.HCl, 랄록시펜, 드롤록시펜, 이독시펜 및 GW 5638을 합성하였다. 타목시펜을 Plantex (Netanya, Israel)로부터 구입하고 토레미펜 시트레이트는 Orion (Espoo, Finland)에서 구입하였다. 에스트론 자극하에, 일당 경구 투여량 50㎍ (2mg/kg, 평균)의 항에스트로겐을 0.4%(w/v/) 메틸셀룰로스의 0.2ml에 현탁시켜 공급하였다. 에스트론 자극 없이, 각 항에스트로겐 200㎍(8mg/kg, 평균)을 일당 1회 경구 투여함으로써 동물을 치료하였다. 양 대조군의 동물들은 0.2ml의 매체만을 수용하였다. 적절한 농도의 항에스트로겐 현탁액을 매달 제조하고, 4℃에 보관하였으며, 일정한 교반하에 이용하였다. 분말의 보존배양을 밀봉하여 4℃(이독시펜, 랄록시펜, 토레미펜, GW 5638, 드롤록시펜) 또는 실온 (타목시펜, EM-652.HCl)에 보관하였다.

종양 측정 및 검시

두개의 수직 직경을 기록하고 종양 면적(mm²)을 식: L/2 x W/2 x π으로 계산하였다. 치료 첫날 측정된 면적을 100%로 하였다.

치료 161일 후, 남아있는 동물을 이소플루란으로 마취하고 방혈로 치사시켰다. 추가로 에스트로겐과 항에스트로겐의 효과를 부여하기 위해, 에스트로겐-반응성 조직, 예컨대 자궁과 질을 즉시 제거하고, 결합조직과 지방조직을 떼어낸 후 칭량하였다. Image Pro-Plus (Media Cybernetics, Maryland, USA)를 이용한 이미지 분석으로 자궁내막의 두께를 측정하기 위해 자궁을 준비하였다. 간단히 말해, 자궁을 10% 포르말린에 고정하고 파라핀으로 파묻었다. 마우스의 자궁 중 헤마톡실린-및 에오신-염색된 구획을 분석하였다. 자궁 당 네개의 이미지 (자궁뿔 당 2개)를 분석하였다. 상피세포의 평균 높이을 각 군의 모든 동물에서 측정하였다.

반응 기준

연구 종료시 또는, 실험의 진행도중 발생하는 경우라면 각 동물의 치사시에 종양 반응을 평가하였다. 이 경우, 적어도 연구의 중반(84일)까지 살아남은 마우스의 자료만이 종양의 반응 분석에 이용되었다. 간단히 말해, 완전한 퇴화는 실험 종료시 종양이 탐지되지 않는 것을 말한다; 부분 퇴화는 원크기의 ≥50% 퇴화된 종양에 상응한다; 안정한 반응은 <50% 퇴화되거나 ≤50% 진행한 종양을 말한다; 진행은 원크기와 비교하여 ≥50% 진행한 종양을 언급한다.

통계적 분석

반복 측정을 위한 ANOVA에 따라서 1일부터 161일 사이, 종양의 총 표면적 변화를 분석하였다. 이 모델에는 치료, 시간 및 시간-치료 상호효과에다가 무작위화에 의한 단계를 설명하는 용어가 포함된다. 따라서 161일째에서 개별적인 치료 효과의 의미는 시간-치료 상호작용에 의해 판단되었다. 오차 분석은, 원 규모상의 측정치 및 시도된 어떠한 변형도 ANOVA에 의한 분석치와 꼭 맞아떨어지지 않음을 보여준다. 상피 두께에 대한 치료 효과는, 또한 무작위 단계화를 포함하는 일-방 ANOVA에 의해 측정되었다. 가장 작은 정사각형법 통계를 이용하여 후쌍방식 비교를 수행하였다. 차이의 유의성을 선언하기 위해 총 타입 I 에러율(α)을 5%로 조절하였다. SAS 소프트웨어상 Proc MIXED를 이용하여 모든 계산을 실행시켰다 (SAS Institute, Carry, NC).

결과

ZR-75-1 종양 생장에 대한 길항 효과

단독의 에스트론 (OVX + E₁)은 23주-치료 기간 동안 ZR-75-1 종양 크기를 707% 증가시켰다 (도 19A). 순수한 항에스트로겐 EM-652.HCl을 일당 경구 투여량 50㎍으로 에스트론-자극성 마우스에 투여시켜 종양의 생장을 완전히 억제하였다. 사실상, 종양의 생장 뿐 아니라 23주 치료 후, 종양의 크기가 치료 시작 시점의 초기 수치보다 26% 감소하였다 (p<0.04). EM-652.HCl로 치료한 이후 얻어지는 이 수치는 다만 난소절제(OVX) 이후 관찰된 것과 통계적으로 다르지 않았고, 종양의 크기는 최초 종양 크기의 61% 아래로 감소하였다. 그밖의 6개 항에스트로겐은, 동일 투여량(50㎍)과 치료 기간으로, 최초의 평균 종양 크기를 감소시키지 못했다. 이들 군의 종양은 OVX 대조군 및 EM-652.HCl-치료군보다 모두 상당히 커졌다 (p<0.01). 사실상, 드롤록시펜, 토레미펜, GW 5638, 랄록시펜, 타목시펜과 이독시펜을 이용한 23주 치료는, 예비치료 수치와 비교하여, 종양의 평균 크기를 예비치료 수치보다 각각 478%, 230%, 227%, 191%, 87% 및 86% 높게 하였다 (도 19A).

ZR-75-1 종양 생장에 대한 촉진 효과

에스트론의 보충 없이, 일당 복용량 200㎍의 타목시펜을 이용한 161일 치료 이후, 종양의 평균 크기는 베이스라인보다 196%까지 증가하였다 (p<0.01 vs OVX)(도 19B). 반면, 이독시펜으로 치료한 마우스의 평균 종양 크기가 (125%) 증가한 한편(p<0.01), 토레미펜으로 치료한 마우스의 종양 크기는 86%까지 증가하였다(p<0.01)(도 19B). 200㎍의 타목시펜에 200㎍의 EM-652.HCl을 첨가시킴으로써 타목시펜만을 이용시 관찰되었던 증식을 완전히 억제할 수 있었다 (도 19C). 반면, EM-652.HCl(p=0.44), 랄록시펜(p=0.11), 드롤록시펜(p=0.36) 또는 GW 5638(p=0.17)만을 이용한 치료는, 실험 종료시, OVX 대조군과 비교하여 ZR-75-1 종양 크기를 현저히 변화시키지 못했다 (도 19B).

반응 카테고리에 대한 효과

에스트론 자극에 대한 50㎍ 항에스트로겐의 효과.

종양 크기상의 효과에 더하여, 실험 종료시 각 개별적인 종양에서 획득한 반응 카테고리가 치료 효능의 중요한 변수가 된다. 난소절제 마우스에서, 완전, 부분 및 안정한 반응을 종양 중 각각 21%, 43% 및 38%로 획득하였고, 진행된 종양은 없었다. 반면, 에스트론을 보충한 OVX 동물에서는 100%의 종양이 진행되었다 (도 20A). 에스트론을 보충한 OVX 동물 중 EM-652.HCl-치료군에서, 완전, 부분 및 안정한 반응은 종양 중 각각 17%, 17% 및 60%로 나타났고 단지 7%만이 (30 중 2개의 종양) 진행되었다. 에스트론 자극의 동일한 조건하에, 일당 50㎍ 복용량의 그밖의 어떠한 항에스트로겐을 이용한 치료로도 진행하는 종양의 백분율을 60% 아래로 떨어뜨릴 수 없었다. 사실상 타목시펜-치료군에서는 65%의 종양 (26 중 17)이 진행된 한편, 토레미펜에서는 89% (28 중 25), 랄록시펜에서는 81% (26 중 21), 드롤록시펜에서는 100% (23 중 23), 이독시펜에서는 71% (28 중 20), 그리고 GW 5638에서는 77% (26 중 20)의 종양이 진행되었다.

에스트론 자극 없이, 반응 카테고리에 대한 200㎍ 항에스트로겐의 효과.

도 20B에 묘사한대로, 에스트론 자극의 부재시, 타목시펜, 이독시펜 및 토레미펜에서는 그밖의 항에스트로겐보다 진행 종양의 비율이 높았다. 사실상, 일당 복용량 200㎍의 타목시펜-, 이독시펜- 및 토레미펜에 의한 치료 결과, 종양 중 각각 62% (26 중 16), 33% (24 중 8) 및 21% (28 중 6)가 진행 카테고리상에 존재하였다. 도 20C에서 볼 수 있듯이, 타목시펜에 200㎍의 EM-652.HCl을 첨가시킴으로써 진행 종양의 백분율이 타목시펜 단독 이용시 62% (26 중 16)으로부터 타목시펜에 EM-652.HCl 첨가시 7% (28 중 2)까지 감소하였다.

자궁 상피세포의 두께에 대한 항에스트로겐의 효과

자궁내막 중 각 화합물의 촉진 및 길항 효과의 가장 직접적인 변수로서 자궁내막의 상피세포 높이를 측정하였다.

에스트론 자극하에 자궁 상피세포의 두께에 대한 일당 50㎍의 항에스트로겐의 효과.

EM-652.HCl은, 일당 경구 투여량 50㎍으로, 상피의 높이에 대한 에스트론의 자극 효과를 70%까지 억제하였다. 그밖에 실험 항에스트로겐 6개의 효능은 현저하게 낮았다 (p<0.01). 사실상, 드롤록시펜, GW 5638, 랄록시펜, 타목시펜, 토레미펜 및 이독시펜은 각각 17%, 24%, 26%, 32%, 41% 및 50%까지 에스트론 자극을 억제하였다 (표 10).

에스트론 자극없이 자궁 상피세포의 두께에 대한 일당 200㎍의 항에스트로겐의 효과.

에스트론 자극없이, EM-652.HCl과 드롤록시펜은 단지 상피세포의 높이를 현저하게 증가시키지 않는 실험 화합물이다 (각각 OVX 대조군 수치의 114% 및 101%). 타목시펜(155%), 토레미펜(135%) 및 이독시펜(176%)은 자궁의 상피 높이에 현저한 자극을 발휘하였다 (p<0.01 vs OVX 대조군). 또한 랄록시펜(122%)과 GW 5638(121%)은 자궁의 상피 높이에 통계적으로 유의한 자극을 발휘하였다 (p<0.01 vs OVX 대조군)(표 10). 자궁과 질의 중량에 대해 측정한 각 항에스트로겐의 촉진 및 길항 효과는 자궁의 상피 두께상에서 관찰된 패턴과 일치하였다 (자료 없음).

실시예 9

¹⁴ C-EM-800(20mg/kg)의 단일 경구 투여에 따른 암컷 래트의 뇌 방사능

실시예 9는 ¹ ⁴C-EM-800(20mg/kg)의 단일 경구 투여에 따른 래트의 뇌 방사능을 보여준다. 비교를 위해, 각각의 이들 동물에서 얻은 혈액, 혈장, 간 및 자궁에 대한 수치를 포함시켰다. 이 결과는, 수컷과 암컷 롱-에반스 래트에 단일 경구 복용량의 ¹ ⁴C-EM-800 (20mg/2ml/kg) 투여에 따라 LREM 연구 1129호 조직 분산과 방사능의 배출로부터 얻은 것이다. 이들 숫자는, 암컷 롱-에반스 래트의 뇌 중 총 약물-유발성 방사능의 양은 매우 적고 (ng equiv/g 조직) 투여 12시간 후에는 검출되지 않는 것을 나타낸다. 2시간째, 뇌 중 방사능은 간보다 412 낮아졌고, 자궁보다 21배 낮으며, 혈액보다는 8.4배 그리고 혈장보다 13배 낮다. 총 뇌 방사능의 비율이 알려지지 않은 것은 혈액 방사능으로 인한 오염 때문이므로, 뇌 방사능에 대해 표 1에 보여진 수치는 뇌 조직 자체의¹⁴C(EM-800)-관련 방사능에 대한 과수치이다. 이러한 수치는, 뇌 조직 중 항에스트로겐의 수준이, 만약 존재한다면, 외생성 에스트로겐의 효과를 상쇄시키기에 지나치게 낮다는 것을 시사한다. 뇌 조직 중 검출되는 몇몇 방사능은 조직내 잔여 혈액에 의한 것임을 주목해야 한다. 추가로 이 연구에 이용된¹⁴C-EM-800의 방사화학 순도는 최소 96.25%이었다.

a: LREM 1129의 조사표에서 얻은 수치 (EM-800: 수컷과 암컷 롱-에반스 래트에 단일 경구 복용량의 ¹ ⁴C-EM-800 (20mg/2ml/kg) 투여에 따른 조직 분산과 방사능 배출)

b: 1.2ng EM-800 당량의 정량 한계 (LOQ)

c: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 한 샘플

d: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 두 샘플

%CV: 편차 계수를 퍼센트로 표시, n=3

NC: 계산 안함.

b: 1.2ng EM-800 당량의 정량 한계 (LOQ)

c: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 한 샘플

d: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 두 샘플

%CV: 편차 계수를 퍼센트로 표시, n=3

NC: 계산 안함.

실시예 10

항에스트로겐 EM-652.HCl과 에스트라디올을 배합시켜 자궁의 자극에 대항한다.

물질 및 방법

동물과 치료

난소절제시 215-265g으로 칭량된 10 내지 12주령의 암컷 Sprague-Dawley 래트(Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada)를 이용하였다. 동물들은 개별적으로 환경-조절 룸에 (온도: 22±3℃; 습도: 50±20%; 12-시간 광주기-12-시간 암주기, 일광 개시 07:15h)에 수용되었다. 동물들은 자유롭게 수돗물과 공인된 설치류 사료 (Lab Diet 5002(펠릿), Ralston Purina, St-Louis, MO)에 접근이 가능하다. 실험용 동물의 보호와 이용에 관한 Canadian Council on AnimalCare(CCAC) 가이드에 따라서, CCAC와 Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)가 승인한 동물 설비에서 실험을 수행하였다.

137마리의 래트를 다음과 같이 각 13 또는 14마리로 구성된 10군으로 무작위 분배하였다: 1)무손상 대조군; 2)난소절제(OVX) 대조군; 3)OVX + 17β-에스트라디올 (E₂;2mg/kg); 4군부터 10)OVX + E₂+ EM-652.HCl (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 또는 10mg/kg). 연구 1일째, 적절한 군의 동물을 취해 이소플루란 마취하에 양측 난소절제(OVX)하였다. 실험 화합물들을, 0.4% 메틸셀룰로스 (0.5ml/래트) 현탁액으로 연구의 1일부터 14일까지 경구 위관영양에 의해 일당 1회 제공하였다. 동물 1군과 2군은 동일한 기간 동안 매체만을 수용하였다. 연구 15일째, 그룹당 4마리에 10% 완충 포르말린을 살포하고 조직검사를 위해 조직을 공정처리하였다. 그밖의 동물들은 이소플루란 마취하에 복부 대동맥 방혈로써 치사시켰다. 자궁과 질을 제거하고, 남아있는 지방을 떼어낸 뒤 칭량하였다. 컴퓨터-화 프로그램을 이용한 자궁내막 상피세포의 높이 측정을 위해, 각 자궁에서 얻은 견본을 10% 완충 포르말린에 고정시켰다 (Software Image-Pro Plus).

혈청 콜레스테롤 수준

1박 절식한 동물로부터 수집한 혈청 샘플상 총 콜레스테롤을 Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 분석기 (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)를 이용하여 측정하였다.

통계적 분석

결과

난소절제 2주후에 관찰된 자궁 중량의 65% 감소는 17β-에스트라디올(E₂)을 2mg/kg 분량으로 일당 경구 투여함으로써 완전히 역전되었다 (490mg±26mg 대 480±17mg;N.S.) (도 21). 동일한 도면에서 볼 수 있듯이, 자궁 중량에 대한 E₂의 자극 효과에 대한 진행 억제를 EM-652.HCl의 분량을 진행시키며 관찰하였고, 항에스트로겐의 분량 3mg/kg과 10mg/kg에서 관찰된 E₂의 효과상 역전은 각각 84% 및 87%이었다. 자궁내막의 상피 높이에 대해서도 유사한 결과를 얻었다 (도 22). 실제로, E₂-자극성 자궁내막의 상피 높이는 항에스트로겐의 분량 3mg/kg 및 10mg/kg에 의해 각각 83% 및 93% 억제되었다. 자궁내막이 상피 높이는 무손상 대조군 동물(31.1±0.7㎛)과 비교하여 E₂화합물로 치료된 OVX 동물군(41.9±1.2㎛)에서 보다 높다 (34.7%, p<0.01).

OVX 동물에 E₂를 보충시켜 무손상 동물(149.9±9.0mg 대 145±5.3mg, N.S.)과 유사한 질의 중량을 얻었다. 자궁의 질량에 대한 것보다 높은 복용량의 EM-652.HCl에서 질의 중량 억제가 관찰되었음을 도 24에서 볼 수 있다. 실제로, 1mg/kg까지의 화합물에서는 질의 중량에 대한 항에스트로겐의 자극 효과가 현저하게 관찰되지 않았다.

실제로, 복용량 3mg/kg의 EM-652.HCl는 E₂의 자극 효과상 통계적으로 현저하지 않은 50%의 억제를 야기시킨 반면, 10mg/kg 분량의 항에스트로겐은 질의 중량상 E₂효과의 완전한 역전을 나타내었다.

혈청 콜레스테롤에서 OVX 2주 후 37%의 증가가 관찰되었다 (p<0.01). 반면, OVX 동물의 E₂치료는 혈청 콜레스테롤 수준의 53%(p<0.01) 억제를 초래하였다 (도 25). EM-652.HCl을 일당 투여량 0.01mg/kg 내지 0.3mg/kg으로 첨가시, E₂의 자극 효과에 대하여 통계적으로 현저한 어떠한 효과도 내지 못했다. 반면, 0.1, 3.0 및 10mg/kg 분량의 EM-652.HCl은 E₂의 효과를 각각 36%, 30% 및 50% 감소시켰다. 본 자료는, 항에스트로겐, EM-652.HCl가 말초 조직상 에스트로겐 작용의 잘 인지되는 두가지 변수인 자궁 중량과 자궁내막 상피 높이에 대하여 E₂의 자극 효과를 상쇄시킴을 명백하게 입증한다. 물론 이러한 자료는, 혈관운동 징후의 경감을 위해 에스트라디올을 수용하는 폐경후 여성에게 EM-652.HCl을 공동-투여시킴으로써 자궁내막상 에스트로겐의 자극 효과를 억제할 수 있음을 시사한다.

1.0mg/kg, 3.0mg/kg 및 10mg/kg 분량의 EM-652.HCl로 인한 36%, 30% 및 50%의 자극 효과상의 역전은 아마도 단독 이용시에도 동일한 억제 효과를 초래하는 항에스트로겐의 탁월한 효과에 의해 설명될 수 있다. 실제로, EM-652.HCl은 래트의 자궁 ER에 대해 E₂보다도 약 5-배 높은 친화력을 갖는다 (Martel 외, J. SteroidBiochem. Molec. Biol., 64:199-205, 1998).

약리적 조성물과 키트의 구체예

후술하는대로, 제한이 아닌 구체예로써, 바람직한 활성 SERM EM-800 또는 EM-652.HCl(EM-1538)와 바람직한 활성 17β-에스트라디올, 에티닐에스트라디올 또는 컨쥬게이트 에스트로겐을 이용한 여러가지 약리적 조성물 및 키트를 제공한다. EM-800 또는 EM-652.HCl 또는 17β-에스트라디올 또는 에티닐에스트라디올 대신 (또는 추가하여) 본 발명의 그밖의 화합물 또는 그 배합을 이용할 수 있다. 활성 성분의 농도는 여기서 기술한 광범한 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 포함 가능한 그밖의 성분들의 양과 종류는 당해 분야에 잘 알려져 있다.

실시예 A

경구 투여용 약리적 조성물(캡슐)

성분	중량% (조성물의 총 중량에 대해)
EM-652.HCl	5.0
에티닐에스트라디올	0.02
수화 락토오스	79.98
전분	4.8
셀룰로스 미세결정체	9.8
마그네슘 스테아레이트	0.4

또는

성분	중량% (조성물의 총 중량에 대해)
EM-652.HCl	5.0
컨쥬게이트 에스트로겐	0.2
수화 락토오스	79.8
전분	4.8
셀룰로스 미세결정체	9.8
마그네슘 스테아레이트	0.4

실시예 B

키트

SERM과 에스트로겐을 경구 투여한다.

경구 투여용 비-스테로이드성 항에스트로겐 조성물(캡슐)

성분	중량% (조성물의 총 중량에 대해)
EM-652.HCl	5.0
수화 락토오스	80.0
전분	4.8
셀룰로스 미세결정체	9.8
마그네슘 스테아레이트	0.4

경구 투여용 에스트로겐 조성물(젤라틴 캡슐)

성분	중량% (조성물의 총 중량에 대해)
에티닐에스트라디올	0.02
수화 락토오스	84.98
전분	4.8
셀룰로스 미세결정체	9.8
마그네슘 스테아레이트	0.4

상기 배합물 중 그밖의 SERM으로 EM-800 또는 EM-01538을 대신할 수 있으며, 그밖이 에스트로겐이 17β-에스트라디올, 에티닐에스트라디올 또는 컨쥬게이트 에스트로겐을 대신할 수 있다. 배합된 중량 백분율이 바람직하게도 상기 구체예에서 주어진 단일 에스트로겐 또는 단일 SERM의 중량 백분율인 경우, 한가지 이상의 SERM 또는 한가지 이상의 에스트로겐을 함유시킬 수 있다.

본 발명을 바람직한 구체예와 실시예로 설명하였으나 이에 제한하는 것은 아니다. 당업자는, 단지 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 보다 넓은 이용가능성과 범위를 용이하게 인식할 것이다.

Claims

폐경기 증상의 발병을 배제하거나 감소시킬 필요가 있는 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지고, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이며 벤조티오펜 유도체가 아닌, 폐경기 증상의 발병을 감소시키거나 배제시키는 방법.
골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 알츠하이머병, 인슐린 내성, 당뇨병, 근육질량의 손실, 비만, 호르몬 대체 치료에 의한 질 건조; 호르몬 대체 치료에 의해 유발된 유방 압통으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제거 또는 감소가 필요한 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지고, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이고 벤조티오펜 유도체가 아닌 방법.
골다공증을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제거 또는 감소가 필요한 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지고, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이며 벤조티오펜 유도체, 나프탈렌 유도체, 이소퀴놀린 유도체 또는 3-페닐퀴놀린 유도체, 3-페닐티오크로만 유도체, 2R 배열의 에난티오머가 10% 이상인 3-페닐크로만 유도체의 에난티오머 혼합물과 별개의 화합물인, 골다공증을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는 방법.
a)약리적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체;

b)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐 또는 그 전구약물; 및

c)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구 약물을 포함하고, 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이며, 상기 조절자는 벤조티오펜 유도체, 나프탈렌 유도체, 이소퀴놀린 유도체 또는 3-페닐퀴놀린 유도체, 3-페닐티오크로만 유도체, 2R 배열의 에난티오머가 10% 이상인 3-페닐크로만 유도체의 에난티오머 혼합물이 아닌 약리적 조성물.
치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 함유하는 약리적 배합물을 포함하는 첫번째 용기; 추가로 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 함유하는 약리적 배합물을 포함하는 두번째 용기로 된, 이 때 상기 조절자는 벤조티오펜 유도체가 아닌 키트.
a)약리적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체;

b)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐 또는 그 전구약물;

c)치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구 약물, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이며,

d)비스포스포네이트, 안드로겐성 약제, 테스토스테론, 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-술페이트, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올, 4-안드로스텐-3,17-디온 및 앞서 말한 첨가제의 어떠한 전구약물로 구성된 군으로부터 선택되는 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 첨가제를 포함하는 약리적 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 방법은 공동 치료의 일부로써 치료적으로 유효한 양의 비스포스포네이트를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
폐경기 증상의 발병 위험을 배제하거나 감소시킬 필요가 있는 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐-수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지고, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의화합물이며, 공동 치료의 일부로써, 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-술페이트, 안드로겐성 약제, 테스토스테론, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올, 4-안드로스텐-3,17-디온 및 앞서 말한 첨가제의 어떠한 전구약물로 구성된 군으로부터 선택되는 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 첨가제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 죽상경화증, 고혈압, 알츠하이머병, 인슐린 내성, 당뇨병, 근육질량의 손실, 비만, 호르몬 대체 치료에 의한 질 건조 및 호르몬 대체 치료에 의해 유발된 유방 압통으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제거 또는 감소가 필요한 환자에 치료적으로 유효한 양의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 투여하는 것과 공동으로 상기 환자에 치료적으로 유효한 양의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 투여하는 것으로 이루어지고, 이 때 상기 조절자는 상기 에스트로겐과 별개의 화합물이며, 공동 치료의 일부로써, 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-술페이트, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올, 안드로겐성 약제, 테스토스테론, 4-안드로스텐-3,17-디온 및 앞서 말한 첨가제의 어떠한 전구약물로 구성된 군으로부터 선택되는 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 첨가제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 에스트로겐 또는 그 전구약물을 함유하는 약리적 배합물을 포함하는 첫번째 용기; 추가로 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구약물을 함유하는 약리적 배합물을 포함하는 두번째 용기로 구성되며, 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-술페이트, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올, 안드로겐성 약제, 테스토스테론, 4-안드로스텐-3,17-디온 및 앞서 말한 첨가제의 어떠한 전구약물로 구성된 군으로부터 선택되는 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 첨가제를 함유하는 상기 키트내 한개 이상의 추가적인 용기를 포함하는 키트.
제 5 항 또는 10 항에 있어서, 치료적으로 유효한 양의 한가지 이상의 비스포스포네이트를 함유하는 약리적 배합물을 포함하는 한개 이상의 추가적인 용기를 포함하는, 골다공증을 치료하거나 그 획득 위험을 감소시키는데 유용한 키트.
제 1 항에 있어서, 공동 치료의 일부로써, 치료적으로 유효한 양의 안드로겐성 약제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 아래와 같은 특징의 분자식을 갖고, 이 때 상기 조절자는 벤조티오펜 유도체, 나프탈렌 유도체, 이소퀴놀린 유도체 또는 3-페닐퀴놀린 유도체, 3-페닐티오크로만 유도체, 2R 배열의 에난티오머가 10% 이상인 3-페닐크로만 유도체의 에난티오머 혼합물이 아닌 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

a) 1 내지 2개의 탄소 원자에 의해 이격된 두개의 방향족 고리, 이 때 두개의 방향족 고리 모두 히드록실기 또는 생체내에서 히드록실로 전환되는 작용기에 의해 치환 또는 비치환됨;

b) 방향족 고리와 삼차 아민 관능기 또는 그 염을 포함하는 측쇄.
제 13 항에 있어서, 상기 측쇄는

로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 13 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자는 트리페닐에틸렌 유도체, 인돌 유도체, 벤조피란 유도체, HMR 3339, HMR 3656, LY 335124, LY 326315, SH 646, ERA 923 및 센트크로만(centchroman) 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
선택적인 에스트로겐 수용체 조절자는 다음 구조식의 벤조티오펜 유도체 화합물인 제 6 항의 약리적 조성물, 제 8 항과 9 항의 방법, 또는 제 10 항의 키트:

이 때, R₁과 R₂는 독립적으로 수소, 히드록실 및 생체내에서 히드록실로 전환되는 부분으로 구성되는 군으로부터 선택되고,

R₃과 R₄는 (a)독립적으로 C1-C4 알킬이거나, (b)피롤리디노, 디메틸-1-피롤리디노, 메틸-1-피롤리디닐, 피페리디노, 헥사메틸렌이미노 및 모르폴리노로 구성된 군으로부터 선택되는, 질소와 공동하여 이들이 결합되는 부분이며,

A는 -CO-, -CHOH-, 및 -CH₂-로 구성되는 군으로부터 선택되고,

B는 페닐렌, 피리딜리덴 및 -시클로C₄H₂N₂-로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제 16 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자는 랄록시펜, LY 353381 및 LY 335563으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 13 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 다음 구조식의 트리페닐에틸렌 또는 디페닐하이드로나프탈렌 유도체 화합물인 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

이 때, D는 -OCH₂CH₂N(R₃)R₄, -OCH₂CH₂OH 또는 -CH=CH-COOH이고 (R₃와 R₄는 독립적으로 C1-C4 알킬로 구성되는 군으로부터 선택되거나, R₃, R₄및 그들에 결합하는 질소 원자가 함께 피롤리디노, 디메틸-1-피롤리디노, 메틸-1-피롤리디닐, 피페리디노, 헥사메틸렌이미노 및 모르폴리노로 구성되는 군에서 선택되는 고리 구조를 형성한다),

E와 K는 독립적으로 수소 또는 히드록실, 포스페이트 에스테르, 또는 저급 알킬이며,

J는 수소 또는 할로겐이다.
제 1 항 내지 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 OH-타목시펜, 드롤록시펜, 토레미펜, 이독시펜, 라소폭시펜, 이프록시펜, FC 1271, 및 GW 5638인 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 13 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 다음 구조식의 인돌 유도체 화합물인 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

이 때, D는 -OCH₂CH₂N(R₇)R₈, -CH=CH-CON(R₇)R₈, -CC-(CH₂)n-N(R₇)R₈로 구성되는 군으로부터 선택되고(R₇와 R₈는 독립적으로 C₁-C₆알킬로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, R₇, R₈및 그들에 결합하는 질소 원자가 함께 피롤리디노, 디메틸-1-피롤리디노, 메틸-1-피롤리디닐, 피페리디노, 헥사메틸렌이미노 및 모르폴리노로 구성된 군으로부터 선택되는 고리 구조를 형성한다),

X는 수소 및 C1-C6 알킬로 구성되는 군으로부터 선택되며,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅및 R₆은 독립적으로 수소, 히드록실, C₁-C₆알킬 및 생체내에서 히드록실로 전환되는 부분으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제 20 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 TSE 424 (2-(4-히드록시페닐)-3-메틸-1-[[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]메틸]-1H-인돌-5-올)인 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 13 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 다음 구조식의 센트크로만 유도체 화합물인 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

이 때, R₁과 R₂는 독립적으로 수소, 히드록실 및 생체내에서 히드록실로 전환되는 부분으로 구성되는 군으로부터 선택되고,

R₅과 R₆는 독립적으로 수소 또는 C₁-C₆알킬이며,

D는 -OCH₂CH₂N(R₃)R₄이다 (R₃와 R₄는 독립적으로 C₁-C₄알킬로 구성되는 군으로부터 선택되거나, R₃, R₄및 그들에 결합하는 질소 원자가 함께 피롤리디노, 디메틸-1-피롤리디노, 메틸-1-피롤리디닐, 피페리디노, 헥사메틸렌이미노, 모르폴리노로 구성되는 군에서 선택되는 고리 구조를 형성한다).
제 22 항에 있어서, 센트크로만 유도체는 (3,4-트랜스-2,2-디메틸-3-페닐-4-[4-(2-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐]-7-메톡시크로만)인 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 13 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 다음 구조식을 갖는 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

이 때, R₁과 R₂는 독립적으로 수소, 히드록실 또는 생체내에서 히드록실로 전환되는 부분이고,

Z는 존재하지 않거나 -CH₂-, -O-, -S- 및 -NR₃- (R₃는 수소 또는 저급 알킬)로 구성된 군으로부터 선택되며,

R₁₀₀은 4-10개의 개재 원자(intervening atoms)에 의해 B-고리로부터 L만큼 떨어져 있는 이가 부분이고,

L은 -SO-, -CON-, -N< 및 -SON<의 군으로부터 선택되는 이가 또는 삼가 부분이고,

G₁은 수소, C₁내지 C₃의 탄화수소, G₂및 L과 공동하여 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리를 형성하는 이가 부분 및 상기의 할로 또는 불포화 유도체로 구성된 군으로부터 선택되며,

G₂는 존재하지 않거나 수소, C₁내지 C₃의 탄화수소, G₁및 L과 결합하여 5 내지 7원 헤테로시클릭 고리를 형성하는 이가 부분 및 상기의 할로 또는 불포화 유도체로 구성되는 군에서 선택되고.

G₃는 수소, 메틸 및 에틸로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제 24 항에 있어서, 상기 화합물은 다음 일반식의 벤조피란 유도체 또는 약리적으로 허용되는 그 염인 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

이 때, D는 -OCH₂CH₂N(R₃)R₄이고 (R₃와 R₄는 독립적으로 C₁-C₄알킬로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되거나, R₃, R₄및 그들에 결합하는 질소 원자가 함께 피롤리디노, 디메틸-1-피롤리디노, 메틸-1-피롤리디닐, 피페리디노, 헥사메틸렌이미노, 모르폴리노로 구성된 군으로부터 선택되는 고리 구조를 형성한다),

R₁과 R₂는 독립적으로 수소, 히드록실 및 생체내에서 히드록실로 전환되는 부분으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제 25 항에 있어서, 벤조피란 유도체는 탄소 2상에 완전한 S 배향을 갖는 그 다수의 입체 이성질체로 인하여 광학적으로 활성이며, 상기 화합물은 다음 분자 구조를 갖는 방법, 약리적 조성물 또는 키트:

이 때, R₁과 R₂는 독립적으로 히드록실 및 생체내에서 히드록실로 전환가능한 부분으로 구성된 군으로부터 선택되고,

R³는 포화, 불포화 또는 치환된 피롤리디닐, 포화, 불포화 또는 치환된 피페리디노, 포화, 불포화 또는 치환된 피페리디닐, 포화, 불포화 또는 치환된 모르폴리노, 질소-함유 시클릭 부분, 질소-함유 폴리시클릭 부분 및 NRaRb로 구성되는 군으로부터 선택되는 종이다 (Ra와 Rb는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지된 C₁-C₆알킬, 직쇄 또는 분지된 C₂-C₆알케닐 및 직쇄 또는 분지된 C₂-C₆알키닐이다).
제 26 항에 있어서, 상기 화합물 또는 염은 실질적으로 (2R)-에난티오머가 결여된 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 26 항에 있어서, 상기 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되고, 이 때 그 입체화학이 표시된 상기의 모든 분자 구조는 2S 배향을 갖는 그 다수의 입체 이성질체로 인하여 광학적으로 활성인 방법, 약리적 조성물 또는 키트:
제 26 항에 있어서, 벤조피란 유도체는 아세트산, 아디프산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포르(camphor)술폰산, 시트르산, 푸마르산, 하이드로요오드산, 하이드로브롬산, 염산, 하이드로클로로티아지드(thiazide)산, 히드록시-나프톤산, 락트산, 말레산, 메탄술폰산, 메틸술푸린산, 1,5-나프탈렌디술폰산, 니트르산, 팔미트산, 피발산, 인산, 프로피온산, 숙신산, 술푸린(sulfuric)산, 타르타르산, 테레프탈산, p-톨루엔술폰산 및 발레르산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 산의 염인 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 29 항에 있어서, 산은 염산인 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 1 항 내지 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가

이고, 2S 배향을 갖는 그 다수의 입체 이성질체로 인하여 광학적으로 활성이며,

이 때 에스트로겐은 17β-에스트라디올, 17β-에스트라디올 에스테르, 17α-에스트라디올, 17α-에스트라디올 에스테르, 에스트리올, 에스트리올 에스테르, 에스트론, 에스트론 에스테르, 컨쥬게이트 에스트로겐, 에퀼린, 에퀼린 에스테르, 17α-에티닐에스트라디올, 17α-에티닐에스트라디올 에스테르, 메스트란올 및 메스트란올 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 1 항 내지 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스트로겐은 17β-에스트라디올, 17β-에스트라디올 에스테르, 에스트리올, 에스트리올 에스테르, 에스트론, 에스트론 에스테르, 컨쥬게이트 에스트로겐, 에퀼린, 에퀼린 에스테르, 17α-에티닐에스트라디올, 17α-에티닐에스트라디올 에스테르, 메스트란올 및 메스트란올 에스테르, 케메스트로겐(chemestrogen), DES, 피테스트로겐(phytestrogen), 티볼론, 2'-에틸에스트로겐옥사졸 및 에티네디올(ethynediol)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 1 항, 2 항, 3 항, 8 항 및 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자가 유방 또는 자궁내막 조직에서 에스트로겐 활성을 갖지 않는 방법.
제 1 항 내지 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에스트로겐은 에스트로겐성/안드로겐성 혼합 화합물인 방법, 약리적 조성물 또는 키트.
제 34 항에 있어서, 에스트로겐성/안드로겐성 혼합 화합물은 티볼론 (Tibolone)인 방법.
제 1 항 또는 8 항에 있어서, 폐경기 증상은 고온 플래시(flashes), 혈관운동성 징후, 불규칙한 월경, 질 건조, 두통 및 수면 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 치료는 유방암 또는 자궁내막암의 획득 위험을 환자로부터 감소시키는 방법.