SK135195A3 - Crystaline spirostalnylglycosidal, its monohydrate pharmaceutical agent on its base and method of production of crystaline steroid glycoside - Google Patents

Description

Kryštalický spirostanylglykozid, jeho monohydrát, farmaceutický prostriedok na jeho báze a spôsob výroby kryštalického steroidného glykozidu

Vynález sa týka steroidných glykozidov a farmaceutických prostriedkov na ich báze. Tieto glykozidy účinne potlačujú hypercholesterolémi u a tiež aterosk1erózu. Osobitne sa týka kryštalického spirostanylglykozidu, jeho monohydrátu, farmaceutického prostriedku na jeho báze a spôsobu výroby tohto kryštalického steroidného glykozidu.

Doterajší stav techniky

Mnohé známe produkty vykazujúce hypolesterolemickú účinnosť sú zas ieťovanými syntetickými polymérnymi derivátmi, napríklad na báze polystyrénu. Tak napríklad zasieťovaná, vo vode nerozpustná živica na báze polystyrénu viazajúca žlčovú kyselinu, ako je Cholestyramine^(R) vyvoláva v ústach pieskový pocit, a preto je málo prijateľná pre pacientov.

Také perlové živice majú okrem toho obvykle nízku účinnosť in vivo. Preto je hypocho1estero1emicky účinná dávka týchto látok príliš vysoká a obyčajne leží v rozmedzí od 18 do 24 g farmaceutického prostriedku za deň. Iné známe polyméry vykazujúce hypocholesterolemickú účinnosť zahŕňajú prírodný produkt chitosán a jeho deriváty (pozri EPA 0 212 145) . I pri týchto materiáloch je však hypocholesterolemicky účinná dávka príliš vysoká.

Z iných činidiel, ktoré regulujú hypocholesteroléra i u, je možné uviesť rastlinné extrakty, ako sú saponiny z vojtešky (alíalfa saponiny). Tieto rastlinné extrakty však majú premenlivé zloženie a obsahujú podstatné množstvá neužitočných chemických látok. S ohľadom na premenlivosť ich zlože2 nia je obťažné určiť ich štandardné dávkovanie a predpovedať prítomné nečistoty. Také extrakty sa preto dosť dobre nehodia pre použitie v humánnom lekárstve. Okrem toho, čistenie týchto extraktov by bolo veľmi nákladné. Ako alternatíva k týmto extraktom boli vyvinuté určité čisté syntetické zlúčeniny odvodené od sapogenínu, napríklad látky získané zo spirostánu, spirosténu alebo látky odvodené od sterolu. Tieto syntetické látky potlačujú absorpciu cholesterolu účinnejšie ako extrakty z vojtešky, a preto je možné je podávať v dávkach s rozumnou hmotnosťou veľkosťou. Vďaka tomu, že chemické zloženie týchto látok je známe a že je možné tieto zlúčeniny syntetizovať s vysokým stupňom čistoty, hodi sa pre použitie pri všetkých teplokrvných živočíchoch, vrátane človeka.

Pokiaľ sa však čisté sapogeniny nepodávajú v značných dávkach, podstatne neinhibujú absorpciu cholesterolu. Sapogeniny vykazujú účinok až potom, čo je do nich zavedená iná časť. Ako príklady takých sapogenínových zlúčenín je možné uviesť tigogenín a diosgenín, najmä ich glykozidy.

V publikácii P. K. Kintia, lu. K. Vasilenko, G. M. Gorianu,

V. A. Bobeiko, I. V. Suetina, N. E. Masshchenko, Kim. Pharm. Zh. , 1981, 15(9), 55 je opísaný 3-0-( β-D-galaktopyranozyl)hekogenín a jeho použitie, ako hypocho1estero1emické činidlo

V US patentoch č. 4 602 003 a 4 602 005 sú opísané určité steroidné glykozidy, najmä 3-0-(β-D-g1ukopyranozy1)t igogení n a 3-0-(β-D-ce1 obiozy1)tigogení n a ich použitie pre kontrolu hypocholesterolémie. 3-0-(β-D-ce1 obiozy1)t igogení n vykazuje vyššiu hypocholesterolemickú účinnosť v porovnaní napríklad s cho1estyramínom.

Okrem toho bolí publikované určité ďalšie steroidné glykozidy, opísané ďalej, ale tieto publikácie sa netýkajú hypocholesterolemickej účinnosti. Publikácia Structural Features of the Antioxidant and Fungicidal Activity of Steroid

Glycosides, Dimoglo, A. S., Choban I. N., Bersuker, I. B., Kintya P. K. , Balashova, N. N. , Bioorg. Khim, 11(3) , 408 413, 1985 sa týka p-D-galaktopyranozidu rockogenínu a p-Daktozidu tigogenlnu. Publikácia Preparát i on and Properties of Some New Steroid β-D-Glucopyranosi des, p-D-Glucopyranosi douronic Acids and Derivati ves, Schne i der J.J., Carb. Research, 17, 199 až 207, 1971 sa týka p-D-glukopyranouronozidu tigogenlnu. Publikácia Sterol Glycoside with Activity as Prostag1 andi n Synthetase Inhibitor, Pegel K. H., Walker H.,

US patent 4 260 603, 7. apríl 1981, sa týka p-D-glukopyranozidu hekogenínu. Publikácia Hemolytic Properties of Synthetic Glycosides, Segal R., Shud F., M i 1 o-Goldzwei g, I.,

J. Pharra. Sci, 67(11) 1589 až 1592, 1978 sa týka p-D-maltozidu tigogenlnu, p-L - fukopyranozidu tigogenlnu, β-maltozidu srailagenínu a of-L-ramnoz i du tigogenlnu. Publikácia “Steroid Glycosides from the Roots of Capsicum Annuura 11= The Structure of the Capsicosi des , Gutsu E. V., Kintya P. K., Lazurevskii G. V., Khim. Prir. Soedin., (2), 242 - 246, 1978 sa týka of-D-arabanopyranoz i du tigogenlnu a p-D-galaktopyranozidu tigogenlnu. Publikácia Mol 1usci c i dal Saponins from Cornus Florida L.“, Hostettmann K., Hostettmann-Kaldas, M., Nakanishi K., Helv. Chim. Acta, 61, 1990 - 1995, 1978 sa týka p-D-galaktopyranozidu smilagenínu. Publikácia Steroidal Saponins from Several Species of Liliiflorae Plants, Yang,

C., Li K., Ding Y., Yunnan Zhiwu Yanjiu Zengkan, suppl. 3, 13-23, 1990 sa týka celobiozidu (25S)-hekogenánu. Publikácia

Determinati on of the Absolute Configurati on of a Secondary Hydroxy Group in a Chiral Secondary Alcohol Using Glycosidation shifts in Carbon-13 NMR Spectroscopy, Seo S., Tomita Y., Tori K., Yoshimura Y., J. Am. Chem.Soc., 100(11), 33313339, 1978 sa týka p-glukozidu smi lagenínu a ar-glukozidu smilagenínu. Publikácia Steroid Glykosides from Asparágus Off i c inali s, Lazurevskii G. V., Goryanu G. M., Kintya P.

K. , Dokl. Akad. Náuk, SSSR, 231(6), 1479-81, 1976 sa týka p-glukozidu sarsasapogenínu.

Iné steroidné glykozidy s vynikajúcou hypocholešte rolemickou účinnosťou sú opísané v US patentovej prihláške 07/904914 podanej 26. júnu 1992. V tejto prihláške je opísaný dihydrát (33,5cŕ, 25R) - 3-[ ( β-D-ce 1 ob i ozy 1) oxy ] spi rostán-11 onu a jeho použitie ako hypocho1estero1emického činidla a antiaterosklerotického činidla.

Podstata vynálezu

Jedným aspektom vynálezu je kryštalický monohydrát spirostanylglykozidu, ktorý je užitočný ako hypocholešte rolemické a antiaterosk1erotické činidlo. Tento kryštalický produkt má zloženie zodpovedajúce vzorcu I

Ďalším aspektom vynálezu je kryštalický spirostanyl glykozid, ktorý v rôntgenovom ditrakčnom obrazci vykazuje 20 najväčších pikov nasledujúcej vzdialenosti d: 23,74; 15,78;

11,82; 9,48; 7,90; 6,77; 6,34; 6,26; 5,91; 5,75; 5,61; 4,72;

4,61; 4,13; 4,00; 3,91; 3,64; 3,38; 2,63 a 2,49.

Kryštalickým spirostany1glykozi dom s hore uvedenými vzdialenosťami d je prednostne monohydrát.

Ďalším aspektom vynálezu je kryštalický spirostanylglykozid, ktorého rôntgenový difrakčný obrazec zodpovedá obr. 1.

Ešte ďalším aspektom vynálezu je farmaceutický prostriedok pre potlačovanie hypocholesterolémie alebo aterosklerózy u cicavcov, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje kryštalickú zlúčeninu vzorca I a farmaceutický vhodný nosič. Také farmaceutické prostriedky môžu obsahovať kryštalickú zlúčeninu vzorca I s hore uvedenými vzdialenosťami d v rontgenovom difrakčnom obrazci alebo s hore uvedeným rontgenovýra difrakčným obrazcom.

Pri potlačovaní hypocholesterolémie alebo aterosklerózy u cicavcov sa cicavcom, ktorí také liečenie potrebujú, podáva kryštalická zlúčenina vzorca I v množstve, ktorá účinne potlačuje hypocholesterolémiu alebo aterosk1erózu.

Ešte ďalším aspektom vynálezu je spôsob výroby kryštalickej zlúčeniny vzorca I. Tento spôsob zahŕňa kryštalizáciu z vhodného rozpúšťadla, prednostne metanolu. V prednostnom predvedení sa tento spôsob vykonáva tak, že sa ( 3β, 5ct, 25R) - 3-[(/3-D-cel obi ozy 1 ) oxylspirostán - 1 1 - on suspenduje v dostatočnom množstve metanolu na dostatočne dlhý čas, aby po ochladení vznikol monohydrát ( 3/3, 5ce, 25R)-3-[ (/3-Dcelobiozyl)oxylspirostán-11-onu.

Vynález predstavuje významný pokrok v tomto odboru, spočívajúci vo vyvinutí termodynamicky stálej kryštalickej f or my ( 3/3, 5ot, 25R) - 3- [ ( β - D - ce 1 ob i ozy 1) oxy ] spi rostán - 1 1 - onu . Získanie stálej kryštalickej formy uľahčuje ďalší vývoj a získanie prehľadu o regulačnej účinnosti tejto zlúčeniny. Okrem toho má táto kryštalická forma lepšie vlastnosti pri manipulácii a spracovaní na farmaceutický prostriedok, napríklad pri tabletovaní. Pre porovnanie je možné uviesť, že amorfná, alebo v podstate amorfná zlúčenina, má lepivú konzistenciu podobnú konzistencii ílu, ktorá veľmi sťažuje jej f i 1tráci u.

Zlúčenina vzorca I je tu definovaná ako jediný enantiomér, ktorého absolútna stereochémia je znázornená vo vzore i I.

Ďalšie znaky a výhody, ktoré vynález prináša, sú zrejmé z nasledujúceho opisu, nárokov a pripojených výkresov, ktoré ilustrujú rozpracovanie vynálezu.

Prehľad obr. na výkrese

Na obr. je znázornený rôntgenový difrakčný obrazec prednostného kryštálu podľa vynálezu.

Nasleduje podrobný opis tohto vynálezu.

Požadovaná kryštalická zlúčenina vzorca I je za podmienok okolia, napríklad pri teplote 23°C a relatívnej vlhkosti 50 % monohydrátom. Túto kryštalickú zlúčeninu je však tiež možné opísať ako nestechiometrický hydrát, pretože boli izolované kryštály obsahujúce premenlivé množstvo vody, v závislosti od toho, za akých podmienok bola kryštalická látka sušená a akej relatívnej vlhkosti bola kryštalická látka vystavená. Napriek tomu, že je teda možné monohydrát označiť za normálny stálejší stav, môže tento monohydrát naberať alebo strácať vodu v závislosti od relatívnej vlhkosti. Nezdá sa, že by tieto relatívne zmeny množstva vody v rozmedzí od asi 0,5 do asi 2 molárnych ekvivalentov meli za následok zmenu kryštalickej štruktúry, ako je to dokumentované práškovým rôntgenovým difrakčným obrazcom. Tak napríklad pri relatívnej vlhkosti 62 % môže kryštál obsahovať 4,5 % vody, čo zodpovedá dihydrátu, ale napriek tomu, je jeho róntgenový difrakčný obrazec zhodný s obrazcom požadovanej kryštalickej formy. Možné je že môže nastať stav, kedy požadovanú kryštalickú štruktúru doloženú rôntgenovým ohybovým obrazcom bude vykazovať dokonca i bezvodá zlúčenina. Požadovaný kryštál je teda možné označiť za hygroskopický. Lepšie porozumenie tomuto vynálezu môže poskyt núť obr. 1, ktorý ilustruje práškový róntgenový difrakčný obrazec požadovaného kryštálu. Na obr. 1 je intenzita (Y) v cykloch za sekundu vynesená do grafu proti 2 théta (X) v stupňoch.

V podstate čistý (s obsahom nečistôt iných ako je voda nižším ako asi 5 %) amorfný ( 3β, 5of, 25R)-3-[ ( β-D-celobiozyl)oxy]spirostán-11-on (napríklad dihydrát alebo monohydrát) sa premení na požadovanú kryštalickú formu tak, že sa táto amorfná látka suspenduje vo vhodnom rozpúšťadle (napriek tomu, že konverzia na požadovanú kryštalickú fázu samozrejme zahŕňa rozpustenie amorfnej látky a vyzrážanie požadovanej kryštalické formy), prednostne metanolu alebo zmesi metanolu a vody (ako je to uvedené ďalej, obsah vody môže byť až 10 %, vztiahnuté na hmotnosť zlúčeniny) a potom sa vykoná kryštalizácia. Amorfná východisková látka prednostne obsahuje menej ako asi 10 % hmotnostných vody a prednosť sa venuje tomu, aby jej obsah vody ležal približne v rozmedzí od 1 do 4 % hmotnostných. Časť tejto vody sa obyčajne zabuduje do kryštálu vo forme hydrátovej vody. Alternatívne je možné kryštalizáciu vykonávať za bezvodých podmienok, pričom hydrát sa ľahko vytvorí po vystavení okolitej vlhkosti. Koncentrácia zlúčeniny v rozpúšťadle leží prednostne v rozmedzí od asi 10 až 1 000 do asi 10 až 100 g/liter. Osobitná prednosť sa venuje koncentrácii v rozmedzí od asi 10 až 1 000 do asi 40 až 1 000 g/liter. Teplota rozpúšťania prednostne leží v rozmedzí od teploty okolia (napríklad 17 až 30°C) do teploty spätného toku, pričom účinnejšia je teplota v rozmedzí od 60°C do teploty spätného toku. Zvýšená teplota sa obyčajne udržiava počas asi 8 až 24 hodín. Pokiaľ sa pri rozpúšťaní používajú zvýšené teploty, výsledná suspenzia sa nechá schladnúť na teplotu okolia a kryštály sa nechajú asi 12 až 60 hodín granúlovať a potom sa bežným spôsobom, ako je napríklad filtrácia a vákuové sušenie, oddelia.

Surový ( 3/3, 5cť, 25R) -3-[(/3-D-cel ob i ozyl) oxy] spirostán-ll-on sa obyčajne pripraví deacetyláciou (tento postup je opísaný ďalej v preparát ívnom postupe 1), prečistí sa pre zrážaním s vhodného rozpúšťadla a až potom sa použije pri výrobe požadovaného kryštálu. Ako rozpúšťadlá na prezrážanie sa používajú acetonitril, metylénchlorid, tetrahydrofurán, ketón s 1 až 5 atómami uhlíka, organické kyseliny s 1 až 4 atómami uhlíka alebo alkoholu s 1 až 4 atómami uhlíka, a to buď samotné, alebo v kombinácii s až 60 % hmotnosťnými vody. Osobitná prednosť sa z týchto rozpúšťadiel venuje zmesi N-propanolu a vody v hmotnosťnom pomeru v rozmedzí od asi 50 : 50 do asi 90 10. Koncentrácia zlúčeniny v rozpúšťadle obyčajne leží v rozmedzí od asi 10 až 1 000 do asi 50 až 1 000 g/liter, prednostne v rozmedzí od asi 10 až 1 000 do asi 10 až 100 g/liter. Obyčajne sa surový deacetylačný produkt (ktorý má v podstate amorfný charakter) zmieša s požadovaným rozpúšťadlom alebo rozpúšťadlami, zmes sa zahreje (napriek tomu, že dostačujú i teploty okolia), prednostne na teplotu spätného toku, počas asi 10 až 60 minút a nerozpustná látka (nečistoty) sa oddelia bežnými filtračnými technológiami (napríklad pri pomoci kremeliny). Získaný roztok sa nechá schladnúť a vzniknutá suspenzia sa prefiltruje.

( 3/3, 5of, 25R) - 3- [(/3-D - ce 1 ob i ozyl ) oxy] spi rošt án - 11 - on sa vyrobí spôsobmi opísanými v patentovej prihláške USA č. 07/904 914 podanej 26. júnu 1992. Celý obsah tejto prihlášky (ktorá bola prevedená na rovnakú firmu, ako prihláška predloženého vynálezu) je relevantný pre opis tohto vynálezu a táto citácia je tu preto uvedená náhradou 2a prenesenie jej celého obsahu do opisu tohto vynálezu.

Nárokovanú zlúčeninu je možné pripraviť najmä takto ( 3β, 5of, 25R) -3 - [ ( heptacetyl - p-D-ce 1 ob i ozy 1) oxylspi rostán-ll-on sa deacetyluje tak, že sa uvedie do styku s nukleofilnou bázou, ako je metoxid sodný alebo kyanid draselný, v rozpúšťadle, ako je metanol, tetrahydrofurán, Npropanol alebo ich zmesi, pri zvýšenej teplote v rozmedzí od 40 do 100°C (obyčajne pri teplote spätného toku) za tlaku v rozmedzí od asi 3,4 kPa do asi 344 kPa (obyčajne za tlaku okolia) na asi 0,25 až asi 3 hodiny, pričom vznikne (3p,5rf, 25R)- 3-[(p-D-ce1 obi ozy1)oxy]spi roštán-11 - on.

( 3p, 5cf, 25R) -3 - [ ( heptaacetyl - p-D-ce 1 ob i ozy 1) oxy] spirostán-11-on sa vyrobí kondenzáciou heptaacetyl-p-D-celob i ozy 1 bróm i du s ( 3p, 5cŕ, 25R) - 3-hydroxyspi rošt án - 1 - onom v aprotickom bezvodom inertnom rozpúšťadle, napríklad acetonitrile pri teplote v rozmedzí od asi 20 do asi 100°C v prie behu 0,5 až asi 12 hodín v prítomnosti 0,5 až asi 4 ekvivalentov fluoridu zinočnatého.

Východiskové látky pre hore uvedené reakcie (napríklad peracetylovaný halogenid cukru) sú ľahko dostupné alebo je môže odborník v tomto odboru ľahko syntetizovať pri použití obvyklých postupov organickej chémie. (3p,5ce, 25R)3 - hydroxy-spi roštán-11 - on je konkrétne dostupný od firmy Aldrich Chemical Company Milvaukee, Wisconsin alebo od firmy Steraloids Inc., Wilton, New Hampshire, USA. Všeobecné preparačné metódy pre výrobu ( 3p, 5cf, 25R)-3-hydroxyspi rostán11-onu sú okrem toho uvedené v knihe L.F. Fieser a M. Fieser Steroids, Reinhold. Publ. Corp. New York, 1959 a v citáci10 ách, ktoré sú v tejto knihe uvedené. Konkrétny návod môže poskytnúť nasledujúci opis.

( 3p, 5ct, 25R)-3-hydroxyspirostán- 1 1 -on je možné vyrobiť di acetyl ác i ou ( 3/3, 5ce, 25R) - 3, 1 2-d i hydroxysp i rostán11-onu postupom opísaným v J. Chem. Soc. 1956, 4 330 a nasledujúcou redukciou vzniknutého produktu vápnikom v amoniaku pri použití postupu opísaného v J. Chem. Soc. 1956 4 334.

( 3p, 5cť, 25R)-3, 1 2-dihydroxyspi rostán-1 1-on sa môže vyrobiť monobromáciou hekogenínu spôsobom opísaným v US patente č.

178 418 (celá táto citácia je relevantná pre opis tohto vynálezu a je tu preto uvedená náhradou za prenesenie jej celého obsahu do opisu tohto vynálezu) a nasledujúcou hydrolýzou, ktorá sa vykonáva spôsobom opísaným v J. Chem. Soc. 1956, 4 330.

Získanou zlúčeninu vzorca I, ktorá obsahuje asymetrické atómy uhlíka, je možné rozdeliť na diastereoméry na základe fyzikálne chemických rozdielov týchto diastereoraérov známymi spôsobmi, napríklad chromatografiou a/alebo frakčnou kryšt a1 i zác i ou.

Zlúčenina podľa vynálezu je silným inhibítorora absorpcie cholesterolu a hodí sa preto pre terapeutické použitie ako činidlo potlačujúce hypocholesteroléraiu cicavcov, najmä ľudí. S ohľadom na to, že hypocholestero1émi a má úzky vzťah k vývoju generalizovaných kardiovaskulárnych, cerebrovaskulárnych alebo periférnych vaskulárnych porúch, sekundárnym účinkom tejto zlúčeniny je prevencia vývoja aterosklerózy, najmä artériosklerózy.

Účinnosť zlúčeniny podľa vynálezu spočívajúca v potlačovaní hypocholesterolémie je možné dokumentovať metódami založenými na štandardných postupoch. Tak napríklad in vivo účinnosť tejto zlúčeniny pri inhibícii intestinálnej absorpcie cholesterolu je možné stanoviť spôsobom opísaným v publikácii Helchoir a Harvell, J. Lipid Res. 1985, 26,

306 až 315.

Účinnosť je možné vyjadriť ako množstvo hypocholesterolemického činidla, ktoré je potrebné pre zníženie absorpcie cholesterolu s ohľadom na kontrolu pri použití skúšania na samcoch zlatého sýrskeho chrčka. Samcom zlatého sýrskeho chrčka sa počas 4 dní buď podáva potrava neobsahujúca cholesterol (kontrolné zvieratá), alebo potrava doplnená o 1 % cholesterolu a 0, 5 % kyseliny cholovej. Ďalší deň sa zvieratá ponechajú bez potravy počas 18 hodín a potom sa im podá 1,5 ml orálny bolus vody obsahujúci 0,25 % metylcelulózy, 0,6 % naraáčadla Tveen 80 a 10 % etanolu (kontrolné zvieratá) alebo orálny bolus, ktorý okrem toho obsahuje skúšanú zlúčeninu v požadovanej koncentrácii. Ihneď po podaní bolusu dostanú zvieratá druhý 1,5 ml orálny bolus kvapalnej potravy pre chrčky s obsahom 1 % [³H]cholesterolu (2,0 juCi/zviera: 210 rozpadov za minútu/nmol) a 0, 5 % kyseliny cholovej a ponechajú sa ďalších 24 hodín bez potravy. Na koncu tohto druhého pôstu sa zvieratá usmrtia, vyrežú sa nim pečeň, pečeň sa zmydelní a alikvotné vzorky produktu sa odfarbia prídavkom peroxidu vodíka a podrobia meraniu rádioaktivity. Celková pečeňová rádioaktivita sa prepočíta na zistenú hmotnosť pečene. Stupeň absorpcie cholesterolu sa vyjadri ako percentuálny podiel celkovej rádioaktivity podanej vo forme orálneho bolusu, ktorý je prítomný v pečeni 24 hodín po podaní tohto bolusu.

Antiaterosklerotický účinok skúšaných zlúčenín je možné vyjadriť ako množstvo činidla, ktoré je potrebné pre zníženie ukladania lipidov v aorte králika. Samci novozélandského bieleho králika sú počas 1 týždňa (potrava sa podáva raz denne) kŕmený potravou obsahujúcou 0,4 % cholesterolu a 5 % arašidového oleja. Po jednom týždni sa nie12 ktorým králikom (kontrolná skupina) ďalej podáva rovnaká potrava a ostatným sa táto potrava podáva doplnená o požadovanú koncentráciu skúšanej zlúčeniny. Po 8,5 týždňa sa podávanie liečiva preruší a zvieratá sa udržujú na diéte obsahujúcej cholesterol ďalšie 2 týždne a potom sa na 5 týždňov prevedú na bezcholesterolovú diétu. Zvieratá sa usmrtia a vyberie sa nim aorta od hrudnej klenby do vetve iliaku. Aorta sa očistí od adventícií, pozdĺžne otvorí a ofarbí farbivom Sudán IV spôsobom opísaným v Holman et al., Lab. Invet. 1958,

7, 42 - 7. Percentuálny podiel ofarbeného povrchu sa kvantitatívne vyhodnotí denzitometriou pri použití zariadenia Optimas Image Analysing System (Image Processing Systems). Zníženie ukladania lipidov je charakterizované znížením percentuálneho podielu ofarbeného povrchu skupiny, ktorej sa podáva liečivo v porovnaní s kontrolnými králikmi.

Zlúčenina podľa vynálezu sa môže podávať akýmkoľvek spôsobom, ktorý ju dopraví do črevného priesvitu. Tieto metódy zahŕňajú orálne podávanie, intraduodenálne podávanie atď.

Množstvo podávaného steroidného glykosidu bude samozrejme závisieť od liečeného subjektu, stupňa postihnutia, spôsobu podávania a od úvahy ošetrujúceho lekára. Obyčajne bude účinná dávka ležať v rozmedzí od 0,71 do 200 mg/kg/deň, prednostne od 2 do 50 mg/kg/deň a najvýhodnejšie od 2 do 7 mg/kg/deň. Pre 70 kg človeka to bude znamenať podanie dennej dávky 0,05 až 14, prednostne 0,14 až 3,5 a najvýhodnejšie 0, 14 až 0,5 g.

Pre orálne podávanie sa môžu použiť farmaceutické prostriedky vo forme roztokov, suspenzií, tabliet, pilúl, kapsúl, práškov, prostriedkov s retardovaným uvoľňovaním apod.

V závislosti od zamýšľaného spôsobu podávania môže mať farmaceutický prostriedok pevnú, polopevnú alebo kvapalnú povahu, a môže ísť napríklad o tablety, piluly, kapsuly, prášky, kvapaliny, suspenzie apod., prednostne v jednotkových dávkovacích formách vhodných pre podávanie presne kvantifikovaných dávok. Tieto farmaceutické prostriedky môžu okrem zlúčeniny podľa vynálezu, ako účinné prísady, obsahovať obvyklé farmaceutické nosiče a excipienty. Okrem toho môžu obsahovať tiež iné medicinálne alebo farmaceutické činidlá, nosiče, adjuvanty atď.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu môžu obsahovať 0,1 až 95 %, prednostne 1 až 70 % zlúčeniny podľa vynálezu, V každom prípade by mal podávaný farmaceutický prostriedok obsahovať túto zlúčeninu v množstve, ktoré je účinné pre potlačovanie hypercholesterolémie alebo aterosklerózy.

V pevných farmaceutických prostriedkoch sa môžu používať obvyklé netoxické pevné nosiče, ako je napríklad manitol, laktóza, škrob, stearan horečnatý, sodná soľ sacharín, mastenec, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan horečnatý apod., pričom tieto látky sa používajú vo farmaceut ickej kvali te.

Kvapalné farmaceutické prostriedky je možné vyrábať tak, že sa steroidný glykozid rozpustí alebo disperguje alebo inak upraví a potom prípadne zmieša s farmaceutickým adjuvantom v nosiči, ako je napríklad voda, roztok chloridu sodného, vodný roztok dextrózy, glycerol, etanol apod., za vzniku roztoku alebo suspenzie.

Spôsoby výroby rôznych farmaceutických prostriedkov obsahujúcich určité množstvo účinnej prísady sú známe, alebo sú zrejmé odborníkom v tomto odboru. Potrebné údaje je možné napríklad nájsť v príručke Remingtons Pharmaceutical Scien14 ces, Mack Publishing Company, Easter, Pensylvánia, USA, 15. vydanie z roku 1975.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady rozpracovania vynálezu

Príklad 1

Kryštál i cký ( 3β, 5af, 25R) -3[(/3-D-celobi ozy 1 ) oxy]spi roštán- 11 - on

V trojhrdlej banke s guľatým dnom, ktorá je opatrená lopatkovým miešadlom sa suspenduje nevysušený koláč z čiastočnej kryštalizácie (viď preparatívny postup A uvedený ďalej) v 500 ml metanolu. Vzniknutá suspenzia obsahuje podľa Karí-Fischerovej analýzy 2,5 % vody. Táto suspenzia sa za miešania 16 hodín zahrieva na teplotu spätného toku, ochladí sa na teplotu okolia a kryštály sa nechajú 48 hodín granulovať. Zlúčenina uvedená v nadpise sa odfiltruje a vysuší za vákua. Získa sa 16,1 g (výťažok 81 %) produktu. Práškový rontgenový difrakčný obrazec tejto vzorky ukazuje, že bola izolovaná požadovaná kryštalická forma zlúčeniny uvedenej v nadpise.

Podobne pripravená látka sa tiež podrobí ďalším analýzam, pri ktorých sa získajú tieto výsledky: tepelná gravimetrická analýza (rýchlosť zahrievania 30°C/rain) vykazuje stratu 1,8 % hmotnostného pri 100°C a stratu 3,0 % hmotnostného pri 300°C. Obsah vody stanovený Karl-Fischerovou titráciou je 1,4 %. D i ferenciálna kalorimetria (DSC) (rýchlosť zahrievania 20°C/min) vysušenej látky poskytuje dve malé endotermy (pri asi 211 a 295°C), po ktorých nasleduje rozklad.

X

Analýza pre C35H62O14.ÍHaO vypočítané: C 60,61, H 8,35 nájdené: C 60,81, H 8,32

Preparatívny postup A

Výroba ( 3/3, 5oŕ, 25R) -3[ ( /3-D-celobiozyl) oxylspirostán- 11 - onu deacetyláci ou

Zmes 3/3, 5oť, 25R) -3E < heptaacetyl -/3-D-celobiozyl) oxy] spirostán-11-onu (6,57 g, 6,26 mmol), metoxidu sodného (68 mg, 1,25 mmol), metanolu (35 ml) a tetrahydrofuránu (75 ml) sa 1 hodinu zahrieva na teplotu spätného toku a potom 12 hodín mieša pri teplote miestnosti. Behom 30 minút sa vytvorí biela zrazenina. Výsledná suspenzia sa skoncentruje pri zníže nom tlaku, a tak sa získa 6,0 g surového produktu. Táto látka sa prečistí rýchlou chromatografiou pri použití najprv chloroformu a potom zmesi chloroformu s metanolom v pomeru 8 ^: 2, ako elučného činidla. Získa sa 2,71 g (výťažok 57 %) zlúčeniny menovanej v nadpise.

’H NMR (DMSO-d_fl) δ : 5,22 (d, J= 5Hz, 1H); 5,00 (m, 3H); 4,54 (s, 1H);

4,58 (t, J= 5 Hz, 1H); 4,54 (t, J= 6Hz, 1H); 4,34 (q, J= 8 Hz, 1H); 4,27 (d,

J= 8Hz, 1H); 4,23 (d, J= 8 Hz, 1H); 3,68 - 2,94 (m, 15 H); 2,34 (m, 2H); 2,08 - 0,81 (m, 23H); 0,92 (s, 3H); 0,86 (d, J = 7 Hz, 3H); 0,72 (d, J = 6 Hz, áH);

0,59 (s, 3H). DEPT ¹³C NMR (DMSO-d_e) <5 : 210,4 (s), 108,8 (s), 103,6 (d),

100.6 (d), 81,1 (d), 80,6 (d), 77,2 (d), 76,9 (d), 76,5 (d), 75,5 (d), 75,1 (d),

73,7 (d), 73,6 (d), 70,5 (d), 66,4 (t), 63,5 (d), 61,5 (t), 60,9 (t), 50,5 (d), 57,1 (t), 54,7 (d). 44,3 (s), 44,1 (d), 41,7 (d), 36,8 (d), 35,6 (t), 35,2 (s), 34,0 (t),

32.6 (t), 31,3 (s), 30,2 (d), 29,2 (t), 28,9 (t), 28,2 (t), 17,5 (q), 17,3 (q), 14,8 (q), 12,3 (q). IR (KBr): 3407 (s), 1700 (m) cm’¹.

FAB HRMS (m/e) : pre C39H620i4Na^; vypočítané: 777,4037, nájdené: 777,4108.

Analýza pre C39H62O14.2H2O ' vypočítané: C 59,22, H 8,41 nájdené: c 59,48, H 8,48

Teplota topenia·’ nad 300°C.

Do trojhrdlej banky s guľatým dnom opatrenej lopatkovýra miešadlom sa umiestni 20 g produktu deacetylácie získaného hore uvedenou reakciou, 600 ml n-propanolu a 400 ml vody. Vzniknutá suspenzia sa zahreje na teplotu spätného toku a pritom vznikne roztok. K tomuto roztoku sa pridá 2, 0 g kremeliny. Zmes sa udržuje pri teplote spätného toku a nerozpustné zložky sa odfiltrujú. Objem filtrátu sa destiláciou za atmosférického tlaku upraví na 600 ml a potom sa ochladí na teplotu okolia. Kar1-Fischerová analýza vzniknutej suspenzie ukazuje, že obsahuje 40,5 % vody. Výsledná suspenzia sa nechá 1 hodinu granulovat! a sčasti vykryštalizovaný produkt (intermediárna fáza) sa odfiltruje. Napriek tomu, že je získaný produkt sčasti kryštalický, nevykazuje požadovaný rontgenový difrakčný obrazec.

Preparatívny postup B ( 3/3, 5<x, 25R) - 3 [ ( heptaace ty 1 - /3 - D - ce 1 ob i ozy 1) oxy ] spi rostán- 11 - on kondenzácia voľného spirostánu vyvolaná fluoridom zinočnatým

Suspenzia 3β, 5<x, 25R) -3-hydroxyspi rostán-1 1 -onu (3,0 g, 6,97 mmol) a bezvodého fluoridu zinočnatého (2,88 g, 27,9 mmol) v suchom acetonitrile (175 ml) sa vysuší oddestilovaním 75 ml acetón i tri 1 u. Vzniknutá suspenzia sa nechá schladnút, pridá sa k nej heptaacety1 - p - D-ce1obiozy1bróm i d (9,75 g,

13,9 mmol) a výsledná suspenzia sa 3 hodiny zahrieva na 65°C. Zmes sa ochladí na teplotu miestnosti, pridá sa k nej metylénchlorid (150 ml) a vzniknutá suspenzia sa 10 minút mieša a potom sa prefiltruje. Filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku, a tak sa získa 10 g surového produktu. Táto látka sa rozpustí v zmesi chloroformu a metanolu v pomeru 8 2, roztok sa peradsorbuje na stĺpci silikagélu a produkt sa prečistí rýchlou chromatografiou pri použití zmesi etylacetátu a hexánu v pomeru 1 1 a potom čistého etylacetátu, ako elučného činidla. Získa sa 6,81 g (výťažok 93 zlúčeniny menovanej v nadpise.

Ή NMR (CDCI₃) Ó : 5;11 (komplex, 2 H); 5,04 (t, J = 9 Hz, 1H); 4,90 (t, J = 9 Hz, 1H); 4,83 (t, J = 8 Hz, 1H); 4,49 (komplex, 4H); 4,34 (dd,

J = 4,5 & 12,5 Hz, 1H); 4,04 (t, J = 13 Hz, 1H); 4,03 (t, J = 11 Hz,

1H); 3,72 (t, J = 9,5 Hz, 1H); 3,65 (m, 1 H); 3,56 (m, 1 H); 3,45 (m,

1H); 2,47 (m, 1 H); 2,22 (s, 2H); 2,08 (s, 3H); 2,06 (s, 3H); 2,00 (s,

6H); 1,99 (s, 6H); 1,96 (s, 3H); 2,00 - 1,00 (m, 22H); 0,98 (s, 3H); 0,92 (d, J = 7 Hz, 3H); 0,77 (d, J = 7 Hz, 3H); 0,68 (s, 3H). DEPT ’³C

NMR (CDCI₃) δ : 209,9 (s), 170,5 (s), 170,3 (s), 170,2 (s), 169,9 (s),

169,8 (s), 169,5 (s), 169,3 (s), 169,0 (s), 109,2 (s), 100,8 (d), 99,4 (d),

90,0 (s), 80,6 (d), 79,4 (d), 76,6 (d), 75,3 (s), 72,9 (d), 72,6 (d), 72,5 (d), 71,9 (d), 71,8 (d), 71,6 (d), 67,8 (s), 66,9 (t), 64,4 (d), 62,1 (t),

61,5 (t). 60,8 (s), 60,7 (d), 57,6 (t), 55,7 (d), 44,8 (d), 44,3 (s), 41,8 (d),

36,9 (d), 35,6 (t), 35,2 (s), 34,1 (t), 32,7 (t), 31,3 (t), 31,2 (t), 30,2 (d),

29,0 (t), 28,7 (t), 28,0 (t), 20,9 (q), 20,7 (q), 20,6 (q), 20,5 (q), 20,5 (q),

17,1 (q), 17,0 (q), 14,2 (q), 12,0 (q). IR (KBr): 1756 (s), 1706 (m) cm⁴.

Analýza pre C53H76O21 H2O vypočítané: C 59,65, H 7,37 nájdené: C 59,86, H 7,25

Teplota topenia: 210 až 212°C.

Preparatívny postup C ( 3/3, 5of, 12/3, 25R) - spi rostán - 3, 12-diol-ll- on ( 3/3, 5cť ,11/3, 25R) - 1 1 - bróm sp i rostán - 3 - ol - 12 - on

Do reaktoru vyloženého sklom sa umiestni 190 litrov metanolu a pod jeho povrch sa uvádza plynový chlorovodík tak dlho, kým sa neabsorbuje 7,7 kg (5,0 ekvivalentu) chlorovodíka. Potom sa do reaktoru pridá 18,8 kg (42,2 mol) (3p,5of,25R) spi roštán-3-o1 - 12-onu (hekogenínu), 190 litrov metanolu a 38 litrov metylénchloridu. Vzniknutá zmes sa ochladí na 10°C a behom dvoch hodín sa k nej pridá roztok 8,4 kg brómu (52,7 mol, 1,25 ekvivalentu) v 38 litroch metylénchloridu, pričom teplota vnútri reakčnej nádoby sa udržiava približne na 10°C. Po dokončení prídavkov sa reakčná zmes nechá ohriatí na teplotu miestnosti a 2 hodiny sa mieša. V tomto okamihu ukazuje chromatografia na tenkej vrstve, že reakcia je ukončená.

Reakčná zmes sa zriedi 190 litrami vody, mieša sa 10 minút, oddelia sa vrstvy a vodná vrstva sa dvakrát extrahuje vždy 114 litrami metylénchloridu. Všetky tri organické extrakty sa spoja a dvakrát premyjú 114 litrami vody, raz 114 litrami nasýteného roztoku chloridu sodného a vysuší sa pomocou 7,0 kg síranu horečnatého. Sušidlo sa odfiltruje na 76cm Lappovom filtre a premyje dvakrát 11,4 litru raetylénchloridu. Filtrát sa spojí s premývacími lúhmi a objem zmesi sa destiláciou za atmosférického tlaku upraví na 27 litrov.

K zvyšku sa pridá dvakrát 38 litrov metanolu a ďalej sa pokračuje v destilácii. Keď sa konečný objem zmenší pod 38 litrov, zmes sa ochladí na teplotu miestnosti. Výsledná suspenzia sa nechá 2 hodiny granúlovať, prefiltruje sa na 76cm Lappovom filtre a filtračný koláč sa dvakrát premyje vždy 11,4 litru metanolu. Potom sa filtračný koláč suší za vákua pri 45 až 50°C. Získa sa 12,6 g (58,6% výťažok) zlúčeniny menovanej v nadpise.

( 3/3, 5of, 12(3, 25R) - sp i rostán - 3, 12-diol-ll- on

Do sklom vyloženého reaktoru sa predloží 12,4 g ( 3(3, 5oí, 1 1/3, 25R) - 11 -brómspi roštán-3-o1 - 12-onu (24,34 mol)

125 litrov terc.butanolu, 125 litrov vody a 7, 5 kg (189 mol, 7,75 ekvivalentu) hydroxidu sodného. Reakčná zmes sa 1,5 ho19 diny zahrieva k spätnému toku a počas 4,5 hodiny sa spätný tok udržiava pri teplote vo varnej nádobe 83°C. Potom sa reakčná zmes ochladí na teplotu miestnosti. V tomto okamihu ukazuje chromatografi a na tenkej vrstve, že reakcia je ukončená.

Z reakčnej zmesi sa destiláciou odstráni terc.butanol. Táto destilácia sa uskutočňuje ako za vákua, tak za atmosférického tlaku. V priebehu koncentračného postupu sa k zmesi pridá dvakrát vždy 123,5 litru vody. Po odstránení terc.butanolu sa vzniknutá vodná suspenzia ochladí na teplotu miestnosti a nechá 2 hodiny granulovať. Potom sa suspenzia prefiltruje cez 76cm Lappov filter, premyje sa dvakrát 11,4 litru vody a filtračný koláč sa usuší na vzduchu pri 60°C. Získa sa 11,1 kg zlúčeniny uvedenej v nadpise.

Preparatívny postup D ( 3β, 5ot, 25R) - spi rostán- 3 - ol - 11 - on (3/3, 5of, 12/3, 25R) -3, 12-diacetoxyspirostán- 11 - on

Do sklom vyloženého reaktoru sa predloží 99 litrov pyridínu, 99 litrov acetanhydridu a 11,0 kg ( 3β, 5ce, 12/3, 25R) spirostán-3, 12-di o1 - 11 -onu (z preparát ívneho postupu C). Vzniknutá zmes sa 2 hodiny zahrieva k spätného toku (teplota vnútri varnej nádoby je 128°C) a potom sa nechá schladnúť na teplotu miestnosti. Objem reakčnej zmesi sa destiláciou pri zníženom tlaku zníži na 57 litrov (teplota vnútri varnej nádoby je behom tejto destilácie 45°C). Vzniknutá suspenzia sa zriedi 95 litrami kyseliny octovej a pokračuje sa v destilácii pri zníženom tlaku tak dlho, kým sa objem zmesi nezníži na 57 litrov (na konci tejto destilácie je teplota vnútri varnej nádoby približne 80°C). Zmes sa zriedi 331 litrami vody a ochladí na teplotu miestnosti. Po 5 hodi20 nách granulácie sa zlúčenina menovaná v nadpise odfiltruje na 76cm Lappovom filtre a odfiltrovaná látka sa premyje dvakrát vždy 11,4 litru vody. Filtračný koláč sa vysuší za vákua pri 60°C. Výťažok požadovaného produktu je 12,2 kg (93,3 % teórie).

( 3/3, 5cf, 25R) -spirostán-3-ol -1 1 -on

Reaktor 2 nehrdzavejúcej oceli sa ochladí na -80°C vedením kvapalného dusíka vnútorným hadom. Do reaktoru sa uvádza amoniak tak dlho, kým reaktor neobsahuje 54,5 kg (80 litrov, 3 200 mol, 170 ekvivalentov) tejto látky.

Súčasne s plnením hore uvedeného reaktoru amoniakom sa do sklom vyloženého reaktoru predloží 10,0 kg (3/3, 5<x, 12/3, 25R)-3,12-diacetoxyspirostán-11-onu (18,84 mol) a 152 litrov tetrahydrofuránu. Objem reakčnej zmesi sa destiláciou za atmosférického tlaku upraví na 99 litrov.

Keď je prvý reaktor naplnený skondenzovaným amoniakom, začnú sa do nej pridávať vápnikové hobliny (2,8 kg, 69,0 gatómu, 3,7 ekvivalentu). Pridávanie je skončené za 30 minút a prebieha pri udržovaní teploty v reakčnej nádobe na hodnote -50°C. Po skončení tohto prídavku sa k vzniknutej zmesi behom 20 minút pridá tetrahydrofuránový roztok ( 3β, 5ce, 12β, 25R) -3, 12-diacetoxyspirostán- 11 - onu (teplota vnútri reakčnej nádoby je na konci tohoto prídavku -35°C) a tiež 3,8 litru tetrahydrofuránu, ktorý bol použitý pre vypláchnutie sklom vyloženého reaktoru. Reakčná zmes sa 30 minút mieša pri -35 až -40°C a pri tejto teplote sa k nej pridá najprv 3,33 litru brómbenzénu (4,98 kg, 31,7 mol,

1,68 ekvivalentu) a potom 3,33 litru vody.

Po dokončení posledne uvedeného prídavku sa zaháji destilácia amoniaku z reaktoru. Oddesti 1ované pary sa vedú do vodného skrubru. Po odstránení všetkého amoniaku sa reak čná zmes (ktorá má teraz teplotu 24°C) premiestni do sklom vyloženého reaktoru. Do tohto reaktoru sa tiež pridá 15,2 litru tetrahydrofuránu použitého pre vypláchnutie reakčnej nádoby. Roztok spolu s oplachovacou tekutinou sa podrobí destilácii pri zníženom tlaku, v ktorej sa pokračuje tak dlho, kým sa nezíska hustý olej. K tomuto oleju sa pridá 133 litrov metanolu a 3, 3 kg (59 mol) hydroxidu draselného. Vzniknutá zmes sa 1 hodinu zahrieva k spätnému toku, potom sa ochladí a pridá sa k nej najprv 10 litrov kyseliny octovej a potom 167 litrov vody. Potom sa suspenzia ochladí na teplotu miestnosti a nechá 1 hodinu granulovať. Vzniknutý produkt, ktorý je tvorený zlúčeninou uvedenou v nadpise sa odfiltruje na 76cm Lappovom filtre. Filtračný koláč sa premyje 19 litrami zmesi vody a metanolu v pomeru 3 1, Po vysušení za vákua pri 55°C sa získa 7,05 kg požadovaného produktu (výťažok 86,9 %) .

Claims (10)

1. Kryštalický monohydrát spirostanylglykozidu vzorca I (I)

H_?0

2. Kryštalický spirostany1 g1ykozi d, ktorý v rontgenovom difrakčnom obrazci vykazuje 20 najväčších pikov nasledujúcej vzdialenosti d= 23,74; 15,78; 11,82; 9,48; 7,90; 6,77;

6,34; 6,26; 5,91; 5,75; 5,61; 4,72; 4,61; 4,13; 4,00; 3,91;

3, 64; 3, 38; 2, 63 a 2, 49.

3. Kryštalický spirostany1 g1ykozi d podľa nároku 2, ktorým je monohydrát spirostany1glykozidu.

4. Kryštalický spirostanylglykozid, ktorého rôntgenový difrakčný obrazec zodpovedá obr. 1.

5. Farmaceutický prostriedok pre potlačovanie hypocholesterolémie alebo aterosklerózy u cicavcov, vyznačujúci sa týra, že obsahuje kryštálický monohydrát spírostany1 gIykozídu podľa nároku 1 a farmaceutický vhodný nosič.

6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, v y značujúci sa týra, že obsahuje kryštálický monohydrát spirostany1 g1yko2idu, ktorý v rontgenovom difrakčnora obrazci vykazuje 20 najväčších pikov nasledujúcej vzdialenosti d: 23,74: 15,78: 11,82: 9,48: 7,90; 6,77: 6,34: 6, 26: 5,91: 5,75: 5,61: 4,72: 4,61: 4,13: 4,00; 3,91: 3,64; 3, 38: 2,63 a 2,49.

7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, v y I značujúci sa tým, že obsahuje kryštálický monohydrát spirostanylglykozidu, ktorého rôntgenový difrakčný obrazec zodpovedá obr. 1.

8. Kryštalický monohydrát spirostanylglykozidu podľa nároku 1 pre potlačovanie hýpercho1esterolémi e alebo aterosklerózy u cicavcov.

9. Spôsob výroby kryštalického steroidného glykosidu, vyznačujúci sa tým, že sa (3/3, 5oŕ, 25R) -3 - C ( p - D-cel ob i ozy 1) oxylspirostán- 1 1 - on suspenduje v metanole a nechá sa vytvoril! kryštalický monohydrát ( 3p, 5oe, 25R) -3-[(β-D-celobi ozyl ) oxy1 spi rostán- 1 1 - onu .

10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa týra, že sa metanolický roztok zahreje a potom ochladí za vzniku kryštálov.