SI9400203A

SI9400203A - Spirostanyl glycosidal crystalline monohydrate

Info

Publication number: SI9400203A
Application number: SI9400203A
Authority: SI
Inventors: Douglas J M Allen; Harry A Watson; Jonathan B Zung
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1993-04-28
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1995-06-30
Also published as: YU22694A; FI941942A0; CA2161239A1; PL311278A1; OA10715A; CN1121722A; MA23179A1; US5760009A; HU9401209D0; CZ280195A3; SK135195A3; IL109374A0; BG100098A; ZA942772B; HUT67142A; WO1994025479A1; AP518A; FI941942A; EP0696292A1; NO954322D0

Description

SPIROSTANILNI GLIKOZIDNI KRISTALNI MONOHIDRAT

Ozadje izuma

Ta izum se nanaša na steroidne glikozide in načine uporabe le-teh, še posebej kot hipoholesterolemična sredstva in antiaterosklerotična sredstva pri sesalcih.

Mnogo poznanih produktov, ki imajo hipoholesterolemično aktivnost so navzkrižno vezani sintetični polimerni derivati, na primer polistirena. Primer: navzkrižno vezani, v vodi netopni, na žolčno kislino vezajoči se ostanki na osnovi polistirena kot je Cholesturamine (blagovna znamka; Op. prev.) povzročjo zrnat občutek v ustih in imajo slab okus. Poleg tega imajo ti ostanki ponavadi nizko učinkovitost in vivo. Torej je aktivna hipoholesterolemična doza teh snovi prekomerna, ponavadi 18-24 gramov formuliranega produkta na dan. Ostali znani polimeri, ki imajo hipoholesterolemično aktivnost vsebujejo naravne produkte citosana in citosanove derivate, kot je opisano v Evropean Application pub.No. 0212145. Vendar pa so učinkovite hipoholesterolemične doze teh snovi ravno tako visoke.

Ostale znane snovi za nadzor hiperholesterolemije vsebujejo rastlinske ekstrakte, kot so alfalfa saponini. Vendar pa imajo ti rastlinski ekstrakti različno sestavo in vsebujejo signifikantne količine neuporabnih kemičnih substanc. Zaradi razlike v sestavi je težko določiti standardno dozo ali predvideti prisotne nečistoče. Zaradi tega ti ekstrakti niso primerni za humano uporabo. Čiščenje teh ekstraktov pa je lahko drago. Kot alternativa, določene sintetično pridobljene spojine iz čistih sapogeninov, kot so substance pridobljene iz spirostana, spirostena ali iz sterola pridobljenih spojin, znižujejo absorbcijo holesterola bolj učinkovito kot alfalfa ekstrakti na utežni osnovi in se zaradi tega lahko administrirajo v razumno velikih dozah. Ker je kemijska sestava teh substanc znana in ker jih lahko sintetiziramo do visoke stopnje čistosti, so primerne za uporabo pri katerih koli toplokrvnih živalih, vključno z ljudmi.

Vendar, čeprav jih administriramo v visokih odmerkih, čisti sapogenini absorbcije holesterola ne inhibirajo signifikantno. Sapogenini imajo željeni učinek samo kadar so v kombinaciji. Primeri takih spojin sapogenina so spojine tigogenin, diosgenin in še posebej njihovi glikozidi. P.K. Kintia, lu. K. Vasilenko, G.M.Gorianu, V.A.Bobeiko,

I.V.Suetina, N.E.Mashchenko, Kirn. Pharm. Zh., 1981, 15(9), so odkrili 3-0-(β-D-galaktopiranozil)hekogenin in njegovo uporabo kot hipoholesterolemično sredstvo. U.S. Pat. No. 4,602,003 in 4,602,005 odkrivata določene steroidne glikozide, še posebej 3-0-(β-D-glukopiranozil)tigogenin in

3-O-(β-D-cellobiosil)tigogenin in njuno uporabo za nadzor hiperholesterolemije. 3-0-(β-D-celobiozil)tigogenin ima nadpovprečno hipoholesterolemično aktivnost v primerjavi z naprimer Cholesturamine (blagovna znamka).

Poleg tega, so določeni steroidni glikozidi, opisani spodaj bili objavljeni, vendar pa te objave ne opisujejo hipoholesterolemične aktivnosti. Structural Features of the Antioxidant and fungicidal Activity of Steroid

Glycosides,Dimoglo, A.S.; Choban I.N.; Berusker, I.B.;

Kintya, P.K.; Balashova, N.N.; Bioorg.Khim, 11(3), 408-413, 1985 odkriva rokogenin β-D-galaktopiranozid in tigogenin βD-laktozid. Preparation and Properties of Some Nev/ Steroid β-ϋ-ΘΙυοοργΓβηοείάβε, β-D-glukopiranosiduronic Acids, and Derivatives, Schneider, J.J.; Carb. Research, 17, 199-207, 1971 odkriva tigogenin β-D-glukopiranuronozid. Sterol Glycoside with Activity as Prostaglandin Synthetase Inhibitor, Pegel, K.H.Walker,H.; United States Patent 4,260,603, April 7, 1981 odkriva hekogenin β-Dglukopiranozid. Hemolytic Properties of Synthetic

Glycosides, Segal,R.; Shud,F.; MiloGoldzweig,I.;J.Pharm.Sci., 67(11) 1589-1592, 1978 odkriva tigigenin β-D-maltozid, tigogenin β-L-fukopiranozid, smilagenin β-maltozid in tigogenin α-L-ramnozid. Steroid Glycosides from the Roots of Capsicum Annuum II: The Structure of the Capsicosides', Gutsu, E.V.; Kintya, P.K.; Lazurevskii, G.V.; Khim. Prir. Soedin., (2) 242-246, 1987 odkriva tigogenin α-D-arabanopiranozid in tigogenin β-Dgalaktopiranozid. Molluscicidal Saponins from Cornus Florida L. Hostettmann, K.; Hostettmann-Kaldas, M.; Nakanishi, K.; Helv. Chim. Acta, 61, 1990-1995, 1987 odkriva smilagenin β-D-galaktopiranozid. Steroidal Saponins from Several Species of Liliiflorae Plants, Yang, C.; Li,K.; Ding, Y.; Yunnan Zhiwu Yanjiu Zengkagen, Suppl. 3, 13-23, 1990 odkriva (25S)-hekogenin celobiozid. Determination of the Absolute Configuration of a Secondary Hydroxy Group in a Chiral Secondary Alcohol Using Glycosidation shifts in Carbon-13 NMR Spectroscopy, Seo.S.; Tomita,Y.; Tori, K.; Yoshimura, Y.; J.Am.Chem.Soc., 100(11), 3331-3339, 1078 odkriva smilagenin β-glukozid in smilagenin a-glukozid. Steroid Glycosides from Asparagus Officinalis ,

Lazurevskii, G.V.; Goryanu,G.M.; Kintya, P.K.;

Dokl.Akad.Nauk. SSSR, 231(6), 1479-81, 1976 odkriva sarsapogenin β-glukozid.

Drugi steroidni glikozid, ki poseduje nadpovprečno hipoholesterolemično aktivnost je odkrit v U.S.patentni prijavi serial No. 07/904,914, vloženi 26.06.1992. V tej prijavi je odkrit dihidrat ( 3β,5α,25R)-3((β-Dcelobiozil)oksi)spirostan-ll-on in njegova uporaba kot hipoholesterolemično sredstvo in antiaterosklerotično sredstvo.

Kratek opis izuma

Ta izum se nanaša na kristalni monohidrat spirostanilnega glikozida, ki je uporaben kot. hipoholesterolemično ali antiaterosklerotična sredstvo. Kristal ima formulo

Izum se prav tako nanaša na kristalni spirostanilni glikozid, kjer ima lom X-žarkov naslednji interval-d:

Interval-d 20 najvišjih točk

23.74

15.78

11.82

9.48

7.90

6.77

6.34

6.26

5.91

5.75

5.61

4.72

4.61

4.13 4.00

3.91

3.64

3.38

2.63

2.49

Prednostni, izmed kristalnih spirostanilnih glikozidov, ki imajo zgornji interval-d je monohidrat.

Izum se nanaša tudi na kristalni spirostanilni glikozid, ki ima vzorec loma X-žarkov, kot je prikazan na sliki 1.

Poleg tega se predmetni izum nanaša tudi na farmacevtske sestavke za nadzor hiperholesterolemije ali ateroskleroze pri sesalcih, ki vsebujejo kristalno spojino s formulo I in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Taki farmacevtski sestavki lahko vsebujejo kristalno spojino s formulo I, kjer ima lom X-žarkov interval-d, kot je navedeno zgoraj ali pa ima lom X-žarkov vzorec, kot je prikazan na sliki 1.

Poleg tega se ta izum nanaša na metodo nadzorovanja hiperholesterolemije ali ateroskleroze pri sesalcih z administracijo nadzorne količine kristalne spojine s formulo I živalim obolelim zaradi hiperholesterolemije ali ateroskleroze .

Poleg tega je ta izum usmerjen tudi na postopek za pripravo kristalne spojine s formulo I. Postopek obsega kristalizacijo iz primernega topila, ki je prednostno metanol. V prednostni izvedbi tega postopka (3β,5α,25β)-3((β-D-celobiozil)oksi)spirostan-ll-on pomešamo v blato z zadostno količino metanola, ter tako pustimo zadosti dolgo časa, da po ohladitvi pridobimo (3β,5α,25R)-3-((β-Dcelobiozil) oksi ) spirostan-ll-on monohidrat.

Torej ta izum v stroki pomeni velik napredek, ker zagotavlja termodinamično stabilno kristalno obliko (3β,5α,25Κ)-3-((β-D-celobiozil)oksi)spirostan-ll-on. Pridobitev stabilne kristalne oblike olajša razvoj preglednega urejevanja spojine. Poeg tega, ima kristalna oblika zelo dobre karakteristike, kar se tiče rokovanja (to je tabletiranje). Ce primerjamo kristalno obliko z amorfno, ali z v bistvu amorfno spojino, ki je lepljiva, glini podobna in zelo gosta, zaradi česar jo je izjemno težko filtrirati.

Spojina s formulo I je tu definirana kot enojna enantiomera, ki ima absolutno stereokemijo narisano v formuli I.

Druge posebnosti in prednosti bodo razvidne iz specifikacije, zahtevkov in priloženih skic, ki upodabljajo izum.

Kratek opis slike

Skica I prikazuje vzorec loma X-žarkov prednostnega kristala iz predmetnega izuma.

Detaljni opis izuma

Ponavadi je, pri pogojih okolice (to je 23^eC; in 50% relativna vlaga) željena kristalna spojina s formulo I monohidrat. Vendar pa lahko kristalno spojino opišemo tudi kot nestohiometrični hidrat, ker kristali , ki so bili izolirani, vsebujejo različne količine vode, v odvisnosti od načina sušenja kristalnega materiala in relativne vlage, kateri je bil kristalni material izpostavljen. Torej, čeprav je monohidrat normalno bolj stabilno stanje, lahko monohidrat pridobi ali izgubi vodo, v odvisnosti od relativne vlage. Te relativne spremembe v količini vode, od 0.5 do približno 2 molnih ekvivalentov, ne povzročajo sprememb v kristalni strukturi, kot je zabeleženo s prašnatim vzorecem loma X-žarkov. Na primer, pri 62% relativni vlagi, kristal lahko vsebuje 4.5% vode, ki je združljiva z dihidratom in je vzorec loma X-žarkov še vedno skladen z željeno kristalno obliko. Lahko se zgodi, da tudi brezvodna spojina pokaže željene kristalne strukture, kot je evidentirano s pomočjo vzorca loma X-žarkov. Torej lahko željeni kristal opišemo kot higroskopičen. Boljše razumevanje predmetnega izuma lahko dosežemo s pomočjo slike 1, ki prikazuje prašnat vzorec loma X-žarkov željenega kristala. Na sliki 1 je prikazana intenzivnost (Y) v cps v razmerju do dva theta (X) v stopinjah.

Čisti (manj kot 5% nečistoč, razen vode) amorfni (3P,5a,25R)-3-((β-D-celobiozil)oksi)spirostan-11-on (kot npr. dihidrat, monohidrat) smo konvertirali v željeno

F, kristalno obliko tako, da smo amorfni material pomešali v blato v primernem topilu (čeprav seveda konverzija v željeno kristalno fazo vključuje tudi raztopitev amorfnega materiala in precipitiranje željene kristalne oblike), prednostno je to metanol ali mešanica metanol-voda, (kot je opisano spodaj, je vode lahko do 10% teže spojine), čemur sledi kristalizacija. Prednostno ima začetni amorfni material manj kot 10% teže vode in je Še posebej željeno, da ima od 1 do 4% teže vode. Ponavadi se nekateri deli vode vkorporirajo v kristal kot hidrat. Alternativno kristalizacijo lahko izvajamo v brezvodnih pogojih, hidrat pa se tvori takoj po izpostavitvi atmosferski vlagi. Prednostno je koncentracija raztopine v primerjavi s topilom cca. 1 proti 10 do 1 proti 10% glede na težo. Se posebej željena koncentracija je od cca. 1 proti 100 do 4 proti 100%. Raztopitvena temperatura variira prednostno med temperaturo okolice (npr. 17“ do 30°) do refluksa, medtem ko so temperature od 60’C do refluksa bolj učinkovite. Ponavadi povišane temperature vzdržujemo od cca.8 ur do cca. 24 ur. Ce te temperature uporabimo tudi pri raztapljanju, lahko dobljene suspenzije pustimo, da se ohladijo do temperature okolice in kristali granulirajo od cca. 12 to 60 ur, nato pa jih zberemo na poznane načine, najraje s filtracijo in sušenjem v vakuumu.

Ponavadi surovi (3β,5α,25R)-3-((β-Dcelobiozil)oksi ) spirostan-ll-on pridobljen z deacetilacijo (kot je opisano v Pripravku 1) Očistimo s pomočjo reprecipitacije iz primernega topila pred zgornjo pripravo željenega kristala. Prednostno je topilo acetonitril, metilen klorid, tetrahidrofuran, <<-05 keton, 0-^-04 organska kislina, alkohol sam ali v kombinaciji z 0 do 60 utežnimi procenti vode. Se posebej prednostno topilo je n-propanol : voda v razmerju od cca. 50 : 50 do cca.90 : 10. Ponavadi je razmerje koncentracije spojine v nasprotju s topilom od cca. 1 do 100 do cca. 5 do 100 utežnih procentov, prednostno od ·ι cca. 1 do 100 do cca. 1 do 10%. V glavnem, surovi produkt deacetilacije, (ki ima v bistvu amorfni značaj) pomešamo z željenim topilom (topili), segrejemo (čeprav temperatura okolice zadostuje), prednostno do refluxa, za cca. od 10 do 60 minut in netopni material (nečistoče) odfiltriramo s pomočjo poznanih načinov (kot npr. s pomočjo diatomejske zemlje). Raztopino nato pustimo, da se ohladi in dobljeno suspenzijo zberemo s filtracijo.

(30,5a,25R)-3-((0-D-celobiozil)oksi)spirostan-ll-on pripravimo po postopkih odkritih v U.S. patent appl.

No.: 07/904,914, vloženi 26.06.1992 (na katerega odkritje se predmetni izum sklicuje).

Se posebej lahko ščiteno spojino pripravimo na naslednji način:

(30,5a,25R ) -3-((heptaacet il-0-D-celobiozil)oksi)spirostan11-on deaceti1iramo s kombinacijo nukleofilnih baz, kot je natrijev metoksid ali kalijev cianid v topilu kot je metanol, tetrahidrofuran, n-propanol ali njihove mešanice pri povišanih temperaturah od cca. 40°C do 100°C (ponavadi pri refluksu) in pri tlakih od cca 3.4475 KPa do cca.

344.75 KPa (ponavadi pri tlaku okolice) cca. tri ure, da dobimo (30,5a,25R)-3-((0-D-oelobiozil)oksi)spirostan-ll-on.

(30,5a,25R)-3-((heptaaceti1-0-D-celobiozi1)oksi)spirostan11-on pripravimo s spajanjem heptaacetil-0-D-celobiozil bromida in (30,5a,25R)-3-hidroksispirostan-on v ne protskem, brezvodnem reakcijsko inertnem topilu (kot npr. acetonitril) pri temperaturi od cca.20’C do cca. 100°C, cca.0.5 do 12 ur v prisotnosti cca. 4 ekvivalentov cinkovega fluorida.

Začetne materiale zgoraj opisanih reakcij (kot npr. paracetiliran sladkorjev halid) so na voljo že pripravljeni, ali pa jih, v stroki vešči, enostavno sintetizirajo s pomočjo poznanih metod organske kemije. Se posebej je lahko dostopen (30,5a , 25R)-3-hidroksispirostan-ll-on in sicer nam ga lahko dobavi Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, USA ali pa Steraloids Inc., Wilton, N.H. Poleg tega lahko metode za pripravo ( 3(3,5α , 25R )-3-hidroksispirostan-on najdemo v L.F. Fieser in M.Fieser, Steroids, Reinhold. Publ. Corp.,

Nev/ York, 1959 in v navedbah v teh delih, vendar pa nam sledeči tekst zagotavlja specifične smernice.

( 30 , 5α,25R)-3-hidroksispirostan-on lahko pripravimo s pomočjo diacetilacije (30,5α,25R)-3,12-dihidroksispirostan11-on z uporabo postopka opisanega v J. Chem.Soc., 1956,

4330 in z redukcijo produkta s pomočjo kalcijem in amonijem po postopku opisanem v J.Chem.Soc. 1956, 4334. (30,5α,25R )3,12-dihidroksispirostan-ll-on lahko pripravimo s pomočjo monobrominacije hekogenina po postopku opisanem v

U . S . Pat.No.3,178,418 (katerega odkritje je sem vključeno z navedbo), čemu sledi hidroliza po postopku opisanem v J.Chem.Soc. 1956, 4330.

Spojino s formulo I, katero smo pridobili in ima asimetrične ogljikove atome, lahko ločimo v njene diastereomere na osnovi njihovih fizikalnih in kemijskih razlik po postopkih poznanih per na primer, s kromatografijo in/ali frakcionalno kristalizacijo.

Spojina predmetnega izuma je učinkovit inhibitor absorbcije holesterola in je torej prilagojena terapevtski uporabi kot sredstvo za nadzor hiperholesterolemije pri sesalcih, še posebej pri ljudeh. Ker je hiperholesterolemija tesno povezana z razvojem splošnih kardiovaskularnih, cerebralno vaskularnih ali periferalno vaskularnih motenj, sekundarno ta spojina preprečuje razvoj ateroskleroze še posebej arterioskleroze.

Nadzor hiperholesterolemije spojine iz predmetnega izuma, lahko pojasnimo s pomočjo metod na osnovi standardnih postopkov. Na primer aktivnost te spojine pri inhibiranju intestinalne absorbcije holesterola jun vivo. lahko ugotovimo po postopku izumiteljev Melchior in Harwell (J.Lipid Res., 1985,26 306-315). Aktivnost lahko ugotovimo s količino

1985,26 306-315). Aktivnost lahko ugotovimo s količino hiperholesterolemičnega sredtva, ki reducira absorbcijo holesterola, glede na primerjalne živalki, pri zlatih sirijskih hrčkih moškega spola. Le-tem 4 dni administriramo dieto brez holesterola (primerjalne živali) ali dieto z dodatkom 1% holesterola in 0.5% žolčne kisline. Naslednjega dne smo živali postili 18 ur in jim nato administrirali

1.5 ml vodno oralno pilulo, ki je vsebovala 0.25% metilceluloze, 0.6% Tween 80 (blagovna znamka; Op.prev.) in 10% etanola (primerjalne živali) ali pa pilulo, ki je poleg tega vsebovala še željene koncentracije testne spojine.

Takoj po tem smo živalim dali drugo 1.5 ml vodno oralno

O pilulo tekoče diete za hrčke, ki je vsebovala 1% (H) holesterol (2.0 pCi/žival; 210 dpm/nmol) in 0.5% žolčne kisline in jih nato postili naslednjih 24 ur. Na koncu te druge perioda postenja smo živali žrtvovali, jetra izrezali, jih namilili in cele dele jeter razbarvali z dodajanjem hidrogen peroksida in jih ocenili glede radioaktivnosti. Celotno radioaktivnost jeter smo izračunali glede na izmerjeno težo jeter. Stopnjo absorbcije holesterola smo izrazili kot procent celotne administrirane radioaktivnosti glede na oralno vodno pilulo, ki je prisotna v jetrih 24 ur po administraciji te pilule.

Anti-holesterolne učinke te spojine lahko ugotovimo s pomočjo količine sredstva, ki reducira usedline lipidov v aorti kunca. Novozelandske bele kunce moškega spola smo 1 teden krmili z dieto, ki je vsebovala 0.4% holesterola in 5% kikirikijevega olja (obrok en-krat dnevno). Po 1 tednu smo pri nekaj kuncih (primerjalna skupina) nadaljevali z dieto, ostalim pa smo dajali dieto z dodatkom željene koncentracije testne spojine. Po 8.5 tednih, smo obdelavo zaključili in živali držali naslednja 2 tedne na dieti, ki je vsebovala holesterol, nato pa smo jim naslednjih 5 tednov dajali dieto, brez holesterola. 2ivali smo žrtvovali in jim

Aorte smo očistili, jih longitudinalno odprli in jih nato pobarvali z Sudan IV (blagovna znamka; Op.prev.), kot je opisano v Holman et.al. (Lab. Invent. 1958, 7,42-47). Procent obarvane površine smo kvantificirali s pomočjo denziometrije, ob uporabi Optimas Image Analyzing System (Image Processing System; Sistem za obdelavo slik; Op.prev.). Zmanjšane usedline lipidov smo zaznali z zmanjšanjem v procentih obarvane površine v skupini zdravljenih kuncev glede na kunce iz primerjalne skupine.

To spojino lahko administriramo na kateregakoli izmed načinov, ki spojino prinesejo v intestinalni lumen. Te metode vljučujejo oralne poti, intraduodenalne poti, itd.

Količina administriranih steroidnih glikozidov je seveda odvisna od zdravlenega subjekta, pogostnosti okužbe, načina administracije in od presoje lečečega zdravnika. V vsakem primeru je efektivni odmerek v obsegu od 0.71 do 200 mg/kg/dan, prednostno od 2 do 50 mg/kg/dan, najraje od 2 do 7 mg/kg/dan. Za povprečnega človeka s 70 kg je primerna količina od 0.05 di 14 g/dan, prednostno od 0.14 do 3.5 g/dan, najraje od 0.14 do 0.5 g/dan.

Za oralno administracijo, ki je prednostna, je farmacevtski sestavek lahko v obliki raztopin, suspenzij, tablet, pilul, kapsul, praškov, sprejemljivih trajnih formulacij in podobno.

Glede na nameravani način administracije, so farmacevtski sestavki lahko v obliki trdnih, pol-trdnih ali tekočih odmerkov, kot so na primer, tablete, pilule, kapsule, praški, tekočine, suspenzije, ali podobno, prednostno v obliki posameznih odmerkov, primernih za posamezno administracijo natančnih odmerkov. Farmacevtski sestavki vključujejo konvencionalne farmacevtske nosilce ali ekscipiente in spojino po tem izumu, kot aktivno sestavino.

Poleg tega, lahko vsebuje druga medicinalna ali farmacevtska sredstva, nosilce, adjuvante, itd.

Farmacevtski sestavki po predmetnem izumu, lahko vsebujejo 0.1% do 95% spojine, prednostno 1% do 70%. V vsakem primeru pa sestavek ali formualcija, namenjena za administracijo, vsebuje količino spojine po tem izumu v odmerku, ki učinkuje anti-hiperholesterolemično ali anti-aterosklerotično.

Za trdne farmacevtske sestavke, konvencionalni ne-toksični trdni nosilci vključujejo, na primer farmacevtske stopnje manitola, laktoze, škroba, magnezijevega stearata, natrijevega saharina, lojevca, celuloze, glukoze, sukroza, magnezijevega karbonata in podobno.

Tekoče sestavke, farmacevtsko primerne za administracijo, lahko pripravimo z raztapljanjem ali disperzijo ali s kakšnim drugim načinom priprave steroidnih glikozidov in z mešanjem le-teh, neobvezno s farmacevtskimi adjuvanti v nosilcu, kot je na primert voda, slanica, vodna dekstroza, glicerol, etanol in podobno, da na ta način formiramo raztopino ali suspenzijo.

Metode za pripravo različnih farmacevtskih sestavkov z določeno količino aktivne sestavine so poznane, ali bodo v stroki izkušenim očitne. Na primer glej Remington's Pharmaceutical Sciences., Mačk Publishing Company, Easter, Pa., 15th Edition (1975).

Primer 1

Kristalni (30,5a,25R)-3-((β-D-celobiozil)oksi)spirostan-11on

V steklenički z mešalom, z okroglim dnom in s tremi vratovi, smo suspendirali neizsušene usedline, ostale iz delne kristalizacije (glej Pripravo A spodaj) (vide supra) v 500 ml metanola. Suspenzija je vsebovala 2.5% vode po Karl Fischer analizi. Premešano suspenzijo smo greli do refluksa 16 ur, jo ohladili na sobno temperaturo in granulirali 48 ur. Naslovno spojino smo izolirali s filtracijo in jo osušili v vakuumu, da smo pridobili 16.1 g (81% donos). Lom X-žarkov na vzorcu prahu, je pokazal, da smo željeno kristalno obliko naslovne spojine izolirali.

Podobno pipravljen material smo analizirali kot sledi. Termalna gravimetrijska analiza (stopnja segrevanja 30*C/min) je pokazala izgubo teže 1.8% pri 100°C in 3.0% izgubo teže pri 300’C. Vsebnost vode, kot je bila ugotovljena s Karl Fischer titracijo, je bila 1.4%. Diferencialni kalorimetri jska analiza (stopnja segrevanja 20°C/min) na osušenem materialu nam je dala dve majhni endotermi (pri cca. 211*C in 295’C), čemur je sledil razkroj.

Analiza računana za 4IH2O' C 60.61; H 8.35

Najdeno: C 60.81; H 8.32

Priprava A (3β,5α,25R)-3-((β-D-celobiozil) oksi) spirostan-ll-on DEACETILACIJA

Mešanico (3β,5α, 25R)-3-((heptaacetil-0-D-celobiozil )oksi)spirostan-ll-on (6.57 g, 6.26 mmol), natrijevega metoksida (68 mg, 1.25 mmol), metanola (35 ml) in tetrahidrofurana (75 ml) smo 1 uro greli do refluksa, nato pa mešali pri sobni temperaturi naslednjih 12 ur. V 30 minutah se je formirali beli precipitat. Končno suspenzijo smo koncentrirali v vakuumu, da smo dobili 6.0 g surovega produkta. Ta material smo nato očistili s hitro kromatografijo (eluent: kloroform, nato pa 8:2 kloroform:etanol), da smo dobili 2.71 g (57% donos) naslovne spojine.

¹H NMR (DMSO-dg) 8:5.22 (d, J=5Hz, IH), 5.00 (m, 3H), 4.64 (s, IH), 4.58 (t, J=5Hz, IH), 4.54 (t, J=6Hz, IH), 4.34 (q, J=8 Hz, IH), 4.27 (d, J=8 Hz, IH), 4.23 (d, J=8Hz, IH),

3 . 68	-2.94	(m,	15H), 2.34	(m, 2H), 2	. 08-0	.81 (m, 23H),	0.92
(s,	3H); 0	.86	(d, J=7 Hz	, 3H), 0.72	(d,	J=6Hz, 3H)	, 0	.59 (	s ,
3H) .	DEPT	13_c	NMR (DMSO-	d₆) δ: 210.	4(s) ,	108.8 (s)	, 103.6
(d),	100.6	(d)	, 81.1 (d)	, 80.6 (d),	77.2	(d), 76.9	(d	), 76	. 5
(d),	75.5	(d),	75.1 (d),	73.7 (d),	73.6	(d), 70.5	(d)	, 66.	4
(t),	63 . 5	(d),	61.5 (t),	60.9 (t),	50.5	(d), 57.1	(t)	, 54.	7
(d),	44.3	(s),	44.1 (d),	41.7 (d),	36.8	(d) , 35.6	(t)	, 35.	2
(s) ,	34.0	(t),	32.6 (t),	31.3 (s),	30.2	(d) , 29.2	(t)	, 28.	9
(t),	28.2	(t),	17.5 (q),	17.3 (q),	14.8	(q), 12.3	(q)
IR (KBr):	3407	(s), 1700	(m) cm^-1.
High	resolution (visoka	ločljivost)	FAB	MS (m/e):

Računano za C₃gH62°i4Na 777.4037, najdeno 777.4108.

Analiza računana za C3gHg2°i4 · 21^0: C 59.22; H 8.41 Najdeno: C 59.48; H 8.48; MP: > 300‘C.

V stekleničko z mešalom, z okroglim dnom in s tremi vratovi, smo dali 20 g deacetilacijskega produkta pridobljenega po zgornji reakciji, 600 ml n-propanola in 400 ml vode. To suspenzijo smo nato greli do refluksa, ko se je formirala raztopina. V to raztopino smo dodali 2.0 g diatomejske zemlje. Med vzdrževanjem temperature refluksa, smo s filtracijo (prosta filtracija) odstranili netopne delce. Filtrat smo atmosfersko destilirali, dokler nismo pridobili celotnega volumna 600 ml in ga ohladili na sobno temperaturo. Analiza te suspenzije po Karlu Fischerju je pokazala, da je vsebovala 40.5% vode. Dobljeno suspenzijo smo eno uro granurilali in parcialno kristalizirani produkt (vmesna faza) smo zbrali s filtracijo. Čeprav delno kristaliziran, produkt ni pokazal željenega vzorca loma Xžarkov.

Priprava B (3P,5a,25R)-3-((heptaacetϊΙ-β-D-celobiozil)oksi )-spirostan11-on

SPAJANJE PROSTEGA SPIROSTANA POSPEŠENO S CINKOVIH FLUORIDOM

Suspenzijo ( 3β , 5α , 25R )--3-hidroksispirostan-ll-on (3.0 g, 6.97 mmol) in brezvodnega cinkovega fluorida (2.88 g, 27.9 mmol) v suhem acetonitrilu (175 ml) smo osušili tako, da smo z destilacijo odstranili 75 ml acetonitrila. Suspenzijo smom pustili, da se ohladi in nato dodali heptaacetiΙ-β-Dcelobiozil bromid (9.75 g, 13.9 mmol) in dobljeno mešanico greli do 65’C 3 ure. Po ohladitvi na sobno temperaturo, smo dodali metilen klorid (150 ml) in suspenzijo mešali 10 minut in jo nato filtrirali. Filtrat smo nato koncentrirali v vakuumu, da smo dobili 10 g surovega produkta. Ta material smo raztopili v 8:2 kloroform:metanol, predabsorbiranim na silikagelu in ga očistili s hitro kromatografijo (eluent 1:1 etil acetat:heksan, nato čisti etil acetat), da smo dobili 6.81 g (93% donos) naslovnega materiala.

¹H NMR (CDC1₃) 5:5.11 (complex, 2H), 5.04 (t, J = 9Hz IH),

4.90	(t,	J=9Hz, IH), 4	.83 (t, J=8Hz,	IH) ,	4.49 (complex,
4H),	4.34	(dd, J=4.5 &	12.5 Hz, IH),	4.04	(t, J = 13	Hz, IH),
4.03	(t,	J=llHz, IH), ;	3.72 (t, J = 9.5Hz, IH) , 3.65 1	(m, IH),
3.56	(m,	IH), 3.45 (m,	IH); 2.47 (m,	IH) ,	2.22 (s,	3H), 2.08
(s ,	3H) ,	2.06 (s, 3H),	2.00 (s, 6H),	1 . 99	(s, 6H),	1.96 (s,

3H), 2.00-1.00 (m, 22H); 0.98 (s, 3H); 0.92 (d, J=7Hz, 3H), 0.77 (d, J=7Hz, 3H), 0.68 (s, 3H).

DEPT ¹³C NMR (CDCI3) 5: 209.9(s), 170.5 (s), 170.3 (s),

170.2	(s), 169.	9 (s:		169	.8	(d), 16	9 . 5	(s ) , 1	69.3	(s) ,	169.0
(s) ,	190.2 (s),	. 100,	.8	(d)	, 9	9.4 (d)	, 90	• 0 (s)	, 80,	.6 (d:	> ,
79.4	(d), 76.6	(d),	75	.3	(s)	, 72.9	(d),	72.6	(d),	72.5	(d),
71.9	(d), 71.8	(d),	71	. 6	(d)	, 67.8	(s ) ,	66.9	(t) ,	64.4	(d),
62.1	(t) , 61.5	(t),	60	.8	(s)	, 60.7	(d),	57.6	(t),	55.7	(d),

.1 7

44.8 (d)	, 44.3	(s),	41.8	(d),	36.9	(d), 35.6 (	:t),	35.2	(s) ,
34.1 (t)	, 32.7	(t),	31.3	(t),	, 31.2	(t) , 30.2 (	:<3),	29.0	(t),
28.7 (t)	, 28.0	(t),	20.9	(q) z	, 20.7	(q), 20.6 (	:q)z	20.5	(q) z
17.1 (q)	, 17.0	(q) z	14.2	(q)<	, 12.0	(q).
IR (KBr)	: 1756	(ε),	1706	(m)	cm^-1.
MS (m/e)	: 1049	(M+H:	) ·
Analiza	računana za	^c53^h76°21·^h2^0:	C 59.65; H	7 . 37
Najdeno:	C 59.	86; H	7.25;	MP: >	210-212’C.
				Priprava	C

(3β,5α,12β,25R)spirostan-3, 12-diol-ll-on (3β,5α,11β,25Ρ)-ll-bromospirostan-3-ol-12-on

Stekleni linijski reaktor smo napolnili s 189 litri metanola in nato podpovršinsko poškropili s bidroklorovo kislino (plin), dokler nismo dodali 7.7 Kg (5.0 ekvivalentov). Po zaključenem škropljenju, smo reaktor napolnili z 18.8 kg (42.2 mol) (3β,5α,25R)spirostan-3-ol-12 on (hekogenin), 189 litrov metanola in 37.8 1 metilen klorida. To mešanico smo nato ohladili na 10'C in v dveh urah dodali raztopino 8.4 kg bromina (5.27 mol, 1.25 ekv) v

37.8 1 metilen klorida, medtem, ko smo temperaturo posode vzdrževali pri temperaturi približno 10°C. Ko smo z dodajanjem zaključili, smo reakcijo pustili, da se segreje na sobno temperaturo in jo mešali 2 uri. Na tej točki nam j TLC (thin liquid chromatography; tankoplastna tekočinska kromatografija; Op.prev.) pokazala, da je reakcija zaključena.

Reakcijo smo razredčili s 189 1 vode in jo mešali 10 minut. Po ločitvi plasti, smo vodeno plast ekstrahirali dvakrat s 113.4 1 metilen klorida. Tri združene organske ekstrakte smo dvakrat sprali s 113.4 1 vode in en krat s

113.4 1 nasičene slanice in jo nato osušili s pomočjo 7.0 kg magnezijevega sulfata. Sušilno sredstvo smo odstranili s filtracijo na 762 mm Lapp (naprava imenovana po izumitelju), nakar smo jo dva krat sprali z 11.34 metilen klorida.

Filtrat in ostanke spiranja smo združili in jih atmosfersko destilirali na skupni volumen 26.46 litra. Dve polnjenji

37.8 1 smo pridobili s kontinuirano destilacijo. Ko smo dosegli končni volumen < 37.8 1, smo mešanico ohladili na sobno temperaturo. Dobljeno suspenzijo smo granulirali 2 uri, jo filtrirali na 762 mm Lapp, in dobljeni filtrat dva krat sprali z 11.34 1 metanola. S sušenjem filtrata v vakuumu pri 4 5-50 ⁰C smo pridobili 12.6 kg (58.6% donos) naslovne spojine.

(30,5a,120,25R)spirostan-3,12-diol-ll-on

Stekleni linijski reaktor smo napolnili z 12.4 kg (3β , 5α,11β , 25R )-11-bromospirostan-3-ol-12-on ( 24.34 mol),

124.74 1 t-butanola, 124.74 1 vode in 7.5 kg (189 mol, 7.75 ekv.) natrijevega hidroksida v obliki pilul. Reakcijo smo greli do refluksa več kot 1.5 ure, vzdrževali pri refluksu

4.5 ure (temperatura posode je bila 83’C) in jo nato ohladili na sobno temperaturo. Na tej točki nam je TLC pokazala, da je reakcija zaključena.

Reakcijo smo destilirali, da smo odstranili t-butanol. To smo dosegli s pomočjo vakuumske in atmosferske destilacije. Med koncentracijo, smo dodali dve polnjenji po 122.85 1. Ko smo t-butanol odstranili, smo vodno suspenzijo ohladili na sobno temperaturo in 2 uri granulirali. Suspenzijo smo filtrirali na 762 mm Lapp, jo dva krat sprali z 11.34 1 vode in dobljeni filtrat osušili na zraku pri 60’C. Tako smo dobili 11.1 kg naslovne spojine.

Priprava D (3β,5α,25R)spirostan-3-ol-ll-on (3β, 5α,12β,25R)-3,12-diacetoksispirostan-ll-on

Stekleni linijski reaktor smo napolnili 98.28 1 piridina, 98.28 1 ocetnega anhidrida in 11.0 kg ( 3β,5α,12β,25R)spirostan-3,12-diol-ll-on (Priprava C). To mešanico smo refluksirali 2 uri (temperatura posode je bila 128°C) in jo pustili, da se ohladi na sobno temperaturo. Reakcijo smo destilirali v vakuumu na skupni volumen 56.7 1 (temperatura posode med destilacijo približno 45’C). Suspenzijo smo razredčili s 94.5 1 ocetne kilsine in nadalje destilirali v vakuumu na skupni volumen 56.7 1 (temperatura posode na koncu približno 80’C). Mešanico smo razredčili z 328.86 1 vode in jo ohladili na sobno temperaturo. Po 5 urah granulacije, smo naslovno spojino izolirali s filtracijo na 762 Lapp, nato pa smo jo dvakrat sprali z 11.34 1 vode. Filtrat smo osušili v vakuumu pri 60’C, da smo dobili 12.2 kg (93.3%) .

(3β,5α,25R)-spirostan-3-ol-ll-on

Reaktor iz nerjavečega jekla smo ohladili na -80’C tako, da smo skozi interne ovoje reaktorja spustili tekoči dušik. V reaktor smo dodali 54.5 kg amonijaka, (80 litrov, 3.200 mol, 170 ekv.).

Istočasno s polnjenjem amonijaka, smo stekleni linijski reaktor polnili s 10.0 kg (3β,5α,12β,25R)-3,12diacetoksispirostan-11-one (18.4 mol) in s 151.2 1 THF. To raztopino smo atmosfersko destilirali na skupni volumen 98.28 1.

ekv .	, ) , medtem ko
Po	zaključenem
THF	in
one	(temperatura
C) ,	nato pa smo

Po končanem polnjenju z amonijakom, smo v 30 minutah dodali 2.8 kg kalcija (69.0 gram atoma, 3.7 ekv smo temperaturo posode vzdrževali pri -50°C dodajanju smo v 20 minutah dodali raztopino THF in (30,5a,12i3,25R)~3,12-diacetoksispirostan~ll-one (t( posode pri koncu tega dodajanja je bila -35’C), nato pa smo dodali 3.78 1 THF ostankov izplakovanja. Reakcijsko mešanico smo mešali 30 minut pri -35’ do -40’C. Medtem, ko je reakcija bila med -35’C in -40’C, smo dodali 3.33 litre bromobenzena (4.98 kg, 31.7 mol, 1.68 ekv.), nato pa še 3.33 litre vode.

Po tem dodajanju smo začeli z destilacijo amonijaka iz reaktorja. To destilacijo smo usmerili v vodni čistilec. Ko smo odstranili ves amonijak, smo reakcijo (sedaj pri 24’C) preselili v stekleni linijski reaktor, nato pa dodali 15.12 1 THF ostankov izplakovanja. Raztopina in izplake smo združili in jih destilirali v vakuumu v gosto olje. V to smo dodali 132.3 1 metanola in 3.3 kg (59 mola) kalijevega hidroksida v obliki pilul. Mešanico smo greli pri refluksu 1 uro, jo ohladili in nato dodali 10 litrov ocetne kisline in 166.32 1 vode. To suspenzijo smo nadalje ohladili na sobno temperaturo in granulirali 1 uro. Naslovno spojino smo izolirali s filtracijo na 762 mm Lapp, nato pa sprali z 3:1 voda:metanol (18.9 1). S sušenjem v vakuumu pri 55’C smo dobili 7.05 kg (86.9%).

Moralo bi biti razumljivo, da predmetni izum ni omejen na določene upodobitve prikazane in opisane v besedilu, ampak da se razne modifikacije in spremembe lahko narede ne da bi se oddaljili od duha in obsega tega novega koncepta, kot je definiran v zahtevkih, ki sledijo.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Kristalni spirostanilni glikozid, značilen po tem, da ima lom X-žarkov naslednji interval-d:

Interval-d 20 najvišjih točk

23.74

15.78

11.82

9.48

7.90

6.77

6.34

6.26

5.91

5.75

5.61

4.72

4.61

4.13 4.00

3.91

3.64

3.38
2.63

2.49

2. Kristalni spirostanilni glikozid, po zahtevku 1, značilen po tem, da je spirostanilni glikozid, monohidrat.
3. Kristalni spirostanilni glikozid, značilen po tem, da ima vzorec loma X-žarkov kot je prikazan na Sliki 1.
4. Farmacevtski sestavek za nadzor hiperholesterolemije ali ateroskleroze pri sesalcih, značilen po tem, da vsebuje kristalni monohidrat spirostanilnega glikozida po zahtevku 1 in farmacevctsko sprejemljiv nosilec.
5. Farmacevtski sestavek po zahtevku 4, značilen po tem, da ima lom X-žarkov naslednji interval-d:

Interval-d 20 najvišjih točk

23.74

15.78

11.82

9.48

7.90
6.77

6.34

6.26

5.91

5.75

5.61

4.72

4.61

4.13 4.00

3.91

3.64

3.38

2.63

2.49

6. Farmacevtski sestavek po zahtevku 4, značilen po tem, da ima vzorec loma X-žarkov kot je prikazan na Sliki 1.