SE522723C2 - Användning av kollagenas vid behandling av Dupuytrens sjukdom - Google Patents

Description

522 723 2 E. Ippolito et al. (Experimental Study On the Use of Collagena- se in Localized Connective Tissue Fibrosis, Ital. J. Orthop., Traumatol., Vol. 1/2, 279-290 [l975]) använde kaninsenor som en modell för Dupuytrenska strängar. Vid in vivo-tester infiltre- rades Akilles-senan hos kaniner med 1 cm3 av en lösning av Whartington-kollagenas. Lösningarna innehöll 40, 80 respektive 160 enheter av enzymet per cm3. (En whartington-enhet är unge- fär lika med två ABC-enheter.) Vid avlivning efter 24 timmar visade senan infiltrerad med 40 enheter inga tecken på spjälk- ning, under det att senan infiltrerad med 160 enheter visade mycket stor spjälkning.

Wegman, Thomas L., US-patent 5,589,l7l, 12/31/96, beskriver be- handling av Dupuytrens sjukdom med hjälp av injicering av kol- lagenas in i den fibrösa strängen. Data presenteras varvid ex- ciderade strängar behandlas in vitro. I ett försök injicerades 3 600 ABC-enheter kollagenas i 0,5 ml spädningsmedel in i var och en av tio strängar, som sedan inkuberades i 24 timmar. Me- deldragmodulen reducerades och kollagenknippbrott observerades.

I ett annat in vitro-försök skars exciderade strängar i bitar och inkuberades 48 timmar med olika koncentrationer av kollage- nas i spädningsmedel som sträckte sig från 225 till 900 ABC- enheter per ml. Undersökning av' sektioner av de behandlade strängarna avslöjade ökat avbrott av kollagen. Slutsatsen drogs att 450 ÅBC-enheter per ml var en lämplig koncentration.

KORT SAMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Framgångsrik lindring av handkontrakturen vid Dupuytrens sjuk- dom fås genom att en effektiv mängd och koncentration av kolla- genas injiceras in i den fibrösa Dupuytrenska strängen, handen immobiliseras omedelbart efter injektion, och hålls orörlig i flera timmar. Bästa resultaten erhålles när patienten är i re- sidualstadiet av sjukdomen. 522 723 y DETALJERAD BESKRIVNING Kollagenas är ett enzym som har den specifika förmågan att spjälka kollagen. Det härledes kommersiellt från jäsning me- delst Clostridium histolyticum och renas genom en kromatogra- fisk teknik.

Bestämningen av styrkan hos kollagenas är baserat på spjälk- ningen av odenaturerad kollagen (från bovin sena) vid pH 7,2 och 37°C_i 20-24 timmar. Antalet peptidbindningar som spjälkats mätes genom reaktion med ninhydrin. Aminogrupper frigjorda ge- nom en trypsinspjälkningskontroll subtraheras. En ren ABC-enhet av kollagenas solubiliserar ninhydrinreaktivt material ekviva- lent mot 1,09 nanomol leucin per minut.

Steriliserat lyofiliserat kollagenaspulver kan erhållas som har en minimumanalys av 50 ABC-enheter per mg. Analysen kan sträcka sig avsevärt över ett sådant värde från sats till sats, men ta- ges hänsyn till vid bestämning av vikten av pulver som skall användas med en farmaceutiskt godtagbar bärare, t.ex. normal saltlösning, vid beredning av en önskad koncentration för be- handling.

Kollagenaset anbringas i en flytande bärare som är farmaceu- tiskt godtagbar, vilket inbegriper inerthet gentemot kollagena- set. Exempel är normal saltlösning, vattenhaltig NaCl/CaCl2- buffert, vattenhaltig dextranlösning, vattenhaltig hetastärkel- selösning.

I enlighet med uppfinningen injiceras kollagenas i en flytande bärare in i en fibrös Dupuytrensk sträng, varefter handen ome- delbart immobiliseras, såsom exempelvis genom såsom genom lind- ning med tillräckligt mycket gasbinda och på sådant sätt att en skrymmande omläggning bildas. Handen, och i synnerhet det på- verkade fingret, förhindras därigenom från väsentlig rörelse.

Immobiliseringen får fortsätta i flera timmar, t.ex. fyra till 522 723 ~ ~** 4 Man förmodar att detta kan minimera utpressning av och medger tillräcklig tio timmar. kollagenaslösningen ut från strängen, men ej överdriven tid för verkan av kollagenaset på strängen, vilket resulterar i goda kliniska resultat. Om injektionen äger rum under den tidigare delen av eftermiddagen kan i typiska fall omläggningen avlägsnas vid sängdags.

Mängden och koncentrationen av det använda kollagenaset är ef- fektiv för att uppmjuka och relaxera eller åstadkomma ruptur av strängen. När den av strängen utövade spänningen som har hållt fingret böjt således avlägsnas rätar fingret snart ut sig, van- ligen fullständigt.

Man föredrar att injicera tillräcklig mängd kollagenaslösning in i den Dupuytrenska strängen för erhållande av en total mängd på minst 8 000 ABC-enheter, och företrädesvis en mängd inom in- tervallet 8 000 till ca. 15 000 ABC-enheter. Den föredragna koncentrationen av kollagenas i bärare ligger inom intervallet från ca. 15 000 till ca. 75 000 ABC-enheter per ml bärare.

Lämpliga kombinationer är exempelvis minst 8 000 ABC-enheter i en koncentration på minst 30 000 enheter/ml; minst 10 000 enhe- ter i en koncentration på minst 40 000 enheter/ml. Allmänt gäl- ler att ju mindre mängden av kollagenas är desto större bör koncentrationen vara. Om det således är önskvärt att i en sär- skild situation använda 5 000 ABC-enheter skulle en koncentra- tion på 20 000 till 50 000 enheter per ml vara önskvärd.

Den totala volymen injicerad vätska överstiger företrädesvis ej 0,5 ml. 0,25 ml till ca. 0,1 ml är allmänt ännu mer föredragen. ca. En mindre volym ned till ca.

Enligt viktiga aspekter av uppfinningen injiceras den totala doseringen per sträng i multipla portioner, företrädesvis minst tre, vid olika punkter i strängen men i omedelbar närhet av varandra. Dessa punkter är lämpligen skilda med ett avstånd på metakarpofalangealleden Nålen på injek- ca. 2 mm, och är vanligen nära och/eller den proximala interfalangealleden. n . < | . 1 | s. r u c | nu *S22 723 :- 5 tionssprutan skall ej isättas i rät vinkel i förhållande till strängen; utan i spetsiga vinklar. Ändamålet med dessa förfa- randen är att säkerställa god fördelning av kollagenaset inom en liten volym av strängen.

I fall där resultaten av' en enskild behandling bedöms vara otillräckliga kan samma förfaranden, totala mängd kollagenas och koncentration upprepas med en veckas intervall i en upp till ej mer än fem gånger.

Dupuytrens sjukdom är långsamt tilltagande under loppet av många år vilket orsakar fixerade böjningsdeformiteter i meta- karpofalangeal-(MP) och proximala interfalangeal-(PIP)lederna i fingrarna. Lill- och ringfingrarna är de som oftast påverkas.

Sjukdomen fortskrider genom tre stadier som beskrivits av Luck JV, J. Bone Joint Surg. 4lA:635-664, 1959. Det initiala proli- ferativa'stadiet kännetecknas av knutbildning :L palmarfascia varvid en cell känd som myofibroblast (Gabbiani G., Majno G.

Am. J. Pathol. 66:l3l-138, 1972) uppträder och börjar prolife- rera. eller mittenstadiet av sjukdomen är fokus för extrem myofibroblastproliferering och bildning av aktivt I det sista eller resi- Involutions- kollagen av typ III av dessa celler. dulstadiet försvinner modulen i och med myofibroblastens för- svinnande och endast en tät fibrös typ-I-kollagensträng, histo- logiskt liknande en sena, kvarstår.

Den bästa användningen av denna uppfinning är vid behandlingen av residual(änd)fasen av Dupuytrens sjukdom. Anledningen till varför man injicerar i strängar istället för Dupuytrenska knu- tor eller involutions(mitten)stadiet är att strängar innehåller en gles population av fibroblaster, är relativt avaskulära och är övervägande sammansatta av typ-I-kollagen men innehåller ej myofibroblaster såsom knutorna och mittenstadiet gör. Det finns inget bevis som antyder att kollagenas är cytotoxiskt för myo- fibroblaster. Således skulle injektion av kollagenas in i knu- tor' eller' mittenstadiet, högst sannolikt resultera i tidigt residiv eller försämring av hand- innehållande myofibroblaster, anno 6 kontrakturen. Detta kan vara anledningen till att tidigare icke-operativa behandlingar misslyckats. Detta tillkortakomman- de kan övervinnas genom injicering i residualstadiesträngar i enlighet med uppfinningen.

EXPERIMENTELLT I allt experimentellt arbete användes Nucleolysin® fràn Ad- vance Biofactures Corporation of Lynbrook, New York. Detta är kollagenas erhållet genom fermentering av Clostridium histoly- ticum, renat genom kromatografi, och lyofiliserat. Det späddes till önskad koncentration med en vattenhaltig buffert av 0,2 mM kalciumklorid och 0,9% natriumklorid.

Studie A I ett reglerat pilotförsök injicerades 3 600 ABC-enheter kolla- genas i 0,5 ml buffert i 10 Dupuytrenska strängar erhållna frán patienter som genomgick fasciektomi. Som kontroll injicerades tio andra strängar behandlade samtidigt pà samma sätt med 0,5 ml buffert endast. Samtliga inkuberades därefter vid 37°C i 24 timmar. Genom sträckning av de behandlade strängarna i en Cha- tillon-maskin och mätning av spänning och töjning, fastställdes det att de kollagenasinjicerade strängarna genomgick en 93%-ig minskning i dragmodul jämfört med kontrollerna.

Forskarna drog slutsatsen att "en dos pà 3 600 enheter var vida överstigande vad som erfordrades för strängruptur i Dupuytrens sjukdom." En kontrollerad in vitro-studie med multipeldos utfördes sedan.

Tjugo strängar erhölls från patienter vid kirurgi, och provbi- tarna delades slumpvis upp i en av fyra grupper: 150 ABC- enheter, 300 ABC-enheter, och 600 ABC-enheter kollagenas, samt en kontrollbuffertgrupp. Varje grupp innehöll fem strängar. Al- la patienterna var män. Medelpatientáldern för 600 enhetsgrup- ~ | n - v n. 5922 723 7 pen var 62 år för 300 enhetsgruppen 58, för 150 enhetsgruppen 67, och för kontrollgruppen 58.

Strängarna injicerades i mittendelen med endera buffert eller 150, 300, eller 600 ABC-enheter kollagenas, varvid varje injek- tion hade en volym på 0,2 ml. De inkuberades därefter vid 37°C i 24 timmar. Sedan sträcktes varje sträng i en Chatillon-maskin tills strängen brast.

Det framkom att en dos på 300 ABC-enheter kollagenas var till- räckligt för att orsaka strängruptur inom medelmaximikraftgrän- serna för fingersträckarna i lill-, ring-, och lång- och pek- fingrarna. Histologiskt förelåg samtliga erhållna prov i resi- dualsjukdomsstadiet och innehöll endast typ-I-kollagen efter Sirrius red-färgningar.

Denna studie har rapporterats i The Journal of Hand Surgery, Vol. 21A, No. 3, maj 1996, 490-495.

Studie B Efter studie A utfördes en in vivo-serie tester på patienter i residualstadiet av Dupuytrens sjukdom, av samma forskare. När 300 ABC-enheter kollagenas i 0,1 ml buffertspädningsmedel ej gav någon effekt, gjordes tester vid dubbla doser, dvs. 600, 1 200, 2 400, 4 800 och 9 600 ABC-enheter, varje dos i 0,1 ml spädningsmedel, en patient för varje dos. En enda injektion vid en vinkel på 90° i förhållande till den Dupuytrenska strängen gjordes nära metakarpofalangealleden (MP) i handen. Efter att ha fått vänta två timmar instruerades patienterna att aktivt sträcka ut sitt finger i ett försök att åstadkomma ruptur av strängen.

Ingen effekt observerades hos någon av dessa patienter. - ~ n n nu n o ø u . Q o. una» a 522 723 Studie C Ett annorlunda tillvägagångssätt användes därefter. Injektionen gjordes nära MP-leden vid tre olika ställen ca. 2 mm från var- andra, varvid nålen var i en sned vinkel i förhållande till strängens axel och isattes i olika vinklar, varigenom den öns- kade totaldosen således gavs i multipla inkrement.

Före injektion mättes djupet för den Dupuytrenska strängen i handen medelst ultraljudsvisualisering med användning av en Al- koa Model 210 tillverkad av Corometrics. Detta möjliggör för läkaren att undvika injektion i den underliggande flexorsenan.

Graden av böjning av fingret vid MP-leden mättes i grader med en digital goniometer.

Totaldosen var 10 000 ABC-enheter i 0,5 eller 0,25 ml späd- ningsmedel.

Omedelbart efter injektion lindades handen i. ett skrymmande gasvävsförband och immobiliserades i flera dygn. I typiska fall skedde injektionen vid middagstid eller kort därefter, och ban- daget avlägsnades vid sängdags. Patienterna uppmanades att ej försöka sträcka eller böja fingrarna.

Med användning av dessa förfaranden erhölls utmärkta kliniska resultat. 1. En 75 år gammal kvinna hade en 400 böjning av sitt vänstra ringfinger. Den Dupuytrenska strängen injicerades, såsom be- skrivits ovan, med 10 000 ABC-enheter kollagenas i 0,5 ml buf- fertlösning. Betydande svullnad erhölls som resultat, men den hade avtagit nästa dag. Efter en vecka hade böjningsvinkeln minskat till 25°. Efter två veckor var den noll, dvs. normal, och förblev så. Efter sju månader kunde strängen fortfarande ses under huden, men den var plattare och mjukare än den var n n - u o ~ . u. 1522 723 9 före injektion, och det tidigare deformerade fingret var fort- farande rakt.

De följande tre patienterna injicerades med 10 000 ABC-enheter kollagenas i 0,25 ml buffertspädningsmedel. 2. Det högra lillfingret hos en 64 årig man var böjt 60°, dvs. dess böjningsvinkel mättes till 60°. Efter uppföljning av den första dagen efter injektion var den 450, och efter en vecka var den noll. 3. En 64 är gammal man hade en mycket tjock Dupuytrensk sträng, som sträckte sig från handflatan in till det vänstra ringfingret som hade en böjningsvinkel på 45°. Ett dygn efter injektion var denna 30°, och hade minskat till noll (normal) i och med den femte dagen. 4. En 64 år gammal man hade en Dupuytrens kontraktur som drog hans högra lillfinger till en böjning pà 60°. Efter injektion var denna efter ett dygn 45°, 25° efter tva dygn, och normal, dvs. 0°, efter fem dygn.

Claims (9)

522 723 /0 .. u o e @ @ n ; - | n q n PATENTKRAV

1. Läkemedel för behandling av Dupuytrens sjukdom omfattande en far- maceutiskt effektiv koncentration av kollagenas och en farmaceutiskt godtagbar injicerbar bärare, vilket läkemedel är avsett att injiceras in i en fibrös sträng i han- den orsakad av sjukdomen, kännetecknat av att koncentrationen av kollagenas är minst ca. 15 OOO ABC-enheter per ml bärare.

2. Läkemedel enligt patentkrav 1, kännetecknat av att koncentrationen av kollagenas ligger inom intervallet från ca. 15 OOO till ca. 75 OOO ABC-enheter per ml bärare.

3. Läkemedel enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat av att koncentrationen av kollagenas är minst ca. 30 OOO, lämpligen minst ca. 40 OOO ABC-enheter per ml bärare.

4. Läkemedel enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat av att bäraren är en vätska.

5. Läkemedel enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat av bäraren är en av följande; normal saltlösning, vattenhaltig NaCl/CaClg-buffert, vattenhaltig dextranlösning, vattenhaltig heta-stärkelselösning.

6. Läkemedel enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat av att det omfattar en mängd kollagenas inom intervallet från 8 OOO till ca. 15 OOO ABC-enheter.

7. Läkemedel enligt patentkrav 6, kännetecknat av det omfattar en mängd kollagenas på minst 10 OOO ABC-enheter.

8. Läkemedel enligt något av de föregående patentkraven, kännetecknat av att det föreligger i en volym vätska ej överstigande ca. 0,5 ml.

9. Läkemedel enligt patentkrav 8, kännetecknat av att det föreligger i en volym vätska inom intervallet från ca. 0,25 till O, 1 ml.