CN114601788A - 一种鹿茸多肽单体凝胶制剂及其在软骨修复及抗衰老中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体地说,涉及一种鹿茸多肽单体凝胶制剂及其在软骨修复及抗衰老中的应用。凝胶剂其包括如下组分:组分A:卡波姆凝胶基质,1,2‑丙二醇,三乙醇胺和无菌注射水;组分B:功能性鹿茸多肽单体;本发明通过对组分进行设计复配,克服了鹿茸多肽在水存在的环境和室温环境下容易失去生物活性的缺陷,经验证本发明所提供的凝胶制剂可显著地促进软骨修复,其功能性鹿茸多肽单体还具有显著的抗衰老效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地说,涉及一种鹿茸多肽单体凝胶制剂及其在软骨修复及抗衰老中的应用。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种常见的关节疾病,表现为关节疼痛、僵硬,软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因。本病在中年以后多发,女性多于男性,40岁人群的患病率为10%-17%,60岁以上为50%,而在75岁以上人群则高达80%。该病有一定的致残率。而随着人口的日益老龄化,骨关节炎将成为影响人们生活质量的重要问题,骨关节炎药物市场需求将不断扩大。
目前临床上对于骨关节炎的治疗药物分为特异性治疗药物与非特异性治疗药物。非特异性治疗药物以镇痛和控制症状为主,但对软骨没有保护作用,如非甾体抗炎药等。特异性治疗药物可保护关节软骨,延缓骨关节炎进展,如氨基葡萄糖、硫酸软骨素、双膦酸盐等,但一般起效较慢,需治疗数周才见效,而且对受损软骨的再生没有作用。因此开发一种安全性好、疗效突出的新型软骨修复和/或骨关节炎药物成为医学界的一大目标。
皮肤老化是由自然因素或非自然因素造成的皮肤衰老现象,人出生后皮肤组织日益发达,功能逐渐活跃,当到达某种年龄就会开始退化,这种退化往往在人们不知不觉中慢慢进行,皮肤组织的成长期一般结束于25岁左右,有人称此期为“皮肤的弯角”,自此后生长与老化同时进行,皮肤弹力纤维渐渐变粗。人们皮肤的老化有两个因素:一是角质层水和能力降低,皮肤表面水脂乳化物含量减少,二是真皮胶原纤维合成减少和弹力纤维变性,因此需要使用一些具有抗衰老功效的产品来减少岁月的痕迹,延缓衰老的速度,在市面上的抗衰老护肤品,具有突释效应,导致皮肤负担过重,浪费活性成分,且不具备持久抗衰老的效果,抗衰老性能有限,不能满足人们的要求。
我们研究发现了一个功能性活性鹿茸多肽单体(胸腺素β10),并首次证实了该鹿茸多肽单体具有显著的促进软骨修复以及抗衰老功效。随着材料学和工业学的发展,多种新型敷料正逐步代替传统敷料,在软骨修复及抗衰老领域扮演着重要的角色。医用新型敷料能有效维持皮肤湿润,加速软骨修复。水凝胶体即是其中的一种,一般是以水溶性的高分子分散在水中形成的一种含水量极高的流体或半流体,这类产品在软骨修复和皮肤衰老中具有较多的应用。
经检索CN103739698公开了一种梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白及其制备方法和用途,并验证了胸腺素β10蛋白对成骨细胞M3T3具有明显的促增殖作用。CN104744583公开了一种梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白及制备方法和应用,表明其胸腺素β10蛋白具有明显的刺激人脐静脉内皮细胞成管的作用。CN202111214458公开了一种促创面愈合的鹿茸多肽单体凝胶制剂及其制备方法,表明胸腺素β10蛋白具有明显的促进创伤愈合的作用。上诉专利均未涉及到本专利所述的领域的权利要求。另外,经检索相关数据库,尚未发现胸腺素β10在软骨修复/治疗以及抗衰老方面的相关文献报道和专利信息。
本发明的所涉及的一种鹿茸多肽单体凝胶制剂在软骨修复及抗衰老中的应用,将为软骨修复治疗以及抗衰老提供新技术和新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性好、加快软骨修复以及延缓衰老的鹿茸多肽单体水凝胶,并同时提供其制备方法。通过参考文献及《中国药典》(2020版)药用辅料目录,设计出基础的凝胶剂配方。在基本配方的基础上,通过考察外观性状、稳定性等评价指标,成功确定了凝胶剂配方中基质材料、保湿剂的用量,最终通过工艺验证实验确定了凝胶剂的制备工艺。
本发明的技术方案如下:
本发明一方面提供了一种具有软骨修复及抗衰老功能的鹿茸多肽单体凝胶制剂,其包括如下组分:
组分A:卡波姆凝胶基质,1,2-丙二醇,三乙醇胺和无菌注射水;
组分B:功能性鹿茸多肽单体;
所述各组分的含量如下:
组分A(占凝胶剂的50%):卡波姆凝胶基质0.4~1.6wt%,1,2-丙二醇1~3wt%,三乙醇胺0.8~1.6wt%,无菌注射水93.8~97.8wt%。
组分B(占凝胶剂的50%):质量体积比为50~500μg/100ml。本发明所述功能短肽的蛋白质序列为madkpdmgeinsfdkaklkktetqekntlptketieqekqak。
本发明另一方面提供了一种上述具有软骨修复及抗衰老功能的鹿茸多肽单体凝胶制剂的制备方法,其具体包括如下步骤:
1.称取卡波姆在无菌水中静置溶胀8-16h,制得卡波姆凝胶基质;
2.称取1,2-丙二醇,在搅拌条件下加入凝胶基质中,得到组分A;
3.将鹿茸多肽用无菌水稀释并进行超声处理充分溶解,得到组分B;
4.在搅拌条件下,将组分A和组分B混合,用三乙醇胺调节溶液pH至5.0-7.0,最后补无菌水至所需重量,制得鹿茸多肽单体凝胶制剂,锡纸包被保存。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
本发明所提供的鹿茸多肽凝胶主要由鹿茸多肽、卡波姆、1,2-丙二醇和三乙醇胺组成,在使用状态时为凝胶状。鹿茸多肽具有软骨修复和抗衰老的功能;卡波姆作为凝胶基质,同时利于软骨创伤愈合和保湿;1,2-丙二醇具有保湿性,可以在创伤维持水分平衡。本发明通过对组分进行设计复配,克服了鹿茸多肽水存在的环境和室温环境下容易失去生物活性的缺陷,经验证本发明所提供的鹿茸多肽水溶液具有增强软骨修复和保湿性能,促进创伤修复愈合。同时,具有抗衰老的良好功效。
本发明所提供的方法操作简单,条件温和,在室温下即可进行,适用于工业推广。
附图说明
图1鹿茸多肽单体的HPLC检测图谱图;
图2鹿茸多肽单体的检测质谱图;
图3本发明所制得促创面愈合的鹿茸多肽单体凝胶制剂;
图4鹿茸多肽单体体外实验促进软骨形成结果;
图5鹿茸多肽单体凝胶制对软骨修复的动物实验结果;
图6鹿茸多肽单体体外实验抗衰老结果;
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。实施实例仅为了更好理解本发明但不局限于本发明范围,实施实例中方法无特殊说明均为常规方法,使用的试剂如无特别说明均为常规市售试剂或按常规试剂配制的试剂。
本实施例部分的功能短肽的蛋白质序列为madkpdmgeinsfdkaklkktetqekntlptketieqekqak。多肽一般在有水存在及室温环境下很容易失去生物活性,达不到所期望的生物效应,极大地限制了功能性多肽在临床上的应用,本发明采用的功能多肽可以是鹿相关基因的重组表达蛋白或者人工合成蛋白,该功能性多肽在本凝胶中可以在室温环境下长期保存,又可以促进软骨修复和抗衰老。
实施例1鹿茸多肽单体的固相合成
本发明的多肽委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用常规固相工艺合成,合成的多肽纯度>98%,其HPLC检测图谱和检测质谱分别如图1和图2所示。
实施例2鹿茸多肽单体凝胶制剂的制备
本发明在基本配方的基础上,通过考察外观性状、稳定性等评价指标,最终确定了凝胶剂配方中基质材料、保湿剂的用量,最终通过工艺验证实验确定了鹿茸多肽单体凝胶制剂的制备工艺:
1.准确称取2g卡波姆2020,加入98mL的无菌水(98g),搅拌后,置于室温过夜(12h以上);
2.称取10g的1,2-丙二醇,在搅拌条件下加入上述凝胶基质(35g凝胶基质)中,得制得溶液A;
3.准确称取1mg鹿茸多肽溶于无菌水(适量,约10mL),充分溶解,获得溶液B。
4.在搅拌条件下,将溶液A和溶液B混合(pH约为3.5左右),用三乙醇胺调节溶液pH至6.0左右(加入0.6mL的三乙醇胺),最后补水至总重量为100g,制得鹿茸多肽凝胶制剂。锡纸包被保存。(图3)。
实施例3鹿茸多肽单体体外(软骨微粒体形成实验)促进软骨形成
体外培养鹿茸干细胞,在其生长至80-90%时,用胰酶消化,计数。将含有1×107个细胞的悬浮液离心,浓缩成100μL。添加到六孔板的中央,孵育3h后。随后缓慢加入2mL的软骨诱导培养基(赛业生物),每隔3-4d更换一次培养基。3周后取出按照常规方法进行阿辛蓝染色和观测。实验组在对照组的基础上添加100ng/mL的鹿茸多肽单体,其余步骤相同。
结果如附图4所示,可以看出使用本发明水凝胶所用的鹿茸多肽单体具有显著地促进软骨形成的作用。
实施例4鹿茸多肽单体凝胶制剂促进软骨修复结果
通过对家兔的膝关节实施关节缺损手术,一侧关节进行鹿茸多肽单体凝胶(实验组)另一侧为对照组,经过30d后观察本发明凝胶制剂和空白对照作用在家兔软骨修复的愈合情况。空白对照的水凝胶与实施实例2中的除不添加鹿茸多肽外其余制备方法完全相同。
结果如附图5所示,可以看出使用本发明水凝胶的软骨愈合速度和软骨修复评分明显大于和高于空白对照。
实施例5鹿茸多肽单体体外的抗衰老实验结果
体外培养鹿茸干细胞,在其生长至80-90%时,用胰酶消化传代3代。随后进行β-半乳糖苷酶法(碧云天)检测鹿茸多肽单体对细胞衰老的影响。每种处理随机选取3个视野,参照试剂盒着色情况说明,统计被着色细胞占全部细胞的比例。实验组在对照组的基础上添加100ng/mL的鹿茸多肽单体,其余步骤相同。
综合结果说明鹿茸多肽单体可以显著地减少衰老的细胞数,说明鹿茸多肽单体凝胶能够显著地延缓衰老,具有抗衰老功效。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (7)
1.本发明公开了一种鹿茸多肽单体凝胶制剂及其在软骨修复及抗衰老中的应用,该凝胶具有显著的促进软骨修复的新功能。同时,该凝胶中的功能性鹿茸多肽单体还具有显著的抗衰老性功能。该凝胶可为治疗软骨相关疾病提供新技术和新方法,同时为抵抗衰老提供新的方案和方法。
2.本发明一方面提供了一种鹿茸多肽单体凝胶制剂,其包括如下组分:
组分A:卡波姆凝胶基质,1,2-丙二醇,三乙醇胺和无菌注射水;
组分B:功能性鹿茸多肽单体。
3.根据权利要求1所述的一种鹿茸多肽单体凝胶制剂,其特征在于,所述各组分的含量如下:
组分A(占凝胶剂的50%):卡波姆凝胶基质0.4~1.6wt%,1,2-丙二醇1~3wt%,三乙醇胺0.8~1.6wt%,无菌注射水93.8~97.8wt%。
组分B(占凝胶剂的50%):质量体积比为50~500μg/100ml。
4.根据权利要求1所述的一种鹿茸多肽单体凝胶制剂,其特征在于,所述功能短肽的蛋白质序列为madkpdmgeinsfdkaklkktetqekntlptketieqekqak。该功能性多肽具有显著的促软骨修复及抗衰老作用。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的具有促进软骨修复和抗衰老功能的鹿茸多肽单体凝胶制剂的制备方法,其特征在于,其具体包括如下步骤:
1)称取卡波姆在无菌水中静置溶胀8-16h,制得卡波姆凝胶基质;
2)称取1,2-丙二醇,在搅拌条件下加入凝胶基质中,得到组分A;
3)将鹿茸多肽用无菌水稀释并进行超声处理充分溶解,得到组分B;
4)在搅拌条件下,将组分A和组分B混合,用三乙醇胺调节溶液pH至5.0-7.0,最后补无菌水至所需重量,制得鹿茸多肽凝胶剂,锡纸包被保存。
6.根据权利要求4所述的具有促进软骨修复和抗衰老功能的鹿茸多肽单体凝胶制剂的制备方法,其特征在于,制备完成后,检验,保存,并可分装至一次性凝胶推注器中。
7.根据权利要求1或4所述的一种鹿茸多肽单体,在软骨修复,和/或用于治疗骨关节炎以及抗衰老方面的应用。
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