KR20040106289A

KR20040106289A - 다관능 생체적합 친수성 젤 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20040106289A
Application number: KR10-2004-7014406A
Authority: KR
Inventors: 블라디슬라브빅토르비치 로파틴
Original assignee: 오브스체스트보 에스 오그라니체노이 오트베트스트벤노스츄 (비타겔)
Priority date: 2002-04-10
Filing date: 2002-04-10
Publication date: 2004-12-17
Also published as: EP1498142B1; EP1498142A4; US7238761B2; CN1308039C; IL163941A; JP2005522473A; US20070292516A1; EA005951B1; AU2002323848A1; US20050054768A1; UA76594C2; AU2002323848B2; RU2236872C1; EP1498142A1; DE50209809D1; WO2003084573A1; KR100675459B1; HK1077194A1; IL163941A0; NZ536201A

Abstract

중량 대 중량 % (w/w)로, 아크릴아마이드 1.95 ~ 8.0, 메트아크릴아마이드 0.54 ~ 3.0, 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 0.003 ~ 0.4, N,N'- 메틸렌-bis-아크릴아마이드 0.006 ~ 0.6, 그리고 총량을 100으로 하는 물 적량을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤. 이 친수성 젤은 상기 언급한 단량체를 물 매질 내에서 과산화물 중합 개시제의 존재 하에 (1) 반응 혼합물을 20 ~ 30℃에서 12~24시간 동안 인큐베이션하고, (2) 0.4~1.0× 10⁶rads의 감마선(γ-radiation)에 노출시키고, 그리고 (3) 100 ~ 130℃의 온도 및 0~1.2 atm의 압력에서 20 ~ 40분 동안 인큐베이션 하는 단계를 포함하는 세 단계로 중합시킴에 의하여 제조된다.

Description

다관능 생체적합 친수성 젤 및 그 제조방법{POLYFUNCTIONAL BIOCOMPATIBLE HYDROGEL AND THE METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF}

프로토타입(prototypes)

폴리아크릴아마이드 친수성 젤(PAAG)은 비교적 비싸지 않고 제조가 용이하며 화학적으로 그리고 생물학적으로 불활성인 것으로 알려져 있다. 필요한 밀도로 그리고 환자의 몸에 최소한의 상처를 주는 피하 및/또는 연 조직에의 주사에 적합한 형태로 젤을 합성하는 것이 용이하다.

약물에서, 주변에 캡슐이 형성된, 예를 들면 피하 주사를 통하여 미리 환자의 조직에 삽입된, 폴리아크릴아마이드 젤에 췌장의 이종 β-세포를 이식함으로써 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하는 방법이 공지되어 있다. (RU 2165263)

미리 포유류 체내에 이식된 폴리아크릴아마이드 젤 내에 포유류의 이종 세포 , 특히 레이디히(Leydig) 세포 및 흑색종 세포를 배양하는 다른 방법이 공지되어있다.(RU 2152800)

이것은 종양학적 질병에 대한 백신 치료의 투여는 물론 수여자를 위하여 필수적인 효소 및/또는 호르몬을 생성할 수 있는 이종 세포를 환자의 체내에 이식함에 의하여 수많은 질병 치료가 가능하도록 한다.

그러나 다른 조건이 동일한 경우, 이식된 이종 세포가 생리학적으로 활성을 나타내는 시간은 폴리아크릴아마이드 젤(PAAG)의 특성에 의존한다는 것이 실험적으로 밝혀졌다.

포유류의 체내에 이식된 PAAG의 주변에 결합 조직 캡슐이 형성된다는 것이 공지되어 있으며(A.B.Shekhter et all "Injectable hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to its 이식", in "Annals of plastic, reconstructive and esthetic surgery",1997, No. 2, p. 19), 이것은 T-임파구가 이식된 이종 세포와 접촉하는 것을 얼마동안 방지하여 이들 세포가 사멸되는 것으로부터 보호한다.

그러나 연골 조직 캡슐의 형성이 수여자의 몸에 이식된 이종세포의 생리적 활성 시간에 영향을 주는 유일한 인자는 아니다.

생체적합성 폴리아크릴아마이드 젤은 EP 742022호 출원에 개시되어 있으며, 이것은 3.5 내지 9.0 % (w/w)의 아크릴아마이드와 가교제로서 메틸렌-bis-아크릴아마이드의 가교된 공중합체 그리고 96.5 내지 99.0 % (w/w)의 물을 함유한다.

동일 출원(EP 742022)에서 개시된 방법으로 젤이 제조되며, 이것은 아크릴아마이드를 메틸렌-bis-아크릴아마이드와 수성 매질에서 과산화물 중합 개시제의 존재 하에 공중합 하는 것에 관련된다. 가교된 공중합체를 얻기 위하여 반응 혼합물은 실온(room temperature)에서 20분 동안 인큐베이션 된다. 이 공정은 한 단계로 수행되며, 과산화물 중합 개시제로서 과황산암모늄과 테트라메틸에틸렌 디아민의 혼합물을 사용하며 수성매질로서 비발열성 물(apyrogenic water) 또는 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 사용한다.

이 방법에 의하여 얻은 친수성 젤은 중합체의 낮은 가교도를 가지며, 이것은 한 단계의 저온 공중합의 결과이다. 이것은 결합 조직이 삽입된 젤로 빠르게 성장하도록 하며 젤의 빠른 수축 및 재흡수를 유도한다. (A.B.Shekhter et all "Injectable hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to its implantation", in "Annals of plastic, reconstructive and esthetic surgery",1997, No. 2, p. 19).

또한, 이 방법으로 얻어진 친수성 젤은 결합되지 않은 테트라메틸에틸렌 디아민, 자유 NH₂-라디칼 그리고 아크릴아마이드 단량체 분자를 중합체 g당 1.0 ~ 1.2μg (1.0 ~ 1.2 ppm)함유하며, 이것은 젤 이식의 초기 단계에서 활성 무균성 염증 반응을 일으킬 수 있다. (A.B.Shekhter et all "Injectable hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to its implantation", in "Annals of plastic, reconstructive and esthetic surgery",1997, No. 2, p. 19).

생체적합성 친수성 젤은 특허 RU 2127129호에 개시되어 있으며, 이것은 1.0내지 8.0 % (w/w)의 아크릴아마이드와 가교제로서 메틸렌-bis-아크릴아마이드의 가교된 공중합체 그리고 92.0 ~ 99.0 % (w/w)의 물을 함유한다. 젤의 제조방법은 또한 특허 RU 2127129에 개시되어 있으며, 아크릴아마이드와 메틸렌-bis-아크릴아마이드를 수성 분산 매질에서 과산화물 중합 개시제의 존재 하에 공중합 시키는 것과 관련된다. 수성 매질은 물의 전기분해에 의해 얻어지며 pH 9.0 ~ 9.5를 갖는다. 공중합체의 가교는 반응 혼합물을 먼저 20 ~ 90℃에서 2~24시간 동안 그리고 나서 100 - 105℃에서 2-4시간 동안 인큐베이션 하는 두 단계로 수행된다.

전술한 방법으로 얻은 친수성 젤은 테트라메틸에틸렌 디아민을 함유하지 않으며, 1%를 약간 초과하는 NH₂-라디칼 그리고 중합체 g당 0.6 ~ 0.8 μg 의 아크릴아마이드 단량체 (0.6 ~ 0.8 ppm)를 함유한다. 그러나 이것 또한 주로 신체 결함의 성형 윤곽 교정을 위하여 설계되고 의도되었으며, 담체로서는 충분히 오랫동안 이식된 이종세포의 생리학적 활성을 유지하지 못한다.

본 발명은 의료 목적을 위한 물질, 특히 포유류의 체내에 이식되는 인간 및 동물 세포를 위한 담체로서 사용될 수 있는 생체적합성 폴리아크릴아마이드 젤 제제(formulation) 및 젤 제조방법에 관한 것이다. ;

- 종양 또는 농양과 같은 경우 장기간 약물 치료를 위한 저장부(depot)로서.

발명의 이해를 돕기 위하여, 이하에서 본원의 생체적합성 친수성 젤 제조의 특정 실시예가 제공된다. 여기서 :

도 1a는 본원의 친수성 젤의 적외선 (IR) 흡수 스펙트럼을 도시하며;

도 1b는 러시아에서 특허 RU 2127129에 의하여 제조된 프로토타입 젤 "포름아크릴(Formacryl)" 의 IR 흡수 스펙트럼을 제공한다. ;

두 IR 스펙트럼은 4000-500 cm^-1에서 얻었다. [파장 (cm^-1)은 횡좌표에 도시되며, 흡수율은 T (%) 세포좌표에 도시된다.];

도 2a는 본원의 친수성 젤의 주사전자현미경(SEM) 사진을 제공한다. ;

도 2b는 포름아크릴 젤의 주사전자현미경(SEM) 사진을 제공한다. ;

두 사진은 히타치 S 405A 전자 현미경을 사용하여 얻었다.

본원 발명은 일차적으로 수여자의 체내에서 폴리아크릴아마이드 젤에 배치된 이종 세포의 생리학적 활성 기간을 증가시키는데 목적이 있다.

두 번째 목적은 친수성 젤의 재흡수를 감소시키며 수여자의 체내로 이식 후 마크로파아지에 대하여 덜 투과성이 되도록 만드는 것이다.

세 번째 목적은 친수성 젤 내의 자유 라디칼 및 단량체의 함량을 최소화함으로써 젤 이식에 대한 조직 반응을 감소시키는 것이다.

전술한 목적은 폴리아크릴아마이드 및 물로 구성된 다관능 생체적합 친수성 젤을 제안함에 의하여 달성된다. 본 발명에 따른 다관능 생체적합 친수성 젤은 폴리아크릴아마이드 성분으로서 아크릴아마이드와 메트아크릴아마이드, 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 및 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드의 공중합체를 함유한다.

전술한 폴리아크릴아마이드는 % (w/w)로 다음의 비율로 구성 성분을 함유한다. :

아크릴아마이드 - 65.0 ~ 80.0,

메트아크릴아마이드 - 18.0 ~ 30.0,

2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 - 0.1 ~ 4.0

N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드 - 0.2 ~ 6.0.

전술한 폴리아크릴아마이드는 생체적합성 친수성 젤의 총 중량에 대하여 3.0 내지 10.0 % (w/w)을 차지한다.

전술한 생체적합성 젤은 % (w/w)로 다음의 비율로 구성 성분을 함유한다. :

아크릴아마이드 - 1.95 ~ 8.0,

메트아크릴아마이드 - 0.54 ~ 3.0,

2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 - 0.003 ~ 0.4,

N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드 - 0.006 ~ 0.6,

총 합이 100이 되도록 적량의 물.

친수성 젤은 물로서 이중증류(bidistilled) 비발열성 물을 함유한다.

다관능 생체적합 친수성 젤은 pH 3.5 ~ 4.5를 갖는다.

전술한 친수성 젤은 주사에 적합하며 주사기에 채워진다.

전술한 친수성 젤은 인간 또는 동물 체내에서 캡슐 형성이 용이하다. 이 목적을 위하여, 이것은 인간 또는 동물 체내에 이식되며, 그 후 선택된 세포주(cell culture)가 내부에 배치된다.

전술한 목적은 또한 단량체와 가교제를 수성 매질 내에서 과산화물 중합 개시제의 존재 하에 다단계 공중합 하는 방식에 의하는 다관능 생체적합 친수성 젤의 제조방법을 제안함에 의하여 달성된다. 본 발명에 따른 다관능 생체적합 친수성 젤의 제조방법에서, 단량체로서 아크릴아마이드 및 메트아크릴아마이드 그리고 가교제로서 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 및 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드를 % (w/w)로 다음의 비율로 취하고 ;

아크릴아마이드 - 1.95 ~ 8.0,

메트아크릴아마이드 - 0.54 ~ 3.0,

2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 - 0.003 ~ 0.4,

N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드 - 0.006 ~ 0.6,

총 합이 100이 되도록 적량의 물.

그리고 공중합은 (1) 반응 혼합물을 20 ~ 30℃에서 12 ~ 24시간 동안 인큐베이션하고, (2) 0.4 ~ 1.0× 10⁶rads의 감마선(γ-radiation)에 노출시키고, 그리고 (3) 100 -130℃의 온도 및 0 ~ 1.2 atm의 압력에서 20 ~ 40분 동안 인큐베이션 하는 것을 포함하는 세 단계로 수행된다.

이 세 단계의 공중합 후에, 반-완결된(half-finished) 생성물은 70~110℃의 뜨거운 물로 3시간 이상 0 ~ 1.2 atm의 압력에서 세척되며, 젤과 물은 중량으로 1 : 8~10의 비율로 취해진다.

공중합 개시제로 사용된 과산화수소 및/또는 과황산암모늄(ammonium persulfate)은 출발 물질 총 중량의 0.33 % (w/w)이하의 비율로 첨가된다.

이중 증류된 비발열성 물이 수성 매질로서 사용된다.

이 방법으로 얻은 젤은 주사기에 배치되거나 채워지며 인간 또는 동물 체내에 이식을 위하여 사용된다. 여기서 이것은 캡슐 형성의 기초가 되며 수반되어 배치되는 선택된 세포주를 위한 담체로서 이용된다.

본원의 친수성 젤은 다른 방법으로 제조될 수 있으며, 본원의 방법은 그것을 제조하는 직접적인 또는 간접적인 다른 접근방법을 어떤 식으로든 제외하지 않으며, 주어진 조성 및 성질을 갖는 친수성 젤을 제조하는 가능한 방법들 중 하나를 제공한다.

폴리아크릴아마이드 친수성 젤은 그것의 셀(cells) 내에 물을 보유하는 가교제에 의하여 가교된 단량체의 공간 그물망으로 알려져 있다. 이것은 특정의 미지의 중합 개시제 용량이 직접적으로 공중합체의 구조에 채워지기 때문에 특정의 미지의 결합되지 않은 중합 개시제를 함유하거나 (참조문헌 M.N. Savitskaya and Yu.D. Kholodova, polyacrylamide, Tekhnika, 1969, p.103) 또는 젤 세척 단계에서 세척된다.

이 친수성 젤의 생물학적 활성은 주로 가교된 중합체의 구조에 의존하며, 이것은 차례로 (1) 합성 조건, 특히 출발 물질, 특히 화학 결합 및 수소 결합(NH, CH, COOH, NH₂, CH₂그룹에서)에 의하여 공중합체의 구조에 채워질 수 있는 중합의 가교제 및 개시제의 정성적 및 정량적 특성, 그리고 (2) 공중합 조건에 의하여 결정된다.

본 발명의 본질은 폴리아크릴아마이드 젤의 제제 및 공중합의 작업 조건이 선택된다는 점에 있으며, 이것은 수여자의 체내에서의 생리학적 활성의 시간을 증가시키도록 작용한다.

본원의 폴리아크릴아마이드 젤을 제조하는 본원의 방법의 사용은 최종 생성물이 결합되지 않는 아미노 그룹, 자유 NH₂-라디칼 그리고 불포화 이중결합을 적게 가지도록 한다. 또한, 고도의 가교는 (-H₂C-NH-CH₂-), (-CO-NH-CR₂-O-R), (-CO-NH-NH-CO-), (H-COR-NH-CR-O-R), (-CONH-R-NH-CO), 여기서 R은 CH₃, CH₂, NH₂,C₂H₅, 또는 C₃H_7,와 같은 구조적 그룹의 형성 그리고 가교, 즉 N-N 결합 넘버의 증가의 결과로 얻어진다.

이들 모두는 함께, 수여자의 체내에 있는 동안 재흡수 및 수축에 고도로 내성을 갖는 친수성 젤을 얻고, 젤에 배치된 세포의 생존을 위한 조건을 형성하는 것이 가능하도록 한다.

본원의 생체적합성 친수성 젤의 제조에 사용된 시약:

■아크릴아마이드: C₃H₅NO, 분자량 71.08, 백색 결정의 무취 분말; 녹는점 84.5℃ Sigma社 제품 (카탈로그 《Biochemicals and reagents for molecular biology and life sciences research》 SIGMA, 1999, p. 47, cat. No.8887);

■메트아크릴아마이드: C₃H₇NO; 분자량 73.08, 백색 분말; 녹는점 111℃; Fluka社 제품 (Fluka 카탈로그 "Chemica-Biochemica", Fluka AG, 스위스, 1986/87, p.1151);

■2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트: C₆H₁₀O₃, 분자량 130.1, 액상; 끓는점205~-208℃; 밀도 1.07 g/ml; Sigma社 제품 (카탈로그 《Biochemicals and reagents for molecular biology and life sciences research》 SIGMA, 1999, p. 567, cat. No.H8633);

■ N,N' - 메틸렌 bis - 아크릴아마이드: C₇H₁₀N₂O₂, 분자량 154.16, 백색 결정 무취의 분말; 녹는점 185 ℃, Sigma社 제품 (카탈로그 《Biochemicals and reagents for molecular biology and life sciences research》 SIGMA, 1999, p. 696, cat. No.M7256);

■과황산암모늄: (NH₄)₂S₂O₈- 분자량 228.19; 무색 평면 결정; 분해 온도(breaking temperature) 120℃; Sigma社 제품 (카탈로그 《Biochemicals and reagents for molecular biology and life sciences research》 SIGMA, 1999, p. 117);

■과산화수소: H₂O₂- 분자량 34.0; 무색 액체, 0℃에서의 밀도 -1.465; 녹는점 -0.89 ℃; Sigma社 제품 (카탈로그 《Biochemicals and reagents for molecular biology and life sciences research》 SIGMA, 1999, p. 556, cat. No.H6520).

전술한 모든 단량체는 생물학적 등급이어야 하며 부가적인 정제 없이 사용에 적합해야 한다.

물은 이중 증류(bidistilled)되어야 하며 비발열성이어야 한다. (pH=5.6)

이 방법은 다음과 같이 실시된다. :

반응 혼합물의 준비를 위하여 이중 증류된 pH 5.6의 비발열성 물을 취한다.아크릴아마이드, 메트아크릴아마이드, 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 그리고 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드를 65.0 ~ 80.0 : 18.0 ~ 30.0 : 0.1 ~ 4.0 : 0.2 ~ 6.0의 비율로 함유하는 수용액이 제조된다.

출발 단량체는 용액의 총 중량의 3.0 내지 10.0 %이다. (출발 혼합물의 단량체들 사이의 비율을 변화시킴으로써, 다른 밀도 및 탄성을 갖는 친수성 젤을 얻을 수 있다.)

얻어진 용액에 과산화수소 0.1~0.3 % (w/w) 또는 과황산암모늄 0.0006~0.03 % (w/w) 또는 이 둘의 혼합물을 어떤 비율로든 그러나 그들의 최대값의 합을 초과하지 않는 용량으로 취한 중합 개시제를 첨가한다. 과산화수소와 과황산암모늄의 비율을 변화시킴으로써 3.5 내지 4.5 범위의 pH 값을 갖는 친수성 젤을 얻는다.

제조된 반응 혼합물은 F8273과 같은 멸균 중합체 필터를 0.45mm CA/CN (Sigma, USA)의 여과속도로 통과시키고, 그 후 20-30 ℃에서 12~24시간 동안 출발 단량체의 공중합을 위하여 인큐베이션 한다. 그 후, 얻어진 반-완결 생성물이 얻어지며, 이것은 이때 즈음에 젤처럼 보이며 뜨거운 물로 세척된다. 이 목적을 위하여, 이것은 70~110 ℃ 온도의 물이 담긴 용기에 0~1.2 atm의 압력으로 4~6 시간동안 둔다. 젤과 물은 1 : 8~10의 비율로 취해진다.

그 후 공중합의 제 2 단계가 수반되며, 이것을 위하여 반-완결 생성물은 0.4~1.0 × 10⁶용량의 감마선(γ-radiation)에 노출된다. 그 후, 반-완결 생성물은 병이나 주사기에 채워지고, 공중합의 제 3단계가 젤을 120℃에서 1.2 atm으로20~40분 동안 인큐베이션 함으로써 수행된다.

본원 친수성 젤의 생리 화학적 및 화학적 특성 그리고 독성에 대한 연구가 ISO 표준 10993 "의료 용구의 생물학적 평가(Biological Evaluation of Medical Devices)", "의료용 고무 및 라텍스 장치의 위생 및 보건 평가에 대한 가이드라인 (Guidelines on Sanitary and Hygienic Assessment of Medical Rubber and Latex Devices)" (USSR 보건당국, M., 1988) 그리고 "식품 친수성 젤 접촉 화학 성분의 허용 가능한 이동 및 분석 방법(Allowable Migration of Chemical Substances Contacting Food Hydrophilic Gels and Assay Methods)" 가이드라인, SanPiN 42-122-42-40-86 (보건 위생 규정 : Sanitary and Hygienic Regulations)에 따라 수행되었다.

얻어진 친수성 젤 내의 아크릴아마이드 단량체 및 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드의 분석은 V.V. Kuznetsov et al.에 개시된 절차에 따라 이루어 졌다. 《폴리아크릴 아미드성 젤 내의 아크릴아마이드의 측정(Determination of Acrylamide in Polyacrylamidic Gels"// The 52-nd Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy. - New Orleany, LA, 2001, Abstract Book, 1648.》

이들 연구에서, 본원 친수성 젤은 다음의 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. :

- 외형 - 젤;

- 색 - 무색 내지 반투명 오팔 ;

- 굴절 지수 1.328~1.360;

- 밀도 1.0 ~ 1.2 g/cm³

- pH 3.5 ~ 4.5;

- 단량체 함량 0.4 ppm이하;

- 브롬 값(Bromine value) 최대 1.0 (브롬의 mg/l).

화학적 연구에 의하면 :

- 원자 흡수법(atomic absorption method)에 의하여 측정된 결과 분석 방법의 반응 한계 내에서 친수성 젤로부터 수성 추출액으로의 금속의 이동(Cu, Fe, Ni, Zn, Al, Ti, Ag)이 발견되지 않았음(각각, 0.02; 0.05; 0.05; 0.02; 0.005; 0.04 mg/l), 이 값들은 대응되는 식수(potable water)를 위하여 설정된 최대 허용가능 농도보다 현저히 낮은 것이다. ;

- 소듐의 이동은 0.12 mg/l를 초과하지 않았으며, 이것은 식수를 위하여 설정된 최대 허용가능 농도 200 mg/l보다 낮은 것이다.

토끼에 대한 생체 내 독성 시험에서, 분리된 적혈구 세포는 친수성 젤의 수성 추출액에 의한 어떠한 용혈 효과도 나타내지 않았다. 용혈 지수(hemolytic index)는 허용 가능한 한계로 설정된 2%에 대하여 0.04%로 나타났다.

흰 쥐에 대한 급성 독성 시험에서, 50.0 ml/ kg 체중의 투여량으로 친수성 젤을 직장 투여 후 동물에서 사망이나 중독의 임상 징후의 출현이 전혀 나타나지 않았다. : 대조군에 비하여 모발 상태, 먹이 섭취, 행동 일반적 상태에서 차이가 없었다.

쥐의 해부 후의 연구에서, 주사 부위의 조직의 상태, 국소 임파절, 내부 기관 상태(간, 신장, 비장)는 정상으로 나타났다.

체중 증가, 임상 및 생화학적 혈액 테스트 결과, 내부 장기 상태에서 젤이 피하 주사된 동물과 대조군 사이에 주사 후 2.5개월 후에 통계학적으로 현저한 차이는 나타나지 않았다.

마스트 세포 탈과립 면역학적 테스트(MCDIT)에서 친수성 젤의 감작 효과는 나타나지 않았다.

골수 생성의 마이크로뉴클리어 테스트(Micronuclear tests)에서 친수성 젤은 돌연변이 유발효과를 나타내지 않았다. 내부 기관(간, 신장, 비장, 정소) 및 주사 부위에서 채취한 조직 샘플의 조직학적 평가에서는 이식 후 첫 날에 온화한 조직 반응을 나타내었을 뿐이며 내부 기관에 이영양형(dystrophic) 또는 괴사성(necrotic) 변화가 나타나지 않았다.

수여자의 체내에서의 이종 세포 배양을 위한 담체로서 본원의 생체적합성 친수성 젤의 용도 및 제조방법의 실시예가 이하에서 제공된다.

실시예 1.

친수성 젤 제조를 위하여, 모두 생물학적 등급인 11.2g의 아크릴아마이드, 3.6g의 메트아크릴아마이드, 0.48g의 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 그리고 0.72g의 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드를 pH 5.6의 이중 증류된 비발열성 물 384ml에 용해시켰다. 그 후, 0.04g의 과황산암모늄 그리고 2ml의 30% 과산화수소를 첨가하였다. 반응 혼합물을 무균 중합체 필터 F8273을 0.45mm CA/CN (Sigma, USA)의 여과 속도로 통과시키고 물중탕으로 30℃에서 22 시간동안 인큐베이션 하였다. 그 후, 이 때 쯤 젤처럼 보이는 반-완결 생성물은 뜨거운 물로 90℃에서 4시간 동안 세척하며, 물과 젤은 10 : 1의 비율로 취해진다. 그 후 반-완결 생성물을 감마선(γ-radiation)에서 0.8~1.0 × 10⁶rads의 강도로 노출시키는 공중합의 제 2단계가 수반되었다. 그 후, 반-완결 생성물은 0.5~3.0ml 주사기에 채워지고, 생성물은 120℃에서 1.2atm으로 30분 동안 인큐베이션 함으로써 공중합의 제 3단계가 수행되었다.

얻어진 젤은 96 % (w/w)의 물과 4 % (w/w)의 공중합체를 함유한다. 공중합체에는 70.0 % (w/w)의 아크릴아마이드를 위하여 22.5 % (w/w)의 메트아크릴아마이드, 0.3 % (w/w)의 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 그리고 0.4 % (w/w)의 N,N'- 메틸렌-bis-아크릴아마이드가 존재하며, 젤은 pH = 4.3을 갖는다.

얻어진 친수성 젤은 다음과 같은 물리화학적 특성을 갖는다. :

외관 - 무색, 반투명, 오팔 빛 젤;

굴절 지수 1,348;

pH 4.3;

밀도 1.0g/cm³

단량체 함량 0.1 ppm;

브롬 값 0.1 (브롬의 mg/l).

친수성 젤의 건조된 샘플을 IR 스펙트로스코프 및 전자 현미경으로 분석하였다. 대응되는 IR 스펙트럼 및 사진이 도 1a 및 2a에 제공된다.

비교를 위하여, Figs. 2b 및 2b는 특허 RU 2127129에 따라 러시아에서 제조된 프로토타입 젤 포름아크릴(Formacryl)의 추출물을 위한 IR 스펙트럼 및 크로마토그램을 제공한다. 이것은 96 % (w/w)의 물과 4 % (w/w)의 공중합체를 함유하며, 공중합체는 96 % (w/w)의 아크릴아마이드를 위하여 4.0 % (w/w)의 N,N'- 메틸렌-bis-아크릴아마이드를 보유하며, 젤은 pH = 5.4 그리고 브롬 값 0.27 (브롬의 mg/l)이다. 그리고 이것은 출발 단량체를 0.3 % (w/w)의 비율(rate)로 첨가되는 과산화수소와 및 과황산암모늄과 제 1 단계에서는 60℃에서 12시간 그리고 그 후 100℃에서 2시간 동안 두 단계로 인큐베이션 함으로써 얻어진다.

도 1a에 도시된 바와 같이, 제공된 스펙트럼에서 1620 cm^-1에서는 피크가 없으며, 이것은 배위 결합(coordinate bonding)에 의하여 구조로 채워 넣어질 수 있는 자유 NH₂-라디칼의 부재를 증명한다.

이와는 반대로, 도 1b는 1620 cm^-1에서 피크를 가지며, 이것은 1%이상의 자유 NH₂-라디칼의 존재를 의미한다.

전자 현미경 연구를 위하여, 본원의 친수성 젤 및 전술한 바와 같이 제조된 포름아크릴 젤을 일정 중량 및 박막처럼 보일 때까지 건조하였다. 친수성 젤의 구조가 Hitachi S 405A 전자 현미경을 사용하여 주사전자현미경(SEM)에 의하여 연구되었다. 테스트되는 친수성 젤의 샘플을 절단하고 액체 질소에서 냉동시켜 현미경관찰 시료를 준비하였다. 주사 전에, 시료의 표면은 금으로 분사되었다.

주사전자현미경(SEM) 으로 얻은 본원의 친수성 젤 및 포름아크릴 젤의 사진은 각각 도 2a 및 2b에서 제공된다.

도2에 도시된 바와 같이, 본원의 친수성 젤이 포름아크릴보다 좁은 그물망 구조를 갖는다.

실시예 2.

이종 종양 세포 배양을 위한 담체로서의 본원 친수성 젤의 용도.

실시예 1에 개시된 바에 따라 제조된 1 ml의 친수성 젤을 C57 블랙 라인 쥐의 피하에 주사하였다. 주사한지 1.5개월 후 결합 조직 캡슐이 젤 주위에 형성된 후, 1 mln. 인간 흑색종SKMEL-1라인 세포가 각 캡슐에 이식되었다.

젤 캡슐은 3, 6 그리고 9 개월에 적출되었으며, 인간 흑색종 세포의 생존율 및 생리학적 활성을 테스트하였다.

인간 흑색종SKMEL-1라인 세포는 본원의 젤의 캡슐 내에서 배양된 지 심지어 9개월 후에도 생존하는 것으로 밝혀졌다.

캡슐로부터 흑색종 세포를 분리하여 배지로 이동한 후, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)의 표준 절차를 사용하여 하여, 표준 브로스(broth)에서 생장한 흑색종 세포 내의 보존 인간 미오글로빈(conservative human myoglobin)이 쥐의 체내의 친수성 젤의 캡슐 내에서 9개월간 배양된 세포의 그것과 동일하다는 것이 밝혀졌다.

이 실시예는 본원의 친수성 젤이 수여자의 체내에 이식된 세포의 장기간의배양을 위한 담체로서 사용될 수 있으며, 이들을 오랫동안 생존시킨다는 것을 보여준다.

실시예 3.

불임의 치료를 위하여 인체 내에 이식되는 돼지 레이디히 세포(porcine Leydig's cells)를 위한 담체로서의 본원의 친수성 젤의 용도.

실시예 1에 따라 제조된 친수성 젤을 남성 환자의 조직에 삽입하였다. 결합조직 캡슐 형성 후, 성숙 초기의 돼지로부터 채취한 레이디히 세포가 이식되었다.

혈액 테스토스테론 농도가 KhemaMedika社 (러시아)의 진단 키트로 제조자의 지시에 따라 측정되었다.

돼지 레이디히 세포의 이식 후 측정된 테스토스테론 농도는 아래 표와 같다.

표에서 도시된 바와 같이, 본원의 친수성 젤은 인체 내에 이식된 돼지 레이디히 세포를 위한 담체로서 성공적으로 사용될 수 있으며 테스토스테론을 22개월동안 생성할 수 있다. 반면, 프로토타입 젤(포름아크릴)에 이식된 세포는 10개월 후부터 일찍 테스토스테론의 합성 감소를 나타내었다.

실시예 4.

인슐린 의존성 당뇨병의 치료를 위하여 인체 내에 이식된 췌장의 이종 세포를 위한 담체로서의 본원 친수성 젤의 용도.

1. 여성 환자 F., 37세.17년 전, 출산 1년 후에 인슐린 의존성 당뇨병의 진단을 받음.

임신은 비정상적이었으며 임신 후반부에 임신 중독증(toxemia), 신병증(nephropathy) 그리고 상당한 체중 증가(26kg까지)가 수반되었다. 발병 이후, 질병의 진행은 불안정 하였으며 이것은 적절한 인슐린 치료를 어렵게 만들었다. 외생 인슐린 섭취는 58 내지 30 유닛/일로 변화를 주었다. 지난 2년 동안, 신장의 병리학적 변화가 진단되었으며 당뇨선 신병증(diabetic nephropathy)으로 진단되었다. 뇨의 단백 농도는 단백뇨의 상한을 10- 그리고 심지어 12-배 초과하였다. 혈압은 170/110 Hg mm로 증가하였다.

실시예 1에 따라 제조된 친수성 젤이 환자의 조직에 삽입되었다. 결합 조직 캡슐 형성 이후, 신생 토끼의 췌장 세포가 젤 내로 이식되었다.

췌장 세포 이식 7일 후, 환자의 전반적 상태가 개선된 것으로 보고되었다. 목이 덜 마르고 구강의 건조감이 감소되었다. 혈압은 140/90 Hg mm로 떨어졌다. 이식 후 15에, 환자의 상태가 더 개선되어 외생 인슐린의 투여량은 30 유닛에서 18 유닛으로 감소되었다. (혈액 및 뇨 콘트롤), 외생 인슐린의 요구량은 이식 후 30일에 12 유닛/일로, 2개월 후에는 4 유닛/일로 떨어졌다.

환자는 췌장 세포 이식 후 12개월 동안 관찰되었다. 당뇨선 신병증의 임상적 징후는 나타나지 않았으며, 혈압의 연령의 정상 범위 내에 있었다. 환자는 경구용 혈당 강하제를 투여하는 것으로 바뀌었으며 항-당뇨병 식단을 엄격히 따르도록 권유하였고 혈액 및 뇨의 당 및 포도당화(glycosylated) 헤모글로빈 농도를 정기적으로 측정하도록 하였다.

2. 남성 환자 K., 52세.18세에 인슐린 의존성 당뇨병으로 진단받았으며 심한 스트레스성임. 초기에, 환자의 상태는 심각하게 불안정하였다. 외생 인슐린의 투여량은 70 유닛/일 정도로 높았다. 그러나 그 후, 질병의 진행은 보다 안정적이 되었으며, 증상은 스트레스 상태 또는 식사 규칙을 따르지 않은 경우에 악화되었다.

지난 3년 동안 하지(lower extremities)의 혈관 상태의 저하, 리비도의 감소, 발기 장애, 성적 교제의 질적 저하가 관찰되었다. 하지 및 페니스의 당뇨성 맥관 장애가 진단되었다. 지난 일 년 동안, 외생 인슐린의 필요량은 20 내지 40 유닛/일이었다.

실시예 1에 따라 제조된 친수성 젤이 환자의 조직에 삽입되었다. 결합 조직 캡슐의 형성 후, 14-일령 돼지 췌장 세포가 젤에 이식되었다.

췌장 세포 이식 2주 후, 전반적인 상태의 개선이 보고되었다. 외생 인슐린의 요구량은 1개월 후에 12 유닛/일로 그리고 2개월 후에 6 유닛/일로 감소되었다. 4개월 후, 환자는 경구용 혈당 강하제 치료로 전이되었다. 성생활이 정상화 되었으며, 하지의 혈관 상태도 개선되었다.

주관적 및 객관적 증상 모두를 평가하고 환자를 테스트한 결과 본원의 조성의 친수성 젤 내로 췌장 이종 세포를 삽입함에 의하여 당뇨병을 치료하는 것은 높은 효율을 나타낸다.

치료 효과는 질병의 심각성에 따라 대개 10~20개월간 지속되었다. 이식되는 세포의 수 역시 당뇨병의 심각성, 특히 외생 인슐린의 투여량에 따른다.

결론적으로, 전술한 실시예는 본원의 생체적합성 친수성 젤이 본원의 방법에 을 사용하여 제조될 수 있음을 증명한다.

본원의 친수성 젤은 실제로 수여자의 체내에서 어떠한 조직 반응, 감작 또는 이영양형/괴사성 변화를 일으키지 않으며, 인간 및 동물 체내로의 이식에 적합하며, 여기서 캡슐 형성의 근거가 되어 그 후 이식되는 선택된 세포 배양을 위한 담체로서 작용한다.

공지의 프로토타입 젤(포름아크릴 친수성 젤)에 비하여, 본원의 젤은 배위 결합에 의하여 친수성 젤의 구조적 그물망에 들어맞는(fit) 자유 NH₂-라디칼을 함유하지 않는다.

프로토타입에 비하여, 본원의 친수성 젤은 보다 폐쇄된 그물망 구조를 가지며 세포를 생존시키며 테스토스테론이나 인슐린 같은 수여자를 위한 필수적 물질을 생성할 수 있도록 유지하여 장기간동안 수여자의 체내에서 이식된 세포의 배양을위한 담체로서 사용될 수 있다.

Claims

폴리아크릴아마이드로서, 아크릴아마이드와 메트아크릴아마이드, 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 그리고 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드의 공중합체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 1항에 있어서, 상기 폴리아크릴아마이드는 아래의 비율로 각 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤 :

아크릴아마이드 65.0 ~ 80.0 w/w %,

메트아크릴아마이드 18.0 ~ 30.0 w/w %,

2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 0.1 ~ 4.0 w/w %,

N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드 0.2 ~ 6.0 w/w %
제 1항에 있어서, 상기 폴리아크릴아마이드는 생체적합성 친수성 젤의 총 중량의 3.0 내지 10.0 % (w/w)인 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 1항에 있어서, 아래의 조성비를 갖는 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤. :

아크릴아마이드 1.95 ~ 8.0 w/w %,

메트아크릴아마이드 0.54 ~ 3.0 w/w %,

2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 0.003 ~ 0.4 w/w %,

N,N'- 메틸렌-bis-아크릴아마이드 0.006 ~ 0.6 w/w %,

총 중량을 100으로 하는 물 적량.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물은 이중 증류된 비발열성 물(bidistilled apyrogenic water)인 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, pH 3.5 ~ 4.5를 갖는 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 1항에 있어서, 주사에 적합한 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 1항에 있어서, 인간 및 동물 조직에서 캡슐의 형성에 적합한 것을 특징으로 하는, 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 1항에 있어서, 이종 (동종[allogenic]의 또는 이종[xenogenic]의) 또는 자가 면역 세포의 배양을 위한 담체로서 사용에 적합한 것을 특징으로 하는, 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
제 7항에 있어서, 주사기 내에 채워지는 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아마이드와 물을 함유하는 다관능 생체적합 친수성 젤.
아크릴아마이드와 메트아크릴아마이드가 단량체로 사용되고, 2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트와 N,N'-메틸렌-bis-아크릴아마이드가 가교제로 사용되며;

각 성분들을 아래의 비율로 취하고; 그리고

아크릴아마이드 1.95 ~ 8.0w/w %,

메트아크릴아마이드 0.54 ~ 3.0w/w %,

2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트 0.003 ~ 0.4w/w %,

N,N'- 메틸렌-bis-아크릴아마이드 0.006 ~ 0.6w/w %,

물 총량이 100이 되도록 적량.

공중합은 (1) 반응 혼합물을 20 ~ 30℃에서 12 ~ 24시간 동안 인큐베이션하고, (2) 0.4 ~ 1.0× 10⁶rads의 감마선(γ-radiation)에 노출시키고, 그리고 (3) 100 ~ 130℃의 온도 및 0 ~ 1.2 atm의 압력에서 20 ~ 40분 동안 인큐베이션 하는 단계를 포함하는 세 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는,

과산화물 중합 개시제의 존재 하에 수성 매질 내에서 단량체와 가교제의 다단계 공중합에 의한 다관능 생체적합 친수성 젤 제조방법.
제 11항에 있어서, 공중합의 첫 번째 단계 이후, 상기 친수성 젤은 70~110℃의 뜨거운 물로 3시간 이상 0 ~ 1.2 atm의 압력에서 세척하며, 젤과 물은 중량으로 1 : 8~10의 비율로 취해지는 것을 특징으로 하는 다관능 생체적합 친수성 젤 제조방법.
제 11항에 있어서, 공중합의 개시제로서 과산화수소 및/또는 과황산암모늄(ammonium persulfate)이 출발 물질 총 중량의 0.33 % (w/w)이하로 첨가되는 것을 특징으로 하는 다관능 생체적합 친수성 젤 제조방법.
제 11항에 있어서, 물 매질로서 이중증류 비발열성 물이 사용되는 것을 다관능 생체적합 친수성 젤 제조방법.
제 11항에 있어서, 상기 친수성 젤은 주사기에 채워지는 것을 특징으로 하는 다관능 생체적합 친수성 젤 제조방법.