-
Die
Erfindung bezieht sich auf eine Rezeptur zur Gewinnung von bioverträglichem
Polyacrylamid-Hydrogel, das als Material für medizinische Zwecke, insbesondere
als Träger
von Menschen- und Tierzellen, die im Organismus von Säugetieren
implantiert sind, als Depot für
medizinische Präparate
während
einer längeren,
medikamentösen
Behandlung, beispielsweise von Geschwülsten oder Abszessen, verwendet
werden kann.
-
Es
ist bekannt, dass die Polyacrylamid-Hydrogele (PAAG) genügend billige
und in der Herstellung einfache Materialien sind und über eine
chemische und biologische Trägheit
verfügen.
Sie lassen sich leicht mit der gewünschten Dichte und in einer
Form synthetisieren, die für
die Unterhauteinführung
und/oder für
die Einführung
in Weichteile mit minimalen Verletzungen des Organismus des Patienten
geeignet ist.
-
In
der Medizin ist durch die
RU
2165263 ein Verfahren zur Behandlung von insulinabhängiger Diabetes bekannt,
bei dem heterogene β-Zellen
der Bauchspeicheldrüse
in das dem Patienten vorher subkutan eingeführte Polyacrylamidgel transplantiert
wird, um das sich eine Kapsel gebildet hat.
-
Durch
die
RU 2152800 ist auch
ein Verfahren zur Kultivierung von heterogenen Zellen von Säugetieren,
insbesondere von Leiding-Zellen und von Melanomzellen, durch deren
Transplantation in das den Säugetieren
vorher eingeführte
Polyacrylamidgel bekannt.
-
Dies
eröffnet
die Möglichkeit
zur Behandlung einer Reihe von Krankheiten durch Transplantation
der heterogenen Zellen in den Organismus des Kranken, der die für ihn nötigen Fermente
und/oder Hormone erzeugt; dies ermöglicht auch eine Impfbehandlung
von onkologischen Krankheiten.
-
Wie
versuchsmäßig festgestellt
wurde, hängt
die Dauer der Erzeugung der durch die heterogenen Zellen der für den Organismus
der Kranken nötigen
Zellen bei gleichen Bedingungen von den Eigenschaften des Polyacrylamidgels
(PAAG) ab.
-
Wie
bekannt ist, bildet sich bei der Implantation von PAAG im Organismus
des Säugetiers
um das Gel herum eine Verbindungskapsel (A.B. Shekhter et al., "Injectable hydrophilic
polyacrylamide gel Formaciyl and tissue response to its implantation", in der Fachzeitschrift "Annalen der plastischen,
rekonstruktiven und ästhetischen
Chirurgie", 1997,
Nr. 2, Seite 19), die für
eine gewisse Zeit das Eindringen von T-Lymphozyten zu den im PAAG implantierten
Zellen und die Zerstörung
der implantierten Zellen verhindert.
-
Jedoch
nicht nur das Vorhandensein der gewebeverbindenden Kapsel beeinflusst
die Dauer der Erzeugung der durch die heterogenen Zellen veranlassten,
für den
Organismus des Kranken erforderlichen Stoffe.
-
Durch
die
EP 742022 ist ein
bioverträgliches
Polyacrylamid-Hydrogel bekannt, das von 3,5 bis 9,0 Mass.% des Kopolymers
Acrylamid mit dem Vernetzungsagens Methylen-bis-Acrylamid und 96,5-99,0 Mass.%
Wasser enthält.
-
Dieses
Hydrogel wird durch ein Verfahren gewonnen, das im gleichen Dokument
beschrieben ist (
EP 742022 )
und das darin besteht, das die Reaktion der Kopolymerisation von
Acrylamid mit Methylen-bis-Acrylamid im Wasser in Anwesenheit von
Peroxidinitiatoren der Polymerisation mit Verzögerung der Reaktionsmischung
bei Zimmertemperatur innerhalb von 20 Minuten für die Vernetzung des Polymers
durchgeführt
wird. Dabei wird der Prozess der Kopolymerisation in einer Stufe
durchgeführt.
Als Peroxid-Polymerisationsinitiatoren wird ein Gemisch aus Peroxodisulfat-Ammonium
und Tetramethyläthylendiamin
verwendet. Als Wassermedium wird Apyrogenwasser oder eine Natriumchloridlösung genommen.
-
Das
Hydrogel, das mit diesem Verfahren gewonnen wurde, hat einen nicht
ausreichenden Vernetzungsgrad, was durch das niedrige Temperaturverhalten
bei der Durchführung
des Kopolymerisationsprozesses und die Einstufigkeit des Verfahrens
bedingt ist. Dies führt
zu einer schnellen Durchwachsung des Bindegewebes in das implantierte
Gel und zu dessen schnellem Schrumpfen und schneller Resorption
(A.B.Shekhter et all "Injectable
hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to
its implantation",
in der Fachzeitschrift "Annalen
der plastischen, rekonstruktiven und ästhetischen Chirurgie", 1997, Nr. 2, Seite
19).
-
Außerdem enthält das mit
diesem Verfahren gewonnene Hydrogel nichtverbundene Moleküle von Tetramethyläthylendiamin,
freie NH2-Radikale und Monomere von Acrylamid
in einer Menge von 1,0-1,2 mkg auf 1 Gramm Polymer (1,0-1,2 ppm),
wodurch eine aktive, aseptische und entzündliche Reaktion im Frühstadium der
Einführung
des Hydrogels in den Organismus hervorgerufen werden kann (s. A.
B. Shekhter et al "Injectable
hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to
its Implantation",
in der Fachzeitschrift "Annalen
der plastischen, rekonstruktiven und ästhetischen Chirurgie ", 1997, Nr. 2, Seite
19).
-
Durch
das Patent
RU 2127129 ist
ein bioverträgliche
Hydrogel bekannt, das von 1,0 bis 8,0 Mass.% quervernetztes Kopolymer
von Acrylamid mit dem Vernetzungsagens Methylen-bis-Acrylamid und
92,0-99,0 Mass% Wasser enthält.
Ein Verfahren zur Gewinnung dieses Materials ist auch im Patent
RU 2127129 beschrieben und
besteht in der Kopolymerisation von Acrylamid mit Methylen-bis-Acrylamid
im wässrigen
Dispersionsmittel in Anwesenheit eines Peroxid-Polymerisationsinitiators.
Dabei wird als Wassermedium der Elektrolyse untergezogenes Wasser
mit einem pH-Wert von 9,0-9,5 genommen. Die Vernetzung des Kopolymers
wird bei der Inkubation der Reaktionsmischung in zwei Stufen durchgeführt; und
zwar bei einer Temperatur von 20-90°C innerhalb von 2-24 Stunden
und dann bei einer Temperatur von 100-105°C im Laufe von 2-4 Stunden.
-
Das
mit dieser Erfindung gewonnene Hydrogel enthält kein Tetramethyläthylendiamin,
enthält
jedoch 1 % freie NH2-Radikale und Monomere
des Acrylamids in einer Menge von 0,6-0,8 mkg auf 1 Gramm des Polymers
(0,6-0,8 ppm). Doch dieses Hydrogel ist vorwiegend für die Plastik
von weichen Geweben entwickelt und geeignet und sichert keine ausreichende
Dauer der aktiven Funktion der heterogenen Zellen bei seiner Verwendung
als Träger
der implantierten Zellen.
-
Die
Hauptaufgabe, die mit der vorgeschlagenen Erfindung gelöst werden
soll, ist die Steigerung der aktiven Lebensfähigkeit der im Polyacrylamid
untergebrachten, heterogenen Zellen im Organismus des Empfängers.
-
Eine
weitere Aufgabe besteht in der Senkung des Resorptionsgrads des
Hydrogels und der Möglichkeit
des Eindringens von Makrophagen nach Implantierung des Hydrogels
in den Organismus des Empfängers.
-
Eine
weitere Aufgabe ist die Verminderung der Gewebereaktion des Organismus
auf das implantierte Hydrogel durch die Verminderung von freien
Radikalen und Monomeren.
-
Die
gestellten Aufgaben werden dadurch gelöst, dass ein mehrfunktionelles,
bioverträgliches
Hydrogel vorgeschlagen wird, das Polyacrylamid und Wasser enthält, wobei
gemäß der Erfindung
das Polyacrylamid das Kopolymer von Acrylamid, Methacrylamid, 2-Hydroxiäthyl-Metacrylat
und N,N'-Methylen-bis-Acrylamid aufweist.
-
Das
genannte Polyacrylamid enthält
die folgenden Verhältnisse
der Komponenten in Mass.%:
Acrylamid | 65,0-80,0, |
Methacrylamid | 18,0-30,0, |
2-Hydroxyäthil Metacrylat | 0,1-4,0 |
N,N'-Methylen-bis-Acrylamid | 0,2-6,0. |
-
Das
genannte Polyacrylamid beträgt
3,0 bis 10,0 Mass.% der gesamten Masse des bioverträglichen Hydrogels.
-
Das
genannte, bioverträgliche
Hydrogel enthält
folgende Verhältnisse
der Komponenten in Mass.%:
Acrylamid | 1,95-8,0, |
Methacrylamid | 0,54-3,0, |
2-Hydroxyäthyl Metacrylat | 0,003-0,4, |
N,N'-Methylen-bis-Acrylamid | 0,006-0,6, |
Wasser | bis
100. |
-
Als
Wasser enthält
das Hydrogel bidestilliertes Apyrogenwasser. Das mehrfunktionelle,
bioverträgliche Hydrogel
weist einen pH-Wert von 3,5-4,5 auf.
-
Das
genannte Hydrogel ist für
die Injektion geeignet, in Spritzen abgepackt und für die Bildung
der Kapsel im Organismus von Tieren und Menschen gut geeignet. Dazu
wird es in den Organismus implantiert, und dann wird darin die gewünschte Zellkultur
untergebracht.
-
Die
gestellten Aufgaben werden folgendermaßen gelöst. Es wird ein Hydrogel zur
Gewinnung eines mehrfunktionellen, bioverträglichen Hydrogels durch Kopolymerisation
von Monomeren und eines Vernetzungsagens in wässrigem Medium in Anwesenheit
von Peroxidinitiatoren vorgeschlagen. Dieses Verfahren läuft in mehreren
Stufen ab. Bei diesem Verfahren werden gemäss der Erfindung als Monomere
Acrylamid und Methacrylamid genommen, und als Vernetzungsagens wird
Hydroxiäthyl-Metacrylat und N,N'-Methylen-bis-Acrylamid
bei folgenden Verhältnissen
der Komponenten in Mass.% genommen:
Acrylamid | 1,95-8,0, |
Methacrylamid | 0,54-3,0, |
2-Hydroxiäthyl Metacrylat | 0,003-0,4, |
N,N'-Methylen-bis-Acrylamid | 0,006-0,6, |
Wasser | bis
100. |
-
Die
Kopolymerisation wird in drei Stufen durchgeführt: die erste Stufe erfolgt
bei Zimmertemperatur von 20-30°C
innerhalb von 12-24 Stunden, die zweite Stufe erfolgt durch γ-Bestrahlung
mit einer Dosis von 0,4-1,0 Megarad, und die dritte Stufe erfolgt
bei einer Temperatur von 100-130°C
und einem Druck von 0-1,2 Atmosphären innerhalb von 20-40 Minuten.
-
Das
genannte Hydrogel wird nach der ersten Stufe der Kopolymerisation
mit heißem
Wasser, das eine Temperatur von 70-110°C hat, mindestens 3 Stunden
lang bei einem Massenverhältnis
des Hydrogels zum Wasser von 1:8-10 und einem Druck von 0-1,2 Atmosphären abgespült.
-
Als
Kopolymerisationsinitiator wird Wasserstoffperoxyd und/oder Peroxydsulfat-Ammonium in einer Menge
von nicht mehr als 0,33% Mass.% des summarischen Gewichts der Ausgangskomponenten
genommen. Als wässriges
Medium wird bidestilliertes Apyrogenwasser genommen.
-
Das
gewonnene Hydrogel wird in Spritzen gefüllt bzw. abgepackt und für die Implantierung
in den Organismus von Tieren und Menschen unter Bildung einer Kapsel
verwendet. Danach werden die gewünschten Zellkulturen
in die Kapsel eingeführt.
-
Das
vorgeschlagene Hydrogel kann mit unterschiedlichen Verfahren gewonnen
werden, und das Verfahren gemäß der Erfindung
zur Gewinnung von Polyacrylamid-Hydrogel
beschränkt
die anderen möglichen Varianten
der Gewinnung, sowohl der direkten als auch indirekten, des Hydrogels
nicht. Dieses Verfahren stellt einen der möglichen Wege zur Gewinnung
des Hydrogels dieser Zusammensetzung mit vorher festgelegten Eigenschaften
dar.
-
Wie
bekannt ist, stellt das Hydrogel, das Polyacrylamid enthält, ein
dreiachsiges Netz der mit dem Vernetzungsagens quervernetzten Monomere
dar, in dessen Zellen das wässrige
Medium enthalten ist. In diesem wässrigen Medium ist eine nicht
festgelegte Menge von nichtverbundenen Polymerisationsinitiatoren
enthalten, da eine gewisse, auch nicht festgelegte Menge von Polymerisationsinitiatoren
unmittelbar in die Struktur des Kopolymers eingebaut (s. M.N. Sawitzkaya,
Ju.D.Holodova "Polyacrylamid", Verlag "Technik" 1969, S. 103) oder
aus dem Hydrogel bei dessen Abspülen
ausgewaschen wird.
-
Dabei
hängen
die biologisch aktiven Eigenschaften eines solchen Gels wesentlich
von der Struktur des Netzpolymers ab, die ihrerseits von den Bedingungen
für die
Synthese des Netzpolymers abhängt,
und zwar vom qualitativen und quantitativen Verhältnis der Ausgangsreagenzien,
darunter das Vernetzungsagens und die Polymerisationsinitiatoren,
die mit ihren chemischen und Wasserstoff-Verbindungen in die Struktur
des Polymers eingebaut werden (nach Gruppen NH, CH, COOH, NH2, CH2). Diese Eigenschaften
hängen
auch von der Art der Polymerisation ab.
-
Das
Wesen der Erfindung besteht darin, dass eine qualitative und quantitative
Zusammensetzung des Polyacrylamid-Gels sowie die Bedingungen der
Durchführung der
Kopolymerisation gefunden wurde, die die Dauer der aktiven Lebensfunktion
der in den Organismus implantierten, heterogenen Zellen zu erhöhen erlauben.
-
Die
Bedingungen zur Gewinnung des vorgeschlagenen Polyacrylamid-Hydrogels
haben erlaubt, die Anzahl der nicht verbundenen Aminogruppen, der
freien NH2-Radikale
sowie der ungesättigten
Doppelbindungen zu vermindern. Es ist auch gelungen, den Vernetzungsgrad
durch die Bildung von Strukturgruppen (H2C-NH-CH2-), (-CO-NH-CR2-O-R),
(-CO-NH-NH-CO-), (N-COR-NH-CR-O-R), (-CONH-R-NH-CO), wobei R gleich
CH3, CH2, NH2, C2H5 oder
C3H7 ist, sowie
durch die Erhöhung
der Anzahl der Quervernetzungen der N-N-Bindungen zu erhöhen.
-
Dadurch
können
eine hohe Beständigkeit
des vorgeschlagenen Hydrogels in Bezug auf die Resorption und das
Schrumpfen im Organismus des Patienten sowie Bedingungen für das Überleben
der ins Gel implantierten Zellen gewährleistet werden.
-
Kurzfassung
der Zeichnungen
-
Die
Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es
zeigen:
-
1a ein
infrarotes (IR) Absorptionsspektrum des vorgeschlagenen Gels,
-
1b ein
infrarotes (IR) Absorptionsspektrum eines Prototyps des Gels, der
in Russland nach dem Patent
RU
2127129 unter der Handelsmarke „Formacryl" hergestellt wird, wobei beide IR-Spektren
im Bereich von 4000-500 cm
–1 liegen, auf der X-Achse
die Länge
der Lichtwelle (cm
–1) und auf der Y-Achse
der Grad der Lichtabsorption T (in %) angegeben ist,
-
2a ein
Photo des vorgeschlagenen Hydrogels, das mit einem elektronischen
Rastermikroskop aufgenommen wurde, und
-
2b ein
Bild des Hydrogels „Formacryl", das ebenfalls mit
einem elektronischen Rastermikroskop aufgenommen wurde.
-
Zur
Gewinnung des vorgeschlagenen, bioverträglichen Gels wird folgendes
genommen:
- – Acrylamid
(acrylamide): C3H5NO3, Mol-Masse 71.08, weißes Kristallpulver ohne Geruch,
Schmelztemperatur 84,5°C,
Produktion der Firma Sigma (Katalog „Reagenzien für die Biochemie
und Untersuchungen im Bereich der Naturwissenschaften", SIGMA, 1999, S.
47, Katalognummer Nr. A8887),
- – Methacrylamid
(methacrylamide): C3H7NO,
Mol-Masse 73.08, weißes
Pulver, Schmelztemperatur 111°C, Produktion
der Firma Fluka (Fluka Katalogue "Chemica-Biochemica", Fluka AG, Switzerland, 1986/87, P-1151),
- – 2-Hydroxyethyl-Methacrylat
(2hydroxyethylmethacrylate): C6H10O3, Mol-Masse 130.1,
Flüssigkeit,
Siedetemperatur 205-208°C,
Dichte 1,07 g/ml, Produktion der Firma Sigma (Katalog "Reagenzien für die Biochemie
und Untersuchungen im Bereich der Naturwissenschaften", SIGMA, 1999, S.
567, Katalognummer Nr. H8633),
- – N,N'-Methylen-bis-Acrylamid
(N,N'-methylene-bis-acrylamide):
C7H10N2O2, Mol-Masse
154,16, weißes Kristallpulver
ohne Geruch, Schmelztemperatur 185°C, Produktion der Firma Sigma
(Katalog „Reagenzien für die Biochemie
und Untersuchungen im Bereich der Naturwissenschaften", SIGMA, 1999, S.
696, Katalognummer Nr. 7256),
- – Peroxodisulfat-Ammonium:
(NH4)2-S2O8, Mol-Masse 228.19,
farblose, flache Kristalle, Zerstörungstemperatur 120°C, Produktion
der Firma Sigma (Katalog „Reagenzien
für die
Biochemie und Untersuchungen im Bereich der Naturwissenschaften", SIGMA, 1999, S.
117),
- – Wasserstoffperoxid
: H2O2, Mol-Masse
34,0, farblose Flüssigkeit,
Dichte bei 0°C:
1,465, Schmelztemperatur 0,89°C,
Produktion der Firma Sigma (Katalog "Reagenzien für die Biochemie und Untersuchungen
im Bereich der Naturwissenschaf ten", SIGMA, 1999, S. 556, Katalognummer
H6520).
-
Alle
oben genannten Monomere gelten als geeignet für die biologischen Ziele, sie
brauchen keine biologische Reinigung. Als Wasser wird bidestilliertes
Apyrogenwasser (pH-Wert 5,6) genommen.
-
Das
Verfahren wird folgendermaßen
realisiert:
Für
die Vorbereitung der Reaktionsmischung wird bidestilliertes Apyrogenwasser
mit einem pH-Wert von 5,6 genommen. Eine Wasserlösung wird zubereitet, die Acrylamid
enthält,
wobei Methacrylamid, 2-Hydroxyethyl-Methacrylat und N,N'-Methylen-bis-Acrylamid im
Verhältnis
65,0-80,0:18,0-30,0:0,1-4,0:0,2-6,0 zueinander stehen. Die Gesamtmasse
der Ausgangsmonomere in der Lösung
beträgt
dabei 3,0 bis 10,0% (durch das Variieren der Ausgangsmonomere in
der Lösung
wird ein Hydrogel unterschiedlicher Dichte und Elastizität gewonnen).
In die gewonnene Lösung
werden die Polymerisationsinitiatoren Wasserstoffperoxid in der
Menge von 0,1-0,3 Mass.% oder Peroxodisulfat-Ammonium in der Menge
von 0,0006-0,03 Mass,% oder ein Gemisch daraus im beliebigen Verhältnis und
in einer Menge eingeführt,
die die Summe ihrer maximalen Werte nicht überschreitet. Durch das Variieren
der Menge von Wasserstoffperoxid und Peroxodisulfat-Ammonium wird
Material gewonnen, das den gewünschten
pH-Wert im Bereich von 3,5-4,5 hat. Die fertige Reaktionsmischung wird
durch bakterizide Polymerfilter gefiltert, beispielsweise vom Typ
F8273 mit einer Porengröße von 0,45 mm,
CA/CN, Produktion Sigma (USA). Die Mischung wird für die Kopolymerisation
der Monomere zur Inkubation bei einer Temperatur von 20-30°C innerhalb
von 12-24 Stunden gebracht. Nach dieser Inkubation wird das Hydrogel,
das schon als Gel aussieht, mit heißem Wasser abgespült. Dazu
wird das Gel in einen Behälter
mit Wasser, das eine Temperatur von 70-110°C aufweist, bei einem Druck
von 0-1,2 Atmosphären
und einem Verhältnis
des Gel-Anteils zu Wasser von 1:8-10 für 4-6 Stunden gebracht. Dann
wird die zweite Stufe der Kopolymerisation ausgeführt, wobei
das Halbprodukt mit einer γ-Bestrahlung
in einer Dosis von 0,4-1,0 Megarad bearbeitet wird. Danach wird
das Produkt im erforderlichen Umfang in Flakons oder in Spritzen
abgefüllt.
Danach wird die dritte Stufe der Kopolymerisation durchgeführt, wobei
das Gel einer Temperatur von 120°C
und einem Druck von 1,2 Atmosphären
innerhalb von 20-40 Minuten ausgesetzt wird.
-
Es
wurden physisch-chemische, hygienisch-chemische und toxikologische
Untersuchungen von Mustern des vorgeschlagenen Hydrogels in Übereinstimmung
mit dem Standard ISO 10993 "Auswertung
der biologischen Wirkung von medizinischen Erzeugnissen", "Methodische Hinweise
zu der hygienischen Auswertung der Gummi- und Latexerzeugnisse für medizinische
Zwecke" (Gesundheitsministerium
UdSSR, M., 1988) und in Übereinstimmung
mit den methodischen Empfehlungen "Zulässige
Mengen der Migration von chemischen Stoffen, die sich aus Polymer-
und anderen Werkstoffen aussondern und die mit Lebensmittelhydrogelen
kontaktieren, sowie die Verfahren für ihre Bestimmung", SanPiN
42-122-42-40-86,
durchgeführt.
-
Die
Bestimmung des Gehalts an den Monomeren Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-Acrylamid in den Mustern
des gewonnenen Hydrogels wurde in Übereinstimmung mit der Methodik
durchgeführt,
die in der Arbeit von V.V. Kuznetsov et al., „Determination of Acrylamide
in Polyacrylamidic gels",
The 52-nd is Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied
Spectroscopy, New Orleans, LA, 2001, Abstract Book, Nr. 1648, beschrieben
ist.
-
Bei
dieser Untersuchung wurde festgestellt, dass das vorgeschlagene
Hydrogel folgende physisch-chemische Eigenschaften besitzt:
- – Aussehen:
Gel
- – Farbe:
von farblosem bis zum halbdurchsichtigen Dunkelbraun, opalisierend,
- – Brechungsverhältnis: 1,328-1,360,
- – Dichte:
1,0-1,2 g/cm3,
- – pH-Wert:
3,5-4,5,
- – Gehalt
an Monomeren: bis 0,4 ppm,
- – Bromierungsniveau:
nicht mehr als 1,0 (mg Brom je 1 l).
-
Hygienische
Versuche haben gezeigt, dass die Migration der Metalle Cu, Fe, Ni,
Zn, Al, Ti, Ag in einem wässrigen
Extrakt aus Hydrogel, die mit dem Atomabsorptionsverfahren bestimmt
wird, in den Grenzen der Empfindlichkeit des Verfahrens nicht gefunden
wurde (jeweils 0.02, 0.05, 0.05, 0.02, 0.005 und 0.04 mg/l). Diese
Werte sind wesentlich niedriger als die zugelassenen Werte, die
für das
Trinkwasser vorgeschrieben sind. Die Migration von Natrium betrug
nicht mehr als 0,12 mg/l bei einem zulässigen Niveau im Trinkwasser
von 200 mg/l.
-
Die
technologischen Versuche haben gezeigt, dass die wässrigen
Extrakte aus Hydrogel keinen hämolytischen
Effekt in den Versuchen "in
vitro" mit den mittels
Erythrozyten isolierten Kaninchen aufgewiesen haben. Es wurde eine
Hämolyse
von 0,04% bei einem zulässigen
Wert von 2% festgestellt.
-
Bei
einem scharfen Versuch mit weißen
Mäusen
bei der parenteralen Einführung
der Hydrogel-Muster in einer Dosis von 50,0 ml auf 1 kg Körpermasse
wurde der Tod der Tiere sowie die klinischen Merkmale der Intoxikation
nicht festgestellt: der allgemeine Zustand der Versuchsmäuse, ihr
Verhalten, die Futtereinnahme und der Zustand des Fells unterschieden
sich von den Kontrollzuständen
nicht. Bei der Obduktion der Versuchsmäuse wurde festgestellt, dass
das Gewebe an der Stelle der Einführung des Hydrogels die regionalen Lymphknoten
und Innenorgane (Leber, Nieren, Milz) in den Grenzen der physiologischen
Norm und Kontrolle waren. Es wurden keine statistisch zuverlässigen Unterschiede
bei der Dynamik der Körpermasse,
der klinisch-biochemichen
Blutwerte, der Kennziffer der Innenorgane bei den Versuchstieren
im Vergleich zu den Kontrollwerten bei der Unterhautimplantierung
des Gels für
2,5 Monate festgestellt.
-
Es
wurde kein Sensibilisierungseffekt des Hydrogels bei der Durchführung der
immunologischen Diagnosereaktion bei der Degranulierung der Mastzellen
ermittelt. Bei einem Mikrokernversuch auf dem Präparat des Knochenmarks wurde
kein mutagener Effekt der Hydrogel-Wirkung festgestellt. Die feingewebliche
Untersuchung des Bereichs der Hydrogel-Implantierung und der Innenorgane
(Leber, Nieren, Milz, Samenblase) zeigte das Vorhandensein einer
schwach ausgeprägten
Gewebereaktion auf Hydrogel nur in den ersten Tagen nach der Implantierung
sowie das Fehlen von dystrophischen und nekrotischen Veränderungen
in den Organen.
-
Im
Folgenden sind konkrete Beispiele zur Gewinnung des vorgeschlagenen,
bioverträglichen
Hydrogels und seiner Anwendung für
die Kultivierung von heterogenen Zellen im Organismus des Empfängers angegeben.
-
Beispiel 1
-
Zur
Gewinnung von Hydrogel wurden 384 ml bidestilliertes Apyrogenwasser
mit einem pH-Wert von 5,6 genommen. Im Wasser wurden dann 11,2 g
Acrylamid, 3,6 g MethAcrylamid, 0,48 g 2-Hydroxyethyl-Methacrylat
und 0,72 g N,N'-Methylen-bis-Acrylamid genommen,
die für
biologische Zwecke geeignet sind. Danach wurden in die Ausgangslösung 0,04
g Peroxodisulfat-Ammonium und 2 ml 30%-iges Wasserstoffperoxid hinzugefügt. Die
gewonnene Mischung wurde durch ein bakterizides Polymerfilter gefiltert,
Typ F8273 mit einer Porengröße von 0,45
mm, CA/CN, Hersteller Fa. Sigma (USA). Die Mischung wurde in einen
Behälter
gefüllt, der
zur Inkubation im Wasserbad bei einer Temperatur von 30°C innerhalb
von 22 Stunden gebracht wurde.
-
Danach
wurde das Hydrogel in Form des Gels mit heißem Wasser im Verhältnis Wasser
zu Gel von 10:1 bei einer Temperatur von 90°C innerhalb von 4 Stunden abgespült. Dann
wurde die zweite Stufe der Kopolymerisation durchgeführt, wobei
das Halbprodukt mit einer γ-Bestrahlung
in einer Dosis von 0,8 Megarad bearbeitet wurde. Danach wurde das
Produkt in Spritzen von 0,5-3,0 ml abgefüllt. Dann wurde die dritte
Stufe der Kopolymerisation durchgeführt, wobei das Gel einer Temperatur
von 120°C
und einem Druck von 1,2 Atmosphären
30 Minuten lang ausgesetzt wurde.
-
Das
gewonnene Gel enthält
96 Mass.% der Wassephase und 4 Mass.% Kopolymer, wobei auf 70,0 Mass.%
Acrylamid 22,5 Mass.% Methacrylamid, 0,3 Mass.% 2-Hydroxyethyl-Methacrylat,
0,4 Mass.% N,N'-Methylen-bis-Acrylamid
entfallen. Das Gel weist einen pH-Wert von 4,3 auf.
-
Das
gewonnene Muster des Hydrogels hat folgende physisch-chemische Eigenschaften:
- – Aussehen:
farbloses, halbdurchsichtiges, opalisierendes Gel,
- – Brechungsverhältnis: 1,348,
- – PH-Wert:
4,3,
- – Dichte:
1,0 g/cm3,
- – Gehaltan
Monomeren: 0,1 ppm,
- – Bromierungsniveau:
0,1 (mg Brom auf 1 l).
-
Es
wurde das IR-Spektrum erhalten, und es wurden elektronenmikroskopische
Untersuchungen des ausgetrockneten Musters dieses Hydrogels durchgeführt, die
jeweils in den
1a und
2a dargestellt sind.
Zum Vergleich sind in den
1b und
2b das
infrarote Spektrum und das Chromatogramm des Extrakts des berühmten Hydrogel-Prototyps,
der in Russland nach dem Patent
RU
2127129 unter der Handelsmarke „Formacryl" hergestellt wird, dargestellt. Dieses
Gel enthält
96 Mass.% der Wasserphase und 4 Mass.% Kopolymer, wobei auf 96 Mass.%
der Wasserphase 4,0 Mass% N,N'-Methylen-bis-Acrylamid
mit einem pH-Wert von 5,4 und einem Bromierungsniveau von 0,27 (mg
Brom auf 1 l) entfielen. Das Gel wurde bei der Inkubation der Ausgangsmischung
in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und Peroxodisulfat-Ammonium
in der summarischen Menge von 0,3 Mass% bei einer Temperatur von
60°C innerhalb
von 12 Stunden und dann bei einer Temperatur von 100°C noch innerhalb
von 2 Stunden erhalten.
-
Wie
aus dem Spektrum in 1a zu ersehen ist, fehlt die
Spitze im Bereich des Streifens bei 1620 cm–1.
Dies zeugt davon, dass in der Struktur des Polymers die frei en NH2-Radikale fehlen, die die Koordinierungsverbindungen
mit dem Strukturnetz des Hydrogels bilden konnten.
-
Wie
aus dem Spektrum in 1b zu ersehen ist, gibt es einen
Streifen bei 1620 cm–1. Dies weist auf das
Vorhandensein von NH2-Radikalen in einer
Menge von etwas mehr als 1 % hin.
-
Zur
Durchführung
der elektronenmikroskopischen Untersuchungen des angemeldeten Hydrogels
und des Hydrogels „Farmokril" wurden die Muster
des Gels, die nach dem beschriebenen Beispiel gewonnen wurden, bis
zu einem konstanten Gewicht ausgetrocknet. Dabei haben die Muster
die Form eines Films erhalten. Die Struktur der Hydrogele wurde
durch das Verfahren der elektronischen Rastermikroskopie (REM) unter
Verwendung eines Elektronenmikroskops S 405A untersucht. Dazu wurde
die Präparation
durch das Verfahren der Absplitterung der in flüssigem Stickstoff eingefrorenen,
ausgetrockneten Muster der Hydrogele durchgeführt. Bevor das Verfahren der
elektronischen Rastermikroskopie zum Einsatz kam, wurde Gold auf
die Oberfläche
der Muster aufgestäubt.
-
Die
elektronenmikroskopischen Bilder des vorgeschlagenen Hydrogels und
des Hydrogels „Formakril" sind jeweils in
den 2a und 2b dargestellt.
Wie sich aus dem Vergleich der in 2 dargestellten
Bilder erkennen lässt,
hat das vorgeschlagene Hydrogel eine Feinzellenstruktur im Vergleich
zum Hydrogel „Formakril".
-
Beispiel 2
-
Das
vorgeschlagene Hydrogel wird zur Kultivierung von xenogenen Geschwulstzellen
verwendet.
-
Das
nach dem beschriebenen Beispiel 1 gewonnene Hydrogel wurde subkutan
in einer Menge von 1 ml Mäusen
der Linie C57-Black implantiert. Nach dem Verlauf von 1,5 Monaten
wurden in das implantierte Gel, um das sich eine Bindegewebskapsel gebildet
hatte, menschliche Melanomzellen der Linie SKMEL-1, und zwar je
1 Mio. Zellen auf jede Kapsel mit Hydrogel eingebracht. Nach 3,
6 und 9 Monaten wurden die Kapseln aus den Tieren herausgenommen
und- die Existenzfähigkeit
und die physiologische Aktivität
der in diesen Kapseln befindlichen Melanomzellen des Menschen geprüft.
-
Es
wurde festgestellt, dass die Melanomzelle des Menschen der Linie
SKMEL-1 ihre Existenzfähigkeit sogar
9 Monate nach der Kultivierung in der Kapsel des vorgeschlagenen
Hydrogels aufrecht erhalten, hatte. Bei der Überführung der aus der Kapsel ausgesonderten
Melanomzellen in die Kultur wurde mit dem konventionellen Verfahren
der Polymerase-Kettenreaktion die volle Identität des konservierten Mioglobins
des Menschen in den Melanomzellen, die im Nährboden kultiviert sind, sowie
die Identität
der Zellen festgestellt, die innerhalb von 9 Monaten in der Kapsel
des Hydrogels kultiviert wurden, die in den Organismus einer Maus
implantiert waren.
-
Dieses
Beispiel zeugt von der Möglichkeit,
mit dem vorgeschlagenen Hydrogel die in den Organismus des Empfängers implantierten
Zellen auf Dauer zu kultivieren, wobei die Zellen ihre Existenzfähigkeit
aufrecht erhalten.
-
Beispiel 3
-
Das
vorgeschlagene Hydrogel wird zur Kultivierung von Leiding-Schweinezellen
im Organismus des Menschen zur Behandlung der Unfruchtbarkeit verwendet.
-
Das
Hydrogel, das nach dem beschriebenen Beispiel 1 gewonnen wurde,
wurde kranken Menschen männlichen
Geschlechts implantiert: Nach der Bildung der Bindegewebskapsel
um das Gel wurden in das Gel die Zellen eingebracht, die von geschlechtsreifen
Ferkeln genommen wurden.
-
Das
Testosteronniveau im Blut des Patienten wurde mit Hilfe eines diagnostischen
Satzes der Fa. ChemaMedika (Russland) nach der Anweisung des Herstellers.
ermit telt. Das Testosteronniveau beim Patienten nach der Implantierung
der Leiding-Schweinezellen
ist in der folgenden Tabelle angegeben.
-
Wie
man aus dieser Tabelle zu ersehen ist, sichert das vorgeschlagene
Hydrogel die Möglichkeit
zur Kultivierung von Leiging-Schweinezellen im Organismus des Menschen
unter Erhaltung der Fähigkeit
dieser Zellen, das Testosteron im Laufe von 22 Monaten zu synthetisieren,
während
bei der Implantation der Zellen in den Gel-Prototyp (Formakril) die Fähigkeit
zur aktiven Synthese des Hormons schon in 10 Monaten zu sinken beginnt
-
Beispiel 4
-
Das
vorgeschlagene Hydrogel wird zur Kultivierung von heterogenen Zellen
der Bauchspeicheldrüse im
Organismus des Menschen für
die Behandlung von insulinabhängiger
Diabetes verwendet.
- 1. Bei der Kranken F.,
37 Jahre alt, wurde eine insulinabhängige Diabetes vor 11 Jahren,
ein Jahr nach der Entbindung, diagnostiziert. Die Schwangerschaft
der Kranken verlief schwer mit einer Toxikose in der zweiten Hälfte der
Schwangerschaftszeit, mit einer Nephropathologie und mit einer wesentlichen
Gewichtszunahme von 26 kg. Die Krankheit hatte alle diese Jahre
einen nicht stabilen Charakter, wodurch viel Mühe bei der Auswahl der adäquaten Insulintherapie
entstand. Der Verbrauch des exogenen Insulins variierte von 58 Einheiten/Tag
bis zu 30 Einheiten/Tag. In den letzten zwei Jahre sind pathologische
Veränderungen
der Nieren diagnostiziert worden, wobei diese Veränderungen
als diabetische Nephropathie definiert werden konnten. In den Urin-Analysen
war eine Steigerung der oberen Grenze der Proteinurie um das 10-12-Fache zu
verzeichnen. Die Erhöhung
des arteriellen Blutdrucks betrug bis zu 170/110 mm Hg.
-
Das
wie im beschriebenen Beispiel gewonnene Hydrogel wurde dieser Kranken
implantiert. Nach der Bildung der Bindegewebskapsel um das Gel wurde
in das Gel eine Zellkultur der Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Kaninchen
eingebracht.
-
Schon
in 7 Tagen nach der Einbringung der Zellen der Bauchspeicheldrüse stellte
die Patientin eine Verbesserung des Allgemeinzustands, eine Senkung
des Durstgefühls
und der Trockenheit der Mundschleimhaut und eine Senkung des arteriellen
Blutdrucks bis zu 140/90 mm Hg fest. In 15 Tagen erlaubte der Zustand der
Patientin, den Bedarf an exogenem Insulin von 30 Einheiten bis zu
18 Einheiten herabzusetzen (Kontrolle des Bluts und des Urins).
In 30 Tagen sank der Bedarf an exogenem Insulin bis 12 Einheiten/Tag
und bis zum Ende des 2. Monats bis zu 4 Einheiten/Tag.
-
Nach
der Einführung
der Zellen der Bauchspeicheldrüse
wurde die Kranke im Laufe von 12 Monaten beobachtet. Klinische Erscheinungen
der Nephropathie ließen
sich nicht erkennen, der arterielle Blutdruck befand sich in den
Grenzen der Altersnormen. Die Patientin wurde auf perorale Antidiabetika
mit der obligatorischen Bedingung der Beachtung von Diabetes-Kost
und der Kontrolle der Glykose im Blut, im Urin und des glykosylierten
Homoglobins gesetzt.
- 2. Am Kranken K., 52 Jahre
alt, wurde insulinabhängige
Diabetes seit dem 18. Lebensjahr mit einer heftigen Stresssituation
im Hintergrund diagnostiziert. Der Charakter der Erkrankung war
am Anfang sehr unstabil. Die Dosen des exogenen Insulins erreichten
70 Einheiten/Tag.
Mit der Zeit stabilisierte sich der Verlauf
der Erkrankung, die Verschlechterungen des Zustands entstanden nach
stressigen Situationen und Versäumnissen
in der Diät.
In den letzten drei Jahren war die Verschlechterung der Gefäße der unteren
Gliedmaßen,
die Senkung des Libidos und die Verschlechterung der Erektion und
der Qualität
des Geschlechtakts zu verzeichnen. Es wurde eine diabetische Angiopathie
der unteren Gliedmaßen
und des Penis diagnostiziert. Der Bedarf an exogenem Insulin betrug
im letzten Jahr 20 Einheiten/Tag bis 40 Einheiten/Tag. Das nach
dem beschriebenen Beispiel 1 gewonnene Hydrogel wurde diesem Kranken
implantiert. Nach der Bildung der Bindegewebskapsel um das Gel wurde
in das Gel die Zellkultur der Bauchspeicheldrüse von 14-tägigen Ferkeln eingebracht.
In
zwei Wochen nach der Einführung
der Zellen der Bauchspeicheldrüse
stellte der Patient eine Verbesserung des Allgemeinzustands fest.
In einem Monat sank der Bedarf an exogenem Insulin bis zu 12 Einheiten/Tag
und in zwei Monaten bis 6 Einheiten/Tag. In 4 Monaten nach der Transplantation
wurde der Kranke auf perorale Antidiabetika gesetzt. Das sexuelle
Leben des Kranken hat sich normalisiert, der Zustand der unteren
Gliedmaßen
hat sich wesentlich gebessert.
-
Die
subjektiven und objektiven Symptome der untersuchten Patienten und
die Angaben der zusätzlichen
Forschungsmethoden (Blut, Urin) erlauben, über die hohe Effektivität der Behandlung
der Zuckerkrankheit mittels Einführung
von heterogenen Zellen der Bauchspeicheldrüse in das Hydrogel der vorgeschlagenen Zusammensetzung
zu reden.
-
Der
therapeutische Effekt dauert in der Regel 10 bis 20 Monate in Abhängigkeit
von der Schwere der Erkrankung. Die Anzahl der zu transplantierenden
Zellen wird auch durch die Schwere des Verlaufs der Zuckerkrankheit
bestimmt, insbesondere durch die Menge des vom Kranken eingenommenen
Insulins.
-
Industrielle
Anwendbarkeit
-
Die
angeführten
Ausführungsbeispiele
bestätigen,
dass das vorgeschlagene bioverträgliche
Hydrogel mit dem vorgeschlagenen Verfahren gewonnen werden kann.
Das vorgeschlagene Hydrogel ruft praktisch keine Gewebereaktion,
keine Sensibilisation des Organismus sowie keine dystrophischen
und keine nekrotischen Veränderungen
hervor und kann für
die Implantierung in den Organismus von Tieren und Menschen zur
Bildung der Kapsel und zur weiteren Kultivierung der gewünschten
Zellkulturen in der Kapsel eingesetzt werden. Im Vergleich zum bekannten
Hydrogel-Prototyp (Hydrogel „Formakril") fehlen in der Struktur
des vorgeschlagenen Hydrogels die freien NH2-Radikale,
welche die koordinative Bindung im Strukturnetz des Hydrogels bilden
könnten.
Das vorgeschlagene Hydrogel besitzt im Gegensatz zum Prototyp eine
bessere Feinzellenstruktur und sichert die Möglichkeit einer längeren Kultivierung
der implantierten Zellen im Organismus des Empfängers unter Erhaltung der Existenzfähigkeit
der Zellen und der Fähigkeit,
die für
den Menschen erforderlichen Produkte, insbesodere Testosteron und
Insulin, zu produzieren.