SE447540B - Sett att framstella pa oral veg administrerbara mikrokulor av fett, innehallande en mikroorganism - Google Patents

Description

H0 447 540- Föreliggande uppfinning uppfyller behovet av ett medel för tillhandahållande, bevarande och utnyttjande på oral väg av mikro- organismer från tarmfloran. Enligt uppfinningen tillhandahållas detta medel i form av en mikrokula som innehåller mikroorganis- merna.

Mikrokulan enligt uppfinningen kännetecknas av att den in- nehåller mikroorganismer av släktet Lactobacillus och/eller Bifidobacterium och/eller andra släkten från tarmfloran, omhölj- da av ett fett som är fast vid kroppstemperaturen.

Det har i praktiken visat sig, att det är möjligt att tillhandahålla dessa mikroorganismer i form av mikrokulor av fast fett, i vilka de bevarar hela sin livskraft även efter en långtidsförvaring av dessa mikrokulor, exempelvis vid rumstempe- ratur, i kylskåp vid 5°c eller i frys vid -3o°c.

Det har visat sig att det är möjligt att administrera des- sa mikrokulor på oral väg, och att den väsentliga andelen av de- ras innehåll av mikroorganismer intakta uppnår tarmkanalen utan att ha skadats av de starkt sura betingelser med pH lägre än 2 som föreligger i magsäcken. Sålunda kan en mikroorganism som är känd för att vara ömtålig, såsom en Bifidobacterium, framledes bevaras och administreras utan problem. Föreliggande uppfinning innebär därför ett avgörande steg på den väg som leder till er- sättning av antibiotika med naturliga medel, som möjliggör att rekonstituera en sund och livskraftig tarmflora, vilken av sig själv motverkar mångfaldigande av patogena mikroorganismer, uppfinningen hänför sig alltså till ett Sätt att framställa dessa mikrokulor, vilket kännetecknas av att en dispersion bere- des av mikroorganismer av släktet Lactobacillus och/eller Bifidobacterium och/eller andra släkten från tarmfloran i smält Sett som uppvisar en smältpunkt som ligger över kroppstemperatu- ren, dispersionen finfördelas i ett rum, i vilket föreligger en temperatur under fettets smältpunkt, och de stelnade mikrokulorna tillvaratages.

Det är väsentligt att mikroorganismerna icke kommer i kon- takt med luften. Ett fett som är fast vid rumstemperatur håller dem avstängda från luften under all hantering som föregår inta- gandet. Detta fett bör likaledes förbli fast vid passagen genom magsäcken, så att de organismer som det innehåller förblir skydda- de mot den där förelívflande surheten. Det är därför som man fö- är; reträdesvis väljer ett ätbart vegetabiliskt fett, speciellt då f 10 15 20 50 35 40 3 447 540 ett hydrogenerat fett från palm, jordnöt, kokosnöt, kakao, raps eller soja, eller animaliskt, där smältpunkten ligger mellan H0 och 6000. Det är icke lämpligt att använda ett fett, vars smältpunkt ligger över 60°C, eftersom den temperatur som erford- ras för att smälta detta fett och bereda emulsionen riskerar att förstöra de mikroorganismer, hos vilka man just önskar bibehålla hela livskraften.

Företrädesvis innehåller mikrokulorna 107-10 livbara individer eller organismer av Lactobacillus och/eller De kan speciellt innehålla mikro- lo återupp- Bifidobacterium per gram fett. organismerna Bifidobacterium (BJ animalis P23 eller B.sui Su 806, eller B. infantis Bi l och Bi 5 och/eller B. longum Bl 10 och Bl ll och/eller B. breve Bbr 8, erhållna från institutet för lantbrukets mikrobiologi vid universitetet i Bologna, Italien.

De uppvisar företrädesvis en diameter mellan 0,1 och 0,5 mm.

En mindre diameter medför inga stora olägenheter annat än att förhållandet mellan ytan och volymen blir större, vilket innebär en större förlust av mikroorganismer som ofullständigt upptagits i massan. En större diameter medför icke heller någon större olägenhet, med undantag för att risk föreligger för hinder vid passage genom små hål, exempelvis hålen i nappar till diflaskor.

För att förbättra rinningsegenskaperna hos ett pulver bildat av en mängd av dessa kulor, eller för att så mycket som möjligt förhindra bildningen av agglomerat av mikrokulor, kan man omhöl- ja dem med ett skikt av ett antiagglomereringsmedel, exempelvis ett protein. Speciellt erhålles mycket goda resultat med ett ytterskikt av zein eller av ett inom galeniken använt skyddsmedel.

För genomförande av sättet för framställning av mikroku- lorna enligt uppfinningen kan mikroorganismerna odlas i lämpligt vätskemedium till bildning av en tillräcklig mängd celler, och dessa kan utvinnas genom centrifugering. De kan därefter findis- pergeras som sådana eller efter att ha torkats genom frystork- ning, i det smälta fettet, vilket uppvisar en smältpunkt mellan M0 och 60°C, i en mängd av 107-1010 individer eller organismer per gram fett.

För framställning av mikrokulorna kan dispersionen finför- delas samtidigt med flytande kväve vid toppen av ett rum, vilket är fyllt med exempelvis steriliserad luft. I en föredragen utfö- ringsform, vilken dessutom lämpar sig för framställning av alla mikrokulor av fett som innehåller ett ömtåligt aktivt medel som 15 30 35 40 447 540 H är känsligt för exempelvis luft, värme och syra, finfördelas dock dispersionen av det aktiva medlet i det smälta fettet vid toppen av ett rum som uppvisar en övre zon med måttlig temperatur och en nedre zon med låg temperatur.

Det har i praktiken visat sig att man kan erhålla en typ av mikrckulor med god sfärisk form och som uppvisar en liten spridning i storleken.

Lämpligen finfördelas dispersionen vid toppen av rummet vid ett tryck mellan 500 och 600 kPa. Vid ett tryck under 300 kPa erhålles en alltför stor spridning i kulornas storlek.

Vid ett tryck över 600 kPa erhålles alltför små kulor. turen i den övre zonen av rummet kan ligga mellan cirka -l0°C och smälttemperaturen för det använda fettet, men företrädesvis Vid en alltför låg tempera- Tempera- användes en temperatur av 15-2500. tur i den övre delen av rummet erhålles en alltför stark sprid- ning i kulornas storlek. Det gäller alltså att upprätthålla de betingelser, vid vilka kulorna bäst bildas innan de uppfångas av den kyla som föreligger i den lägre zonen. Höjden hos den öv- re zon för "bildning" av kulorna som bör inställas ovanför den lägre zonen för "stelnande" av kulorna är beroende av anlägg- ningens totala höjd, men den är lämpligen av storleksordningen minst en meter. Den kyla som bör föreligga i rummets lägre zon kan åstadkommas genom att där finfördelas flytande kväve. Kvä- vet kan exempelvis finfördelas med utgående från rummets botten.

Trycket och den tillförda mängden av kväve väljes med beroende av höjden hos det moln av kvävgas som man önskar erhålla.

Oavsett det förfaringssätt som väljes för genomförande av finfördelningen av dispersionen, kan de fina droppar som bil- das och sedan stelnar vid kontakt med luft, kväve eller annat kylmedium som är anordnat i rummet uppsamlas vid rummets botten på en transportör eller i en behållare, vars temperatur icke överstiger 5-l5°C. De kan konditioneras, konserveras och använ- das som sådana eller först omhöljas med ett skikt av material som förhindrar dem att klibba vid varandra, med andra ord ett* antiagglomereringsmedel. Detta medel kan exempelvis utgöras av ett protein, speciellt då zein, eller ett skyddsmedel som använ- des inom galeniken. Detta skikt kan exempelvis anbringas genom att en lösning av medlet finfördelas över mikrokulorna i fluidi- serad bädd. Mikrokulorna kan förvaras i kylskåp, fryuhnx eller vid rumstemperatur. 10 20 2 FS U Ji 447 540 Hikrokulorna enligt föreliggande uppfinning kan administre- ras direkt på oral väg, eller blandade med vissa livsmedel i fast eller flytande form. De kan exempelvis blandas med den mjölk som användes i diflaskor till spädbarn, varvid deras dimensioner med- ger att de passerar genom det eller de hål som är upptagna i nap- pen.

Uppfinningen äskådliggöres närmare av de följande exemplen.

Procenttal och delar är räknade efter vikt, såvida intet annat angives.

Exempel l I en behållare på 100 liter beredes 80 liter odlingsmedium TSAR med följande sammansättning i procent: Jšstextrakt 0,25 % Tryptikas 1,00 Fyton (hydrolysat av sojaprotein) ,O,50 Glukos 1,50 L~cystein.HCl 0,05 K¿HPo, 0,25 ZnS0u 0,025 FeCl¿ Spår Vatten Återstod till 100 Å Iediet inympas med l liter av en 20 timmars odling av Bifidobacterium animalis P 23, erhâllen från institutet för lant- brukets mikrobiologi vid universitetet i Bologna, Italien. Inku- beringen genomföras i 12 timmar vid 5700. Odlingsmediet centri- fageras, och 240 3 celler erhålles. De utspädes med 250 ml skum- njölk, försett med 7 % laktos, och blandninaen fryses med flytan- de kväve, varefter den frystorkas vid 4000 under en natt. En dispersion framställes av 5 ß av det erhållna pulvret i hydroge- nerat vegetabiliskt fett, vilket uppvisar en smältpunkt av 4200 och är smält vid 4500.

Dißpersionen inledas vid 45°c under ett tryck av 400 kra tillsammans med flytande kväve i en mängd av 1 del dispersion till 5 delar kväve vid toppenzw auvemákal cylinder med 1,5 meter diameter och 10 meter höjd. Vid cylinderns botten är anbragt en behållare, innehållande flytande kväve, i vilken uppsnmlaß mikro- kulorna, vilkas diameter varierar mellan 0,1 och 0,5 mm.

En tredjedel av mikrokulorna anbrinqas i fluidiserad bädd, och över bädden finfördelas en alkohollösninm av 8 % sein l en sådan mängd, att det skikt av zein som bildas kring mikrokulorna , iopoon QUALITY kf! 15 k; 'n 447 540 uteör 5 % av deras vikt.

På analogt sätt, med utgående från en blandning av ïudragit L och S (anjoniska polymerer av metakrylsyra och estrar av metakrylsyra) i 10-procentig lösning i isopropanol, omnöljes en andra tredjedel av mikrokulorna med ett skikt av blandning, som utgör 5-10 % av mikrokulornas vikt.

Efter 6 månaders förvaring i kylskåp vid 500, liksom även vid rumstemperatur, innehåller de tre typerna av mikrokulor fortfarande mer än 108 levande mikroorganismer per gram.

Exempel 2 Förfarandet genomföres på samma sätt som angivits i exem- pel l, med undantag för att vid cylinderns botten mikrokulorna uppsamlas på ett transportband, kylt till 500.

Exempel 5 Förfarandet genomföras på samma sätt som i exempel l, med undantag för att i stället för odlingsmediet TSAR användes ett odlingsmedíum med följande sammansättning i procent: 0,10 % Tryptikas 0,25 Jlstextrakt "šacto soytone" (hydrolysat 0,25 av sogaprotein) Glukos 0,50 L-cyStein.HCl 0,001 fl¿HPOu 0,10 :iqciz 0,002 ZnSOn 0,001 FêCl, 0,0002 Permeat från vassla Ä,00 Hajsstöpvätska 0,50 Destillerat vatten återstod till 100 X šïempel 4 Förfarandet genomföres på samma sätt som angivits i exem- çel l, med undantag för att mediet inympas med 1 liter av en od- ling av Lactobacillus acidophilus i stället för Bifidobacterium animalis. fL-:efiïielí .

Förfarandet genomföres på samma sätt som i exempel l, med ïundantag för att dispersionen inledes vid toppen av en vertikal sylindcr med 1,3 meter diameter och höjden 2,5 meter i stället för l0 meter. nsausauïv U? 10 15 20 25 50 Exempel 6 447 540 Till råttor administreras torrt de mikrokulor som belagts med zein och förvaras i 6 månader enligt exempel 1, i en mängd Från den följande dagen av l g per måltid och l måltid per dag. räknas antalet milliarder bifidobakterier i faeoes hos de råttor, till vilka mikrokulorna administrerats (behandlade råttor), me- dan faeces hos råttor som icke intagit mikrokulorna (ej behand- lade råttor) icke uppvisar bifidobakteríer.

Den följande tabel- len visar resultatet av jämförande analyser av faeces hos behand- lade och obehandlade råttor: Före behandling Efter 7 dagars Behandlade råttor 1 å behandling g Totalantal mikro- Därav- Totalantal Därav 5 organismer Bifidus mikroorga- Bifidus I (mil/g) (%) nismer (%) [ (mil/g) obenandlaae råttor |' 5000 o 6500 0 5500 o 7500 75 Ett test med hybridisering av DNA hos laboratorieodlingar med DNA hos de bifidobakterier som isolerats från faeces bekräf- tar har har Exempel 7 att de två mikroorganismerna är samma. sålunda överlevt förvaringen och passagen genom magen, och förökat sig i råttornas matsmältningskanal.

Bifidobakterierna För administrering till griskultingar framställes enligt föreliggande uppfinning mikrokulor som innehåller mikroorganis- men Bifidobacterium sui Su 806,,erhållen från institutet för jordbrukets mikrobiologi vid universitetet i Bologna.

Exempel 8 För administrering till spädbarn vid kliniska försök framställes enligt föreliggande uppfinning mikrokulor som inne- håller mikroorganismerna Bifidobacterium infantis Bi l och Bi 5, Bifidobacterium longum Bl 10 och Bl ll, och Bifidobacterium breve Bbr 8, erhållna från institutet för jordbrukets mikrobiologi vid universitetet i Bologna.

För genomförande av detta framställes en frystorkad bio- massa av de ovanstående mlkroorgunismcrna. 0 25 delar av den I 10 l5 447 540 2 8 frystorkade biomassan dispergeras i 5 delar hydrogenerad palmolja, smält vid en temperatur av ü5°C. Medelst ett munstycke Spraying System CO 5510/H22 finfördelas vid 550 kPa 75 liter per timme av dispersionen vid toppen av en behållare med höjden 2,7 meter till I den övre delen av behållaren upprätt- I den lägre delen av behållaren en trattformig botten. hâlles en temperatur av 26°C. upprätthålles en temperatur av -l45°C genom att vid botten och vid ett tryck av l60 kPa medelst ett avlänkningsmunstycke in- blåses ett moln av flytande kväve, vars topp når högst 1,2 meter under inledningsmunstyoket för fett. Vid trattens botten utvin- nes väl rundade mikrokulor med diameter mellan 0,l och 0,2 mm, och som innehåller 4.108 återupplivbara mikroorganismer per g.

Exempel 9-12 Mikrokulor framställes på samma sätt som beskrivits i exempel 8, med undantag för att dispersionen och kvävet inledes vid olika tryck (pD och pN ), och att temperaturerna i den övre delen (TH) och i den lägre delen (TB) hos behållaren likaledes Betingelserna vid de olika försöken och de i mikroskop varieras. observerade resultaten angives i följande tabell: Éxempelí PD i PN TH TB 1 Resultat " 2 nr (kPa) (kPa) (°C) (°C) 1 (observerade i mikroskop) 9 350 130 -9,5 -110 410110:- med diametern (ø) 0,2- ! 0,5 mm. Ringa spridning. ; 3 God sfärisk form. ! g 10 100 130 -22,3 -9L|,2 å Kulor med 0 mindre än 0,1 mm.

Alltför många små kulor, av- I sevärd mängd av små stavar. ll N00 150 21 -150 Sfäriska kulor med 0 0,5-0,5= mm. Liten spridning. 12 1000 160 i 19,6 -1113 sfär-ieke kulor, men med ø mindre än 0,1 mm. Éillägg: Stammarna B. animalis P23 och B. sui Su 806 har depone- rats vid "American Type Culture collection" i USA och föreligger i l978 år katalog från denna samling under nr ATCC 27536 och 27686. Stammarna B. infantis Bi 5, B. breve Bbr 8, B. Longum Bl 10 och-Bl ll har deponerats den 29 oktober l979 vid Collection Nationale des cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur i Frankrike och där erhållit nr I-100, resp. I-l0l, I-102 och I~l05. _-..-...__-----__..---_-..----_-___

Claims (1)

447 540 Patentkrav

1. Sätt att framställa på oral väg administrerbara mikro- kulor av fett, innehållande en mikroorganism, genom finfördelníng av én dispersion av mikroorganismen i det smälta fettet i kall luft, k ä n n e t e c k n a t därav, att man framställer en dispersion av 107 till 1010 individer av Släktet Lactobacillus och/eller Bifidobacterium per gram av ett smält fett som har en smältpunkt av 40-600, dispersionen finfördelas vid ett tryck av 300-600 kPa vid toppen av ett rum, vilket uppvisar en övre zon med måttlig temperatur och en lägre zon med låg temperatur, varvid den övre zonen har en höjd av minst 1 m och en temperatur mellan -10°C och fettets smältpunkt, och de stelnade mikrokulorna uppsamlas. 2, Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bereder en dispersion av mikroorganismen Bifidobacterium (B.) animalis ATCC 27536 eller B. Sui ATCC 27686 eller B.infantis CNCM I-100 och/eller B. breve CNCM 1-101 och/eller B. longum CNCM I-102 och CNCM I-103. 3_ Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att den låga temperaturen i den lägre zonen åstadkommes genom att där finfördelas flytande kväve. 4, Sätt enligt krav.1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man använder ett animaliskt eller vegetabiliskt fett, speciellt då ett hydrogenerat fett från palm, jordnöt, kokosnöt, kakao, raps eller soja. 5_ Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att mikrokulorna belägges med ett agglomereringsförhindrande medel, speciellt då zeín.