HU214778B

HU214778B - Eljárás baktériumtenyészetet tartalmazó mikrokapszulák előállítására

Info

Publication number: HU214778B
Application number: HU9301855A
Authority: HU
Inventors: Jack E. Allen; William W. Harlowe; Donald J. Mangold; William M. Rutherford; Herman Wade Schlameus
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International Inc.
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1998-05-28
Also published as: GR3023476T3; BG97909A; JP2573892B2; EP0565522A4; YU83491A; DE69126037D1; RU2096452C1; SK279880B6; JPH06503705A; HUT68380A; ES2100951T3; HU9301855D0; BG61399B1; DK0565522T3; CA2099617C; EP0565522B1; CA2099617A1; DE69126037T2; WO1992012234A1; BR9107280A

Abstract

A találmány szerinti eljárással főrgókőrőngős módszerrel baktériűmőttartalmazó gömb alakú mikrőkapszűlák állíthatók elő. Az eljárás sőrána mikrőkapszűlák előállításáhőz zsírsavat alkalmazn k; a szárítőtt,előnyösen fagyasztva szárítőtt baktériűmtenyészetet és a zsírsavkőmpőnenst keverékként vagy külön anyagáramők alakjában vezetik aberendezés főrgókőrőngjára. A kapőtt termék állati t karmányőkalkőtórészeként alkalmazható kiváló stabilitása miatt. ŕ

Description

KIVONAT

A találmány szerinti eljárással forgókorongos módszerrel baktériumot tartalmazó gömb alakú mikrokapszulák állíthatók elő. Az eljárás során a mikrokapszulák előállításához zsírsavat alkalmaznak; a szárított, előnyösen fagyasztva szárított baktériumtenyészetet és a zsírsav komponenst keverékként vagy külön anyagáramok alakjában vezetik a berendezés forgókorongjára. A kapott termék állati takarmányok alkotórészeként alkalmazható kiváló stabilitása miatt.

A leírás terjedelme 6 oldal (ezen belül 2 lap ábra)

HU 214 778 B

HU 214 778 Β

Ismeretes, hogy bizonyos baktériumok állati takarmányhoz keverve előnyös hatásúak lehetnek. Ezen baktériumok abban az esetben hatásosak, ha a bélcsatomában természetes mikroflórát alkotnak. Egyes cégek alkalmas baktériumokat tartalmazó probiotikumokat hoznak forgalomba. A probiotikumok stabilitásával kapcsolatban bizonyos nehézségek állnak elő. Általában ezeket a tenyészeteket meglehetősen kis mennyiségben, körülbelül egy százalékban adják a takarmányhoz. A felhasználatlan takarmányt vagy takarmányadalékot tartalmazó probiotikumot a gazdálkodók gyakran hosszú ideig tárolják, s a raktározás sokszor többé-kevésbé nedves helyen történik. Sok esetben a nedvesség csak ahhoz elegendő, hogy a baktériumok aktiválódjanak vagy növekedésnek induljanak, de a fennmaradásukhoz kevés, ezért ezek elpusztulnak. így a probiotikumot tartalmazó takarmányhoz vagy takarmányadalékhoz adott antibiotikum kedvezőtlen hatást gyakorol a baktériumokra, különösen, ha nedvesség is jelen van. A baktériumok ilyen esetekben is elpusztulnak. A probiotikumok hosszabb ideig történő tárolásakor tehát jelentős problémák adódnak stabilitásuk megőrzésével kapcsolatban. Más alkalmazási területen, ha a probiotikumot például baromfitakarmányhoz adják, a takarmányt az előzetesen hozzáadott probiotikummal együtt szemcsésítik. A granulálás során használt gőzből származó nedvesség részlegesen aktiválja a baktériumokat, de a fennmaradásukhoz elégtelen nedvesség el is pusztíthatja azokat. A granuláláshoz szükséges hő is hasonló hatású lehet. Problémát okoz a gyomor savas közege is, mely inaktiválja a baktériumokat, mielőtt azok ténylegesen elérnék a bélcsatomát. így tehát folyamatos igény van olyan probiotikumokra, melyek a baktériumokat a megfelelő időben bocsátják ki a bélcsatomába, anélkül, hogy az előbéltől a vékonybélig uralkodó nedvesség illetve előnytelen pH-értékek hatására korai kibocsátás következne be.

A találmány tárgya eljárás takarmány adalékként alkalmazható probiotikumok előállítására, melyek szabad zsírsav felhasználásával, speciális forgókorongos kapszulálási technikával mikrokapszulált baktériumokat tartalmaznak.

A találmány szerinti probiotikumok stabilitása háromtól hat hónapig biztosított, anélkül, hogy a mikroorganizmusok mennyiségében jelentős csökkenés mutatkozna.

A szárított - előnyösen fagyasztva szárított - baktériumok rotációs mikrokapszulálása során különálló burkolt baktérium partikulumok keletkeznek, ellentétben az ismert összetapadt, burkolt baktérium clusterekkel.

A találmány szerinti eljárásban forgókorongos módszerrel mikrokapszulált szárított baktériumként különösen Enterococcus faeciumot alkalmazunk.

Az 1., 2. és 3. ábrák grafikusan mutatják be a sztearinsav alkalmazásával kapszuláit törzsek stabilitását.

A találmány szerint a zsírsavakkal, elsősorban sztearinsavval kapszuláit, Enterococcus faecium diszkrét partikulumok alakjában állítható elő. A szárított, előnyösen fagyasztva szárított baktériumkultúrákat 50-90 tömegszázalékos arányban, például sztearinsav olvadékkal keveijük, majd forgókorongos módszerrel kapszulájuk.

A találmány szerinti eljárásnak két specifikus jellemzője van, mely megkülönbözteti a korábbi, kapszuláit baktériumokra vonatkozó eljárástól. Az első a kapszulázó anyag, mely zsírsav. A második maga a kapszulálási eljárás, mely nem a hagyományos, például a porlasztva szárító technika, hanem egy forgókorongos mikrokapszulálás. Ezen két tényező együttes jelenléte biztosítja a találmány szerinti eljárás termékével előállítható igen stabil probiotikumot. Ha a fentiek közül csak az egyik feltétel biztosított, a stabilitás nem megfelelő. A legelőnyösebb kapszuláié ágens egy 12-24 szénatomos zsírsav. Bár zsírsavak keveréke is alkalmazható, kedvezőbb egy adott zsírsav felhasználása; különösen előnyös egy telítetlen zsírsav, elsősorban sztearinsav alkalmazása.

Nagy általánosságban lényeges, hogy a zsírsav olvadáspontja 75 °C alatti, előnyösen 40 °C-75 °C legyen. Természetesen annak érdekében, hogy hatásos kapszulensként funkcionáljon, szobahőmérsékleten a zsírsavnak szilárd halmazállapotúnak kell lennie. A fentebb leírt kémiai jellemzőknek megfelelő valamennyi szabad zsírsav eleget tesz ezeknek a követelményeknek. Az, hogy pontosan milyen baktériumot kapszulálunk, nem elsődleges kérdés. A végső soron előállítandó probiotikumtól függ, hogy melyik baktériumot részesítjük előnyben. A találmány gyakorlatában Enterococcus faeciumot alkalmaztunk. Más mikroorganizmusok, mint például a Lactobacillus és más Bacillus-félék szintén felhasználhatók. A törzsek keveréke éppúgy alkalmazható, mint az egyes törzsek külön-külön. A termék stabilitásának növelése érdekében a találmány szerint szárított, előnyösen fagyasztva szárított baktériumokat kell használni, így azok nedvesség hozzáadásával aktiválhatok.

A következőkben részletezett eljárás szerint a mikrokapszulált partikulumok a baktériumtenyészethez képest 50-90 tömegszázalékban tartalmaznak zsírsavat. A legkedvezőbb arány 60-75 tömegszázalék zsírsav. Ha a felhasznált zsírsav mennyisége túl kevés, úgy a burok nem fejti ki védőhatását, míg ha túl sok, a burok túl vastag lesz, miáltal a kibocsátás kedvezőtlenül alakul a bélcsatomában.

A találmány szerinti kapszulálási eljárás a forgókorongos kapszulálás, amely egy vagy két anyagáram alkalmazásával valósítható meg. A forgókorongos technológia során a baktérium szuszpenziót és a zsírsav komponenseket az egyik változat szerint összekeverjük, és az elegyet állandó sebességgel adagoljuk a rozsdamentes forgó acélkorong közepére. A centrifugális erő hatására a keverék kiszóródik.

Két anyagáram alkalmazása esetén a kapszuláló ágenst és a tenyészetet külön adagoljuk, adott esetben előzetesen rövid ideig - max. 1 percen át - érintkeztetjük.

Bár a forgókorongos kapszulálás ismert eljárás, fagyasztva szárított baktérium mikrokapszulálásához történő felhasználása ez idáig nem ismert. A forgókorongos kapszulálás általános leírását illetően hivatkozunk

HU 214 778 Β

Johnson és munkatársai cikkére (Southwest Research Institute fór San Antonio, Journal of Gas Chromatography, 1965. p. 345-347).

A terméket összegyűjtjük, hidegkamrában környezeti feltételeknek megfelelő vagy annál némiképp alacsonyabb hőmérsékleten tartva méret szerint osztályozzuk, s előkészítjük a csomagolásra.

Feltétlenül meg kell jegyeznünk, hogy a rotációs mikrokapszulálás egyértelműen más, jobb minőségű terméket eredményez, mint a hagyományos porlasztva szárítás. A porlasztva szárítás során a partikulumok hajlamosak clustereződni (csomósodni), a kialakított burok vastagsága egyenlőtlen, s a termék stabilitása néhány naptól néhány hétig biztosított. Rotációs mikrokapszulálással, különösen, ha e találmány szerinti kapszulák» ágenseket használjuk, a kapott baktériumok stabilitása háromtól hat hónapig biztosított még akkor is, ha nedvesség vagy antibiotikum-hatás éri azokat. Ha a találmány szerinti szabad zsírsav kapszulenseket használjuk - melyek a fentebb leírt tulajdonságokkal rendelkeznek -, a kapszulátor tipikusan alkalmazott 4 hüvelykes (10,12 cm) forgó korongját 2000-4000 percenkénti fordulattal - előnyösen 2500-3200 között - működtetjük, miközben a betáplált nyersanyag 50-200 gramm percenként. A jelenleg ismert legelőnyösebb feltételek: sztearinsav kapszulens, Enterococcus faecium felhasználása, 4 hüvelykes korong 3000 percenkénti fordulattal működtetve, 100 gramm percenkénti baktérium/sztearinsav (35% baktérium, 65% sztearinsav) keverékként vagy külön való betáplálási arány mellett. Ilyen módon a termék partikulumainak mérete 75-300 pm-ig teljed, előnyösen 250 pm alatti.

A következő példák a találmány további illusztrálását teszik lehetővé, de a találmány alkalmazása nem korlátozódik csupán ezekre. A példákat az 1., 2., 3. ábrákra hivatkozva írjuk le.

Példák

1. példa

Az 1. példa az 1. ábrával kapcsolatos; két Enterococcus faecium törzzsel előállított termék stabilitását mutatja be 4, illetve 27 °C-on. Az 1. ábra a kapszuláit Enterococcus faecium törzsek stabilitását ábrázolja. A kapszulálást forgókorongos kapszulátorral végeztük, sztearinsav felhasználásával, 35 tömegszázalékos baktérium arány mellett. A kapszulálás körülményei a fentebb leírtakkal azonosak (35/65 tömegszázalékos baktérium/sztearinsav arány, 60 °C hőmérséklet, 3000 percenkénti fordulattal működő 4 hüvelykes rotációs korong, 100 gramm percenkénti betáplálás). A baktériumkultúrát kapszuláitok, párazáró tasakokba helyeztük, és a CFU meghatározáshoz hetenként roncsolásos mintavételt végeztünk. Látható, hogy a találmány terméke a kolóniát alkotó egységek számát (CFU, colony forming unit) illetően megőrizte kiváló tulajdonságát a 70 napos tárolás során.

2. példa

A 2. példát a 2. ábra segítségével jellemezzük. Az ábra a kapszuláit törzsek stabilitását mutatja be típusos takarmánykeverékben, három baromfi antibiotikum je-

lenlétében. A takarmány összetétele a következő:
54%	finomra őrölt kukorica
26%	szójababliszt
2%	halliszt (nedvességtartalom: 12%
1,5%	dikalcium-foszfát
1%	mészkő
5,5%	szójaolaj.

A három antibiotikumot a következő arányban adagoltuk: Deccox 6% (454 ppm), Salinomycin (50 ppm), Nátrium-monensin (120 ppm).

A baktériumkultúrát l*10⁶ CFU/gramm takarmány (100-150 gramm/tonna) arányban adtuk a keverékhez. A takarmányt leforrasztott tasakokba csomagoltuk, s szobahőmérsékleten inkubáltuk. A CFU meghatározáshoz hetenként vettünk mintát. A 2. ábra grafikonja a kiváló stabilitást illusztrálja.

3. példa

A 3. példát a 3. ábrával kapcsolatban jellemezzük. Az ábra a takarmányhoz kevert, kapszuláit Enterococcus faecium stabilitását ábrázolja különböző antibiotikumok jelenlétében. A takarmány 60% finomra őrölt kukoricából, 38% szójabab lisztből és 2% mészkőből áll, 14%-os nedvességtartalommal. A baktériumkultúrát 10⁶ CFU/gramm takarmány arányban adagoltuk. Tíz lb.-os (453,6 dkg) adagokat lezárt tasakokban tároltunk 20 °C-on, és 16 héten keresztül hetenként mintát vettünk. A takarmány a következő arányokban tartalmazta az antibiotikumokat:

Bacitracin-metilén-diszalicilát 50 g/tonna
Carbadox	50 g/tonna
Chlortetracycline	200 g/tonna
Lasalocid	30 g/tonna
Lincomycin	100 g/tonna
Neomycin	140 g/tonna
Oxytetracycline	150 g/tonna
Sulfamethazine	100 g/tonna
Tylosin	100 g/tonna
Virginiamycin	20 g/tonna
ASP250	100 g/tonna
Az 1. táblázat a	kolóniát alkotó egységek száma

(CFU) logaritmusának 1 egésszel történő csökkenéséhez minimálisan szükséges időket tartalmazza.

1. táblázat lóg CFU csökkenéshez szükséges idő (napok), 20 °C-on, 14% nedvességtartalom mellett

Antibiotikum	Tárolási idő (napok)
Kontroll	103
Bacitracin	88
Carbadox	54
Chlortetracycline	60
Lasalocid	57
Lincomycin	75
Neomycin	53

HU 214 778 Β

1. táblázat (folytatás)

Antibiotikum	Tárolási idő (napok)
Oxytetracycline	59
Sulfamethazine	62
Tylosin	52
Virginiamycin	112
ASP 250	67
Furadox	53

4. példa

A 4. példában a csirketápként történő felhasználás érdekében szemcsésített termék stabilitását határoztuk meg. A mikrokapszulálás körülményei megfelelnek a korábban leírtaknak. Ezen vizsgálat során a takarmány összetétele a következő volt:

Nyers fehérje nem kevesebb, mint 18,0%

Nyers zsír nem kevesebb, mint 5,0%

Nyers rost nem több, mint 6,0%

A granulátum - akár antibiotikummal (CTC, 50 g/tonna), akár anélkül - a következő anyagokkal, illetve a következő körülmények mellett készült.

Kukorica, szójaliszt, tejsavó, szójaolaj, dikalciumfoszfát, mészkő, ásványi anyagok, vitaminkészítmények, szelén, réz-szulfát. A baktériumkultúrát hozzávetőlegesen 5xl0⁵ CFU/gramm takarmány (100-150 g/tonna) arányban adtuk a keverékhez.

A kondicionálási hőmérséklet 70 °C volt, a szemcsék színezése 78 °C-on történt.

A granulátumot lezártan tasakokban tároltuk, s a CFU meghatározáshoz hetenként vettünk mintát.

A szemcsésítés körülményei egyik esetben sem csökkentették a granulátum stabilitását. Nevezetesen, a granulátum ugyanolyan stabilitást mutatott, mint a szemcsésítés nélküli termék.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egymáshoz nem tapadó, baktériumot tartalmazó gömb alakú mikrokapszulák előállítására, azzal jellemezve, hogy

a)

i) szárított, előnyösen fagyasztva szárított baktériumkultúrát készítünk;

ii) a szárított kultúrát 50-90 tömegszázaléknyi 12-24 szénatomos olvadt zsírsavval keveijük;

iii) a zsírsav és a szárított kultúra keverékét forgókorongos kapszulátor forgó felszínére adagoljuk és iv) az így előállított mikrokapszulákat adott esetben lehűtjük; vagy

b)

i) elkészítünk egy 12-24 szénatomos olvadt zsírsavból álló első alapanyagot, ii) elkészítünk egy szárított, előnyösen fagyasztva szárított baktériumkultúrából álló második alapanyagot, iii) a két alapanyagot külön-külön adagoljuk a forgókorongos kapszulátor forgó felszínére 50-90 t% olvadt zsírsavat tartalmazó keverék előállítására, és iv) az így előállított keveréket a berendezésben mikrokapszulákká alakítjuk, majd adott esetben lehűtjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a forgókorongot 2000—4000 percenkénti fordulatszámmal működtetjük.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a forgókorongot 2500-32000 percenkénti fordulatszámmal működtetjük.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a forgókorongos kapszulátorba a nyersanyagot 50-200 gramm/perc sebességgel tápláljuk be.
5. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy zsírsavként 12-24 szénatomos zsírsavat alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy zsírsavként sztearinsavat alkalmazunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként Enterococcus faeciumot alkalmazunk.
8. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy a külön előkészített és elkülönítve tárolt első és a második alapanyagot a forgókorongra való betáplálást közvetlenül megelőzően érintkezésbe hozzuk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1 percnél rövidebb időt alkalmazunk.

HU 214 778 B Int. Cl.⁶: C 12 N 1/04

Telepalkotó baktériumok Telepalkotó baktéri számának logaritmusa számának logarit

40 50 60

Összekeverés után eltelt napok

l.ÁBRA

-X— -X^-4*C

O--θ' 27-C __j-------1__ ve

-x— —>erc --& 2TC —1— —F4’C

-El-------El· 27*C eltelt napok 2. ÁBRA

HU 214 778 B