RU2428182C1

RU2428182C1 - Противомикробное вещество

Info

Publication number: RU2428182C1
Application number: RU2010133928/15A
Authority: RU
Inventors: Виктор Вениаминович Тец (RU); Виктор Вениаминович Тец; Георгий Викторович Тец (RU); Георгий Викторович ТЕЦ; Константин Андреевич Краснов (RU); Константин Андреевич Краснов
Original assignee: Виктор Вениаминович Тец; Георгий Викторович ТЕЦ
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2011-09-10

Abstract

Изобретение относится к синтетическим биологически активным веществам гетероциклического ряда, обладающим противомикробной активностью, и представляет собой продукты модификации известного β-лактамного антибиотика - ампициллина, включая все пространственные изомеры заявляемого вещества, все их таутомерные и солевые формы. Противомикробное вещество с общей формулой:

где R выбран из группы: Н, метил, этил, н-алкил (С3-С9), фенил; X1 и Х3 выбраны из группы: СН₂, О или N (NH или NR, где R - метил, этил, линейный или разветвленный алкил, алкенил или циклоалкил С3-С10, CH₂CH₂OEt, СН₂СН₂СН₂ОМе, Ph, производное бензола, замещенное один или несколько раз линейным или разветвленным алкилом, алкенилом или циклоалкилом С1-С9, галогеном (F, Cl или Вr), СF₃, метоксигруппой или другой алкоксигруппой, карбоксилом или карбоксиалкилом либо одновременно несколькими из перечисленных заместителей, CH₂Ph, CH₂CH₂Ph, СН(СН₃)Ph, СН₂С₆Н₄(ОМе-р), СН₂С₆Н₄(F-р), СН₂СН₂С₆Н₄(F-p), СН₂СН₂С₆Н₃(3,4-диОМе); 2-фурилметил, 2-(2-тиенил)этил; Х2 выбран из группы: С=0, C=S, СН₂, СМе₂, С(С₅Н₁₀-цикло). Изобретение обеспечивает биологически активное вещество с высокой антибактериальной активностью и широким спектром действия, эффективно действующим на бактерии, находящиеся в клетках человека и в составе биопленок. 11 табл.

Description

Изобретение относится к синтетическим биологически активным веществам гетероциклического ряда, обладающим противомикробной активностью, и представляет собой продукты модификации известного β-лактамного антибиотика - ампициллина, включая все пространственные изомеры заявляемого вещества, все их таутомерные и солевые формы; изобретение может быть использовано при лечении заболеваний, вызванных инфекциями, а также для аналогичных целей в ветеринарии.

Антибиотики пенициллинового ряда имеют огромное значение в терапии бактериальных инфекций, продолжая оставаться одной из важнейших и широко применяемых групп противомикробных препаратов. Появление в 1940 г. в медицинской практике пенициллина было выдающимся достижением, позволившим эффективно лечить многие опасные инфекции. В дальнейшем было создано много других препаратов пенициллинового ряда, что значительно расширило возможности терапии инфекционных заболеваний [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп.- М.: Новая Волна, 2006. - 1206 с.]. Тем не менее, поиск новых, более эффективных антибиотиков продолжается и в настоящее время. Необходимость создания новых антибиотиков связана с появлением микробных штаммов, устойчивых к существующим препаратам, и открытием возможности жизни микробов в составе сообществ, получивших название «биопленки». Бактериальные биопленки представляют собой основную форму существования микробов в естественных условиях, в том числе в организме животных и человека. В биопленках бактерии и грибы защищены от факторов окружающей среды дополнительными оболочками, не дающими антибиотикам достигнуть микробных клеток (Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov 2003; 2:114-122; Campanac C., Pineau L., Payard A., Baziard-Mouysset G., Roques C. Interactions between Biocide Cationic Agents and Bacterial Biofilms. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 1469-1474; Tetz V.V., Korobov V.P., Artemenko N.K., Lemkina L.M., Panjkova N.V., Tetz G.V. Extracellular phospholipids of isolated bacterial communities Biofilms 2004; 1:149-155; B.B.Тец, А.Л.Бобров, Л.Ю.Орехова, Д.В.Левкович, Д.С.Щербакова, Г.В.Тец, А.А.Доморад.).

Известные антибиотики пенициллинового ряда, в том числе его полусинтетические производные, плохо проникают в человеческие клетки и бактериальные биопленки, в результате слабо действуют на находящиеся в них бактерии, что способствует ускорению изменчивости образующих их бактерий и, как было недавно показано, повышают риск формирования хронических инфекций (Anderl, J.N., Franklin M.J., Stewart P.S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob. Agents Chemother. 2000. 44:1818-1824. Zahller J., Stewart P.S. Transmission Electron Microscopic Study of Antibiotic Action on Klebsiella pneumoniae Biofilm Antimicrob Agents Chemother. 2002; 46: 2679-2683).

Наиболее близким по химическому строению и назначению к заявленному противомикробному веществу является антибиотик ампициллин, который был выбран в качестве прототипа, см. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Медицина, часть 2.- М., 1985, стр.212-215.

Ампициллин обладает широким спектром антибактериальной активности, имеет низкую токсичность.

Фармакокинетика ампициллина позволяет использовать препарат для лечения инфекций различной локализации.

Однако ампициллин не действует на бактерии, находящиеся в клетках человека и животных, и слабо действует на бактерии, находящиеся в составе бактериальных биопленок.

Задача изобретения состоит в создании биологически активного вещества с высокой антибактериальной активностью и широким спектром действия, эффективно действующим на бактерии, находящиеся в клетках человека и в составе биопленок.

Поставленная задача решается путем синтеза противомикробных веществ общей формулы (I):

где R выбран из группы: H, метил, этил, н-алкил (C3-C9), фенил;

X1 и X3 выбраны из группы: CH₂, О или N (NH или NR, где R - метил, этил, линейный или разветвленный алкил, алкенил или циклоалкил C3-C10, CH₂CH₂OEt, CH₂CH₂CH₂OMe, Ph, производное бензола, замещенное один или несколько раз линейным или разветвленным алкилом, алкенилом или циклоалкилом C1-C9, галогеном (F, C1 или Br), CF₃, метоксигруппой или другой алкоксигруппой, карбоксилом или карбоксиалкилом либо одновременно несколькими из перечисленных заместителей, CH₂Ph, CH₂CH₂Ph, CH(CH₃)Ph, CH₂C₆H₄(OMe-p), CH₂C₆H₄(F-p), CH₂CH₂C₆H₄(F-p), CH₂CH₂C₆H₃(3,4-диOMe); 2-фурилметил, 2-(2-тиенил)этил;

X2 выбран из группы: C=O, C=S, CH₂, CMe₂, C(C₅H₁₀-цикло).

Изобретение распространяется на все пространственные изомеры заявляемых веществ, все их таутомерные и солевые формы.

Заявляемые вещества общей формулы (I) могут применяться в виде нейтральных форм или в виде солей с катионами натрия, калия, лития, аммония, магния, кальция или другими фармакологически приемлемыми катионами.

Таблица 1
Структура наиболее активных заявляемых производных ампициллина общей формулы I
Субстанция №	R	X1	X2	X3
1а	H	NH	C=O	NH
1б	H	NH	C=O	NMe
1в	H	NMe	C=O	NMe
1г	H	N-н-Нех	C=O	NH
1д	H	NCH₂Ph	C=O	NH
1е	H	NCH₂C₆H₄OMe-p	C=O	NH
1ж	H	NMe	C=S	NMe
1з	H	NCH₂CH=CH₂	C=S	NH
1и	H	N-Циклопропил	C=S	NH
1к	H	NC₆H₅	C=S	NH
1л	H	N-o-Толил	C=S	N-o-Толил
1м	H	О	CMe₂	O
1н	H	CH₂	CH₂	CH₂
1о	H	N-CH₂CH₂OEt	C=S	NH
1п	H	N-Циклогексил	C=S	NH
1р	H	NC₆H₄OMe-p	C=S	NH
1с	Me	NMe	C=O	NMe

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «Новизна».

Биологическая активность обнаруживается в той или иной степени у всех представителей данной группы при R, X1, X2, X3, перечисленных в общей формуле (I). Способ синтеза заявляемого вещества является также общим для всех членов группы. Таким образом, принципиальное значение имеет не конкретная структура радикалов и заместителей R, X1, X2, X3, которая влияет лишь на количественный уровень биологической активности, а принадлежность этих радикалов к химическим группам, перечисленным в общей формуле (I).

Заявителем не выявлены источники, в которых содержались бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. Указанное новое свойство объекта обусловливает, по мнению заявителя, соответствие изобретения критерию «Изобретательский уровень».

Заявляемые вещества синтезируют в соответствии со Схемой 1. Расшифровка радикалов в структуре промежуточных реагентов 2, 3 и 4 приведена под Схемой 1, а в целевых веществах 1 - в Таблице 1.

Схема 1

R1=H (1a-p, 3a-p), R1=Me (1c, 3c)

X1=X3=H, X2=CO (1а, 2а, 3а); X1=NMe, X2=CO, X3=NH (1б, 2б, 3б); X1=X3=NMe, X2=CO (1в,с, 2в,с, 3в,с); X1=N-н-Hex, X2=CO, X3=NH (1г, 2г, 3г); X1=NCH₂Ph, X2=CO, X3=NH (1д, 2д, 3д); X1=NCH₂C₆H₄OMe-p, X2=CO, X3=NH (1e, 2e, 3e); X1=X3=NMe, X2=CS (1ж, 2ж, 3ж); X1=NCH₂CH=CH₂, X2=CS, X3=NH (1з, 2з, 3з); X1=N-Циклопропил, X2=CS, X3=NH (1и, 2и, 3и); X1=NC₆H₅, X2=CS, X3=NH (1к, 2к, 3к); X1-X3=N-о-Толил, X2=CS (1л, 2л, 3л); X1=X3=O, X2=СМе₂ (1 м, 2 м, 3м); X1=X2=X3=CH₂ (1н, 2н, 3н); X1=N-CH₂CH₂OEt, Х2=CS, X3=NH (1o, 2o, 3o); X1=N-Циклогексил, X2=CS, X3=NH (1п, 2п, 3п); X1=NC₆H₄OMe-p, X2=CS, X3=NH (1p, 2p, 3p).

Синтез заявляемого вещества для всех членов группы состоит из двух основных этапов.

1) Получают β-трикарбонильный реагент (3) из соответствующего циклического β-дикарбонильного реагента (2) (производного барбитуровой, 2-тиобарбитуровой кислот, кислоты Мельдрума или циклогексан-1,3-диона) путем ацилирования (формилирования) соответствующим ацилирующим (формилирующим) агентом. Полученный реагент 3 очищают либо используют в сыром виде (без очистки).

2) Получают целевое соединение (1a-c) из синтезированного на первом этапе реагента 3 и ампициллина (4).

Синтез может проводиться в одну или две стадии. Процесс синтеза целевых соединений 1а-с считается одностадийным, если промежуточный реагент 3 используется без очистки, а если реагент 3 выделяется в чистом виде, то процесс считается двухстадийным.

Сущность изобретения поясняется приведенными ниже примерами синтеза промежуточных веществ, примерами синтеза заявленного вещества, таблицами выходов и характеристик целевых веществ и таблицами результатов экспериментов по определению биологических свойств заявляемых веществ, где:

примеры 1 - конкретный вариант выполнения 1-го этапа синтеза заявляемого вещества (получение промежуточного реагента 3);

примеры 3 и 4 - конкретные варианты выполнения 2-го этапа синтеза заявляемого вещества (получение целевых веществ 1a-c);

эксперимент 1 - определение антибактериальной активности;

эксперимент 2 - определение активности заявляемых веществ против резистентных бактериальных штаммов;

эксперимент 3 - определение острой токсичности;

таблица 1 - структура наиболее активных представителей заявляемых веществ 1a-c;

таблица 2 - исходные реагенты и выход целевых веществ 1a-c;

таблица 3 - данные спектров ¹Н ЯМР целевых веществ 1a-c;

таблица 4 - данные элементного анализа целевых веществ 1a-c;

таблица 5 - результаты определения антибактериальной активности заявляемых веществ in vitro в сравнении со стандартами;

таблица 6 - результаты определения активности заявляемых веществ против резистентных бактериальных штаммов;

таблица 7 - результаты определения острой токсичности заявляемых веществ.

Пример 1. Вариант выполнения 1-го этапа синтеза заявляемого вещества (получение промежуточного β-трикарбонильного реагента 5-формилбарбитуровой кислоты (3а)).

Схема 2

В плоскодонную колбу вместимостью 100 мл, снабженную обратным воздушным холодильником, загружают 6.4 г (0.05 моль) барбитуровой кислоты 2а, 20 мл диметилформамида и 7.4 г (0.05 моль) триэтилового эфира ортомуравьиной кислоты 5. Колбу нагревают до 120°C с постепенной отгонкой выделяющегося конденсата и выдерживают при этой температуре 15 мин. Затем охлаждают реакционную смесь до комнатной температуры, добавляют 50 мл эфира и перемешивают. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 6.1 г продукта 3а в виде светло-желтых кристаллов с Т_пл>250°C (разл).

Пример 2. Вариант выполнения 1-го этапа синтеза заявляемого вещества (получение промежуточного β-трикарбонильного реагента - 1,3-диметил-5-формилбарбитуровой кислоты (3в)).

Схема 3

В плоскодонную колбу вместимостью 100 мл, снабженную обратным воздушным холодильником, загружают 6.24 г (0.04 моль) 1,3-диметилбарбитуровой кислоты 2в и 7.4 г (0.05 моль) триэтилового эфира ортомуравьиной кислоты 5. Колбу помещают на масляную баню при 70°C и в течение 10 мин доводят температуру бани до 120°C с постепенной отгонкой выделяющегося конденсата. Затем охлаждают реакционную смесь до 60°C и промывают горячим гексаном. Гексановый экстракт сливают с осадка, а осадок растворяют без нагревания в 40 мл водного раствора 1.6 г (0.04 моль) NaOH. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат охлаждают до 10°C и подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH 1. Выделившийся осадок промывают холодной водой и сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Получают 6.6 г продукта 3в в виде светло-желтых кристаллов с Т_пл 111°C.

По аналогичной методике получают другие β-трикарбонильные реагенты 3б, г-с из соответствующих циклических β-дикарбонильных соединений 2.

Пример 3. Вариант выполнения 2-го этапа синтеза заявляемого вещества (получение целевого вещества - 3,3-диметил-7-оксо-6-[(2-{[(2,4,6-триоксотетрагидропиримидин-5(2H)-илиден)фенил]амино}пропаноил)амино]-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты (1a)).

Схема 4

В колбе вместимостью 150 мл растворяют при нагревании 0.01 моль (3.49 г) ампициллина 4 (или эквивалентное количество натриевой соли ампициллина) в 50 мл воды. К этому раствору приливают горячий раствор 0.01 моль (1.84 г) 5-формилбарбитуровой кислоты 3a и 0.02 моль (1.64 г) ацетата натрия в 30 мл воды. Полученную реакционную смесь нагревают 30 мин при 70°C, затем охлаждают до комнатной температуры и подкисляют соляной кислотой до pH 1-2. Выделившийся осадок фильтруют, промывают водой, затем водным спиртом и сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Получают 4.12 г продукта 1а в виде кристаллического порошка светло-желтого цвета. Выход 80%.

Пример 4. Вариант выполнения 2-го этапа синтеза заявляемого вещества - получение целевого вещества - 3,3-диметил-7-оксо-6-[(2-{[(1,3-диметил-4,6-диоксо-2-тиоксотетрагидропиримидин-5(2H)-илиден)фенил]амино}пропаноил)амино]-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты (1з).

Схема 5

В колбу вместимостью 100 мл, снабженную обратным воздушным холодильником, загружают 6.24 г (0.04 моль) 1,3-диметил-2-тиобарбитуровой кислоты 2ж и 7.4 г (0.05 моль) триэтилового эфира ортомуравьиной кислоты. Колбу помещают на масляную баню при 70°C и в течение 10 мин доводят температуру бани до 110°C с постепенной отгонкой выделяющегося конденсата. Затем охлаждают реакционную смесь до комнатной температуры, добавляют к ней 60 мл водного раствора 0.1 моль ацетата натрия и перемешивают при 30°C 10 мин. Нерастворенный остаток отфильтровывают, фильтрат переносят в колбу вместимостью 200 мл и добавляют 0.04 моль ампициллина 4. Реакционную смесь нагревают 30 мин при 70°C, затем фильтруют, фильтрат охлаждают до комнатной температуры и подкисляют соляной кислотой до pH 1-2. Выделившийся осадок фильтруют, промывают водой, затем водным спиртом и сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Получают 13.43 г продукта 1ж в виде кристаллического порошка кремового цвета.

Пример 5. Вариант выполнения 2-го этапа синтеза заявляемого вещества 1 (Общий метод синтеза, см. Схему 1).

В колбе вместимостью 150 мл растворяют при нагревании 0.01 моль ампициллина 4 (или эквивалентное количество натриевой соли ампициллина) в 50 мл воды. К этому раствору приливают горячий раствор 0.01 моль β-трикарбонильного реагента 0.02 моль (1.64 г) ацетата натрия в 30 мл воды. Полученную реакционную смесь нагревают 30 мин при 70°C, затем охлаждают до комнатной температуры и подкисляют соляной кислотой до pH 1-2. Выделившийся осадок фильтруют, промывают водой, затем водным спиртом и сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Выход целевого продукта 1а-с приведен в таблице 2, спектральные характеристики и данные элементного анализа - в таблицах 3 и 4.

Таблица 2
Исходные реагенты для синтеза и выход целевых веществ
Номер целевого вещества	Исходный β-трикарбонильный реагент	Метод синтеза (№ Примера)	Выход целевого вещества, %
1а	3а	3	78
1а	3а	5	78
1б	3б	5	76
1в	3в	4	71
1в	3в	5	82
1г	3г	5	79
1д	3д	5	85
1е	3е	5	88
1ж	3ж	5	83
1з	3з	5	80
1и	3и	5	80
1к	3к	5	80
1л	3л	5	69
1м	3м	5	64
1н	3н	5	67
1о	3о	5	85
1п	3п	5	82
1р	3р	5	82
1с	3с	5	45

Таблица 3
Данные спектров ¹H целевых веществ в ДМСО-d₆
№ вещест- ва	Химический сдвиг, в м.д.
№ вещест- ва	CMe₂, с+с	CHCOO с∗	CH-CH, 2H, м	CHP h д∗	ArH м	=CH, д∗	NHCO с∗	NHC= д∗	Другие H
1а	1.43+1.50	4.13	5.45	5.61	7.33	8.02	9.35	10.45	10.61+10.74 (2H, с+с, NH)
1б	1.40+1.52	4.13	5.41	5.63	7.30	8.08	9.39	10.50	3.12 (3H, c, NMe), 10.72 (1H, с, NH)
1в	1.33+1.45	4.10	5.34	5.49	7.22	8.15	8.74	10.55	3.08+3.19 (6H, с+с, NMe)
1г	1.42+1.47	4.11	5.40	5.63	7.30	8.08	9.39	10.50	0.92 (3H, т, Me), 1.20-1.42 (8H, м, CH₂), 3.62 (2H, кв, NCH₂), 10.66 (1H, с, NH)
1д	1.45+1.53	4.16	5.41	5.61	7.23 10H	8.15	9.27	10.85	4.93 (2H, д, аб-система, NCH₂), 10.68 (1H, с, NH)
1е	1.45+1.53	4.16	5.41	5.60

Продолжение таблицы 3
1ж	1.36+1.44	4.11	5.35	5.47	7.25	8.10	8.53	11.26	3.52+3.58 (6Н, с+с, NMe)
1з	1.43+1.50	4.15	5.45	5.66	7.29	8.16	9.37	11.08	4.83 (2H, д, NCH₂), 5.11 (2H, м, =CH₂), 5.80 (1H, м, -CH=), 10.66 (1H, с, NH)
1и	1.34+1.46	4.15	5.37	5.60	7.26	8.19	9.43	11.04	0.75+1.12 (4H, м+м, CH₂CH₂), 2.66 (1H, м, NCH), 11.70+11.91 (1H, с+с, NH)
1к	1.44+1.50	4.13	5.42	5.67	7.35 10H	8.25	9.42	11.05	11.03 (1H, с, NH)
1л	1.45+1.47	4.11	5.40	5.55	7.50 13H	8.12	9.51	11.26	2.17+2.19 (6H, с+с, NMe)
1м	1.45+1.53 1.62+1.66	4.12	5.33	5.71	7.29	8.26	9.11	10.92

Продолжение таблицы 3
1н	1.40+1.52	4.15	5.30	5.42	7.23	7.88	8.94	10.61	1.83 (2H, м, CH₂), 2.41 (2H, м, 2CH₂)
1о	1.33+1.45	4.13	5.41	5.59	7.42	8.24	9.45	11.10	1.13 (3H, т, Me), 3.51 (4H, м, NCH₂+O CH₂), 4.44 (2H, т, OCH₂)
1п	1.41+1.50	4.14	5.42	5.62	7.40	8.19	9.36	11.08	1.20-2.45 (10H, м, 5CH₂), 4.37 (1H, NCH)
1р	1.45+1.51	4.15	5.42	5.60	6.97 4Н 7.43 5Н	8.21	9.49	11.03	3.78 (3H, с, OMe)
1с	1.36+1.41	4.10	5.34	5.49	7.32	-	8.79	10.94	2.56 (3H, с, =CMe), 3.14 (6H, с, NMe)
∗ Примечание. Для веществ 1б, г-е, з-к, о-р характерно удвоение данных сигналов из-за Z/E изомерии относительно енаминовой двойной связи

Таблица 4
Данные элементного анализа целевых веществ
№ вещества	Найдено, %			Брутто-формула	Вычислено, %
№ вещества	С	Н	N	Брутто-формула	C	H	N
1а	51.74	4.34	14.37	C21H21N5O7S	51.74	4.34	14.37
1б	52.51	4.60	13.88	C22H23N5O7S	52.69	4.62	13.96
1в	53.65	4.91	13.52	C23H25N5O7S	53.58	4.89	13.58
1г	56.99	5.87	12.13	C27H33N5O7S	56.73	5.82	12.25
1д	58.04	4.78	12.00	C28H27N5O7S	58.22	4.71	12.12
1е	57.44	4.89	11.41	C29H29N5O8S	57.32	4.81	11.53
1ж	51.75	4.86	13.01	C23H25N5O6S2	51.97	4.74	13.17
1з	52.86	4.77	12.74	C24H25N5O6S2	53.03	4.64	12.88
1и	52.91	4.73	12.80	C24H25N5O6S2	53.03	4.64	12.88
1к	55.70	4.44	11.95	C27H25N5O6S2	55.95	4.35	12.08
1л	61.35	4.99	10.12	C35H33N5O6S2	61.48	4.86	10.24
1м	54.68	5.21	8.20	C23H25N3O8S	54.86	5.00	8.35
1н	58.34	5.48	8.66	C23H25N3O6S	58.59	5.34	8.91
1о	53.90	5.57	12.03	C25H29N5O7S2	52.16	5.08	12.17
1п	55.12	5.39	11.74	C27H31N5O6S2	55.37	5.33	11.96
1р	55.09	4.55	11.42	C28H27N5O7S2	55.16	4.46	11.49
1с	54.37	5.18	13.14	C24H27N5O7S	54.43	5.14	13.22

Примеры изучения биологической активности

Пример 6.

Определение эффективности вещества в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

В экспериментах использованы стандартные коллекционные штаммы и бактерии, выделенные от больных. Оценку проводили методом серийных разведений с использованием питательных сред, пригодных для культивирования соответствующих видов микроорганизмов.

Соединения растворяли в стерильной воде и титровали в концентрациях от 500 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°C (таблица 5).

Таблица 5
Минимальная подавляющая концентрация полученных соединений
Соединение	МИК, мг/л
Соединение	S. aureus	E. coli	M. smegmatis
Ампициллин Контроль	0.05	1.5	12.5
1в	0.03	12.5	12.0
1д	1.5	5.0	12.0
1ж	1.0	5.0	12.0
1з	0.25	3.5	6.2
1к	0.012	1.0	12.0
1л	0.05	3.0	6.2
1о	0.05	5.0	6.2
1р	0.05	5.0	6.2

Полученные результаты свидетельствуют, что заявляемые соединения сопоставимы с ампициллином по уровню и спектру антимикробной активности, а некоторые превосходят по определенным параметрам прототип - ампициллин.

Пример 7.

Действие на S. aureus, находящиеся в составе биопленок

Таблица 6
Выживание S. aureus в биопленках при действии заявляемых соединений (24-часовое действие)
Антибиотик	Число КОЕ (Log10)
Контроль	9.9±0.76
Ампициллин	9.78±0.64
1а	8.27±0.34
1б	8.35±0.82
1в	8.32±0.45
1г	8.02±0.16
1д	8.27±0.62
1к	7.47±0.72
1о	8.18±0.24
1р	8.12±0.72

Представленные данные указывают, что заявляемые соединения, в отличие от прототипа - ампициллина, активны против стафилококков, находящихся в составе биопленок.

Пример 8.

Действие на S. pyogenes, находящиеся в составе биопленок

Таблица 7
Выживание S. pyogenes в биопленках при действии заявляемых соединений (24-часовое действие)
Антибиотик	Число КОЕ (Log10)
Контроль	8.41±0.76
Ампициллин	8.15±0.66
1в	7,46±0.40
1д	6.44±0.87
1ж	7.05±0.15
1з	7.50±0.70
1к	6.24±0.54
1л	7,20±0.34
1о	8.00±0.65
1р	7.75±0.23

Представленные данные указывают, что заявляемые соединения, в отличие от прототипа - ампициллина, активны против стрептококков, находящихся в составе биопленок.

Пример 9.

Действие на E. coli, находящиеся в составе биопленок

Таблица 8
Выживание в биопленках при действии заявляемых соединений (24-часовое действие)
Испытуемое вещество	Число КОЕ (Log10)
Контроль (добавлен растворитель)	8.97±0.48
Ампициллин	8.64±0.62
1в	7.50±0.15
1д	7.15±0.32
1ж	7.27±0.55
1з	7,54±0.34
1к	7.11±0.65
1л	7.72±0.52

Представленные данные указывают, что заявляемые соединения, в отличие от прототипа - ампициллина, активны против грамотрицательных эшерихий, находящихся в составе биопленок.

Пример 10.

Действие на K. pneumoniae, находящиеся в составе биопленок

Таблица 9
Выживание K. pneumoniae в биопленках при действии заявляемых соединений (24-часовое действие)
Испытуемое вещество	Число КОЕ (Log10)
Контроль (добавлен растворитель)	8.79±0.72
Ампициллин	8.57±0.74
1а	7.49±0.54
1д	7.37±0.14
1ж	8.00±0.27
1е	7.78±0.76
1к	7.02±0.44
1л	7.78±0.76

Представленные данные указывают, что заявляемые соединения, в отличие от прототипа - ампициллина, активны против грамотрицательных клебсиелл, находящихся в составе биопленок.

Пример 11.

Действие на A. baumannii, находящиеся в составе биопленок

Таблица 10
Выживание A. baumannii в биопленках при действии заявляемых соединений (24-часовое действие)
Испытуемое вещество	Число КОЕ (Log10)
Контроль (добавлен растворитель)	8.54±0.87
Ампициллин	8.48±0.43
1б	8.11±0.46
1в	7.71±0.15
1д	7.51±0.38
1е	7.79±0.85
1и	7.51±0.75
1к	6.61±0.55
1о	7.67±0.45
1р	7.41±0.55

Представленные данные указывают, что заявляемые соединения, в отличие от прототипа - ампициллина, активны против A. baumannii, находящихся в составе биопленок.

Пример 12.

Проникновение заявляемых соединений на S.sonnei, находящиеся внутри клеток

Для выполнения исследования клетки HeLa инфицировали 24-часовой культурой S.sonnei, предварительно отмытой двукратным центрифугированием от питательной среды и ресуспендированной в фосфатном буфере. После 4-часовой экспозиции все бактерии, не проникшие в клетки, были убиты гентамицином, обладающим бактерицидным действием и не проникающим в клетки эукариот. После экспозиции с гентамицином среду вместе с антибиотиком (гентамицином) удаляли и добавляли свежую среду с испытуемыми препаратами или без них.

Таблица 11
Действие заявляемых соединений на S.sonnei, находящиеся внутри клеток
N	Вещество	Число неповрежденных клеток
1.	Интактные клетки	8000 (100%)
2.	ДМСО	8000 (100%)
3.	Инфицированные клетки	6000 (75%)
4.	Ампициллин	6200 (77,5%)
5.	1з	7200 (90%)
6.	1к	7800 (97,5%)
7.	1л	7500 (93,75%)

Полученные результаты свидетельствуют, что заявляемые соединения в отличие от прототипа проникают в клетки человека и действуют на находящиеся в них бактерии.

Приведенные выше примеры подтверждают высокую антибактериальную активность веществ общей формулы (I), широкий спектр действия и, что весьма важно, эффективное воздействие на бактерии, находящиеся в клетках человека и в составе биопленок.

Claims

Противомикробное вещество с общей формулой

где R выбран из группы: Н, метил, этил, н-алкил (С3-С9), фенил;
X1 и Х3 выбраны из группы: СН₂, О или N (NH или NR, где R - метил, этил, линейный или разветвленный алкил, алкенил или циклоалкил С3-С10, CH₂CH₂OEt, CH₂CH₂CH₂OMe, Ph, производное бензола, замещенное один или несколько раз линейным или разветвленным алкилом, алкенилом или циклоалкилом С1-С9, галогеном (F, Сl или Вr), СF₃, метоксигруппой или другой алкоксигруппой, карбоксилом или карбоксиалкилом, либо одновременно несколькими из перечисленных заместителей, CH₂Ph, CH₂CH₂Ph, СН(СН₃)Рh, СН₂С₆Н₄(ОМе-р), СН₂С₆H₄(F-p), СН₂СН₂С₆Н₄(F-p), СН₂СН₂С₆Н₃(3,4-диОМе); 2-фурилметил, 2-(2-тиенил)этил;
Х2 - выбран из группы: C=O, C=S, CH₂, СМе₂, С(С₅Н₁₀-цикло).