RS68084B1 - Materijali i postupci za lečenje poremećaja povezanih sa bolom - Google Patents

Materijali i postupci za lečenje poremećaja povezanih sa bolom

Info

Publication number
RS68084B1
RS68084B1 RS20260565A RSP20260565A RS68084B1 RS 68084 B1 RS68084 B1 RS 68084B1 RS 20260565 A RS20260565 A RS 20260565A RS P20260565 A RSP20260565 A RS P20260565A RS 68084 B1 RS68084 B1 RS 68084B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sequence
cell
cells
gene
pyogenes
Prior art date
Application number
RS20260565A
Other languages
English (en)
Inventor
Ante Sven Lundberg
Samarth Kulkarni
Lawrence Klein
Hari Kumar Padmanabhan
Original Assignee
Vertex Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharma filed Critical Vertex Pharma
Publication of RS68084B1 publication Critical patent/RS68084B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Mycology (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] Oblast pronalaska
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast genskog uređivanja, a posebno na promenu gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A).
[0007] Povezane aplikacije
[0009] Predmetna prijava zahteva korist od U.S. privremene patentne prijave br. 62/358,763 podnete 6. jula 2016 i U.S. privremene patentne prijave br 62/461,874 podnete 22. februara 2017.
[0011] Lista sekvenci
[0013] Predmetna prijava sadrži Listu sekvenci u računarski čitljivom obliku [naziv datoteke: 170152PCT (SCN9A) sequence listing (Part 1): 18.643.508 bajtova - ASCII tekstualna datoteka; kreirana 28. juna 2017; 170152PCT (SCN9A) sequence listing (Part 2): 16.350.005 bajtova - ASCII tekstualna datoteka; kreirana 28. juna 2017; i 170152PCT (SCN9A) sequence listing (Part 3): 14.922.048 bajtova - ASCII tekstualna datoteka; kreirana 28. juna 2017].
[0015] Stanje tehnike
[0017] Genomski inženjering se odnosi na strategije i tehnike za ciljanu, specifičnu modifikaciju genetske informacije (genoma) živih organizama. Genomski inženjering je veoma aktivno polje istraživanja zbog širokog spektra mogućih primena, posebno u oblastima ljudskog zdravlja. Na primer, genomski inženjering se može koristiti za izmenu (npr. ispravljanje ili nokautiranje) gena koji nosi štetnu mutaciju ili za istraživanje funkcije gena. Rane tehnologije razvijene za umetanje transgena u živu ćeliju često su bile ograničene slučajnom prirodom umetanja nove sekvence u genom. Slučajna umetanja (insercije) u genom mogu dovesti do poremećaja normalne regulacije susednih gena, što dovodi do ozbiljnih neželjenih efekata. Štaviše, tehnologije slučajne integracije nude malu reproduktivnost, jer ne postoji garancija da će sekvenca biti umetnuta na isto mesto u dve različite ćelije. Nedavne strategije genomskog inženjeringa, kao što su nukleaze cinkovog prsta (ZFN), efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN), homing endonukleaze (HE) i MegaTAL, omogućavaju modifikaciju određenog dela DNK, čime se povećava preciznost izmene u poređenju sa ranim tehnologijama. Ove novije platforme nude mnogo veći stepen reproduktivnosti, ali i dalje imaju svoja ograničenja.
[0019] Uprkos naporima istraživača i medicinskih stručnjaka širom sveta koji pokušavaju da se pozabave genetskim poremećajima, i uprkos obećanjima pristupa genomskom inženjeringu, npr. putem nukleaza cinkovih prstiju, kako bi se eliminisao gen SCN9A koji kodira podjedinicu natrijumovog kanala Nav1.7, a koja je uključena u hronični bol, kao što je stavljeno na uvid javnosti u US 2011/0016541, i dalje postoji kritična potreba za razvojem bezbednih i efikasnih tretmana koji uključuju indikacije povezane sa SCN9A.
[0021] Korišćenjem alata za inženjering genoma za stvaranje trajnih promena u genomu koje mogu da se pozabave poremećajima ili stanjima povezanim sa SCN9A sa samo jednim tretmanom, dobijena terapija može potpuno da izleči određene indikacije i/ili bolesti povezane sa SCN9A.
[0023] Suština pronalaska
[0025] Predmetni pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Pronalazak se odnosi na jednomolekulsku vodeću RNK koja sadrži najmanje jednu sekvencu spejsera koja je RNK sekvenca koja odgovara SEQ ID NO: 47439. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na DNK koja kodira jednomolekulsku vodeću RNK predmetnog pronalaska. Prema predmetnom pronalasku, jednomolekulska vodeća RNK predmetnog pronalaska može se koristiti u lečenju poremećaja povezanog sa alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A), što obuhvata uređivanje gena SCN9A u ćeliji pacijenta. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak za uređivanje gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) u ćeliji putem uređivanja genoma, što obuhvata uvođenje u ćeliju: jedne ili više s. pyogenes Cas9 endonukleaze ili jednog ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više s. pyogenes Cas9 endonukleaza; i jednomolekulsku vodeću RNK (sgRNK) predmetnog pronalaska ili DNK predmetnog pronalaska; da bi se izazvao jedan ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu SCN9A gena ili SCN9A regulatornih elemenata što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu SCN9A gena, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija SCN9A genskih proizvoda.
[0027] Ovde su opisani ćelijski, ex vivo i in vivo postupci za stvaranje trajnih promena u genomu uvođenjem jedne ili više insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) ili drugih DNK sekvenci koje kodiraju regulatorne elemente SCN9A gena putem uređivanja genoma i smanjenja ili eliminacije genskih proizvoda alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A), koje se mogu koristiti za lečenje bola. Ovde su, takođe, date komponente i kompozicije, kao i vektori za izvođenje takvih postupaka.
[0029] Ovde je opisan postupak za uređivanje gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) u ćeliji putem uređivanja genoma, koji obuhvata: uvođenje u ćeliju jedne ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) radi izvođenja jednog ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu SCN9A gena ili SCN9A regulatornih elemenata, što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu SCN9A gena, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija SCN9A genskih proizvoda.
[0031] Takođe je ovde opisan i ex vivo postupak za lečenje pacijenta koji ima stanje ili poremećaj povezan sa SCN9A koji obuhvata: uređivanje indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija specifičnih za pacijenta (iPSC) unutar ili blizu gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) ili drugih DNK sekvenci koje kodiraju regulatorne elemente SCN9A gena; diferencijaciju uređenih iPSC u neuron perifernog nervnog sistema; i primenu neurona perifernog nervnog sistema pacijentu.
[0033] U nekim aspektima, korak uređivanja obuhvata: uvođenje jedne ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) u iPSC da bi se izazvali jedan ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu SCN9A gena ili SCN9A regulatornih elemenata, što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu SCN9A gena, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija SCN9A genskih proizvoda.
[0034] Takođe je ovde opisan i ex vivo postupak za lečenje pacijenta koji ima stanje ili poremećaj povezan sa SCN9A koji obuhvata: uređivanje mezenhimalne matične ćelije unutar ili blizu gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) ili drugih DNK sekvenci koje kodiraju regulatorne elemente SCN9A gena; diferencijaciju uređene mezenhimalne matične ćelije u neuron perifernog nervnog sistema; i primenu neurona perifernog nervnog sistema pacijentu.
[0036] U nekim aspektima, korak uređivanja obuhvata: unošenje jedne ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) u mezenhimalnu matičnu ćeliju radi izvođenja jednog ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu gena SCN9A ili regulatornih elemenata SCN9A, što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu gena SCN9A, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija proizvoda gena SCN9A.
[0038] Takođe je ovde opisan i in vivo postupak za lečenje pacijenta sa poremećajem povezanim sa SCN9A koji obuhvata: uređivanje gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) u ćeliji pacijenta.
[0040] U nekim aspektima, korak uređivanja obuhvata: unošenje u ćeliju jedne ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) da bi se izazvalo jedno ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu gena SCN9A ili regulatornih elemenata SCN9A, što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu gena SCN9A, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija proizvoda gena SCN9A.
[0042] U nekim aspektima, ćelija je neuron perifernog nervnog sistema. U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) se isporučuje neuronu perifernog nervnog sistema putem direktne intraganglionske ili intraspinalne injekcije ili intratekalne isporuke.
[0044] Ovde je takođe opisan postupak izmene susedne genomske sekvence SCN9A gena u ćeliji koji obuhvata: kontaktiranje ćelije sa jednom ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) da bi se izazvali jedan ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB). U nekim aspektima, izmena susedne genomske sekvence se dešava u jednom ili više eksona SCN9A gena.
[0045] U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je izabrana iz bilo koje od onih u SEQ ID NO: 1-620 i varijanti koje imaju najmanje 90% homologije sa bilo kojom od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 1-620.
[0047] U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je jedan ili više proteina ili polipeptida. U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je jedan ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više endonukleaza DNK. U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je jedna ili više ribonukleinskih (RNK) kiselina koje kodiraju jednu ili više endonukleaza DNK. U nekim aspektima, jedna ili više ribonukleinskih (RNK) kiselina je jedna ili više hemijski modifikovanih RNK. U nekim aspektima, jedna ili više ribonukleinskih (RNK) kiselina je hemijski modifikovana u kodirajućem regionu. U nekim aspektima, jedan ili više polinukleotida ili jedna ili više ribonukleinskih (RNK) kiselina je optimizovana za kodone.
[0049] U nekim aspektima, postupci dalje obuhvataju unošenje u ćeliju jedne ili više gRNK ili jedne ili više sgRNK. U nekim aspektima, jedna ili više gRNK ili jedna ili više sgRNK sadrže sekvencu spejsera koja je komplementarna DNK sekvenci unutar ili blizu gena SCN9A. U nekim aspektima, jedna ili više gRNK ili jedna ili više sgRNK su hemijski modifikovane. U nekim aspektima, jedna ili više gRNK ili jedna ili više sgRNK su prethodno kompleksovane sa jednom ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK). U nekim aspektima, prethodno kompleksovanje uključuje kovalentno vezivanje jedne ili više gRNK ili jedne ili više sgRNK za jednu ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK).
[0051] U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je formulisana u lipozomu ili lipidnoj nanočestici. U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) je formulisana u lipozomu ili lipidnoj nanočestici koja, takođe, sadrži jednu ili više gRNK ili jednu ili više sgRNK.
[0053] U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) su kodirane u čestici AAV vektora. U nekim aspektima, jedna ili više gRNK ili jedna ili više sgRNK su kodirane u čestici AAV vektora. U nekim aspektima, jedna ili više endonukleaza dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) su kodirane u čestici AAV vektora, koja takođe kodira jednu ili više gRNK ili jednu ili više sgRNK. U nekim aspektima, AAV vektorska čestica je izabrana od bilo koje od onih opisanih u SEQ ID NO: 4734-5302 i Tabeli 2.
[0054] Ovde je, takođe, opisana vodeća RNK sa jednim molekulom koja sadrži: najmanje jednu sekvencu spejsera koja je RNK sekvenca koja odgovara bilo kom od SEQ ID NO: 5305-125469. U nekim aspektima, vodeća RNK sa jednim molekulom dalje sadrži region produžetka sekvence spejsera. U nekim aspektima, vodeća RNK sa jednim molekulom dalje sadrži region produžetka tracrRNK. U nekim aspektima, vodeća RNK sa jednim molekulom je hemijski modifikovana.
[0056] U nekim aspektima, jednomolekulska vodeća RNK je prethodno kompleksovana sa polipeptidom usmerenim ka mestu. U nekim aspektima, polipeptid usmeren ka mestu je DNK endonukleaza. U nekim aspektima, endonukleaza DNK je Cas9 ili CPf1 endonukleaza. U nekim aspektima, Cas9 ili Cpfl endonukleaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od: s. pyogenes Cas9, S. aureus Cas9, N. meningitides Cas9, S. thermophilus CRISPR1 Cas9, S. thermophilus CRISPR 3 Cas9, T. denticola Cas9, L. bacterium ND2006 Cpfl i acidaminococcus sp. BV3L6 Cpfl, i varijante koje imaju najmanje 90% homologije sa ovim endonukleazama. U nekim aspektima, Cas9 ili Cpfl endonukleaza sadrži jedan ili više signala jedarne lokalizacije (NLS). U nekim aspektima, najmanje jedan NLS je na ili unutar 50 amino-kiselina od amino-terminusa Cas9 ili Cpfl endonukleaze i/ili najmanje jedan NLS je na ili unutar 50 amino-kiselina od karboksi-terminusa Cas9 ili Cpfl endonukleaze.
[0058] Takođe je ovde opisana RNK koja kodira jednomolekularni vodič polinukleotida opisan ovde.
[0059] Takođe je ovde opisana RNK koja kodira CRISPR/Cas sistem opisan ovde.
[0061] Takođe je ovde data DNK koja kodira jednomolekularnu vodeću RNK kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0063] Takođe je ovde opisana DNK koja kodira CRISPR/Cas sistem opisan ovde.
[0065] Ovde je takođe opisan vektor koji sadrži DNK koja kodira jednomolekularnu vodeću RNK ili CRISPR/Cas sistem. U nekim aspektima, vektor je plazmid. U nekim aspektima, vektor je čestica AAV vektora, gde je serotip AAV vektora izabran od onih navedenih u SEQ ID NO: 4734-5302 ili Tabeli 2.
[0067] Kratak opis crteža
[0069] Različiti aspekti materijala i postupaka otkrivenih i opisanih u ovoj specifikaciji mogu se bolje razumeti uz upućivanje na prateće crteže, na kojima:
[0070] Slike 1A-B prikazuju CRISPR/Cas sistem tipa II;
[0072] Slika 1A je prikaz CRISPR/Cas sistema tipa II koji uključuje gRNK;
[0074] Slika 1B je još jedan prikaz CRISPR/Cas sistema tipa II koji uključuje sgRNK;
[0076] Slike 2A-G opisuju efikasnost sečenja s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0078] Slika 2A opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 93,3 - 98,5% od s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0080] Slika 2B opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 86,1 - 93% od s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0082] Slika 2C opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 78,8 - 86% od s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0084] Slika 2D opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 67,2 - 78,8% s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0086] Slika 2E opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 50,7 - 66,8% s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0088] Slika 2F opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 23,4 - 49,8% od s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0090] Slika 2G opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 4,1 - 22,1% od s. pyogenes gRNK odabrane putem in vitro transkribovanog (IVT) gRNK skrininga;
[0092] Slike 3A-C opisuju efikasnost sečenja s. pyogenes gRNK u ćelijama HEK293T koje ciljaju gen SCN9A;
[0094] Slika 3A opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 80,9 - 98,5% s. pyogenes gRNK u ćelijama HEK293T koje ciljaju gen SCN9A;
[0096] Slika 3B opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 50,7 - 80,9% od s. pyogenes gRNK u ćelijama HEK293T koje ciljaju gen SCN9A; i
[0097] Slika 3C opisuje efikasnost sečenja u rasponu od 4,1 - 49,8% od s. pyogenes gRNK u ćelijama HEK293T koje ciljaju gen SCN9A.
[0099] Kratak opis liste sekvenci
[0101] SEQ ID NO: 1-620 su Cas endonukleazne ortološke sekvence.
[0102] SEQ ID NO: 621-631 ne uključuju sekvence.
[0103] SEQ ID NO: 632-4715 su mikroRNK sekvence.
[0104] SEQ ID NO: 4716-4733 ne uključuju sekvence.
[0105] SEQ ID NO: 4734-5302 su AAV sekvence serotipa.
[0106] SEQ ID NO: 5303 je SCN9A nukleotidna sekvenca.
[0107] SEQ ID NO: 5304 je genska sekvenca koja uključuje 1-5 kilobaznih parova uzvodno i/ili nizvodno od gena SCN9A.
[0108] SEQ ID NO: 5305-6250 su sekvence spejsera od 20 bp za ciljanje unutar ili blizu SCN9A gena ili druge DNK sekvence koja kodira regulatorni element SCN9A gena sa t. denticola Cas9 endonukleazom.
[0109] SEQ ID NO: 6251-8561 su sekvence spejsera od 20 bp za ciljanje unutar ili blizu SCN9A gena ili druge DNK sekvence koja kodira regulatorni element SCN9A gena sa s. thermophilus Cas9 endonukleazom.
[0110] SEQ ID NO: 8562-13614 su sekvence spejsera od 20 bp za ciljanje unutar ili blizu SCN9A gena ili druge DNK sekvence koja kodira regulatorni element SCN9A gena sa s. aureus Cas9 endonukleazom.
[0111] SEQ ID NO: 13615-18988 su sekvence spejsera od 20 bp za ciljanje unutar ili blizu SCN9A gena ili druge DNK sekvence koja kodira regulatorni element SCN9A gena sa n. meningitides Cas9 endonukleazom.
[0113] SEQ ID NO: 18989 - 56863 su sekvence spejsera od 20 bp za ciljanje unutar ili blizu SCN9A gena ili druge DNK sekvence koja kodira regulatorni element SCN9A gena sa s. pyogenes Cas9 endonukleazom.
[0115] SEQ ID NO: 56864 - 125469 su sekvence spejsera od 20 bp za ciljanje unutar ili blizu SCN9A gena ili druge DNK sekvence koja kodira regulatorni element SCN9A gena sa acidaminococcus, lachnospiraceae i franciscella novicida Cpf1 endonukleazom.
[0116] SEQ ID NO: 125470-125499 ne uključuju sekvence.
[0117] SEQ ID NO: 125500 je uzorak vodeće RNK (gRNK) za s. pyogenes Cas9 endonukleazom. SEQ ID NO: 125501-125503 prikazuju uzorke sgRNK sekvenci.
[0119] Detaljan opis
[0121] I. UVOD
[0123] Uređivanje genoma
[0125] Predmetni pronalazak obezbeđuje strategije i tehnike za ciljanu, specifičnu promenu genetske informacije (genoma) živih organizama. Kako se ovde koristi, izraz „alternacija“ ili „alternacija genetske informacije“ odnosi se na bilo koju promenu u genomu ćelije. U kontekstu lečenja genetskih poremećaja, promene mogu uključivati, ali nisu ograničene na, umetanje, brisanje i korekciju. Kako se ovde koristi, izraz „umetanje/insercija“ odnosi se na dodavanje jednog ili više nukleotida u DNK sekvencu. Umetanja mogu biti u rasponu od malih umetanja nekoliko nukleotida do umetanja velikih segmenata kao što su cDNK ili gen. Izraz „brisanje/delecija“ odnosi se na gubitak ili uklanjanje jednog ili više nukleotida u DNK sekvenci ili gubitak ili uklanjanje funkcije gena. U nekim slučajevima, delecija može uključivati, na primer, gubitak nekoliko nukleotida, eksona, introna, segmenta gena ili cele sekvence gena. U nekim slučajevima, delecija gena odnosi se na eliminaciju ili smanjenje funkcije ili ekspresije gena ili njegovog genskog proizvoda. Ovo može biti rezultat ne samo delecije sekvenci unutar ili blizu gena, već i drugih događaja (npr. insercija, besmislena mutacija) koje remete ekspresiju gena. Izraz „korekcija“, kako se ovde koristi, odnosi se na promenu jednog ili više nukleotida genoma u ćeliji, bilo insercijom, delecijom ili supstitucijom. Takva korekcija može rezultirati povoljnijim genotipskim ili fenotipskim ishodom, bilo u strukturi ili funkciji, u odnosu na genomsko mesto koje je korigovano. Jedan neograničavajući primer „korekcije“ uključuje korekciju mutantne ili defektne sekvence u sekvencu divljeg tipa koja vraća strukturu ili funkciju genu ili njegovom genskom proizvodu(ima). U zavisnosti od prirode mutacije, korekcija se može postići putem različitih strategija opisanih ovde. U jednom neograničavajućem primeru, misens mutacija može se korigovati zamenom regiona koji sadrži mutaciju njegovim pandanom divljeg tipa. Kao još jedan primer, mutacije duplikacije (npr. ponovljene ekspanzije) u genu mogu se ispraviti uklanjanjem dodatnih sekvenci.
[0126] U nekim aspektima, izmene mogu takođe uključivati nokin, nokaut ili nokdaun gena. Kako se ovde koristi, termin „nokin“ se odnosi na dodavanje DNK sekvence ili njenog fragmenta u genom. Takve DNK sekvence koje treba nokautirati mogu uključivati ceo gen ili gene, mogu uključivati regulatorne sekvence povezane sa genom ili bilo kojim delom ili fragmentom gore navedenog. Na primer, cDNK koja kodira protein divljeg tipa može biti umetnuta u genom ćelije koja nosi mutantni gen. Strategije nokauta ne moraju da zamene defektni gen, u celini ili delimično. U nekim slučajevima, strategija nokina može dalje uključivati supstituciju postojeće sekvence sa datom sekvencom, npr. supstitucija mutantnog alela kopijom divljeg tipa. S druge strane, izraz „nokaut“ se odnosi na eliminaciju gena ili ekspresiju gena. Na primer, gen može biti nokautovan ili delecijom ili dodavanjem nukleotidne sekvence što dovodi do poremećaja okvira za čitanje. Kao još jedan primer, gen može biti nokautovan zamenom dela gena irelevantnom sekvencom. Konačno, izraz „nokdaun“, kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje ekspresije gena ili njegovih genskih proizvoda. Kao rezultat nokdaun gena, aktivnost ili funkcija proteina može biti oslabljena ili nivoi proteina mogu biti smanjeni ili eliminisani.
[0128] Uređivanje genoma se generalno odnosi na proces modifikovanja nukleotidne sekvence genoma, poželjno na precizan ili unapred određen način. Primeri postupaka uređivanja genoma opisani ovde uključuju postupke korišćenja nukleaza usmerenih na mesto za sečenje dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) na preciznim ciljnim lokacijama u genomu, čime se stvaraju jednolančani ili dvolančani prekidi DNK na određenim lokacijama unutar genoma. Takvi prekidi mogu biti i redovno se popravljaju prirodnim, endogenim ćelijskim procesima, kao što su popravka usmerena na homologiju (HDR) i spajanje nehomolognih krajeva (NHEJ), kao što je pregledano u Cox et al., Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015). Ova dva glavna procesa popravke DNK sastoje se od porodice alternativnih puteva. NHEJ direktno spaja krajeve DNK koji nastaju usled dvostrukog prekida, ponekad uz gubitak ili dodavanje nukleotidne sekvence, što može poremetiti ili poboljšati ekspresiju gena. HDR koristi homolognu sekvencu, ili donorsku sekvencu, kao šablon za umetanje definisane DNK sekvence na mestu prekida. Homologna sekvenca može biti u endogenom genomu, kao što je sestrinska hromatida. Alternativno, donor može biti egzogena nukleinska kiselina, kao što je plazmid, jednolančani oligonukleotid, dvolančani oligonukleotid, dupleks oligonukleotid ili virus, koji ima regione visoke homologije sa lokusom cepanim nukleazom, ali koji takođe može sadržati dodatne sekvence ili promene sekvence, uključujući delecije koje se mogu ugraditi u cepani ciljni lokus. Treći mehanizam popravke može biti spajanje krajeva posredovano mikrohomologijom (MMEJ), takođe poznat kao „alternativni NHEJ“, kod koga je genetski ishod sličan NHEJ po tome što se male delecije i insercije mogu javiti na mestu cepanja. MMEJ može da koristi homologne sekvence od nekoliko baznih parova koji okružuju mesto prekida DNK kako bi se postigao povoljniji ishod popravke spajanja krajeva DNK, a nedavni izveštaji su dodatno razjasnili molekularni mehanizam ovog procesa; videti, npr. Cho and Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kent et al., Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015); Mateos-Gomez et al., Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldi et al., Nature 528, 258-62 (2015). U nekim slučajevima, moguće je predvideti verovatne ishode popravke na osnovu analize potencijalnih mikrohomologija na mestu prekida DNK.
[0130] Svaki od ovih mehanizama za uređivanje genoma može se koristiti za stvaranje željenih genomskih promena. Korak u procesu uređivanja genoma može biti stvaranje jednog ili dva prekida DNK, potonji kao dvolančani prekidi ili kao dva jednolančana prekida, u ciljnom lokusu blizu mesta namerne mutacije. Ovo se može postići upotrebom polipeptida usmerenih ka mestu, kao što je ovde opisano i ilustrovano.
[0132] CRISPR endonukleazni sistem
[0134] Genomski lokus CRISPR (grupisana redovno isprepletena kratka palindromska ponavljanja) može se naći u genomima mnogih prokariota (npr. bakterije i arheje). Kod prokariota, lokus CRISPR kodira proizvode koji funkcionišu kao vrsta imunog sistema koji pomaže u odbrani prokariota od stranih uljeza, kao što su virusi i fagi. Postoje tri faze funkcije lokusa CRISPR: integracija novih sekvenci u lokus CRISPR, ekspresija CRISPR RNK (crRNK) i utišavanje nukleinske kiseline stranog uljeza. Pet vrsta CRISPR sistema (npr. Tip I, Tip II, Tip III, Tip U i Tip V) je identifikovana
[0135] CRISPR lokus uključuje brojne kratke ponavljajuće sekvence koje se nazivaju „ponavljanja“. Kada se eksprimuju, ponavljanja mogu formirati sekundarne strukture (npr. ukosnice) i/ili obuhvatiti nestrukturirane jednolančane sekvence. Ponavljanja se obično javljaju u klasterima i često diverguju između vrsta. Ponavljanja su redovno isprepletena jedinstvenim intervencionim sekvencama koje se nazivaju „spejseri (razmaknice)“, što rezultira arhitekturom lokusa ponavljanje-spejser-ponavljanje. Spejseri su identični ili imaju visoku homologiju sa poznatim stranim sekvencama uljeza. Jedinica spejser-ponavljanje kodira crisprRNK (crRNK), koja se obrađuje u zreli oblik jedinice spejser-ponavljanje. crRNK sadrži „seme“ ili spejser koja je uključena u ciljanje ciljne nukleinske kiseline (u prirodnom obliku kod prokariota, spejser cilja stranu nukleinsku kiselinu uljeza). Spejser se nalazi na 5’ ili 3’ kraju crRNk.
[0137] CRISPR lokus, takođe, obuhvata polinukleotidne sekvence koje kodiraju CRISPR asocirane (Cas) gene. Cas geni kodiraju endonukleaze uključene u biogenezu i faze interferencije funkcije crRNK kod prokariota. Neki Cas geni sadrže homologne sekundarne i/ili tercijarne strukture.
[0139] CRISPR sistemi tipa II
[0141] Biogeneza cRNK u CRISPR sistemu tipa II u prirodi zahteva trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNK). Neograničavajući primeri CRISPR sistema tipa II prikazani su na slikama 1A i 1B. TracrRNK može biti modifikovana endogenom RNaseIII, a zatim hibridizuje sa crRNK ponavljanjem u pre-crRNK nizu. Endogena RNaseIII može biti regrutovana za cepanje precrRNK. Cepane crRNK mogu biti podvrgnute egzoribonukleaznom skraćivanju da bi se proizveo zreli crRNK oblik (npr. skraćivanje 5’). TracrRNK može ostati hibridizovana sa krRNK, a TracrRNK i krRNK se povezuju sa polipeptidom usmerenim ka mestu (npr. Cas9). CRRNK kompleksa crRNK-tracrRNK-Cas9 može da vodi kompleks do ciljne nukleinske kiseline sa kojom se crRNK može hibridizovati. Hibridizacija crRNK sa ciljnom nukleinskom kiselinom može da aktivira Cas9 za ciljano cepanje nukleinske kiseline. Ciljna nukleinska kiselina u CRISPR sistemu tipa II naziva se protospejser susedni motiv (PAM). U prirodi, PAM je neophodan za olakšavanje vezivanja polipeptida usmerenog na mesto (npr. Cas9) do ciljne nukleinske kiseline. Sistemi tipa II (takođe poznati kao Nmeni ili CASS4) su dalje podeljeni na tip II-A (CASS4) i II-B (CASS4a). Jinek et al., Science, 337(6096):816‑821 (2012) pokazao je da je CRISPR/Cas9 sistem koristan za RNK-programabilno uređivanje genoma, a broj međunarodne patentne prijave WO2013/176772 daje brojne primere i primene CRISPR/Cas endonukleaznog sistema za uređivanje gena na određenom mestu.
[0143] CRISPR sistemi tipa V
[0145] CRISPR sistemi tipa V imaju nekoliko važnih razlika u odnosu na sisteme tipa II. Na primer, Cpf1 je endonukleaza vođena jednom RNK koja, za razliku od sistema tipa II, nema tracrRNK. U stvari, CRISPR nizovi povezani sa Cpfl mogu se obraditi u zrele crRNK bez potrebe za dodatnom transaktivirajućom tracrRNK. CRISPR niz tipa V može se obraditi u kratke zrele crRNK dužine 42-44 nukleotida, pri čemu svaka zrela crRNK počinje sa 19 nukleotida direktnog ponavljanja, nakon čega sledi 23-25 nukleotida sekvence spejsera. Nasuprot tome, zrele crRNK u sistemima tipa II mogu početi sa 20-24 nukleotida sekvence spejsera, nakon čega sledi oko 22 nukleotida direktnog ponavljanja. Takođe, Cpfl može da koristi protospejser susedni motiv bogat T-om, tako da kompleksi Cpfl-crRNK efikasno cepaju ciljnu DNK kojoj prethodi kratak PAM bogat T-om, što je u suprotnosti sa PAM bogatim G-om koji sledi ciljnu DNK kod sistema tipa II. Dakle, sistemi tipa V cepaju DNK na tački koja je udaljena od PAM, dok sistemi tipa II cepaju DNK na tački koja je pored PAM. Pored toga, za razliku od sistema tipa II, Cpfl cepa DNK preko stepenastog dvolančanog prekida DNK sa 5’ prepustom od 4 ili 5 nukleotida. Sistemi tipa II cepaju DNK preko tupog dvolančanog prekida. Slično sistemima tipa II, Cpfl sadrži predviđeni endonukleazni domen sličan RuvC, ali mu nedostaje drugi HNH endonukleazni domen, što je u suprotnosti sa sistemima tipa II.
[0147] Cas geni/Polipeptidi i protospejser susedni motivi
[0149] Primeri CRISPR/Cas polipeptida uključuju Cas9 polipeptide objavljene u Fonfara et al., Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014). Sistem imenovanja gena CRISPR/Cas je prošao kroz opsežno ponovno ispisivanje otkako su Cas geni otkriveni. Fonfara et al. takođe obezbeđuje PAM sekvence za Cas9 polipeptide iz različitih vrsta (videti, takođe, Tabelu 1 infra).
[0151] II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI PREDMETNE OBJAVE
[0153] Ovde je, kako je definisano u patentnim zahtevima, obezbeđen in vitro ili ex vivo postupak za uređivanje gena SCN9A u ćeliji putem uređivanja genoma, koji obuhvata unošenje u ćeliju: jedne ili više s. pyogenes Cas9 endonukleaza ili jednog ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više s. pyogenes Cas9 endonukleaza; i jednomolekulske vodeće RNK (sgRNK) predmetnog pronalaska ili DNK predmetnog pronalaska; da bi se izazvalo jedno ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu SCN9A gena ili regulatornih elemenata SCN9A što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu SCN9A gena, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija genskih proizvoda SCN9A. Na ovaj način, primeri navedeni u predmetnoj objavi mogu pomoći u smanjenju ili eliminisanju ekspresije SCN9A gena sa samo jednim tretmanom (umesto da se isporučuju potencijalne terapije tokom čitavog života pacijenta).
[0154] Polipeptidi usmereni ka mestu (endonukleaze, enzimi)
[0156] Polipeptid usmeren ka mestu je nukleaza koja se koristi u uređivanju genoma za razlaganje DNK. Polipeptid usmeren ka mestu može se primeniti u ćeliju ili pacijenta kao: jedan ili više polipeptida, ili jedna ili više mRNK koje kodiraju polipeptid. Bilo koji od enzima ili ortologa navedenih u SEQ ID NO: 1-620, ili ovde opisanih, može se koristiti u ovde opisanim postupcima. Jednomolekulska vodeća RNK može biti prethodno kompleksovana sa polipeptidom usmerenim ka mestu. Polipeptid usmeren ka mestu može biti bilo koja od DNK endonukleaza opisanih ovde.
[0158] U kontekstu CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistema, polipeptid usmeren ka mestu može se vezati za vodeću RNK koja, zauzvrat, određuje mesto u ciljnoj DNK na koje je polipeptid usmeren. U CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistemima opisanim ovde, polipeptid usmeren ka mestu može biti endonukleaza, kao što je DNK endonukleaza.
[0160] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži veći broj domena koji cepaju nukleinske kiseline (tj. nukleazne). Dva ili više domena koji cepaju nukleinske kiseline mogu biti povezani zajedno preko linkera. Na primer, linker može da sadrži fleksibilni linker. Linkeri mogu da sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 ili više aminokiselina.
[0162] Prirodno prisutni Cas9 enzimi divljeg tipa sadrže dva nukleazna domena, HNH nukleazna domena i RuvC domen. Ovde se izraz „Cas9“ odnosi i na prirodni i na rekombinantni Cas9. Cas9 enzimi koji se ovde razmatraju mogu da sadrže HNH ili HNH-slične nukleazne domene i/ili RuvC ili RuvC-slične nukleazne domene.
[0164] HNH ili HNH-slični domeni sadrže prevoj sličan McrA. HNH ili HNH-slični domeni sadrže dva antiparalelna β-lanca i α-heliks. HNH ili HNH-slični domeni sadrže mesto vezivanja metala (npr. mesto vezivanja dvovalentnih katjona). HNH ili HNH-slični domeni mogu da cepaju jedan lanac ciljne nukleinske kiseline (npr. komplementarni lanac ciljanog lanca crRNK).
[0166] RuvC ili RuvC-slični domeni sadrže RNaseH ili RNaseH-slični prevoj. RuvC/RNaseH domeni su uključeni u raznovrstan skup funkcija zasnovanih na nukleinskim kiselinama, uključujući delovanje i na RNK i na DNK. RNaseH domen sadrži 5 β-lanaca okruženih sa više α-heliksa. RuvC/RNaseH ili RuvC/RNaseH-slični domeni sadrže mesto vezivanja metala (npr. mesto vezivanja dvovalentnih katjona). RuvC/RNaseH ili RuvC/RNaseH-slični domeni mogu da cepaju jedan lanac ciljne nukleinske kiseline (npr. nekomplementarni lanac dvolančane ciljne DNK).
[0167] Polipeptidi usmereni ka mestu mogu uvesti dvolančane ili jednolančane prekide u nukleinskim kiselinama, npr. genomske DNK. Dvolančani prekid može stimulisati endogene puteve popravke DNK ćelije (npr. popravka zavisna od homologije (HDR) ili NHEJ ili alternativno nehomologno spajanje krajeva (A-NHEJ) ili spajanje krajeva posredovano mikrohomologijom (MMEJ)). NHEJ može popraviti odcepljenu ciljnu nukleinsku kiselinu bez potrebe za homolognim šablonom. Ovo ponekad može dovesti do malih delecija ili insercija (indela) u ciljnoj nukleinskoj kiselini na mestu cepanja i može dovesti do poremećaja ili izmene ekspresije gena. HDR se može javiti kada je dostupan homologni šablon za popravku, ili donor. Homologni šablon za popravku može da sadrži sekvence koje su homologne sekvencama koje okružuju mesto cepanja ciljne nukleinske kiseline. Sestrinska hromatida može biti korišćena od strane ćelije kao šablon za popravku. Međutim, u svrhu uređivanja genoma, šablon za popravku može biti obezbeđen kao egzogena nukleinska kiselina, kao što je plazmid, dupleks oligonukleotid, jednolančani oligonukleotid ili virusna nukleinska kiselina. Sa egzogenim donorskim šablonima, dodatna sekvenca nukleinske kiseline (kao što je transgen) ili modifikacija (kao što je promena jedne ili više baza ili delecija) može se uvesti između bočnih regiona homologije tako da se dodatna ili izmenjena sekvenca nukleinske kiseline takođe inkorporira u ciljni lokus. MMEJ može rezultirati genetskim ishodom koji je sličan NHEJ po tome što se male delecije i insercije mogu javiti na mestu cepanja. MMEJ može koristiti homologne sekvence od nekoliko parova baza koje okružuju mesto cepanja kako bi se postigao favorizovani ishod popravke DNK spajanjem krajeva. U nekim slučajevima, moguće je predvideti verovatne ishode popravke na osnovu analize potencijalnih mikrohomologija u ciljnim regionima nukleaze.
[0169] Stoga, u nekim slučajevima, homologna rekombinacija može biti korišćena za umetanje egzogene polinukleotidne sekvence u ciljno mesto cepanja nukleinske kiseline. Egzogena polinukleotidna sekvenca se ovde naziva „donorski polinukleotid“ (ili donorska ili donorska sekvenca). Donorski polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida ili deo kopije donorskog polinukleotida mogu biti umetnuti u ciljno mesto cepanja nukleinske kiseline. Donorski polinukleotid može biti egzogena polinukleotidna sekvenca, tj. sekvenca koja se prirodno ne javlja na mestu cepanja ciljne nukleinske kiseline.
[0170] Modifikacije ciljne DNK usled NHEJ i/ili HDR mogu dovesti do, na primer, mutacija, delecija, promena, integracija, korekcije gena, zamene gena, obeležavanja gena, umetanja transgena, delecije nukleotida, poremećaja gena, translokacija i/ili mutacije gena. Procesi brisanja genomske DNK i integracije nenativne nukleinske kiseline u genomsku DNK su primeri uređivanja genoma.
[0171] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili 100% identiteta sekvence amino-kiselina sa primernim polipeptidom usmerenim ka mestu divljeg tipa [npr. Cas9 iz s. pyogenes, US2014/0068797 Sequence ID No. 8 ili Sapranauskas et al., Nucleic Acids Res, 39(21): 9275-9282 (2011)], i razni drugi polipeptidi usmereni na mesto. Polipeptid usmeren na mesto može da sadrži najmanje 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ili 100% identiteta sa polipeptidom usmerenim na mesto divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra) preko 10 susednih amino-kiselina. Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži najviše: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ili 100% identiteta sa polipeptidom usmerenim ka mestu divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra) preko 10 susednih amino-kiselina. Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži najmanje: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ili 100% identiteta sa polipeptidom usmerenim ka mestu divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra) preko 10 susednih amino-kiselina u HNH nukleaznom domenu polipeptida usmerenog na mesto. Polipeptid usmeren na mesto može da sadrži najviše: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ili 100% identiteta sa polipeptidom usmerenim na mesto divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra) preko 10 susednih aminokiselina u HNH nukleaznom domenu polipeptida usmerenog na mesto. Polipeptid usmeren na mesto može da sadrži najmanje: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ili 100% identiteta sa polipeptidom usmerenim na mesto divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra) preko 10 susednih aminokiselina u RuvC nukleaznom domenu polipeptida usmerenog na mesto. Polipeptid usmeren na mesto može da sadrži najviše: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 ili 100% identiteta sa polipeptidom usmerenim na mesto divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra) preko 10 susednih aminokiselina u RuvC nukleaznom domenu polipeptida usmerenog ka mestu.
[0173] Usmereni polipeptid može da sadrži modifikovani oblik divljeg tipa, kao primera, usmerenog polipeptida. Modifikovani oblik divljeg tipa, kao primera, usmerenog polipeptida može da sadrži mutaciju koja smanjuje aktivnost cepanja nukleinske kiseline. Modifikovani oblik divljeg tipa, kao primera, usmerenog polipeptida može imati manje od 90%, manje od 80%, manje od 70%, manje od 60%, manje od 50%, manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 1% aktivnosti cepanja nukleinske kiseline divljeg tipa, kao primera, usmerenog polipeptida.npr. Cas9 od s. pyogenes, supra). Modifikovani oblik polipeptida usmerenog na mesto ne može imati značajnu aktivnost cepanja nukleinskih kiselina. Kada je polipeptid usmeren na mesto modifikovani oblik koji nema značajnu aktivnost cepanja nukleinskih kiselina, ovde se naziva „enzimski neaktivan“.
[0175] Modifikovani oblik polipeptida usmerenog ka mestu može da sadrži mutaciju tako da može da indukuje jednolančani prekid (SSB) na ciljnoj nukleinskoj kiselini (npr. presecanjem samo jedne od šećerno-fosfatnih kičmi dvolančane ciljne nukleinske kiseline). U nekim aspektima, mutacija može rezultirati sa manje od 90%, manje od 80%, manje od 70%, manje od 60%, manje od 50%, manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 1% aktivnosti cepanja nukleinske kiseline u jednom ili više od mnoštva domena za cepanje nukleinske kiseline polipeptida usmerenog ka mestu divljeg tipa (npr. Cas9 od s. pyogenes, supra). U nekim aspektima, mutacija može dovesti do toga da jedan ili više od mnoštva domena koji cepaju nukleinske kiseline zadržavaju sposobnost cepanja komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline, ali smanjuju svoju sposobnost cepanja nekomplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Mutacija može dovesti do toga da jedan ili više od mnoštva domena koji cepaju nukleinske kiseline zadržavaju sposobnost cepanja nekomplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline, ali smanjuju svoju sposobnost cepanja komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ostaci u primeru divljeg tipa s. pyogenes Cas9 polipeptidi, kao što su Asp10, His840, Asn854 i Asn856, mutiraju se da bi se inaktivirao jedan ili više od mnoštva domena za cepanje nukleinskih kiselina (npr. nukleazni domeni). Ostaci koji treba mutirati mogu odgovarati ostacima Asp10, His840, Asn854 i Asn856 u primeru divljeg tipa s. pyogenes Cas9 polipeptid (npr. kako je određeno sekvencom i/ili strukturnim poravnanjem). Neograničavajući primeri mutacija uključuju D10A, H840A, N854A ili N856A. Stručnjak u tehnici će prepoznati da mogu biti pogodne i druge mutacije osim supstitucija alaninom.
[0177] U nekim aspektima, mutacija D10A može biti kombinovana sa jednom ili više mutacija H840A, N854A ili N856A da bi se proizveo polipeptid usmeren ka mestu kome značajno nedostaje aktivnost cepanja DNK. Mutacija H840A može biti kombinovana sa jednom ili više mutacija D10A, N854A ili N856A da bi se proizveo polipeptid usmeren ka mestu kome značajno nedostaje aktivnost cepanja DNK. Mutacija N854A može biti kombinovana sa jednom ili više mutacija H840A, D10A ili N856A da bi se proizveo polipeptid usmeren ka mestu kome značajno nedostaje aktivnost cepanja DNK. Polipeptidi usmereni ka mestu koji sadrže jedan značajno neaktivni nukleazni domen nazivaju se „nikaze“.
[0179] Varijante nikaza RNK-vođenih endonukleaza, na primer Cas9, mogu se koristiti za povećanje specifičnosti CRISPR-posredovanog uređivanja genoma. Divlji tip Cas9 je obično vođen jednom vodećom RNK dizajniranom da se hibridizuje sa određenom sekvencom od ~20 nukleotida u ciljnoj sekvenci (kao što je endogeni genomski lokus). Međutim, može se tolerisati nekoliko neusklađenosti između voeće RNK i ciljnog lokusa, efikasno smanjujući dužinu potrebne homologije u ciljnom mestu na, na primer, samo 13 nt homologije, i time rezultirajući povećanim potencijalom za vezivanje i cepanje dvostrukog lanca nukleinske kiseline pomoću CRISPR/Cas9 kompleksa na drugim mestima u ciljnom genomu - takođe poznato kao cepanje van cilja. Pošto varijante nikaza Cas9 seku samo jedan lanac, da bi se stvorio dvostruki prekid, neophodno je da se par nikaza veže u neposrednoj blizini i na suprotnim lancima ciljne nukleinske kiseline, čime se stvara par zareza, što je ekvivalent dvostrukom prekidu. Ovo zahteva da se dve odvojene vodeće RNK - po jedna za svaku nikazu - moraju vezati u neposrednoj blizini i na suprotnim lancima ciljne nukleinske kiseline. Ovaj zahtev u suštini udvostručuje minimalnu dužinu homologije potrebnu za prekid dvostrukog lanca, čime se smanjuje verovatnoća da će se događaj cepanja dvostrukog lanca dogoditi negde drugde u genomu, gde je malo verovatno da će dva mesta vodeće RNK - ako postoje - biti dovoljno blizu jedno drugom da bi omogućila formiranje prekida dvostrukog lanca. Kao što je opisano u tehnici, nikaze se takođe mogu koristiti za pospešivanje HDR u odnosu na NHEJ. HDR se može koristiti za uvođenje odabranih promena u ciljna mesta u genomu upotrebom specifičnih donorskih sekvenci koje efikasno posreduju u željenim promenama.
[0181] Razmatrane mutacije mogu uključivati supstitucije, adicije i delecije ili bilo koju njihovu kombinaciju. Mutacija pretvara mutiranu amino-kiselinu u alanin. Mutacija pretvara mutiranu amino-kiselinu u drugu amino-kiselinu (npr. glicin, serin, treonin, cistein, valin, leucin, izoleucin, metionin, prolin, fenilalanin, tirozin, triptofan, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, asparagin, glutamin, histidin, lizin ili arginin). Mutacija pretvara mutiranu amino-kiselinu u neprirodnu amino-kiselinu (npr. selenometionin). Mutacija pretvara mutiranu amino-kiselinu u imitatore amino-kiselina (npr. fosfomimici). Mutacija može biti konzervativna mutacija. Na primer, mutacija pretvara mutiranu amino-kiselinu u amino-kiseline koje podsećaju na veličinu, oblik, naelektrisanje, polaritet, konformaciju i/ili rotamere mutiranih amino-kiselina (npr. mutacija cisteina/serina, mutacija lizina/asparagina, mutacija histidina/fenilalanina). Mutacija može izazvati pomeranje okvira za čitanje i/ili stvaranje prevremenog stop kodona. Mutacije mogu izazvati promene u regulatornim regionima gena ili lokusa koji utiču na ekspresiju jednog ili više gena.
[0183] Polipeptid usmeren ka mestu (npr. varijanta, mutirani, enzimski neaktivni i/ili uslovno enzimski neaktivni polipeptid usmeren ka mestu) može ciljati nukleinsku kiselinu. Polipeptid usmeren ka mestu (npr. varijanta, mutirana, enzimski neaktivna i/ili uslovno enzimski neaktivna endoribonukleaza) može ciljati DNK. Polipeptid usmeren ka mestu (npr. varijanta, mutirana, enzimski neaktivna i/ili uslovno enzimski neaktivna endoribonukleaza) može ciljati RNK.
[0185] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži jednu ili više nenativnih sekvenci (npr. polipeptid usmeren ka mestu je fuzioni protein).
[0187] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži amino-kiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje 15% identiteta amino-kiselina sa Cas9 iz bakterije (npr. s. pyogenes), domen za vezivanje nukleinske kiseline i dva domena za cepanje nukleinske kiseline (tj. HNH domen i RuvC domen).
[0188] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži amino-kiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje 15% identiteta amino-kiselina sa Cas9 iz bakterije (npr. s. pyogenes), i dva domena za cepanje nukleinskih kiselina (tj. HNH domen i RuvC domen).
[0190] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži amino-kiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje 15% identiteta amino-kiselina sa Cas9 iz bakterije (npr. s. pyogenes), i dva domena za cepanje nukleinskih kiselina, gde jedan ili oba domena za cepanje nukleinskih kiselina sadrže najmanje 50% identiteta amino-kiselina sa domenom nukleaze iz Cas9 iz bakterije (npr. s. pyogenes).
[0191] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži amino-kiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje 15% identiteta amino-kiselina sa Cas9 iz bakterije (npr. S. pyogenes), dva domena za cepanje nukleinskih kiselina (tj. HNH domen i RuvC domen) i nenativnu sekvencu (na primer, signal nuklearne lokalizacije) ili linker koji povezuje polipeptid usmeren ka mestu sa nenativnom sekvencom.
[0193] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži amino-kiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje 15% identiteta amino-kiselina sa Cas9 iz bakterije (npr. s. pyogenes), dva domena za cepanje nukleinskih kiselina (tj. HNH domen i RuvC domen), pri čemu polipeptid usmeren ka mestu sadrži mutaciju u jednom ili oba domena za cepanje nukleinskih kiselina koja smanjuje aktivnost cepanja nukleaznih domena za najmanje 50%.
[0195] Polipeptid usmeren ka mestu može da sadrži amino-kiselinsku sekvencu, koja sadrži najmanje 15% identiteta amino-kiselina sa Cas9 iz bakterije (npr. s. pyogenes), i dva domena za cepanje nukleinskih kiselina (tj. HNH domen i RuvC domen), pri čemu jedan od nukleaznih domena sadrži mutaciju asparaginske kiseline 10, i/ili pri čemu jedan od nukleaznih domena može da sadrži mutaciju histidina 840, i pri čemu mutacija smanjuje aktivnost cepanja nukleaznog(ih) domena(a) za najmanje 50%.
[0197] Jedan ili više polipeptida usmerenih ka mestu, npr. DNK endonukleaze, mogu da sadrže dve nikaze koje zajedno izazovu jedan dvolančani prekid na specifičnom lokusu u genomu, ili četiri nikaze koje zajedno izazovu dva dvolančana prekida na specifičnim lokusima u genomu. Alternativno, jedan polipeptid usmeren ka mestu, npr. DNK endonukleaza, može izazvati ili izazvati jedan dvolančani prekid na specifičnom lokusu u genomu.
[0199] Neograničavajući primeri Cas9 ortologa iz drugih bakterijskih sojeva uključuju, ali nisu ograničeni na, Cas proteine identifikovane u Acaryochloris marina MBIC11017; acetohalobium arabaticum DSM 5501; acidithiobacillus caldus; acidithiobacillusferrooxidans ATCC 23270; alicyclobacillus acidocaldarius LAA1; alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius DSM 446; allochromatium vinosum DSM 180; ammonifex degensii KC4; anabaena variabilis ATCC 29413; arthrospira maxima CS-328; arthrospira platensis str. paraca; arthrospira sp. PCC 8005; bacillus pseudomycoides DSM 12442; bacillus selenitireducens MLS10; burkholderiales bacterium 1_1_47; caldicelulosiruptor becscii DSM 6725; candidatus desulforudis audaxviator MP104C; caldicellulosiruptor hydrothermalis_108; clostridium phage c-st; clostridium botulinum A3 str. loch maree; clostridium botulinum Ba4 str.657; Clostridium difficile QCD-63q42; crocosphaera watsonii WH 8501; cyanothece sp. ATCC 51142; cyanothece sp. CCY0110; cyanothece sp. PCC 7424; cyanothece sp. PCC 7822; exiguobacterium sibiricum 255-15; finegoldia magna ATCC 29328; ktedonobacter racemifer DSM 44963; lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus PB2003/044-T3-4; lactobacillus salivarius ATCC 11741; listeria innocua; lyngbya sp. PCC 8106; marinobacter sp. ELB17; methanohalobium evestigatum Z-7303; microcystis phage Ma-LMM01; microcystis aeruginosa NIES-843; microscilla marina ATCC 23134; Microcoleus chthonoplastes PCC 7420; neisseria meningitidis; nitrosococcus halophilus Nc4; nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43111; nodularia spumigena CCY9414; nostoc sp. PCC 7120; oscillatoria sp. PCC 6506; pelotomaculum_thermopropionicum_SI; petrotoga mobilis SJ95; polaromonas naphthalenivorans CJ2; polaromonas sp. JS666; pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486; streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486; streptococcus thermophilus; streptomyces viridochromogenes DSM 40736; streptosporangium roseum DSM 43021; synechococcus sp. PCC 7335; i thermosipho africanus TCF52B (Chylinski et al., RNA Biol., 2013; 10(5): 726-737).
[0201] Pored Cas9 ortologa, druge Cas9 varijante kao što su fuzioni proteini neaktivnog dCas9 i efektorski domeni sa različitim funkcijama mogu poslužiti kao platforma za genetsku modulaciju. Bilo koji od gore navedenih enzima može biti koristan u predmetnom pronalasku.
[0203] Dalji primeri endonukleaza koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku dati su u SEQ ID NO: 1-620. Ovi proteini mogu biti modifikovani pre upotrebe ili mogu biti kodirani u sekvenci nukleinske kiseline kao što je DNK, RNK ili mRNK ili unutar vektorske konstrukcije kao što su plazmidi ili AAV vektori koji su ovde opisani. Dalje, mogu biti optimizovani po kodonima.
[0205] SEQ ID NO: 1-620 otkrivaju neiscrpnu listu endonukleaznih sekvenci.
[0207] Nukleinska kiselina usmerena na genom
[0209] Predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu usmerenu (koja cilja) na genom koja može da usmerava aktivnosti povezanog polipeptida (npr. polipeptid usmeren ka mestu) na specifičnu ciljnu sekvencu unutar ciljne nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina usmerena na genom može biti RNK. RNK usmerena na genom se ovde naziva „vodeća RNK“ ili „gRNK“. Vodeća RNK može da sadrži najmanje jednu sekvencu spejsera koja se hibridizuje sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline od interesa i CRISPR ponavljajuću sekvencu. U sistemima tipa II, gRNK takođe sadrži drugu RNK koja se naziva tracrRNK sekvenca. U vodećoj RNK tipa II (gRNK), CRISPR ponavljajuća sekvenca i tracrRNK sekvenca se hibridizuju jedna sa drugom da bi formirale dupleks. U vodećoj RNK tipa V (gRNK), crRNK formira dupleks. U oba sistema, dupleks može da se veže za polipeptid usmeren ka mestu, tako da vodeća RNK i polipeptid usmeren ka mestu formiraju kompleks. Nukleinska kiselina usmerena na genom može da obezbedi specifičnost cilja kompleksu zahvaljujući svojoj povezanosti sa polipeptidom usmerenim ka mestu. Nukleinska kiselina usmerena na genom stoga može da usmeri aktivnost polipeptida usmerenog ka mestu.
[0211] Primeri vodeće RNK uključuju sekvence spejsera u SEQ ID NO: 5305-125469 Liste sekvenci. Kao što je poznato stručnjaku u tehnici, svaka vodeća RNK može biti dizajnirana tako da uključuje sekvencu spejsera komplementarnu njenoj genomskoj ciljnoj sekvenci. Na primer, svaka od sekvenci spejsera u SEQ ID NO: 5305-125469 Liste sekvenci može biti stavljena u jednu RNK himeru ili crRNK (zajedno sa odgovarajućom tracrRNK). Videti Jinek et al., Science, 337, 816‑821 (2012) i Deltcheva et al., Nature, 471, 602‑607 (2011).
[0213] Nukleinska kiselina usmerena na genom može biti dvomolekulska vodeća RNK. Nukleinska kiselina usmerena na genom može biti jednomolekulska vodeća RNK.
[0215] Dvostruko-molekularna vodeća RNK može da sadrži dva lanca RNK. Prvi lanac sadrži, u smeru od 5’ do 3’, opcionu sekvencu za produženje spejsera, sekvencu spejsera i minimalnu CRISPR ponavljajuću sekvencu. Drugi lanac može da sadrži minimalnu tracrRNK sekvencu (komplementarnu minimalnoj CRISPR ponavljajućoj sekvenci ), 3’ tracrRNK sekvencu i opcionu sekvencu za produženje tracrRNK.
[0217] Jednomolekulska vodeća RNK (sgRNK) u sistemu tipa II može da sadrži, u smeru od 5’ do 3’, opcionu sekvencu za produženje spejsera, sekvencu spejsera, minimalnu CRISPR ponavljajuću sekvencu, jednomolekularni vodič linker, minimalnu tracrRNK sekvencu, 3’ tracrRNK sekvencu i opcionu tracrRNK sekvencu za produženje. Opciono tracrRNK produženje može da sadrži elemente koji doprinose dodatnoj funkcionalnosti (npr. stabilnosti) vodeće RNK. Jednomolekularni vodič linker može povezati minimalno CRISPR ponavljanje i minimalnu tracrRNK sekvencu da bi formirao strukturu ukosnica. Opciono tracrRNK produženje može da sadrži jednu ili više ukosnica.
[0218] sgRNK može da sadrži sekvencu spejsera od 20 nukleotida na 5’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži sekvencu spejsera manje od 20 nukleotida na 5’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži sekvencu spejsera od više od 20 nukleotida na 5’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži sekvencu spejsera promenljive dužine sa 17-30 nukleotida na 5’ kraju sgRNK sekvence (videti Tabelu 1).
[0220] SgRNK može da ne sadrži uracil na 3’ kraju sgRNK sekvence, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 125502 u Tabeli 1. SgRNK može da sadrži jedan ili više uracila na 3’ kraju sgRNK sekvence, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 125503 u Tabeli 1. Na primer, sgRNK može da sadrži 1 uracil (U) na 3’ kraju sgRNK sekvence. SgRNK može da sadrži 2 uracila (UU) na 3’ kraju sgRNK sekvence. SgRNK može da sadrži 3 uracila (UUU) na 3’ kraju sgRNK sekvence. SgRNK može da sadrži 4 uracila (UUUU) na 3’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži 5 uracila (UUUUU) na 3’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži 6 uracila (UUUUUU) na 3’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži 7 uracila (UUUUUUU) na 3’ kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da sadrži 8 uracila (UUUUUUUU) na 3’ kraju sgRNK sekvence.
[0222] sgRNK može biti nemodifikovana ili modifikovana. Na primer, modifikovane sgRNK mogu da sadrže jedan ili više 2’-O-metil fosforotioatnih nukleotida.
[0224] Tabela 1
[0226]
[0228] Jednomolekulska vodeća RNK (sgRNK) u sistemu tipa V može da sadrži, u smeru od 5’ do 3’, minimalnu CRISPR ponavljajuću sekvencu i sekvencu spejsera.
[0229] Na primer, vodeće RNK koje se koriste u CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistemu, ili druge manje RNK, mogu se lako sintetizovati hemijskim sredstvima, kao što je prikazano u daljem tekstu i opisano u tehnici. Iako se hemijski sintetički postupci stalno šire, prečišćavanje takvih RNK postupcima kao što je visokoefikasna tečna hromatografija (HPLC, koja izbegava upotrebu gelova kao što je PAGE) ima tendenciju da postane izazovnije kako se dužine polinukleotida značajno povećavaju preko stotinu nukleotida. Jedan pristup koji se koristi za generisanje RNK veće dužine jeste proizvodnja dva ili više molekula koji su ligirani zajedno. Mnogo duže RNK, kao što su one koje kodiraju Cas9 ili Cpfl endonukleazu, lakše se generišu enzimski. Različite vrste modifikacija RNK mogu se uvesti tokom ili nakon hemijske sinteze i/ili enzimskog generisanja RNK, npr. modifikacije koje poboljšavaju stabilnost, smanjuju verovatnoću ili stepen urođenog imunog odgovora i/ili poboljšavaju druge atribute, kao što je opisano u tehnici.
[0231] Sekvenca produžetka (ekstenzije) spejsera
[0233] U nekim primerima nukleinskih kiselina usmerenih na genom, sekvenca ekstenzije spejsera može da modifikuje aktivnost, obezbedi stabilnost i/ili obezbedi lokaciju za modifikacije nukleinske kiseline usmerene na genom. Sekvenca ekstenzije spejsera može da modifikuje aktivnost ili specifičnost na ili van cilja. U nekim primerima, može se obezbediti sekvenca ekstenzije spejsera. Sekvenca ekstenzije spejsera može imati dužinu veću od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 ili 7000 ili više nukleotida. Sekvenca ekstenzije spejsera može imati dužinu manju od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 ili više nukleotida. Sekvenca ekstenzije spejsera može biti kraća od 10 nukleotida. Sekvenca ekstenzije spejsera može biti dužine između 10-30 nukleotida. Sekvenca ekstenzije spejsera može biti dužine između 30-70 nukleotida.
[0235] Sekvenca ekstenzije spejsera može da sadrži drugi deo (npr. sekvencu za kontrolu stabilnosti, sekvencu za vezivanje endoribonukleaze, ribozim). Deo može smanjiti ili povećati stabilnost nukleinske kiseline koja cilja nukleinsku kiselinu. Deo može biti segment terminatora transkripcije (tj. sekvenca za terminaciju transkripcije). Deo može da funkcioniše u eukariotskoj ćeliji. Deo može da funkcioniše u prokariotskoj ćeliji. Deo može da funkcioniše i u eukariotskim i u prokariotskim ćelijama. Neograničavajući primeri pogodnih delova uključuju: 5’ kapu (npr. 7 metilguanilatna kapa (m7 G)), sekvencu riboprekidača (npr. da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i proteinskim kompleksima), sekvencu koja formira dupleks dsRNK (tj. ukosnicu), sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr. jedro, mitohondrije, hloroplasti i slično), modifikaciju ili sekvencu koja omogućava praćenje (npr. direktna konjugacija sa fluorescentnim molekulom, konjugacija sa delom koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentnu detekciju itd.), i/ili modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histonske acetiltransferaze, histonske deacetilaze i slično).
[0237] Sekvenca spejsera
[0239] Sekvenca spejsera se hibridizuje sa sekvencom u ciljnoj nukleinskoj kiselini od interesa. Spejser nukleinske kiseline usmerene na genom može da interaguje sa ciljnom nukleinskom kiselinom na način specifičan za sekvencu putem hibridizacije (tj. uparivanje baza). Nukleotidna sekvenca spejsera može da varira u zavisnosti od sekvence ciljne nukleinske kiseline od interesa.
[0241] U CRISPR/Cas sistemu ovde, sekvenca spejsera može biti dizajnirana da se hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom koja se nalazi 5’ od PAM enzima Cas9 koji se koristi u sistemu. Spejser može savršeno da se podudara sa ciljnom sekvencom ili može imati neusklađenosti. Svaki Cas9 enzim ima određenu PAM sekvencu koju prepoznaje u ciljnoj DNK. Na primer, s. pyogenes prepoznaje u ciljnoj nukleinskoj kiselini PAM koji sadrži sekvencu 5’-NRG-3’, gde R sadrži ili A ili G, gde je N bilo koji nukleotid, a N je neposredno 3’ od ciljne sekvence nukleinske kiseline na koju cilja sekvenca spejsera.
[0243] Ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da sadrži 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može da sadrži manje od 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može da sadrži više od 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može da sadrži najmanje: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ili više nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može da sadrži najviše: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ili više nukleotida. Ciljna sekvenca nukleinske kiseline može da sadrži 20 baza neposredno 5’ od prvog nukleotida PAM-a. Na primer, u sekvenci koja obuhvata 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3’ (SEQ ID NO: 125500), ciljna nukleinska kiselina može da obuhvati sekvencu koja odgovara Ns, pri čemu je N bilo koji nukleotid, a podvučena NRG sekvenca je s. pyogenes PAM. Ova ciljna sekvenca nukleinske kiseline se često naziva PAM lanac, a komplementarna sekvenca nukleinske kiseline se često naziva ne-PAM lanac. Stručnjak u tehnici će prepoznati da se sekvenca spejsera hibridizuje sa ne-PAM lancem ciljne nukleinske kiseline (Slike 1A i 1B).
[0245] Sekvenca spejsera koja se hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom može imati dužinu od najmanje oko 6 nukleotida (nt). Sekvenca spejsera može biti najmanje oko 6 nt, najmanje oko 10 nt, najmanje oko 15 nt, najmanje oko 18 nt, najmanje oko 19 nt, najmanje oko 20 nt, najmanje oko 25 nt, najmanje oko 30 nt, najmanje oko 35 nt ili najmanje oko 40 nt, od oko 6 nt do oko 80 nt, od oko 6 nt do oko 50 nt, od oko 6 nt do oko 45 nt, od oko 6 nt do oko 40 nt, od oko 6 nt do oko 35 nt, od oko 6 nt do oko 30 nt, od oko 6 nt do oko 25 nt, od oko 6 nt do oko 20 nt, od oko 6 nt do oko 19 nt, od oko 10 nt do oko 50 nt, od oko 10 nt do oko 45 nt, od oko 10 nt do oko 40 nt, od oko 10 nt do oko 35 nt, od oko 10 nt do oko 30 nt, od oko 10 nt do oko 25 nt, od oko 10 nt do oko 20 nt, od oko 10 nt do oko 19 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt ili od oko 20 nt do oko 60 nt. U nekim primerima, sekvenca spejsera može da sadrži 20 nukleotida. U nekim primerima, spejser može da sadrži 19 nukleotida. U nekim primerima, spejser može da sadrži 18 nukleotida. U nekim primerima, spejser može da sadrži 22 nukleotida.
[0247] U nekim primerima, procenat komplementarnosti između sekvence spejsera i ciljne nukleinske kiseline je najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100%. U nekim primerima, procenat komplementarnosti između sekvence spejsera i ciljne nukleinske kiseline je najviše oko 30%, najviše oko 40%, najviše oko 50%, najviše oko 60%, najviše oko 65%, najviše oko 70%, najviše oko 75%, najviše oko 80%, najviše oko 85%, najviše oko 90%, najviše oko 95%, najviše oko 97%, najviše oko 98%, najviše oko 99% ili 100%. U nekim primerima, procenat komplementarnosti između sekvence spejsera i ciljne nukleinske kiseline je 100% na šest susednih 5’-krajnjih nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Procenat komplementarnosti između sekvence spejsera i ciljne nukleinske kiseline može biti najmanje 60% na oko 20 susednih nukleotida. Dužina sekvence spejsera i ciljne nukleinske kiseline mogu se razlikovati za 1 do 6 nukleotida, što se može smatrati ispupčenjem ili ispupčenjima.
[0249] Sekvenca spejser može biti dizajnirana ili odabrana pomoću računarskog programa. Računarski program može koristiti promenljive, kao što su predviđena temperatura topljenja, formiranje sekundarne strukture, predviđena temperatura žarenja, identitet sekvence, genomski kontekst, pristupačnost hromatina, % GC, učestalost genomskog pojavljivanja (npr. sekvenci koje su identične ili slične, ali variraju na jednom ili više mesta kao rezultat neusklađenosti, insercije ili delecije), status metilacije, prisustvo SNP i slično.
[0251] Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca
[0253] U nekim aspektima, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca je sekvenca sa najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% identiteta sekvence sa referentnom CRISPR ponavljajućom sekvencom (npr. cRNK iz s. pyogenes).
[0255] U nekim aspektima, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca sadrži nukleotide koji se mogu hibridizovati sa minimalnom tracrRNK sekvencom u ćeliji. Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca i minimalna tracrRNK sekvenca mogu formirati dupleks, tj. dvolančanu strukturu sa uparenim bazama. Zajedno, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca i minimalna tracrRNK sekvenca mogu se vezati za polipeptid usmeren ka mestu. Barem deo minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence može se hibridizovati sa minimalnom tracrRNK sekvencom. Barem deo minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence može činiti najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% komplementarnosti minimalnoj tracrRNK sekvenci. U nekim aspektima, barem deo minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence obuhvata najviše oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% komplementarnosti minimalnoj tracrRNK sekvenci.
[0257] Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može imati dužinu od oko 7 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, dužina minimalne CRISPR sekvence ponavljanja je od oko 7 nukleotida (nt) do oko 50 nt, od oko 7 nt do oko 40 nt, od oko 7 nt do oko 30 nt, od oko 7 nt do oko 25 nt, od oko 7 nt do oko 20 nt, od oko 7 nt do oko 15 nt, od oko 8 nt do oko 40 nt, od oko 8 nt do oko 30 nt, od oko 8 nt do oko 25 nt, od oko 8 nt do oko 20 nt, od oko 8 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt, ili od oko 15 nt do oko 25 nt. U nekim aspektima, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca je dužine približno 9 nukleotida. U nekim aspektima, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca je dužine približno 12 nukleotida.
[0259] Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može biti najmanje oko 60% identična referentnoj minimalnoj CRISPR ponavljajućoj sekvenci (npr. divljeg tipa crRNK iz s. pyogenes) tokom niza od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida. Na primer, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može biti najmanje oko 65% identična, najmanje oko 70% identična, najmanje oko 75% identična, najmanje oko 80% identična, najmanje oko 85% identična, najmanje oko 90% identična, najmanje oko 95% identična, najmanje oko 98% identična, najmanje oko 99% identična ili 100% identična referentnoj minimalnoj CRISPR ponavljajućoj sekvenci tokom niza od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida.
[0261] Minimalna tracrRNK sekvenca
[0263] Minimalna tracrRNK sekvenca može biti sekvenca sa najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% identiteta sekvence sa referentnom tracrRNK sekvencom (npr. divlji tip TracrRNK iz s. pyogenes).
[0265] Minimalna tracrRNK sekvenca može da sadrži nukleotide koji se hibridizuju sa minimalnom CRISPR ponavljajućom sekvencom u ćeliji. Minimalna tracrRNK sekvenca i minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca formiraju dupleks, tj. dvolančana struktura sa uparenim bazama. Zajedno, minimalna tracrRNK sekvenca i minimalno CRISPR ponavljanje mogu se vezati za polipeptid usmeren ka mestu. Barem deo minimalne tracrRNK sekvence može se hibridizovati sa minimalnom CRISPR sekvencom ponavljanja. Minimalna tracrRNK sekvenca može biti najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% komplementarna minimalnoj CRISPR ponavljajućoj sekvenci.
[0267] Minimalna sekvenca tracrRNK može imati dužinu od oko 7 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, minimalna sekvenca tracrRNK može biti od oko 7 nukleotida (nt) do oko 50 nt, od oko 7 nt do oko 40 nt, od oko 7 nt do oko 30 nt, od oko 7 nt do oko 25 nt, od oko 7 nt do oko 20 nt, od oko 7 nt do oko 15 nt, od oko 8 nt do oko 40 nt, od oko 8 nt do oko 30 nt, od oko 8 nt do oko 25 nt, od oko 8 nt do oko 20 nt, od oko 8 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt dužine. Minimalna sekvenca TracrRNK može biti približno 9 nukleotida. Minimalna sekvenca TracrRNK može biti približno 12 nukleotida. Minimalna TracrRNK može se sastojati od TracrRNK nt 23-48 opisanih u Jinek et al., supra.
[0269] Minimalna sekvenca tracrRNK može biti najmanje oko 60% identična referentnoj minimalnoj tracrRNK (npr. divlji tip, tracrRNK iz s. pyogenes) sekvenci tokom dela od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida. Na primer, minimalna sekvenca tracrRNK može biti najmanje oko 65% identična, oko 70% identična, oko 75% identična, oko 80% identična, oko 85% identična, oko 90% identična, oko 95% identična, oko 98% identična, oko 99% identična ili 100% identična referentnoj minimalnoj tracrRNK sekvenci tokom dela od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida.
[0270] Dupleks između minimalne CRISPR RNK i minimalne tracrRNK može da sadrži dvostruku spiralu. Dupleks između minimalne CRISPR RNK i minimalne tracrRNK može da sadrži najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotida. Dupleks između minimalne CRISPR RNK i minimalne tracrRNK može da sadrži najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotida.
[0271] Dupleks može da sadrži neusklađenost (tj. dva lanca dupleksa nisu 100% komplementarna). Dupleks može da sadrži najmanje oko 1, 2, 3, 4 ili 5 neusklađenosti. Dupleks može da sadrži najviše oko 1, 2, 3, 4 ili 5 neusklađenosti. Dupleks može da sadrži ne više od 2 neusklađenosti.
[0273] Ispupčenja
[0275] U nekim slučajevima, može postojati „ispupčenje“ u dupleksu između minimalne CRISPR RNK i minimalne tracrRNK. Ispupčenje je neupareni region nukleotida unutar dupleksa. Ispupčenje može doprineti vezivanju dupleksa za polipeptid usmeren ka mestu. Ispupčenje može da sadrži, na jednoj strani dupleksa, neupareni 5’-XXXY-3’ gde je X bilo koji purin, a Y sadrži nukleotid koji može da formira kolebajući par sa nukleotidom na suprotnom lancu, i neupareni nukleotidni region na drugoj strani dupleksa. Broj neuparenih nukleotida na dve strane dupleksa može biti različit.
[0276] U jednom primeru, ispupčenje može da sadrži nespareni purin (npr. adenin) na minimalnom lancu CRISPR ponavljanja ispupčenja. U nekim primerima, ispupčenje može da sadrži neupareni 5’-AAGY-3’ minimalnog lanca tracrRNK sekvence ispupčenja, gde Y sadrži nukleotid koji može da formira uparivanje sa nukleotidom na minimalnom lancu CRISPR ponavljanja.
[0277] Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnim CRISPR ponavljanjem može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više neuparenih nukleotida. Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnim CRISPR ponavljanjem može da sadrži najviše 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više neuparenih nukleotida. Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnim CRISPR ponavljanjem može da sadrži 1 neupareni nukleotid.
[0278] Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom tracRNK sekvencom može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više neuparenih nukleotida. Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom tracRNK sekvencom može da sadrži najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više neuparenih nukleotida. Ispupčenje na drugoj strani dupleksa (npr. minimalna strana tracrRNK sekvence dupleksa) može da sadrži 4 neuparena nukleotida.
[0280] Ispupčenje može da sadrži najmanje jedno Wobble-ovo uparivanje. U nekim primerima, ispupčenje može da sadrži najviše jedno Wobble-ovo uparivanje. Ispupčenje može da sadrži najmanje jedan purinski nukleotid. Ispupčenje može da sadrži najmanje 3 purinska nukleotida. Sekvenca ispupčenja može da sadrži najmanje 5 purinskih nukleotida. Sekvenca ispupčenja može da sadrži najmanje jedan gvaninski nukleotid. U nekim primerima, sekvenca ispupčenja može da sadrži najmanje jedan adeninski nukleotid.
[0282] Ukosnice
[0284] U različitim primerima, jedna ili više ukosnica mogu biti locirane 3’ od minimalne tracrRNK u 3’ tracrRNK sekvenci.
[0286] Ukosnica može početi najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više nukleotida 3’ od poslednjeg uparenog nukleotida u dupleksu minimalnog CRISPR ponavljanja i minimalne tracrRNK sekvence. Ukosnica može početi najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotida 3’ od poslednjeg uparenog nukleotida u dupleksu minimalnog CRISPR ponavljanja i minimalne tracrRNK sekvence.
[0288] Ukosnica može da sadrži najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više uzastopnih nukleotida. Ukosnica može da sadrži najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili više uzastopnih nukleotida.
[0290] Ukosnica može da sadrži CC dinukleotid (tj. dva uzastopna citozinska nukleotida).
[0291] Ukosnica može da sadrži dupleksirane nukleotide (npr. nukleotide u ukosnici, hibridizovani zajedno). Na primer, ukosnica može da sadrži CC dinukleotid koji je hibridizovan sa GG dinukleotidom u dupleksu ukosnica 3’ tracrRNK sekvence.
[0293] Jedna ili više ukosnica mogu da interaguju sa regionima polipeptida usmerenog ka mestu koji interaguju sa vodećom RNK.
[0295] U nekim primerima postoje dve ili više ukosnica, a u drugim primerima tri ili više ukosnica.
[0297] 3’ TracrRNK sekvenca
[0299] 3’ TracrRNK sekvenca može da sadrži sekvencu sa najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% identiteta sekvence sa referentnom TracrRNK sekvencom (npr. TracrRNK iz s. pyogenes).
[0301] 3’ tracrRNK sekvenca može imati dužinu od oko 6 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, 3’ TracrRNK sekvenca može imati dužinu od oko 6 nukleotida (nt) do oko 50 nt, od oko 6 nt do oko 40 nt, od oko 6 nt do oko 30 nt, od oko 6 nt do oko 25 nt, od oko 6 nt do oko 20 nt, od oko 6 nt do oko 15 nt, od oko 8 nt do oko 40 nt, od oko 8 nt do oko 30 nt, od oko 8 nt do oko 25 nt, od oko 8 nt do oko 20 nt, od oko 8 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt, ili od oko 15 nt do oko 25 nt.3’ tracrRNK sekvenca može imati dužinu od približno 14 nukleotida.
[0303] 3’ tracrRNK sekvenca može biti najmanje oko 60% identična referentnoj 3’ TracrRNK sekvenci (npr. sekvenca divljeg tipa 3’ tracrRNK iz s. pyogenes) preko dela od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida. Na primer, 3’ TracrRNK sekvenca može biti najmanje oko 60% identična, oko 65% identična, oko 70% identična, oko 75% identična, oko 80% identična, oko 85% identična, oko 90% identična, oko 95% identična, oko 98% identična, oko 99% identična ili 100% identična referentnoj 3’ tracrRNK sekvenci (npr. sekvenca divljeg tipa 3’ tracrRNK iz s. pyogenes) tokom niza od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida.
[0305] 3’ tracrRNK sekvenca može da sadrži više od jednog dupleksiranog regiona (npr. ukosnica, hibridizovani region). 3’ tracrRNK sekvenca može da sadrži dva dupleksirana regiona.
[0307] 3’ tracrRNK sekvenca može da sadrži strukturu matične petlje. Struktura matične petlje u 3’ tracrRNK može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više nukleotida. Struktura matične petlje u 3’ tracrRNK može da sadrži najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotida. Struktura matične petlje može da sadrži funkcionalni deo. Na primer, struktura matične petlje može da sadrži aptamer, ribozim, ukosnicu koja interaguje sa proteinima, CRISPR niz, intron ili ekson. Struktura matične petlje može da sadrži najmanje oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih delova. Struktura matične petlje može da sadrži najviše oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih delova.
[0308] Ukosnica u 3’ tracrRNK sekvenci može da sadrži P-domen. U nekim primerima, P-domen može da sadrži dvolančani region u ukosnici.
[0310] Sekvenca ekstenzije tracrRNK
[0312] Sekvenca ekstenzije tracrRNK može biti obezbeđena bez obzira da li je tracrRNK u kontekstu vodiča sa jednim molekulom ili vodiča sa dva molekula. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može imati dužinu od oko 1 nukleotida do oko 400 nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može imati dužinu veću od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380 ili 400 nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može imati dužinu od oko 20 do oko 5000 ili više nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može imati dužinu veću od 1000 nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može imati dužinu manju od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 ili više nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može imati dužinu manju od 1000 nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može sadržati manje od 10 nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može biti dužine 10-30 nukleotida. Sekvenca ekstenzije tracrRNK može biti dužine 30-70 nukleotida.
[0314] Sekvenca ekstenzije tracrRNK može da sadrži funkcionalni deo (npr. sekvenca za kontrolu stabilnosti, ribozim, sekvenca za vezivanje endoribonukleaze). Funkcionalni deo može da sadrži segment terminatora transkripcije (tj. sekvenca za terminaciju transkripcije). Funkcionalni deo može imati ukupnu dužinu od oko 10 nukleotida (nt) do oko 100 nukleotida, od oko 10 nt do oko 20 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 30 nt do oko 40 nt, od oko 40 nt do oko 50 nt, od oko 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do oko 90 nt, ili od oko 90 nt do oko 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt, ili od oko 15 nt do oko 25 nt. Funkcionalni deo može funkcionisati u eukariotskoj ćeliji. Funkcionalni deo može funkcionisati u prokariotskoj ćeliji. Funkcionalni deo može funkcionisati i u eukariotskim i u prokariotskim ćelijama.
[0315] Neograničavajući primeri odgovarajućih funkcionalnih delova za produženje tracrRNK uključuju 3’ poli-adenilovani rep, sekvencu riboprekidača (npr. da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i proteinskim kompleksima), sekvenca koja formira dupleks dsRNK (tj. ukosnica), sekvenca koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr. jedro, mitohondrije, hloroplasti i slično), modifikacija ili sekvenca koja omogućava praćenje (npr. direktna konjugacija sa fluorescentnim molekulom, konjugacija sa delom koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvenca koja omogućava fluorescentnu detekciju, itd.) i/ili modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histonske acetiltransferaze, histonske deacetilaze i slično). Sekvenca ekstenzije tracrRNK može da sadrži mesto vezivanja prajmera ili molekularni indeks (npr. sekvenca barkoda). Sekvenca ekstenzije tracrRNK može da sadrži jednu ili više afinitetnih oznaka.
[0317] Sekvenca jednomolekulskog linkera vodiča
[0319] Linkerska sekvenca jednomolekulske vodič nukleinske kiseline može imati dužinu od oko 3 nukleotida do oko 100 nukleotida. Jinek et al., supra, na primer, korišćena je jednostavna „tetrapetlja“ od 4 nukleotida (-GAAA-), Science, 337(6096):816‑821 (2012). Ilustrativni linker ima dužinu od oko 3 nukleotida (nt) do oko 90 nt, od oko 3 nt do oko 80 nt, od oko 3 nt do oko 70 nt, od oko 3 nt do oko 60 nt, od oko 3 nt do oko 50 nt, od oko 3 nt do oko 40 nt, od oko 3 nt do oko 30 nt, od oko 3 nt do oko 20 nt, od oko 3 nt do oko 10 nt. Na primer, linker može imati dužinu od oko 3 nt do oko 5 nt, od oko 5 nt do oko 10 nt, od oko 10 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 20 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 25 nt do oko 30 nt, od oko 30 nt do oko 35 nt, od oko 35 nt do oko 40 nt, od oko 40 nt do oko 50 nt, od oko 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do oko 90 nt, ili od oko 90 nt do oko 100 nt. Linker vodič jednomolekulske nukleinske kiseline može biti između 4 i 40 nukleotida. Linker može biti najmanje oko 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 ili 7000 ili više nukleotida. Linker može biti najviše oko 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 ili 7000 ili više nukleotida.
[0321] Linkeri mogu da sadrže bilo koju od različitih sekvenci, mada u nekim primerima linker neće obuhvatati sekvence koje imaju opsežne regione homologije sa drugim delovima vodeće RNK, što bi moglo da izazove intramolekularno vezivanje koje bi moglo da ometa druge funkcionalne regione vodiča. Kod Jinek et al., supra, korišćena je jednostavna sekvenca od 4 nukleotida -GAAA-, Science, 337(6096):816‑821 (2012), ali se mogu koristiti i brojne druge sekvence, uključujući i duže sekvence.
[0323] Linker sekvenca može da sadrži funkcionalnu grupu. Na primer, linker sekvenca može da sadrži jednu ili više karakteristika, uključujući aptamer, ribozim, ukosnicu koja interaguje sa proteinima, mesto vezivanja proteina, CRISPR niz, intron ili ekson. Linker sekvenca može da sadrži najmanje oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih grupa. U nekim primerima, linker sekvenca može da sadrži najviše oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih grupa.
[0325] Modifikacije nukleinskih kiselina (hemijske i strukturne modifikacije)
[0327] U nekim aspektima, polinukleotidi uvedeni u ćelije mogu da sadrže jednu ili više modifikacija koje se mogu koristiti pojedinačno ili u kombinaciji, na primer, za poboljšanje aktivnosti, stabilnosti ili specifičnosti, izmenu isporuke, smanjenje urođenih imunih odgovora u ćelijama domaćina ili za druga poboljšanja, kao što je dalje opisano ovde i poznato u tehnici.
[0329] U određenim primerima, modifikovani polinukleotidi mogu se koristiti u CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistemu, u kom slučaju se vodeće RNK (bilo jednomolekulski ili dvomolekulski vodiči) i/ili DNK ili RNK koja kodira Cas9 ili Cpfl endonukleazu uvedenu u ćeliju mogu modifikovati, kao što je opisano i prikazanu u daljem tekstu. Takvi modifikovani polinukleotidi mogu se koristiti u CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistemu za uređivanje bilo jednog ili više genomskih lokusa.
[0331] Koristeći CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistem u svrhu neograničavajućih ilustracija takvih upotreba, modifikacije vodećih RNK mogu se koristiti za poboljšanje formiranja ili stabilnosti CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 kompleksa za uređivanje genoma koji sadrži vodeće RNK, koje mogu biti jednomolekulski ili dvomolekulski vodiči, i Cas9 ili Cpfl endonukleazu. Modifikacije vodiča RNK mogu se, takođe, ili alternativno koristiti za poboljšanje inicijacije, stabilnosti ili kinetike interakcija između kompleksa za uređivanje genoma sa ciljnom sekvencom u genomu, što se može koristiti, na primer, za poboljšanje aktivnosti na cilju. Modifikacije vodeće RNK mogu se takođe ili alternativno koristiti za poboljšanje specifičnosti, npr. relativne stope uređivanja genoma na ciljanom mestu u poređenju sa efektima na drugim (vanciljnim) mestima.
[0332] Modifikacije se, takođe, mogu ili alternativno koristiti za povećanje stabilnosti vodeće RNK, npr. povećavanjem njegove otpornosti na razgradnju ribonukleazama (RNazama) prisutnim u ćeliji, čime se povećava njen poluživot u ćeliji. Modifikacije koje povećavaju poluživot vodeće RNK mogu biti posebno korisne u aspektima u kojima se Cas9 ili Cpf1 endonukleaza uvodi u ćeliju radi uređivanja putem RNK koja treba da se translira da bi se generisala endonukleaza, jer se povećanje poluživota vodiča RNK uvedenih istovremeno sa RNK koja kodira endonukleazu može koristiti za povećanje vremena koegzistiranja vodiča RNK i kodirane Cas9 ili Cpfl endonukleaze u ćeliji.
[0333] Modifikacije se takođe ili alternativno mogu koristiti za smanjenje verovatnoće ili stepena u kome RNK unete u ćelije izazivaju urođene imune odgovore. Takvi odgovori, koji su dobro okarakterisani u kontekstu RNK interferencije (RNKi), uključujući male interferirajuće RNK (siRNK), kao što je opisano u nastavku i u tehnici, imaju tendenciju da budu povezani sa smanjenim poluživotom RNK i/ili izazivanjem citokina ili drugih faktora povezanih sa imunim odgovorima.
[0335] Jedna ili više vrsta modifikacija mogu se takođe napraviti na RNK koje kodiraju endonukleazu i koje se unose u ćeliju, uključujući, bez ograničenja, modifikacije koje poboljšavaju stabilnost RNK (kao što je povećanje njene razgradnje pomoću RNaza prisutnih u ćeliji), modifikacije koje poboljšavaju translaciju rezultujućeg proizvoda (tj. endonukleaza) i/ili modifikacije koje smanjuju verovatnoću ili stepen u kome RNK unete u ćelije izazivaju urođene imune odgovore.
[0337] Kombinacije modifikacija, kao što su gore navedene i druge, takođe se mogu koristiti. U slučaju CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1, na primer, jedna ili više vrsta modifikacija mogu se napraviti da bi se usmerile RNK (uključujući one koje su gore navedene kao primeri), i/ili jedna ili više vrsta modifikacija mogu se napraviti na RNK koje kodiraju Cas endonukleazu (uključujući one koje su gore navedene kao primeri).
[0339] Na primer, vodeće RNK koje se koriste u CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistemu, ili druge manje RNK, mogu se lako sintetizovati hemijskim sredstvima, što omogućava lako ugradnju brojnih modifikacija, kao što je prikazano u daljem tekstu i opisano u tehnici. Iako se hemijski sintetički postupci stalno šire, prečišćavanje takvih RNK postupcima kao što je visokoefikasna tečna hromatografija (HPLC, koja izbegava upotrebu gelova kao što je PAGE) ima tendenciju da postane sve izazovnije kako se dužine polinukleotida značajno povećavaju preko stotinu nukleotida. Jedan pristup koji se može koristiti za generisanje hemijski modifikovanih RNK veće dužine jeste proizvodnja dva ili više molekula koji su ligirani zajedno. Mnogo duže RNK, kao što su one koje kodiraju Cas9 endonukleazu, lakše se generišu enzimski. Iako je manje vrsta modifikacija dostupno za upotrebu u enzimski proizvedenim RNK, i dalje postoje modifikacije koje se mogu koristiti da se, npr. poboljša stabilnost, smanji verovatnoća ili stepen urođenog imunog odgovora i/ili poboljšaju drugi atributi, kao što je detaljnije opisano u nastavku i u tehnici; i redovno se razvijaju nove vrste modifikacija.
[0341] Kao ilustracija različitih tipova modifikacija, posebno onih koje se često koriste sa manjim hemijski sintetizovanim RNK, modifikacije mogu obuhvatiti jedan ili više nukleotida modifikovanih na 2’ poziciji šećera, u nekim aspektima 2’-O-alkil, 2’-O-alkil-O-alkil ili 2’-fluoromodifikovani nukleotid. U nekim primerima, modifikacije RNK uključuju 2’-fluoro, 2’-amino ili 2’-O-metil modifikacije na ribozi pirimidina, abazne ostatke ili invertovanu bazu na 3’ kraju RNK. Takve modifikacije se rutinski ugrađuju u oligonukleotide i pokazalo se da ovi oligonukleotidi imaju viši Tm (tj. veći afinitet vezivanja za metu) nego 2’-deoksioligonukleotidi prema datoj meti.
[0342] Pokazano je da brojne modifikacije nukleotida i nukleozida čine oligonukleotid u koji su ugrađeni otpornijim na varenje nukleazama nego prirodni oligonukleotid; ovi modifikovani oligonukleotidi preživljavaju netaknuti duže vreme od nemodifikovanih oligonukleotida. Specifični primeri modifikovanih oligonukleotida uključuju one koji sadrže modifikovane osnovne linije, na primer, fosforotioate, fosfotriestre, metil fosfonate, kratkolančane alkil ili cikloalkil međušećerne veze ili kratkolančane heteroatomske ili heterociklične međušećerne veze. Neki oligonukleotidi su oligonukleotidi sa fosforotioatnim osnovnim lancima i oni sa heteroatomskim osnovnim lancima, posebno CH<2>-NH-O-CH<2>, CH,~N(CH<3>)~O~CH<2>(poznat kao metilen(metilimino) ili MMI kičma), CH<2>-O-N (CH<3>)-CH<2>, CH<2>-N (CH<3>)-N (CH<3>)-CH<2>i O-N (CH<3>)- CH<2>-CH<2>kičme, pri čemu je nativna fosfodiesterska kičma predstavljena kao O- P- O- CH,); amidne kičme [videti De Mesmaeker et al., Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995)]; strukture morfolinskog skeleta (videti Summerton and Weller, U.S. Patent No. 5,034,506); peptidni nukleinski kiselinski (PNK) skelet (pri čemu je fosfodiesterski skelet oligonukleotida zamenjen poliamidnim skeletom, pri čemu su nukleotidi direktno ili indirektno vezani za aza atome azota poliamidnog skeleta, videti Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497). Veze koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničene na, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate koji sadrže 3’-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate koji sadrže 3’-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate sa normalnim 3’-5’ vezama, 2’-5’ povezanim analogima ovih veza, i one sa invertovanom polarnošću gde su susedni parovi nukleozidnih jedinica povezani 3’-5’ sa 5’-3’ ili 2’-5’ sa 5’-2’; videti U.S. Patente br.3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; i 5,625,050.
[0344] Oligomerna jedinjenja na bazi morfolina su opisana u Braasch and David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, Volume 30, Issue 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Nasevicius et al., Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000); i U.S. Patentu br.5,034,506, izdatom 23. jula 1991.
[0346] Mimetici cikloheksenil nukleinskih kiselina oligonukleotida su opisani Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000).
[0348] Modifikovani oligonukleotidni skeleti koji ne uključuju atom fosfora imaju skelete koji su formirani kratkim alkil ili cikloalkil internukleozidnim vezama, mešovitim heteroatomima i alkil ili cikloalkil internukleozidnim vezama, ili jednom ili više kratkih heteroatomskih ili heterocikličnih internukleozidnih veza. To obuhvata one koji imaju morfolino veze (delimično formirane od šećernog dela nukleozida); siloksanske skelete; sulfidne, sulfoksidne i sulfonske skelete; formacetilne i tioformacetilne skelete; metilen formacetilne i tioformacetilne skelete; skelete koji sadrže alkene; sulfamatne skelete; metilenimino i metilenhidrazino skelete; sulfonatne i sulfonamidne skelete; amidne skelete; i druge koji imaju mešovite N, O, S, i CH<2>sastavne delove; videti U.S. Patente br.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i 5,677,439.
[0350] Takođe mogu biti uključeni jedan ili više supstituisanih šećernih ostataka, npr. jedno od sledećeg na 2’ poziciji: OH, SH, SCH<3>, F, OCN, OCH<3>OCH<3>, OCH<3>O(CH<2>)n CH<3>, O(CH<2>)n NH<2>, or O(CH<2>)n CH<3>, pri čemu je n od 1 do oko 10; C1 do C10 niži alkil, alkoksialkoksi, supstituisani niži alkil, alkaril ili aralkil; Cl; Br; CN; CF<3>; OCF<3>; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; SOCH<3>; SO<2>CH<3>; ONO<2>; NO<2>; N<3>; NH<2>; heterocikloalkil; heterocikloalkaril; aminoalkilamino; polialkilamino; supstituisani silil; grupa za cepanje RNK; reporterska grupa; interkalator; grupa za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava oligonukleotida; ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava oligonukleotida i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. U nekim aspektima, modifikacija uključuje 2’-metoksietoksi (2’--O-CH<2>CH<2>OCH<3>, takođe poznat kao 2’-O-(2-metoksietil)) (Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486). Druge modifikacije uključuju 2’-metoksi (2’-O-CH<3>), 2’-propoksi (2’-OCH<2>CH<2>CH<3>) i 2’-fluoro (2’-F). Slične modifikacije mogu se napraviti i na drugim pozicijama oligonukleotida, posebno na 3’ poziciji šećera na 3’ terminalnom nukleotidu i 5’ poziciji 5’ terminalnog nukleotida. Oligonukleotidi, takođe, mogu imati mimetike šećera, kao što su ciklobutili umesto pentofuranozil grupe.
[0352] U nekim primerima, i šećerna i internukleozidna veza, tj. kičma, nukleotidnih jedinica može se zameniti novim grupama. Bazne jedinice mogu se zadržati za hibridizaciju sa odgovarajućim ciljnim jedinjenjem nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, mimetik oligonukleotida za koji je pokazano da ima odlična svojstva hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNK). U PNK jedinjenjima, šećerna kičma oligonukleotida može se zameniti kičmom koja sadrži amid, na primer, aminoetilglicinskom kičmom. Nukleobaze se mogu zadržati i direktno ili indirektno vezati za aza atome azota amidnog dela okosnice. Reprezentativni američki patenti koji uče o pripremi PNK jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, U.S. Patente br.
[0353] 5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dalja učenja o PNK jedinjenjima mogu se naći u Nielsen et al, Science, 254: 1497-1500 (1991).
[0355] Vodeće RNK mogu takođe da uključuju, dodatno ili alternativno, modifikacije ili supstitucije nukleobaza (često se u tehnici nazivaju jednostavno „baza“). Kako se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju adenin (A), guanin (G), timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju nukleobaze koje se retko ili prolazno nalaze u prirodnim nukleinskim kiselinama, npr. hipoksantin, 6-metiladenin, 5-Me pirimidini, posebno 5-metilcitozin (takođe poznat kao 5-metil-2’ deoksicitozin i često u tehnici kao 5-Me-C), 5-hidroksimetilcitozin (HMC), glikozil HMC i gentobiozil HMC, kao i sintetičke nukleobaze, npr.
[0356] 2-aminoadenin, 2-(metilamino)adenin, 2-(imidazolilalkil)adenin, 2-(aminoalkilamino)adenin ili drugi heterosupstituisani alkiladenini, 2-tiouracil, 2-tiotimin, 5-bromouracil, 5-hidroksimetiluracil, 8-azaguanin, 7-deazaguanin, N6 (6-aminoheksil)adenin i 2,6diaminopurin. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 75-77 (1980); Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res. 15:4513 (1997). „Univerzalna“ baza poznata u tehnici, npr. inozin, takođe može biti uključen. Pokazano je da 5-Me-C supstitucije povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, str. 276-278) i su aspekti supstitucija baza.
[0358] Modifikovane nukleobaze mogu da obuhvate druge sintetičke i prirodne nukleobaze, kao što su 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetilcitozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azouracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudo-uracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilkuanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin.
[0360] Dalje, nukleobaze mogu obuhvatiti one opisane u U.S. Patentu br.3,687,808, one objavljene 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', str. 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, one koje su otkrili Englisch et al., Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, str. 613, i one koje su otkrili Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications', str.289- 302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Određene od ovih nukleobaza su posebno korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja predmetnog pronalaska. To uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, koji obuhvataju 2-aminopropiladenin, 5-propinilluracil i 5-propinilcitozin. Pokazano je da supstitucije 5-metilcitozina povećavaju stabilnost dupleksa nukleinskih kiselina za 0,6-1,2°C (anghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, str. 276-278) i aspekti su supstitucija baza, još posebno kada se kombinuju sa modifikacijama 2’-O-metoksietil šećera. Modifikovane nukleobaze su opisane u U.S. Patentima br. 3,687,808, kao i 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596, 091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653; 6,005,096; I U.S. objavi patenta 2003/0158403.
[0361] Dakle, izraz „modifikovan“ odnosi se na neprirodni šećer, fosfat ili bazu koja je ugrađena u vodeću RNK, endonukleazu ili i u vodeću RNK i u endonukleazu. Nije neophodno da sve pozicije u datom oligonukleotidu budu jednoobrazno modifikovane, i zapravo, više od jedne od gore pomenutih modifikacija može biti ugrađeno u jedan oligonukleotid, ili čak u jedan nukleozid unutar oligonukleotida.
[0363] Vodeće RNK i/ili mRNK (ili DNK) koje kodiraju endonukleazu mogu biti hemijski povezane sa jednim ili više delova ili konjugata koji poboljšavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijski apsorpcioni unos oligonukleotida. Takvi delovi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, lipidne delove kao što je holesterolski deo [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556 (1989)]; holna kiselina [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)]; tioetar, npr. heksil-S-tritiltiol Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992) i Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)]; tioholesterol [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)]; alifatični lanac, npr. dodekandiol ili undecil ostaci [Kabanov et al., FEBS Lett., 259: 327‑330 (1990) i Svinarchuk et al., Biochimie, 75: 49‑ 54 (1993)]; fosfolipid, npr. di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-racglicero-3-H-fosfonat [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651‑3654 (1995) i Shea et al., Nucl. Acids Res., 18: 3777‑3783 (1990)]; poliamin ili lanac polietilen glikola [Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 14:969‑973 (1995)]; adamantan sirćetna kiselina [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651‑3654 (1995)]; palmitilni deo [(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229‑237 (1995)]; ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-t-oksiholesterolni deo [Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923‑937 (1996)]. Videti takođe U.S. Patente br.
[0364] 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580, 731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5, 578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,26 3; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,21 4,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574, 142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 i 5,688,941.
[0366] Šećeri i drugi delovi mogu se koristiti za usmeravanje proteina i kompleksa koji sadrže nukleotide, kao što su katjonski polizomi i lipozomi, na određena mesta. Na primer, prenos usmeren ka ćelijama jetre može biti posredovan putem asialoglikoproteinskih receptora (ASGPR); videti, npr. Hu, et al., Protein Pept Lett. 21(10):1025‑30 (2014). Drugi sistemi poznati u tehnici i redovno razvijani mogu se koristiti za usmeravanje biomolekula koji se koriste u ovom slučaju i/ili njihovih kompleksa na određene ciljne ćelije od interesa.
[0368] Ovi ciljni delovi ili konjugati mogu da uključuju konjugovane grupe kovalentno vezane za funkcionalne grupe, kao što su primarne ili sekundarne hidroksilne grupe. Konjugovane grupe predmetnog pronalaska uključuju interkalatore, reporterske molekule, poliamine, poliamide, polietilen glikole, polietere, grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva oligomera i grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva oligomera. Tipične konjugovane grupe uključuju holesterole, lipide, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrahinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje. Grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva, u kontekstu predmetnog pronalaska, uključuju grupe koje poboljšavaju usvajanje, poboljšavaju otpornost na razgradnju i/ili jačaju sekvencijalno specifičnu hibridizaciju sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva, u kontekstu predmetnog pronalaska, uključuju grupe koje poboljšavaju usvajanje, distribuciju, metabolizam ili izlučivanje jedinjenja predmetnog pronalaska. Reprezentativne konjugovane grupe su otkrivene u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US92/09196, podnetoj 23. oktobra 1992 (objavljeno kao WO1993007883), i U.S. Patentu br. 6,287,860. Konjugovani delovi uključuju, ali nisu ograničeni na, lipidne delove kao što su holesterolski deo, holna kiselina, tioetar, npr. heksil-5-tritiltiol, tioholesterol, alifatski lanac, npr. dodekandiol ili undecil ostaci, fosfolipid, npr. diheksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat, poliamin ili polietilen glikolni lanac, ili adamantan sirćetna kiselina, palmitilni deo, ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksi holesterolski deo. Videti, npr. U.S. Patente br. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941.
[0369] Duži polinukleotidi koji su manje podložni hemijskoj sintezi i koji se obično proizvode enzimskom sintezom takođe mogu biti modifikovani na različite načine. Takve modifikacije mogu uključivati, na primer, uvođenje određenih nukleotidnih analoga, ugradnju određenih sekvenci ili drugih delova na 5’ ili 3’ krajevima molekula i druge modifikacije. Ilustracije radi, mRNK koja kodira Cas9 je dugačka približno 4 kb i može se sintetizovati pomoću in vitro transkripcija. Modifikacije iRNK mogu se primeniti da, npr. povećaju njenu translaciju ili stabilnost (kao što je povećanje njenu otpornosti na razgradnju sa ćelijom), ili smanjiti tendenciju RNK da izazove urođeni imuni odgovor koji se često primećuje u ćelijama nakon unošenja egzogenih RNK, posebno dužih RNK kao što je ona koja kodira Cas9.
[0371] Brojne takve modifikacije su opisane u tehnici, kao što su poliA repovi, 5’-kapajući analozi (npr. Anti Reverzni Kap Analog (ARCA) ili m7G(5’)ppp(5’)G (mCAP)), modifikovani 5’ ili 3’ neprevedeni regioni (UTR), upotreba modifikovanih baza (kao što su Pseudo-UTP, 2-Tio-UTP, 5-Metilcitidin-5’-Trifosfat (5-Metil-CTP) ili N6-Metil-ATP), ili tretman fosfatazom za uklanjanje 5’ terminalnih fosfata. Ove i druge modifikacije su poznate u tehnici, a nove modifikacije RNK se redovno razvijaju.
[0373] Postoje brojni komercijalni dobavljači modifikovanih RNK, uključujući na primer, TriLink Biotech, AxoLabs, Bio-Synthesis Inc., Dharmacon i mnoge druge. Kao što je opisao TriLink, na primer, 5-metil-CTP se može koristiti za davanje poželjnih karakteristika, kao što su povećana stabilnost nukleaza, povećana translacija ili smanjena interakcija urođenih imunih receptora sa in vitro transkribovana RNK. 5-metilcitidin-5’-trifosfat (5-metil-CTP), N6-metil-ATP, kao i pseudo-UTP i 2-tio-UTP, takođe su pokazali da smanjuju urođenu imunsku stimulaciju u kulturi i in vivo uz poboljšanje translacije, kao što je prikazano u publikacijama Kormann et al. i Warren et al. navedenim u daljem tekstu.
[0375] Pokazano je da je hemijski modifikovana mRNK isporučena in vivo može se koristiti za postizanje poboljšanih terapeutskih efekata; videti, npr. Kormann et al., Nature Biotechnology 29, 154‑157 (2011). Takve modifikacije mogu se koristiti, na primer, za povećanje stabilnosti molekula RNK i/ili smanjenje njegove imunogenosti. Korišćenjem hemijskih modifikacija kao što su Pseudo-U, N6-metil-A, 2-Tio-U i 5-metil-C, utvrđeno je da zamena samo jedne četvrtine ostataka uridina i citidina sa 2-Tio-U i 5-metil-C, redom, rezultira značajnim smanjenjem prepoznavanja iRNK posredovanog receptorom sličnim Tol-u (TLR) kod miševa. Smanjenjem aktivacije urođenog imunog sistema, ove modifikacije se mogu koristiti za efikasno povećanje stabilnosti i dugovečnosti iRNK in vivo; videti, npr. Kormann et al., supra.
[0377] Takođe je pokazano da ponovljena primena sintetičkih informacionih RNK koje uključuju modifikacije dizajnirane da zaobiđu urođene antivirusne odgovore može reprogramirati diferencirane humane ćelije u pluripotentnost. Videti, npr. Warren, et al., Cell Stem Cell, 7(5):618‑30 (2010). Takve modifikovane mRNK koje deluju kao primarni proteini za reprogramiranje mogu biti efikasno sredstvo za reprogramiranje više tipova humanih ćelija. Takve ćelije se nazivaju indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC), i utvrđeno je da se enzimski sintetizovana RNK koja uključuje 5-metil-CTP, pseudo-UTP i anti-reverzni kap analog (ARCA) može koristiti za efikasno izbegavanje antivirusnog odgovora ćelije; videti, npr. Warren et al., supra.
[0379] Druge modifikacije polinukleotida opisane u tehnici uključuju, na primer, upotrebu poliA repova, dodavanje 5’ kapa analoga (kao što je m7G(5’)ppp(5’)G (mCAP)), modifikacije 5’ ili 3’ neprevedenih regiona (UTR) ili tretman fosfatazom za uklanjanje 5’ terminalnih fosfata - i redovno se razvijaju novi pristupi.
[0381] Razvijen je niz kompozicija i tehnika primenljivih za generisanje modifikovanih RNK za upotrebu ovde u vezi sa modifikacijom RNK interferencije (RNKi), uključujući male interferirajuće RNK (siRNK). siRNK predstavljaju posebne izazove in vivo, jer su njihovi efekti na utišavanje gena putem interferencije iRNK generalno prolazni, što može zahtevati ponovljenu primenu. Pored toga, siRNK su dvolančane RNK (dsRNK) i ćelije sisara imaju imune odgovore koji su evoluirali da detektuju i neutrališu dsRNK, koja je često nusproizvod virusne infekcije. Stoga postoje enzimi sisara kao što je PKR (dsRNK-responzivna kinaza) i potencijalno retinoinska kiselina-inducibilni gen I (RIG-I), koji mogu posredovati u ćelijskim odgovorima na dsRNK, kao i Toll-slični receptori (kao što su TLR3, TLR7 i TLR8) koji mogu pokrenuti indukciju citokina kao odgovor na takve molekule; videti, npr. recenzije od Angart et al., Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440‑468 (2013); Kanasty et al., Molecular Therapy 20(3): 513‑524 (2012); Burnett et al., Biotechnol J.
[0382] 6(9):1130‑46 (2011); Judge and MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111‑24 (2008); i reference navedene u njima.
[0384] Razvijen je i primenjen veliki broj modifikacija kako bi se poboljšala stabilnost RNK, smanjili urođeni imuni odgovori i/ili postigle druge koristi koje mogu biti korisne u vezi sa uvođenjem polinukleotida u humane ćelije, kao što je ovde opisano; videti, npr. recenzije od Whitehead KA et al., Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2: 77‑96 (2011); Gaglione and Messere, Mini Rev Med Chem, 10(7):578‑95 (2010); Chernolovskaya et al, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158‑67 (2010); Deleavey et al., Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16:Unit 16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305‑19 (2008); Fucini et al., Nucleic Acid Ther 22(3): 205‑210 (2012); Bremsen et al., Front Genet 3:154 (2012).
[0386] Kao što je gore navedeno, postoji veliki broj komercijalnih dobavljača modifikovanih RNK, od kojih su se mnoge specijalizovale za modifikacije dizajnirane da poboljšaju efikasnost siRNK. Raznovrsni pristupi se nude na osnovu različitih nalaza objavljenih u literaturi. Na primer, Dharmakon napominje da je zamena kiseonika koji ne premošćuje vezu sumporom (fosforotioat, PS) intenzivno korišćena za poboljšanje otpornosti siRNK na nukleaze, kao što je objavljeno od strane Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11: 125-140 (2012)). Prijavljeno je da modifikacije 2’-pozicije riboze poboljšavaju otpornost internukleotidne fosfatne veze na nukleaze, istovremeno povećavajući stabilnost dupleksa (Tm), što je takođe pokazalo da pruža zaštitu od imunološke aktivacije. Kombinacija umerenih modifikacija PS kičme sa malim, dobro tolerisanim 2’-supstitucijama (2’-O-metil, 2’-fluoro, 2’-hidro) povezana je sa visoko stabilnim siRNK za primenu in vivo, kako je izvestio Soutschek et al. Nature 432:173‑178 (2004); i 2’-O-metil modifikacije su prijavljene kao efikasne u poboljšanju stabilnosti, kako je prijavljeno od strane Volkov, Oligonucleotides 19:191‑202 (2009). Što se tiče smanjenja indukcije urođenih imunih odgovora, objavljeno je da modifikovanje specifičnih sekvenci sa 2’-O-metil, 2’-fluoro, 2’-hidro smanjuje interakciju TLR7/TLR8, dok generalno očuva aktivnost utišavanja; videti, npr. Judge et al., Mol. Ther. 13:494‑505 (2006); I Cekaite et al., J. Mol. Biol. 365:90‑108 (2007). Dodatne modifikacije, kao što su 2-tiouracil, pseudouracil, 5-metilcitozin, 5-metiluracil i N6-metiladenozin, takođe su pokazale da minimiziraju imunološke efekte posredovane TLR3, TLR7 i TLR8; videti, npr. Kariko, K. et al., Immunity 23:165‑175 (2005).
[0388] Kao što je, takođe, poznato u tehnici i komercijalno dostupno, brojni konjugati mogu se primeniti na polinukleotide, kao što su RNK, za upotrebu ovde, što može poboljšati njihovu isporuku i/ili apsorpciju od strane ćelija, uključujući na primer, holesterol, tokoferol i folnu kiselinu, lipide, peptide, polimere, linkere i aptamere; videti, npr. pregled od strane Winkler, Ther. Deliv.
[0389] 4:791‑809 (2013), i reference navedene u njemu.
[0390] Optimizacija kodonom
[0392] Polinukleotid koji kodira polipeptid usmeren ka mestu može biti optimizovan kodonima prema standardnim postupcima u tehnici za ekspresiju u ćeliji koja sadrži ciljnu DNK od interesa. Na primer, ako se nameravana ciljna nukleinska kiselina nalazi u ljudskoj ćeliji, ljudski polinukleotid sa optimizovanim kodonima koji kodira Cas9 je razmatran za upotrebu za proizvodnju Cas9 polipeptida.
[0394] Kompleksi nukleinske kiseline usmerene na genom i polipeptida usmerenog na mesto
[0395] Nukleinska kiselina usmerena na genom interaguje sa polipeptidom usmerenim na mesto (npr. nukleinska kiselina-vođena nukleinskom kiselinom kao što je Cas9), čime se formira kompleks. Nukleinska kiselina usmerena na genom vodi polipeptid usmeren ka ciljnoj nukleinskoj kiselini.
[0397] Ribonukleoproteinski kompleksi (RNP)
[0399] Polipeptid usmeren ka mestu i nukleinska kiselina usmerena na genom mogu se primeniti odvojeno ćeliji ili pacijentu. S druge strane, polipeptid usmeren ka mestu može biti prethodno kompleksovan sa jednom ili više vodećih RNK, ili jednom ili više crRNK zajedno sa tracrRNK. Prethodno kompleksovani materijal se zatim može primeniti u ćeliju ili pacijentu. Takav prethodno kompleksovani materijal je poznat kao ribonukleoproteinska čestica (RNP). Polipeptid usmeren ka mestu u RNP može biti, na primer, Cas9 endonukleaza ili Cpfl endonukleaza. Polipeptid usmeren ka mestu može biti okružen na N-terminusu, C-terminusu ili i na N-terminusu i na C-terminusu jednim ili više signala jedarne lokalizacije (NLS). Na primer, Cas9 endonukleaza može biti okružena sa dva NLS, jednim NLS koji se nalazi na N-terminusu i drugim NLS koji se nalazi na C-terminusu. NLS može biti bilo koji NLS poznat u tehnici, kao što je SV40 NLS. Težinski odnos nukleinske kiseline usmerene na genom i polipeptida usmerenog na mesto u RNP može biti 1:1. Na primer, težinski odnos sgRNK i Cas9 endonukleaze u RNP može biti 1:1.
[0401] Komponente sistema za kodiranje nukleinskih kiselina
[0403] Predmetni pronalazak pruža nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom iz pronalaska, polipeptid usmeren ka mestu iz pronalaska i/ili bilo koju nukleinsku kiselinu ili proteinski molekul neophodan za sprovođenje aspekata postupka iz pronalaska.
[0404] Nukleinska kiselina koja kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom iz pronalaska, polipeptid usmeren ka mestu iz pronalaska i/ili bilo koja nukleinska kiselina ili proteinski molekul neophodan za sprovođenje aspekata metoda iz pronalaska može da sadrži vektor (npr. rekombinantni ekspresioni vektor).
[0406] Izraz „vektor“ se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Jedna vrsta vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu ligirati dodatni segmenti nukleinske kiseline. Druga vrsta vektora je virusni vektor, gde se dodatni segmenti nukleinske kiseline mogu ligirati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori sa bakterijskim poreklom replikacije i epizomalni sisarski vektori). Drugi vektori (npr. neepisomalni sisarski vektori) se integrišu u genom ćelije domaćina nakon unošenja u ćeliju domaćina i time se repliciraju zajedno sa genomom domaćina.
[0408] U nekim primerima, vektori mogu biti sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori“ ili jednostavnije „ekspresioni vektori“, koji služe ekvivalentnim funkcijama.
[0410] Izraz „operativno povezan“ znači da je nukleotidna sekvenca od interesa povezana sa regulatornom sekvencom (sekvencama) na način koji omogućava ekspresiju nukleotidne sekvence. Izraz „regulatorna sekvenca“ treba da obuhvati, na primer, promotere, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr. signali poliadenilacije). Takve regulatorne sekvence su dobro poznate u tehnici i opisane su, na primer, u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorne sekvence uključuju one koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence u mnogim tipovima ćelija domaćina i one koje usmeravaju ekspresiju nukleotidne sekvence samo u određenim ćelijama domaćina (npr. tkivno-specifične regulatorne sekvence). Stručnjacima u tehnici biće jasno da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od faktora kao što su izbor ciljne ćelije, željeni nivo ekspresije i slično.
[0412] Razmatrani vektori ekspresije uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore zasnovane na virusu vakcinije, poliovirusu, adenovirusu, adeno-asociranom virusu, SV40, virusu herpes simpleksa, virusu humane imunodeficijencije, retrovirusu (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su virus Rausovog sarkoma, virus Harvejevog sarkoma, virus ptičje leukoze, lentivirus, virus humane imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke) i drugi rekombinantni vektori. Drugi vektori koji se razmatraju za eukariotske ciljne ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, i pSVLSV40 (Pharmacia). Mogu se koristiti i drugi vektori sve dok su kompatibilni sa ćelijom domaćinom.
[0414] U nekim primerima, vektor može da sadrži jedan ili više elemenata za kontrolu transkripcije i/ili translacije. U zavisnosti od korišćenog sistema domaćin/vektor, u ekspresionom vektoru može se koristiti bilo koji od brojnih odgovarajućih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente pojačivača transkripcije, terminatore transkripcije itd. Vektor može biti samoinaktivirajući vektor koji ili inaktivira virusne sekvence ili komponente CRISPR mehanizma ili druge elemente.
[0416] Neograničavajući primeri odgovarajućih eukariotskih promotora (tj. promoteri funkcionalni u eukariotskoj ćeliji) uključuju one iz citomegalovirusa (CMV) neposredno ranog, timidin kinaze virusa herpes simpleksa (HSV), ranog i kasnog SV40, dugih terminalnih ponavljanja (LTR) iz retrovirusa, promotora humanog faktora elongacije-1 (EF1), hibridne konstrukcije koja sadrži pojačivač citomegalovirusa (CMV) spojen sa promotorom beta-aktina pileta (CAG), promotorom virusa mišjih matičnih ćelija (MSCV), promotorom lokusa fosfoglicerat kinaze-1 (PGK) i mišjeg metalotioneina-I.
[0418] Za ekspresiju malih RNK, uključujući vodeće RNK koje se koriste u vezi sa Cas endonukleazom, različiti promotori kao što su promotori RNK polimeraze III, uključujući na primer U6 i H1, mogu biti korisni. Opisi i parametri za poboljšanje upotrebe takvih promotora su poznati u tehnici, a dodatne informacije i pristupi se redovno opisuju; videti, npr. Ma, H. et al., Molecular Therapy -Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12.
[0420] Ekspresioni vektor može, takođe, da sadrži mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju translacije i terminator transkripcije. Ekspresioni vektor može, takođe, da sadrži odgovarajuće sekvence za amplifikaciju ekspresije. Ekspresioni vektor može, takođe, da sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju ne-nativne oznake (npr. histidinska oznaka, hemaglutininska oznaka, zeleni fluorescentni protein, itd.) koji su fuzionisani sa polipeptidom usmerenim ka mestu, što rezultira fuzionim proteinom.
[0421] Promotor može biti inducibilni promotor (npr. promotor toplotnog šoka, promotor regulisan tetraciklinom, promotor regulisan steroidima, promotor regulisan metalom, promotor regulisan receptorom estrogena, itd.). Promotor može biti konstitutivni promotor (npr. CMV promotor, UBC promotor). U nekim slučajevima, promotor može biti prostorno ograničen i/ili vremenski ograničen promotor (npr. promotor specifičan za tkivo, promotor specifičan za tip ćelije, itd.).
[0422] Nukleinska kiselina koja kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom iz predmetnog pronalaska i/ili polipeptid usmeren ka mestu može biti upakovana u ili na površinu sredstava za isporuku radi isporuke ćelijama. Predviđena sredstva za isporuku uključuju, ali nisu ograničena na, nanosfere, lipozome, kvantne tačke, nanočestice, čestice polietilen glikola, hidrogelove i micele. Kao što je opisano u tehnici, mogu se koristiti različiti ciljni delovi za poboljšanje preferencijalne interakcije takvih sredstava sa željenim tipovima ili lokacijama ćelija.
[0424] Unošenje kompleksa, polipeptida i nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska u ćelije može se desiti virusnom ili bakteriofagnom infekcijom, transfekcijom, konjugacijom, fuzijom protoplasta, lipofekcijom, elektroporacijom, nukleofekcijom, taloženjem kalcijum fosfata, transfekcijom posredovanom polietileniminom (PEI), transfekcijom posredovanom DEAE-dekstranom, transfekcijom posredovanom lipozomima, tehnologijom čestičnog pištolja, taloženjem kalcijum fosfata, direktnom mikroinjekcijom, isporukom nukleinskih kiselina posredovanom nanočesticama i slično.
[0426] Terapeutski pristup
[0428] Predmetni pronalazak obezbeđuje jednomolekularnu vodeću RNK kako je definisano u zahtevima ili DNK kako je definisano u zahtevima za upotrebu u lečenju poremećaja povezanog sa SCN9A, što obuhvata uređivanje SCN9A gena u ćeliji pacijenta. Ovde su takođe opisani postupci za lečenje pacijenta sa bolom. Jedan aspekt može biti ex vivo ćelijska terapija. Na primer, vrši se biopsija perifernih nerava pacijenta. Nervno tkivo može biti izolovano sa kože ili noge pacijenta. Zatim se ćelija perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama) izoluje iz biopsiranog materijala. Zatim se hromozomska DNK ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neurona ili glijalne ćelije kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama) može izmeniti korišćenjem materijala i metoda opisanih ovde. Konačno, izmenjena ćelija perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama) može biti implantirana u pacijenta. Bilo koji izvor ili tip ćelije može se koristiti kao ćelija-progenitor.
[0430] Još jedan aspekt može biti ex vivo ćelijska terapija. Na primer, može se stvoriti indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) specifične za pacijenta. Zatim se hromozomska DNK ovih iPSC ćelija može izmeniti korišćenjem materijala i postupaka opisanih ovde. Zatim, genomski izmenjene iPSC mogu se diferencirati u ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama). Konačno, diferencirane ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama) mogu se implantirati pacijentu.
[0432] Još jedan aspekt može biti ex vivo ćelijska terapija. Na primer, mezenhimalne matične ćelije mogu biti izolovane od pacijenta, koje se mogu izolovati iz koštane srži ili periferne krvi pacijenta. Zatim, hromozomska DNK ovih mezenhimalnih matičnih ćelija može biti uređena korišćenjem materijala i metoda opisanih ovde. Zatim, genomski uređene mezenhimalne matične ćelije mogu biti diferencirane u ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama). Konačno, diferencirane ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama) mogu biti implantirane u pacijenta.
[0434] Jedna prednost jednog ex vivo pristupa ćelijske terapije je sposobnost sprovođenja sveobuhvatne analize terapije pre primene. Terapija zasnovana na nukleazi može imati određeni nivo efekata van cilja. Izvođenje genskog uređivanja ex vivo omogućava karakterizaciju izmenjene ćelijske populacije pre implantacije. Predmetni pronalazak uključuje sekvenciranje celog genoma izmenjenih ćelija kako bi se osiguralo da se efekti van cilja, ako ih ima, mogu nalaziti na genomskim lokacijama povezanim sa minimalnim rizikom za pacijenta. Štaviše, populacije specifičnih ćelija, uključujući klonske populacije, mogu se izolovati pre implantacije.
[0436] Još jedna prednost ex vivo ćelijske terapije se odnosi na genetsku modifikaciju iPSC u poređenju sa drugim primarnim ćelijskim izvorima. iPSC su produktivne, što olakšava dobijanje velikog broja ćelija koje će biti potrebne za ćelijsku terapiju. Štaviše, iPSC su idealan tip ćelija za izvođenje klonskih izolacija. Ovo omogućava skrining za ispravnu genomsku modifikaciju, bez rizika od smanjenja vitalnosti. Nasuprot tome, druge primarne ćelije, kao što su glijalne ćelije, su održive samo nekoliko pasaža i teško ih je klonalno razmnožavati. Stoga, manipulacija iPSC za lečenje bola može biti mnogo lakša i može skratiti vreme potrebno za izvođenje željene genetske modifikacije.
[0438] Upotreba može, takođe, da uključuje in vivo terapiju. Hromozomska DNK ćelija kod pacijenta se uređuje korišćenjem materijala i postupaka opisanih ovde. U nekim aspektima, ciljna ćelija u in vivo terapiji je neuron perifernog nervnog sistema.
[0440] Iako određene ćelije predstavljaju atraktivnu metu za ex vivo lečenje i terapija, povećana efikasnost u isporuci može omogućiti direktno in vivo isporuka takvim ćelijama. Idealno bi bilo da ciljanje i uređivanje budu usmereni na relevantne ćelije. Cepanje u drugim ćelijama takođe se može sprečiti upotrebom promotora aktivnih samo u određenim ćelijama i/ili razvojnim fazama. Dodatni promotori su inducibilni i stoga se mogu vremenski kontrolisati ako se nukleaza isporučuje kao plazmid. Količina vremena koju isporučena RNK i protein ostaju u ćeliji takođe se može podesiti korišćenjem tretmana ili dodanih domena da bi se promenilo vreme poluraspada. In vivo tretman bi eliminisao brojne korake lečenja, ali niža brzina isporuke može zahtevati veće stope uređivanja. In vivo tretman može eliminisati probleme i gubitke od ex vivo tretmana i prisađivanja i post-prisađivanja integracije neurona i glijalnih ćelija na odgovarajući način u postojeća moždana kola.
[0442] Prednost in vivo genska terapija može biti jednostavnost terapijske proizvodnje i primene. Isti terapijski pristup i terapija će imati potencijal da se koriste za lečenje više od jednog pacijenta, na primer, više pacijenata koji dele isti ili sličan genotip ili alel. Nasuprot tome, ex vivo ćelijska terapija obično zahteva korišćenje sopstvenih ćelija pacijenta, koje mogu biti izolovane, manipulisane i vraćene istom pacijentu.
[0444] Takođe je ovde dat ćelijski postupak za uređivanje gena SCN9A u ćeliji putem uređivanja genoma. Na primer, ćelija se može izolovati od pacijenta ili životinje. Zatim se hromozomska DNK ćelije može izmeniti korišćenjem materijala i postupaka opisanih ovde.
[0446] Postupci kako su definisane u zahtevima mogu uključivati smanjenje (nokaut) ili eliminisanje (ukidanje) ekspresije gena SCN9A uvođenjem jedne ili više insercija, delecija ili mutacija unutar ili blizu gena SCN9A ili drugih DNK sekvenci koje kodiraju regulatorne elemente gena SCN9A.
[0447] Na primer, strategija nokauta ili nokauta može uključivati poremećaj okvira za čitanje u genu SCN9A uvođenjem slučajnih insercija ili delecija (indela) koje nastaju zbog nepreciznog puta popravke NHEJ. Ovo se može postići indukovanjem jednog jednolančanog prekida ili dvolančanog prekida u genu SCN9A sa jednom ili više CRISPR endonukleaza i gRNK (npr. crRNK tracrRNK ili sgRNK), ili dva ili više jednolančanih prekida ili dvolančanih prekida u genu SCN9A sa dve ili više CRISPR endonukleaza i dve ili više sgRNK. Ovaj pristup može zahtevati razvoj i optimizaciju sgRNK za gen SCN9A.
[0449] Alternativno, strategija nokdauna ili nokauta može takođe uključivati deleciju jednog ili više segmenata unutar ili blizu gena SCN9A ili drugih DNK sekvenci koje kodiraju regulatorne elemente gena SCN9A. Ova strategija delecije zahteva najmanje par gRNK (npr. crRNK tracrRNK ili sgRNK) sposobnih da se vežu za dva različita mesta unutar ili blizu gena SCN9A i jednu ili više CRISPR endonukleaza. CRISPR endonukleaze, konfigurisane sa dve gRNK, indukuju dva dvolančana prekida na željenim lokacijama. Nakon cepanja, dva kraja, bez obzira da li su tupi ili sa prepustima, mogu se spojiti pomoću NHEJ, što dovodi do delecije posredujućeg segmenta. U određenim aspektima, putevi popravke NHEJ mogu dovesti do insercija, delecija ili mutacija na spojevima.
[0451] Pored gore navedenih strategija za uređivanje genoma, druga strategija uključuje moduliranje ekspresije, funkcije ili aktivnosti SCN9A uređivanjem regulatorne sekvence.
[0453] Pored gore navedenih opcija za uređivanje, Cas9 ili slični proteini mogu se koristiti za ciljanje efektorskih domena na ista ciljna mesta koja se mogu identifikovati za uređivanje ili na dodatna ciljna mesta unutar dometa efektorskog domena. Niz enzima koji modifikuju hromatin, metilaza ili demetilaza može se koristiti za promenu ekspresije ciljnog gena. Jedna mogućnost je smanjenje ekspresije SCN9A proteina ako mutacija dovodi do neželjene aktivnosti. Ove vrste epigenetske regulacije imaju neke prednosti, posebno zato što su ograničene u mogućim efektima van cilja.
[0454] Pored kodirajućih i splajsing sekvenci, može biti prisutan i niz vrsta genomskih ciljnih mesta.
[0455] Regulacija transkripcije i translacije podrazumeva niz različitih klasa mesta koja interaguju sa ćelijskim proteinima ili nukleotidima. Često se mesta vezivanja DNK transkripcionih faktora ili drugih proteina mogu ciljati na mutaciju ili deleciju kako bi se proučila uloga mesta, mada se mogu ciljati i na promenu ekspresije gena. Mesta se mogu dodati putem nehomolognog spajanja krajeva NHEJ ili direktnim uređivanjem genoma pomoću homologno usmerene popravke (HDR). Povećana upotreba sekvenciranja genoma, ekspresije RNK i studija vezivanja transkripcionih faktora na nivou celog genoma povećala je našu sposobnost da identifikujemo kako mesta dovode do razvojne ili vremenske regulacije gena. Ovi kontrolni sistemi mogu biti direktni ili mogu uključivati opsežnu kooperativnu regulaciju koja može zahtevati integraciju aktivnosti iz višestrukih pojačivača. Transkripcioni faktori se obično vezuju za degenerisane DNK sekvence dužine 6-12 parnih baza. Nizak nivo specifičnosti koji obezbeđuju pojedinačna mesta sugeriše da su složene interakcije i pravila uključeni u vezivanje i funkcionalni ishod. Mesta vezivanja sa manjom degeneracijom mogu pružiti jednostavnija sredstva regulacije. Veštački transkripcioni faktori mogu biti dizajnirani da specificiraju duže sekvence koje imaju manje sličnih sekvenci u genomu i imaju manji potencijal za cepanje van cilja. Bilo koje od ovih vrsta mesta vezivanja može biti mutirano, izbrisano ili čak kreirano kako bi se omogućile promene u regulaciji ili ekspresiji gena (Canver, M.C. et al., Nature (2015)).
[0457] Druga klasa regulatornih regiona gena koji imaju ove karakteristike su mesta vezivanja mikroRNK (miRNK). miRNK su nekodirajuće RNK koje igraju ključnu ulogu u posttranskripcionoj regulaciji gena. miRNK mogu da regulišu ekspresiju 30% svih gena koji kodiraju proteine sisara. Otkriveno je specifično i snažno utišavanje gena pomoću dvolančane RNK (RNKi), plus dodatne male nekodirajuće RNK (Canver, M.C. et al., Nature (2015)). Najveća klasa nekodirajućih RNK važnih za utišavanje gena su miRNK. Kod sisara, miRNK se prvo transkribuju kao dugačak RNK transkript, koji može biti odvojena transkripciona jedinica, deo proteinskih introna ili drugi transkripti. Dugački transkripti se nazivaju primarna miRNK (pri-miRNK) i uključuju strukture ukosnica sa nesavršeno uparenim bazama. Ove pri-miRNK mogu se razdvojiti na jednu ili više kraćih prekursorskih miRNK (pre-miRNK) pomoću mikroprocesora, proteinskog kompleksa u jedru, koji uključuje Drosha-u.
[0459] Pre-miRNK su kratke matične petlje dužine ~70 nukleotida sa 2-nukleotidnim 3’-prepustom koje se eksportuju u zrele miRNK:miRNK* duplekse od 19-25 nukleotida. Lanac miRNK sa nižom stabilnošću uparivanja baza (vodeći lanac) može se učitati na RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC). Putnički lanac (označen sa *) može biti funkcionalan, ali je obično degradiran. Zrela miRNK vezuje RISC za delimično komplementarne motive sekvence u ciljnim iRNK koje se pretežno nalaze unutar 3’ neprevedenih regiona (UTR) i indukuje posttranskripciono utišavanje gena (Bartel, D.P. Cell 136, 215‑233 (2009); Saj, A. & Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504‑510 (2011)).
[0460] miRNK mogu biti važne u razvoju, diferencijaciji, ćelijskom ciklusu i kontroli rasta, i u praktično svim biološkim putevima kod sisara i drugih višećelijskih organizama. miRNK, takođe, mogu biti uključene u kontrolu ćelijskog ciklusa, apoptozu i diferencijaciju matičnih ćelija, hematopoezu, hipoksiju, razvoj mišića, neurogenezu, lučenje insulina, metabolizam holesterola, starenje, replikaciju virusa i imune odgovore.
[0462] Jedna miRNK može ciljati stotine različitih transkripata iRNK, dok pojedinačni transkript miRNK može biti ciljan od strane mnogih različitih miRNK. Više od 28645 mikroRNK je anotirano u najnovijem izdanju miRBase (v.21). Neke miRNK mogu biti kodirane od strane više lokusa, od kojih se neki mogu ekspresovati iz tandemno kotranskribovanih klastera. Karakteristike omogućavaju složene regulatorne mreže sa višestrukim putevima i povratnim kontrolama. miRNK mogu biti sastavni delovi ovih povratnih i regulatornih kola i mogu pomoći u regulaciji ekspresije gena održavanjem proizvodnje proteina u granicama (Herranz, H. & Cohen, S.M. Genes Dev 24, 1339‑1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1‑6 (2014)).
[0464] miRNK, takođe, može biti važna kod velikog broja humanih bolesti koje su povezane sa abnormalnom ekspresijom miRNK. Ova povezanost naglašava važnost regulatornog puta miRNK. Nedavne studije delecije miRNK povezale su miRNK sa regulacijom imunih odgovora (Stern-Ginossar, N. et al., Science 317, 376‑381 (2007)).
[0466] miRNK, takođe, ima jaku vezu sa rakom i može igrati ulogu u različitim vrstama raka. Utvrđeno je da su miRNK smanjeno regulisane u brojnim tumorima. miRNK može biti važna u regulaciji ključnih puteva povezanih sa rakom, kao što su kontrola ćelijskog ciklusa i odgovor na oštećenje DNK, i stoga se može koristiti u dijagnozi i može biti ciljana klinički. MikroRNK mogu delikatno regulisati ravnotežu angiogeneze, tako da eksperimenti koji iscrpljuju sve mikroRNK suzbijaju tumorsku angiogenezu (Chen, S. et al., Genes Dev 28, 1054‑1067 (2014)).
[0468] Kao što je pokazano za gene koji kodiraju proteine, geni miRNK takođe mogu biti podložni epigenetskim promenama koje se javljaju kod raka. Mnogi lokusi miRNK mogu biti povezani sa CpG ostrvcima, što povećava njihovu mogućnost za regulaciju metilacijom DNK (Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. & Lyko, F. Cell Cycle 6, 1001‑1005 (2007)). Većina studija je koristila tretman lekovima za remodeliranje hromatina kako bi otkrila epigenetski utišane miRNK.
[0469] Pored svoje uloge u utišavanju RNK, miRNK takođe mogu aktivirati translaciju (Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1‑6 (2014)). Uklanjanje miRNK mesta može dovesti do smanjene ekspresije ciljanog gena, dok uvođenje ovih mesta može povećati ekspresiju.
[0471] Pojedinačne miRNK se mogu najefikasnije isključiti mutacijom semenske sekvence (baze 2-8 mikroRNK), što može biti važno za specifičnost vezivanja. Cepanje u ovom regionu, praćeno pogrešnom popravkom pomoću NHEJ, može efikasno ukinuti funkciju miRNK blokiranjem vezivanja za ciljna mesta. miRNK se, takođe, može inhibirati specifičnim ciljanjem posebnog regiona petlje pored palindromske sekvence. Katalitički neaktivni Cas9 se takođe može koristiti za inhibiciju ekspresije shRNA (Zhao, Y. et al., Sci Rep 4, 3943 (2014)). Pored ciljanja miRNK, mesta vezivanja, takođe, mogu biti ciljana i mutirana kako bi se sprečilo utišavanje od strane miRNK.
[0473] Prema predmetnom pronalasku, bilo koja od mikroRNK (miRNK) ili njihovih mesta vezivanja može biti uključena u kompozicije koje su opisane, ali nisu ovde zahtevane.
[0475] Kompozicije mogu imati region kao što je, ali nije ograničeno na, region koji sadrži sekvencu bilo koje od mikroRNK navedenih u SEQ ID NO: 632-4715, reverzni komplement mikroRNK navedenih u SEQ ID NO: 632-4715 ili anti-semenski region mikroRNK bilo koje od mikroRNK navedenih u SEQ ID NO: 632-4715.
[0477] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu da sadrže jednu ili više ciljnih sekvenci mikroRNK, sekvenci mikroRNK ili semena mikroRNK. Takve sekvence mogu odgovarati bilo kojoj poznatoj mikroRNK, kao što su one opisane u U.S. objavi US2005/0261218 i US objavi US2005/0059005. Kao neograničavajući primer, poznate mikroRNK, njihove sekvence i sekvence njihovih mesta vezivanja u ljudskom genomu navedene su u nastavku u SEQ ID NO: 632-4715.
[0479] MikroRNK sekvenca obuhvata „semensku“ sekvencu, tj. sekvencu u regionu pozicija 2-8 zrele mikroRNK, koja sekvenca ima savršenu Votson-Krikovu (Watson-Crick) komplementarnost sa ciljnom sekvencom miRNK. Seme mikroRNK može obuhvatati pozicije 2-8 ili 2-7 zrele mikroRNK. U nekim aspektima, seme mikroRNK može obuhvatati 7 nukleotida (npr. nukleotide 2-8 zrele mikroRNK), pri čemu je mesto komplementarnog semenu u odgovarajućoj ciljnoj miRNK okruženo adeninom (A) nasuprot poziciji 1 mikroRNK. U nekim aspektima, seme mikroRNK može obuhvatati 6 nukleotida (npr. nukleotide 2-7 zrele mikroRNK), pri čemu je mesto komplementarnog semenu u odgovarajućoj ciljnoj miRNK okruženo adeninom (A) nasuprot poziciji 1 mikroRNK. Videti na primer, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell.2007 Jul 6;27(1):91‑105. Baze mikroRNK semena imaju potpunu komplementarnost sa ciljnom sekvencom.
[0481] Identifikacija mikroRNK, ciljnih regiona mikroRNK, kao i njihovih obrazaca ekspresije i uloge u biologiji su objavljeni (Bonauer et al., Curr Drug Targets 201011:943‑949; Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 201118:171‑176; Contreras and Rao Leukemia 201226:404‑413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215‑233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401‑1414; Gentner and Naldini, Tissue Antigens.2012 80:393‑403).
[0483] Na primer, ako kompozicija nije namenjena za isporuku u jetru, već tamo završi, onda miR-122, mikroRNK koja je obilno prisutna u jetri, može inhibirati ekspresiju isporučene sekvence ako se jedno ili više ciljnih mesta miR-122 inženjerišu u polinukleotid koji kodira tu ciljnu sekvencu. Uvođenje jednog ili više mesta vezivanja za različite mikroRNK može se inženjerski izvršiti kako bi se dodatno smanjio dugovečnost, stabilnost i translacija proteina, čime se obezbeđuje dodatni sloj održivosti.
[0485] Kako se ovde koristi, izraz „mesto mikroRNK“ odnosi se na ciljno mesto mikroRNK ili mesto prepoznavanja mikroRNK, ili bilo koju nukleotidnu sekvencu za koju se mikroRNK vezuje ili povezuje. Treba razumeti da „vezivanje“ može pratiti tradicionalna Votson-Krikova pravila hibridizacije ili može odražavati bilo koju stabilnu vezu mikroRNK sa ciljnom sekvencom na ili pored mesta mikroRNK.
[0487] Nasuprot tome, za potrebe kompozicija predmetnog pronalaska, mesta vezivanja mikroRNK mogu biti konstruisana iz (tj. uklonjena iz) sekvenci u kojima se prirodno javljaju kako bi se povećala ekspresija proteina u specifičnim tkivima.
[0489] Konkretno, poznato je da se mikroRNK diferencijalno eksprimuju u imunim ćelijama (takođe nazvanim hematopoetskim ćelijama), kao što su ćelije koje prezentuju antigen (APC) (npr. dendritske ćelije i makrofagi), makrofagi, monociti, B limfociti, T limfociti, granulociti, prirodne ćelije ubice, itd. MikroRNK specifične za imune ćelije su uključene u imunogenost, autoimunitet, imuni odgovor na infekciju, upalu, kao i neželjeni imuni odgovor nakon genske terapije i transplantacije tkiva/organa. MikroRNK specifične za imune ćelije, takođe, regulišu mnoge aspekte razvoja, proliferacije, diferencijacije i apoptoze hematopoetskih ćelija (imunih ćelija). Na primer, miR-142 i miR-146 se isključivo eksprimuju u imunim ćelijama, posebno su zastupljene u mijeloidnim dendritskim ćelijama. Uvođenje mesta vezivanja miR-142 u 3’-UTR polipeptida predmetnog pronalaska može selektivno suzbiti ekspresiju gena u ćelijama koje prezentuju antigen putem degradacije mRNK posredovane miR-142, ograničavajući prezentaciju antigena u profesionalnim APC (npr. dendritske ćelije) i time sprečavajući antigenom posredovan imuni odgovor nakon isporuke gena (videti, Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152‑5161).
[0491] U jednom primeru, mesta vezivanja mikroRNK za koja se zna da se eksprimuju u imunim ćelijama, posebno u ćelijama koje prezentuju antigen, mogu se ugraditi u polinukleotide kako bi se suzbila ekspresija polinukleotida u APC putem degradacije RNK posredovane mikroRNK, suzbijajući imuni odgovor posredovan antigenom, dok se ekspresija polinukleotida održava u neimunim ćelijama gde se mikroRNK specifične za imune ćelije ne eksprimuju.
[0493] Mnoge studije ekspresije mikroRNK su sprovedene i opisane u tehnici kako bi se profilisala diferencijalna ekspresija mikroRNK u različitim ćelijama/tkivima raka i drugim bolestima. Neke mikroRNK su abnormalno prekomerno eksprimovane u određenim ćelijama raka, a druge su nedovoljno eksprimovane. Na primer, mikroRNK su diferencijalno eksprimovane u ćelijama raka (WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO2011/157294); matične ćelije raka (US2012/0053224); rak i bolesti pankreasa (US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); astma i upala (US8415096); rak prostate (US2013/0053264); hepatocelularni karcinom (WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); ćelije raka pluća (WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/0323357); kožni T-ćelijski limfom (WO2013/011378); ćelije kolorektalnog karcinoma (WO2011/0281756, WO2011/076142); limfni čvorovi pozitivni na rak (WO2009/100430, US2009/0263803); nazofaringealni karcinom (EP2112235); hronična opstruktivna bolest pluća (US2012/0264626, US2013/0053263); rak štitne žlezde (WO2013/066678); ćelije raka jajnika ( US2012/0309645, WO2011/095623); ćelije raka dojke (WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), leukemija i limfom (WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563).
[0495] Neograničavajući primeri mikroRNK sekvenci i ciljanih tkiva i/ili ćelija otkriveni su u SEQ ID NO: 632-4715.
[0496] Strategije genomskog inženjeringa
[0498] U nekim aspektima, postupci predmetnog pronalaska mogu uključivati uređivanje jednog ili oba alela. Uređivanje gena radi modifikacije alela(a) ima prednost trajne izmene ciljnog gena ili genskih proizvoda.
[0500] Korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska mogu obuhvatiti uređivanje ćelija perifernog nervnog sistema (npr. neurona ili glijalne ćelije kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama) izolovanih od pacijenta korišćenjem genomskog inženjeringa. Alternativno, korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska može obuhvatiti uređivanje pacijentove specifične iPSC ili mezenhimalne matične ćelije. Slično tome, korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska uključuju uređivanje ćelija kod pacijenata koji doživljavaju bol korišćenjem genomskog inženjeringa. Slično tome, korak u ćelijskim metodama predmetnog pronalaska može obuhvatiti uređivanje gena SCN9A u humanoj ćeliji genomskim inženjeringom.
[0501] Pacijenti koji doživljavaju bol mogu pokazivati širok spektar mutacija u genu SCN9A. Stoga, različitim pacijentima mogu biti potrebne različite strategije uređivanja. Bilo koja CRISPR endonukleaza može se koristiti u postupcima predmetnog pronalaska, pri čemu svaka CRISPR endonukleaza ima svoj sopstveni PAM, koji može, ali i ne mora biti specifičan za bolest.
[0503] Na primer, ekspresija gena SCN9A može biti poremećena ili eliminisana uvođenjem slučajnih insercija ili delecija (indela) koje nastaju zbog nepreciznog puta popravke NHEJ. Ciljni regioni mogu biti kodirajuće sekvence gena SCN9A (tj. eksoni). Umetanje ili brisanje nukleotida u kodirajućoj sekvenci gena može izazvati „pomeranje okvira čitanja“ gde je poremećen normalan obrazac kodona od 3 slova. Na ovaj način, ekspresija gena, a samim tim i proizvodnja proteina, mogu se smanjiti ili eliminisati. Ovaj pristup se takođe može koristiti za ciljanje bilo kog introna, spoja introna i eksona ili regulatornog elementa DNK gena SCN9A gde promena sekvence može ometati ekspresiju gena SCN9A.
[0505] Kao još jedan primer, NHEJ se takođe može koristiti za brisanje segmenata gena, direktno ili promenom mesta donora ili akceptora splajsovanja putem cepanja jednom gRNK koja cilja nekoliko lokacija ili nekoliko gRNK. Ovo može biti korisno ako su mali nasumični indeksi neefikasni za nokautiranje ciljnog gena. Parovi gRNK su korišćeni za ovu vrstu delecija.
[0506] Bez prisustva donora, krajevi iz jednog prekida DNK ili krajevi iz različitih prekida mogu se spojiti korišćenjem nekoliko nehomolognih puteva popravke u kojima su krajevi DNK spojeni sa malo ili bez uparivanja baza na spoju. Pored kanonskog NHEJ, postoje slični mehanizmi popravke, kao što je alt-NHEJ. Ako postoje dva prekida, međusegment može biti obrisan ili invertovan. NHEJ putevi popravke mogu dovesti do insercija, delecija ili mutacija na spojevima.
[0508] NHEJ, takođe, može dovesti do integracije cilja nezavisne od homologije. Na primer, uključivanje ciljnog mesta nukleaze na donorskom plazmidu može podstaći integraciju transgena u hromozomski dvolančani prekid nakon in vivo nukleaznog razlaganja i donora i hromozoma (Cristea., Biotechnol Bioeng.2013 Mar;110(3):871‑80). NHEJ je korišćen za umetanje inducibilne kasete za ekspresiju gena od 15 kb u definisani lokus u ljudskim ćelijskim linijama nakon cepanja nukleazom. (Videti npr. Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res 23, 539‑546 (2013); Suzuki et al. Nature, 540, 144‑149 (2016)). Integrisana sekvenca može poremetiti okvir za čitanje gena SCN9A ili promeniti strukturu gena.
[0510] Kao dalja alternativa, homologija usmerena popravka (HDR) takođe se može koristiti za nokautiranje gena ili promenu funkcije gena. Na primer, strategija HDR nokauta može uključivati narušavanje strukture ili funkcije gena SCN9A umetanjem nefunkcionalne ili irelevantne sekvence u gen SCN9A. Ovo se može postići indukovanjem jednog jednolančanog prekida ili dvolančanog prekida u genu od interesa sa jednom ili više CRISPR endonukleaza i gRNK (npr. crRNK tracrRNK ili sgRNK), ili dva ili više jednolančanih prekida ili dvolančanih prekida u genu od interesa sa jednom ili više CRISPR endonukleaza i dve ili više gRNK, u prisustvu donorskog DNK šablona unetog egzogeno da bi se usmerio ćelijski DSB odgovor na homologija usmerenu popravku (donorski DNK šablon može biti kratki jednolančani oligonukleotid, kratki dvolančani oligonukleotid, dugačak jednolančani ili dvolančani molekul DNK). Ovaj pristup može zahtevati razvoj i optimizaciju gRNK i molekula donorske DNK za gen SCN9A.
[0512] Homologno usmerena popravka (HDR) je u suštini mehanizam bez grešaka koji koristi datu homolognu DNK sekvencu kao šablon tokom popravke DSB. Brzina HDR je funkcija udaljenosti između mutacije i mesta preseka, tako da je izbor preklapajućih ili najbližih ciljnih mesta važan. Šabloni mogu da uključuju dodatne sekvence okružene homolognim regionima ili mogu da sadrže sekvencu koja se razlikuje od genomske sekvence, što omogućava uređivanje sekvence.
[0513] Najčešći oblik HDR je homologna rekombinacija. Postoje dodatni putevi za HDR, uključujući jednolančano žarenje i alternativni HDR. Alati genomskog inženjeringa omogućavaju istraživačima da manipulišu putevima ćelijske homologne rekombinacije kako bi stvorili modifikacije genoma specifične za mesto. Utvrđeno je da ćelije mogu da poprave dvolančani prekid koristeći sintetički molekul donora koji je obezbeđen in trans. Stoga, uvođenjem dvolančanog prekida u blizini specifične mutacije i obezbeđivanjem odgovarajućeg donora, mogu se napraviti ciljane promene u genomu. Specifično cepanje povećava brzinu HDR više od 1.000 puta iznad brzine od 1 na 10<6>ćelija koje primaju samo homolognog donora. Brzina popravke usmerene homologijom (HDR) na određenom nukleotidu je funkcija udaljenosti do mesta preseka, tako da je izbor preklapajućih ili najbližih ciljnih mesta važan. Uređivanje gena nudi prednost u odnosu na dodavanje gena, jer uređivanje in situ ostavlja ostatak genoma netaknutim.
[0515] Donori koji se isporučuju za uređivanje pomoću HDR značajno variraju, ali mogu da sadrže željenu sekvencu sa malim ili velikim bočnim homološkim krakovima kako bi se omogućilo vezivanje za genomsku DNK. Homološki regioni koji okružuju uvedene genetske promene mogu biti 30 bp ili manji, ili veliki kao kaseta od više kilobaza koja može da sadrži promotere, cDNK, itd. Korišćeni su i jednolančani i dvolančani donori oligonukleotida. Ovi oligonukleotidi se kreću u veličini od manje od 100 nt do preko mnogo kb, mada se mogu generisati i koristiti i duže ssDNA. Mogu se koristiti dvolančani donori, uključujući PCR amplikone, plazmide i minikrugove. Generalno, utvrđeno je da AAV vektor može biti veoma efikasno sredstvo za isporuku donorskog šablona, iako su ograničenja pakovanja za pojedinačne donore <5 kb. Aktivna transkripcija donora je povećala HDR tri puta, što ukazuje da uključivanje promotora može povećati konverziju. Nasuprot tome, CpG metilacija donora je smanjila ekspresiju gena i HDR.
[0516] Pored endonukleaza divljeg tipa, kao što je Cas9, postoje varijante nikaza koje imaju jedan ili drugi nukleazni domen inaktiviran, što rezultira sečenjem samo jednog lanca DNK. HDR može biti usmeren iz pojedinačnih Cas nikaza ili korišćenjem parova nikaza koje okružuju ciljno područje. Donori mogu biti jednolančani, nikovani ili dsDNA.
[0518] Donorska DNK može biti isporučena sa nukleazom ili nezavisno različitim postupcima, na primer, transfekcijom, nanočesticama, mikroinjekcijom ili virusnom transdukcijom. Predložen je niz opcija povezivanja kako bi se povećala dostupnost donora za HDR. Primeri uključuju vezivanje donora za nukleazu, vezivanje za proteine koji vezuju DNK i vezuju se u blizini ili vezivanje za proteine koji su uključeni u vezivanje ili popravku kraja DNK.
[0520] Izbor puta popravke može biti vođen brojnim uslovima kulture, kao što su oni koji utiču na ćelijski ciklus, ili ciljanjem popravke DNK i povezanih proteina. Na primer, da bi se povećao HDR, ključni molekuli NHEJ mogu biti suzbijeni, kao što su KU70, KU80 ili DNK ligaza IV.
[0522] Pored uređivanja genoma pomoću NHEJ ili HDR, sprovedene su i insercije gena specifične za mesto koje koriste i NHEJ put i HDR. Kombinovani pristup može biti primenljiv u određenim uslovima, moguće uključujući granice introna/egzona. NHEJ može biti efikasan za ligaciju u intronu, dok HDR bez grešaka može biti pogodniji u kodirajućem regionu.
[0524] Gen SCN9A sadrži određeni broj eksona kao što je prikazano u Tabeli 3. Bilo koji od ovih eksona ili više obližnjih introna mogu biti ciljani kako bi se stvorio jedan ili više indela koji remete okvir za čitanje i na kraju eliminišu abnormalnu aktivnost SCN9A proteina.
[0526] U nekim aspektima, metode mogu da obezbede parove gRNK koji vrše deleciju presecanjem gena dva puta na lokacijama koje okružuju neželjenu sekvencu. Ova sekvenca može da uključuje jedan ili više egzona, introna, spojeva intron:egzon, drugih DNK sekvenci koje kodiraju regulatorne elemente gena SCN9A ili njihove kombinacije. Sečenje se može postići parom DNK endonukleaza od kojih svaka pravi DSB u genomu, ili višestrukim nikazama koje zajedno prave DSB u genomu.
[0527] Alternativno, postupci mogu da obezbede jednu gRNK za pravljenje jednog dvolančanog preseka unutar kodirajuće ili splajsing sekvence. Dvolančani presek može biti napravljen pomoću jedne DNK endonukleaze ili višestrukih nikaza koje zajedno čine DSB u genomu.
[0529] Donor i akceptor za splajsovanje su generalno unutar 100 baznih parova od susednog introna. U nekim primerima, metode mogu da obezbede gRNK koje seku približno /- 100-3100 bp u odnosu na svaki spoj eksona/introna od interesa.
[0531] Za bilo koju od strategija uređivanja genoma, uređivanje gena može se potvrditi sekvenciranjem ili PCR analizom.
[0533] Izbor ciljne sekvence
[0535] Pomeranja položaja 5’ granice i/ili 3’ granice u odnosu na određene referentne lokuse mogu se koristiti za olakšavanje ili poboljšanje određenih primena genskog uređivanja, koje delimično zavise od endonukleaznog sistema izabranog za uređivanje, kao što je ovde dalje opisano i ilustrovano.
[0537] U prvom neograničavajućem primeru takve selekcije ciljne sekvence, mnogi endonukleazni sistemi imaju pravila ili kriterijume koji mogu voditi početnu selekciju potencijalnih ciljnih mesta za cepanje, kao što je zahtev za motiv PAM sekvence na određenoj poziciji pored mesta cepanja DNK u slučaju endonukleaza CRISPR tipa II ili tipa V.
[0539] U drugom neograničavajućem primeru selekcije ili optimizacije ciljne sekvence, učestalost aktivnosti van cilja za određenu kombinaciju ciljne sekvence i endonukleaze za uređivanje gena (tj. učestalost pojavljivanja DSB na mestima koja nisu odabrana ciljna sekvenca) može se proceniti u odnosu na učestalost aktivnosti na cilju. U nekim slučajevima, ćelije koje su pravilno izmenjene na željenom lokusu mogu imati selektivnu prednost u odnosu na druge ćelije. Ilustrativni, ali neograničavajući, primeri selektivne prednosti uključuju sticanje atributa kao što su poboljšane stope replikacije, perzistentnost, otpornost na određene uslove, poboljšane stope uspešnog kalemljenja ili perzistentnosti in vivo nakon unošenja u pacijenta, i drugi atributi povezani sa održavanjem ili povećanim brojem ili vitalnošću takvih ćelija. U drugim slučajevima, ćelije koje su pravilno izmenjene na željenom lokusu mogu biti pozitivno odabrane jednom ili više metoda skrininga koje se koriste za identifikaciju, sortiranje ili na drugi način selekciju ćelija koje su pravilno izmenjene. I postupci selektivne prednosti i postupci usmerene selekcije mogu iskoristiti fenotip povezan sa promenom. U nekim slučajevima, ćelije se mogu izmeniti dva ili više puta kako bi se stvorila druga modifikacija koja stvara novi fenotip koji se koristi za selekciju ili prečišćavanje željene populacije ćelija. Takva druga modifikacija može se stvoriti dodavanjem druge gRNK koja omogućava ekspresiju selektabilnog ili skrining markera. U nekim slučajevima, ćelije se mogu pravilno izmeniti na željenom lokusu korišćenjem DNK fragmenta koji sadrži cDNK, a takođe i selektabilni marker.
[0541] Bez obzira da li je primenljiva bilo kakva selektivna prednost ili treba primeniti bilo kakvu usmerenu selekciju u određenom slučaju, izbor ciljne sekvence može se, takođe, voditi razmatranjem frekvencija van cilja kako bi se poboljšala efikasnost primene i/ili smanjio potencijal za neželjene izmene na mestima koja nisu željena meta. Kao što je dalje opisano i ilustrovano ovde i u tehnici, na pojavu aktivnosti van cilja može uticati niz faktora, uključujući sličnosti i razlike između ciljnog mesta i različitih mesta van cilja, kao i određenu endonukleazu koja se koristi.
[0542] Dostupni su bioinformatički alati koji pomažu u predviđanju aktivnosti van cilja, i često se takvi alati mogu koristiti i za identifikaciju najverovatnijih mesta aktivnosti van cilja, koja se zatim mogu proceniti u eksperimentalnim uslovima kako bi se procenila relativna frekvencija aktivnosti van cilja u odnosu na aktivnost na cilju, čime se omogućava izbor sekvenci koje imaju veće relativne aktivnosti na cilju. Ilustrativni primeri takvih tehnika su ovde dati, a druge su poznate u tehnici.
[0544] Još jedan aspekt selekcije ciljne sekvence odnosi se na homologne rekombinacione događaje. Sekvence koje dele regione homologije mogu poslužiti kao žarišta za homologne rekombinacione događaje koji rezultiraju brisanjem interventnih sekvenci. Takvi rekombinacioni događaji se dešavaju tokom normalnog toka replikacije hromozoma i drugih DNK sekvenci, a takođe i u drugim vremenima kada se DNK sekvence sintetišu, kao što je slučaj popravki dvolančanih prekida (DSB), koji se redovno dešavaju tokom normalnog ciklusa replikacije ćelija, ali se takođe mogu pojačati pojavom različitih događaja (kao što su UV svetlost i drugi induktori lomljenja DNK) ili prisustvom određenih agenasa (kao što su različiti hemijski induktori). Mnogi takvi induktori uzrokuju da se DSB neselektivno javljaju u genomu, a DSB se mogu redovno indukovati i popravljati u normalnim ćelijama. Tokom popravke, originalna sekvenca se može rekonstruisati sa potpunom vernošću, međutim, u nekim slučajevima, male insercije ili delecije (nazvane „indeli“) se uvode na mesto DSB.
[0546] DSB se, takođe, mogu specifično indukovati na određenim lokacijama, kao u slučaju endonukleaznih sistema opisanih ovde, koji se mogu koristiti za izazivanje usmerenih ili preferencijalnih događaja modifikacije gena na odabranim hromozomskim lokacijama. Tendencija da homologne sekvence budu podložne rekombinaciji u kontekstu popravke DNK (kao i replikacije) može se iskoristiti u brojnim okolnostima i osnova je za jednu primenu sistema za uređivanje gena, kao što je CRISPR, u kome se homologna usmerena popravka koristi za umetanje sekvence od interesa, obezbeđene upotrebom „donorskog“ polinukleotida, u željenu hromozomsku lokaciju.
[0548] Regioni homologije između određenih sekvenci, koji mogu biti mali regioni „mikrohomologije“ koji mogu obuhvatiti samo deset baznih parova ili manje, takođe se mogu koristiti za postizanje željenih delecija. Na primer, jedan DSB može biti uveden na mesto koje pokazuje mikrohomologiju sa obližnjom sekvencom. Tokom normalnog toka popravke takvog DSB, rezultat koji se javlja sa velikom učestalošću je delecija intervenirajuće sekvence kao rezultat rekombinacije koju olakšava DSB i prateći proces ćelijske popravke.
[0550] Međutim, u nekim okolnostima, odabir ciljnih sekvenci unutar regiona homologije može dovesti i do mnogo većih delecija, uključujući fuzije gena (kada su delecije u kodirajućim regionima), što može, ali i ne mora biti poželjno u datim okolnostima.
[0552] Primeri dati ovde dodatno ilustruju izbor različitih ciljnih regiona za kreiranje DSB dizajniranih da indukuju insercije, delecije ili mutacije koje rezultiraju smanjenjem ili eliminacijom aktivnosti SCN9A proteina, kao i izbor specifičnih ciljnih sekvenci unutar takvih regiona koje su dizajnirane da minimiziraju događaje van cilja u odnosu na događaje na cilju.
[0554] Humane ćelije
[0556] Za ublažavanje bola ili bilo kog poremećaja povezanog sa SCN9A, kao što je ovde opisano i ilustrovano, glavne mete za gensko uređivanje su humane ćelije. Na primer, u ex vivo postupcima, humane ćelije mogu biti somatske ćelije, koje nakon modifikacije korišćenjem opisanih tehnika mogu dati porast diferenciranih ćelija, npr. neurona perifernog nervnog sistema ili ćelija progenitora. Na primer, u in vivo postupcima, humane ćelije mogu biti neuroni perifernog nervnog sistema ili ćelije iz drugih pogođenih organa.
[0558] Izvođenjem genskog uređivanja u autolognim ćelijama koje su izvedene iz pacijenta kome je potrebna pomoć i stoga su već potpuno usklađene sa njim, moguće je generisati ćelije koje se mogu bezbedno ponovo uneti u pacijenta i efikasno stvoriti populaciju ćelija koje će biti efikasne u ublažavanju jednog ili više kliničkih stanja povezanih sa bolešću pacijenta.
[0560] Matične ćelije su sposobne i za proliferaciju i za stvaranje više ćelija progenitora, koje zauzvrat imaju sposobnost da generišu veliki broj matičnih ćelija koje zauzvrat mogu dati poreklo diferenciranim ili diferencijabilnim ćelijama-ćelijama. Same ćerke ćelije mogu biti indukovane da proliferiraju i proizvode potomstvo koje se potom diferencira u jedan ili više tipova zrelih ćelija, dok istovremeno zadržavaju jednu ili više ćelija sa roditeljskim razvojnim potencijalom. Izraz „matična ćelija“ se, dakle, odnosi na ćeliju sa kapacitetom ili potencijalom, pod određenim okolnostima, da se diferencira u specijalizovaniji ili diferenciraniji fenotip, i koja zadržava kapacitet, pod određenim okolnostima, da se proliferira bez značajne diferencijacije. U jednom aspektu, izraz progenitor ili matična ćelija se odnosi na generalizovanu matičnu ćeliju čiji se potomci (potomstvo) specijalizuju, često u različitim pravcima, diferencijacijom, npr. sticanjem potpuno individualnih karakteristika, kao što se dešava u progresivnoj diverzifikaciji embrionalnih ćelija i tkiva. Ćelijska diferencijacija je složen proces koji se obično odvija kroz mnoge ćelijske deobe. Diferencirana ćelija može nastati iz multipotentne ćelije koja je, sama po sebi, izvedena iz multipotentne ćelije, i tako dalje. Iako se svaka od ovih multipotentnih ćelija može smatrati matičnim ćelijama, raspon tipova ćelija koje svaka može dati može značajno da varira. Neke diferencirane ćelije takođe imaju sposobnost da daju ćelije većeg razvojnog potencijala. Takav kapacitet može biti prirodan ili može biti veštački indukovan tretmanom različitim faktorima. U mnogim biološkim slučajevima, matične ćelije takođe mogu biti „multipotentne“ jer mogu da proizvedu potomstvo više od jednog različitog tipa ćelija, ali to nije neophodno za „matičnost“.
[0561] Samoobnavljanje može biti još jedan važan aspekt matičnih ćelija. U teoriji, samoobnavljanje se može dogoditi putem dva glavna mehanizma. Matične ćelije se mogu deliti asimetrično, pri čemu jedna ćerka zadržava matično stanje, a druga ćerka ispoljava neku posebnu specifičnu funkciju i fenotip. Alternativno, neke od matičnih ćelija u populaciji mogu se simetrično podeliti na dva stabla, čime se neke matične ćelije održavaju u populaciji kao celini, dok druge ćelije u populaciji daju samo diferencirano potomstvo. Generalno, „progenitorske ćelije“ imaju ćelijski fenotip koji je primitivniji. (tj. nalazi se u ranijoj fazi razvojnog puta ili progresije nego što je to potpuno diferencirana ćelija). Često, progenitorske ćelije, takođe, imaju značajan ili veoma visok proliferativni potencijal. Progenitorske ćelije mogu dati poreklo više različitih diferenciranih tipova ćelija ili samo jednom diferenciranom tipu ćelija, u zavisnosti od razvojnog puta i okruženja u kome se ćelije razvijaju i diferenciraju.
[0563] U kontekstu ćelijske ontogeneze, pridev „diferenciran“ ili „diferencirajući“ je relativan pojam. „Diferencirana ćelija“ je ćelija koja je dalje napredovala na razvojnom putu od ćelije sa kojom se upoređuje. Dakle, matične ćelije se mogu diferencirati u ćelije prekursore ograničene lozom (kao što je ćelija prekursor miocita), koje se zauzvrat mogu diferencirati u druge tipove ćelija prekursora dalje na tom putu (kao što je prekursor miocita), a zatim u ćeliju diferenciranu u završnoj fazi, kao što je miocit, koji igra karakterističnu ulogu u određenom tipu tkiva i može, ali i ne mora zadržati sposobnost dalje proliferacije.
[0564] Indukovane pluripotentne matične ćelije
[0566] Genetski modifikovane humane ćelije opisane ovde mogu biti indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC). Prednost korišćenja iPSC je u tome što ćelije mogu biti izvedene od istog subjekta kome će se progenitorske ćelije primeniti. To jest, somatska ćelija se može dobiti od subjekta, reprogramirati u indukovanu pluripotentnu matičnu ćeliju, a zatim ponovo diferencirati u progenitorsku ćeliju koja će se primeniti na subjekta (npr. autologne ćelije). Pošto su progenitori u suštini izvedeni iz autolognog izvora, rizik od odbacivanja kalemljenja ili alergijske reakcije može se smanjiti u poređenju sa upotrebom ćelija od drugog subjekta ili grupe subjekata. Pored toga, upotreba iPSC negira potrebu za ćelijama dobijenim iz embrionalnog izvora. Dakle, u jednom aspektu, matične ćelije koje se koriste u opisanim postupcima nisu embrionalne matične ćelije.
[0568] Iako je diferencijacija generalno nepovratna u fiziološkim kontekstima, nedavno je razvijeno nekoliko metoda za reprogramiranje somatskih ćelija u iPSC. Primeri postupaka su poznati stručnjacima u tehnici i ukratko su opisani u nastavku.
[0570] Izraz „reprogramiranje“ odnosi se na proces koji menja ili obrće stanje diferencijacije diferencirane ćelije. (npr. somatska ćelija). Drugim rečima, reprogramiranje se odnosi na proces usmeravanja diferencijacije ćelije unazad ka nediferenciranijem ili primitivnijem tipu ćelije. Treba napomenuti da stavljanje mnogih primarnih ćelija u kulturu može dovesti do gubitka potpuno diferenciranih karakteristika. Dakle, samo kultivisanje takvih ćelija obuhvaćenih terminom diferencirane ćelije ne čini ove ćelije nediferenciranim ćelijama (npr. nediferencirane ćelije) ili pluripotentne ćelije. Prelazak diferencirane ćelije u pluripotentnost zahteva stimulus reprogramiranja pored stimulusa koji dovode do delimičnog gubitka diferenciranog karaktera u kulturi. Reprogramirane ćelije, takođe, imaju karakteristiku kapaciteta produženog pasiranja bez gubitka potencijala rasta, u odnosu na primarne ćelijske roditelje, koje generalno imaju kapacitet za samo ograničen broj deoba u kulturi.
[0572] Ćelija koja se reprogramira može biti delimično ili terminalno diferencirana pre reprogramiranja. Reprogramiranje može obuhvatiti potpuno vraćanje stanja diferencijacije diferencirane ćelije. (npr. somatske ćelije) u pluripotentno stanje ili multipotentno stanje. Reprogramiranje može obuhvatiti potpunu ili delimičnu reverziju stanja diferencijacije diferencirane ćelije (npr. somatske ćelije) u nediferenciranu ćeliju (npr. ćelija slična embrionu). Reprogramiranje može dovesti do ekspresije određenih gena od strane ćelija, čija ekspresija dodatno doprinosi reprogramiranju. U određenim primerima opisanim ovde, reprogramiranje diferencirane ćelije (npr. somatske ćelije) može dovesti do toga da diferencirana ćelija pređe u nediferencirano stanje (npr. je nediferencirana ćelija). Dobijene ćelije se nazivaju „reprogramirane ćelije“ ili „indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC ili iPS ćelije)“.
[0574] Reprogramiranje može uključivati izmene, npr. preokret, barem nekih od naslednih obrazaca modifikacije nukleinskih kiselina (npr. metilacija), kondenzacija hromatina, epigenetske promene, genomski imprinting, itd., koji se javljaju tokom ćelijske diferencijacije. Reprogramiranje se razlikuje od jednostavnog održavanja postojećeg nediferenciranog stanja ćelije koja je već pluripotentna ili održavanja postojećeg manje nego potpuno diferenciranog stanja ćelije koja je već multipotentna ćelija (npr. miogena matična ćelija). Reprogramiranje se takođe razlikuje od podsticanja samoobnavljanja ili proliferacije ćelija koje su već pluripotentne ili multipotentne, iako se kompozicije i postupci opisani ovde mogu koristiti i za takve svrhe, u nekim primerima.
[0576] U tehnici je poznato mnogo postupaka koje se mogu koristiti za generisanje pluripotentnih matičnih ćelija iz somatskih ćelija. Bilo koji takav postupak koji reprogramira somatsku ćeliju u pluripotentni fenotip bila bi prikladna za upotrebu u postupcima opisanim ovde.
[0578] Opisane su metodologije reprogramiranja za generisanje pluripotentnih ćelija korišćenjem definisanih kombinacija transkripcionih faktora. Somatske ćelije miša mogu se pretvoriti u ćelije slične ES ćelijama sa proširenim razvojnim potencijalom direktnom transdukcijom Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc; videti, npr. Takahashi and Yamanaka, Cell 126(4): 663-76 (2006)). iPSC podsećaju na ES ćelije, jer obnavljaju transkripciona kola povezana sa pluripotencijom i veliki deo epigenetskog pejzaža. Pored toga, mišje iPSC zadovoljavaju sve standardne testove za pluripotenciju: konkretno, in vitro diferencijacija u ćelijske tipove tri klicina sloja, formiranje teratoma, doprinos himerama, prenos klicine linije [videti, npr. Maherali and Hochedlinger, Cell Stem Cell.3(6):595‑605 (2008)], i tetraploidna komplementacija.
[0580] Humane iPSC se mogu dobiti korišćenjem sličnih postupaka transdukcije, a trio transkripcionih faktora, OCT4, SOX2 i NANOG, utvrđen je kao osnovni skup transkripcionih faktora koji upravljaju pluripotencijom; videti, npr Budniatzky and Gepstein, Stem Cells Transl Med.
[0581] 3(4):448‑57 (2014); Barrett et al., Stem Cells Trans Med 3:1‑6 sctm.2014‑0121 (2014); Focosi et al., Blood Cancer Journal 4: e211 (2014); i reference navedene u njima. Proizvodnja iPSC može se postići unošenjem sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju gene povezane sa matičnim ćelijama u odraslu, somatsku ćeliju, istorijski koristeći virusne vektore.
[0583] iPSK mogu biti generisane ili izvedene iz terminalno diferenciranih somatskih ćelija, kao i iz odraslih matičnih ćelija ili somatskih matičnih ćelija. To jest, nepluripotentna progenitorska ćelija može se učiniti pluripotentnom ili multipotentnom reprogramiranjem. U takvim slučajevima, možda neće biti potrebno uključiti onoliko faktora reprogramiranja koliko je potrebno za reprogramiranje terminalno diferencirane ćelije. Dalje, reprogramiranje može biti indukovano nevirusnim uvođenjem faktora reprogramiranja, npr. uvođenjem samih proteina, ili uvođenjem nukleinskih kiselina koje kodiraju faktore reprogramiranja, ili uvođenjem informacionih RNK koje nakon translacije proizvode faktore reprogramiranja (videti npr. Warren et al., Cell Stem Cell, 7(5):618‑30 (2010). Reprogramiranje se može postići uvođenjem kombinacije nukleinskih kiselina koje kodiraju gene povezane sa matičnim ćelijama, uključujući, na primer, Oct-4 (takođe poznat kao Oct‑3/4 ili Pouf51), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klfl, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, 1-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, i LIN28. Reprogramiranje korišćenjem postupaka i kompozicija opisanih ovde može dalje da obuhvati uvođenje jednog ili više Oct-3/4, člana porodice Sox, člana porodice Klf i člana porodice Myc u somatsku ćeliju. Postupci i kompozicije opisane ovde mogu dalje da obuhvate uvođenje jednog ili više od svakog od Oct-4, Sox2, Nanog, c-MYC i Klf4 za reprogramiranje. Kao što je gore navedeno, tačna metoda koja se koristi za reprogramiranje nije nužno kritična za postupke i kompozicije opisane ovde. Međutim, tamo gde se koriste ćelije diferencirane od reprogramiranih ćelija, npr. humana terapija, u jednom aspektu reprogramiranje se ne vrši postupkom koji menja genom. Stoga, u takvim primerima, reprogramiranje se može postići, npr. bez upotrebe virusnih ili plazmidnih vektora.
[0585] Efikasnost reprogramiranja (tj. broj reprogramiranih ćelija) izvedenih iz populacije početnih ćelija može se povećati dodatkom različitih agenasa, npr. mali molekuli, kao što je pokazano od strane Shi et al., Cell-Stem Cell
[0587] 2:525‑528 (2008); Huangfu et al., Nature Biotechnology 26(7):795‑797 (2008) and Marson et al., Cell-Stem Cell 3:132‑135 (2008). Dakle, sredstvo ili kombinacija sredstava koja poboljšavaju efikasnost ili brzinu indukovane proizvodnje pluripotentnih matičnih ćelija mogu se koristiti u proizvodnji iPSC specifičnih za pacijenta ili bolest. Neki neograničavajući primeri sredstava koja poboljšavaju efikasnost reprogramiranja uključuju rastvorljivi Wnt, Wnt uslovljene medijume, BIX-01294 (histon metiltransferaza G9a), PD0325901 (inhibitor MEK), inhibitore DNK metiltransferaze, inhibitore histon deacetilaze (HDAC), valproinsku kiselinu, 5’-azacitidin, deksametazon, suberoilanilid, hidroksaminsku kiselinu (SAHA), vitamin C i trihostatin (TSA), između ostalog.
[0589] Drugi neograničavajući primeri sredstava za poboljšanje reprogramiranja uključuju: Suberoilanilid hidroksamsku kiselinu (SAHA) (npr. MK0683, vorinostat) i druge hidroksaminske kiseline), BML-210, Depudecin (npr. (-)-Depudecin), HC toksin, Nullscript (4-(1,3-diokso-1H,3H-benzo[de]izohinolin-2-il)-N-hidroksibutanamid), fenilbutirat (npr. natrijum fenilbutirat) i valproinska kiselina ((VP A) i druge masne kiseline kratkog lanca), Skriptejd, Suramin natrijum, Trihostatin A (TSA), APHA jedinjenje 8, Apicidin, Natrijum butirat, pivaloiloksimetil butirat (Pivaneks, AN-9), Trapoksin B, Hlamidocin, Depsipeptid (takođe poznat kao FR901228 ili FK228), benzamidi (npr. CI-994 (npr. N-acetil dinalin) i MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ‑824, CBHA (m-karboksicinaminska kiselina bihidroksamska kiselina), JNJ16241199, Tubacin, A‑161906, proksamid, oksamflatin, 3-Cl-UCHA (npr.6-(3-hlorofenilureido) kaproinska hidroksaminska kiselina), AOE (2-amino-8-okso-9,10-epoksidekanoinska kiselina), CHAP31 i CHAP 50. Drugi agensi za poboljšanje reprogramiranja uključuju, na primer, dominantno negativne oblike HDAC (npr. katalitički neaktivni oblici), siRNK inhibitore HDAC i antitela koja se specifično vezuju za HDAC. Takvi inhibitori su dostupni, npr. od kompanija BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals, MethylGene, i Sigma Aldrich.
[0591] Da bi se potvrdila indukcija pluripotentnih matičnih ćelija za upotrebu sa postupcima opisanim ovde, izolovani klonovi mogu biti testirani na ekspresiju markera matičnih ćelija. Takva ekspresija u ćeliji izvedenoj iz somatske ćelije identifikuje ćelije kao indukovane pluripotentne matične ćelije. Markeri matičnih ćelija mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja uključuje SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbxl5, Ecatl, Esgl, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Daxl, Zpf296, Slc2a3, Rexl, Utfl, i Natl. U jednom slučaju, na primer, ćelija koja eksprimuje Oct4 ili Nanog je identifikovana kao pluripotentna. Postupci za detekciju ekspresije takvih markera mogu uključivati, na primer, RT-PCR i imunološke metode koje detektuju prisustvo kodiranih polipeptida, kao što su Western blot ili analize protočne citometrije. Detekcija može uključivati ne samo RT-PCR, već može uključivati i detekciju proteinskih markera. Intracelularni markeri se najbolje mogu identifikovati putem RT-PCR ili metoda detekcije proteina kao što je imunocitohemija, dok se markeri na površini ćelija lako identifikuju, npr. imunocitohemijom.
[0592] Pluripotentni karakter matičnih ćelija izolovanih ćelija može se potvrditi testovima koji procenjuju sposobnost iPSC da se diferenciraju u ćelije svakog od tri klicina sloja. Kao jedan primer, formiranje teratoma kod golih miševa može se koristiti za procenu pluripotentnog karaktera izolovanih klonova. Ćelije se mogu uvesti u gole miševe, a histologija i/ili imunohistohemija se mogu izvršiti na tumoru koji nastaje iz ćelija. Rast tumora koji obuhvata ćelije iz sva tri klicina sloja, na primer, dodatno ukazuje na to da su ćelije pluripotentne matične ćelije.
[0594] Ćelije perifernog nervnog sistema
[0596] U nekim aspektima, genetski modifikovane humane ćelije opisane ovde su neuroni i nervi izvan mozga i kičmene moždine. Neuroni, koji obrađuju informacije, i glijalne ćelije, koje pružaju mehaničku i metaboličku podršku nervnom sistemu, su dve glavne klase ćelija perifernog nervnog sistema. Neograničavajući primeri neurona uključuju senzorne neurone (sakupljaju impulse od senzornih receptora u oblastima kao što su koža, mišići i organi i prenose te impulse kroz živce do CNS) i motorne neurone (sakupljaju odlazne poruke iz CNS i dostavljaju ih odgovarajućim organima tela, upućujući ih koje akcije treba preduzeti). Neograničavajući primeri glijalnih ćelija uključuju Švanove ćelije u živcima ili satelitske ćelije u ganglijama.
[0598] Kreiranje iPSC specifičnih za pacijenta
[0600] Jedan korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska može uključivati kreiranje iPS ćelija specifičnih za pacijenta, iPS ćelija specifičnih za pacijenta ili iPS ćelijske linije specifične za pacijenta. Postoji mnogo utvrđenih metoda u tehnici za kreiranje iPS ćelija specifičnih za pacijenta, kao što je opisano kod Takahashi and Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabe et al.2007. Na primer, korak kreiranja može da obuhvati: a) izolovanje somatske ćelije, kao što je ćelija kože ili fibroblast, od pacijenta; i b) unošenje skupa gena povezanih sa pluripotencijom u somatsku ćeliju kako bi se indukovalo da ćelija postane pluripotentna matična ćelija. Skup gena povezanih sa pluripotencijom može biti jedan ili više gena izabranih iz grupe koja se sastoji od OCT4, SOX1, SOX2, SOX3, SOX15, SOX18, NANOG, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5, c-MYC, n-MYC, REM2, TERT i LIN28.
[0601] Izvođenje biopsije ili aspirata tkiva pacijenta
[0603] Biopsija ili aspirat je uzorak tkiva ili tečnosti uzet iz tela. Postoji mnogo različitih vrsta biopsija ili aspirata. Skoro sve one uključuju upotrebu oštrog alata za uklanjanje male količine tkiva. Ako će biopsija biti na koži ili drugom osetljivom području, prvo se može primeniti lek za utrnuće. Biopsija ili aspirat mogu se izvršiti prema bilo kom od poznatih postupaka u tehnici. Na primer, kod aspirata koštane srži, velika igla se koristi za ulazak u karličnu kost radi sakupljanja koštane srži. Na primer, u slučaju biopsije nerva sa kože ili noge radi izolacije neurona perifernog nervnog sistema, nervni segment se iseca, nanoseći minimalnu mehaničku povredu. Izbegava se stiskanje ili istezanje nerva i ne pokušava se prekomerno uklanjanje masti ili vezivnog tkiva.
[0605] Izolovanje neurona perifernog nervnog sistema
[0607] Neuroni perifernog nervnog sistema mogu se izolovati prema bilo kom poznatom postupku u tehnici. Na primer, nervni segment se iseca uz minimalnu mehaničku povredu pod aseptičnim uslovima. Strogo se izbegava stiskanje ili istezanje nerva i ne pokušava se prekomerno uklanjanje masti ili vezivnog tkiva. Pošto su nervna vlakna veoma osetljiva na mehaničke povrede, prvo se vrši rez proksimalnog nerva. Nakon izolacije, najspoljašnji sloj vezivnog tkiva, epineurijum, se uklanja i sakuplja za enzimsku digestiju. Vlakna se cepkaju pomoću finih pinceta dok se svi fascikuli ne razdvoje na pojedinačna vlakna. Epineurijum i cepkana vlakna se zatim podvrgavaju enzimskoj digestiji preko noći pomoću dispaze II i kolagenaze tipa I. Digestirani proizvodi se filtriraju i sakupljaju centrifugiranjem. Dobijene ćelijske suspenzije se nanose na adhezivnu PLL/laminin podlogu. Adherentne ćelije se kultivišu za analizu (Andersen et al., Scientific Reports-Nature, 2016, 6:31781).
[0609] Izolovanje mezenhimalnih matičnih ćelija
[0611] Mezenhimalne matične ćelije mogu se izolovati prema bilo kom postupku poznatom u tehnici, kao što je iz koštane srži pacijenta ili periferne krvi. Na primer, aspirat koštane srži može se sakupiti u špric sa heparinom. Ćelije se mogu isprati i centrifugirati na Percoll-u. Ćelije se mogu kultivisati u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) (sa niskim sadržajem glukoze) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC et al., Science 1999; 284:143‑147).
[0612] Genetski modifikovane ćelije
[0614] Izraz „genetski modifikovana ćelija“ odnosi se na ćeliju koja sadrži najmanje jednu genetsku modifikaciju uvedenu uređivanjem genoma (npr. koristeći sistem CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1). U nekim ex vivo primerima ovde, genetski modifikovana ćelija može biti genetski modifikovana ćelija prekursor. U nekim in vivo primerima ovde, genetski modifikovana ćelija može biti genetski modifikovani neuron perifernog nervnog sistema. Ovde se razmatra genetski modifikovana ćelija koja sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu usmerenu na genom i/ili egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom.
[0616] Izraz „kontrolno tretirana populacija“ opisuje populaciju ćelija koja je tretirana identičnim medijumom, virusnom indukcijom, sekvencama nukleinskih kiselina, temperaturom, konfluentnošću, veličinom bočice, pH itd., sa izuzetkom dodavanja komponenti za uređivanje genoma. Bilo koja metoda poznata u tehnici može se koristiti za merenje transkripcije gena ili ekspresije ili aktivnosti proteina SCN9A, na primer Western Blot analiza proteina SCN9A ili PCR u realnom vremenu za kvantifikaciju SCN9A mRNK.
[0618] Izraz „izolovana ćelija“ odnosi se na ćeliju koja je uklonjena iz organizma u kome je prvobitno pronađena, ili potomka takve ćelije. Opciono, ćelija se može kultivisati in vitro, npr. pod definisanim uslovima ili u prisustvu drugih ćelija. Opciono, ćelija se kasnije može uneti u drugi organizam ili ponovo uneti u organizam iz kojeg je (ili ćelija iz koje potiče) izolovana.
[0620] Izraz „izolovana populacija“ u odnosu na izolovanu populaciju ćelija odnosi se na populaciju ćelija koja je uklonjena i odvojena iz mešovite ili heterogene populacije ćelija. U nekim slučajevima, izolovana populacija može biti suštinski čista populacija ćelija, u poređenju sa heterogenom populacijom iz koje su ćelije izolovane ili obogaćene. U nekim slučajevima, izolovana populacija može biti izolovana populacija humanih ćelija progenitora, npr. suštinski čista populacija humanih progenitorskih ćelija, u poređenju sa heterogenom populacijom ćelija koja obuhvata humane progenitorske ćelije i ćelije iz kojih su humane progenitorske ćelije izvedene.
[0622] Izraz „značajno poboljšan“, u odnosu na određenu ćelijsku populaciju, odnosi se na populaciju ćelija u kojoj je pojava određenog tipa ćelija povećana u odnosu na postojeće ili referentne nivoe, najmanje 2 puta, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 50, najmanje 100, najmanje 400, najmanje 1000, najmanje 5000, najmanje 20000, najmanje 100000 ili više puta, u zavisnosti od npr. željenih nivoa takvih ćelija za ublažavanje bola.
[0624] Izraz „značajno obogaćen“ u odnosu na određenu ćelijsku populaciju, odnosi se na populaciju ćelija koja je najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% ili više u odnosu na ćelije koje čine ukupnu ćelijsku populaciju.
[0626] Izraz „suštinski čist“ u odnosu na određenu ćelijsku populaciju, odnosi se na populaciju ćelija koja je najmanje oko 75%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95% čista u odnosu na ćelije koje čine ukupnu ćelijsku populaciju. To jest, izrazi „u suštini/suštinski čist“ ili „u suštini/suštinski prečišćen“, u odnosu na populaciju ćelija progenitora, odnose se na populaciju ćelija koje sadrže manje od oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 9%, oko 8%, oko 7%, oko 6%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, oko 2%, oko 1% ili manje od 1% ćelija koje nisu ćelije progenitora kako je definisano ovde navedenim izrazima.
[0628] Diferencijacija genomski modifikovanih iPSC u ćelije perifernog nervnog sistema
[0630] Još jedan korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska mogu obuhvatiti diferencijaciju iPSC sa izmenjenim genomom u ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama). Korak diferencijacije može se izvršiti prema bilo kom postupku poznatom u tehnici. Na primer, neuronska diferencijacija iPSC se indukuje korišćenjem kombinacije neurotrofičnog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), neurotrofičnog faktora izvedenog iz glijalnih ćelija (GDNF), faktora rasta nerava (NGF) i dibutiril cikličnog AMP (dbcAMP). Zatim se neuronske ćelije izvedene iz iPSC dalje diferenciraju u Švanove ćelije korišćenjem cilijarnog neurotrofičnog faktora (CNTF), neuregulina 1β i dbcAMP (Wang et al., Biomaterials. 2011; 32(22): 5023‑5032).
[0632] Diferencijacija genomski modifikovanih mezenhimalnih matičnih ćelija u ćelije perifernog nervnog sistema
[0634] Još jedan korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska mogu obuhvatiti diferencijaciju genomski modifikovanih mezenhimalnih matičnih ćelija u ćelije perifernog nervnog sistema (npr. neuron ili glijalna ćelija kao što je Švanova ćelija u nervima ili satelitska glijalna ćelija u ganglijama). Korak diferencijacije može se izvršiti prema bilo kom postupku poznatom u tehnici. Na primer, MSK se tretiraju različitim faktorima i hormonima, uključujući bazični faktor rasta fibroblasta, humani rekombinantni faktor rasta izveden iz trombocita, forskolin i glijalni faktor rasta-2 (Ladak et al., Experimental Neurology 228 (2011) 242‑252).
[0636] Implantacija ćelija u pacijente
[0638] Još jedan korak ex vivo postupka predmetnog pronalaska mogu obuhvatiti implantaciju neurona perifernog nervnog sistema sa izmenjenim genomom u pacijente. Ovaj korak implantacije može se obaviti korišćenjem bilo koje metode implantacije poznate u tehnici. Na primer, genetski modifikovane ćelije mogu se ubrizgati direktno u krv pacijenta ili na drugi način primeniti pacijentu.
[0640] III. FORMULACIJE I ISPORUKA
[0642] Farmaceutski prihvatljivi nosači
[0644] Ex vivo postupci primene progenitorskih ćelija subjektu koje se ovde razmatraju uključuju upotrebu terapeutskih kompozicija koje sadrže progenitorske ćelije.
[0646] Terapeutske kompozicije mogu da sadrže fiziološki podnošljiv nosač zajedno sa ćelijskom kompozicijom, i opciono najmanje jedno dodatno bioaktivno sredstvo kako je ovde opisano, rastvoreno ili dispergovano u njoj kao aktivni sastojak. U nekim slučajevima, terapeutska kompozicija nije suštinski imunogena kada se primenjuje na sisara ili ljudskog pacijenta u terapeutske svrhe, osim ako se to ne želi.
[0648] Generalno, progenitorske ćelije opisane ovde mogu se primenjivati kao suspenzija sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Stručnjak u tehnici će prepoznati da farmaceutski prihvatljiv nosač koji se koristi u ćelijskoj kompoziciji neće sadržati pufere, jedinjenja, sredstva za krioprezervaciju, konzervanse ili druge agense u količinama koje značajno ometaju vitalnost ćelija koje se isporučuju subjektu. Formulacija koja sadrži ćelije može da sadrži npr. osmotske pufere koji omogućavaju održavanje integriteta ćelijske membrane i opciono, hranljive materije za održavanje vitalnosti ćelija ili poboljšanje prihvatanja nakon primene. Takve formulacije i suspenzije su poznate stručnjacima u tehnici i/ili se mogu prilagoditi za upotrebu sa progenitorskim ćelijama, kao što je ovde opisano, korišćenjem rutinskog eksperimentisanja.
[0650] Ćelijska kompozicija može biti emulgovana ili predstavljena kao lipozomska kompozicija, pod uslovom da postupak emulgiranja ne utiče negativno na vitalnost ćelija. Ćelije i bilo koji drugi aktivni sastojak mogu se mešati sa ekscipijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom, i u količinama pogodnim za upotrebu u terapeutskim postupcima opisanim ovde.
[0652] Dodatni agensi uključeni u ćelijski sastav mogu da uključuju farmaceutski prihvatljive soli komponenti u njemu. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju adicione soli kiselina (formirane sa slobodnim amino grupama polipeptida) koje se formiraju sa neorganskim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organske kiseline kao što su sirćetna, vinska, bademova i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu biti izvedene iz neorganskih baza, kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksidi, i organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain i slično.
[0654] Fiziološki podnošljivi nosači su dobro poznati u tehnici. Primeri tečnih nosača su sterilni vodeni rastvori koji ne sadrže nikakve materijale pored aktivnih sastojaka i vode, ili sadrže pufer kao što je natrijum fosfat na fiziološkoj pH vrednosti, fiziološki rastvor ili oba, kao što je fosfatno puferovani fiziološki rastvor. Dalje, vodeni nosači mogu da sadrže više od jedne puferske soli, kao i soli kao što su natrijum i kalijum hloridi, dekstroza, polietilen glikol i druge rastvorene supstance. Tečne kompozicije takođe mogu da sadrže tečne faze pored i isključujući vodu. Primeri takvih dodatnih tečnih faza su glicerin, biljna ulja kao što je ulje semena pamuka i emulzije voda-ulje. Količina aktivnog jedinjenja koje se koristi u ćelijskim kompozicijama, a koja je efikasna u lečenju određenog poremećaja ili stanja, može zavisiti od prirode poremećaja ili stanja i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama.
[0656] Formulacija vodeće RNK
[0658] Vodeće RNK predmetnog pronalaska mogu se formulisati sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su nosači, rastvarači, stabilizatori, adjuvansi, razblaživači itd., u zavisnosti od određenog načina primene i doznog oblika. Kompozicije vodičkih RNK mogu se formulisati da bi se postigao fiziološki kompatibilan pH, i da se kreće od pH od oko 3 do pH od oko 11, od oko pH 3 do oko pH 7, u zavisnosti od formulacije i načina primene. U nekim slučajevima, pH se može podesiti na raspon od oko pH 5.0 do oko pH 8. U nekim slučajevima, kompozicije mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog jedinjenja kako je ovde opisano, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Opciono, kompozicije mogu da sadrže kombinaciju jedinjenja opisanih ovde, ili mogu da sadrže drugi aktivni sastojak koristan u lečenju ili prevenciji rasta bakterija (na primer i bez ograničenja, antibakterijska ili antimikrobna sredstva), ili mogu da sadrže kombinaciju reagensa predmetnog pronalaska.
[0660] Pogodni ekscipijensi uključuju, na primer, molekule nosače koji uključuju velike, sporo metabolizujuće makromolekule kao što su proteini, polisaharidi, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne amino-kiseline, kopolimeri amino-kiselina i neaktivne virusne čestice. Drugi primeri ekscipijenasa mogu uključivati antioksidante (na primer i bez ograničenja, askorbinsku kiselinu), helatirajuća sredstva (na primer i bez ograničenja, EDTA), ugljene hidrate (na primer i bez ograničenja, dekstrin, hidroksialkilcelulozu i hidroksialkilmetilcelulozu), stearinsku kiselinu, tečnosti (na primer i bez ograničenja, ulja, vodu, fiziološki rastvor, glicerol i etanol), sredstva za kvašenje ili emulgiranje, supstance za puferovanje pH i slično.
[0662] Isporuka
[0664] Vodeći RNK polinukleotidi (RNK ili DNK) i/ili endonukleazni polinukleotid(i) (RNK ili DNK) mogu se isporučiti virusnim ili nevirusnim sredstvima za isporuku poznatim u tehnici. Alternativno, endonukleazni polipeptid(i) može se isporučiti virusnim ili nevirusnim sredstvima za isporuku poznatim u tehnici, kao što su elektroporacija ili lipidne nanočestice. U daljim alternativnim aspektima, DNK endonukleaza može se isporučiti kao jedan ili više polipeptida, bilo sami ili prethodno u kompleksu sa jednom ili više vodijućih RNK, ili jednom ili više crRNK zajedno sa tracrRNK.
[0666] Polinukleotidi se mogu isporučiti nevirusnim sredstvima za isporuku, uključujući, ali ne ograničavajući se na, nanočestice, lipozome, ribonukleoproteine, pozitivno naelektrisane peptide, male molekule RNK-konjugate, aptamer-RNK himere i RNK-fuzione proteinske komplekse. Neka primerna nevirusna sredstva za isporuku opisana su u Peer and Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127‑1133 (2011) (koji se fokusira na nevirusna sredstva za isporuku siRNK koja su, takođe, korisna za isporuku drugih polinukleotida).
[0668] Za polinukleotide predmetnog pronalaska, formulacija može biti izabrana iz bilo koje od onih opisanih, na primer, u međunarodnoj prijavi PCT/US2012/069610.
[0670] Polinukleotidi, kao što su vodeća RNK, sgRNK i mRNK koje kodiraju endonukleazu, mogu se dostaviti ćeliji ili pacijentu pomoću lipidne nanočestice (LNP).
[0671] LNP se odnosi na bilo koju česticu prečnika manjeg od 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm ili 25 nm. Alternativno, nanočestica može biti veličine od 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm ili 25-60 nm.
[0673] LNP mogu biti napravljene od katjonskih, anjonskih ili neutralnih lipida. Neutralni lipidi, kao što je fuzogeni fosfolipid DOPE ili membranska komponenta holesterol, mogu biti uključeni u LNP kao „pomoćni lipidi“ kako bi se poboljšala transfekciona aktivnost i stabilnost nanočestica. Ograničenja katjonskih lipida uključuju nisku efikasnost zbog loše stabilnosti i brzog klirensa, kao i stvaranje inflamatornih ili antiinflamatornih odgovora.
[0675] LNP mogu, takođe, biti sastavljeni od hidrofobnih lipida, hidrofilnih lipida ili i hidrofobnih i hidrofilnih lipida.
[0677] Bilo koji lipid ili kombinacija lipida koji su poznati u tehnici može se koristiti za proizvodnju LNP. Primeri lipida koji se koriste za proizvodnju LNP su: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-holesterol, DOTAP-holesterol, GAP-DMORIE-DPyPE i GL67A-DOPE-DMPE-polietilen glikol (PEG). Primeri katjonskih lipida su: 98N12‑5, C12‑200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1, i 7C1. Primeri neutralnih lipida su: DPSC, DPPC, POPC, DOPE, i SM. Primeri PEG-modifikovanih lipida su: PEG-DMG, PEG-CerC14, i PEG-CerC20.
[0679] Lipidi se mogu kombinovati u bilo kom broju molarnih odnosa da bi se proizvela LNP. Pored toga, polinukleotid(i) se mogu kombinovati sa lipidom(ima) u širokom rasponu molarnih odnosa da bi se proizvela LNP.
[0681] Kao što je prethodno rečeno, polipeptid usmeren ka mestu i nukleinska kiselina usmerena na genom mogu se primeniti odvojeno ćeliji ili pacijentu. S druge strane, polipeptid usmeren ka mestu može biti prethodno kompleksovan sa jednom ili više vodećih RNK, ili jednom ili više crRNK zajedno sa tracrRNK. Prethodno kompleksovani materijal se zatim može primeniti u ćeliju ili pacijentu. Takav prethodno kompleksovani materijal je poznat kao ribonukleoproteinska čestica (RNP).
[0683] RNK je sposobna da formira specifične interakcije sa RNK ili DNK. Iako se ovo svojstvo koristi u mnogim biološkim procesima, ono takođe nosi rizik od promiskuitetnih interakcija u ćelijskom okruženju bogatom nukleinskim kiselinama. Jedno rešenje za ovaj problem je formiranje ribonukleoproteinskih čestica (RNP), u kojima je RNK prethodno kompleksovana sa endonukleazom. Još jedna prednost RNP je zaštita RNK od degradacije.
[0685] Endonukleaza u RNP može biti modifikovana ili netolerantna. Slično tome, gRNK, crRNK, tracrRNK ili sgRNK mogu biti modifikovane ili netolerantne. Brojne modifikacije su poznate u tehnici i mogu se koristiti.
[0687] Endonukleaza i sgRNK se generalno mogu kombinovati u molarnom odnosu 1:1. Alternativno, endonukleaza, crRNK i tracrRNK se generalno mogu kombinovati u molarnom odnosu 1:1:1. Međutim, širok raspon molarnih odnosa može se koristiti za proizvodnju RNP.
[0689] AAV (adenoasocirani virus)
[0691] Rekombinantni vektor adeno-asociranog virusa (AAV) može se koristiti za isporuku. Tehnike za proizvodnju rAAV čestica, u kojima se AAV genom koji treba upakovati, a koji uključuje polinukleotid koji treba isporučiti, rep i cap gene i funkcije pomoćnih virusa, obezbeđuju ćeliji, standardne su u tehnici. Proizvodnja rAAV obično zahteva da sledeće komponente budu prisutne u jednoj ćeliji (ovde označenoj kao ćelija za pakovanje): rAAV genom, AAV rep i cap geni odvojeni od (tj. ne u) genomu rAAV i funkcijama pomoćnog virusa. Geni AAV rep i cap mogu biti iz bilo kog serotipa AAV za koji se može izvesti rekombinantni virus, i mogu biti iz različitog serotipa AAV od ITR genoma rAAV, uključujući, ali ne ograničavajući se na, serotipove AAV opisane ovde. Proizvodnja pseudotipizovanog rAAV je otkrivena, na primer, u međunarodnoj prijavi patenta broj WO 01/83692.
[0693] Serotipovi AAV
[0695] AAV čestice koje pakuju polinukleotide koji kodiraju kompozicije predmetnog pronalaska, npr. endonukleaze, donorske sekvence ili RNK vodič molekula, predmetnog pronalaska mogu da sadrže ili budu izvedene iz bilo kog prirodnog ili rekombinantnog AAV serotipa. Prema predmetnom pronalasku, AAV čestice mogu koristiti ili biti zasnovane na serotipu odabranom iz bilo kog od sledećih serotipova i njihovih varijanti, uključujući, ali ne ograničavajući se na AAV1, AAV10, AAV106.1/hu.37, AAV11, AAV114.3/hu.40, AAV12, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.1/hu.43, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV16.12/hu.11, AAV16.3, AAV16.8/hu.10, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV1-7/rh.48, AAV1-8/rh.49, AAV2, AAV2.5T, AAV2-15/rh.62, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV2-3/rh.61, AAV24.1, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV27.3, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV2G9, AAV-2-pre-miRNA-101, AAV3, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-11/rh.53, AAV3-3, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV3-9/rh.52, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV4-19/rh.55, AAV42.12, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV4-4, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV4-8/r11.64, AAV4-8/rh.64, AAV4-9/rh.54, AAV5, AAV52.1/hu.20, AAV52/hu. 19, AAV5-22/rh.58, AAV5-3/rh.57, AAV54.1/hu.21, AAV54.2/hu.22, AAV54.4R/hu.27, AAV54.5/hu.23, AAV54.7/hu.24, AAV58.2/hu.25, AAV6, AAV6.1, AAV6.1.2, AAV6.2, AAV7, AAV7.2, AAV7.3/hu.7, AAV8, AAV-8b, AAV-8h, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAV-b, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5R1, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAV-DJ, AAV-DJ8, AAVF3, AAVF5, AAV-h, AAVH-1/hu.1, AAVH2, AAVH-5/hu.3, AAVH6, AAVhE1.1, AAVhER1.14, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhER1.23, AAVhEr1.35, AAVhEr1.36, AAVhEr1.5, AAVhEr1.7, AAVhErl.8, AAVhEr2.16, AAVhEr2.29, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AA VhEr2.36, AAVhEr2.4, AAVhEr3.1, AAVhu.1, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.11, AAVhu.12, AAVhu.13, AAVhu.14/9, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.19, AAVhu.2, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.3, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.4, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44R1, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48R1, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.5, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.53, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.6, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.7, AAVhu.8, AAVhu.9, AAVhu.t 19, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVLG-9/hu.39, AAV-LK01, AAV-LK02, AAVLK03, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV-LK19, AAVN721-8/rh.43, AAV-PAEC, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAVpi.1, AAVpi.2, AAVpi.3, AAVrh.10, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.2, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.2R, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.43, AAVrh.44, AAVrh.45, AAVrh.46, AAVrh.47, AAVrh.48, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.50, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.55, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.59, AAVrh.60, AAVrh.61, AAVrh.62, AAVrh.64, AAVrh.64R1, AAVrh.64R2, AAVrh.65, AAVrh.67, AAVrh.68, AAVrh.69, AAVrh.70, AAVrh.72, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh8R, AAVrh8R A586R mutant, AAVrh8R R533A mutant, BAAV, BNP61 AAV, BNP62 AAV, BNP63 AAV, goveđu AAV, kozji AAV, japanski AAV 10, pravi tip AAV (ttAAV), UPENN AAV 10, AAV-LK16, AAAV, AAV Shuffle 100-1, AAV Shuffle 100-2, AAV Shuffle 100-3, AAV Shuffle 100-7, AAV Shuffle 10-2, AAV Shuffle 10-6, AAV Shuffle 10-8, AAV SM 100-10, AAV SM 100-3, AAV SM 10-1, AAV SM 10-2, i/ili AAV SM 10-8.
[0697] U nekim aspektima, serotip AAV može biti, ili imati, mutaciju u AAV9 sekvenci, kao što je opisano od strane N Pulicherla et al. (Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)), kao što su, ali ne ograničavajući se na, AAV9.9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84.
[0699] U nekim aspektima, AAV serotip može biti, ili imati, sekvencu kao što je opisano u U.S. Patentu br. US 6156303, kao što su, ali ne ograničavajući se na, AAV3B (SEQ ID NO: 1 i 10 iz U.S.
[0700] 6156303), AAV6 (SEQ ID NO: 2, 7 i 11 iz U.S. 6156303), AAV2 (SEQ ID NO: 3 i 8 iz U.S.
[0701] 6156303), AAV3A (SEQ ID NO: 4 i 9, iz U.S.6156303), ili njihovi derivati.
[0703] U nekim aspektima, serotip može biti AAVDJ ili njegova varijanta, kao što je AAVDJ8 (ili AAV-DJ8), kako je opisano od strane Grimm et al. (Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)). Amino-kiselinska sekvenca AAVDJ8 može da sadrži dve ili više mutacija kako bi se uklonio domen vezivanja heparina (HBD). Kao neograničavajući primer, sekvenca AAV-DJ opisana kao SEQ ID NO: 1 u U.S. Patentu br. 7,588,772, može obuhvatati dve mutacije: (1) R587Q gde je arginin (R; Arg) na amino-kiselini 587 promenjen u glutamin (Q; Gln) i (2) R590T gde je arginin (R; Arg) na amino-kiselini 590 promenjen u treonin (T; Thr). Kao još jedan neograničavajući primer, može obuhvatati tri mutacije: (1) K406R gde je lizin (K; Lys) na amino-kiselini 406 promenjen u arginin (R; Arg), (2) R587Q gde je arginin (R; Arg) na amino-kiselini 587 promenjen u glutamin (Q; Gln) i (3) R590T gde je arginin (R; Arg) na amino-kiselini 590 promenjen u treonin (T; Thr).
[0705] U nekim aspektima, AAV serotip može biti, ili imati, sekvencu kao što je opisano u Međunarodnoj publikaciji br. WO2015121501, kao što su, ali ne ograničavajući se na, pravi tip AAV (ttAAV) (SEQ ID NO: 2 iz WO2015121501), „UPenn AAV10“ (sekvenca ID br.: 8 iz WO2015121501), „Japanski AAV10“ (SEQ ID NO: 9 iz WO2015121501), ili njihove varijante.
[0707] Prema predmetnom pronalasku, selekcija ili upotreba serotipa kapsida AAV može biti iz različitih vrsta. U jednom primeru, AAV može biti ptičji AAV (AAAV). Serotip AAAV može biti ili imati sekvencu kao što je opisano u U.S. Patent No. 9238800, kao što su, ali ne ograničavajući se na, AAAV (SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 i 14 iz US 9,238,800), ili njihove varijante.
[0709] U jednom primeru, AAV može biti goveđi AAV (BAAV). Serotip BAAV može biti, ili imati, sekvencu kao što je opisano u U.S. Patent No.9,193,769, kao što su, ali ne ograničavajući se na, BAAV (SEQ ID NO: 1 i 6 iz U.S.9193769), ili njihove varijante. Serotip BAAV može biti ili imati sekvencu kao što je opisano u U.S. Patent No. 7427396, kao što su, ali ne ograničavajući se na, BAAV (SEQ ID NO: 5 i 6 iz U.S.7427396), ili njihove varijante.
[0711] U jednom primeru, AAV može biti kozji AAV. Serotip kozjeg AAV može biti, ili imati, sekvencu kao što je opisano u U.S. Patent No.7427396, kao što su, ali ne ograničavajući se na, kozji AAV (SEQ ID NO: 3 iz U.S.7427396), ili njihove varijante.
[0713] U drugim primerima, AAV može biti konstruisan kao hibridni AAV od dva ili više roditeljskih serotipova. U jednom primeru, AAV može biti AAV2G9 koji sadrži sekvence iz AAV2 i AAV9. Serotip AAV2G9 može biti, ili imati, sekvencu kao što je opisano u U.S. Patentnoj objavi br.
[0714] 20160017005.
[0716] U jednom primeru, AAV može biti serotip generisan od strane AAV9 kapsidne biblioteke sa mutacijama u amino-kiselinama 390-627 (VP1 numeracija) kao što je opisano od strane Pulicherla i dr. (Molekularna terapija 19(6):1070-1078 (2011). Serotip i odgovarajuće supstitucije nukleotida i amino-kiselina mogu biti, ali nisu ograničene na, AAV9.1 (G1594C; D532H), AAV6.2 (T1418A and T1436X; V473D and I479K), AAV9.3 (T1238A; F413Y), AAV9.4 (T1250C and A1617T; F417S), AAV9.5 (A1235G, A1314T, A1642G, C1760T; Q412R, T548A, A587V), AAV9.6 (T1231A; F4111), AAV9.9 (G1203A, G1785T; W595C), AAV9.10 (A1500G, T1676C; M559T), AAV9.11 (A1425T, A1702C, A1769T; T568P, Q590L), AAV9.13 (A1369C, A1720T; N457H, T574S), AAV9.14 (T1340A, T1362C, T1560C, G1713A; L447H), AAV9.16 (A1775T; Q592L), AAV9.24 (T1507C, T1521G; W503R), AAV9.26 (A1337G, A1769C; Y446C, Q590P), AAV9.33 (A1667C; D556A), AAV9.34 (A1534G, C1794T; N512D), AAV9.35 (A1289T, T1450A, C1494T, A1515T, C1794A, G1816A; Q430L, Y484N, N98K, V606I), AAV9.40 (A1694T, E565V), AAV9.41 (A1348T, T1362C; T450S), AAV9.44 (A1684C, A1701T, A1737G; N562H, K567N), AAV9.45 (A1492T, C1804T; N498Y, L602F), AAV9.46 (G1441C, T1525C, T1549G; G481R, W509R, L517V), 9.47 (G1241A, G1358A, A1669G, C1745T; S414N, G453D, K557E, T582I), AAV9.48 (C1445T, A1736T; P482L, Q579L), AAV9.50 (A1638T, C1683T, T1805A; Q546H, L602H), AAV9.53 (G1301A, A1405C, C1664T, G1811T; R134Q, S469R, A555V, G604V), AAV9.54 (C1531A, T1609A; L511I, L537M), AAV9.55 (T1605A; F535L), AAV9.58 (C1475T, C1579A; T492I, H527N), AAV.59 (T1336C; Y446H), AAV9.61 (A1493T; N498I), AAV9.64 (C1531A, A1617T; L511I), AAV9.65 (C1335T, T1530C, C1568A; A523D), AAV9.68 (C1510A; P504T), AAV9.80 (G1441A,;G481R), AAV9.83 (C1402A, A1500T; P468T, E500D), AAV9.87 (T1464C, T1468C; S490P), AAV9.90 (A1196T; Y399F), AAV9.91 (T1316G, A1583T, C1782G, T1806C; L439R, K528I), AAV9.93 (A1273G, A1421G, A1638C, C1712T, G1732A, A1744T, A1832T; S425G, Q474R, Q546H, P571L, G578R, T582S, D611V), AAV9.94 (A1675T; M559L) i AAV9.95 (T1605A; F535L).
[0718] U jednom primeru, AAV može biti serotip koji sadrži najmanje jedan AAV kapsidni CD8+ T-ćelijski epitop. Kao neograničavajući primer, serotip može biti AAV1, AAV2 ili AAV8.
[0720] U jednom primeru, AAV može biti varijanta, kao što je PHP.A ili PHP.B kao što je opisano u Deverman. 2016. Nature Biotechnology.34(2): 204-209.
[0722] U jednom primeru, AAV može biti serotip izabran iz bilo kog od onih koji se nalaze u SEQ ID NO: 4734-5302 i Tabeli 2.
[0724] U jednom primeru, AAV može biti kodiran sekvencom, fragmentom ili varijantom kao što je opisano u SEQ ID NO: 4734-5302 i Tabeli 2.
[0726] Opšti principi proizvodnje rAAV su pregledani, na primer, u Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97129). Various approaches are described in Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); U.S. Patent br.
[0727] 5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajućem U.S. Patentu br. 5,658,776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; U.S. Patentu br. 5,786,211; U.S. Patentu br.5,871,982; i U.S. Patentu br.6,258,595.
[0729] Serotipovi AAV vektora mogu se upariti sa tipovima ciljnih ćelija. Na primer, sledeći primerni tipovi ćelija mogu se transdukovati, između ostalog, naznačenim AAV serotipovima.
[0731] Tabela 2. Tipovi tkiva/ćelija i serotipovi
[0733]
[0735] Pored adeno-asociranih virusnih vektora, mogu se koristiti i drugi virusni vektori. Takvi virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, lentivirus, alfavirus, enterovirus, pestivirus, bakulovirus, herpesvirus, Epštajn-Barov virus, papovavirus, poksvirus, virus vakcinije i virus herpes simpleksa.
[0736] U nekim aspektima, Cas9 mRNK, sgRNK koja cilja jedno ili dva mesta u SCN9A genu i donorska DNK mogu se svaka odvojeno formulisati u lipidne nanočestice ili se sve koformulisati u jednu lipidnu nanočesticu.
[0737] U nekim aspektima, Cas9 mRNK može biti formulisana u lipidnoj nanočestici, dok sgRNK i donorska DNK mogu biti isporučene u AAV vektoru.
[0739] Dostupne su opcije za isporuku Cas9 nukleaze kao DNK plazmida, kao iRNK ili kao proteina. Vodeća RNK može biti eksprimirana iz iste DNK ili se može isporučiti i kao RNK. RNK može biti hemijski modifikovana da bi se promenilo ili poboljšalo njeno vreme poluraspada ili smanjila verovatnoća ili stepen imunog odgovora. Endonukleazni protein može biti kompleksiran sa gRNK pre isporuke. Virusni vektori omogućavaju efikasnu isporuku; podeljene verzije Cas9 i manji ortolozi Cas9 mogu biti upakovani u AAV, kao i donori za HDR. Postoji i niz nevirusnih metoda isporuke koje mogu isporučiti svaku od ovih komponenti, ili se nevirusne i virusne postupci mogu koristiti zajedno. Na primer, nanočestice se mogu koristiti za isporuku proteina i vodeće RNK, dok se AAV može koristiti za isporuku donorske DNK.
[0741] U nekim aspektima in vivo terapija zasnovana na njemu, opisana, ali ovde nije zahtevana, virusni vektor(i) koji kodiraju endonukleazu, vodeća RNK i/ili donorsku DNK mogu se dostaviti neuronima perifernog neuronskog sistema, kao što su primarni senzorni i motorni neuroni, putem direktne intraganglionske ili intraspinalne injekcije ili intratekalne isporuke (Hoyng et al., Front Mol Neurosci.2015 Jul 15;8:32).
[0743] IV. DOZIRANJE I PRIMENA
[0745] Izrazi „primena“, „unošenje“ i „transplantacija“ koriste se naizmenično u kontekstu postavljanja ćelija, npr. ćelija progenitora, u subjekta, metodom ili putem koji rezultira barem delimičnom lokalizacijom uvedenih ćelija na željenom mestu, kao što je mesto povrede ili popravke, tako da se proizvede željeni efekat(i). Ćelije npr. progenitorske ćelije ili njihovo diferencirano potomstvo mogu se primenjivati bilo kojim odgovarajućim putem koji rezultira isporukom na željeno mesto kod subjekta gde barem deo implantiranih ćelija ili komponenti ćelija ostaje održiv. Period održivosti ćelija nakon primene kod subjekta može biti kratak kao nekoliko sati, npr. dvadeset četiri sata, do nekoliko dana, do nekoliko godina, ili čak i životni vek pacijenta, tj. dugoročno prihvatanje kalemljenja. Na primer, u nekim aspektima opisanim ovde, efikasna količina ćelija progenitora se primenjuje sistemskim putem primene, kao što je intraperitonealni ili intravenski put.
[0746] Izrazi„pojedinac“, „subjekt“, „domaćin“ i „pacijent“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na bilo kog subjekta za koga je potrebna dijagnoza, lečenje ili terapija. U nekim aspektima, subjekt je sisar. U nekim aspektima, subjekt je ljudsko biće.
[0748] Kada se daju profilaktički, progenitorske ćelije opisane ovde mogu se primeniti kod subjekta pre bilo kog simptoma bola. Shodno tome, profilaktička primena populacije progenitorskih ćelija služi za sprečavanje bola.
[0750] Populacija ćelija progenitora koja se primenjuje prema ovde opisanim postupcima može da obuhvati alogene ćelije progenitora dobijene od jednog ili više donora. Takve ćelije progenitora mogu biti bilo kog ćelijskog ili tkivnog porekla, npr. jetre, mišića, srca, itd. „Alogene“ se odnose na ćeliju progenitora ili biološke uzorke koji sadrže ćelije progenitora dobijene od jednog ili više različitih donora iste vrste, gde geni na jednom ili više lokusa nisu identični. Na primer, populacija ćelija progenitora jetre koja se primenjuje na subjekta može biti izvedena od jednog ili više nesrodnih donora ili od jedne ili više neidentičnih braće i sestara. U nekim slučajevima, mogu se koristiti singene populacije ćelija progenitora, kao što su one dobijene od genetski identičnih životinja ili od identičnih blizanaca. Ćelije progenitora mogu biti autologne ćelije; to jest, ćelije progenitora se dobijaju ili izoloju od subjekta i primenjuju se na istog subjekta, tj. donor i primalac su isti.
[0752] Izraz „efikasna količina“ odnosi se na količinu populacije ćelija progenitora ili njihovog potomstva potrebnu za sprečavanje ili ublažavanje najmanje jednog ili više znakova ili simptoma bola, i odnosi se na dovoljnu količinu kompozicije da bi se obezbedio željeni efekat, npr. za lečenje subjekta koji ima bol. Izraz „terapeutski efikasna količina“ se stoga odnosi na količinu ćelija progenitora ili kompoziciju koja sadrži ćelije progenitora, a koja je dovoljna da pospeši određeni efekat kada se primeni na tipičnog subjekta, kao što je onaj koji ima ili je u riziku od bola. Efikasna količina bi, takođe, uključivala količinu dovoljnu da spreči ili odloži razvoj simptoma bolesti, promeni tok simptoma bolesti (na primer, ali ne ograničavajući se na, uspori progresiju simptoma bolesti) ili preokrene simptom bolesti. Razume se da za svaki dati slučaj, odgovarajuću „efikasnu količinu“ može odrediti stručnjak u tehnici korišćenjem rutinskog eksperimentisanja.
[0754] Za upotrebu u različitim aspektima opisanim ovde, efikasna količina ćelija progenitora sadrži najmanje 10<2>progenitorskih ćelija, najmanje 5 X 10<2>progenitorskih ćelija, najmanje 10<3>progenitorskih ćelija, najmanje 5 X 10<3>progenitorskih ćelija, najmanje 10<4>progenitorskih ćelija, najmanje 5 X 10<4>progenitorskih ćelija, najmanje 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 2 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 3 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 4 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 5 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 6 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 7 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 8 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 9 X 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 1 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 2 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 3 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 4 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 5 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 6 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 7 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 8 X 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 9 X 10<6>progenitorskih ćelija ili njihove višestruke brojeve. Progenitorske ćelije mogu biti izvedene od jednog ili više donora ili se mogu dobiti iz autolognog izvora. U nekim ovde opisanim primerima, ćelije progenitora mogu biti razmnožene u kulturi pre primene subjektu kome je to potrebno.
[0756] Umerena i postepena smanjenja nivoa SCN9A eksprimovanog u ćelijama pacijenata koji imaju bol mogu biti korisna za ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti, za povećanje dugoročnog preživljavanja i/ili za smanjenje neželjenih efekata povezanih sa drugim tretmanima. Nakon primene takvih ćelija kod humanih pacijenata, prisustvo progenitora koji proizvode smanjene nivoe SCN9A je korisno. U nekim slučajevima, efikasan tretman subjekta dovodi do smanjenja SCN9A za najmanje oko 3%, 5% ili 7% u odnosu na ukupni SCN9A kod tretiranog subjekta. U nekim primerima, smanjenje SCN9A će biti najmanje oko 10% ukupnog SCN9A. U nekim primerima, smanjenje SCN9A će biti najmanje oko 20% do 30% ukupnog SCN9A. Slično tome, uvođenje čak i relativno ograničenih subpopulacija ćelija koje imaju značajno smanjene nivoe SCN9A može biti korisno kod različitih pacijenata, jer će u nekim situacijama normalizovane ćelije imati selektivnu prednost u odnosu na obolele ćelije. Međutim, čak i skromni nivoi progenitorskih ćelija sa smanjenim nivoima SCN9A mogu biti korisni za ublažavanje jednog ili više aspekata bola kod pacijenata. U nekim primerima, oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90% ili više progenitorskih ćelija kod pacijenata kojima se takve ćelije primenjuju proizvode smanjene nivoe SCN9A.
[0758] „Primenjeno/dato“ se odnosi na isporuku kompozicije progenitorskih ćelija subjektu postupkom ili putem koji rezultira barem delimičnom lokalizacijom ćelijske kompozicije na željenom mestu. Ćelijska kompozicija može se primeniti bilo kojim odgovarajućim putem koji rezultira efikasnim lečenjem kod subjekta, tj. primena rezultira isporukom na željeno mesto kod subjekta gde se barem deo kompozicije isporuči, tj. najmanje 1 x 10<4>ćelija se dostavljaju na željeno mesto tokom određenog vremenskog perioda.
[0760] U jednom aspektu postupka, farmaceutska kompozicija može se primenjivati putem kao što je, ali nije ograničen na, enteralni (u crevo), gastroenteralni, epiduralni (u duru), oralni (kroz usta), transdermalni, periduralni, intracerebralni (u mozak), intracerebroventrikularni (u moždane komore), epikutani (primena na kožu), intradermalni (u samu kožu), potkožni/supkutani (ispod kože), nazalni primen (kroz nos), intravenski (u venu), intravenski bolus, intravenski kap po kap, intraarterijski (u arteriju), intramuskularni (u mišić), intrakardijalni (u srce), intraosealna infuzija (u koštanu srž), intratekalni (u kičmeni kanal), intraperitonealni (infuzija ili injekcija u peritoneum), intravezikalna infuzija, intravitrealni (kroz oko), intrakavernozna injekcija (u patološku šupljinu), intrakavitarna (u bazu penisa), intravaginalni primen. intrauterina, ekstraamnionska primena, transdermalna (difuzija kroz netaknutu kožu za sistemsku distribuciju), transmukozna (difuzija kroz sluzokožu), transvaginalna, insuflacija (šmrkanje), sublingvalna, sublabijalna, klistir, kapi za oči (na konjunktivu), kapi za uši, aurikularna (u ili kroz uho), bukalna (usmerena ka obrazu), konjunktivalna, kutana, dentalna (na zub ili zube), elektroosmoza, endocervikalna, endosinuzijalna, endotrahealna, ekstrakorporalna, hemodijaliza, infiltracija, intersticijalna, intraabdominalna, intraamnionska, intraartikularna, intrabilijarna, intrabronhijalna, intraburzalna, intrahrskavična (unutar hrskavice), intrakaudalna (unutar kaude ekvine), intracisternalna (unutar cisterne magne cerebelomedularis), intrakornealna (unutar rožnjače), dentalna intrakornalna, intrakoronarna (unutar koronarne arterije), intrakorporus kavernozum (unutar dilatabilnih prostora corporus cavernosa penisa), intradiskalni (unutar diska), intraduktalni (unutar kanala žlezde), intraduodenalni (unutar dvanaestopalačnog creva), intraduralni (unutar ili ispod dure), intraepidermalni (u epidermis), intraezofagealni (u jednjak), intragastrični (unutar želuca), intragingivalni (unutar gingive), intrailealni (unutar distalnog dela tankog creva), intralezionalni (unutar ili direktno uveden u lokalizovanu leziju), intraluminalni (unutar lumena cevi), intralimfatični (unutar limfe), intramedularni (unutar šupljine koštane srži), intrameningealni (unutar moždanih ovojnica), intramiokardijalni (unutar miokarda), intraokularni (unutar oka), intraovarijalni (unutar jajnika), intraperikardijalni (unutar perikarda), intrapleuralni (unutar pleure), intraprostatični (unutar prostata), intrapulmonalni (unutar pluća ili njihovih bronhija), intrasinalni (unutar nazalnih ili periorbitalnih sinusa), intraspinalni (unutar kičmenog stuba), intrasinovijalni (unutar sinovijalne šupljine zgloba), intratendinozni (unutar tetive), intratestikularni (unutar testisa), intratekalni (unutar cerebrospinalne tečnosti na bilo kom nivou cerebrospinalne ose), intratorakalni (unutar grudnog koša), intratubularni (unutar tubula organa), intratumorski (unutar tumora), intratimpanični (unutar aurus media), intravaskularni (unutar krvnog suda ili krvnih sudova), intraventrikularni (unutar komore), jontoforeza (pomoću električne struje gde joni rastvorljivih soli migriraju u tkiva tela), irigacija (za kupanje ili ispiranje otvorenih rana ili telesnih šupljina), laringealni (direktno na grkljan), nazogastrični (kroz nos i u želudac), tehnika okluzivnog zavijanja (topična primena, koja se zatim pokriva zavoj koji zatvara područje), oftalmološki (na spoljašnju stranu oka), orofaringealni (direktno u usta i ždrelo), parenteralni, perkutani, periartikularni, periduralni, perineuralni, parodontalni, rektalni, respiratorni (unutar respiratornog trakta udisanjem oralno ili nazalno za lokalni ili sistemski efekat), retrobulbarni (iza mosta ili iza očne jabučice), intramiokardijalni (ulazak u miokard), mekotkinijski, subarahnoidalni, subkonjunktivalni, submukozni, topički, transplacentarni (kroz ili preko placente), transtrahealni (kroz zid traheje), transtimpanični (kroz ili kroz bubnu duplju), ureteralni (do uretera), uretralni (do uretre), vaginalni, kaudalni blok, dijagnostički, nervni blok, bilijarna perfuzija, srčana perfuzija, fotofereza i spinalni.
[0762] Načini primene uključuju injekciju, infuziju, instilaciju i/ili gutanje. „Injekcija“ uključuje, bez ograničenja, intravenoznu, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intraventrikularnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, potkožnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, intracerebrospinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. U nekim primerima, put je intravenski. Isporuka ćelija, može se izvršiti primena injekcijom ili infuzijom.
[0764] Ćelije se mogu primenjivati sistemski. Izrazi „sistemska primena“, „primenjivati sistemski“, „periferna primena“ i „primenjivati periferno“ odnose se na primenu populacije ćelija progenitora na način koji nije direktno u ciljno mesto, tkivo ili organ, tako da umesto toga ulazi u cirkulatorni sistem subjekta i stoga je podložna metabolizmu i drugim sličnim procesima.
[0766] Efikasnost tretmana koji sadrži kompoziciju za lečenje bola može odrediti vešt kliničar. Međutim, tretman se smatra „efikasnim tretmanom“ ako se bilo koji ili svi znaci ili simptomi, kao samo jedan primer, nivoa SCN9A, promene na koristan način (npr. smanjeno za najmanje 10%), ili su drugi klinički prihvaćeni simptomi ili markeri bolesti poboljšani ili ublaženi. Efikasnost se, takođe, može meriti nepostojanjem pogoršanja kod pojedinca, što se procenjuje hospitalizacijom ili potrebom za medicinskim intervencijama. (npr. progresija bolesti je zaustavljena ili bar usporena). Postupci merenja ovih indikatora su poznati stručnjacima u tehnici i/ili su ovde opisani. Lečenje obuhvata bilo koje lečenje bolesti kod pojedinca ili životinje (neki neograničavajući primeri uključuju čoveka ili sisara) i obuhvata: (1) inhibiranje bolesti, npr. zaustavljanje ili usporavanje progresije simptoma; ili (2) ublažavanje bolesti, npr. izazivanje regresije simptoma; i (3) sprečavanje ili smanjenje verovatnoće razvoja simptoma.
[0768] Lečenje prema predmetnom pronalasku može ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa bolom smanjenjem ili promenom količine SCN9A proteina kod pojedinca.
[0770] V. KARAKTERISTIKE I SVOJSTVA GENA ALFA PODJEDINICE TIPA IX NATRIJUMSKIH KANALA SA NAPONOM (SCN9A)
[0772] SCN9A je povezan sa bolestima i poremećajima kao što su, ali ne ograničavajući se na, kongenitalna neosetljivost na bol, anosmija, kao da je ličnost, granični poremećaj ličnosti, maligna neoplazma dojke, nesitnoćelijski karcinom pluća, netolerancija na hladnoću, febrilne konvulzije, dijabetes, dijabetes melitus, disocijativni poremećaj, epilepsija, eritromelalgija, primarna eritermalgija, bol u licu, infekcije izazvane virusom Herpesviridae, nasledna senzorna autonomna neuropatija tipa 5, hiperplazija, neuralgija, nasledne senzorne i autonomne neuropatije, degenerativni poliartritis, bol, bol u udovima, postoperativni bol, Parkinsonova bolest, postherpetična neuralgija, neoplazme prostate, pruritus, napadi, somatoformni poremećaj, poremećaj upotrebe duvana, trigeminalna neuralgija, sinovijalna cista, hronični bol, akutni bol, paramiotonija kongenita (poremećaj), malaksalost, senzorna nelagodnost, peckanje, ravnodušnost prema bolu, inflamatorni bol, mehanički bol, bol u skalpu, nasledna motorna i senzorna neuropatija tipa II, česta migrena, odsustvo osećaja bola, maligna neoplazma prostate, poremećaj bola, osteoartritis kolena, neuropatija, kompleksni regionalni sindromi bola, tonično-klonični napadi, nasledne neuropatije, karcinom prostate, karcinom dojke, infantilna teška mioklona epilepsija, miksoidna cista, kanalopatije, paroksizmalni ekstremni bolni poremećaj, bolna neuropatija, kompresivne neuropatije, kongenitalna ravnodušnost prema bolu (autozomno recesivna), generalizovana epilepsija sa febrilnim napadima plus tip 2, generalizovana epilepsija sa febrilnim napadima plus 7, febrilni napadi familijarni 3B i neuropatija malih vlakana (početak u odraslom dobu naziva se neuropatija malih vlakana). Uređivanje gena SCN9A korišćenjem bilo kog od ovde opisanih postupaka može se koristiti za lečenje, sprečavanje i/ili ublažavanje simptoma bolesti i poremećaja opisanih ovde.
[0774] Gen SCN9A kodira alfa podjedinicu natrijumovog kanala pod nazivom NaV1.7. NaV1.7 se prvenstveno eksprimuje u senzornim neuronima i igra značajnu ulogu u nocicepcijskoj signalizaciji. Poznato je da mutacije u genu SCN9A izazivaju poremećaje percepcije bola, uključujući primarnu eritemalgiju, paroksizmalni ekstremni bol, kongenitalnu neosetljivost na bol i neuropatiju malih vlakana. Mutacije sa dobitkom funkcije u genu SCN9A dovode do spontanog bola kao što se primećuje kod primarne eritemalgije i paroksizmalnog ekstremnog bola. Stoga, nokaut ili nokdaun gena SCN9A kod pacijenata sa primarnom eritromelalgijom ili paroksizmalnim ekstremnim bolom može se koristiti za lečenje, sprečavanje i/ili ublažavanje povezanih simptoma.
[0775] Primarna eritromelalgija je retko autozomno dominantno oboljenje koje karakterišu epizode peckanja u stopalima i rukama kao odgovor na toplotu i pokret. Pogođene osobe obično razvijaju znake i simptome u ranom detinjstvu, mada se u blažim slučajevima simptomi mogu pojaviti kasnije u životu. Lečenje ovog stanja je uglavnom simptomatsko. Pored izbegavanja okidača bola (kao što su toplota, vežbanje i alkohol), mogućnosti lečenja uključuju hlađenje i podizanje ekstremiteta, upotrebu anestetika kao što su lidokain i meksilitin, i upotrebu opioidnih lekova u ekstremnim slučajevima.
[0777] Paroksizmalni ekstremni bol je još jedan redak poremećaj koji karakteriše jak epizodni bol u rektumu, očnim i mandibularnim predelima, kao i crvenilo kože. Simptomi ovog stanja često počinju u neonatalnom periodu ili u ranom detinjstvu i mogu trajati tokom celog života. Sredstva za lečenje hroničnih neuropatskih bolova se često koriste za ublažavanje epizoda bola izazvanih bolešću. Karbamazepin, blokator natrijumovih kanala, pokazao se najefikasnijim od ovih tretmana.
[0779] U jednom primeru, gen je alfa podjedinica tipa IX natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A), koji se takođe može nazivati natrijumski naponski kontrolisana alfa podjedinica 9, natrijum kanalni, naponski kontrolisani, tip IX, alfa polipeptid, naponski kontrolisana podjedinica natrijumskog kanala alfa Nav1.7, protein natrijumskog kanala tip IX podjedinica alfa, neuroendokrini natrijumov kanal, periferni natrijumov kanal 1, HNE-Na, NENA, PN1, GEFSP7, HSAN2D, Nav1.7, FEB3B, ETHA, i SFNP. SCN9A ima citogenetsku lokaciju 2q24.3, a genomske koordinate su na hromozomu 2 na prednjem lancu na poziciji 166,195,185‑166,375,993.
[0780] Nukleotidna sekvenca SCN9A je prikazana kao SEQ ID NO: 5303. SCN7A je gen uzvodno od SCN9A na obrnutom lancu, a RN7SKP152 je gen nizvodno od SCN9A na obrnutom lancu. AC010127.3 je gen koji se nalazi na prednjem lancu suprotno od SCN9A. SCN9A ima NCBI genski ID od 6335, Uniprot ID od Q15858 i Ensembl genski ID od ENSG00000169432. SCN9A ima 3906 SNP, 39 introna i 38 eksona. Identifikator eksona iz Ensembl-a i mesta početka/zaustavljanja introna i eksona prikazani su u Tabeli 3.
[0782] Tabela 3. Introni i eksoni za SCN9A
[0784]
[0785]
[0786]
[0789] Tabela 4 daje informacije o svim transkriptima za gen SCN9A na osnovu Ensembl baze podataka. U Tabeli 4 su dati ID transkripta iz Ensembl-a i odgovarajući NCBI RefSeq ID za transkript, ID translacije iz Ensembl-a i odgovarajući NCBI RefSeq ID za protein, biotip sekvence transkripta kako je klasifikovan od strane Ensembl-a i eksoni i introni u transkriptu na osnovu informacija u Tabeli 3.
[0791] Tabela 4. Informacije o transkriptu za SCN9A
[0793]
[0794]
[0795]
[0798] SCN9A ima 3906 SNP i NCBI rs broj i/ili UniProt VAR broj za ovaj gen SCN9A su VAR_019947, VAR_019948, VAR_019949, VAR_019950, VAR_030444, VAR_032014, VAR_032015, VAR_032016, VAR_032017, VAR_032018, VAR_032019, VAR_032020, VAR_032021, VAR_032022, VAR_032023, VAR_064595, VAR_064596, VAR_064597, VAR_064598, rs71428908, VAR_064600, VAR_064601, VAR_064602, VAR_064603, VAR_064604, VAR_064605, VAR_064606, VAR_064607, VAR_064608, VAR_064609, VAR_064610, VAR_064611, VAR_064612, VAR_064613, VAR_072279, VAR_072280, VAR_072280, VAR_072281, rs951510, rs952462, rs952463, rs1011778, rs1358532, rs1406272, rs1540870, rs1540871, rs1540875, rs1919177, rs1881436, rs1881437, rs1881438, rs1881439, rs1997291, rs1528481, rs1528483, rs1528484, rs1528487, rs2893013, rs4131159, rs4131160, rs4131632, rs4488677, rs4408747, rs4331519, rs4429487, rs4001001, rs4273234, rs4583483, rs4438497, rs4286289, rs4546021, rs4455168, rs4455169, rs4605385, rs4465779, rs4384809, rs4386335, rs4667512, rs5836099, rs6432898, rs6432899, rs6432900, rs6432901, rs6432902, rs6432903, rs6432904, rs6432905, rs6432906, rs6432907, rs6432910, rs6723900, rs6720769, rs6715214, rs6712015, rs6712019, rs6708450, rs6708715, rs6725355, rs6725732, rs6722807, rs6716736, rs6723160, rs6726575, rs6760472, rs6723789, rs6728885, rs6738419, rs6729030, rs6732627, rs6719276, rs6729980, rs6738102, rs6750593, rs6756635, rs6718922, rs6718791, rs7576631, rs7569509, rs7563366, rs6708467, rs6715470, rs6757555, rs6731773, rs6715367, rs7577446, rs6732135, rs6714902, rs7570862, rs6746587, rs6721003, rs7558866, rs6432909, rs7584766, rs7589477, rs7584892, rs7559171, rs6432908, rs7590179, rs7572553, rs7566965, rs7602898, rs6432897, rs6432896, rs7580299, rs7603335, rs7597876, rs4667883, rs4667882, rs7582061, rs9287866, rs5836096, rs10171225, rs4564789, rs7594979, rs4459751, rs7606521, rs4599137, rs9646771, rs4076255, rs4447616, rs4443015, rs10188002, rs3956542, rs4132348, rs4132347, rs4131162, rs4131161, rs1528486, rs1528485, rs1881440, rs1609311, rs1540876, rs1540874, rs10930216, rs10930217, rs10930218, rs10930219, rs1540873, rs1540872, rs6728894, rs11280107, rs11686478, rs7424841, rs12105034, rs13000874, rs6734919, rs11674528, rs12692794, rs12692795, rs6753017, rs6744871, rs6736291, rs11340941, rs12478446, rs6757314, rs13004059, rs11693091, rs6757502, rs6737120, rs6732242, rs12463992, rs12612992, rs12464575, rs13417859, rs13395456, rs12615462, rs6746615, rs7420705, rs13027418, rs12616699, rs12467272, rs11898284, rs7589743, rs16851931, rs7597083, rs7597178, rs16851958, rs16851960, rs7598695, rs7592978, rs16851968, rs9759544, rs7606196, rs16852023, rs16852031, rs16852043, rs16852048, rs16852054, rs16852069, rs13030011, rs11899120, rs13013237, rs12469343, rs7606274, rs13401294, rs12992260, rs10190952, rs9646772, rs7608288, rs10193767, rs10538478, rs12994338, rs13016545, rs12994880, rs13405544, rs13034090, rs13017469, rs10556841, rs13017637, rs11888456, rs10600584, rs13035164, rs10611611, rs10634344, rs12473416, rs13431341, rs13020056, rs10638743, rs13021236, rs12999243, rs13000233, rs13000683, rs10655845, rs13387119, rs11435802, rs35244507, rs10688081, rs10696005, rs10710576, rs11463044, rs35280187, rs10497283, rs34327610, rs13390803, rs34920657, rs10497284, rs34355606, rs35730267, rs34926643, rs35333199, rs34936668, rs36101458, rs12476306, rs12105169, rs58078583, rs12692796, rs58159440, rs41268677, rs11890824, rs58184464, rs35789805, rs56058874, rs35353363, rs34490209, rs35821032, rs35360495, rs34449821, rs35425598, rs56999748, rs11681893, rs35473199, rs11682860, rs11676630, rs11693152, rs13004690, rs12615972, rs34617014, rs13026637, rs56149857, rs16851928, rs35911982, rs16851935, rs16851943, rs55681559, rs16851964, rs16851966, rs35542360, rs16851974, rs16852010, rs11885693, rs17766038, rs17766243, rs17766561, rs17766807, rs11901118, rs13426370, rs57275972, rs12993435, rs13427940, rs12472033, rs12622435, rs12622743, rs35187227, rs13035599, rs36035794, rs12996068, rs13021074, rs34784693, rs60461278, rs59265133, rs56282252, rs36096260, rs59348143, rs56292816, rs16826112, rs35257630, rs34813283, rs55945526, rs13411967, rs60930703, rs67175205, rs73025509, rs73025522, rs73025523, rs73025528, rs28532836, rs73025590, rs35683510, rs13391197, rs62176964, rs62176965, rs55989063, rs62178525, rs35433129, rs33999505, rs34533574, rs71428911, rs71428912, rs71428915, rs71428916, rs71428917, rs71428918, rs71428919, rs60050530, rs71428910, rs34038642, rs72149794, rs35077026, rs35080467, rs34582751, rs57073619, rs57087440, rs34082367, rs73972306, rs73972316, rs73972318, rs74336612, rs75477543, rs56152529, rs76673713, rs71031239, rs34099849, rs34101964, rs35129718, rs76710665, rs76711511, rs79030107, rs74445522, rs79031716, rs74449889, rs75597232, rs76740831, rs75608447, rs34132334, rs34649195, rs35552412, rs77937563, rs72882854, rs72882859, rs72882882, rs72882899, rs72882901, rs72884703, rs17766014, rs17766982, rs72884732, rs72884741, rs72884745, rs72884753, rs72884762, rs72884775, rs72884780, rs72884785, rs72884786, rs35962214, rs72884797, rs72884798, rs17817307, rs72884802, rs75675344, rs72886606, rs72886608, rs17817547, rs79140856, rs79147031, rs17817679, rs80356466, rs35182375, rs80356469, rs35595054, rs55754250, rs75773428, rs60310134, rs60392208, rs36073771, rs71395218, rs115848509, rs66472972, rs79202357, rs75794168, rs57861261, rs71405933, rs73025538, rs112373468, rs62176960, rs75818857, rs62176961, rs67339035, rs62178526, rs115911128, rs75848558, rs60056351, rs71428914, rs115946138, rs74706664, rs113603623, rs111285706, rs111302354, rs77046324, rs60145586, rs113610968, rs72330491, rs112490413, rs73969684, rs112504933, rs111337704, rs74757084, rs116013127, rs73969685, rs74768783, rs73969700, rs116037918, rs73969701, rs72520704, rs74385849, rs71031240, rs79417925, rs74791755, rs71031242, rs74423851, rs75620229, rs79061212, rs75645300, rs113739900, rs72884720, rs113758466, rs72884726, rs72884789, rs72884800, rs78215125, rs75709114, rs77151034, rs77154470, rs111426485, rs80356465, rs80356468, rs114760918, rs80356470, rs114985967, rs79187718, rs74613934, rs112644902, rs76904702, rs111528010, rs78278362, rs115847294, rs112347596, rs115028579, rs113518536, rs78304745, rs79221441, rs79222523, rs112718465, rs115074698, rs113962992, rs111624869, rs75818591, rs115099720, rs74658674, rs75006765, rs115881388, rs113988866, rs114811473, rs111281728, rs111679051, rs75029843, rs112761603, rs78428931, rs112768548, rs113629537, rs111705022, rs111705421, rs75053746, rs78118515, rs79645790, rs115979359, rs113660887, rs114893976, rs78162977, rs114048544, rs115193623, rs75093813, rs78510947, rs77373314, rs76244722, rs112835924, rs76247525, rs113698317, rs78552930, rs74778123, rs116048770, rs116373723, rs75949647, rs114920745, rs116069340, rs112869318, rs114923155, rs114926041, rs115322950, rs113737673, rs112561342, rs77143068, rs79446427, rs111404258, rs112919255, rs111415017, rs75225428, rs111458233, rs112945476, rs111470787, rs79493055, rs116451742, rs111899000, rs77487847, rs113850984, rs77192374, rs76448913, rs78250271, rs116188445, rs112675405, rs111948101, rs111953170, rs77231154, rs114267271, rs115435826, rs79853207, rs77579497, rs113911089, rs78334485, rs79876905, rs76510000, rs76102017, rs116547783, rs115473061, rs111643968, rs115489522, rs77639503, rs116268225, rs111654843, rs113989468, rs114344033, rs77682648, rs115119378, rs77328118, rs112779076, rs78452939, rs113173376, rs76571042, rs115522370, rs114032727, rs78863850, rs113195803, rs78454756, rs116653005, rs77784194, rs77797040, rs78906046, rs75468572, rs80095598, rs138982989, rs138989210, rs114358903, rs113283978, rs113182934, rs114525222, rs115555277, rs75069209, rs79684957, rs115244856, rs113309940, rs113311364, rs80160529, rs115251943, rs115274753, rs112867239, rs114118902, rs139080215, rs114143095, rs116773598, rs148713442, rs142480223, rs77432282, rs140701967, rs148765803, rs145478117, rs79741845, rs142518463, rs139170417, rs77441037, rs75200610, rs148846057, rs145575900, rs116422705, rs111858722, rs116435828, rs116962683, rs75230883, rs148931877, rs112947029, rs121908920, rs121908921, rs140792426, rs115783892, rs113436493, rs111884740, rs139281380, rs139288692, rs112970706, rs115393048, rs112995109, rs75273355, rs77539813, rs115812636, rs142707672, rs78731163, rs184266839, rs140830160, rs111972606, rs149102734, rs78763917, rs116547537, rs114319629, rs145811912, rs184317901, rs77642761, rs149157378, rs115495114, rs79918973, rs142779717, rs149194222, rs112047115, rs181405366, rs76564908, rs78843438, rs181423521, rs184404793, rs80126387, rs149285180, rs137950241, rs184447464, rs149297295, rs78947176, rs117581394, rs187270227, rs139017042, rs116710246, rs149301325, rs142909834, rs140574148, rs137962506, rs190380742, rs137966449, rs116713443, rs149350025, rs112222195, rs184515932, rs116748713, rs142952951, rs139064023, rs181563231, rs181572301, rs181577442, rs78998616, rs145366755, rs113361139, rs115726491, rs184560681, rs184561606, rs148819190, rs190457189, rs142559100, rs149429956, rs143007711, rs142585699, rs114681048, rs140761356, rs145608272, rs121908916, rs142666506, rs187410330, rs115802383, rs187428818, rs149490896, rs149507189, rs113450348, rs149034908, rs146213117, rs145737444, rs184675901, rs146234445, rs181717210, rs184685668, rs181276399, rs187500785, rs145769973, rs190597640, rs181734340, rs184275120, rs143161505, rs146267489, rs149592596, rs190625704, rs115823295, rs141042794, rs138081618, rs190666356, rs190668591, rs184760546, rs149648597, rs145798468, rs184289118, rs142753783, rs187145433, rs181814822, rs146333890, rs187164514, rs187187436, rs181818571, rs181414054, rs184784994, rs181414423, rs181840211, rs187627632, rs145969336, rs187630476, rs187638933, rs181864169, rs117600380, rs143281561, rs149739106, rs187660096, rs184471275, rs139433712, rs143307775, rs187686954, rs143323637, rs146453073, rs184491945, rs184503606, rs149812467, rs187735078, rs181543382, rs187739615, rs149846122, rs181976860, rs181544216, rs184525265, rs187760599, rs190446880, rs137993592, rs184557454, rs182005122, rs184956974, rs184558307, rs184973913, rs184975345, rs190455017, rs146114242, rs182041228, rs149440243, rs190971448, rs139677117, rs138238059, rs143020225, rs187396655, rs149989224, rs191004585, rs187404611, rs150021077, rs146148893, rs182164896, rs182169962, rs149458240, rs187420437, rs187457184, rs141218614, rs146210131, rs146758972, rs185134458, rs187483230, rs187499307, rs138051487, rs139537793, rs190630868, rs150115235, rs149656478, rs191129855, rs187982120, rs182221863, rs184769972, rs181809487, rs141258921, rs146330125, rs184777485, rs139562000, rs188023656, rs150184169, rs139564447, rs191220059, rs146882468, rs184798240, rs187628994, rs143699917, rs143713899, rs184829398, rs143292594, rs188117229, rs143733438, rs141345692, rs188123311, rs188145250, rs146953750, rs141083667, rs143769263, rs181942663, rs146963548, rs149811195, rs190856490, rs191334405, rs190873215, rs191343221, rs139815430, rs181981693, rs191359321, rs149865252, rs150371036, rs143829355, rs191372613, rs138452077, rs138452908, rs185386849, rs143842609, rs188237643, rs150393847, rs187773100, rs187775085, rs184966574, rs184977393, rs191427726, rs188275827, rs182035257, rs184996404, rs141453198, rs188284141, rs190995816, rs138488726, rs139848912, rs182512669, rs191445085, rs146642805, rs191006637, rs182521362, rs188309132, rs150023650, rs191085791, rs185460522, rs185466137, rs182175100, rs191091185, rs191109954, rs185493398, rs146761679, rs182203285, rs185502977, rs150107947, rs191122461, rs139722857, rs141521157, rs185512688, rs188369589, rs191126523, rs139884364, rs139732025, rs143623645, rs138334413, rs185538321, rs182251259, rs138341036, rs182626281, rs191206839, rs182313512, rs141315817, rs147236226, rs144030757, rs141338230, rs182655507, rs191614297, rs150639101, rs143731425, rs188153399, rs144066296, rs141603539, rs150324876, rs141375532, rs185622259, rs191640401, rs146970406, rs188513575, rs141629021, rs150341781, rs191351429, rs141401072, rs188532495, rs188248808, rs147057677, rs188544520, rs191692191, rs144131152, rs147074129, rs182496397, rs191429109, rs182500442, rs141673661, rs139846473, rs150446261, rs150785198, rs182820808, rs182520122, rs182835951, rs182529061, rs188657481, rs182852687, rs138621998, rs182529589, rs185798678, rs150473901, rs141757967, rs182553426, rs185815125, rs143943780, rs185496131, rs150902480, rs185498433, rs191884045, rs185502994, rs185503388, rs188365371, rs188776686, rs185517165, rs141530060, rs188383084, rs191914888, rs191918328, rs191918870, rs150560390, rs191920350, rs144365987, rs144372216, rs191935835, rs188403481, rs188811649, rs185898649, rs147221067, rs182626458, rs150991753, rs144016113, rs191958942, rs150590478, rs183013605, rs182641899, rs183026897, rs139927718, rs144435180, rs144435267, rs140119151, rs188473580, rs147697530, rs139930314, rs151064878, rs150652684, rs185979948, rs185640009, rs140151023, rs188519035, rs183095706, rs188522328, rs150690124, rs191679645, rs183115017, rs183125824, rs183133746, rs186044551, rs141940569, rs151168288, rs138746989, rs191681855, rs144136503, rs150725477, rs191708188, rs191711647, rs182806094, rs144573884, rs147831105, rs147833108, rs147430160, rs185756419, rs188657198, rs141742493, rs144270467, rs138636241, rs186110761, rs186125436, rs151258913, rs150885548, rs192222550, rs192233893, rs147939855, rs183284329, rs147539362, rs185839773, rs188756672, rs138823585, rs188769302, rs140057840, rs183353183, rs188780390, rs183367774, rs188784746, rs185874593, rs188790411, rs192366053, rs188810319, rs188814235, rs189287946, rs182991290, rs144392389, rs147640034, rs151008517, rs192402484, rs183036253, rs138700080, rs138700579, rs183064984, rs185993526, rs189320567, rs183090065, rs192417863, rs142157838, rs180836507, rs186006161, rs148149379, rs144500679, rs151120735, rs180884797, rs180886733, rs186060853, rs144552092, rs189017951, rs189022051, rs186460536, rs140492487, rs186461495, rs189023255, rs186466472, rs141954437, rs189522976, rs189523541, rs189049999, rs148313223, rs151210240, rs189054543, rs147849719, rs189539871, rs189064184, rs189068219, rs192210846, rs147956569, rs186209759, rs189569164, rs192674981, rs144747253, rs186238424, rs183351491, rs183367424, rs192699758, rs183370069, rs189262728, rs192363212, rs183403867, rs192726587, rs142134626, rs183711149, rs142138406, rs181081805, rs192738555, rs142140153, rs200131264, rs140380560, rs181094108, rs200134765, rs144841509, rs183732115, rs192406551, rs142150794, rs148096531, rs200162971, rs186321392, rs370110583, rs148456006, rs192433693, rs186364672, rs186633344, rs180802944, rs200178927, rs200194515, rs375200578, rs200182914, rs145193907, rs183502133, rs140445008, rs180893354, rs138915544, rs145244774, rs148241180, rs186442256, rs200240989, rs186465363, rs148278257, rs145257168, rs189524843, rs148315085, rs183628282, rs189533865, rs183640056, rs148556202, rs200292819, rs192655074, rs192658579, rs189564784, rs138962140, rs148362057, rs142347131, rs189586446, rs200341902, rs200063079, rs370018897, rs200099565, rs192906198, rs183704773, rs192723631, rs181075520, rs186767700, rs181079869, rs370059723, rs186771296, rs529190860, rs370067909, rs529209086, rs186784826, rs200394559, rs200399998, rs183730817, rs538838362, rs370082676, rs200408344, rs142400656, rs200411606, rs145182185, rs145187060, rs186806270, rs200172456, rs192975309, rs375204316, rs370455867, rs200449501, rs186648437, rs534019932, rs529286738, rs375210239, rs370472054, rs192801395, rs370474533, rs186654635, rs200213811, rs186674692, rs538940239, rs375250531, rs200482081, rs375566600, rs181175263, rs200486515, rs370211696, rs181183562, rs181186118, rs193052322, rs200518320, rs200258203, rs186875141, rs181200412, rs375314088, rs184015802, rs375635737, rs186886737, rs529393841, rs375684756, rs539081952, rs200296022, rs189773617, rs375344768, rs375717078, rs189783847, rs193147774, rs189793333, rs189802138, rs375383262, rs200341995, rs148603098, rs370331208, rs183883370, rs190038995, rs190041054, rs200356611, rs192916635, rs148622242, rs539165024, rs534237861, rs189833651, rs200381002, rs539201442, rs529545926, rs190079309, rs529224329, rs538840251, rs200677133, rs538845547, rs370750101, rs534286923, rs375828071, rs200417967, rs539238807, rs184127871, rs375484262, rs190100237, rs200702592, rs538865759, rs200441726, rs370458490, rs375873835, rs370471482, rs370474188, rs534038802, rs534350762, rs534357040, rs200464271, rs184169321, rs193007084, rs529641451, rs529320212, rs375570049, rs529339341, rs538978492, rs193043836, rs200774110, rs189961043, rs200780217, rs534113220, rs370879581, rs534409097, rs534414126, rs534415144, rs370562444, rs200579922, rs199528742, rs200815709, rs534171106, rs539098927, rs539117115, rs200830395, rs186937907, rs370939400, rs539140140, rs200617539, rs200619065, rs184228905, rs200835066, rs376036522, rs539143083, rs200849406, rs539479843, rs376051261, rs529755984, rs534486080, rs534488673, rs193152357, rs375749001, rs375763051, rs193166864, rs539520802, rs529783271, rs200878465, rs534232221, rs375776919, rs200884318, rs190061595, rs534278901, rs190082049, rs545837483, rs375825189, rs187135957, rs375828938, rs193224590, rs376111502, rs553880123, rs193232467, rs375856563, rs553890257, rs534545311, rs200709311, rs539583140, rs200720228, rs199625995, rs539285858, rs375886661, rs539314440, rs529638862, rs200757990, rs193290821, rs200764978, rs370859545, rs193298128, rs190162179, rs529872397, rs554016514, rs370874132, rs539661794, rs375980172, rs200809157, rs545964402, rs539677853, rs200826539, rs200972952, rs554071139, rs534456457, rs529727269, rs184226889, rs554100480, rs376022705, rs200831251, rs200999865, rs201000497, rs529730407, rs200843960, rs184246546, rs190358218, rs554163756, rs554165274, rs199576878, rs539500156, rs376288233, rs199589622, rs184260785, rs371207844, rs200882280, rs199599557, rs199756028, rs529983093, rs200885240, rs187133567, rs563464573, rs201061055, rs539547053, rs554273987, rs529802379, rs199609865, rs553889410, rs546154866, rs553889944, rs534551405, rs553911796, rs371042731, rs554309833, rs554312712, rs199784484, rs201087484, rs371264016, rs199791955, rs563543796, rs554341821, rs546194264, rs371271639, rs545893207, rs539907191, rs546211175, rs539907650, rs554376047, rs534785673, rs200925482, rs201111027, rs546225573, rs190283527, rs553954986, rs199824489, rs200939963, rs199828294, rs539633485, rs534590465, rs530084774, rs199836776, rs553992440, rs200946565, rs376437229, rs534834256, rs545955340, rs529878459, rs534839750, rs539669267, rs563692075, rs546307681, rs199679924, rs554081720, rs534850887, rs554088921, rs540043962, rs554092522, rs190336684, rs199879584, rs530137975, rs200995410, rs530143022, rs371164212, rs190349718, rs546362979, rs199717009, rs371397880, rs540082625, rs201198963, rs201021546, rs563799556, rs199737519, rs371414170, rs554199061, rs199746311, rs546391192, rs190379146, rs199753578, rs201051190, rs199757256, rs199915769, rs546428044, rs554663323, rs199924841, rs540148616, rs563477777, rs199933920, rs546146748, rs563898086, rs201243874, rs546456054, rs199940586, rs530215503, rs563913729, rs530218681, rs376579866, rs199948709, rs540192719, rs540198060, rs554750370, rs563492226, rs554287627, rs546498422, rs546158464, rs540216332, rs554299241, rs199968973, rs546516362, rs563983733, rs199780289, rs199780984, rs371286659, rs371523166, rs530267604, rs199987389, rs540258346, rs534786295, rs546227682, rs535009588, rs371537833, rs546570808, rs546572548, rs534792758, rs554861011, rs530289862, rs539955067, rs199832245, rs199832681, rs199841742, rs554463637, rs535055981, rs564125461, rs200028908, rs546625033, rs199848155, rs376692400, rs564139470, rs199850424, rs201155458, rs554499889, rs535082824, rs554501599, rs371367087, rs563737735, rs200056934, rs564203583, rs546340639, rs371630270, rs540400302, rs376746720, rs201185327, rs546352773, rs575423992, rs376493135, rs546717270, rs371397187, rs540431428, rs534892966, rs201205411, rs199903431, rs376515297, rs563817371, rs563824187, rs546746556, rs555098627, rs575492002, rs201217172, rs376529993, rs554686400, rs546760948, rs534939379, rs563953797, rs540206408, rs546500427, rs540485824, rs376608116, rs554799633, rs540505612, rs201445594, rs546799753, rs540240449, rs534999520, rs540519101, rs564030716, rs376835362, rs530454237, rs564030746, rs199998975, rs200004737, rs564394299, rs540551673, rs575674513, rs564399141, rs564446433, rs200011236, rs575695879, rs530483113, rs530485751, rs575707171, rs564466723, rs376885423, rs535039496, rs546880794, rs371565974, rs546882633, rs371773562, rs535234661, rs540598706, rs564107843, rs201343843, rs201354058, rs201503351, rs530342843, rs546907614, rs376908183, rs201510411, rs554978785, rs201511761, rs200048101, rs546921591, rs530350892, rs376922975, rs564200680, rs200060978, rs201533181, rs575403459, rs564241971, rs564580989, rs546961299, rs201544671, rs201545926, rs371836327, rs540688834, rs201398365, rs575434258, rs564263518, rs564274418, rs376775745, rs575466805, rs555444508, rs201414746, rs546745027, rs564310081, rs376792809, rs564315036, rs547017479, rs530416775, rs564331757, rs547021107, rs564332268, rs564662103, rs540733381, rs555135086, rs555471824, rs576009530, rs530597787, rs576019908, rs555139503, rs201589695, rs546790645, rs576055160, rs564376709, rs564714000, rs201599943, rs530619739, rs547065965, rs575600523, rs540522467, rs540547244, rs547082685, rs564445595, rs540567098, rs540796514, rs371731981, rs564769026, rs546879622, rs377073478, rs540589456, rs555621992, rs371916205, rs371958712, rs530634413, rs575756239, rs376897349, rs371780831, rs376904842, rs535249716, rs575804340, rs555336411, rs540652005, rs530685640, rs376937738, rs555659985, rs201659566, rs530547787, rs575882807, rs201664439, rs564870320, rs376965890, rs564871823, rs546993077, rs575943952, rs201560701, rs540907392, rs564896638, rs564896690, rs547000677, rs564899870, rs201563763, rs576373898, rs564640008, rs555445641, rs575973973, rs372028184, rs371863491, rs555773796, rs564960625, rs547253736, rs576455029, rs540974086, rs564986496, rs564993510, rs201726729, rs371864190, rs565010528, rs540730019, rs201574893, rs376994924, rs530783315, rs201577842, rs201741634, rs201743233, rs547309884, rs371884028, rs372088334, rs377222716, rs576572380, rs576041557, rs547054615, rs201761066, rs377231210, rs576600072, rs576089157, rs530626933, rs541061398, rs530815395, rs576098220, rs565110303, rs540810897, rs555612139, rs541084553, rs576662260, rs547128261, rs540853945, rs555633602, rs377085474, rs547403854, rs565167501, rs530849811, rs576712624, rs547415198, rs201649913, rs201651716, rs377093160, rs535596388, rs576773731, rs576676610, rs535558092, rs565234556, rs377328308, rs555955176, rs565256471, rs556091995, rs372131207, rs201845924, rs555645605, rs541215463, rs564833136, rs565311283, rs565318120, rs540868515, rs576946641, rs556156424, rs547539536, rs201883775, rs535414368, rs372262107, rs530959005, rs540871938, rs577021824, rs535419397, rs201895529, rs540879571, rs372269123, rs377116511, rs547186293, rs565405762, rs547588654, rs201905108, rs556236282, rs201905758, rs547191791, rs540903705, rs547201834, rs530979178, rs372002155, rs576377214, rs555741423, rs577086434, rs201915876, rs530989045, rs540941092, rs556278477, rs535735811, rs201707595, rs576479846, rs541356065, rs541358959, rs535499788, rs541362812, rs565031158, rs535511711, rs577214491, rs372339994, rs377206205, rs576544612, rs377226193, rs576585621, rs541054278, rs577266682, rs565097315, rs565571242, rs577289107, rs556405965, rs576629767, rs535795174, rs530825627, rs565155125, rs565186443, rs201992546, rs541131401, rs377540035, rs377540898, rs541131406, rs565224250, rs201821518, rs541464325, rs577369845, rs565254553, rs577404457, rs372203675, rs565602281, rs202014643, rs576881042, rs577440102, rs547742253, rs577443766, rs531116715, rs377543079, rs565709853, rs201999985, rs377592540, rs541216093, rs201867764, rs565371438, rs372263773, rs547573283, rs201896555, rs535696383, rs201899627, rs530977363, rs577068583, rs201908866, rs547600407, rs547600820, rs535712483, rs556270749, rs541350117, rs577567218, rs577154533, rs565779439, rs541577543, rs577175836, rs531022872, rs565800474, rs565519424, rs541591158, rs547675018, rs541594618, rs565809092, rs372495273, rs541395767, rs202083986, rs556650900, rs565547663, rs577251799, rs556665730, rs556373614, rs531050542, rs565585913, rs531203453, rs565871418, rs535797353, rs202109432, rs577720248, rs201987450, rs531083937, rs577393911, rs531100303, rs556716582, rs577747466, rs556487424, rs372559804, rs556713829, rs531103846, rs565682322, rs372563835, rs577815172, rs377588911, rs565947211, rs547813798, rs531250791, rs556789899, rs531125112, rs541713728, rs556819410, rs377754745, rs556713324, rs547819277, rs536000213, rs377597385, rs202165845, rs556543920, rs535860380, rs556549617, rs577508369, rs556552102, rs548057554, rs565736915, rs202180059, rs556878947, rs547836679, rs202051580, rs577538470, rs577539276, rs531148427, rs556584085, rs531302114, rs202061011, rs535883810, rs556612694, rs531317317, rs202071016, rs372490157, rs372654175, rs556940143, rs372655989, rs541594525, rs578059299, rs541831570, rs577625085, rs547898574, rs372511122, rs202219028, rs531188532, rs547913013, rs541630786, rs547938227, rs578134604, rs541870309, rs556706372, rs202110802, rs372557663, rs547975937, rs566204756, rs566207903, rs577796497, rs556764057, rs557048933, rs202241586, rs531379120, rs557050535, rs541923828, rs556774205, rs578243189, rs541702079, rs535980549, rs531270141, rs535997775, rs566269762, rs556841303, rs557109946, rs745311902, rs548256739, rs556848020, rs548043362, rs536155895, rs566022284, rs577936356, rs541985091, rs548053319, rs556871781, rs536168223, rs566049151, rs577967498, rs566340038, rs386391721, rs386391722, rs557188530, rs367584747, rs386391723, rs566366442, rs536028182, rs542030965, rs578005069, rs566085715, rs566086387, rs578024455, rs367621683, rs548346140, rs372833423, rs548105826, rs202211195, rs745531940, rs202215137, rs578072210, rs372665054, rs531338785, rs536243045, rs566133697, rs578090160, rs367666265, rs578114636, rs548158077, rs566180671, rs397765197, rs536089884, rs557356456, rs397767714, rs367683945, rs566528668, rs745659906, rs267598976, rs557071588, rs267598977, rs367701477, rs566564807, rs536281976, rs578242489, rs566583346, rs548214486, rs548476797, rs536129992, rs548482202, rs566262563, rs566594213, rs267607030, rs372744611, rs557461504, rs745754029, rs566617243, rs566617297, rs548258391, rs566310144, rs548519839, rs745338187, rs536158076, rs548274093, rs745823712, rs536163412, rs397868358, rs548542674, rs536168659, rs745839147, rs566338405, rs566348964, rs557535791, rs548558816, rs548565032, rs745383244, rs397870091, rs548565940, rs542287393, rs566709971, rs372990045, rs557204387, rs745418676, rs566409045, rs566730224, rs566752170, rs566753733, rs372818817, rs397722222, rs745983399, rs367830408, rs745480989, rs566793485, rs397734324, rs548645786, rs557669888, rs745516750, rs548657650, rs548381702, rs745552432, rs536425753, rs397973279, rs746070730, rs548387911, rs557708733, rs372854250, rs745569838, rs548698515, rs566482323, rs557734401, rs746118213, rs542420738, rs367667669, rs397986566, rs566902157, rs531528009, rs548736753, rs566500747, rs542456172, rs746187360, rs367671512, rs566932278, rs745660727, rs367697326, rs548464529, rs531756169, rs542471936, rs566573122, rs566962886, rs542498214, rs566982218, rs542504451, rs557806739, rs398090827, rs746306232, rs536489917, rs531803128, rs745714010, rs367720972, rs557918693, rs746350953, rs745725339, rs367991453, rs527241020, rs531579666, rs746381295, rs542208653, rs397818828, rs746391927, rs557954773, rs531600512, rs566644132, rs548866946, rs536555587, rs566656331, rs372959324, rs548538509, rs567102431, rs745838757, rs397868838, rs746437505, rs397868962, rs548885146, rs531845059, rs536570765, rs372983721, rs557571631, rs566719571, rs536584686, rs566723075, rs542325703, rs542643487, rs368055368, rs373019820, rs567192923, rs548936551, rs542349880, rs558065104, rs542355012, rs368062692, rs536415135, rs397963856, rs746552388, rs557690548, rs542394071, rs746083843, rs548693261, rs557732835, rs746143575, rs542699414, rs558122779, rs567298923, rs536465674, rs558134318, rs531746406, rs527346644, rs548743673, rs368107300, rs367917548, rs746198188, rs557871766, rs567022998, rs567363028, rs373168195, rs567043047, rs567054046, rs558207456, rs542763237, rs746378441, rs536545503, rs542568822, rs548865256, rs368147111, rs542580556, rs558228752, rs536555646, rs746772302, rs536557590, rs531975462, rs746796860, rs527408032, rs746420496, rs536564089, rs368176642, rs558272974, rs746431232, rs531844054, rs527275962, rs746843910, rs567526414, rs542614723, rs549120414, rs549124141, rs536578689, rs549140206, rs567586614, rs536744845, rs558044120, rs746516190, rs558055629, rs746920567, rs558060550, rs368061706, rs527461217, rs567208316, rs531886773, rs746554596, rs567220976, rs542895321, rs746974389, rs567222661, rs549185419, rs567237436, rs527336026, rs527483460, rs558121403, rs548993925, rs567691347, rs747002615, rs548995543, rs746650412, rs368271911, rs567723777, rs747040934, rs747050192, rs746670993, rs567347819, rs527512680, rs531938194, rs549242146, rs549032856, rs567373871, rs567394422, rs368307024, rs542980503, rs558508221, rs536676061, rs536681562, rs558516052, rs549052565, rs368145556, rs532090630, rs527554992, rs532120905, rs558490145, rs747176695, rs542991566, rs542774236, rs368150079, rs373340022, rs558242385, rs549357789, rs531980410, rs368389084, rs746808580, rs549368350, rs567506427, rs531991551, rs536910845, rs549105394, rs746848184, rs373384143, rs549407905, rs558344252, rs527453833, rs549417854, rs746919102, rs746928276, rs527655882, rs368229380, rs558364672, rs549168229, rs368463219, rs568161057, rs558762757, rs532232329, rs549168547, rs747470520, rs549464271, rs543190810, rs543192154, rs368241422, rs536968067, rs747507965, rs558804203, rs542903509, rs747524681, rs567666371, rs558400652, rs549194158, rs527487277, rs368267915, rs536991033, rs568290255, rs558428181, rs567744716, rs527721202, rs568321346, rs568324171, rs568330046, rs567746937, rs568347691, rs747644321, rs747646048, rs567759326, rs747078793, rs536831479, rs568368464, rs558924666, rs543302057, rs543307320, rs747708818, rs558953446, rs568439076, rs532106809, rs558517679, rs558548847, rs747224561, rs568476272, rs567841142, rs549626904, rs373748468, rs747772882, rs747777569, rs559008851, rs549332923, rs373735201, rs747760347, rs568467648, rs568540915, rs568478645, rs568552353, rs368374445, rs747265095, rs567978316, rs559065366, rs527824027, rs537109464, rs747287657, rs747918167, rs536895056, rs373815330, rs536905377, rs537128261, rs558672062, rs568679804, rs537140055, rs747362082, rs543122161, rs558701088, rs747382624, rs373841126, rs532429751, rs568724063, rs543132278, rs747426187, rs543154656, rs373616597, rs747448727, rs558755199, rs543176875, rs558793028, rs549483878, rs559205579, rs549801876, rs748064481, rs549805500, rs568786830, rs368724653, rs368741155, rs558812967, rs373650798, rs558827971, rs527935102, rs549505744, rs532266308, rs568910791, rs543588977, rs568921105, rs543252094, rs568938831, rs568308434, rs748230779, rs558889724, rs543276363, rs532518466, rs549553842, rs558900091, rs568478922, rs373953968, rs549933491, rs559388880, rs569021337, rs748301976, rs527792590, rs748304870, rs537274423, rs527797934, rs549957716, rs559020013, rs747831682, rs747839515, rs537094901, rs568565984, rs549993366, rs373786499, rs568616456, rs528024377, rs569138531, rs373808223, rs748419478, rs568648416, rs747947163, rs543458934, rs527866121, rs748000776, rs748452908, rs543474534, rs559511141, rs532596683, rs528051938, rs748032198, rs559524225, rs559189600, rs748504526, rs537164960, rs569247301, rs748039029, rs549789421, rs559564579, rs543501994, rs748048145, rs748564719, rs368926174, rs532635443, rs373862049, rs559205490, rs532651681, rs368949323, rs374099497, rs543549351, rs537201581, rs550141100, rs537202219, rs532674344, rs543574164, rs748190208, rs559321177, rs559677369, rs569424535, rs748690640, rs748695381, rs527959809, rs748236906, rs537243887, rs568970879, rs559373028, rs373953011, rs569027161, rs543882002, rs559723934, rs549952543, rs528001989, rs748754609, rs569502538, rs532712684, rs374154008, rs369022060, rs569525422, rs543668808, rs550218083, rs369031999, rs532562751, rs537295453, rs543930117, rs537468875, rs550244319, rs569098216, rs550247150, rs569123332, rs748398622, rs569610503, rs569138600, rs559826745, rs559831361, rs537315654, rs374011315, rs569152152, rs559871284, rs550298627, rs550018415, rs374021078, rs748455811, rs369107141, rs569197685, rs569789352, rs544062895, rs550041205, rs749055063, rs544064839, rs569814685, rs532613900, rs537352949, rs550065962, rs569844606, rs559995442, rs569277903, rs550412301, rs569291008, rs368934346, rs569896484, rs550421090, rs748602707, rs374102129, rs560036890, rs528121884, rs537409772, rs569406301, rs749187435, rs560050695, rs374116302, rs749215366, rs560073328, rs749217434, rs569413716, rs569435862, rs537425379, rs559701154, rs550504055, rs537429508, rs537648288, rs528365663, rs748720721, rs559707544, rs748725716, rs570053547, rs748745862, rs528373215, rs537657709, rs749311576, rs569486858, rs544215781, rs374387803, rs748789887, rs369261656, rs544222244, rs559774900, rs369037062, rs528392678, rs569589072, rs569594721, rs537484448, rs560194858, rs532943697, rs528207220, rs550610763, rs570175462, rs543970760, rs532756083, rs749422762, rs537706167, rs550630579, rs528430659, rs569673848, rs570223084, rs544008440, rs748956951, rs532972999, rs560270291, rs749479220, rs560277925, rs559882854, rs749000031, rs544323417, rs570287651, rs749525560, rs528461391, rs537558317, rs749079120, rs374481593, rs550724860, rs560344389, rs559975872, rs374497861, rs569835399, rs749602473, rs749608721, rs570379112, rs749616223, rs570383918, rs560388069, rs550404028, rs550788771, rs532851603, rs532852070, rs528314905, rs570419018, rs528315588, rs374522881, rs569919976, rs550435904, rs570456628, rs569926252, rs550450442, rs749695781, rs749701713, rs374544338, rs528533074, rs537818590, rs570492575, rs570495057, rs544454714, rs374350913, rs570000771, rs570005998, rs570551342, rs369229821, rs749284610, rs570558380, rs528366547, rs550901951, rs550527209, rs570048995, rs550533340, rs570063206, rs369464511, rs528383682, rs374397762, rs550927757, rs550923680, rs560539816, rs533107673, rs374594002, rs369476119, rs749864558, rs570646108, rs550966261, rs749881351, rs749897918, rs550925375, rs544544030, rs544231457, rs560608042, rs560181527, rs544551194, rs369520775, rs533153225, rs528632986, rs749364100, rs544577577, rs369534920, rs570119696, rs570782066, rs528411030, rs550621249, rs551063575, rs750002442, rs750005785, rs528650251, rs369296369, rs560255202, rs374670592, rs551081825, rs570227654, rs570232101, rs550676640, rs560705198, rs551103406, rs750060579, rs570253110, rs570861231, rs551126930, rs560742915, rs532994198, rs537750141, rs528481236, rs374500828, rs528693904, rs544387925, rs528695618, rs544671979, rs749640667, rs528701463, rs570957540, rs528504065, rs528504422, rs560405294, rs570985462, rs560819326, rs560408978, rs533248873, rs544410928, rs570467358, rs571031386, rs544422821, rs571046788, rs550875084, rs544456517, rs533083149, rs528558257, rs570555980, rs749782980, rs571112937, rs533289922, rs560511642, rs533297953, rs528567800, rs544487770, rs750377110, rs369709511, rs750395605, rs560523856, rs570685646, rs560602815, rs533104605, rs571201597, rs369722062, rs538095397, rs537898453, rs560644731, rs533167279, rs560669576, rs551401679, rs369545306, rs561042263, rs551429062, rs750017693, rs369556343, rs551090369, rs538124443, rs750042378, rs537945859, rs374872804, rs571350458, rs561086455, rs571361273, rs570859811, rs570896555, rs570898206, rs544911099, rs561103484, rs750110593, rs544921736, rs528872305, rs571410824, rs571416933, rs369592808, rs528882230, rs551531848, rs551164285, rs528891024, rs533405417, rs750148529, rs571464240, rs750175883, rs551569090, rs560811710, rs544697883, rs571001720, rs544980017, rs571007860, rs551236739, rs551249244, rs528924602, rs571065554, rs528745212, rs750724319, rs538210953, rs528933846, rs571071311, rs750755032, rs528942614, rs538036504, rs538040234, rs544760124, rs560927301, rs544802212, rs538235148, rs528956488, rs551342807, rs533481144, rs369899370, rs551359194, rs369900308, rs750399158, rs538259887, rs528795367, rs750864433, rs750411662, rs533498494, rs560998810, rs571707506, rs561331700, rs375028919, rs545103329, rs571703952, rs544837618, rs528807734, rs551400406, rs571269005, rs544875089, rs529020508, rs533357560, rs750951154, rs551440261, rs750514774, rs544886311, rs551792787, rs561404804, rs571366310, rs528855590, rs751001567, rs375069289, rs533379792, rs571842712, rs533382711, rs561137186, rs571879284, rs750631806, rs529077450, rs561470191, rs750638359, rs529093387, rs551558117, rs551573774, rs551579214, rs571500446, rs561525428, rs545229175, rs751136819, rs551581886, rs750707641, rs571528077, rs755813688, rs561214522, rs572015044, rs571536730, rs369860008, rs528947505, rs551963416, rs538225517, rs545277826, rs533634090, rs561260903, rs571600152, rs369874176, rs571638665, rs552017588, rs571666279, rs571668997, rs369907063, rs769057914, rs552049341, rs769065818, rs751325083, rs561669214, rs552061128, rs572187861, rs756005334, rs538475444, rs756013985, rs545099670, rs552106230, rs545375585, rs572237867, rs561726025, rs769150127, rs529011948, rs538288286, rs571755014, rs571757393, rs538515826, rs545115612, rs533712836, rs545115642, rs750944314, rs529029702, rs571778387, rs529035618, rs552177570, rs571826748, rs751000526, rs369968332, rs571851662, rs545431594, rs561799159, rs561460464, rs571880265, rs769270578, rs533571445, rs571940318, rs756189754, rs545217019, rs571959447, rs751128080, rs538381958, rs755804903, rs751159961, rs751175785, rs572018867, rs756228072, rs751582483, rs561574977, rs561576248, rs572437382, rs755851030, rs561611663, rs552286628, rs545506688, rs768991354, rs769402083, rs769406063, rs572087546, rs538428981, rs769026589, rs755939083, rs572579811, rs769491361, rs561982435, rs769046166, rs751371429, rs572259896, rs545578378, rs756446498, rs751798524, rs572656276, rs756457749, rs769554090, rs538674345, rs751813574, rs552419780, rs756076130, rs552432031, rs769194199, rs533853260, rs572717577, rs769195919, rs572295505, rs533714676, rs538700995, rs545631150, rs538526606, rs572321690, rs572759437, rs538715990, rs562093903, rs552491193, rs552493086, rs751920813, rs572323525, rs552522135, rs769705492, rs751482341, rs572334430, rs751492391, rs545682563, rs751495665, rs538752299, rs545696456, rs538535248, rs572354221, rs751523153, rs545446264, rs572377516, rs533919054, rs572892333, rs769771450, rs769774967, rs572382379, rs572388571, rs756700849, rs756704425, rs769807240, rs769295468, rs572950216, rs562222303, rs751550702, rs752097894, rs769296900, rs572978709, rs572982359, rs561835001, rs552229556, rs552242552, rs533760063, rs552650520, rs752133481, rs561858372, rs756247571, rs769912734, rs756277853, rs545508686, rs561928325, rs572544925, rs561951163, rs756369671, rs752191138, rs769511874, rs751770785, rs769520412, rs756476767, rs545617350, rs573120275, rs552452362, rs552743787, rs552722759, rs573125010, rs572720574, rs752267943, rs572723257, rs562364859, rs769633498, rs752289745, rs770063371, rs756983343, rs552799307, rs756541837, rs756588238, rs752355486, rs770120624, rs572827353, rs751960880, rs552847137, rs573278742, rs769713298, rs752418228, rs573311661, rs533903238, rs552555197, rs562163326, rs573336871, rs770205263, rs562492571, rs552901035, rs573360915, rs770226861, rs552927404, rs752501530, rs752008244, rs756662298, rs752010591, rs752027589, rs562558634, rs573456683, rs769784952, rs752598240, rs572946713, rs756749599, rs756758706, rs752107556, rs769861427, rs562628042, rs573532135, rs752123654, rs573539819, rs752651234, rs757322465, rs545769534, rs757324658, rs573014318, rs752159218, rs752669367, rs545789688, rs562288190, rs573583431, rs752694131, rs553077185, rs752705175, rs562290070, rs573057895, rs756846139, rs752187308, rs757406912, rs573077799, rs552710847, rs757431594, rs573668899, rs553131814, rs562733566, rs562322012, rs573698013, rs770570377, rs769977143, rs752262387, rs752842135, rs553198489, rs562795927, rs573769337, rs752265531, rs770014639, rs757542280, rs573778414, rs573160530, rs573173020, rs756996519, rs757574398, rs573226807, rs573830638, rs573832648, rs770130183, rs770143495, rs770714259, rs752395219, rs757620158, rs562472371, rs757091887, rs757651862, rs573329574, rs552932842, rs757678036, rs562906731, rs573398771, rs573931855, rs757698701, rs573423419, rs757196334, rs573956248, rs562590653, rs770844073, rs753073195, rs757264923, rs770368521, rs562966673, rs553375250, rs757286231, rs562624182, rs553028786, rs562631637, rs553396451, rs757816346, rs752659859, rs770424435, rs753158893, rs753161012, rs553429432, rs757326234, rs562658586, rs757848676, rs563030100, rs757851276, rs770440360, rs553444080, rs562685659, rs770998439, rs757903328, rs752715463, rs753243305, rs574158047, rs753248999, rs573615359, rs771049218, rs553520048, rs574218458, rs574218497, rs770484072, rs770507859, rs757415695, rs573692993, rs771127117, rs753348681, rs770572267, rs574279980, rs573729847, rs553217886, rs752874223, rs574313437, rs770646119, rs753375127, rs553594673, rs753413529, rs563204921, rs563204956, rs573793230, rs553615720, rs770669377, rs752915464, rs752935458, rs771254688, rs563250976, rs752936829, rs573845641, rs758171359, rs553671701, rs757627939, rs770755089, rs770761836, rs573905888, rs758213818, rs574458879, rs758231448, rs770785487, rs563313026, rs758251421, rs758252419, rs573944942, rs753048798, rs771377765, rs563340232, rs553350853, rs758286245, rs562957866, rs553362365, rs757786023, rs574020661, rs753630953, rs562989702, rs574575080, rs753648561, rs753119257, rs753668162, rs753149666, rs563015753, rs753169837, rs553433381, rs770963601, rs574621082, rs753732662, rs758421005, rs574670231, rs757870156, rs771562041, rs574145206, rs574724729, rs757927255, rs553537463, rs771111770, rs574251637, rs553550103, rs563161459, rs758527549, rs574771040, rs753843081, rs553570026, rs771649415, rs574292008, rs771662229, rs574805977, rs574854330, rs771738593, rs563201986, rs758651382, rs574315059, rs758656020, rs574340577, rs758660161, rs771774637, rs758691949, rs758107372, rs754017346, rs771227297, rs563235099, rs553661695, rs754045274, rs563260674, rs754055297, rs563269397, rs553682936, rs574438316, rs771304275, rs758800428, rs753559306, rs771919739, rs753582578, rs754141945, rs575081551, rs563336388, rs575092590, rs753600502, rs575125159, rs771392468, rs563351273, rs758888190, rs563353671, rs758905037, rs771413333, rs553772622, rs574587211, rs753682189, rs758373659, rs772039702, rs772039784, rs772048626, rs754275081, rs771477905, rs753690596, rs553815137, rs575278958, rs574681748, rs575303100, rs771582810, rs758485743, rs759087854, rs575348590, rs753812341, rs759111100, rs772225059, rs758499442, rs754462186, rs754476252, rs574742878, rs754490813, rs772285262, rs753828829, rs574761563, rs772336893, rs754543076, rs759290654, rs772395366, rs753849639, rs754638250, rs758555473, rs759384662, rs574887579, rs754694440, rs772505511, rs754710057, rs753978827, rs771768782, rs772542224, rs772565872, rs574947376, rs759493094, rs771816020, rs574962188, rs758720517, rs754046765, rs772538411, rs754056327, rs759582553, rs754072901, rs759604608, rs759618021, rs759618971, rs772713563, rs754073647, rs754934055, rs754977237, rs772800001, rs758784984, rs754113212, rs575064964, rs575092333, rs771950039, rs575127361, rs771984656, rs771998562, rs772005602, rs759809047, rs772905789, rs575158631, rs755129606, rs754241027, rs755139637, rs754241912, rs759868988, rs575188566, rs755204073, rs773012423, rs773015695, rs773030286, rs575222561, rs759000378, rs575270437, rs772133229, rs759054169, rs760019571, rs575323599, rs772196281, rs755344662, rs755345735, rs759150088, rs773161532, rs755360952, rs755361509, rs772283807, rs760088897, rs773197006, rs773259205, rs760189302, rs755471441, rs755501706, rs754512913, rs760244093, rs755553046, rs772335325, rs759300259, rs772449743, rs773425925, rs772489586, rs754719129, rs755653914, rs755666694, rs760410743, rs759482720, rs759520309, rs754870625, rs760471093, rs759523063, rs754822550, rs773686703, rs754840578, rs760600919, rs760603637, rs772672495, rs754892941, rs760523838, rs760451171, rs755736948, rs760557658, rs760816228, rs772714587, rs755000613, rs772804611, rs755017523, rs759736603, rs759736945, rs760912489, rs774006498, rs772843217, rs759766086, rs755067851, rs759784688, rs761013330, rs772909429, rs772930184, rs761116601, rs761152276, rs774249327, rs774251259, rs774274995, rs772944744, rs761216742, rs774309167, rs772964132, rs761267824, rs761373885, rs759949565, rs755275181, rs774519927, rs774522732, rs761441210, rs761463732, rs773084045, rs773099131, rs773104432, rs760030368, rs774666634, rs761564783, rs761565126, rs755324498, rs773159916, rs761601211, rs755370020, rs761671328, rs774795813, rs774799502, rs760228901, rs774812992, rs774858304, rs761769631, rs755586452, rs761781232, rs774899950, rs773396301, rs760333909, rs755619723, rs774976082, rs761920258, rs761927300, rs761950663, rs773446299, rs761963623, rs775079499, rs755705775, rs773689919, rs760624162, rs760699862, rs762086202, rs775205757, rs762111294, rs762125145, rs760733738, rs773860024, rs775323392, rs762225419, rs775369857, rs775376322, rs773919023, rs773782386, rs760694869, rs775387692, rs773967655, rs760882331, rs762340832, rs762148321, rs762202141, rs775464792, rs775131844, rs762435356, rs775544399, rs762034007, rs762510204, rs775614853, rs775627209, rs773976748, rs760891383, rs760906241, rs774029965, rs775822699, rs762720619, rs774047193, rs774053322, rs762804252, rs774058465, rs774129861, rs761104208, rs762966087, rs762968069, rs776089462, rs761185751, rs774332033, rs774469859, rs776158237, rs774482073, rs774589810, rs761511663, rs763179120, rs761511750, rs774646303, rs761588559, rs774694132, rs774728176, rs761697288, rs774886139, rs774922349, rs761826946, rs761845760, rs775063793, rs762003012, rs776637872, rs776654464, rs763546628, rs775110547, rs762276860, rs775383881, rs775461240, rs762422181, rs776740578, rs763649134, rs775386066, rs762309744, rs762328054, rs762349561, rs763826888, rs776958522, rs763851219, rs763608389, rs776992703, rs763887905, rs776685090, rs763905132, rs763962939, rs763974094, rs777096875, rs764029915, rs763580952, rs775580427, rs762627922, rs777288188, rs762666941, rs762675794, rs775794317, rs762726532, rs762730738, rs762889511, rs762892329, rs762959657, rs763002281, rs763002290, rs763012243, rs776218442, rs777563631, rs776244370, rs777622383, rs776251366, rs776332292, rs763230781, rs776360258, rs776427552, rs764653324, rs776476300, rs763360058, rs763363216, rs776553236, rs763457677, rs777864926, rs763480814, rs763480911, rs776628475, rs763552752, rs763566743, rs778010014, rs778022974, rs778036245, rs763698303, rs776874241, rs777012344, rs763688323, rs778143440, rs777215702, rs778289549, rs778300575, rs764096123, rs776939122, rs776981873, rs778119782, rs778380666, rs778267601, rs765112370, rs778321318, rs778494297, rs765311513, rs764145516, rs777290815, rs765318979, rs765320933, rs764873930, rs764888631, rs778333649, rs778374010, rs764194425, rs778674007, rs777339467, rs777382966, rs777418612, rs777478358, rs765540232, rs764346157, rs764347894, rs778800909, rs764349631, rs764377819, rs764399440, rs778929063, rs779079123, rs777546243, rs764445619, rs765838143, rs779164966, rs777646023, rs779192695, rs764496311, rs777703989, rs777740982, rs777812604, rs777829093, rs764661916, rs777840632, rs779461736, rs777844017, rs777855721, rs766045094, rs766058889, rs764699511, rs764719051, rs764746314, rs764794225, rs779681069, rs777969265, rs779840641, rs779874157, rs778055850, rs778396766, rs779957394, rs766239824, rs780023870, rs780043145, rs766263796, rs766274346, rs778441261, rs765258572, rs780109322, rs778501127, rs765316534, rs766324084, rs778543495, rs765369653, rs778602129, rs766393434, rs780316047, rs765423637, rs778611965, rs780347157, rs765492974, rs765497371, rs778714853, rs780447105, rs765533323, rs766481843, rs780503041, rs780639638, rs765541870, rs780693341, rs778736307, rs765643844, rs765653200, rs765673912, rs765800389, rs766622658, rs780798844, rs779132370, rs766649583, rs779175706, rs779230028, rs779282960, rs779344629, rs779375751, rs765948436, rs779425422, rs781124123, rs779450397, rs765993652, rs766010851, rs766066655, rs766071038, rs779649545, rs779679057, rs779738791, rs766206300, rs766879944, rs779928230, rs766901141, rs766933679, rs780083168, rs766940667, rs766287305, rs766299085, rs766300702, rs781535786, rs781539021, rs781551678, rs780193488, rs780222163, rs780296350, rs766400518, rs796125137, rs767194024, rs780344643, rs767261742, rs780357335, rs766453651, rs766456874, rs780494441, rs766560176, rs796454833, rs767330330, rs766575026, rs780717433, rs796834572, rs780751522, rs796879015, rs796895878, rs796908878, rs796943897, rs780779741, rs767568953, rs767585211, rs767665163, rs780791041, rs780805821, rs767821897, rs767874262, rs780879054, rs767995767, rs768064437, rs766687711, rs766688014, rs766704428, rs768290765, rs781060177, rs781072045, rs768466223, rs781072572, rs781158522, rs781159679, rs768587771, rs768603693, rs768623038, rs768653386, rs768702122, rs768711176, rs768744959, rs768781393, rs781188766, rs768844255, rs781231699, rs768884828, rs768886558, rs781253062, rs781284676, rs766863424, rs781317195, rs781327688, rs781361862, rs781448754, rs781467412, rs766956430, rs781531817, rs767039336, rs767055311, rs781777533, rs767184929, rs796249942, rs796309254, rs767265990, rs796349008, rs796352290, rs796380704, rs796730002, rs796797940, rs796870168, rs796981058, rs767788312, rs767804500, rs767905631, rs768152740, rs768239772, rs768260693, rs768385834, rs768416620, rs768531332, rs768574136, rs768585281, rs768804885, i rs768853312.
[0800] Vodeća RNK koja se koristi u predmetnom pronalasku definisana je u patentnim zahtevima. Pored date vodeće RNK, druge vodeće RNK koje nisu obuhvaćene zahtevima, a koje sadrže najmanje jednu ciljnu sekvencu nukleinske kiseline od 20 nukleotida (nt), navedene su u Tabeli 5. U Tabeli 5 su dati simbol gena i identifikator sekvence gena (SEQ ID NO gena), sekvenca gena koja uključuje 1-5 kilobaznih parova uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog gena (Prošireni SEQ ID NO gena) i ciljna sekvenca nukleinske kiseline od 20 nt (20 nt Ciljne sekvence SEQ ID NO). U sekvenci koja navodi odgovarajući ciljni gen, lanac za ciljanje gena (označen kao (+) lanac ili (-) lanac u listi sekvenci), povezani PAM tip i PAM sekvenca su opisani za svaku od ciljnih sekvenci nukleinske kiseline od 20 nt (SEQ ID NO: 5305-125469). U tehnici se podrazumeva da sekvenca spejsera, gde „T“ je „U“, može biti RNK sekvenca koja odgovara sekvencama od 20 nt navedenim u Tabeli 5.
[0802] Tabela 5. Sekvence nukleinskih kiselina
[0804]
[0807] U jednom primeru, vodeća RNK koja se koristi u predmetnom pronalasku može da sadrži najmanje jednu sekvencu spejsera koja, gde „T“ je „U“, može biti RNK sekvenca koja odgovara ciljnoj sekvenci od 20 nukleotida (nt), kao što je, ali nije ograničena na, bilo koja od SEQ ID NO: 5305-125469.
[0809] U jednom primeru, vodeća RNK koja se koristi u predmetnom pronalasku može da sadrži najmanje jednu sekvencu spejsera koja, gde „T“ je „U“, predstavlja RNK sekvencu koja odgovara sekvencama od 20 nt, kao što je, ali nije ograničena na, bilo koja od SEQ ID NO: 5305-125469.
[0810] U jednom primeru, vodeća RNK može da sadrži ciljnu sekvencu nukleinske kiseline od 20 nukleotida (nt) povezanu sa PAM tipom, kao što su, ali ne ograničavajući se na, NAAAAC, NNAGAAW, NNGRRT, NNNNGHTT, NRG ili YTN. Kao neograničavajući primer, ciljna sekvenca nukleinske kiseline od 20 nt za specifični ciljni gen i specifični PAM tip može biti, gde „T“ je „U“, RNK sekvenca koja odgovara bilo kojoj od sekvenci nukleinske kiseline od 20 nt u Tabeli 6.
[0812] Tabela 6. Sekvence nukleinskih kiselina po tipu PAM
[0814]
[0815] U jednom primeru, vodeća RNK može da sadrži ciljnu sekvencu nukleinske kiseline od 20 nukleotida (nt) povezanu sa YTN PAM tipom. Kao neograničavajući primer, ciljna sekvenca nukleinske kiseline od 20 nt za specifični ciljni gen može da sadrži osnovnu sekvencu od 20 nt gde osnovna sekvenca od 20 nt, gde „T“ je „U“, može biti RNK sekvenca koja odgovara SEQ ID NO: 56864-125469. Kao još jedan neograničavajući primer, ciljna sekvenca nukleinske kiseline od 20 nt za specifični ciljni gen može da sadrži osnovnu sekvencu gde osnovna sekvenca, gde „T“ je „U“, može biti fragment, segment ili region RNK sekvence koji odgovara bilo kojoj od SEQ ID NO: 56864-125469.
[0817] VI. DRUGI TERAPEUTSKI PRISTUPI
[0819] Gensko uređivanje može se sprovesti korišćenjem nukleaza konstruisanih da ciljaju specifične sekvence. Do danas postoje četiri glavna tipa nukleaza: meganukleaze i njihovi derivati, nukleaze cinkovog prsta (ZFN), efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) i CRISPR-Cas9 nukleazni sistemi. Nukleazne platforme se razlikuju po težini dizajna, gustini ciljanja i načinu delovanja, posebno zato što je specifičnost ZFN i TALEN kroz interakcije proteina i DNK, dok interakcije RNK i DNK prvenstveno vode Cas9.
[0821] CRISPR endonukleaze, kao što je Cas9, mogu se koristiti u postupcima predmetnog pronalaska. Međutim, učenja opisana ovde, kao što su terapijska ciljna mesta, mogla bi se primeniti na druge oblike endonukleaza, kao što su ZFN, TALEN, HE ili MegaTAL, ili korišćenjem kombinacija nukleaza. Međutim, da bi se učenja predmetnog pronalaska primenila na takve endonukleaze, bilo bi potrebno, između ostalog, konstruisati proteine usmerene na specifična ciljna mesta.
[0823] Dodatni domeni vezivanja mogu se spojiti sa Cas9 proteinom radi povećanja specifičnosti. Ciljna mesta ovih konstrukcija bi se mapirala na identifikovano mesto određeno za gRNK, ali bi zahtevala dodatne motive vezivanja, kao što je domen cinkovog prsta. U slučaju Mega-TAL, meganukleaza se može spojiti sa TALE domenom vezivanja DNK. Domen meganukleaze može povećati specifičnost i obezbediti cepanje. Slično tome, inaktivirani ili mrtvi Cas9 (dCas9) može se spojiti sa domenom cepanja i zahtevati ciljno mesto sgRNK/Cas9 i susedno mesto vezivanja za fuzioni domen vezivanja DNK. Ovo bi verovatno zahtevalo određeno inženjering proteina dCas9, pored katalitičke inaktivacije, kako bi se smanjilo vezivanje bez dodatnog mesta vezivanja.
[0825] Nukleaze cinkovih prstiju
[0826] Nukleaze cinkovih prstiju (ZFN) su modularni proteini koji se sastoje od inženjerisanog domena za vezivanje DNK cinkovog prsta povezanog sa katalitičkim domenom endonukleaze tipa II FokI. Pošto FokI funkcioniše samo kao dimer, par ZFN mora biti inženjerisan da bi se vezao za srodne ciljne sekvence „polu-mesta“ na suprotnim lancima DNK i sa preciznim razmakom između njih kako bi se omogućilo formiranje katalitički aktivnog Fokl dimera. Nakon dimerizacije Fokl domena, koji sam po sebi nema specifičnost sekvence, generiše se dvostruki prekid DNK između ZFN polu-mesta kao početni korak u uređivanju genoma.
[0828] DNK vezujući domen svakog ZFN se obično sastoji od 3-6 cinkovih prstiju obilne Cys2-His2 arhitekture, pri čemu svaki prst prvenstveno prepoznaje triplet nukleotida na jednom lancu ciljne DNK sekvence, iako može biti važna i unakrsna interakcija sa četvrtim nukleotidom. Promena amino-kiselina prsta na pozicijama koje ostvaruju ključne kontakte sa DNK menja specifičnost sekvence datog prsta. Dakle, protein cinkovog prsta sa četiri prsta će selektivno prepoznati ciljnu sekvencu od 12 bp, gde je ciljna sekvenca kompozit tripletnih preferencija koje doprinosi svaki prst, iako na tripletne preferencije mogu u različitom stepenu uticati susedni prsti. Važan aspekt ZFN je da se oni mogu lako preusmeriti na skoro bilo koju genomsku adresu jednostavnim modifikovanjem pojedinačnih prstiju, iako je za dobro urađeno ovo potrebno značajno iskustvo. U većini primena ZFN koriste se proteini od 4-6 prstiju, koji prepoznaju 12-18 bp redom. Stoga, par ZFN će obično prepoznati kombinovanu ciljnu sekvencu od 24-36 bp, ne uključujući uobičajeni razmak od 5-7 bp između polu-mesta. Mesta vezivanja mogu se dalje razdvojiti većim spejserma, uključujući 15-17 bp. Ciljna sekvenca ove dužine verovatno je jedinstvena u ljudskom genomu, pod pretpostavkom da su ponavljajuće sekvence ili genski homolozi isključeni tokom procesa dizajniranja. Ipak, interakcije ZFN proteina i DNK nisu apsolutne u svojoj specifičnosti, tako da se događaji vezivanja i cepanja van cilja dešavaju, bilo kao heterodimer između dva ZFN, ili kao homodimer jednog ili drugog od ZFN. Poslednja mogućnost je efikasno eliminisana inženjeringom interfejsa dimerizacije Fokl domena da bi se stvorile „plus“ i „minus“ varijante, poznate i kao obligatne heterodimerne varijante, koje mogu dimerizovati samo jedna sa drugom, a ne i sa sobom. Forsiranje obligatnog heterodimera sprečava formiranje homodimera. Ovo je značajno poboljšalo specifičnost ZFN, kao i bilo koje druge nukleaze koja usvaja ove FokI varijante.
[0829] U tehnici je opisan niz sistema zasnovanih na ZFN, njihove modifikacije se redovno objavljuju, a brojne reference opisuju pravila i parametre koji se koriste za vođenje dizajna ZFN; videti, npr. Segal et al., Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758‑63 (1999); Dreier B et al., J Mol Biol.
[0830] 303(4):489‑502 (2000); Liu Q et al., J Biol Chem.277(6):3850‑6 (2002); Dreier et al., J Biol Chem 280(42):35588‑97 (2005); and Dreier et al., J Biol Chem.276(31):29466‑78 (2001).
[0832] Efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN)
[0834] TALEN predstavljaju drugi format modularnih nukleaza pri čemu je, kao i kod ZFN, genetski modifikovani domen za vezivanje DNK povezan sa domenom nukleaze FokI, a par TALEN deluje u tandemu kako bi se postiglo ciljano cepanje DNK. Glavna razlika od ZFN je priroda domena za vezivanje DNK i povezana svojstva prepoznavanja ciljne sekvence DNK. TALEN domen za vezivanje DNK potiče od TALE proteina, koji su prvobitno opisani kod biljnog bakterijskog patogena xanthomonas sp. TALE se sastoje od tandemskih nizova od 33-35 ponavljanja aminokiselina, pri čemu svako ponavljanje prepoznaje jedan bazni par u ciljnoj DNK sekvenci koja je tipično dužine do 20 bp, što daje ukupnu dužinu ciljne sekvence do 40 bp. Specifičnost nukleotida svakog ponavljanja određena je varijablom diresidue (RVD), koja uključuje samo dve aminokiseline na pozicijama 12 i 13. Baze guanin, adenin, citozin i timin pretežno prepoznaju četiri RVD: Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp i Asn-Gly, redom. Ovo predstavlja mnogo jednostavniji kod za prepoznavanje nego za cinkove prste i stoga predstavlja prednost u odnosu na ove druge za dizajn nukleaza. Ipak, kao i kod ZFN, interakcije proteina i DNK TALEN nisu apsolutne u svojoj specifičnosti, a TALEN su takođe imali koristi od upotrebe obligatnih heterodimernih varijanti Fokl domena kako bi se smanjila aktivnost van cilja.
[0836] Kreirane su dodatne varijante Fokl domena koje su deaktivirane u svojoj katalitičkoj funkciji. Ako jedna polovina TALEN ili ZFN para sadrži neaktivni FokI domen, onda će se na ciljnom mestu dogoditi samo cepanje (nikovanje) jednolančane DNK, umesto DSB-a. Ishod je uporediv sa upotrebom CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 „nikaza“ mutanata kod kojih je jedan od Cas9 domena cepanja deaktiviran. DNK nikovi se mogu koristiti za pokretanje uređivanja genoma pomoću HDR, ali sa manjom efikasnošću nego sa DSB. Glavna prednost je što se nikovi van cilja brzo i precizno popravljaju, za razliku od DSB, koji je sklon pogrešnoj popravci posredovanoj NHEJ.
[0837] U tehnici je opisan niz sistema zasnovanih na TALEN, a njihove modifikacije se redovno prijavljuju; videti, npr. Boch, Science 326(5959):1509‑12 (2009); Mak et al., Science 335(6069):716‑9 (2012); i Moscou et al., Science 326(5959):1501 (2009).Upotrebu TALEN zasnovanih na platformi „Zlatna kapija“ (Golden Gate), odnosno shemi kloniranja, opisalo je više grupa; videti, npr. Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011); Li et al., Nucleic Acids Res. 39(14):6315‑25(2011); Weber et al., PLoS One. 6(2):e16765 (2011); Wang et al., J Genet Genomics 41(6):339‑47, Epub 2014 May 17 (2014); i Cermak T et al., Methods Mol Biol.
[0838] 1239:133‑59 (2015).
[0840] Homing endonukleaze
[0842] Homing endonukleaze (HE) su sekvencijalno specifične endonukleaze koje imaju dugačke sekvence prepoznavanja (14-44 bazna para) i cepaju DNK sa visokom specifičnošću - često na mestima jedinstvenim u genomu. Postoji najmanje šest poznatih porodica HE klasifikovanih po svojoj strukturi, uključujući GIY-YIG, His-Cis box, H-N-H, PD‑(D/E)xK,i Vsr-slične koje potiču od širokog spektra domaćina, uključujući eukariote, protiste, bakterije, arheje, cijanobakterije i fage. Kao i kod ZFN i TALEN, HE se mogu koristiti za kreiranje DSB na ciljnom lokusu kao početni korak u uređivanju genoma. Pored toga, neke prirodne i inženjerske HE seku samo jedan lanac DNK, čime funkcionišu kao nikaze specifične za mesto. Velika ciljna sekvenca HE i specifičnost koju nude učinile su ih atraktivnim kandidatima za kreiranje DSB specifičnih za mesto.
[0844] U tehnici je opisan niz sistema zasnovanih na visokotemperaturnim elektrodifuznim energijama, a njihove modifikacije se redovno objavljuju; videti, npr. preglede od strane Steentoft et al., Glycobiology 24(8):663‑80 (2014); Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol.1123:1‑26 (2014); Hafez and Hausner, Genome 55(8):553‑69 (2012); i reference navedene u njima.
[0846] MegaTAL / Tev-mTALEN / MegaTev
[0848] Kao dalji primeri hibridnih nukleaza, MegaTAL platforma i Tev-mTALEN platforma koriste fuziju TALE domena za vezivanje DNK i katalitički aktivnih HE elemenata, koristeći prednosti i podesivog vezivanja DNK i specifičnosti TALE-a, kao i specifičnosti sekvence cepanja HE; videti, npr. Boissel et al., NAR 42: 2591‑2601 (2014); Kleinstiver et al., G34:1155‑65 (2014); i Boissel and Scharenberg, Methods Mol. Biol.1239: 171‑96 (2015).
[0850] U daljoj varijaciji, arhitektura MegaTev je fuzija meganukleaze (Mega) sa nukleaznim domenom izvedenim iz GIY-YIG homing endonukleaze I-TevI (Tev). Dva aktivna mesta su udaljena ~30 bp na DNK supstratu i generišu dva DSB sa nekompatibilnim kohezivnim krajevima; videti, npr. Wolfs et al., NAR 42, 8816‑29 (2014). Očekuje se da će se razviti i druge kombinacije postojećih pristupa zasnovanih na nukleazi i biti korisne u postizanju ciljanih modifikacija genoma opisanih ovde.
[0852] dCas9-FokI ili dCpf1-Fok1 i druge nukleaze
[0854] Kombinovanje strukturnih i funkcionalnih svojstava gore opisanih nukleaznih platformi nudi dalji pristup uređivanju genoma koji potencijalno može prevazići neke od inherentnih nedostataka. Na primer, sistem za uređivanje genoma CRISPR obično koristi jednu Cas9 endonukleazu za kreiranje DSB. Specifičnost ciljanja je vođena sekvencom od 20 ili 24 nukleotida u vodičnoj RNK koja se podvrgava Votson-Krikovom uparivanju baza sa ciljnom DNK (plus dodatne 2 baze u susednoj NAG ili NGG PAM sekvenci u slučaju Cas9 iz s. pyogenes). Takva sekvenca je dovoljno dugačka da bude jedinstvena u ljudskom genomu, međutim, specifičnost interakcije RNK/DNK nije apsolutna, sa značajnim promiskuitetom koja se ponekad toleriše, posebno u 5’ polovini ciljne sekvence, efikasno smanjujući broj baza koje pokreću specifičnost. Jedno rešenje za ovo je bilo potpuno deaktiviranje katalitičke funkcije Cas9 ili Cpf1 - zadržavajući samo funkciju vezivanja DNK vođenu RNK - i umesto toga spajanje FokI domena sa deaktiviranim Cas9; videti, npr. Tsai et al., Nature Biotech 32: 569‑76 (2014); i Guilinger et al., Nature Biotech. 32: 577‑82 (2014). Pošto FokI mora da dimerizuje da bi postao katalitički aktivan, potrebne su dve vodeće RNK da bi povezale dve Fokl fuzije u neposrednoj blizini kako bi formirale dimer i razdvojile DNK. Ovo u suštini udvostručuje broj baza u kombinovanim ciljnim mestima, čime se povećava strogost ciljanja pomoću CRISPR-baziranih sistema.
[0856] Kao dalji primer, fuzija TALE DNK vezujućeg domena sa katalitički aktivnim HE, kao što je I-TevI, koristi prednosti i podesivog vezivanja DNK i specifičnosti TALE, kao i specifičnosti sekvence cepanja I-TevI, sa očekivanjem da se vanciljno cepanje može dodatno smanjiti.
[0858] VII. POGOCI
[0860] Predmetni pronalazak opisuje, ali ne zahteva prava na komplete za sprovođenje ovde opisanih postupaka. Komplet može da sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina usmerenih na genom, polinukleotida koji kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom, polipeptida usmerenog na mesto, polinukleotida koji kodira polipeptid usmeren na mesto i/ili bilo koju nukleinsku kiselinu ili proteinski molekul neophodne za sprovođenje aspekata ovde opisanih postupaka, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0862] Komplet može da sadrži: (1) vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom, (2) polipeptid usmeren ka mestu ili vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid usmeren ka mestu i (3) reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje vektora(a) i/ili polipeptida.
[0864] Komplet može da sadrži: (1) vektor koji sadrži (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na genom i (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid usmeren ka mestu; i (2) reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje vektora.
[0866] U bilo kom od gore navedenih kompleta, komplet može da sadrži jednomolekularnu vodičnu nukleinsku kiselinu usmerenu na genom. U bilo kom od gore navedenih kompleta, komplet može da sadrži dvomolekularnu nukleinsku kiselinu usmerenu na genom. U bilo kom od gore navedenih kompleta, komplet može da sadrži dva ili više dvomolekularnih ili jednomolekularnih vodiča. Kompleti mogu da sadrže vektor koji kodira nukleinsku kiselinu usmerenu na nukleinsku kiselinu.
[0867] U bilo kom od gore navedenih kompleta, komplet može dodatno da sadrži polinukleotid koji se ubacuje da bi se izvršila željena genetska modifikacija.
[0869] Komponente kompleta mogu biti u odvojenim kontejnerima ili kombinovane u jednom kontejneru.
[0870] Bilo koji komplet opisan gore može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih reagensa, gde su takvi dodatni reagensi odabrani iz pufera, pufera za unošenje polipeptida ili polinukleotida u ćeliju, pufera za pranje, kontrolnog reagensa, kontrolnog vektora, kontrolnog RNK polinukleotida, reagensa za in vitro proizvodnju polipeptida iz DNK, adaptera za sekvenciranje i slično. Pufer može biti stabilizacioni pufer, rekonstituišući pufer, razblažujući pufer ili slično. Komplet, takođe, može da sadrži jednu ili više komponenti koje se mogu koristiti za olakšavanje ili poboljšanje vezivanja na cilj ili cepanja DNK endonukleazom ili za poboljšanje specifičnosti ciljanja.
[0872] Pored gore pomenutih komponenti, komplet može dodatno da sadrži uputstva za korišćenje komponenti kompleta za vežbanje postupaka. Uputstva za vežbanje postupaka mogu biti snimljena na odgovarajućem medijumu za snimanje. Na primer, uputstva mogu biti odštampana na podlozi, kao što je papir ili plastika itd. Uputstva mogu biti prisutna u kompletima kao uložak u pakovanju, na etiketi posude kompleta ili njegovih komponenti. (tj. povezano sa pakovanjem ili podpakovanjem), itd. Uputstva mogu biti prisutna kao elektronska datoteka sa podacima za skladištenje koja se nalazi na odgovarajućem računarski čitljivom medijumu za skladištenje, npr. CD-ROM, disketa, fleš disk, itd. U nekim slučajevima, stvarna uputstva nisu prisutna u kompletu, ali mogu se obezbediti sredstva za dobijanje uputstava iz udaljenog izvora (npr. putem interneta). Primer ovog slučaja je komplet koji sadrži internet adresu gde se uputstva mogu pregledati i/ili sa koje se uputstva mogu preuzeti. Kao i kod uputstava, ovo sredstvo za dobijanje uputstava može biti snimljeno na odgovarajućoj podlozi.
[0874] IX. DEFINICIJE
[0876] Izraz „koji obuhvata“ ili „sadrži“ se koristi u vezi sa kompozicijama, postupcima i njihovim odgovarajućim komponentama, koje su neophodne za predmetni pronalazak, ali su otvorene za uključivanje nespecifikovanih elemenata, bez obzira da li su neophodni ili ne.
[0878] Izraz „koji se u suštini sastoji od“ odnosi se na one elemente potrebne za dati aspekt. Izraz dozvoljava prisustvo dodatnih elemenata koji materijalno ne utiču na osnovne i nove ili funkcionalne karakteristike tog aspekta predmetnog pronalaska.
[0880] Izraz „koji se sastoji od“ odnosi se na kompozicije, postupke i njihove odgovarajuće komponente kako je ovde opisano, a koje isključuju bilo koji element koji nije naveden u tom opisu aspekta.
[0881] Jednina „a“, „an“ i „the“ (iz engleske verzije) uključuje i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0883] Bilo koji numerički raspon naveden u ovoj specifikaciji opisuje sve podraspone iste numeričke preciznosti (tj. one sa istim brojem navedenih cifara) obuhvaćene navedenim rasponom. Na primer, navedeni raspon od „1,0 do 10,0“ opisuje sve podraspone između (uključujući) navedene minimalne vrednosti od 1,0 i navedene maksimalne vrednosti od 10,0, kao što je, na primer, „2,4 do 7,6“, čak i ako raspon od „2,4 do 7,6“ nije izričito naveden u tekstu specifikacije. Shodno tome, podnosilac zahteva zadržava pravo da izmeni ovu specifikaciju, uključujući i patentne zahteve, kako bi izričito naveo bilo koji podraspon iste numeričke preciznosti obuhvaćen opsezima izričito navedenim u ovoj specifikaciji. Svi takvi opsezi su inherentno opisani u ovoj specifikaciji tako da će izmena radi izričitog navođenja bilo kog takvog podraspona biti u skladu sa zahtevima za pisani opis, dovoljnost opisa i dodatne informacije, uključujući zahteve prema 35 U.S.C. članu 112(a) i članu 123(2) EPK. Takođe, osim ako nije izričito naznačeno ili kontekst drugačije zahteva, svi numerički parametri opisani u ovoj specifikaciji (kao što su oni koji izražavaju vrednosti, raspone, količine, procente i slično) mogu se čitati kao da im prethodi reč „oko“, čak i ako reč „oko“ ne stoji izričito ispred broja. Pored toga, numeričke parametre opisane u ovoj specifikaciji treba tumačiti u svetlu broja prijavljenih značajnih cifara, numeričke preciznosti i primenom uobičajenih tehnika zaokruživanja. Takođe se podrazumeva da će numerički parametri opisani u ovoj specifikaciji nužno posedovati inherentnu varijabilnost karakterističnu za osnovne tehnike merenja koje se koriste za određivanje numeričke vrednosti parametra.
[0885] Detalji jednog ili više primera predmetnog pronalaska navedeni su u pratećem opisu u nastavku. Iako se bilo koji materijali i postupci slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada su opisani preferirani materijali i postupci. Ostale karakteristike, ciljevi i prednosti predmetnog pronalaska biće očigledne iz opisa. U opisu, jednina takođe uključuje i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ih obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovo predmetni pronalazak pripada. U slučaju sukoba, ovaj opis će biti merodavan.
[0887] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima.
[0889] X. PRIMERI
[0891] Predmetni pronalazak će biti potpunije razumljiv uz upućivanje na sledeće primere. Sledeći primeri su dati samo u svrhu reference i odgovarajuće realizacije ne čine deo pronalaska čija se zahteva traži.
[0893] Primeri opisuju upotrebu CRISPR sistema kao ilustrativne tehnike uređivanja genoma za kreiranje definisanih terapeutskih genomskih delecija, insercija ili zamena, ovde nazvanih „genomske modifikacije“, u genu SCN9A koje dovode do trajne delecije ili mutacije gena SCN9A, što smanjuje ili eliminiše aktivnost proteina SCN9A. Uvođenje definisanih terapeutskih modifikacija predstavlja novu terapeutsku strategiju za potencijalno ublažavanje bola, kao što je ovde opisano i ilustrovano.
[0895] Različiti Cas ortolozi se procenjuju na sečenje. gRNK se isporučuju kao RNK i eksprimuju se iz U6 promotora u plazmidima. Odgovarajući Cas protein se ili ubacuje u ćelijsku liniju od interesa i konstitutivno se eksprimuje, isporučuje kao mRNK ili isporučuje kao protein. Aktivnost gRNK u svim formatima se procenjuje korišćenjem TIDE analize u HEK293T ćelijama.
[0897] Uvođenje definisanih terapijskih modifikacija opisanih gore predstavlja novu terapijsku strategiju za potencijalno ublažavanje bola i srodnih poremećaja, kao što je ovde opisano i ilustrovano.
[0898] Primer 1 - Ciljna mesta CRISPR/SpCas9 za SCN9A gen
[0900] Regioni gena SCN9A su skenirani u potrazi za ciljnim mestima. Svaka oblast je skenirana u potrazi za protospejser susednom motivu (PAM) koji ima sekvencu NRG. Zatim su identifikovane sekvence spejsera od 20 bp gRNK koje odgovaraju PAM, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 18989-56863 Liste sekvenci.
[0902] Primer 2 - Ciljna mesta CRISPR/SaCas9 za SCN9A gen
[0904] Regioni gena SCN9A su skenirani u potrazi za ciljnim mestima. Svaka oblast je skenirana u potrazi za protospejser susednom motivu (PAM) koji ima sekvencu NNGRRT. Zatim su identifikovane sekvence spejsera gRNK od 20 bp koje odgovaraju PAM, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 8562-13614 Liste sekvenci.
[0906] Primer 3 - Ciljna mesta CRISPR/StCas9 za SCN9A gen
[0908] Regioni gena SCN9A su skenirani u potrazi za ciljnim mestima. Svaka oblast je skenirana u potrazi za protospejser susednom motivu (PAM) koji ima sekvencu NNAGAAW. Zatim su identifikovane sekvence spejsera gRNK od 20 bp koje odgovaraju PAM, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 6251-8561 Liste sekvenci.
[0910] Primer 4 - Ciljna mesta CRISPR/TdCas9 za SCN9A gen
[0912] Regioni gena SCN9A su skenirani u potrazi za ciljnim mestima. Svaka oblast je skenirana u potrazi za protospejser susednom motivu (PAM) koji ima sekvencu NAAAAC. Zatim su identifikovane sekvence spejsera gRNK od 20 bp koje odgovaraju PAM, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 5305-6250 Liste sekvenci.
[0914] Primer 5 - Ciljna mesta CRISPR/NmCas9 za SCN9A gen
[0916] Regioni gena SCN9A su skenirani u potrazi za ciljnim mestima. Svaka oblast je skenirana u potrazi za protospejser susednom motivu (PAM) koji ima sekvencu NNNNGHTT. Zatim su identifikovane sekvence spejsera gRNK od 20 bp koje odgovaraju PAM, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13615-18988 Liste sekvenci.
[0918] Primer 6 - Ciljna mesta CRISPR/Cpf1 za SCN9A gen
[0920] Regioni gena SCN9A su skenirani u potrazi za ciljnim mestima. Svaka oblast je skenirana u potrazi za protospejser susednom motivu (PAM) koji ima sekvencu YTN. Zatim su identifikovane sekvence spejsera gRNK od 20 bp koje odgovaraju PAM, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 56864-125469 Liste sekvenci.
[0922] Primer 7 - Bioinformatička analiza vodiča
[0924] Kandidati za vodiče će zatim biti pregledani i odabrani u jednom procesu ili višestepenom procesu koji uključuje i teorijsko vezivanje i eksperimentalno procenjenu aktivnost i na ciljnim i vanciljnim mestima. Na primer, kandidati za vodiče koji imaju sekvence koje se podudaraju sa određenim ciljnim mestom, kao što je mesto unutar gena SCN9A, sa susednim PAM, mogu se proceniti na osnovu njihovog potencijala za cepanje na vanciljnim mestima koja imaju slične sekvence, koristeći jedan ili više različitih bioinformatičkih alata dostupnih za procenu vanciljnog vezivanja, kao što je detaljnije opisano i prikazano u daljem tekstu, kako bi se procenila verovatnoća efekata na hromozomskim pozicijama koje nisu one koje su predviđene.
[0926] Kandidati za koje se predviđa da imaju relativno niži potencijal za vanciljnu aktivnost mogu se zatim eksperimentalno proceniti kako bi se izmerila njihova aktivnost na cilju, a zatim i vanciljna aktivnost na različitim mestima. Poželjni vodiči imaju dovoljno visoku aktivnost na cilju da bi postigli željene nivoe genskog uređivanja na odabranom lokusu i relativno nižu vanciljnu aktivnost da bi smanjili verovatnoću promena na drugim hromozomskim lokusima. Odnos na ciljnoj i vanciljnoj aktivnosti se često naziva „specifičnošću“ vodiča.
[0928] Za početni skrining predviđenih aktivnosti van cilja, postoji niz poznatih i javno dostupnih bioinformatičkih alata koji se mogu koristiti za predviđanje najverovatnijih mesta van cilja; a pošto je vezivanje za ciljna mesta u CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 nukleaznom sistemu vođeno Votson-Krikovim uparivanjem baza između komplementarnih sekvenci, stepen različitosti (i samim tim smanjen potencijal za vezivanje van cilja) je u suštini povezan sa razlikama u primarnim sekvencama: neusklađenostima i ispupčenjima, tj. baze koje su promenjene u nekomplementarne baze i insercije ili delecije baza u potencijalnom vanciljnom mestu u odnosu na ciljno mesto.
[0929] Primer bioinformatičkog alata pod nazivom COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions) (dostupan na internetu na crispr.bme.gatech.edu) sastavlja takve sličnosti. Drugi bioinformatički alati uključuju, ali nisu ograničeni na, autoCOSMID i CCTop.
[0930] Bioinformatika je korišćena za minimiziranje vanciljnog cepanja kako bi se smanjili štetni efekti mutacija i hromozomskih preuređenja. Studije na CRISPR/Cas9 sistemima sugerisale su mogućnost vanciljne aktivnosti zbog nespecifične hibridizacije lanca vodiča sa DNK sekvencama sa neusklađenostima baznih parova i/ili ispupčenjima, posebno na pozicijama distalno od PAM regiona. Stoga je važno imati bioinformatički alat koji može da identifikuje potencijalna vanciljna mesta koja imaju insercije i/ili delecije između lanca vodiča RNK i genomskih sekvenci, pored neusklađenosti baznih parova. Bioinformatički alati zasnovani na vanciljnom algoritmu CCTop korišćeni su za pretragu genoma za potencijalna CRISPR vanciljna mesta (CCTop je dostupan na internetu na crispr.cos.uni-heidelberg.de/). Izlazne liste rangiranih vanciljnih mesta na osnovu broja i lokacije neusklađenosti, omogućavajući informisaniji izbor ciljnih mesta i izbegavajući upotrebu mesta sa verovatnijim vanciljnim cepanjem.
[0932] Koriste se dodatni bioinformatički kanali obrade koji procenjuju procenjenu aktivnost ciljnih mesta gRNK u regionu na i/ili van cilja. Druge karakteristike koje se mogu koristiti za predviđanje aktivnosti uključuju informacije o dotičnom tipu ćelije, dostupnosti DNK, stanju hromatina, mestima vezivanja transkripcionih faktora, podacima o vezivanju transkripcionih faktora i drugim CHIP-sekvencionim podacima. Procenjuju se dodatni faktori koji predviđaju efikasnost uređivanja, kao što su relativni položaji i pravci parova gRNK, karakteristike lokalnih sekvenci i mikro-homologije.
[0934] Početna evaluacija i skrining ciljnih mesta CRISPR/Cas9 fokusirani su na eksone 2-17 gena SCN9A i 100-300 bp sekvenci iz introna 2-16 koje okružuju ove eksone. Ove gRNK se, takođe, mogu koristiti za uređivanje jednog ili više nukleotida, eksonskih sekvenci i/ili intronskih sekvenci.
[0936] Početna bioinformatička analiza je identifikovala 602 gRNK koje ciljaju eksone 2-17, introne 2-16 i sekvence od 100-300 parnih parova koje okružuju intronske sekvence. Dalja analiza predviđenih mesta van cilja i procena ciljnog mesta gRNK unutar gena SCN9A rezultirala je sa 192 gRNK odabrane za skrining. Prioritetna lista od 192 pojedinačne gRNK koje ciljaju gen SCN9A testirana je na efikasnost smanjenja korišćenjem spCas9 (Tabela 7).
[0937] Tabela 7
[0938]
[0939]
[0940]
[0941]
[0942]
[0943]
[0946] Treba napomenuti da SEQ ID NO predstavljaju DNK sekvencu genomske mete, dok će gRNK ili sgRNK sekvenca spejsera biti RNK verzija DNK sekvence.
[0948] Primer 8 - Testiranje poželjnih vodiča u in vitro transkribovanom (IVT) gRNK skriningu
[0950] Da bi se identifikovao veliki spektar parova gRNK sposobnih da uređuju srodni ciljni region DNK, sproveden je in vitro transkribovani (IVT) skrining gRNK. Relevantna genomska sekvenca je poslata na analizu korišćenjem softvera za dizajn gRNK. Dobijena lista gRNK je sužena na odabranu listu gRNK kao što je gore opisano na osnovu jedinstvenosti sekvence (skrinirane su samo gRNK bez savršenog podudaranja negde drugde u genomu) i minimalnih predviđenih offtargeta. Ovaj skup gRNK je in vitro transkribovan i transfektovan korišćenjem Lipofectamine MessengerMAX u HEK293T ćelije koje konstitutivno eksprimuju Cas9. Ćelije su sakupljene 48 sati nakon transfekcije, genomska DNK je izolovana, a efikasnost sečenja je procenjena korišćenjem TIDE analize. (Slike 2A-G; Slike 3A-C).
[0952] gRNK ili parovi gRNK sa značajnom aktivnošću mogu se zatim pratiti u kultivisanim ćelijama kako bi se izmerila ekspresija proteina SCN9A. Događaji van cilja mogu se ponovo pratiti. Mogu se transfektovati različite ćelije i izmeriti nivo korekcije gena i mogući događaji van cilja. Ovi eksperimenti omogućavaju optimizaciju dizajna i isporuke nukleaze i donora.
[0954] Primer 9 - Testiranje poželjnih vodiča u ćelijama za aktivnost van cilja
[0956] gRNK koje imaju najbolju aktivnost na cilju iz IVT skrininga u gornjem primeru testirane su na aktivnost van cilja korišćenjem hibridnih testova hvatanja, GUIDE Seq. i sekvenciranja celog genoma pored drugih postupaka.
[0957] Primer 10 - In vivo testiranje na relevantnom životinjskom modelu
[0959] Nakon što se CRISPR-Cas9/vodič ponovo proceni, biće testirane vodeće formulacije in vivo u životinjskom modelu.
[0961] Kultura u humanim ćelijama omogućava direktno testiranje na ljudskoj meti i pozadinskom ljudskom genomu, kao što je gore opisano.
[0963] Prekliničke evaluacije efikasnosti i bezbednosti mogu se posmatrati kroz ugradnju modifikovanih mišjih ili humanih neurona perifernog nervnog sistema u mišjem modelu. Modifikovane ćelije mogu se posmatrati u mesecima nakon ugradnje.
[0965] XI. Ekvivalenti i obim
[0967] Patentni zahtevi ili opisi koji sadrže „ili“ između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljenim ako je jedan, više od jednog ili svi članovi grupe prisutni u, angažovani u ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces, osim ako nije naznačeno suprotno ili je drugačije očigledno iz konteksta. Predmetni pronalazak uključuje primere u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, angažovan u ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Predmetni pronalazak uključuje primere u kojima je više od jednog ili cela grupa prisutna u, angažovana u ili na drugi način relevantna za dati proizvod ili proces.
[0969] Pored toga, treba razumeti da bilo koji poseban primer predmetnog pronalaska koji spada u prethodno stanje tehnike može biti eksplicitno isključen iz bilo kog jednog ili više patentnih zahteva. Pošto se smatra da su takvi primeri poznati stručnjaku u tehnici, oni mogu biti isključeni čak i ako isključenje nije eksplicitno navedeno ovde. Bilo koji poseban primer sastava predmetnog pronalaska (npr. bilo koji antibiotik, terapeutski ili aktivni sastojak; bilo koji postupak proizvodnje; bilo koji postupak upotrebe; itd.) može biti isključen iz bilo kog jednog ili više zahteva, iz bilo kog razloga, bez obzira da li je povezan sa postojanjem prethodnog stanja tehnike ili ne.

Claims (15)

1. Patentni zahtevi
1. Jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes koja obuhvata najmanje spejser sekvencu, koja je RNK sekvenca koja odgovara SEQ ID NO: 47439.
2. Jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes prema zahtevu 1, pri čemu jednomolekulska vodeća RNK dalje obuhvata region produžetka spejsera, region produžetka tracrRNK ili njihovu kombinaciju.
3. Jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu je jednomolekulska vodeća RNK hemijski modifikovana.
4. Jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je jednomolekulska vodeća RNK u prethodno formiranom kompleksu sa S. pyogenes Cas9 endonukleazom.
5. Jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes prema zahtevu 4, pri čemu S. pyogenes Cas9 endonukleaza obuhvata jedan ili više signala jedarne lokalizacije (NLS) na ili unutar 50 amino-kiselina od amino-terminusa i/ili karboksi-terminusa S. pyogenes Cas9 endonukleaze.
6. DNK koja kodira jednomolekulsku vodeću RNK specifičnu za S. pyogenes prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
7. Jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes prema bilo kom od zahteva 1 do 5 ili DNK prema zahtevu 6 za upotrebu u lečenju poremećaja povezanog sa alfa podjedinicom 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A), koja obuhvata uređivanje SCN9A gena u ćeliji pacijenta.
8. In vitro ili ex vivo posutpak za uređivanje gena alfa podjedinice 9 natrijumskih kanala sa naponom (SCN9A) u ćeliji putem uređivanja genoma, koji obuhvata unošenje u ćeliju:
jedne ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaze ili jednog ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza; i
jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes (sgRNK) prema bilo kom od zahteva 1 do 3 ili DNK prema zahtevu 6;
da se izvede jedan ili više jednolančanih prekida (SSB) ili dvolančanih prekida (DSB) unutar ili blizu gena SCN9A ili regulatornih elemenata SCN9A što rezultira jednom ili više trajnih insercija, delecija ili mutacija najmanje jednog nukleotida unutar ili blizu gena SCN9A, čime se smanjuje ili eliminiše ekspresija ili funkcija proizvoda gena SCN9A.
9. Postupak prema zahtevu 8 ili jednomolekulska vodeća RNK specifična za S. pyogenes ili DNK za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu je ćelija neuron perifernog nervnog sistema.
10. Postupak prema zahtevu 8 ili 9, pri čemu jedan ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza predstavlja jednu ili više DNK ili RNK koje kodiraju jednu ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza.
11. Postupak prema zahtevu 10, pri čemu je jedna ili više RNK koje kodiraju jednu ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza hemijski modifikovana, opciono pri čemu je hemijska modifikacija u kodirajućem regionu.
12. Postupak prema bilo kom od zahteva 8 do 11, pri čemu je jedan ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza kodon-optimizovan.
13. Postupak prema bilo kom od zahteva 8 do 12, pri čemu je jedna ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza formulisana u lipozomu ili lipidnoj nanočestici, koja opciono dodatno sadrži sgRNK.
14. Postupak prema bilo kom od zahteva 8 do 12, pri čemu je jedna ili više S. pyogenes Cas9 endonukleaza kodirana u čestici AAV vektora, koja opciono dodatno kodira S. pyogenes specifičnu sgRNK.
15. Postupak prema bilo kom od zahteva 8 do 11, pri čemu je S. pyogenes specifična sgRNK kodirana u čestici AAV vektora.
RS20260565A 2016-07-06 2017-07-06 Materijali i postupci za lečenje poremećaja povezanih sa bolom RS68084B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662358763P 2016-07-06 2016-07-06
US201762461874P 2017-02-22 2017-02-22
PCT/IB2017/054086 WO2018007980A1 (en) 2016-07-06 2017-07-06 Materials and methods for treatment of pain related disorders
EP17754197.6A EP3481857B1 (en) 2016-07-06 2017-07-06 Materials and methods for treatment of pain related disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS68084B1 true RS68084B1 (sr) 2026-05-29

Family

ID=59649967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260565A RS68084B1 (sr) 2016-07-06 2017-07-06 Materijali i postupci za lečenje poremećaja povezanih sa bolom

Country Status (17)

Country Link
US (3) US11459587B2 (sr)
EP (1) EP3481857B1 (sr)
JP (4) JP7548696B2 (sr)
CN (2) CN118542952A (sr)
AU (1) AU2017292173B2 (sr)
CA (1) CA3029141A1 (sr)
DK (1) DK3481857T3 (sr)
ES (1) ES3072537T3 (sr)
FI (1) FI3481857T3 (sr)
HR (1) HRP20260614T1 (sr)
LT (1) LT3481857T (sr)
PL (1) PL3481857T4 (sr)
PT (1) PT3481857T (sr)
RS (1) RS68084B1 (sr)
SI (1) SI3481857T1 (sr)
SM (1) SMT202600214T1 (sr)
WO (1) WO2018007980A1 (sr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116059236A (zh) 2015-12-14 2023-05-05 冷泉港实验室 用于治疗常染色体显性精神发育迟滞5型和Dravet综合征的反义寡聚体
EP3481857B1 (en) 2016-07-06 2026-02-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of pain related disorders
EP4650364A3 (en) 2016-07-06 2026-01-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of pain related disorders
CA3034089A1 (en) * 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
KR20260009385A (ko) 2017-08-25 2026-01-19 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환 치료용 안티센스 올리고머
WO2019165067A1 (en) * 2018-02-21 2019-08-29 Bristol-Myers Squibb Company Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof
CN112513273A (zh) * 2018-06-22 2021-03-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节scn9a表达的寡核苷酸
US12281305B2 (en) 2018-11-21 2025-04-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing prion expression
KR20210134003A (ko) 2019-02-27 2021-11-08 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환의 치료를 위한 안티센스 올리고머
US20220202957A1 (en) * 2019-04-09 2022-06-30 The Regents Of The University Of California Long-lasting analgesia via targeted in vivo epigenetic repression
CA3136700A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene-editing systems for modifying a scn9a or scn10a gene and methods of use thereof
CN118813654A (zh) 2019-08-12 2024-10-22 生命编辑制药股份有限公司 Rna指导的核酸酶及其活性片段及变体以及使用方法
WO2021108602A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Disarm Therapeutics, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
WO2021123086A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Enhanced oligonucleotides for inhibiting scn9a expression
JP2023516226A (ja) 2020-04-24 2023-04-18 ライフエディット セラピューティクス，インコーポレイティド Ｒｎａ誘導型ヌクレアーゼとその活性な断片およびバリアント、ならびに利用の方法
US12338437B2 (en) 2020-05-11 2025-06-24 Stoke Therapeutics, Inc. OPA1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
WO2021247995A2 (en) * 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
CN116368227A (zh) * 2020-07-22 2023-06-30 弗洛里神经科学与心理健康研究所 用于治疗与scn2a中功能失去突变相关的障碍的组合物和方法
JP2023542889A (ja) 2020-09-17 2023-10-12 キュー－ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 複数の標的を介して疼痛を処置するための治療用組成物
WO2022147541A1 (en) * 2021-01-04 2022-07-07 Exicure Operating Company Compounds for modulating scn9a expression
WO2022232395A2 (en) * 2021-04-28 2022-11-03 Q-State Biosciences, Inc. Therapeutic compositions for treating pain via multiple targets
US20240254483A1 (en) * 2021-07-30 2024-08-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
US20240366680A1 (en) * 2021-08-16 2024-11-07 Editas Medicine, Inc. Treatment of pain
GB202114871D0 (en) * 2021-10-18 2021-12-01 Ucl Business Ltd Guide RNA and uses thereof
WO2023122762A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Camp4 Therapeutics Corporation Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
CN115844918B (zh) * 2022-09-27 2024-11-22 首都医科大学附属北京天坛医院 一种miR-3131抑制剂在制备药物中的应用
WO2025106999A1 (en) * 2023-11-16 2025-05-22 The Johns Hopkins University Deprivation of human pluripotent stem cell-derived trpv1+, mrgprx1+ and scn9a+ sensory neurons and their functional characterization
WO2025128967A1 (en) * 2023-12-15 2025-06-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Compositions and methods for restoring susceptibility to pyrethroid insecticides in resistant populations

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
JPH06502300A (ja) 1990-08-03 1994-03-17 サノフィ 遺伝子発現の抑制のための化合物及び方法
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
DE69132510T2 (de) 1990-11-08 2001-05-03 Hybridon, Inc. Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
JP2823959B2 (ja) 1991-10-24 1998-11-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
DE69433922T2 (de) 1993-11-09 2005-07-28 Medical College Of Ohio, Toledo Stabile zellinie, die in der lage ist, das replikationsgen des adenoassoziertenvirus zu exprimieren
EP0733103B1 (en) 1993-11-09 2004-03-03 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
JPH11511326A (ja) 1995-08-30 1999-10-05 ジエンザイム コーポレイション アデノウィルスおよびａａｖの精製
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
CA2995542A1 (en) 1997-09-05 1999-03-11 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
JP2004514407A (ja) 2000-04-28 2004-05-20 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 異種キャプシド中にシュードタイピングされたａａｖ５キャプシドおよびａａｖ５ベクターを含む組換えａａｖベクター
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
EP2428570B1 (en) 2001-09-28 2018-05-23 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
WO2005017101A2 (en) 2003-05-19 2005-02-24 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
WO2005056807A2 (en) 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
EP2484782B1 (en) 2006-01-05 2015-11-18 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
WO2007081680A2 (en) 2006-01-05 2007-07-19 The Ohio State University Research Foundation Microrna expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors
EP2522748A1 (en) 2006-03-02 2012-11-14 The Ohio State University MicroRNA expression profile associated with pancreatic cancer
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
CA2664383C (en) 2006-09-19 2017-08-22 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
WO2008054828A2 (en) 2006-11-01 2008-05-08 The Ohio State University Research Foundation Microrna expression signature for predicting survival and metastases in hepatocellular carcinoma
CN101622348A (zh) 2006-12-08 2010-01-06 奥斯瑞根公司 作为治疗性干预靶标的miR-20调节的基因和途径
US8415096B2 (en) 2007-05-23 2013-04-09 University Of South Florida Micro-RNAs modulating immunity and inflammation
WO2008154098A2 (en) 2007-06-07 2008-12-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Reagents and methods for mirna expression analysis and identification of cancer biomarkers
EP2225396A4 (en) 2007-11-30 2011-03-02 Univ Ohio State Res Found PROFILING AND SCREENING OF MICRO-RNA EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD IN LUNG CANCER
WO2009100430A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Asuragen, Inc miRNAs DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN LYMPH NODES FROM CANCER PATIENTS
JP2011517932A (ja) 2008-02-28 2011-06-23 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション ヒト慢性リンパ球性白血病（ｃｃｌ）と関連するマイクロｒｎａシグネチャーおよびその使用
JP2009215191A (ja) 2008-03-07 2009-09-24 Keio Gijuku 神経損傷治療剤及び神経損傷治療方法
EP2112235A1 (en) 2008-04-24 2009-10-28 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Compositions and methods for microRNA expression profiling of nasopharyngeal carcinoma
WO2010018563A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Rosetta Genomics Ltd. Compositions and methods for the prognosis of lymphoma
US9074206B2 (en) 2008-11-13 2015-07-07 Fudan University Compositions and methods for micro-RNA expression profiling of colorectal cancer
US20110023148A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of addiction-related genes in animals
US20110016541A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of sensory-related genes in animals
US20120053224A1 (en) 2008-12-10 2012-03-01 Universitat Regensburg Compositions and methods for micro-rna expression profiling of cancer stem cells
US20120264626A1 (en) 2009-05-08 2012-10-18 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA Expression Profiling and Targeting in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) Lung Tissue and Methods of Use Thereof
JP5700301B2 (ja) 2009-06-03 2015-04-15 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法
CN102858985A (zh) 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
KR20120097483A (ko) 2009-07-24 2012-09-04 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 게놈 편집을 위한 방법
WO2011076143A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Compositions and methods for microrna expression profiling of lung cancer
WO2011076142A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Compositions and methods for microrna expession profiling in plasma of colorectal cancer
EP2341145A1 (en) 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
WO2011094683A2 (en) 2010-01-29 2011-08-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Method of identifying myelodysplastic syndromes
EP2354246A1 (en) 2010-02-05 2011-08-10 febit holding GmbH miRNA in the diagnosis of ovarian cancer
US20130059015A1 (en) 2010-03-11 2013-03-07 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute Human Cancer micro-RNA Expression Profiles Predictive of Chemo-Response
WO2011157294A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Universita' Degli Studi Di Padova Compositions for use in treating or preventing cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, metastasis, heart failure, cardiac remodelling, dilated cardiomyopathy, autoimmune diseases, or diseases or disorders related thereto
WO2012151212A1 (en) 2011-05-01 2012-11-08 University Of Rochester Multifocal hepatocellular carcinoma microrna expression patterns and uses thereof
US20130042333A1 (en) 2011-05-06 2013-02-14 Jean-Gabriel JUDDE Markers for cancer prognosis and therapy and methods of use
JP5965481B2 (ja) 2011-07-15 2016-08-03 レオ ファーマ アクティーゼルスカブ 皮膚ｔ細胞リンパ腫（ｃｔｃｌ）の診断用マイクロｒｎａプロファイリング
WO2013033640A1 (en) 2011-09-01 2013-03-07 Allegro Diagnostics Corp. Methods and compositions for detecting cancer based on mirna expression profiles
US20140243240A1 (en) 2011-10-26 2014-08-28 Georgetown University microRNA EXPRESSION PROFILING OF THYROID CANCER
BR112014009102A2 (pt) 2011-10-26 2017-04-18 Pfizer Ltd compostos químicos
ES2728782T3 (es) 2012-05-25 2019-10-28 Univ California Métodos y composiciones para la modificación de ADN objetivo dirigida por ARN y para la modulación de la transcripción dirigida por ARN
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
AU2014240392A1 (en) 2013-03-14 2015-11-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to Nav1.7
ES2926774T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y composiciones para vectores AAV de doble unión de glicano
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
BR112016007062A2 (pt) 2013-10-03 2017-09-12 Janssen Biotech Inc variantes de protoxina-ii e métodos de uso
CN111218447B (zh) 2013-11-07 2024-10-11 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
AU2015290554A1 (en) 2014-07-18 2017-03-09 Kyoto University Method for inducing T cells for cell-based immunotherapy from pluripotent stem cells
CA2963940A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 The Regents Of The University Of California Targeted disruption of a csf1-dap12 pathway member gene for the treatment of neuropathic pain
EP3302575A4 (en) 2015-05-28 2019-01-16 Coda Biotherapeutics GEMONEDITIERUNGSVEKTOREN
CA2994969A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted protein degradation to attenuate adoptive t-cell therapy associated adverse inflammatory responses
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11221329B2 (en) 2015-10-30 2022-01-11 Lieber Institute, Inc. Treatment of neurological and neurodevelopmental diseases and disorders associated with aberrant ion channel expression and activity
EP3374494A4 (en) * 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. CRISPR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR GENE THERAPY
WO2017110008A1 (en) * 2015-12-25 2017-06-29 Compagnie Generale Des Etablissements Michelin A tire with radial or bias carcass
EP4650364A3 (en) 2016-07-06 2026-01-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of pain related disorders
EP3481857B1 (en) 2016-07-06 2026-02-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of pain related disorders
EP3490542A4 (en) 2016-07-26 2020-07-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. NEUROMODULATION COMPOSITIONS AND RELATED THERAPEUTIC METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER BY MODULATION OF AN ANTI-CANCER RESPONSE
CA3034089A1 (en) * 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
WO2018049075A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Flagship Pioneering, Inc. Methods and compositions for modulating gene expression
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US20200384226A1 (en) 2017-03-10 2020-12-10 Vanderbilt University Nasopharyngeal catheters and applications of same

Also Published As

Publication number Publication date
DK3481857T3 (da) 2026-05-18
AU2017292173A9 (en) 2022-01-13
EP3481857B1 (en) 2026-02-11
JP2025146901A (ja) 2025-10-03
US20190153477A1 (en) 2019-05-23
JP2022132353A (ja) 2022-09-08
EP3481857A1 (en) 2019-05-15
AU2017292173B2 (en) 2022-01-13
AU2017292173A1 (en) 2019-01-31
US11459587B2 (en) 2022-10-04
WO2018007980A1 (en) 2018-01-11
JP7429264B2 (ja) 2024-02-07
US12442020B2 (en) 2025-10-14
PL3481857T3 (pl) 2026-07-27
JP7719222B2 (ja) 2025-08-05
US20260078414A1 (en) 2026-03-19
PT3481857T (pt) 2026-05-14
CA3029141A1 (en) 2018-01-11
US20230279439A1 (en) 2023-09-07
FI3481857T3 (fi) 2026-05-08
JP2024028643A (ja) 2024-03-04
SI3481857T1 (sl) 2026-07-31
HRP20260614T1 (hr) 2026-06-05
CN118542952A (zh) 2024-08-27
JP2019520079A (ja) 2019-07-18
SMT202600214T1 (it) 2026-07-16
ES3072537T3 (en) 2026-07-02
JP7548696B2 (ja) 2024-09-10
CN109843914A (zh) 2019-06-04
LT3481857T (lt) 2026-06-10
CN109843914B (zh) 2024-03-15
PL3481857T4 (pl) 2026-07-27