JP5965481B2 - 皮膚t細胞リンパ腫(ctcl)の診断用マイクロrnaプロファイリング - Google Patents
皮膚t細胞リンパ腫(ctcl)の診断用マイクロrnaプロファイリング Download PDFInfo
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Description
本発明の詳細な実施形態に関する説明の前に、本発明の主な態様および実施形態に関する具体的な用語の定義が与えられる。
本研究において、悪性(CTCL)と、乾癬、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎等の良性の炎症性皮膚疾患とを区別する潜在的能力を有するmiRNAの初期スクリーニング用のマイクロアレイを発明者らは用いた。90人の患者の最初の訓練セット、58人の患者の試験セット、および50人の患者の独立コホートを含む合計198人の患者において、良性症状と悪性症状とを高い精度(>90%)で見分けた、5つのmiRNA(miR−203、miR−205、miR−326、miR−663bおよびmiR−711)が識別された。実施例1、図1。重要なことに、103人の患者由来のRNAサンプルに対するqRT−PCRを用いて、5つのmiRNA中4つ(miR−203、miR−205、miR−326およびmiR−663b)の発現パターンが確かめられた。従って、本発明の一実施形態は、炎症性皮膚疾患の個体由来の試験皮膚細胞サンプルを皮膚リンパ腫に分類する方法であって、試験皮膚細胞サンプルにおける、例えばmiR−326、miR−203、miR−205およびmiR−663bを含むmiRの選択マイクロRNA(miR)の発現レベルを検出することと、前記マイクロRNAの発現レベルを含むデータセットに基づいて、試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算することと、臨床スコアの値に基づいて、試験細胞サンプルを皮膚リンパ腫か否かに分類することとを含む方法である。
(線形)miRxの発現レベル〜2−Cp(miRx)
式中、Cp(miRx)は、miRxと呼ばれるある具体的なmiRを特異的に検出した、リアルタイムQ−PCR装置からのCp読出しを示す。実施例5は、このようなアッセイを詳細に記載する。
S=X*C(miR−155)+Y*C(miR−205)+Z*C(miR−203)
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)であり、X、YおよびZは、線形回帰によって決定される係数であるが、分類エラーを最小にするために、X+Y+Z=0であるという制約がある。
[マイクロアレイデータ前処理]
共変量としてバックグラウンド強度を用い、正規分布および指数分布のコンボリューションをフォアグラウンド強度へ適合させることによって、プローブシグナルがバックグラウンド補正された(非特許文献17)。各プローブについて4つの技術的反復スポットが組み合わされて、信頼できるスポットの対数ベースの2平均をとることによって、1つのシグナルを生成した。与えられたプローブについて4つ全ての反復が信頼できないと判断されれば、そのプローブはさらなる分析から除外された。リファレンスデータベクトルRが、全サンプル中の各プローブのメディアンシグナルとして計算された。サンプルデータベクトルSによって表される、与えられたサンプルにおける全プローブシグナルについて、局所的に重み付けされた多項回帰によって曲線Fが決定されて、SとRとの最適合致を与えた(非特許文献18)。これから、関数Fで変換することによって、正規化されたサンプルベクトルMが計算された。M=F(S)であった。このようにして、全サンプルは、リファレンスRに対して正規化された。この正規化手順はほとんど、非特許文献19において概説されているものに従っている。離れたデータポイント(シグナル単位あたり15プローブ未満の、まばらにサンプリングされた強度領域におけるプローブ)は、この方法によって信頼なく調整されたとみなされ、さらなる分析の前に除外された。
発現レベルの有意差が、非対比両側t検定によって評価された。最近接収縮重心分類を用いてクラス予測がなされた(非特許文献20)。手短に言うと、各クラスにおける各マイクロRNAの平均発現が、そのマイクロRNAについてのクラス内標準偏差で割られたものとして、標準化重心が各クラスについて算出される。続いて、これらのクラス重心のそれぞれに対して、新たなサンプルのマイクロRNA発現プロフィールが比較され、重心がユークリッド距離で最も近いクラスが、その新たなサンプルについて予測されるクラスである。訓練セットに関して、10倍の交差検証を通して決定される誤分類エラーを最小にする閾量により、全クラスについて、クラス重心を全体の重心の方へ収縮させることによって、アルゴリズムは訓練される。
マイクロアレイを用いたmiRNAの発現プロファイリング
マイクロアレイ分析が用いられて、148人分の、ホルマリン固定され、かつパラフィン包埋された生検のmiRNAプロファイリングを実行した。これらのサンプルのうち、63人分は種々の形態のCTCLの患者由来であり、85人分は良性の炎症性皮膚疾患の患者または健康な個体(BDN)由来であった(表1)。
CTCL−特異的miRNAシグナチュアの識別
CTCL特異的シグナチュアを見出すために、発明者らは最近接収縮重心アルゴリズムにより訓練セットを分析した(非特許文献20)。アレイ分析において識別された27の高度に有意なmiRNAのうち、最も誘導された上位3つ(miR−326、miR−663b、miR−711)および最も抑制された2つ(miR−203、miR−205)のmiRNAが、重心の収縮後の分類に最適なmiRNAのセットであることがわかった。
qRT−PCRベースのmiRNAクラシファイヤーの識別
診断の目的で、qRT−PCRが、マイクロアレイよりも感度が高く、特異的であり、かつ適用可能である。上述のマイクロアレイ結果を確かめるために、実施例1に記載の148サンプルのうちの103サンプルのサブセットに対する5−miRNAシグナチュアのためのqRT−PCRにより、発現レベルが測定された。サンプルのサブセットは、NanoDropによって測定した高RNA含有量に基づいて選択され、訓練セットサンプルおよび試験セットサンプルの双方をカバーした。
UniRT法
この実施例では、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)技術の使用による非コーディング小RNA分子の増幅および定量化のためのUniRT法が、手短に記載される。
UniRT法によるマイクロRNAの識別
UniRT qPCR法(実施例4参照)を用いて、let−7b、miR−103、miR−155、miR−184、miR−191、miR−203、miR−205、miR−24、miR−299−5p、miR−326、miR−34b、miR−423−5p、miR−663b、miR−711、およびmiR−718のレベルが定量化された。以下、手短に言う。
反応バッファ(1×反応バッファは;167mMのNaCl、25mMのKCl、50mMのTris−HCl、8mMのMgCl2、3.33mMのDTT、0.1mMのATP、0.1mMのdATP、0.1mMのdCTP、0.1mMのdGTP、および0.1mMのdTTPを含む)
0.5μMのRT−プライマー(L2TA3:5’−ggtactagtttttttttttttttvnn(配列番号1))(vはシトシン、グアニン、およびアデニン残基を示し、nはシトシン、グアニン、アデニン、およびチミン残基を示す)
100ユニットのマローニーマウス白血病ウィルス(M−MuLV)逆転写酵素(New England Biolabs,Ipswich MA)
1ユニットの大腸菌(E.coli)ポリ(A)ポリメラーゼ(New England Biolabs,Ipswich MA)
RT反応液は、42℃で1時間、95℃で5分間インキュベートされた。
続いて、RT反応液は、qPCR分析−ステップ2の前に、水中に50×希釈された。
ABI TaqMan qRT−PCRアッセイ
皮膚生検サンプルが、皮膚T細胞リンパ腫の患者、乾癬およびアトピー性皮膚炎を含む良性の皮膚疾患の患者、ならびに健康な対象から得られた。FFPEブロックが、RNアーゼフリーの環境において区分された。8つの10μmの組織切片がそれぞれ、2本の1.5mLマイクロ遠心チューブ内に入れられ(合計で16切片)、Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit(Applied Biosystems/Ambion,USA)を用いて、メーカのガイドラインに従って、全RNAが抽出された。各サンプルから、TaqMan Micro RNA Reverse Transcription Kitを適当なプライマーと共に用いて(Applied Biosystems,USA)、メーカのガイドラインに従って、15ngの全RNAがcDNAに逆転写された。反応あたり5ngのcDNAの3部がそれぞれ、TaqMan Universal PCR Master Mix、ならびに関連するプライマーおよびプローブ(Applied Biosystems,USA)と混合され、標準設定のApplied Biosystems ABI Prism 7900HT 384−ウェル装置で走らされた。サイクル閾値(Ct,プローブシグナルが蛍光バックグラウンドを超える閾値に達するPCRサイクル)が、各ウェルについて判定された。
Claims (19)
- 炎症性皮膚疾患の個体由来の試験皮膚細胞サンプルを皮膚リンパ腫に分類する方法であって:
miR−155およびmiR−326の少なくとも1つ、ならびにmiR−203およびmiR−205の少なくとも1つのマイクロRNAの発現レベルをQ−PCR技術によって検出することと、
前記マイクロRNAの発現レベルを含むデータセットに基づいて、前記試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算することと、
前記試験細胞サンプルを、前記臨床スコアの値に基づいて、皮膚リンパ腫か否かに分類することと
を含む方法。 - 前記試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算するために、マイクロRNAであるmiR−155、ならびにmiR−203およびmiR−205の少なくとも1つの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算するために、マイクロRNAであるmiR−326、ならびにmiR−203およびmiR−205の少なくとも1つの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算するために、マイクロRNAであるmiR−155、miR−326、ならびにmiR−203およびmiR−205の少なくとも1つの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算するために、マイクロRNAであるmiR−155、miR−326、miR−203およびmiR−205の前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記試験細胞サンプルの臨床スコア(S)を計算するために、マイクロRNAであるmiR−155、miR−326、miR−203、miR−205およびmiR−663−bの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記皮膚リンパ腫が皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)である、請求項1〜請求項6のいずれかに記載の方法。
- 前記臨床スコアが、miR−155の発現レベルと、miR−203および/またはmiR−205の平均発現レベルとの比として計算される、請求項1〜請求項7のいずれかに記載の方法。
- 前記臨床スコアが、miR−326の発現レベルと、miR−203および/またはmiR−205の平均発現レベルとの比として計算される、請求項1〜請求項8のいずれかに記載の方法。
- 前記臨床スコアが、miR−203および/またはmiR−205の平均発現レベルに対する、miR−155およびmiR−326の発現レベルの比として計算される、請求項1〜請求項9のいずれかに記載の方法。
- 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=X*C(miR−155)+Y*C(miR−205)+Z*C(miR−203)
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)であり、X、YおよびZは、線形回帰によって決定される係数であるが、X+Y+Z=0であるという制約がある、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=X*C(miR−326)+Y*C(miR−205)+Z*C(miR−203)
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)であり、X、YおよびZは、線形回帰によって決定される係数であるが、X+Y+Z=0であるという制約がある、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=C(miR−155)−C(miR−205)/2−C(miR−203)/2
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=C(miR−326)−C(miR−205)/2−C(miR−203)/2
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=C(miR−155)+C(miR−326)−C(miR−205)−C(miR−203)
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=C(miR−155)/3+C(miR−326)/3+C(miR−663b)/3−C(miR−205)/2−C(miR−203)/2
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 式中、「C」は、クロッシングポイント値(Cp)であり、前記臨床スコア「S」が、約6.5よりも低い、特に6.0よりも低い場合、前記試験皮膚細胞サンプルが皮膚T細胞リンパ腫であることを試験は示し、前記臨床スコア「S」が、約6.5よりも高い、特に約7.0よりも高い場合、前記試験皮膚細胞サンプルが良性であることを試験は示す、請求項13に記載の方法。
- 前記臨床スコアが、以下のように計算され:
S=X*C(miR−155)+Y*C(miR−326)+Z*C(miR−663b)+W*C(miR−203)+Q*C(miR−205)
式中、「C」は、閾サイクル値(Ct)またはクロッシングポイント値(Cp)であり、X、Y、Z、WおよびQは、線形回帰によって決定される係数であるが、X+Y+Z+W+Q=0であるという制約がある、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記Q−PCRの方法がUniRTである、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
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