RS56075B1 - Varijante receptora fc gama iib - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein od SEQ ID NO: 1; vektor koji sadrži navedenu sekvencu nukleinske kiseline i ćeliju domaćina koja sadrži navedenu sekvencu nukleinske kiseline ili navedeni vektor. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom navedene sekvence nukleinske kiseline ili navedenog vektora u ćeliji domaćinu. Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na protein kodiran sekvencom nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 6. Pored toga predmetni pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije i postupak za proizvodnju istih. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju materije koja sadrži protein prema SEQ ID NO: 2 i/ili 3, pri čemu ta kompozicija može dalje da sadrži protein prema SEQ ID NO: 4 i/ili 5.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] FcyRs pripada familiji Fc receptora (FcRs) koji su krucijalni za odbranu ljudskog organizma od infekcija. Uopšteno, treba razlikovati aktivaciju FcyRs i inhibiciju FcyRs. Od tri glavna FcyRs kod ljudi, FcγRI može da vezuje monomerni IgG, dok se FcγRII i FcγRIII vezuju za multivalentne imune komplekse (ICs) sastavljene od antitela i antigena (Takai, T. Nature Reviews Immunology 2002: 580-592.). Efektorne funkcije koje se pokreću pomoću FcyRs obuhvataju, u zavisnosti od tipa eksprimiranog FcR i povezanih proteina, endocitozu sa kasnijom neutralizacijom patogena i prikazivanjem antigena, ćelijsku toksičnost zavisnu od antitela (ADCC), izlučivanje medijatora ili regulaciju proizvodnje antitela (Fridman et al. Immunol Rev. 1992125:49-76, van de Winkel and Capel Immunol Today. 1993: 14(5):215-21).

[0003] WO 00/32767 opisuje rastvorljive Fc receptore (FcRs) koji su sastavljeni samo od ekstracelularnog dela receptora i nisu glikozilovani. Zahvaljujući odsustvu transmembranskog domena i signalnog peptida, ovi proteini su prisutni u rastvorljivom obliku i nisu vezani za ćelije. Pored toga, FcRs opisani u WO 00/32767 mogu biti proizvedeni rekombinantno i predloženi su za lečenje autoimunih bolesti zahvaljujući njihovoj sposobnosti da vežu Fc deo antitela bez ometanja drugih komponenti imunog sistema. WO 00/32767 dodatno opisuje kristalnu strukturu određenih FcRs i mogućnost nalaženja supstanci koje inhibiraju interakciju IgG sa FcRs uz pomoć ovih kristalnih struktura. Objašnjenje kristalne strukture omogućava nalaženje takvih inhibitora skriningom baza podataka upotrebom dostupnih kompujuterskih programa. Pronalazak koji kao što je opisan u WO 03/043648 je dalje razvio nalaze iz WO 00/32767 i obezbeđuje postupke lečenja naročito za bolesti kao što su multipla skleroza (MS), sistemski lupus eritematozus (SLE) i reumatoidni artritis (RA) i takođe za bolesti sa povišenim nivoom ćelija prirodnih ubica.

Kada su navedeni receptori proizvedeni rekombinantno u prokariotama i prema tome su bili neglikozilovani, pronalazači WO 03/043648 su iznenađujuće našli da iako se očekuje da su neglikozilovani proteini slabo rastvorljivi, receptori su mogli biti prečišćeni sa visokim koncentracijama FcyR u rastvorljivom obliku. WO 03/043648 i druge publikacije dokumentuju da FcRs imaju važnu ulogu u odbrambenim reakcijama imunog sistema.

[0004] EP1870422 otkriva (SEQ ID NO:1) humani FcγRIIb N-terminalni, ekstracelularni domen, koji se sastoji od 181 ostatka i koji je identičan u 176 aminokiselina sa predmetnim SEQ ID NO:1.

[0005] Fc receptori imaju centralnu ulogu u imunom sistemu gde kontrolišu stepen i jačinu imunog odgovora. Ispostavilo se da je naročito rastvorljivi (tj. ekstracelularni deo Fc gama receptora IIB) Fc gama receptor IIB (sFcγRIIB), koji je u kompeticiji sa FcyRs eksprimiran na imunim ćelijama za patogene imune komplekse koristan u lečenju autoimunih bolesti. Ometanje imunih reakcija u ranom stadijumu koje se odigrava kod autoimunih bolesti sprečava pokretanje kaskade koja rezultira u inflamaciji i destrukciji tkiva. Specifično, u međuvremenu sFcγRIIB je u fazi II kliničkih ispitivanja za indikaciju primarne imune trombocitopenije (ITP) i sistemskog lupus eritematozusa (SLE). Kao što je uobičajeno poznato, za klinička ispitivanja je potreban biološki materijal, ovde sFcγRIIB, koji ima poželjno dobre hemijske osobine, osobine proizvodnje i kontrole (CMC), kao što su visoka čistoća i stabilnost u toku prečišavanja. Na taj način, cilj predmetnog pronalaska je bio obezbediti humane FcγRIIB proteine sa dobrim CMC osobinama. Ovaj cilj je rešen primerima izvođenja koji su reflektovani u patentnim zahtevima, opisanim ovde, ilustrovanim u Primerima i Slikama. Iznenađujuće je pokazano za proteine kao što su oni opisani ovde, da se veće prečišćavanje može postići zahvaljujući boljoj rastvorljivosti na koncentracijama amonijum sulfata koje prelaze 1.5M. Taloženje amonijum sulfata je korisno za uklanjanje velikih količina kontaminanata proteina, kao prvi korak u mnogim šemama publikacije. Što je veća koncentracija amonijum sulfata, to je bolje kada je cilj visoko čist protein, ali veći stres za protein, zbog visoke jonske jačine amonijum sulfata. Na taj način, što je protein otporniji na stres, to može biti viša koncentracija amonijum sulfata i na taj način biće veća čistoća proteina. Specifično, dodavanjem kosmotropnog amonijum sulfata talože se sporedni proizvodi kao što su nesavijene i pogrešno savijene vrste, ali takođe nečistoće poreklom od ćelije domaćina kao što su komponente ćelijskog zida i proteina. Sa rastućom koncentracijom taloga efikasnost taloženja će biti povećana i stoga je dobijen visoko prečišćeni protein sve dok je protein od interesa otporan na taloženje na takvim visokim koncentracijama amonijum sulfata. Kao što je rečeno, iznenađujuće se ispostavilo da je FcR protein kao što je ovde opisan visoko rastvorljiv na koncentracijama amonijum sulfata jednakim ili većim od 1.5 M. Ovo se nije moglo očekivati, s obzirom na to da su se FcR proteini iz stanja tehnike ponašali drugačije kao što je prikazano u Primerima i nije bilo dostupnog vodiča za to kako modifikovati FcR protein tako da se ponaša i ima osobine kao FcR protein obezbeđen predmetnim pronalaskom. Kao što je rečeno, na veliko iznenađenje pronalazača predmetnog pronalaska, ispostavilo se da su proteini koji su ovde opisani zaista otporni na visoke koncentracije amonijum sulfata, na taj način omogućavajući dobro prečišćavanje u poređenju sa FcγRIIB proteinima iz stanja tehnike, kao što su FcγRIIB proteini opisani u WO 00/32767 ili WO 03/043648.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID No: 1. Predmetni pronalazak takođe daje sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine prikazane u SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ili 9. Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEQ ID NO: 6 kodira protein prema SEQ ID NO: 1.

[0007] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ili 9.

[0008] Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili vektora prema predmetnom pronalasku u ćeliji domaćinu, poželjno prokariotskoj ćeliji domaćinu, poželjnije u E. coli.

[0009] Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na protein koji je kodiran sekvencom nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 6.

[0010] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili vektor prema predmetnom pronalasku u ćeliji domaćinu ili protein koji je kodiran sekvencom nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 6.

[0011] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju materije koja sadrži protein prema SEQ ID No: 2 i/ili 3. Poželjno, kompozicija materije je farmaceutska kompozicija.

[0012] U jednom primeru izvođenja, kompozicija materije prema predmetnom pronalasku dalje sadrži protein prema SEQ ID No. 4 i/ili 5. Poželjno, kompozicija materije je farmaceutska kompozicija.

[0013] U sledećem primeru izvođenja, kompozicija materije prema predmetnom pronalasku ima količinu proteina prema SEQ ID No: 2 koja je veća od one proteina prema SEQ ID No: 3.

[0014] U sledećem primeru izvođenja, kompozicija materije prema predmetnom pronalasku ima količinu proteina prema SEQ ID No: 2 koja je veća od one od proteina prema SEQ ID No: 3 i količinu proteina prema SEQ ID No: 2 i 3 koja je veća od one od proteina prema SEQ ID No: 4 i/ili 5.

[0015] Takođe, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju materije koja sadrži protein prema SEQ ID No: 9. Poželjno, kompozicija materije je farmaceutska kompozicija.

[0016] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili ćeliju domaćina koja sadrži vektor prema predmetnom pronalasku koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ili 9 ili ćelija domaćin sadrži vektor prema predmetnom pronalasku koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ili 9.

[0017] U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin prema predmetnom pronalasku je prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin.

[0018] U sledećem primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, prokariotska ćelija domaćin je E. coli, poželjno E. coli BL21, kao što je BL21 (DE3)

[0019] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koja sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju kodiranog proteina, i izolaciju dobijene farmaceutske kompozicije.

SLIKE

[0020]

Slika 1: a) Kristalna struktura humanog sFcγRIIB (identifikator baze u PDB: 2FCB). Nepromenljiva struktura jezgra kao što je predstavljena aminokiselinskom sekvencom varijante 1 (SEQ ID No: 7) koja je identična za sve sFcR varijante testirane u ovoj studiji je prikazana u tamno sivoj, petlje za koje se pretpostavlja da su značajne za vezivanje IgG su prikazane u svetlo sivoj i N- i C-terminalni produžeci su prikazani u crnoj. Dva disulfidna mosta su prikazana u prikazu sa lopticama i štapićima. Identičnost strukture jezgra između svih testiranih varijanti je takođe očigledna iz poravnanja sekvenci prikazanog na Slici 1b.

b) Poravnanje sekvenci sFcR varijanti 1-4 (skraćeno "var.") korišćeno u ovoj studiji. SEQ ID NO: je skraćeno SEQ.

Slika 2: Rezultati analize taloženja FcR. FcR varijante 1-4 su inkubirane u trajanju od 1 časa na 25°C i naznačenoj pH i koncentraciji amonijum sulfata. Posle centrifugiranja sadržaj FcR u supernatantu je određen pomoću merenja OD280i prikazan na grafikonu prema koncentraciji amonijum sulfata.

SEKVENCE

[0021] Sledeće sekvence obezbeđuju prikaz sekvenci koje su ovde korišćene:

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0022] Mora biti navedeno da kao što su ovde korišćeni, oblici u jednini "a", "an", i "the", obuhvataju množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na taj način, na primer, pozivanje na " reagens" obuhvata jedan ili više takvih različitih reagenasa i pozivanje na "postupak" obuhvata pozivanje na ekvivalentne korake i postupke poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike koji bi mogli biti modifikovani ili zamenjeni sa ovde opisanim postupcima.

[0023] Sve publikacije i patenti citirani u ovom opisu su obuhvaćeni referencom u njihovoj celini. U meri u kojoj je materijal obuhvaćen referencom u suprotnosti sa ili nije u skladu sa ovom specifikacijom, tada će specifikacija imati prednost u odnosu na bilo koji takav materijal.

[0024] Osim ukoliko nije naznačeno drugačije, termin "najmanje" koji prethodi seriji elemanata treba razumeti tako da označava svaki element u seriji. Stručnjacima iz date oblasti tehnike će biti jasno, ili će moći da ustanove upotrebom ne više od rutinskog eksperimentisanja, mnoge ekvivalente specifičnih primera izvođenja prema pronalasku koji su ovde opisani. Takvi ekvivalenti su određeni tako da budu obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

[0025] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrži", i varijacije kao što su "koji sadrži" i "sadržati", biće shvaćeni tako da ukazuju na uključenost naznačenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne isključenost bilo kog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada je ovde korišćen termin "sadrži" može biti zamenjen terminom "koji sadrži" ili nekada kada je korišćen ovde sa terminom "ima".

[0026] Kada je ovde korišćen "sastoji se od" isključuje bilo koji element, korak ili ceo broj koji nije naznačen u elementu patentnog zahteva. Kada je ovde korišćen, "uglavnom se sastoji od" ne isključuje materijale ili korake koji materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike patentnog zahteva.

[0027] U svakom slučaju ovde bilo koji od termina "sadrži", "uglavnom se sastoji od" i "sastoji se od" može biti zamenjen bilo kojim od druga dva termina.

[0028] Nekoliko dokumenata je citirano u tekstu ove specifikacije. Svaki od dokumenata koji su ovde citirani (uključujući sve patente, patentne prijave, naučne publikacije, specifikacije proizvođača, uputstva, itd.), bilo navedene u prethodnom ili daljem tekstu, su ovde obuhvaćeni referencom u njihovoj celini. Ovde ništa ne bi trebalo tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da prethodi takvom otkriću ranijim pronalaskom.

[0029] U prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID No: 1.

[0030] Kao što su ovde korišćeni, termini "nukleinske kiseline" i "nukleotidne sekvence" ili "sekvenca nukleinske kiseline" obuhvataju molekule DNK (npr., cDNK ili genomsku DNK), molekule RNK (npr., iRNK), kombinacije DNK i RNK molekula ili hibridne molekule DNK/RNK, i analoge molekula DNK ili RNK. Takvi analozi mogu biti generisani upotrebom, na primer, nukleotidnih analoga, koji obuhvataju, ali bez ograničenja na, inozin ili tritilovane baze. Takvi analozi takođe mogu da sadrže molekule DNK ili RNK koji sadrže modifikovane osnove koje daju korisne osobine molekulima kao što su, na primer, otpornost na nukleazu ili povećana sposobnost da prođu kroz ćelijske membrane. Sekvence nukleinske kiseline ili nukleotidne sekvence mogu biti jednolančane, dvolančane, mogu da sadrže i jednolačane i dvolančane delove, i mogu da sadrže trolančane delove, ali poželjno je dvolančana DNK.

[0031] Različite modifikacije mogu biti napravljene u DNK i RNK; na taj način, termin "molekuli nukleinskih kiselina" ili "sekvenca nukleinske kiseline" obuhvata hemijski, enzimatski ili metabolički modifikovane oblike. Na primer, molekuli nukleinskih kiselina ili sekvenca mnukleinske kiseline prema predmetnom pronalsku mogu biti modifikovani posttranslaciono ili post-transkripciono.

[0032] Sekvenca nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku kodira protein SEQ ID NO: 1. Sekvenca polipeptida kodiranog od strane SEQ ID NO: 1 može biti modifikovana zahvaljujući post-translacionim ili post-transkripcionim modifikacijama, u zavisnosti od ćelije domaćina koja eksprimira polipeptid kodiran od strane SEQ ID NO: 1.

[0033] Kada je ovde korišćen "protein od SEQ ID NO: X", pri čemu je X jednako 1, 2, 3, 4, 5, ili 9, on označava protein koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu ili kao što je prikazana u SEQ ID NO: X, pri čemu je X jednako 1, 2, 3, 4, 5 ili 9.

[0034] Termin "polipeptid" ili "protein" kada je ovde korišćen označava peptid, protein, ili polipeptid, koji su korišćeni naizmenično i koji obuhvata aminokiselinske lance date dužine, pri čemu su aminokiselinski ostaci vezani kovalentnim peptidnim vezama. Međutim, peptidomimetici takvih proteina/polipeptida u kojima su aminokiselina(e) i/ili peptidna veza(e) zamenjeni funkcionalnim analozima takođe su obuhvaćeni pronalaskom kao i druge, osim 20 aminokiselina kodiranih genima, kao što je selenocistein. Peptidi, oligopeptidi i proteini mogu biti označeni terminom polipeptidi. Kao što je navedeno termini polipeptid i protein su ovde često korišćeni naizmenično. Termin polipeptid takođe označava, i ne isključuje, modifikacije polipeptida. Modifikacije obuhvataju glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, fosforilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hem dela, kovalentno vezivanje nukleotida ili nukleotidnog derivata, kovalentno vezivanje lipida ili lipidnog derivata, kovalentno vezivanje fosfatidilinozitola, unakrsno vezivanje, ciklizaciju, formiranje disulfidne veze, demetilaciju, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cisteina, formiranje piroglutamata, formulaciju, gamakarboksilaciju, glikozilaciju, formiranje GPI sidra, hidroksilaciju, jodinaciju, metilaciju, miristoilaciju, oksidaciju, pegilaciju, proteolitičku obradu, fosforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, selenoilaciju, sulfataciju, adiciju aminokiselina proteinima posredovanu preko transfer-RNK kao što je arginilacija, i ubikvitinacija; videti, na primer, PROTEINS -STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983), pgs. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol. 182 (1990); 626-646, Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992); 48-62.

[0035] Proteini prema predmetnom pronalasku su prikazani u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ili 9. Na taj način, predmetni pronalazak daje proteine prikazane u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ili 9.

[0036] Termin "ekspresija" ili "ekspresija sekvence nukleinske kiseline" označava transkripciju specifične nukleinske kiseline ili specifičnog genetičkog konstrukta. Termin "ekspresija" ili "ekspresija nukleinske kiseline" naročito označava transkripciju sekvence nukleinske kiseline ili genetičkog konstrukta kao što je vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu od SEQ ID NO: 1 u strukturnu RNK (rRNK, tRNK) ili iRNK sa ili bez kasnije translacije iRNK u protein. Poželjno, protein je zatim translatiran. Postupak obuhvata transkripciju DNK i obradu rezultirajućeg proizvoda iRNK. iRNK je zatim translatirana u polipeptidne lance, koji su konačno savijeni u krajnje polipeptide/proteine. Ekspresija proteina je uobičajeno korišćena od strane istraživača proteomike za označavanje mere prisustva i zastupljenosti jednog ili više proteina u određenoj ćeliji ili tkivu. Ekspresija proteina ćelije može biti merena različitim sredstvima. Na primer, imunohistohemijom ili western blot analizom. Ovde dobijeni rezultati mogu biti procenjivani pomoću ćelije transficirane vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu prema predmetnom pronalasku u poređenju sa lažno transficiranom ćelijom. Ćelija (domaćin) sa većom ekspresijom pokazuje bojenje, koje je povećano npr. u intenzitetu, u poređenju sa kontrolnom ćelijom (lažno transficiranom) u istoj postavci. Takođe, ekspresija iRNK može biti merena npr. pomoću RT-PCR-a. Stručnjak iz date oblasti tehnike zna različite tehnike, kako odrediti ekspresiju određenog proteina ili iRNK ćelije. Takođe su predviđeni proteini, dobijeni zahvaljujući post-transkripcionim ili posttranslacionim modifikacijama.

[0037] "Varijanta" polipeptida obuhvata polipeptid u kome su jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstituisani, poželjno konzervativno supstituisani u poređenju sa navedenim polipeptidom i pri čemu je navedena varijanta poželjno sposobna da se vezuje za Fc deo antitela (videti vezivanje FcyR) i moguće za limfocite. Takve varijante obuhvataju delecije, insercije, inverzije, ponovke i supstitucije izabrane prema opštim pravilima poznatim u stanju tehnike. Na primer, vodič koji se bavi time kako napraviti fenotipski tihe aminokiselinske supstitucije dat je u Bowie, Science 247: (1990) 1306-1310, gde autori ukazuju na to da postoje dve glavne strategije za ispitivanje tolerancije promena od strane aminokiselinske sekvence. Poželjne varijante FcγRIIB su prikazane u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ili 9, pri čemu je FcγRIIB prikazan u SEQ ID NO: 1 poželjan.

[0038] Termin "Fc gama receptor" je ovde korišćen naizmenično sa "FcgR" ili "Fcγ receptor" ili "FcyR" i sadrži membranozne FcyRs i rastvorljive (tj. ekstracelularni deo Fcγ receptora) FcyRs. Fc gama receptori pripadaju imunoglobulinskoj superfamiliji proteina i nalaze se na mnogim hematopoetskim linijama. Kao što njihov naziv ukazuje, Fc receptori prepoznaju i vezuju se za Fc (fragment, koji može da se kristalizuje) deo antitela, tj. fragment kome odgovaraju dva C-terminalna domena oba teška lanca antitela i tipično interaguje sa efektornim molekulima i ćelijama.

[0039] Poželjno je da je protein prema SEQ ID NO: 1 rastvorljivi FcyR. Slično, poželjno je da je protein prema SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ili 9 rastvorljiv FcyR. Takođe je poželjno, da je protein prema SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ili 9 kao takav rastvorljiv u pogodnoj tečnosti, kao što je vodena tečnost.

[0040] FcyRs prepoznaje IgG antitela. Kod ljudi postoje četiri IgG podklase, imenovane po redosledu njihove zastupljenosti u serumu (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, pri čemu je IgG1 najzastupljeniji IgG tip). Kod ljudi postoje tri klase FcyRs: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIIIA (CD16). Pored toga, FcyRs se javlja u različitim izoformama, tj. funkcionalno slični Fc gama receptori koji imaju sličnu, ali ne identičnu aminokiselinsku sekvencu. Navedene izoforme obuhvataju FcyRIA, B1, B2, C; FcγRIIA1-2, B1-3, C i, pored toga, nekoliko alela (FcγRIIa1-HR, -LR; FcγRIIIb-NA1,-NA2) (van de Winkel and Capel, Immunol. Today 1993, 14:215-221). Različite klase i izoforme FcyR mogu se razlikovati u odnosu na njihov afinitet za IgG i specifično za različite IgG podklase. Tipično, FcyR se javlja kao tip I transmembranskih proteina ili u rastvorljivim oblicima, ali takođe postoji oblik FcγRIII (FcγRIIIB) sa glikozilfosfatidilinozitol sidrom.

[0041] "Rastvorljivi FcyRs" su takođe označeni kao "sFcyRs". Kao što je ovde korišćen, termin "rastvorljivi Fcγ receptor" i analogni termini označavaju ekstracelularni deo Fcγ receptora. Takav deo može biti rastvoren u tečnosti. Uopšteno, rastvorljivi oblici bilo koje klase FcyR, izoforme ili alela mogu biti identifikovani slovom "s" pre samog njegovog naziva, npr., sCD32 ili sFcγRII označava rastvorljivi Fc gama RII receptor. Tipično, nasuprot membranoznom (tj., vezanom za membranu) FcyR, rastvorljivi FcyR ne sadrži transmembranski region ili intracitoplazmatični rep.

[0042] Poželjno, FcyR prema pronalasku je ljudskog porekla ili humani FcyR. Termin "ljudskog porekla" treba tumačiti u njegovom najširenom smislu. Uopšteno, on označava da FcyR (ili njegov region ili fragment) liči ili je sličan humanom FcyR (tj., protein nađen u ljudskom telu) prema aminokiselinsoj sekvenci i/ili strukturi.

[0043] Alternativno, FcyR "ljudskog porekla" može biti rekombinantni FcyR koji je dobijen ekspresijom rekombinantne nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu, npr. kao što su opisali Sondermann and Jacob (1999), Bioll. Chem. 380(6), 717-721. Ukratko, gen od interesa je dobijen iz organizma i uveden u vektor, npr. plazmid ili virus, koji je zatim korišćen za transfer gena u ćeliju domaćina koja eksprimira rekombinantni gen i proizvodi rekombinantni proteinski proizvod. Stručnjak iz date oblasti tehnike će znati koju ćeliju domaćina treba izabrati u cilju dobijanja FcyR koji je npr. pogodan za pripremu farmaceutske kompozicije. Na primer, u nekim primerima izvođenja, može biti poželjan neglikozilovani FcyR. Stručnjak iz date oblasti tehnike može zatim da izabere prokariotsku ćeliju domaćina za ekspresiju FcyR koja je bez enzimske mašinerije neophodne za proteinsku glikozilaciju. U jednom primeru izvođenja FcyRs mogu biti eksprimirani u prokariotima i kasnije prečišćeni i ponovno savijeni prema opisu WO 00/32767.

[0044] U sledećem primeru izvođenja FcyRs mogu biti lako i jeftino proizvedeni sa visokom čistoćom u eukariotskim ekspresionim sistemima. Korisni sistemi obuhvataju eukariote sa specijalizovanim aparatom za proizvodnju ekstracelularnih proteina, npr. B ćelija. Drugi mogući eukariotski ekspresioni sistemi obuhvataju, ali bez ograničenja na, CHO ili HEK ćelije. Navedeni rastvorljiv FcyR je prema tome rekombinantan, rastvorljiv i glikozilovani FcyR.

[0045] FcyRs su ovde označeni tako da dalje obuhvataju FcyRs koji su, u poređenju sa FcyR divljeg tipa, modifikovani ili promenjeni u odnosu na aminokiselinsku sekvencu, i obuhvataju, npr., dodatna glikozilaciona mesta ili slično. Međutim, takođe su predviđeni neglikozilovani oblici FcyRs i to su FcyRs poželjnog primera izvođenja.

[0046] Fcγ receptor prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jednu od aminokiselinskih sekvenci kao što je prikazana u SEQ ID NO:1 (aminokiselinska sekvenca od SM101, takođe označena ovde kao varijanta 3). FcyR prema predmetnom pronalasku je kodirana sa najmanje jednom od sekvence nukleinske kiseline prema SEQ ID NO:6 (sekvenca nukleinske kiseline koja kodira SM101, takođe ovde označena kao varijanta 3). Ove sekvence mogu biti klonirane u ekspresioni vektor da bi se proizveo odgovarajući FcyR pomoću rekombinantne ekspresije.

[0047] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1. Takav vektor može biti, npr., plazmid, kozmid, virus, bakteriofag ili drugi vektor korišćen npr. konvencionalno u genetičkom inženjeringu, i može da sadrži dodatne gene kao što su marker geni koji omogućavaju selekciju i/ili replikaciju navedenog vektora u pogodnoj ćeliji domaćinu i pod pogodnim uslovima. U poželjnom primeru izvođenja, navedeni vektor je ekspresioni vektor, u kome je molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku operativno vezan i na ekspresionu kontrolnu sekvencu(e) koje omogućavaju ekspresiju u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima kao što su ovde opisane. Termin "operativno vezan", kao što je korišćen u ovom kontekstu, označava vezu između jedne ili više ekspresionih kontrolnih sekvenci i kodirajućeg regiona u polinukelotidu koji će biti eksprimiran na takav način da se ekspresija postiže pod uslovima kompatibilnim sa ekspresionom kontrolnom sekvencom.

[0048] Molekuli nukelinskih kiselina prema predmetnom pronalasku mogu na taj način biti inserirani u nekoliko komercijalno dostupnih vektora. Neograničavajući primeri obuhvataju plazmidne vektore kompatibilne sa sisarskim ćelijama, kao što su pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen), pREP (Invitrogen), pCRTopo (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, pIZD35, pLXIN i pSIR (Clontech) i pIRES-EGFP (Clontech). Poželjno, molekuli nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku su inserirani u vektor "pET" pod kontrolom IPTG inducibilnog T7-promotora. Bakulovirusni vektori kao što su pBlueBac, BacPacz Baculovirus Expression System (CLONTECH) i Max-BacTM Baculovirus Expression System, ćelije insekata i protokoli (Invitrogen) su dostupni komercijalno i takođe mogu biti korišćeni za proizvodnju visokih prinosa biološki aktivnog proteina. (videti takođe, Miller (1993), Curr. Op. Genet. Dev., 3, 9; O’Reilly, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, p. 127). Pored toga, prokariotski vektori kao što je pcDNA2; i vektori kvasca kao što je pYes2 su neograničavajući primeri drugih vektora pogodnih za upotrebu sa predmetnim pronalaskom.

[0049] Drugi poželjni ekspresioni vektori prema predmetnoj prijavi su oni za ekspresiju proteina u ćelijama Drosophila koji su dobro poznati u stanju tehnike, kao što su DES2-serije iz Invitrogen. Poželjno, navedeni ekspresioni vektor ćelije Drosophila je pMTBiP/V5-His B (Invitrogen). pMT/BiP/V5-His vektor pruža sledeće dodatne karakteristike. Ima malu veličinu (3.6 kb) za poboljšanje prinosa DNK i povećanje efikasnosti subkloniranja, ima C-terminalni V5 epitop tag za brzu detekciju sa Anti-V5 antitelom i ima C-terminalni 6xHis tag za jednostavno prečišćavanje rekombinantnih fuzionih proteina upotrebom nikl-helatirajuće smole.

[0050] Za tehnike modifikacije vektora, videti Sambrook and Russel (2001), loc. cit. Vektori mogu da sadrže jedan ili više sistema replikacije i nasleđivanja za kloniranje ili ekspresiju, jedan ili više markera za selekciju u domaćinu, npr., rezistenciju na antibiotike i jednu ili više ekspresionih kaseta.

[0051] Kodirajuće sekvence inserirane u vektoru mogu biti sintetisane pomoću standardnih postupaka, izolovane iz prirodnih izvora ili pripremljene kao hibridi. Ligacija kodirajućih sekvenci za transkripcione regulatorne elemente (npr., promotore, pojačivače i/ili izolatore) i/ili za druge sekvence koje kodiraju aminokiseline može se izvesti upotrebom ustanovljenih postupaka.

[0052] Pored toga, vektori mogu, pored sekvenci nukleinskih kiselina prema pronalasku, da sadrže ekspresione kontrolne elemente, omogućavajući pravilnu ekspresiju kodirajućih regiona u pogodnim domaćinima. Takvi kontrolni elementi su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike i mogu da obuhvataju promotor, kodon za inicijaciju translacije, mesto translacije i insercije ili unutrašnja mesta ulaska ribozoma (IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476) za uvođenje inserta u vektor. Poželjno, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku je operativno vezan za navedene ekspresione kontrolne sekvence omogućavajući ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama.

[0053] Kontrolni elementi koji osiguravaju ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, oni obično sadrže regulatorne sekvence koje osiguravaju inicijaciju transkripcije i izborno poli-A signale koji osiguravaju terminaciju transkripcije i stabilizaciju transkripta. Dodatni regulatorni elementi mogu da obuhvataju transkripcione kao i translacione pojačivače, i/ili prirodno vezane ili heterologne promotorske regione. Mogući regulatorni elementi koji dozvoljavaju ekspresiju u na primer sisarskim ćelijama domaćinima sadrže promotor CMVHSV timidin kinaze, SV40, RSV-promotor (Rous virus sarkoma), promotor humanog elongacionog faktora 1 alfa, CMV pojačivač, promotor CaM-kinaze ili SV40-pojačivač.

[0054] Za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, opisano je mnoštvo promotora uključujući, na primer, tac-lac-promotor, lacUV5 ili trp promotor. Pored elemenata koji su odgovorni za inicijaciju transkripcije takvi regulatorni elementi mogu takođe da sadrže transkripcione terminacione signale, kao što je SV40-poli-A mesto ili tk-poli-A mesto, nishodno od polinukleotida. U ovom kontekstu, u stanju tehnike su poznati pogodni ekspresioni vektori kao što je Okayama-Berg cDNK ekspresioni vektor pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-Vitrogene, kao što je korišćen, pored ostalog u priloženim primerima), pSPORT1 (GIBCO BRL) ili pGEMHE (Promega), ili prokariotski ekspresioni vektori, kao što je lambda gt11.

[0055] Ekspresioni vektor prema ovom pronalasku je bar sposoban da usmerava replikaciju, i poželjno ekspresiju, nukleinskih kiselina i proteina ovog pronalaska. Pogodni oridžini replikacije obuhvataju, na primer, Col E1, virusni SV40 i M 13 oridžine replikacije. Pogodni promotori obuhvataju, na primer, promotor citomegalovirusa (CMV), lacZ promotor, gal10 promotor i promotor polihedrina virusa multiple jedarne polihedroze Autographa californica (AcMNPV). Pogodne terminacione sekvence obuhvataju, na primer, goveđi hormon rasta, SV40, lacZ i AcMNPV polihedralne poliadenilacione signale. Primeri selektabilnih markera obuhvataju markere za rezistenciju na neomicin, ampicilin i higromicin i slično, poželjno kanamicin. Specifično dizajnirani vektori omogućavaju prenos DNK između različitih ćelija domaćina, kao što su ćelije bakterije-kvasca, ili bakterije-životinje, ili ćelije bakterije-gljiva ili ćelije bakterija-beskičmenjaka.

[0056] Pored molekula nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku, vektor može dalje da sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju sekrecione signale. Takve sekvence sekrecionih signala su dobro poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike. Pored toga, u zavisnosti od ekspresionog sistema korišćene lider sekvence sposobne za usmeravanje eksprimiranog polipeptida do ćelijskog kompartmenta mogu biti dodate kodirajućoj sekvenci molekula nukleinskih kiselina prema pronalasku i dobro su poznate u stanju tehnike. Lider sekvenca(e) je (su) sastavljene u odgovarajućoj fazi sa translacionim, inicijacionim i terminacionim sekvencama, i poželjno, lider sekvenca je sposobna da usmerava sekreciju translatiranog proteina ili njegovog dela, u, pored ostalog, ekstracelularnu membranu. Izborno, heterologna sekvenca može da kodira fuzioni protein uključujući C- ili N-terminalni identifikacioni peptid koji daje željene karakteristike, npr., stabilizaciju ili pojednostavljeno prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proizvoda. Pošto je vektor ugrađen u odgovarajućeg domaćina, domaćin je održavan pod uslovima pogodnim za visok nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci, i, kako je poželjno, mogu da slede sakupljanje i prečišćavanje proteina, antigenih fragmenata ili fuzionih proteina prema pronalasku. Naravno, vektor može takođe da sadrži regulatorne regione iz patogenih organizama.

[0057] Vektor može poželjno biti inducibilni ekspresioni vektor npr. IPTG-inducibilni vektor.

[0058] Pored toga, navedeni vektor takođe može biti, pored ekspresionog vektora, vektor za transfer gena i/ili vektor za ciljno delovanje na gen. Genska terapija, koja je zasnovana na uvođenju terapeutskih gena (na primer za vakcinaciju) u ćelije pomoću ex vivo ili in-vivo tehnika, jedna je od najvažnijih primena transfera gena. Pogodni vektori, vektorski sistemi i postupci za in-vitro ili in-vivo gensku terapiju su opisani u literaturi i poznati su stručnjacima iz date oblasti tehnike; videti, npr., Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 ili Verma, Nature 389 (1997), 239-242 i reference koje su u njima citirane.

[0059] Molekuli nukleinskih kiselina prema pronalasku i vektori kao što su opisani ovde u prethodnom tekstu mogu biti dizajnirani za direktno uvođenje ili za uvođenje preko lipozoma, ili virusnih vektora (npr. adenovirusnog, retrovirusnog) u ćeliju. Pored toga, bakulovirsni sistemi ili sistemi na bazi virusa vakcinije ili Semliki Forest virusa mogu biti korišćeni kao eukariotski ekspresioni sistem za molekule nukleinskih kiselina prema pronalasku. Pored rekombinantne proizvodnje, fragmenti proteina, fuzioni protein ili antigeni fragmenti prema pronalasku mogu biti proizvedeni pomoću direktne sinteze peptida upotrebom tehnika čvrste faze (videti Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). In vitro sinteza proteina može biti izvedena upotrebom ručnih tehnika ili automatizacijom. Automatska sinteza može biti postignuta, na primer, upotrebom Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City CA) u skladu sa uputstvima obezbeđenim od strane proizvođača. Različiti fragmenti mogu biti hemijski sintetisani posebno i spojeni upotrebom hemijskih postupaka za proizvodnju molekula pune dužine.

[0060] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1.

[0061] Navedeni "domaćin", može biti proizveden uvođenjem navedenog vektora ili nukleotidne sekvence u ćeliju domaćina koja usled prisustva u ćeliji posreduje u ekspresiji proteina kodiranog od strane nukleotidne sekvence prema pronalasku ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu ili vektor prema pronalasku, pri čemu nukleotidna sekvenca i/ili kodirani polipeptid je stran za ćeliju domaćina. Termin "domaćin" kada je ovde korišćen obuhvata ćelije domaćine.

[0062] "Strani" označava da je nukleotidna sekvenca i/ili kodirani polipeptid ili heterologna/heterologan u odnosu na domaćina, ovo znači poreklom od ćelije ili organizma sa različitom genomskom osnovom, ili homologa/homologan u odnosu na domaćina, ali se nalazi u različitoj genomskoj sredini od prirodnog parnjaka navedene nukleotidne sekvence. Ovo znači da, ako je nukleotidna sekvenca homologa u odnosu na domaćina, ona se ne nalazi u njenoj prirodnoj lokaciji u genomu navedenog domaćina, naročito ona je okružena različitim genima. U ovom slučaju nukleotidna sekvenca može biti ili pod kontrolom njenog sopstvenog promotora ili pod kontrolom heterolognog promotora. Lokacija uvedenog molekula nukleinske kiseline ili vektora može biti određena od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike upotrebom postupaka koji su dobro poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike, npr., Southern Blotting. Vektor ili nukleotidna sekvenca prema pronalasku koji/koja je prisutan/prisutna u domaćinu može ili biti integrisan/integrisana u genom domaćina ili može biti održavan/održavana u nekom obliku ekstrahromozomalno. U ovom smislu, takođe je potrebno razumeti da nukleotidna sekvenca prema pronalasku može biti korišćena za povratak ili stvaranje mutantnog gena preko homologe rekombinacije.

[0063] U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koji kodira protein prema SEQ ID NO: 1 je prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin. Poželjno, prokariotska ćelija domaćin je E. coli, poželjnije E. coli BL21, kao što je BL21 (DE3).

[0064] Pogodne prokariotske/bakterijske ćelije su one koje se generalno koriste za kloniranje kao E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens ili Bacillus subtilis. Navedeni eukariotski domaćin može biti sisarska ćelija, ćelija vodozemca, ćelija ribe, insekatska ćelija, ćelija gljive, biljna ćelija ili bakterijska ćelija (npr., sojevi E coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 i JM101). Poželjne su prokariotske rekombinantne ćelije domaćini, pri čemu je najpoželjnija E. coli.

[0065] Dodatni primeri eukariotskih ćelija domaćina obuhvataju, ali bez ograničenja na, ćelije kvasca, npr., ćelije Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis ili Pichia pastoris, ćelijske linije poreklom od čoveka, goveda, svinje, majmuna, i glodara, kao i ćelije insekata, uključujući, ali bez ograničenja na, ćelije insekta Spodoptera frugiperda i ćelije poreklom od insekta Drosophila kao i ćelije zebrice. Ćelijske linije izvedene iz vrsta sisara pogodne za upotrebu i komercijalno dostupne uključuju, ali nisu ograničene na, L ćelije, CV-1 ćelije, COS-1 ćelije (ATCC CRL 1650), COS-7 ćelije (ATCC CRL 1651), HeLa ćelije (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) i MRC-5 (ATCC CCL 171).

[0066] Pomenute ćelije izvedene iz Drosophila mogu biti Drosophila S2 (ATCC CRL-1963) koje su, pogodno upotrebljene za ekspresiju heterolognih proteina u Drosophila ekspresionim sistemima, na primer, Drosophila Expression System (DES®).

[0067] Ćelijske linije izvedene iz vrsta sisara pogodne za upotrebu i komercijalno dostupne uključuju, ali nisu ograničene na, L ćelije, CV-1 ćelije, COS-1 ćelije (ATCC CRL 1650), COS-7 ćelije (ATCC CRL 1651), HeLa ćelije (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) i MRC-5 (ATCC CCL 171).

[0068] U sledećem poželjnijem primeru izvođenja pomenuta ćelija vodozemca je oocita. U još poželjnijem primeru izvođenja pomenuta oocita je oocita žabe, naročito je poželjno oocita Xenopus laevis.

[0069] U još poželjnijem primeru izvođenja, domaćin prema pronalasku je ne-humani transgeni organizam. Pomenuti ne-humani organizam može biti sisar, vodozemac, riba, insekt, gljiva ili biljka. Naročito poželjne ne-humane transgene životinje su vrste Drosophila, Caenorhabditis elegans, Xenopus species, zebrica, Spodoptera frugiperda, Autographa californica, miševi i pacovi. Transgene biljke obuhvataju, ali nisu ograničene na, pšenicu, duvan, peršun i Arabidopsis.

[0070] Transgene gljive su takođe doboro poznate u tehnici i sadrže, između ostalih, kvasce, kao što su S. pombe ili S. cerevisae, ili vrste Aspergillus, Neurospora ili Ustilago ili vrste Pichia.

[0071] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 u ćeliji domaćinu, poželjno prokariotskoj ćeliji domaćinu, poželjnije u E. coli, najpoželjnije u E. coli BL21, kao što je E. coli BL21 (D3).

[0072] Ovde su opisani postupak za proizvodnju polipeptida kodiranog molekulom nukleinske kiseline pronalaska koji sadrži kultivaciju/gajenje domaćina pronalaska i izolaciju proizvedenog polipeptida.

[0073] U tehnici postoji veliki broj pogodnih postupaka za proizvodnju polipeptida u odgovarajućim domaćinima. Ukoliko je domaćin jednoćelijski organizam ili ćelija sisara ili insekta, stručnjak se može vratiti različitim uslovima kultivisanja koji se mogu dodatno optimizovati bez nepotrebnog povećanja posla. Pogodno, proizvedeni protein je sakupljen iz medijuma kulture ili iz izolovanih (bioloških) inkluzionih tela ustanovljenim tehnikama. Dodatno, proizvedeni polipeptid može biti direktno izolovan iz ćelije domaćina. Pomenuta ćelija domaćin može biti deo ili izvedena iz dela organizma domaćina, na primer pomenuta ćelija domaćin može biti deo tkiva, npr. CNS, kože itd. životinje ili može biti deo koji se može prikupiti od biljke. Dodatno, proizvedeni polipeptid se može izolovati iz tečnosti izvedenih iz pomenutog domaćina, kao što su krv, mleko ili cerebrospinalna tečnost.

[0074] Dodatno predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide koji su kodirani sekvencom nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 pronalaska.

[0075] Polipeptid pronalaska može biti shodno tome proizveden mikrobiološkim postupcima ili transgenim sisarima. Takođe je predviđeno da se polipeptid pronalaska može rekuperovati iz transgenih biljaka. Alternativno, polipeptid pronalaska se može proizvesti sintetički ili polusintetički.

[0076] Na primer, može se koristiti hemijska sinteza, kao što je procedura čvrste faze opisana od strane Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135. Sledeći postupak je in vitro translacija iRNK. Poželjan postupak uključuje rekombinantnu proizvodnju proteina u ćelijama domaćinima kao što je prethodno opisano. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže sve ili deo bilo kojih nukleotidnih sekvenci prema pronalasku mogu se sintetisati sa PCR, inserirati u ekspresioni vektor, i ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom. Nakon toga, ćelija domaćin je kultivisana da bi se proizveo odgovarajući polipeptid, koji je izolovan i prečišćen. Izolacija i prečišćavanje proteina može se postići bilo kojom od nekoliko poznatih tehnika; na primer i bez ograničenja, jono-izmenjivačkom hromatografijom, gel filtracionom hromatografijom i hromatografijom prema afinitetu, tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPLC), reverzno-faznom HPLC, preparativnom disk gel elektroforezom. Dodatno, mogu se koristiti translacioni sistemi bez ćelija da bi se proizveli polipeptidi ovog pronalaska. Pogodni ekspresioni sistemi bez ćelija za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju lizat retikulocita zeca, ekstrakt pšenične klice, pankreasne mikrozomalne membrane psa, E. coli S30 ekstrakt, i kuplovane transkripcione/translacione sisteme kao što je TNT-sistem (Promega). Ovi sistemi omogućavaju ekspresiju rekombinantnih polipeptida ili peptida po dodavanju klonirajućih vektora, DNK fragmenata, ili RNK sekvenci koje sadrže kodirajuće regione i odgovarajuće promotorne elemente. Kao što je prethodno pomenuto, tehnike izolacije/prečišćavanja proteina mogu zahtevati modifikaciju proteina predmetnog pronalaska korišćenjem konvencionalnih postupaka. Na primer, proteinu se može dodati histidinski tag da bi se omogućilo prečišćavanje na koloni sa niklom. Druge modifikacije mogu izazvati veću ili manju aktivnost, dozvoliti više nivoe proizvodnje, ili pojednostaviti prečišćavanje proteina. Drugi tagovi takođe uključuju flag-tag. Takvi tagovi su poželjno korišćeni za eukariotske domaćine.

[0077] Protein predmetnog pronalaska poželjno ima aminokiselinsku sekvencu kodiranu od strane molekula nukleinske kiseline predmetnog pronalaska kao što je ovde opisano ili je dobijeno ili se može dobiti ekspresijom pomenute sekvence nukleinske kiseline koja je ovde opisana. Kao takvi, vektori koji sadrže SEQ ID NO: 1 kao što je npr. u ekspresionim vektorima, mogu se upotrebiti da bi se postigla ekspresija proteina dobijenog ili koji se može dobti ekspresijom sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1.

[0078] Na primer, E. coli sojevi BL21 (DE3) se mogu upotrebiti da bi se posredovalo u ekspresiji proteina iz SEQ ID NO: 1 ili vektora koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1. Konstrukcija vektora npr. za ekspresiju pod kontrolom IPTG inducibilnog T7-Promotora poznata je u tehnici. Elektrokompetentne E. coli BL21(DE3) ćelije mogu se transformisati sa DNK plazmida npr. ekspresionim vektorom kao što je prethodno opisano. Obrađene ćelije su zatim uzgajane u medijumu. Nakon kultivacije, ćelije su sakupljene centrifugiranjem ili se mogu direktno lizirati npr. obradom ultrazvukom i suspenzija je zatim centrifugirana ili tretirana kao što je dato u primeru. Talog, tj. sirova inkluziona tela, mogu se zatim resuspendovati u puferu npr. puferu za lizu. Zatim je povećana rastvorljivost vlažnih inkluzionih tela. Nakon sledećeg centrifugiranja protein od interesa se može dobiti ili pre toga protein može biti ponovo savijen npr. kao što je dato u primeru. Ekspresija proteina, disrupcija ćelije, rekuperacija inkluzionih antitela, i ponovno savijanje inkluzionih tela se tipično izvodi kao što je poznato u tehnici i, npr., ovde opisano u Primerima.

[0079] Jedan način da se prečisti protein uključuje taloženje sa amonijum sulfatom jer je ovo postupak korišćen da se prečiste proteini menjanjem njihove rastvorljivosti. To je specifični slučaj opštije tehnike poznate kao isoljavanje. Amonijum sulfat se uobičajeno koristi jer je njegova rastvorljivost toliko velika da su dozvoljeni rastvori soli sa velikom jonskom snagom. Rastvorljivost proteina varira u skladu sa jonskom snagom rastvora, i stoga u skladu sa koncentracijom soli. Dva posebna efekta se uočavaju: na niskim koncentracijama soli, rastvorljivost proteina povećava se sa povećanjem koncentracije soli (npr. povećanjem jonske snage), efekat označen kao usoljavanje. Kako se koncentracija soli (jonska snaga) dalje povećava, počinje da se smanjuje rastvorljivost proteina. Na dovoljno velikoj jonskoj snazi, protein će se skoro potpuno istaložiti iz rastvora (isoljavanje).

[0080] Kako se proteini jasno razlikuju po rastvorljivosti na visokoj jonskoj snazi, isoljavanje je veoma korisna procedura koja pomaže u prečišćavanju datog proteina. Dodavanjem kosmotropskog amonijum sulfata talože se sporedni proizvodi savijanja kao što su nesavijene i pogrešno savijene vrste, ali takođe i nečistoće izvedene iz ćelije domaćina kao što su komponente ćelijskog zida i proteini. Sa povećavanjem koncentracije efikasnost taloženja će se povećati i stoga se dobija visoko prečišćeni FcR preparat sve dok je FcR varijanta otporna na taloženje na tako visokim koncentracijama amonijum sulfata. Stoga je poželjno imati FcR varijantu koja je visoko rastvorljiva na koncentracijama amonijum sulfata jednakim ili koje čak premašuju 1.5 M.

[0081] Istaloženi protein se tada uklanja centrifugiranjem i zatim je povećana koncentracija amonijum sulfata do vrednosti koja će istaložiti većinu proteina od interesa uz ostavljanje maksimalne količine kontaminacije proteina i dalje u rastvoru. Istaloženi protein od interesa je rekuperovan centrifugiranjem i rastvoren u svežem puferu za sledeći stadijum prečišćavanja.

[0082] Poželjno, protein predmetnog pronalaska ima visoku rastvorljivost na visokim koncentracijama amonijum sulfata jednakim ili koje premašuju 1.5 M.

[0083] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na protein koji je kodiran sekvencom nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 6.

[0084] Protein prema SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, ili 9 može biti kodiran sekvencom nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 6, gde

(i) prvi kodon (ATG) je izostavljen iz SEQ ID NO: 6 što rezultuje u proteinu prema SEQ ID NO: 2,

(ii) prvi (ATG) i drugi kodon (GCA) su izostavljeni iz SEQ ID NO: 6 što rezultuje u proteinu prema SEQ ID NO: 3,

(iii) prvi (ATG), drugi (GCA) i treći kodon (CCG) su izostavljeni iz SEQ ID NO: 6 što rezultuje u proteinu prema SEQ ID NO: 4,

(iv) prvi (ATG), drugi (GCA), treći (CCG), četvrti (CCG) i peti (AAA) kodon su izostavljeni iz SEQ ID NO:6 što rezultuje u proteinu prema SEQ ID NO: 5,

(v) kodoni koji kodiraju od N-do C-terminusa aminokiseline TPA dodati su između prvog (ATG) i drugog (GCA) kodona iz SEQ ID NO: 6 i kodoni koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu MGI dodati su 3’ u odnosu na pretposlednji kodon (CCG) iz SEQ ID NO: 6 što rezultuje u proteinu prema SEQ ID NO: 9.

[0085] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili protein kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 6.

[0086] Termin "kompozicija", kao što je korišćeno u skladu sa predmetnim pronalaskom, odnosi se na

(a) kompoziciju(e) koja sadrži(e) najmanje jedan protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1; (b) ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ili 9;

(c) ili protein kodiran sekvencom nukelinske kiseline iz SEQ ID NO: 6;

(d) ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ili 9.

[0087] Predviđeno je da kompozicije predmetnog pronalaska koje su ovde opisane u nastavku sadrže prethodno pomenute proteine u bilo kojoj kombinaciji. One mogu, izborno, sadržati dodatne molekule koji su sposobni da vezuju druge proteine npr. antitela ili limfocite. Kompozicija može biti u čvrstom, tečnom ili gasovitom obliku i može biti, između ostalog, u obliku (a) praška(praškova), (a) tablete(tableta), (a) rastvora(ili više njih) (an) aerosola(ili više njih), granula, pilula, suspenzija, emulzija, kapsula, sirupa, tečnosti, eliksira, ekstrakata, tinkture ili tečnih ekstrakata ili u obliku koji je naročito pogodan za oralnu ili parentalnu ili topikalnu primenu.

[0088] Sledeća poželjna kompozicija predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja izborno dodatno sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač i/ili ekscipijens. Pomenuta farmaceutska kompozicija sadrži, između ostalog, sekvencu nukleinske kiseline predmetnog pronalaska ili polipeptid predmetnog pronalaska koji može biti kuplovan sa dodatnim polipeptidom, na primer antitelom ili drugim proteinom prisutnim u serumu.

[0089] Farmaceutska kompozicija se može primenti sa fiziolški prihvatljivim nosačem na pacijenta, kao što je ovde opisano. U specifičnom primeru izvođenja, termin "farmaceutski prihvatljiv" označava odobren od strane regulatorne agencije ili druge opšte prihvaćene farmakopeje za upotrebu na životinjama, i naročito na ljudima.

[0090] Termin "nosač" odnosi se na razblaživač, ađuvans, ili vehikulum sa kojim se farmaceutska kompozicija primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja. Voda je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Fiziološki rastvori i vodeni rastvori glukoze i glicerola takođe se mogu upotrebiti kao tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore.

[0091] Pogodni farmaceutski ekscipijensi obuhvataju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, jon natrijuma, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ako je poželjno, takođe može da sadrži manje količine sredstava za vlaženje ili emulgovanje, ili pH puferujućih sredstava. Ove kompozicije mogu imati oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Kompozicija može biti formulisana kao supozitorija, sa tradicionalnim vezujućim sredstvima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralne formulacije mogu da obuhvataju standardne nosače kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijuum karbonat, farmaceutskog kvaliteta, itd. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington’s Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Takve kompozicije će sadržati terapeutski efikasnu količinu gore navedenih jedinjenja, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa pogodnom količinom nosača tako da se obezbedi oblik za pogodnu primenu na subjekta. Formulacija bi trebalo da odgovara načinu primene.

[0092] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim postupcima kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensku primenu na ljude. Tipično, kompozicije za intravensku primenu su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je neophodno, kompozicija može takođe da obuhvata solubilizaciono sredstvo i lokalni anestetik kao što je lidokain za olakšavanje bola na mestu injekcije. Generalno, sastojci su dopremljeni posebno ili mešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prašak ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontjeneru kao što je ampula ili kesica koja ima naznačenu količinu aktivnog sredstva. Tamo gde se kompozicija primenjuje infuzijom, ona može biti primenjena sa bocom za infuziju koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutskog kvaliteta. Tamo gde je kompozicija primenjena injekcijom, ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor može biti obezbeđena tako da sastojci mogu biti mešani pre primene.

[0093] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti formulisana kao neutralni ili oblici soli. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju one formirane sa anjonima kao što su oni poreklom od hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one formirane sa katjonima kao što su oni poreklom od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, ferihidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd.

[0094] In vitro analize mogu izborno biti korišćene za pomoć u identifikaciji optimalnih opsega doza. Tačna doza koja će biti korišćena u formulaciji takođe će zavisiti od puta primene, i ozbiljnosti bolesti ili poremećaja, i trebalo bi da bude određena prema proceni lekara i stanja svakog subjekta. Efikasne doze se mogu ekstrapolirati iz krivih doza-odgovor izvedenih iz in vitro ili sa test sistemima na životinjskim modelima. Poželjno, farmaceutska kompozicija se primenjuje direktno ili u kombinaciji sa ađuvansom.

[0095] Farmaceutska kompozicija može biti dizajnirana za primenu u genskoj terapiji. Tehnika genske terapije je već prethodno opisana u vezi sa ćelijama domaćinima predmetnog pronalaska i sve što je tamo rečeno takođe se primenjuje u vezi sa farmaceutskom kompozicijom. Na primer, molekul nukleinske kiseline ili protein koji sadrži protein dobijen ili koji se može dobiti ekspresijom nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 1 ili vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira protein prema SEQ ID NO: 1 ili protein kodiran od sekvence nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 6 u farmaceutskoj kompoziciji je poželjno u obliku koji omogućava njegovo uvođenje, ekspresiju i/ili stabilnu integraciju u ćelije pojedinačnog subjekta koji se leči.

[0096] Za gensku terapiju mogu se koristiti različiti virusni vektori, na primer, adenovirus, herpes virus, vakcinia, ili, poželjno, RNK virus kao što je retrovirus. Primeri retrovirusnih vektora u koje se može inserirati pojedinačni strani gen uključuju, ali nisu ograničeni na: virus Moloney mišje leukemije (MoMuLV), virus Harvey mišjeg sarkoma (Ha-MuSV), virus mišjeg tumora dojke (MuMTV), i Rous virus sarkoma (RSV). Brojni dodatni retrovirusni vektori mogu takođe uključiti višestruke gene. Svi ovi vektori mogu preneti ili inkorporisati gene za selektabilni marker tako da se mogu identifikovati i stvoriti transducirane ćelije. Retrovirusni vektori se mogu napraviti kao ciljno specifični insercijom, na primer, polinukleotida koji kodira šećer, glikolipida, ili proteina. Stručnjacima će biti poznato, ili mogu lako konstatovati bez nepotrebnog eksperimentisanja, specifične polinukleotidne sekvence koje se mogu inserirati u retrovirusni genom da bi se omogućilo ciljno specifično dopremanje retrovirusnog vektora koji sadrži inseriranu polinukelotidnu sekvencu.

[0097] S obzirom na to da su rekombinantni retrovirusi poželjno defektni, oni zahtevaju pomoć da bi proizveli infektivne vektorske čestice. Ova pomoć može biti obezbeđena, na primer, upotrebom pomoćnih ćelijskih linija koje sadrže plazmide koji kodiraju sve strukturne gene retrovirusa pod kontrolom regulatornih sekvenci unutar LTR. Ovim plazmidima nedostaje nukleotidna sekvenca koja omogućava da mehanizam pakovanja prepozna RNK transkript za inkapsidaciju. Pomoćne ćelijske linije koje imaju delecije pakujućeg signala obuhvataju, ali bez ograničenja na, na primer, w2, PA317 i PA12. Ove ćelijske linije proizvode prazne virione, s obzirom na to da genom nije pakovan. Ako je retrovirusni vektor uveden u takve ćelije u kojima je pakujući signal intaktan, ali su strukturni geni zamenjeni drugim genima od interesa, vektor može biti pakovan i može biti proizveden vektorski virion. Alternativno, NIH 3T3 ili druge ćelije kulture tkiva mogu biti direktno transficirane sa plazmidima koji kodiraju retrovirusne strukturne gene gag, pol i env, pomoću konvencionalne transfekcije uz upotrebu kalcijum fosfata. Ove ćelije su zatim transficirane vektorskim plazmidom koji sadrži gene od interesa. Dobijene ćelije oslobađaju retrovirusni vektor u medijum kulture. Sledeći sistem ciljane primene za molekule nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku je koloidni disperzioni sistem. Koloidni disperzioni sistemi obuhvataju makromolekulske komplekse, nanokapsule, mikrosfere, kuglice i sisteme na bazi lipida uključujući emulzije ulje-u-vodi, micele, mešane micele i lipozome. Poželjan koloidni sistem ovog pronalaska je lipozom. Lipozomi su vezikule veštačke membrane koje su korisne kao nosači za primenu in vitro i in vivo. Pokazano je da velike unilamelarne vezikule (LUV), koje su veličine u opsegu od 0.2-4.0 pm mogu da inkapsuliraju značajan procenat vodenog pufera koji sadrži velike makromolekule. RNK, DNK i intaktni virioni mogu biti inkapsulirani unutar vodene unutrašnjosti i primenjeni na ćelije u biološki aktivnom obliku (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Popred sisarskih ćelija, lipozomi su korišćeni za primenu polinukleotida u biljnim ćelijama, ćelijama kvasca i bakterijskim ćelijama. Da bi lipozom bio efikasan nosač transfera gena, sledeće karakteristike bi trebalo da su prisutne: (1) inkapsulacija gena od interesa na visokoj efikasnosti, a da se istovremeno ne ugrožava njihova biološka aktivnost; (2) preferencijalno i značajno vezivanje za ciljnu ćeliju u poređenju sa ćelijama koje nisu ciljne; (3) primena vodenih sadržaja vezikule na citoplazmu ciljne ćelije u visokoj efikasnosti; i (4) tačna i efikasna ekspresija genetičke informacije (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). Sastav lipzoma je obično kombinacija fosfolipida, naročito fosfolipida sa visokom temperaturom faznog prelaza, obično u kombinaciji sa steroidima, naročito holesterolom. Drugi fosfolipidi ili drugi lipidi takođe mogu biti korišćeni. Fizičke karakteritike lipozoma zavise od pH, jonske jačine, i prisustva dvovalentnih katjona. Primeri lipida korisnih u proizvodnji lipozoma obuhvataju fosfatidil jedinjenja, kao što su fosfatidilglicerol, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipidi, cerebrozidi i gangliozidi. Naročito su korisni diacilfosfatidilgliceroli, gde lipidni deo sadrži od 14-18 atoma ugljenika, naročito od 16-18 atoma ugljenika, i zasićen je. Ilustrativni fosfolipidi obuhvataju fosfatidilholin iz jaja, dipalmitoilfosfatidilholin i distearoilfosfatidilholin. Ciljno delovanje lipozoma može biti klasfikovano na osnovu anatomskih i mehaničkih faktora. Anatomska klasifikacije je zasnovana na nivou selektivnosti, na primer, organ-specifično, ćelijski-specifično i specifično za organelu. Mehanističko ciljno delovanje može biti razlikovano na osnovu toga da li je pasivno ili aktivno. Pasivno ciljno delovanje koristi prirodnu tendenciju lipozoma da se distribuiraju na ćelije retikulo-endotelijalnog sistema (RES) u organima koji sadrže sinusoidne kapilare.

[0098] U kontekstu predmetnog pronalaska termin "subjekat" označava individuu kod koje postoji potreba za lečenjem afektivnog poremećaja. Poželjno, subjekat je kičmenjak, čak poželjnije sisar, naročito poželjno čovek. U jednom primeru izvođenja, čovek je pacijent ili individua.

[0099] Termin "primenjen" označava primenu terapeutski ili dijagnostički efikasne doze gore navedenog molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid prema predmetnom pronalasku na individuu.

[0100] Kao što je ovde korišćena, "terapeutski efikasna količina" označava količinu terapeutski aktivne komponente ili sredstva koja je dovoljna za lečenje ili poboljšanje bolesti ili poremećaja, za odlaganje početka bolesti ili obezbeđuje bilo koju terapeutsku korist u lečenju ili kontrolisanju bolesti.

[0101] Kao što je poznato u stanju tehnike i opisano u prethodnom tekstu, može biti neophodno podešavanje za sistemsku naspram lokalizovanoj primeni, prema starosti, telesnoj težini, opštem zdravstvenom stanju, polu, ishrani, vremenu primene, interakciji leka i težini stanja, i moći će lako da se odredi rutinskim eksperimentisanjem od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Ovi postupci su primenljivi za humanu terapiju i za veterinarske primene. Jedinjenja opisana ovde koja imaju željenu terapeutsku aktivnost mogu biti primenjivana u fiziološki prihvatljivom nosaču na pacijenta, kao što je ovde opisano. U zavisnosti od načina uvođenja, jedinjenja mogu biti formulisana na različite načine kao što su razmatrani u daljem tekstu. Koncentracija terapeutski aktivnog jedinjenja u formulaciji može da varira od oko 0.1-100 tež. %. Sredstva mogu biti primenjivana pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima.

[0102] Primena farmaceutske kompozicije može biti izvedena na različite načine kao što su razmatrani u prethodnom tekstu, uključujući, ali bez ograničenja na, oralno, subkutano, intravenski, intra-arterijski, intranodalno, intramedularno, intratekalno, intraventrikularno, intranazalno, intrabronhijalno, transdermalno, intranodalno, intrarektalno, intraperitonealno, intramuskularno, intrapulmonalno, vaginalno, rektalno ili intraokularno. U nekim slučajevima, na primer, u tretmanu rana i inflamacije, sredstva kandidati mogu biti direktno primenjena kao rastvor preko suvog spreja.

[0103] Farmaceutska kompozicija je poželjno injektirana. Ova injekcija se primenjuje upotrebom intravenskih infuzija, subkutano ili intramuskularno. Pored toga farmaceutska kompozicija može da sadrži druge farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijense. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava generalno priznatu farmakopeju za upotrebu kod životinja, i naročito kod ljudi.

[0104] Tamo gde se kompozicija primenjuje infuzijom, ona može biti primenjena sa infuzionom bocom koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutskog kvaliteta. Tamo gde se kompozicija primenjuje injekcijom, ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološkog rastvora može biti obezbeđena tako da sastojci mogu biti mešani pre primene. Pored toga, farmaceutska kompozicija može biti primenjena u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava ili antitela, kao što su steroidi ili intravenski imunoglobulin, naročito kortikosteroidi, glukokortikoidni prolekovi, npr. prednizon, IVIG, anti-D, alkaloidi zimzelena, npr. vinkristin ili vinblastin, danazol, imunosupresivna sredstva, npr. azatioprin, ciklofosfamid ili ciklosporin A, dapson, trombopoetička sredstva, rituksimab, mikofenolat mofetil, romiplostim, eltrombopag, mikofenolat mofetil. Kao što je ovde korišćen, termin "u kombinaciji" označava upotrebu više od jednog profilaktičkog i/ili terapeutskog sredstva. Upotreba termina "u kombinaciji" ne ograničava redosled u kome se profilaktička i/ili terapeutska sredstva primenjuju na pacijenta.

[0105] Nadležni lekar i klinički faktori će odrediti režim doziranja. Kao što je dobro poznato u oblasti medicine, doze za svakog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, specifičnu površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje će se primenjivati, pol, vreme i put primene, opšte zdravstveno stanje, i drugi lekovi koji se primenjuju istovremeno. Tipična doza može biti, na primer, u opsegu od 0.001 do 1000 μg; međutim, doze ispod ili iznad ovog primera opsega su predviđene, naročito uzimajući u obzir gore navedene faktore.

Doze se poželjno daju jednom nedeljno, međutim, u toku napredovanja tretmana doze mogu biti davane u mnogo dužim vremenskim intervalima i prema potrebi mogu biti davane u mnogo kraćim vremenskim intervalima, npr., jednom dnevno. U poželjnom slučaju imuni odgovor je praćen upotrebom ovde opisanih postupaka i dodatnih postupaka poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike i doze su optimizovane, npr., u vremenu, količini i/ili kompoziciji. Doze će varirati, ali poželjna doza za intravensku primenu DNK je od približno 10<6>do 10<12>kopija DNK molekula. Ako je režim kontinuirana infuzija, ona bi takođe trebalo da bude u opsegu od 1 μg do 10 mg jedinica po kilogramu telesne težine u minuti, respektivno. Napredovanje može biti praćeno periodičnom procenom. Farmakološka kompozicija prema pronalasku može biti primenjivana lokalno ili sistemski. Primena će poželjno biti parenteralna, npr., intravenska. Preparati za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, bilna ulja kao što je maslinovo ulje i injektabilni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači obuhvataju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane medijume. Parenteralni nosači obuhvataju rastvor natrijumovog jona, Ringerov rastvor sa dekstrozom, dekstrozu i jon natrijuma, laktatni Ringerov rastvor ili masna ulja. Intravenski nosači obuhvataju tečne i hranljive punioce, punioce elektrolita (kao što su oni na bazi Ringerovog rastvora sa dekstrozom), i slično. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, anti-oksidanti, helatirajuća sredstva i inertni gasovi i slično. Takođe je predviđeno da se farmaceutske kompozicije koriste u pristupima ko-terapije sa drugim sredstvima, na primer, korisnim u detekciji metilovane DNK i, na taj način, na primer, korisnim u dijagnozi maligniteta koji mogu da pokažu tipičan metilovani obrazac. Predmetni pronalazak daje komplete koji se mogu koristiti za gore opisane postupke. Stručnjak iz date oblasti tehnike takođe dobro zna da farmaceutska kompozicija može biti u obliku kompleta sa višestrukom dozom koji sadrži dovoljne količine doza za primenu FcyR za efikasan tretman ili prevenciju inflamatornih bolesti i/ili autoimunih bolesti kod pacijenta. U jednom primeru izvođenja, farmaceutsko pakovanje ili komplet sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku. Pored toga, jedan ili više dodatnih profilaktičkih ili terapeutskih sredstava korisnih za lečenje bolesti takođe može biti uključen u farmaceutsko pakovanje ili komplet.

[0106] Pored toga, farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može biti korišćena za lečenje i prevenciju poremećaja ili bolesti.

[0107] Kao što je ovde korišćen, termin "lečenje" i analogni termini označavaju brigu i negu pacijenta i/ili borbu protiv bolesti ili poremećaja. Kao što su ovde korišćeni, termini "sprečiti", "sprečavanje" i "prevencija" označavaju prevenciju ponovne pojave ili početka jednog ili više simptoma poremećaja kod subjekta koja je rezultat primene profilaktičkog ili terapeutskog sredstva.

[0108] Kao što su ovde korišćeni, termini "poremećaj" i "bolest" su korišćeni naizmenično za označavanje stanja kod subjekta. Naročito, termin "autoimuna bolest" je korišćen naizmenično sa terminom "autoimuni poremećaj" da bi se označilo stanje kod subjekta okarakterisano povredom ćelije, tkiva i/ili organa uzrokovanom imunološkom reakcijom subjekta na svoje sopstvene ćelije, tkiva i/ili organe. Termin "inflamatorna bolest" je korišćen naizmenično sa terminom "inflamatorni poremećaj" za označavanje stanja kod subjekta okarakterisanog inflamacijom, poželjno hronične inflamacije. Autoimuni poremećaji mogu ili ne moraju biti povezani sa inflamacijom. Pored toga, inflamacija može ili ne mora da bude uzrokovana autoimunim poremećajem. Na taj način, određeni poremećaji mogu biti okarakterisani kao autoimuni i inflamatorni poremećaji.

[0109] U poželjnom primeru izvođenja inflamatorna bolest koja može biti tretirana predmetnim postupkom je primarna imuna trombocitopenija (ITP), sistemski lupus eritomatozus (SLE), reumatoidni artritis (RA) ili autoimuna hemoliitička anemija (AIHA).

[0110] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju materije koja sadrži protein prema SEQ ID No: 2 i/ili 3.

[0111] Termin "kompozicija materije" označava sve kompozicije dve ili više supstanci i sve složene supstance, bilo da su one rezultat hemijskog spajanja, ili mehaničke smeše, ili biološki proizvod. Kompozicija materije može biti formirana pomoću smeše od dva ili više sastojaka. Smeša sastojaka u kompoziciji materije može biti proizvedena pomoću mehaničkih ili hemijskih operacija ili pomoću bioloških procesa.

[0112] Kompozicija materije može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aktivnih sastojaka. "Aktivni sastojak" označava terapeutski efikasan sastojak. Takav aktivni sastojak može da se veže za IgG antitela kao što je ovde opisano i moguće može da se veže za limfocite, npr. T-ćelije, B-ćelije, ćelije prirodne ubice. Takav aktivni sastojak se vezuje samo za konstantni region. Poželjno je da je u kompoziciji materije jedini aktivni sastojak protein prema predmetnom pronalasku kao što je opisan u prethodnom tekstu.

[0113] U jednom primeru izvođenja kompozicija materije sadrži protein prema SEQ ID No: 2 i 3. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije sadrži protein prema SEQ ID No: 2 ili 3. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije sadrži protein prema SEQ ID No: 2. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije sadrži protein prema SEQ ID No: 3.

[0114] U jednom primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku dalje sadrži protein prema SEQ ID No. 4 i/ili 5. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku dalje sadrži protein prema SEQ ID No. 4 i 5. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku dalje sadrži protein prema SEQ ID No. 4 ili 5. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku dalje sadrži protein prema SEQ ID No. 4. U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku dalje sadrži protein prema SEQ ID No.5.

[0115] U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što je količina proteina prema SEQ ID No: 2 veća od količine proteina prema SEQ ID No: 3.

[0116] U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što je količina proteina prema SEQ ID No: 3 veća od količine proteina prema SEQ ID No: 2.

[0117] U sledećem primeru izvođenja kompozicija materije prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što je količina proteina prema SEQ ID No: 2 veća od količine proteina prema SEQ ID No: 3 i količina proteina prema SEQ ID No: 2 i 3 je veća od količine proteina prema SEQ ID No: 4 i/ili 5.

[0118] U jednom primeru izvođenja kompozicija materije sadrži protein prema SEQ ID No: 9.

[0119] Kompozicija materije je u poželjnom primeru izvođenja farmaceutska kompozicija.

[0120] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku pod uslovima koji mogućavaju ekspresiju kodiranog proteina, i izolaciju dobijene farmaceutske kompozicije.

PRIMERI

[0121] Sledeći primeri ilustruju pronalazak. Ove primere ne bi trebalo tumačiti tako da ograničavaju obim ovog pronalaska. Primeri su uključeni za svrhe ilustracije i predmetni pronalazak je ograničen samo patentnim zahtevima.

Materijal i metode

Proizvodnja varijanti FcR

[0122] 75 mL LB dopunjenog sa 50 μg/mL Kanamicina u 250 mL konusnoj posudi sa deflektorima je inokulisano sa 5 μL glicerol stoka i mućkano u trajanju od 15 časova na 37°C, 170 rpm (Multitron Standard, Infors HT). Zatim, 1 L LB u 2 L konusnoj posudi sa deflektorima je inokulisano sa 10 mL prekonoćne kulture i mućkano na 37°C, 170 rpm. Na OD600 od 1.6, ekspresija je indukovana dodavanjem 1 mM IPTG. Posle kultivacije od još 3 časa na 37°C, 170 rpm ćelije su sakupljene centrifugiranjem (10 min na 5’000·g, 4°C), isprane jednom sa 200 mL ledeno hladnog PBS i čuvane na -20°C.

Kidanje ćelija i izolacija inkluzionih tela

[0123] 6 - 8 g zamrznutih ćelija E. coli je otopljeno na sobnoj temperaturi i resuspendovano u 30 mL pufera za lizu (50 mM Tris/HCl, 25 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.0) dopunjenog sa 100 μg/mL lizozima upotrebom teflon-u-staklu homogenizatora. Posle inkubacije od 15 min na ledu, ćelije su kidane ultrazvukom (podešavanje snage 6, radni ciklus 30%, 30 min, Sonifier 250 opremljen sa mikrovrhom, Branson) i suspenzija je centrifugirana (45 min na 13’000·g, 4°C). 1 mL supernatanta je uzorkovano i preostala tečnost je odbačena. Talog, tj. sirova inkluziona tela, su resuspendovana u 35 mL pufera za lizu dopunjenog sa 0.5% (zapr./zapr.) Polysorbate 20 upotrebom teflon-u-staklu homogenizatora i centrifugirana (15 min na 13’000·g, 4°C). Posle jednog dodatnog koraka ispiranja deterdžentom, krajnji korak ispiranja je izveden upotrebom samog pufera za lizu. Isprana inkluziona tela su čuvana na -20°C do upotrebe.

Ponovno savijanje i prečišćavanje varijanti FcR

[0124] Vlažna inkluziona tela su solubilizovana na 200 mg/mL u 20 mM Tris/HCl, 6 M guanidina, 3 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 8.0 u trajanju od 2.5 časa na 20°C pod konstantnim mešanjem (400 rpm) u zatvorenoj epruveti za centrifugu. Posle centrifugiranja (20’000·g, 10 min, 20°C) supernatant je sakupljen odlivanjem i sadržaj FcR je određen posle 1:60 razblaženja pomoću RP-HPLC na Knauer Bioselect C4. Na osnovu analitičkih rezultata, solubilizovana inkluziona tela su razblažena sa 20 mM Tris/HCl, 6 M guanidina, 3 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 8.0 do sadržaja FcR od 21 mg/mL i jedan deo razblaženog rastvora FcR je dodat ukapavanjem u 20 delova mešanog (800 rpm) pufera za ponovno savijanje (20 mM Tris/HCl, 2 M urea, 0.5 M arginin, 2 mM cisteamin, 2 mM cistamin, pH 7.7 na 6°C). Posle inkubacije u trajanju od 16 časova na 10°C u hermetički zatvorenom kontejneru bez mešanja, rastvor za ponovno savijanje je zagrevan do sobne temperature. Topao rastvor za ponovno savijanje je podešen do 1.1 M (NH4)2SO4ukapavnjem 3.5 M (NH4)2SO4, 20 mM NH4H2PO4, pH 7.0 uz konstantno mešanje (400 rpm). Posle mešanja još 1 čas na 200 rpm suspenzija je centrifugirana (20’000·g, 20 min, 20°C), supernatant je filtriran (0.2 mm Durapore®, Millipore) i filtrat je sipan na 4 mL/min, ≤4 mg proteina/mL smole na 35 mL Phenyl Sepharose HP kolone (h=6.6 cm, d=2.6 cm, GE Healthcare) ekvilibrisane u 1.2 M (NH4)2SO4, 20 mM NH4H2PO4, pH 7.0. Kolona je isprana sa 100 mL 1.2 M (NH4)2SO4, 20 mM NH4H2PO4, pH 7.0 i vezani protein je eluiran sa 350 mL linearnog gradijenta od 1.2 M do 0 M (NH4)2SO4u 20 mM NH4H2PO4, pH 7.0 na 5 mL/min. Eluat je sakupljen u frakcije od 7.5 mL, koje su podvrgnute RP-HPLC analizi na Phenomenex Jupiter C4. Frakcije sa čistoćom iznad 85% u vezi sa traženom varijantom FcR su sakupljene, koncentrovane približno dva puta i diafiltrirane nasuprot 20 mM L-histidina pH 6.5 pomoću tangencijalne protočne filtracije (Vivaflow 50, 5 kDa MWCO, 0.01 m<2>, unakrsni-protok 200 mL /min, pIN= 2bar; Sartorius) sve dok provodljivost nije smanjena do približno 5 mS/cm. Posle izmene pufera, rastvor je punjen u 2 mL/min, ≤20 mg proteina/mL smole na 9 mL SP Sepharose HP kolone (h=4.5 cm, d=1.6 cm, GE Healthcare) ekvilibrisane u 20 mM L-histidina, pH 6.5. Kolona je isprana sa 30 mL 20 mM L-histidina, 30 mM NaCl, pH 6.5 i vezani protein je eluiran sa 90 mL linearnog gradijenta od 20 mM do 400 mM NaCl u 20 mM L-histidina, pH 6.5 na 3 mL/min. Frakcije koje sadrže glavni pik su sakupljene, podešene do 15.4 mS/cm sa 20 mM L-histidina pH 6.5, koncentrovane do približno 20 mg/mL pomoću ultrafiltracije (4’000·g, 5 kDa MWCO, Vivaspin 20, Sartorius) i razblažene do 15mg/mL sa 20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, pH 6.5. Razblaženi rastvor FcR je filtriran (0.45 μm PES membrana, Puradisc™ 25 mm, Whatman), podeljen u alikvote, trenutno zamrznut u tečnom azotu i čuvan na -80°C.

Analiza taloženja

[0125] FcR je podešen do 0.7 mg/mL u prisustvu 20 mM histidina, 150 mM NaCl i 0 - 2.8 M amonijum sulfata dodavanjem odgovarajuće količine ddH2O, 10X histidina/NaCl stok rastvora (200 mM histidin, 1.5 M NaCl) i stok rastvor amonijum sulfata (4M u ddH2O). pH je podešena do 6, 7 ili 8 upotrebom 10X histidina/NaCl i amonijum sulfatnog stoka na odgovarajućoj pH. Svaki od uslova je postavljen u dva ponavljanja. Uzorci su inkubirani 1 čas na 25°C, centrifugirani (20’000xg, 10 min) i 30 μL supernatanta je prebačeno u 384 – komornu ploču (μ providne, nevezujuće, crne, Greiner Bio-one). Merena je apsorbanca na 280 nm (Spectrofluor plus, Tecan) i sadržaj proteina je izračunavan prema Lambert Beersovom zakonu upotrebom koeficijenta ekstinkcije po jedinici mase od 1.5625 mL x mg<-1>x cm<-1>i dužine puta od 0.24 cm. Apsorbanca komorice uzorka je korigovana apsorbancom komorice koja sadrži samo blanko pufer.

SDS-PAGE

[0126] Da bi se suprimirala kasnija disulfidna izmena, slobodni tioli su alkilovani sa jodoacetamidom mešanjem 18 μL solubilizovanih IBs ili ponovnim savijanjem oba sa 2 μL 250 mM sveže pripremljenog jodoacetamida u H2O. Smeša je inkubirana u trajanju od 45 min na 30°C, 750 rpm u mraku i direktno korišćena za SDS-PAGE pripremu uzoraka prema NuPAGE® Novex® uputstvu (Invitrogen). Proteini su razdvojeni na 4-12% Bis-Tris gelu u MES radnom puferu (oba NuPAGE® Novel®, Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Gelovi su isprani tri puta sa ddH2O i bojeni sa Simply Blue™ Safe bojom (Invitrogen) najmanje 6 časova na sobnoj temperaturi. Kao marker molekulske mase korišćeno je 10 μL SeeBlue® Plus2 prethodno obojenog standarda (Invitrogen).

LC-MS

[0127] Molekulska masa intaktnog eksprimiranog proteina je određena pomoću masene spektroskopije zajedno sa MPI iz Biochemistry (Martinsried). Uzorci su analizirani na ESI-TOF masenom analizatoru (microTOF, Bruker) opremljenom sa Phenomenex Aeris™ Widepore C4 kolonom (100 mm x 2.1 mm, 3.6 μM veličina čestica, 300 Å veličina pora) prethodno ekvilibrisanom u 30% acetonitrilu, 0.05% TFA. Uzorci koji sadrže FcR su injektirani u 0.25 mL/min, 20°C i vezani protein je eluiran sa 15 min linearnim gradijentom od 30% do 80% acetonitrila, 0.05% TFA.

UV/VIS spektroskopija

[0128] Ako je neophodno rastvor proteina je razblažen sa odgovarajućim puferom do OD280 između 0.2 i 0.8.400 μL rastvora je prebačeno u UV-mikrokivetu (UV-cuvette micro, Brand). Beležena je apsorbanca na 280 nm i 320 nM (TidasE, J&M Analytik) i koncentracija proteina u mg/mL je izračunavana prema sledećoj jednačini:

cprotein = (OD280 – OD320) x 0.64 mg/ml

[0129] Kao blanko je korišćen odgovarajući pufer. Analiza je izvedena u tri ponavljanja i od rezultata je izračunata srednja vrednost.

Primer 1: Analiza taloženja

[0130] Proizvodnja FcR proteina pomoću postupka na bazi ponovnog savijanja uobičajeno obuhvata korak taloženja amonijum sulfatom. Dodavanjem kosmotropnog amonijum sulfata talože se sporedni proizvodi savijanja kao što su nesavijene ili pogrešno savijene vrste, ali takođe i nečitoće poreklom od ćelije domaćina kao što su komponente ćelijskog zida i proteini. Sa rastućom koncentracijom precipitanta efikasnost taloženja će biti povećana i stoga se dobija visoko prečišćeni FcR preparat sve dok je FcR varijanta otporna na taloženje na takvim visokim koncentracijama amonijum sulfata. Prema tome, poželjno je imati FcR varijantu koja je visoko rastvorljiva na koncentracijama amonijum sulfata jednakim ili većim od 1.5 M. Pored neposrednog taloženja nečistoća, visoke koncentracije amonijum sulfata će olakšati vezivanje za HIC smolu. Kako je visok dinamički kapacitet vezivanja uvek ključno ciljno mesto razvoja za korak hvatanja u hromatografiji, rastvorljivost u prisustvu visokih koncentracija amonijum sulfata je obavezna.

[0131] U cilju procene rastvorljivosti FcR varijanti u prisustvu amonijum sulfata svaka varijanta je inkubirana sa rastućim koncentracijama amonijum sulfata na pH 6 do 8. Posle 1 časa na 25°C koncentracija FcR u supernatantu je određena pomoću UV/vis spektroskopije. Kao što je prikazano na Slici 2 varijanta 3 je najotpornija na taloženje amonijum sulfatom sa polovinom maksimalnog taloženja na 2.05 M do 2.13 M (NH4)2SO4. Nasuprot tome, "varijanta 2" (SEQ ID NO: 8) i "varijanta 4" (SEQ ID NO: 9) su manje rastvorljive na visokim koncentracijama amonijum sulfata, pokazujući polovinu maksimalnog taloženja na koncentracijama (NH4)2SO4u opsegu 1.70 M - 1.76 M. Ipak, "varijanta 4" je još uvek rastvorljiva na visokoj koncentraciji amonijum sulfata. Zavisnost rastvorljivosti od pH je bila za sve varijante FcR zanemarljiva.

[0132] Treba napomenuti da nije moguće izvesti analizu taloženja i, na taj način, odrediti rastvorljivost "varijante 1" u visokim koncentracijama amonijum sulfata, s obzirom na to da se "varijanta 1" ne savija ponovo dovoljno i, prema tome, ne može se dobiti rastvorljivi protein za analizu taloženja.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein prema SEQ ID No: 1.

2. Vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1.

3. Protein dobijen ekspresijom sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili vektora prema patentnom zahtevu 2 u ćeliji domaćinu.

4. Protein prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što ćelija domaćin je prokariotska ćelija domaćin.

5. Protein prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačen time što ćelija domaćin je E. coli.

6. Protein koji je kodiran sekvencom nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 6.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži protein prema patentnom zahtevu 3 ili 4.

8. Kompozicija materije koja sadrži protein prema SEQ ID No: 2 i/ili 3.

9. Kompozicija materije prema patentnom zahtevu 8 koja dalje sadrži protein prema SEQ ID No. 4 i/ili 5.

10. Kompozicija materije prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačena time što je količina proteina prema SEQ ID No: 2 veća od količine proteina prema SEQ ID No: 3.

11. Kompozicija materije prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 10, naznačena time što je količina proteina prema SEQ ID No: 2 i 3 veća od količine proteina prema SEQ ID No: 4 i/ili 5.

12. Ćelija domaćin koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili vektor prema patentnom zahtevu 2.

13. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 12, koja je prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin.

14. Prokariotska ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 13, koja je E. coli, poželjno E. coli BL21.

15. Postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koji sadrži kultivaciju ćelije domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 14 pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju kodiranog proteina, i izolaciju dobijene farmaceutske kompozicije.