KR20150122621A - Fc 감마 수용체 IIB 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열 번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열; 상기 염기서열을 포함하는 벡터와 상기 염기서열 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 염기서열 또는 벡터의 숙주세포내 발현에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화된 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 약학 조성물 및 그 제조방법을 포함한다.

Description

Fc 감마 수용체 IIB 변이체{Fc GAMMA RECEPTOR IIB VARIANTS}

본 발명은 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열; 상기 염기서열을 포함하는 벡터; 및 상기 염기서열 또는 상기벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 숙주 세포에서 상기 염기서열 또는 상기 벡터의 발현을 통해 수득되거나 수득 가능한 단백질에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 약학 조성물 및 그 제조 방법을 더 포함한다. 본 발명은 또한 서열번호 2 및/또는 서열번호 3에 따른 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 서열번호 4 및/또는 서열번호 5의 단백질을 더 포함할 수 있다.

Fc 수용체(Fc receptors; FcRs)의 패밀리에 속하는 FcγRs은 감염에 대한 인체 방어에 있어서 중요하다. 일반적으로, 활성 FcγRs 및 억제 FcγRs로 구별된다. 인간에 있어서 세가지 주요 FcγRs로는, 단량체 IgG에 결합할 수 있는 FcγRI 그리고, 항체 및 항원으로 구성된 다가면역복합체(ICs)에 결합하는 FcγRII 및 FcγRIII가 있다(Takai, T. Nature Reviews Immunology 2002: 580-592). FcγRs에 의해 개시되는 효과기 작용은, 발현된 FcR 유형 및 관련된 단백질, 병원체 및 항원표출(antigen presentation)의 중화반응에 대한 엔도사이토시스(endocytosis), 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 매개체의 분비물 또는 항체 생성물의 조절에 의해 좌우된다(Fridman et al. Immunol Rev. 1992125:49-76, van de Winkel and Capel Immunol Today. 1993: 14(5):215-21).

WO 00/32767에는 수용체의 세포 외 부분으로만 구성되며, 당화되지 않은 가용성 Fc 수용체(FcRs)가 기재되어 있다. 트렌스멤브레인 도메인(transmembrane domain) 또는 신호 펩타이드가 결여되어 있기 때문에, 이들 단백질은 가용성 형태로 존재하며, 세포에 결합하지 않는다. 또한, WO 00/32767에는 FcRs는 재조합 생성될 수 있으며, 항체의 Fc 부분에 결합하는 능력으로 인해 면역시스템의 다른 구성성분의 간섭 없이 자가면역질환 치료에 유용함이 기재되어 있다. WO 00/32767은 또한, 특정 FcRs의 결정구조 및 이러한 결정구조의 도움으로 IgG의 FcRs와의 간섭을 억제하는 물질을 찾을 가능성을 기재하고 있다. 상기 결정구조는 유용한 컴퓨터 시스템을 사용한 데이터베이스 스크리닝를 통해 특정 억제제를 찾게 할 수 있음이 설명되어 있다. WO 03/043648 발명은 WO 00/32767의 결과보다 더욱 발전한 정의를 내리며, 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus; SLE) 및 류마티스관절염(rheumatoid arthritis; RA) 및 향상된 수준의 NK세포(naural killer cells)에 의한 질병 등의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 수용체는 원핵생물에서 재조합 생성되며, 비당화(unglycosylated)되어있다. WO 03/043648의 발명에서는 비당화 단백질이 난용성일 것으로 예상되지만, 상기 수용체가 고농도의 FcγR에 의해 가용성 형태로 정제될 수 있음을 발견하였다. WO 03/043648 및 다른 공개 문서에서 FcRs가 면역 시스템의 방어반응에 관련한 중요한 역할을 한다고 개시되어 있다.

Fc 수용체는 면역 시스템에서 면역반응의 강도 및 정도를 조절하는 중요한 역할을 한다. 특히 FcγR과 경쟁하는, 병원성 면역 복합체의 면역 세포에 발현된 FcγR에 맞서는 특정 가용성(즉, Fc 감마 수용체 IIB의 세포 외 부분) Fc 감마 수용체 IIB(sFcγRIIB)는 자가면역질환의 치료에 효용이 있는 것으로 밝혀졌다.

자가면역 질환에서 발생하는 면역 반응 초기 단계에서의 간섭은 염증 및 조직 파괴의 결과를 초래하는 연쇄반응의 개시를 예방할 수 있다. 특히, sFcγRIIB는 일차 면역성 혈소판 감소증(Immune Thrombocytopenia; ITP) 및 전신 홍반성 루프스(Systemic Lupus Erythematosus; SLE) 적응증에 대한 제2상 임상시험 중에 있다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 임상시험의 생물학적 시료인, sFcγRIIB는 정제 공정에서 고순도 및 안정성과 같은 제조생산 및 품질관리 제어(CMC) 특성을 가지는 가급적 우수한 화학물질이 바람직하다.

이와 같이, 본 발명의 목적은 향상된 CMC 특성을 가지는 인간 FcγRIIB 단백질을 제공하는 것이다. 상기 목적은 구현예를 통하여 해결되며 본원에 기재된 청구항에 반영되고, 도면 및 실시예를 통하여 설명하였다.

본 발명에 기재된 바와 같이, 이러한 단백질은 1.5M 이상의 황산암모늄 농도에서 가용성이 좋아짐에 따라, 더 높은 수준의 단백질 정제를 할 수 있음을 보여주고 있다. 많은 정제 방식 중 하나인 황산암모늄 침전법은 많은 양의 오염된 단백질 제거에 유용하다. 높은 황산암모늄 농도는 고순도 단백질을 목표로 할 때 좋지만, 황산암모늄의 높은 이온 강도 때문에 단백질에 더 많은 스트레스가 가해진다. 그러므로, 많은 스트레스 내성 단백질은 더 높은 황산암모늄 농도를 적용할 수 있으며, 따라서 단백질의 순도를 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 코스모트로픽 황산 암모늄(kosmotropic ammonium sulfate)의 첨가에 의해, 언폴딩 및 미스폴딩된 형태의 부산물 뿐만 아니라 세포벽 성분과 같은 숙주세포 유래의 불순물 및 단백질이 침전된다. 침전제 농도가 증가함에 따라 침전율은 증가할 수 있으며, 그러므로 고농도 황산암모늄에 특정 단백질이 침전 내성을 나타내는 동안 고순도 단백질 물질을 얻을 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 기재된 FcR 단백질은 1.5M 이상의 황산암모늄 농도에서 높은 가용성을 가지는 것을 알 수 있다. 종래 기술의 FcR 단백질은 예시에서 보여주는 바와 다르게 작용되었으며, 본 발명에 따른 FcR 단백질과 같은 작용 및 특성을 갖는 FcR 단백질 변형 방법이 가능하다는 어떠한 언급도 없었기 때문에 예측 불가한 것이다. 본 발명자들은 본 발명에 기재된 단백질이 실제로 고농도 황산암모늄에 저항하는 것을 발견함에 따라, WO 00/32767 또는 WO 03/043648에 기재된 FcγRIIB 단백질과 같은 종래 기술에 비교하여 향상된 정제법을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 단백질을 암호화(encoding)하는 염기서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 9의 단백질을 암호화하는 염기서열을 제공한다. 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 서열번호 6의 염기서열을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 9의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열 또는 숙주 세포, 바람직하게는 원핵 숙주세포, 더욱 바람직하게는 대장균(E. coli) 내(內) 본 발명의 벡터의 발현에 의해 수득 되거나, 수득 가능한 단백질에 관한 것이다.

더하여, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열 또는 숙주 세포 내 본 발명의 벡터 또는 서열번호 6에 의해 암호화되는 단백질의 발현에 의해 수득되거나, 수득 가능한 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 및/또는 3의 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학 조성물이다.

일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 서열번호 4 및/또는 5의 단백질을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학 조성물이다.

다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 서열번호 3의 단백질보다 많은 양의 서열번호 2의 단백질을 포함한다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 서열번호 3의 단백질보다 많은 양의 서열번호 2의 단백질을 포함하며, 서열번호 4 및/또는 5의 단백질보다 많은 양의 서열번호 2 및 서열번호 3의 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 서열번호 9의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학 조성물이다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 숙주세포 또는 청구항 1의 염기서열을 포함하는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 9의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 숙주세포 또는 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 9의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.

일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 상기 숙주세포는 원핵 또는 진핵 숙주세포이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 원핵 숙주세포는 대장균(E.coli), 바람직하게는 BL21(DE3)과 같은 E.coli BL21이다.

본 발명은 또한, 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 숙주세포 배양을 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법 및 획득한 약학 조성물의 수득 방법에 관한 것이다.

도 1a는 인간 sFcγRIIB(PDB 엔트리:2FCB) 결정 구조를 나타낸다. 모든 sFcR 변이체 검사에서 동일한 본 연구의 변이체 염기서열(서열번호 7)로 대표되는 불변 중심 구조는 짙은 회색, IgG 결합에 대해 중요한 루프는 밝은 회색 그리고, N- 및 C- 말단 확장(terminal extension)은 검은색으로 나타내었다. 두 개의 이황화 결합은 공-막대형으로 표시하였다. 모든 변이체 검사에서의 중심 구조 특성은 도 1b의 염기서열 정렬에서 분명히 나타났다.
도 1b는 본 실험에 사용된 sFcR 변이체 1-4(이하 "var"이라 함)의 염기서열 정렬을 나타낸다.
도 2는 FcR 침전검사 결과를 나타낸다. FcR 변이체 1-4를 기재된 pH 및 황산암모늄 농도로 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 원심분리 후 상등액 내의 FcR 함량을 OD₂₈₀에서 측정하였고, 황산암모늄 농도법으로 분리하였다.

본 명세서에 사용된 서열의 개요는 다음과 같다:

서열번호 1 ("변이체3"으로 약칭함.)

MAPPKAVLKL EPQWINVLQE DSVTLTCRGT HSPESDSIQW FHNGNLIPTH TQPSYRFKAN

NNDSGEYTCQ TGQTSLSDPV HLTVLSEWLV LQTPHLEFQE GETIVLRCHS WKDKPLVKVT

FFQNGKSKKF SRSDPNFSIP QANHSHSGDY HCTGNIGYTL YSSKPVTITV QAPSSSP

서열번호 2

APPKAVLKLE PQWINVLQED SVTLTCRGTH SPESDSIQWF HNGNLIPTHT QPSYRFKANN

NDSGEYTCQT GQTSLSDPVH LTVLSEWLVL QTPHLEFQEG ETIVLRCHSW KDKPLVKVTF

FQNGKSKKFS RSDPNFSIPQ ANHSHSGDYH CTGNIGYTLY SSKPVTITVQ APSSSP

서열번호 3

PPKAVLKLEP QWINVLQEDS VTLTCRGTHS PESDSIQWFH NGNLIPTHTQ PSYRFKANNN

DSGEYTCQTG QTSLSDPVHL TVLSEWLVLQ TPHLEFQEGE TIVLRCHSWK DKPLVKVTFF

QNGKSKKFSR SDPNFSIPQA NHSHSGDYHC TGNIGYTLYS SKPVTITVQA PSSSP

서열번호 4

PKAVLKLEPQ WINVLQEDSV TLTCRGTHSP ESDSIQWFHN GNLIPTHTQP SYRFKANNND

SGEYTCQTGQ TSLSDPVHLT VLSEWLVLQT PHLEFQEGET IVLRCHSWKD KPLVKVTFFQ

NGKSKKFSRS DPNFSIPQAN HSHSGDYHCT GNIGYTLYSS KPVTITVQAP SSSP

서열번호 5

AVLKLEPQWI NVLQEDSVTL TCRGTHSPES DSIQWFHNGN LIPTHTQPSY RFKANNNDSG

EYTCQTGQTS LSDPVHLTVL SEWLVLQTPH LEFQEGETIV LRCHSWKDKP LVKVTFFQNG

KSKKFSRSDP NFSIPQANHS HSGDYHCTGN IGYTLYSSKP VTITVQAPSS SP

서열번호 6

atggcaccgc cgaaagcagt tctgaaactg gaaccgcagt ggattaacgt tctgcaggaa

gatagcgtta ccctgacctg tcgtggcacc catagcccgg aaagcgatag cattcagtgg

tttcacaacg gcaatctgat tccgacccat acccagccga gctatcgttt taaagcgaac

aacaacgata gcggcgaata tacctgtcag accggtcaga ccagcctgag cgatccggtt

catctgaccg ttctgagcga atggctggtt ctgcagaccc cgcatctgga atttcaggaa

ggcgaaacca ttgttctgcg ttgccacagc tggaaagata aaccgctggt taaagttacc

ttcttccaga acggcaaaag caaaaaattc agccgtagcg atccgaattt tagcattccg

caggcgaatc atagccatag cggcgattat cattgtaccg gcaacattgg ctataccctg

tatagcagca aaccggtgac cattaccgtt caggcgccga gcagcagccc gtaa

서열번호 7 ("변이체 1"로 약칭함. 이 서열은 WO 03/043648에 서열번호 1로 기재되어 있음.)

MAVLKLEPQW INVLQEDSVT LTCRGTHSPE SDSIQWFHNG NLIPTHTQPS YRFKANNNDS

GEYTCQTGQT SLSDPVHLTV LSEWLVLQTP HLEFQEGETI VLRCHSWKDK PLVKVTFFQN

GKSKKFSRSD PNFSIPQANH SHSGDYHCTG NIGYTLYSSK PVTITV

서열번호 8 ("변이체 2"로 약칭함. 이 서열은 WO 00/32767에 서열번호 3으로 기재되어 있음.)

MGTPAAPPKA VLKLEPQWIN VLQEDSVTLT CRGTHSPESD SIQWFHNGNL IPTHTQPSYR

FKANNNDSGE YTCQTGQTSL SDPVHLTVLS EWLVLQTPHL EFQEGETIVL RCHSWKDKPL

VKVTFFQNGK SKKFSRSDPN FSIPQANHSH SGDYHCTGNI GYTLYSSKPV TITVQAPSSS

PMGII

서열번호 9 ("변이체 4"로 약칭함.)

MTPAAPPKAV LKLEPQWINV LQEDSVTLTC RGTHSPESDS IQWFHNGNLI PTHTQPSYRF

KANNNDSGEY TCQTGQTSLS DPVHLTVLSE WLVLQTPHLE FQEGETIVLR CHSWKDKPLV

KVTFFQNGKS KKFSRSDPNF SIPQANHSHS GDYHCTGNIG YTLYSSKPVT ITVQAPSSSP

MGI

본 발명에서 사용한 단수형의 "하나(의)" 표현은 문맥상 명확히 다르게 언급하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "하나의 시약"이라는 표현은 하나 또는 다른 시약들과 함께 그 이상을 포함하고, "하나의 방법"이라는 표현은 본 발명에 기재된 변형 또는 대체할 수 있는 동등한 단계 및 당업자에게 공지된 방법을 포함한다.

모든 간행물 및 특허는 그 전체가 참조로서 포함되어 본 명세서에 인용된다. 참조로 포함되는 물질이 본 명세서에 모순되거나 부합하지 않는 경우, 부합하는 물질로 대체한다.

달리 언급하지 않는 한, 용어 "적어도" 전술한 일련의 요소는 모든 일련의 요소를 참조하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 기재된 특정 실시예와 동등한, 통상의 기술자가 알아낼 수 있거나, 통상의 실험만을 통해 도출할 수 있는 많은 등가물이 본원 발명에 포함되는 것을 의미한다.

문맥에 따라 달리 해석되지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에 포함되는 다음의 용어 "포함하는"은 언급한 정수 또는 단계를 포함하거나 정수 또는 단계의 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 정수 또는 단계의 그룹을 제외하는 것은 아니다. 본 명세서의 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "가지는"으로 대체하여 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "구성되는"은 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 구성요소를 제외하는 것을 의미한다. 또한, "필수적으로 구성되는"은 청구항의 신규한 특성 및 근본에 실질적인 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.

본 명세서에 기재된 "포함하는", "필수적으로 구성되는" 및 "구성되는" 각각의 용어는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.

본 명세서의 본문에는 몇 가지 문서들이 인용되었다. 본 명세서에 인용된 각각의 문서(모든 특허, 출원특허, 과학 간행물, 제조명세서, 설명서 등)들은, 특정 범위 내이든 밖이든, 그 전체가 참조로 인용된다. 본 명세서에서는 어떤 것도 선행 발명의 자격이 있는 것으로 인정되지 않는다.

일 태양에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드 서열" 또는 "염기서열"은 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic) DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA 및 RNA 분자의 조합 또는 DNA/RNA 하이브리드 분자 및 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 상기 유사체는 예를 들어, 이노신 또는 트리틸화 염기를을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 유사체는 분자에 핵산가수분해효소(nucleases) 저항 또는 세포막 통과 능력 증가와 같은 유익한 도움을 주는 변형된 구조(backbone)를 함유하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다.

상기 핵산 또는 염기서열은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 단일가닥 및 이중가닥 부분을 모두 포함할 수 있으며, 삼중가닥 부분을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 이중가닥 DNA일 수 있다.

DNA 및 RNA에는 다양한 변형이 가해질 수 있다; 그러므로, 용어 "핵산 분자" 또는 "염기서열"은 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태를 수용한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산분자 또는 염기서열은 번역 후(post-translation) 또는 전사 후(post-transcription) 변형될 수 있다.

본 발명의 염기서열은 서열번호 1의 단백질을 암호화한다. 서열번호 1로 암호화된 폴리펩타이드 서열은 번역 후 또는 전사 후 변형 과정에 의해 수정될 수 있으며, 서열번호 1로 암호화되는 폴리펩타이드를 발현하는 숙주세포에 의해 좌우된다.

본 명세서에 사용된 "서열번호 X의 단백질"은 표시된 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 기재된 서열번호 X를 의미하고, 상기 X는 1, 2, 3, 4, 5 또는 9를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미하며 대체하여 사용이 가능하다. 그리고 소정 길이의 아미노산 사슬을 포함하며, 상기 아미노산 잔기는 펩타이드 공유결합에 의해 결합되어 있다. 그러나, 아미노산 및/또는 펩타이드 결합에 의한 단백질/펩타이드와 같은 펩티도미메틱(peptidomimetics)은 기능적 유사체로서 대체되며, 셀레노시스테인과 같은 20개의 유전자로 암호화된 아미노산 등으로 본 발명에 또한 포함된다. 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질은 폴리펩타이드로 기재될 수 있다. 상기와 같은 용어 폴리펩타이드 및 단백질은 본 명세서에서 대체 가능하게 사용될 수 있다.

상기 용어 폴리펩타이드는 또한, 폴리펩타이드의 변형(modifications)과 관련 있으며 이를 배제하는 것은 아니다. 상기 모디피케이션은 글리코실화(glycosylation), 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), 인산화(phosphorylation), ADP-리보실화(ADP-ribosylation), 아미드화(amidation), 플라빈(flavin) 공유결합, 헴부분(heme moiety) 공유결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 공유결합, 지질 또는 지질 유도체 공유결합, 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) 공유결합, 가교(cross-links), 고리화(cyclization), 이황화결합 형성, 탈메틸화(demethylation), 공유결합 가교 형성, 시스테인(cysteine) 형성, 피로글루타메이트(pyroglutamate) 형성, 제형화, 감마-카르복시화(gamma-carboxylation), GPI 앵커(GPI anchor) 형성, 히드록시화(hydroxylation), 요오드화(iodination), 메틸화(methylation), 미리스토일화(myristoylation), 산화, 페길레이션(pegylation), 단백질 가수분해 처리, 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 셀레노일화(selenoylation), 황산화, 아르기닐화와 같은 전이-RNA(transfer-RNA)에 의한 단백질에 대한 아마노산의 추가 및 유비퀴틴화(ubiquitination)를 포함한다. 예를 들어, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2판, T.E. 크레이턴, W.H. Freeman and Company, 뉴욕(1993); POST-TRANSLATION AL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. 존슨, Academic Press, 뉴욕(1992); 48-62 를 참조할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 9에 나타난다. 아울러, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 9로 표시되는 단백질을 제공한다.

용어 "발현" 또는 "염기서열의 발현"은 특정 핵산 또는 특정 유전자 구조의 전사를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "핵산 발현"은 특히, 서열번호 1의 핵산을 포함하는 염기서열 또는 벡터와 같은 유전자 구조의 mRNA 또는 구조 RNA(rRNA, tRNA)로의 전사를 의미한다. 상기 mRNA 또는 구조 RNA(rRNA, tRNA)는 단백질로의 후속 전사를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 번역된다. 공정은 DNA의 전사 및 최종 mRNA 산물의 처리를 포함한다. mRNA는 궁극적으로 최종 폴리펩타이드/단백질로 접혀 폴리펩타이드 사슬로 번역될 수 있다. 단백질 발현은 특정 세포 또는 조직에서 하나 이상의 단백질의 양 및 존재의 측정을 나타내기 위해 단백질체학 연구자에 의해 일반적으로 사용된다. 세포의 단백질 발현은 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역조직화학법(immunohistochemistry) 또는 웨스턴블랏 분석법을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 본원 발명의 핵산을 포함하는 벡터의 세포 형질전환(transfection)을 형질전환되지 않은 세포와의 비교를 통하여 결과를 평가하였다. (숙주)세포의 발현은 염색법을 통하여 나타내었다. 예를 들어, 같은 조건에서 대조군 세포(감염되지 않은 세포)와 비교 하였을 때 강한 발색은 발현의 증가를 의미한다. 또한, mRNA 발현은 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다. 당업계에서 통상의 기술자는 세포의 특정 단백질 또는 mRNA의 발현을 확인하는 방법으로 다른 기술을 대체할 수 있다. 또한, 예상 단백질은 전사 후 또는 번역 후 변형에 의해 수득될 수 있다.

폴리펩타이드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된 폴리펩타이드를 포함하고, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드에 비하여 보존적으로 치환될 수 있다. 그리고, 상기 변이체는 항체(FcγR 결합 참조) 및 림프구의 Fc 부분에 결합하는 것이 바람직하다. 이러한 변이체는 당업계의 일반적인 공지에 따라 선택된 탈락(deletion), 삽입(insertion), 역위(inversion), 반복(repeat) 및 치환(substitution)을 포함한다. 예를 들어, 표현형 잠재 아미노산 치환(phenotypically silent amino acid substitutions) 방법에 관한 지침이 보위, science 247: (1990) 1306-1310에 기재되어 있으며, 저자는 아미노산 서열을 변형하기 위한 내성 연구에 대한 두 가지 전략을 개시하였다. FcγRIIB의 바람직한 변이체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 9 에 개시하였으며, 가장 바람직한 FcγRIIB는 서열번호 1에 개시하였다.

본 명세서에 사용된 용어 "Fc 감마 수용체"는 "FcgR" 또는 "Fcγ 수용체" 또는 "FcγR"로 대체할 수 있으며, 막질 FcγRs 및 가용성 FcγRs(Fcγ 수용체의 세포 외 부분) 모두를 포함한다. Fc 감마 수용체는 단백질의 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하며, 많은 조혈계통에서 발견된다. 이름에서 알 수 있듯이, Fc 수용체는 항체의 Fc(파편, 결정화) 부분을 인식하고 결합한다. 즉, 항체의 양 중쇄의 두개의 C-말단 도메인과 일치하며, 일반적으로 이펙터 분자(effector molecule) 및 세포와 상호작용한다.

바람직하게는, 서열번호 1의 단백질은 가용성 FcγR이다. 마찬가지로, 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 9에 따른 단백질은 가용성 FcγR이다. 또한 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 9에 따른 단백질은 수성 용액과 같은, 적합한 용액에 가용성인 것이 바람직하다.

FcγRs는 IgG 항체를 인식한다. 상기 IgG는 혈청에서 풍부한 순으로 명명된(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 . IgG1은 가장 풍부한 IgG 유형) 네 가지 하위분류로 인간에 존재한다. 또한, 인간에게는 3 분류의 Fcγ가 존재한다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIIIA(CD16). 또한, FcγRs는 예를 들어, 유사하지만 동일하지 않은 아미노산 서열을 가지는, 기능적으로 유사한 Fc 감마 수용체와 같은 다양한 아이소폼(isoform)이 존재한다. 상기 아이소폼은 FcγRIA, B1, B2, C; FcγRIIA1-2, B1-3, C 및 더 나아가, 각각의 대립형질(FcγRIIa1-HR, -LR; FcγRIIIb-NA1, -NA2)(van de Winkel and Capel, Immunol. Today)을 포함한다. FcγR의 다른 분류 및 아이소폼은 IgG 및 특히 다른 IgG 하위분류에 대한 유사성이 다를 수 있다. 일반적으로, FcγR는 타입 I 트랜스맴브레인 단백질 또는 가용성 형태로서 나타나지만, 또한 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol) 고정 형태의 FcγRIII(FcγRIIIB)로 존재한다.

"가용성 FcγRs"는 "sFcγRs"로도 기재된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "가용성 Fcγ 수용체" 및 유사체 용어는 Fcγ 수용체의 세포외 부분을 나타낸다. 이러한 세포 외 부분은 용액에 용해될 수 있다. 일반적으로, 특정 Fcγ 분류, 아이소폼 또는 대립유전자(allele)의 가용성 형태는 앞의 "s"에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, sCD32 또는 sFcγRII는 가용성 Fc 감마 RII 수용체를 나타낸다. 일반적으로, 막질(막 결합) FcγR과는 대조적으로, 가용성 FcγR은 막관통 영역(transmembrane region) 또는 세포질 내 꼬리(intracytoplasmatic tail)를 포함하지 않는다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 FcγR는 인간 기원 또는 인간 FcγR이다. 용어 "인간 기원의"는 넓은 의미로 이해되어야 한다. 일반적으로, FcγR(또는 영역 또는 그 단편)는 아미노산 서열 및/또는 구조의 관점에서 인간 FcγR(인체에서 발견되는 단백질)와 유사하거나 닮은 것을 의미한다.

그렇지 않으면, "인간 기원의" FcγR는 예를 들어, Sondermann and Jacob(1999), Bioll, Chem. 380(6), 717-721에 기재된 바와 같이, 숙주세포에서 재조합 핵산의 발현에 의해 수득된 재조합 FcγR일 수 있다. 간단히 하면, 유기체로부터 관심 유전자가 수득되고 벡터에 도입된다. 상기 백터는 재조합 유전자를 발현하고 재조합 단백질을 생성하는 숙주세포로 유전자를 전달하는데 사용되는 플라스미드 또는 바이러스일 수 있다. 당업자는 FcγR을 획득하기 위한(예를 들어, 약학 조성물의 제조에 적합한) 숙주세포를 용이하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 비당화 FcγR가 바람직할 수 있다. 당업자는 FcγR의 발현을 위해 원핵 숙주세포를 선택할 수 있으며, 상기 숙주세포는 단백질 당화를 위해 필요한 효소 기작이 결여되어 있다. WO 00/32767의 기재에 따르면, 일 실시예에서 FcγRs는 원핵생물에서 발현될 수 있으며, 그 후 정제 및 재폴딩될 수 있다.

다른 실시예에서 FcγRs는 진핵세포 발현 시스템에서 용이하고 저렴하게 고순도로 제조될 수 있다. 유용한 시스템으로는 세포 외 단백질의 제조를 위한 특수기관을 갖는 진핵세포(예를 들어, B cell)가 있다. 다른 사용 가능한 진핵세포 발현 시스템으로 CHO 세포 또는 HEK 세포가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 가용성 FcγR은 또한 재조합, 수용성 및 당화된 FcγR을 의미할 수 있다.

본 발명에 사용된 FcγRs은 야생형 FcγR와 비교하여 수정 또는 변경된(예를 들어, 추가적으로 당화된 부분 또는 그와 유사한) 아미노산 서열의 FcγR을 더 포함한다. 그러나, FcγRs의 비당화 형태 또한 예측될 수 있으며, FcγRs의 비당화 형태는 FcγR의 바람직한 실시예이다.

본 발명의 Fcγ 수용체는 서열번호 1(SM101의 아미노산 서열, 본 발명의 변이체 3)에 나타나는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 FcγR는 서열번호 6(SM101를 암호화하는 염기서열, 본 발명의 변이체 3)에 따른 적어도 하나의 염기서열에 의해서 암호화 된다. 상기 서열은 재조합 발현에 의해 해당 FcγR를 생산하는 발현 벡터에서 복제될 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 또는 통상적으로 유전 공학에서 사용되는 다른 벡터일 수 있다.

또한, 상기 벡터는 적정 환경 및 적정 숙주세포에서 벡터의 선택 및/또는 복제를 가능하게 하는 마커 유전자와 같은 추가의 유전자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 상기 발현 벡터는 본 발명의 핵산분자와 영향력 있게 결합되어 있으며, 본 발명에 기재된 바와 같이, 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 발현을 허용하는 조절 서열(control sequence)을 발현시킨다. 상기 "영향력 있게 결합된"은 발현 조절 서열과 호환되는 조건에서 이루어지는 발현 방법에 의해 발현된 폴리뉴클레오티드에서의 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열과 암호화 영역 간의 결합을 의미한다.

본 발명의 핵산분자는 여러 통상적으로 사용 가능한 벡터에 삽입될 수 있다. 비제한적인 예로는, pUC, pBluescript(stratagene), pET(novagen), pREP(invitrogen), pCRTopo(Invitrogen), pcDNA3(Invitrogen), pCEP4(Invitrogen), pMCl neo(Stratagene), pXTl(Stratagene), pSG5(Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, plZD35, pLXIN, pSIR(Clontech) 및 pIRES-EGFP(Clontech)와 같은 포유류 세포와 호환 가능한 플라스미드 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 핵산분자는 T7-프로모터를 유도할 수 있는 IPTG의 조절 하에 "pET" 벡터에 삽입된다. pBlueBac, BacPacz 베큘로바이러스 발현 시스템(CLONTECH) 및 MaxBacTM 베큘로바이러스 발현 시스템과 같은 베큘로바이러스(baculovirus) 벡터, 곤충세포 및 실험방법(Invitrogen)은 상업적으로 사용 가능하며, 또한 생리활성 단백질의 고수율 생산에 사용될 수 있다(밀러(1993), Curr. Op. Genet. Dev., 3, 9; O'Reilly, Baculovirus Vectors: A Laboratory Manual, p. 127 참조). 또한, 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 벡터의 비제한적 예로서 pcDNA2와 같은 원핵세포 벡터 및 pYes2와 같은 이스트벡터를 들 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 발현 벡터는 Invitrogen 사의 DES2-시리즈와 같은 당업계에 공지된 초파리 세포(Drosophila cells)에서의 단백질 발현을 위한 것들이다. 바람직하게는, 상기 초파리 세포 발현 벡터는 pMTBiP/V5-His B(Invitrogen)이다. pMT/BiP/V5-His 벡터는 다음의 추가 기능을 제공한다. 상기 pMT/BiP/V5-His 벡터는 DNA 수율을 개선시키고, 서브클로닝 효율을 증가시키는 작은 크기(3.6kb)이다. 상기 pMT/BiP/V5-His 벡터는 anti-V5 항체를 이용한 빠른 검출을 위하여 C-terminal V5 epitope 태그를 가지며, 니켈 킬레이팅 수지를 사용한 재조합 융합 단백질의 간단한 정제를 하기 위하여 C-terminal 6xHis 태그를 갖는다.

벡터 모디피케이션 기술에 대해서는 샘브룩과 러셀(2001) (상기 인용문헌)을 참조한다. 벡터는 클로닝 또는 발현을 위한, 하나 또는 그 이상의 자가 복제 또는 유전 시스템, 숙주에서 하나 또는 그 이상의 항생제 저항성과 같은 선택 마커, 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 가질 수 있다.

벡터에 삽입되는 암호화 서열은 표준 방법에 의해서 합성되었거나, 천연 근원으로부터 분리되었거나, 잡종으로 준비될 수 있다. 전사조절인자(프로모터, 인핸서(enhancers) 및/또는 절연인자(insulators)) 및/또는 다른 아미노산 암호화 서열과 암호화 서열간의 라이게이션은 확립된 방법을 이용하여 이루어질 수 있다.

또한, 상기 벡터는 본 발명의 염기서열뿐만 아니라, 발현 조절인자를 포함하고, 적합한 숙주에서 암호화 영역의 적절한 발현을 허용한다. 상기 조절인자는 당업자에게 공지되어 있으며, 프로모터, 번역개시코돈, 번역 및 삽입 영역 또는 벡터로의 삽입을 유인하기 위한 내부 리보솜 유입점(IRES)(Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산분자는 진핵세포 또는 원핵세포에서 발현을 허용하는 발현 조절 서열에 영향력 있게 결합된다.

진핵세포 및 원핵세포에서 발현하게 하는 조절인자는 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 조절인자는 일반적으로 전사를 개시하게 하는 조절서열 및 선택적으로 전사를 종결하게 하는 poly-A 신호를 포함한다. 또한, 조절인자는 전사뿐만 아니라, 번역 인헨서(translational enhancer) 및/또는 자연적인 결합(naturally-associate) 또는 이종의 프로모터 영역(heterologous promoter region)을 포함할 수 있다. 포유류 숙주세포 등에서의 발현을 허용하는 적절한 조절인자에는 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터(CMV-HSV thymidine kinase promoter), SV40, RSV-프로모터(라우스살콤 바이러스), 인간연장인자 1 알파-프로모터(human elongation factor 1 alpha-promoter), CMV 인헨서, CaM-키나아제 프로모터 또는 SV40-인헨서가 포함된다.

원핵세포에서의 발현을 위한 다양한 프로모터에는 tac-lac 프로모터, lacUV5 또는 trp 프로모터 등이 포함된다. 게다가, 인자(elements)로서는 전사 개시를 담당하는 조절인자 뿐만 아니라 SV40-poly-A 영역 또는 tk-poly-A 영역과 같은 전사종결신호 및 폴리뉴클레오티드의 다운스트림(downstream)을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 당업자에게 알려진 적합한 벡터로는 오카야마-버그 cDNA 발현 벡터 pcDV1(pharmacia), pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3(In-Vitrogene, 첨부된 예시에서 사용함), pSPORTl(GIBCO BRL) 또는 pGEMHE(Promega)와 또는 람다 gt11과 같은 원핵세포 발현벡터 등이 알려져 있다.

본 발명에 따른 발현벡터는 적어도 본 발명의 핵산 및 단백질의 복제 및 바람직하게는 발현을 지시할 수 있다. 적합한 복제개시점(origin of replication)은 Col E1, 바이러스성 SV40 및 M13 등의 복제개시점을 포함한다. 적합한 프로모터(promoter)는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter), lacZ 프로모터, gal10 프로모터 및 AcMNPV 다면체 프로모터(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus polyhedral promoter)등을 포함한다. 적합한 종결서열(termination sequence)은 소 성장 호르몬, SV40, lacZ 및 AcMNPV 다면체 아데닐산중합반응 신호 등을 포함한다. 선별 마커(selectable marker)의 예로는, 네오마이신, 암피실린 및 하이그로마이신 내성 유전자 및 그와 유사한 것, 바람직하게는 카나마이신 내성 유전자를 포함한다. 특정하게 설계된 벡터는 박테리아-효모, 박테리아-동물세포, 박테리아-균류세포 또는 박테리아-무척추동물 세포와 같이 다른 숙주세포 사이에서 DNA 운반(DNA shuttling)을 허용한다.

벡터는 본 발명의 핵산분자 외에도 분비신호(secretion signal)를 암호화하는 핵산서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 분비신호 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 발현 시스템에 따라 사용되는 세포 구획에 폴리펩타이드 발현을 지시할 수 있는 선도서열(leader sequence)은 본원 발명의 핵산 분자의 암호화 서열에 첨가될 수 있으며, 상기 선도서열은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 선도서열은 번역, 개시 및 종결서열과 적절한 단계에서 조합되며, 바람직하게는 선도서열은 번역된 단백질 또는 그 일부를 세포 외 막으로 분비시키는 지시를 할 수 있다. 선택적으로, 이종서열(heterologous sequence)은 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 상기 융합단백질은 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단수화된 정제와 같은 원하는 특성을 부여하는 C- 또는 N-말단 식별 펩타이드를 포함한다. 상기 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 상기 숙주는 염기 서열의 높은 수준의 발현을 위해 적절한 조건 하에 유지되며, 상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 단백질, 병원성 단편 또는 융합 단백질의 회수 및 정제가 뒤따를 수 있다. 또한, 상기 벡터는 병원성 유기체 유래의 조절 영역 역시 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 벡터는 IPTG-유도성 벡터와 같은 발현벡터를 유도할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 발현벡터 외에도, 유전자 전달, 유전자 표적 벡터 또는 이들의 조합일 수 있다. 엑스-비보(ex-vivo) 또는 인-비보(in-vivo) 기술을 이용하여 치료 유전자를 세포에 도입하는 것(예를 들어, 예방접종)과 같은 유전자 치료(gene therapy)는 유전자 전달의 중요한 적용 중 하나이다. 인-비트로(in-vitro) 또는 인-비보(in-vivo) 유전자 치료를 위한 적합한 벡터, 벡터 시스템 및 방법은 문헌에 기재되어 있으며 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다; 예들 들어, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 or Verma, Nature 389 (1997), 239-242 및 이들의 인용문헌을 참조할 수 있다.

본 발명의 핵산분자 및 상기 벡터는 세포로 직접 도입 또는 리포좀이나 바이러스 벡터(아데노바이러스, 레트로바이러스)를 통한 도입을 위하여 설계될 수 있다. 부가적으로, 베큘로바이러스 시스템 또는, 천연두 바이러스(vaccinia virus)나 셈리키삼림열바이러스(Semliki Forest Virus)는 본 발명의 핵산 분자의 진핵생물 발현 시스템에 사용할 수 있다. 재조합 생성뿐 아니라, 본 발명의 단백질 단편, 융합 단백질 또는 항원 단편은 고체상 방법(solid-phase technique)을 사용하는 직접 펩타이드 합성법에 의해 생성될 수 있다(Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154 참조). 인-비트로 단백질 합성은 수동적 또는 자동적 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성은, 예를 들어, 제조업체에 의해 제공되는 방법에 따라 어플라이드 바이오 시스템즈 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer, Foster City CA)등을 사용하여 이루어질 수 있다. 다양한 단편은 완전구조분자(full length molecule)를 생성하기 위하여, 별도로 화학적 합성될 수 있으며, 화학적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 숙주세포 또는 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

상기 "숙주"는 본 발명의 벡터 또는 염기서열의 숙주세포 도입에 의해 생산될 수 있다. 상기 숙주세포는 본원의 염기서열에 의해 암호화되어 발현되는 단백질 또는 본원 발명의 염기서열 또는 벡터가 세포에 존재하는 것이다. 숙주 세포에 있어서 상기 염기서열 및/또는 암호화된 폴리펩타이드는 이질적이다. 용어 "숙주"는 본 명세서에서 숙주세포를 포함하여 기재될 수 있다.

상기 "이질적"의 의미는 상기 염기서열 및/또는 암호화된 폴리펩타이드가 숙주에 대해 이종인 것을 의미하고, 다른 유전적 배경의 세포 또는 유기체로부터 유래되거나, 숙주에 대해 상동이지만 상기 염기서열에 상응하는 자연적 발생과 비교하여 다른 유전자 환경에 위치하는 것을 의미한다. 이러한 의미는, 상기 염기서열이 숙주에 대해 상동인 경우, 상기 숙주의 유전체에서 자연적 위치에 자리하지 않고 특히, 다른 유전자에 의해 둘러싸여 있는 것을 의미한다. 이러한 경우 염기서열은 자체의 프로모터 조절 하에 또는 이종의 프로모터 조절 하에 있을 수 있다. 도입되는 핵산분자 또는 벡터의 위치는 서던블로팅(Southern Blotting) 등과 같은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 숙주에 존재하는 본 발명에 따른 상기 벡터 또는 염기서열은 숙주의 유전체에 통합되거나, 일부 형태로 염색체 외에 유지될 수 있다. 상기와 같이, 본 발명의 염기서열은 상동 재조합을 통해 유전자 변이를 만들거나 복구하는 데 사용될 수 있음이 또한 이해되어야 한다.

일구현예에 따르면, 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 상기 벡터를 포함하는 상기 숙주세포는 원핵 또는 진핵 숙주세포이다. 바람직하게는 원핵 숙주세포는 E.coli, 더욱 바람직하게는 BL21(DE3)과 같은, E.coli BL21이다.

적절한 상기 원핵/박테리아 세포는 E.coli, 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 또는 고초균(Bacillus subtilis)등의 클로닝에 일반적으로 사용된다. 상기 진핵숙주는 포유류 세포(mammalian cell), 양서류 세포(amphibian cell), 어류 세포(fish cell), 곤충류 세포(insect cell), 진균 세포(fungal cell), 식물 세포(plant cell) 또는 박테리아 세포(예를 들어, HB101, HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 및 JM101의 E.coli 균주)일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 원핵 숙주세포는 E.coli가 가장 적합하다.

진핵숙주세포의 또 다른 예로는, 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포와 같은 효모, 인간, 소, 돼지, 원숭이 및 설치류 기원의 세포주 뿐 아니라 곤충세포를 포함하나 이에 한정되지는 않으며, 도둑나방 곤충세포(Spodoptera frugiperda insect cells) 및 초파리 유래 곤충세포(Drosophila-derived insect cells) 뿐 아니라 제브라피시(zebra fish) 세포를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 사용하기에 적합한 시판 포유류 종 유래 세포주는 L cells, CV-1 cells, COS-1 cells (ATCC CRL 1650), COS-7 cells (ATCC CRL 1651), HeLa cells (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) 및 MRC-5 (ATCC CCL 171)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

상기 초파리 유래 세포는 바람직하게는 드로소필라 발현 시스템(DES®)과 같은, 초파리 발현 시스템에서 이종 단백질 발현을 위해 사용되는 Drosophila S2(ATCC CRL-1963)일 수 있다.

사용하기 적합한 시판 포유류 종 유래 세포주는 L cells, CV-1 cells, COS-1 cells (ATCC CRL 1650), COS-7 cells (ATCC CRL 1651), HeLa cells (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) 및 MRC-5 (ATCC CCL 171)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

더욱 바람직한 구현예에서 상기 양서류 세포는 난모세포(oocyte)이다. 더욱 바람직한 구현예로는 상기 난모세포는 개구리 난모세포이며, 특히 손톱개구리 난모세포(Xenopus laevis oocyte)가 바람직하다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주는 비인간 형질전환유전자 유기체이다. 상기 비인간 유기체는 포유류, 양서류, 어류, 곤충류, 진균류 또는 식물류일 수 있다. 특히, 비인간 형질전환유전자 유기체는 초파리 종(Drosophila species), 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans), 제노푸스 종(Xenopus species), 제브라피시(zebra fish), 두둑나방(Spodoptera frugiperda), 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica), 생쥐 및 쥐(rat)가 바람직하다. 형질전환유전자 식물류는 밀, 담배, 파슬리 및 애기장대(Arabidopsis)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 형질전환유전자 진균류는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그 중에서도 S. pombe 또는 S. cerevisae와 같은 효모 또는 누룩곰팡이(Aspergillus), 붉은 옥수수 곰팡이(Neurospora) 또는 우스틸라고(ustilago) 종 또는 피치아(pichia) 종을 포함한다.

본 발명은 또한 숙주세포에서 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터의 발현에 의해 획득되는 또는 획득 가능한 단백질에 관한 것으로, 상기 숙주세포는 바람직하게는 원핵숙주세포, 더욱 바람직하게는 E.coli, 가장 바람직하게는 E.coli BL21(D3)과 같은 E.coli BL21이다.

본 발명의 핵산분자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 제조방법은 본 발명에 따른 숙주의 배양/성장 및 생성된 폴리펩타이드의 분리를 포함하며 본 명세서에 기재되어 있다.

적합한 숙주에서 폴리펩타이드를 제조하기 위한 많은 종류의 적절한 방법이 당업계에 존재한다. 상기 숙주가 단세포생물 또는 포유류 또는 곤충류 세포인 경우, 통상의 기술자는 작업의 과도한 부담 없이 더욱 최적화할 수 있는 다양한 배양 조건으로 조절할 수 있다. 간단하게는, 생성된 단백질은 확립된 기술에 의해 배양 배지 또는 분리된 (생물학적)봉입체로부터 수득된다. 또한, 상기 생성된 폴리펩타이드는 상기 숙주세포로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 상기 숙주세포는 숙주 유기체의 일부 또는 일부로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 동물 또는 식물의 획득 가능한 부분의 CNS, 피부 등과 같은 세포조직의 일부일 수 있다. 또한, 상기 생성된 폴리펩타이드는 혈액, 유액 또는 뇌척수액과 같은 상기 숙주에서 유래된 유체로부터 분리될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

상기 폴리펩타이드는 미생물학적 방법에 의해 제조되거나, 형질전환 동물에 의해 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 형질전환 식물로부터 회수할 수 있음을 예상할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩타이드는 합성 또는 반합성적으로 제조될 수 있다.

예를 들어, Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135에 기재된 고체상 합성법과 같은 화학적 합성법이 사용될 수 있다. 다른 방법으로는 mRNA의 인-비트로 번역(translation)있다. 바람직한 방법은 전술한 바와 같이, 숙주세포에서 단백질의 재조합 생산을 포함한다. 예를 들어, 상기 본 발명에 따른 염기 서열 중 어느 하나의 부분 또는 전체를 포함하는 염기서열은 PCR방법을 통하여 합성되고, 발현벡터에 삽입되고, 발현벡터에 의해 숙주세포로 형질전환될 수 있다. 그 후, 상기 숙주세포는 원하는 폴리펩타이드를 생산하기 위해 배양되거나, 분리 및 정제된다. 단백질의 분리 및 정제는 몇 가지 공지된 기술 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마로그래피 및 친화성 크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피(HPLC), 역상고속액체크로마토그래피, 제조용 디스크겔전기영동법을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 무세포 번역 시스템(cell-free translation systems)은 본 발명의 폴리펩타이드 생성을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 적절한 무세포 발현 시스템은 토끼 망상적혈구 용해질(rabbit reticulocyte lysate), 밀 배아 추출액(wheat germ extract,), 개 췌장의 마이크로좀 막(canine pancreatic microsomal membranes), E.coli S30 추출물 및 TNT-시스템(Promega)와 같은 동반 전사/번역 시스템을 포함한다. 이러한 시스템에 암호화 영역 및 적합한 프로모터 인자를 포함하는 복제 벡터, DNA 단편 또는 RNA 서열을 부가하여 재조합 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 허용한다. 상술한 바와 같은, 단백질 분리/정제 기술은 통상적인 방법에 의한 본 발명의 단백질 모디피케이션을 요구할 수 있다. 예를 들어, 니켈 컬럼 정제 시 단백질에 히스티딘 태그를 부가할 수 있다. 다른 모디피케이션으로는 더 높거나 더 낮은 활성을 유발하고, 더 높은 단백질 생산을 허용하거나, 단백질의 정제를 단순화할 수 있다. 다른 태그로는 플래그 태그(flag-tag) 또한 포함할 수 있다. 이러한 태그는 바람직하게는 진핵생물 숙주에 사용된다.

본 발명의 단백질은 바람직하게는 본 발명에 기재된 핵산분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가지거나, 본 발명에 기재된 염기서열 발현에 의해 획득되거나 획득 가능하다. 또한, 예를 들어 발현벡터에서, 서열번호 1을 포함하는 상기 벡터는 서열번호 1에 대한 염기서열의 발현에 의해 획득되거나 획득 가능한 단백질의 발현을 달성하기 위해 이용될 수 있다.

예를 들어, E.coli 균주 BL21(DE3)은 서열번호 1의 단백질 발현을 매개하는 데에 이용되거나, 상기 벡터는 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함한다. 예를 들어, T7-프로모터를 유도할 수 있는 IPTG의 조절 하에서 발현을 위한 벡터의 구성은 당업계에 잘 알려져 있다. 전기적격(electrocompetent) E.coli BL21(DE3) 세포는 상기 발현벡터와 같은 플라스미드 DNA로 형질전환될 수 있다. 상기 가공된 세포는 배지에서 배양된다. 배양 후에, 상기 세포는 원심분리에 의해 수득하거나, 초음파 처리 등에 의해 직접 용해될 수 있다. 그리고 상기 현탁액은 원심분리되거나 실시예와 같이 처리될 수 있다. 상기 펠렛 즉, 봉입체는 라이시스 버퍼(lysis buffer)와 같은 버퍼에 재현탁될 수 있다. 그 후 젖은 봉입체는 용해된다. 그 후, 관심 단백질을 원심분리하여 획득하거나, 그 전에 실시예와 같이 재폴딩할 수 있다. 단백질 발현, 세포 분쇄(disruption), 봉입체의 회수 및 봉입체의 재폴딩은 본 발명의 실시예와 같이, 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 일반적으로 수행될 수 있다.

단백질을 정제하기 위한 방법으로는, 용해도의 변화를 통한 단백질 정제 방법으로 황산암모늄 침전법을 포함한다. 이러한 방법은 염석법(salting out)과 같은 일반적인 기술보다 특정한 것이다. 황산암모늄은 그 용해도가 높으므로, 높은 이온강도의 염 용액을 허용할 수 있어 일반적으로 사용된다. 단백질의 용해도는 상기 용액의 이온강도에 따라 달라지므로, 염 농도에 따라 변화한다. 두 가지 뚜렷한 효과가 관찰된다: 낮은 염 농도에서, 단백질의 용해도는 염 농도가 증가함에 따라(이온강도의 증가) 증가하고, 이러한 효과는 염석이라 불린다. 염 농도(이온강도)가 더욱 증가할 때 단백질의 용해도는 감소하기 시작한다. 충분히 높은 이온강도에서 단백질은 용액으로부터 거의 완전히 침전될 수 있다(염석).

단백질의 용해도는 높은 이온강도에서 뚜렷하게 다르기 때문에, 염석법은 특정한 단백질의 정제에 도움이 되는 매우 유용한 방법이다. 코스모트로픽 황산암모늄(kosmotropic ammonium sulfate) 첨가에 의해, 풀림 및 이상접힘 종류 같은 폴딩 부산물뿐 아니라, 숙주세포 유래의 세포벽 성분과 같은 불순물 및 단백질이 침전된다. 침전 농도의 증가에 따라 침전 효과는 증가하므로, FcR 변이체가 고농도의 황산암모늄에서와 같은 침전에 대해 저항하는 동안은 고순도 FcR 제조물질을 획득할 수 있다. 그러므로 1.5M 이상의 황산암모늄 농도에서 높은 용해도를 갖는 FcR 변이체를 갖는 것이 바람직하다.

상기 침전된 단백질은 원심분리에 의해 제거되고, 용액 안에 여전히 단백질 오염물의 최대량이 남아있는 동안, 황산암모늄 농도는 대부분의 관심 단백질이 침전하는 값으로 증가한다. 다음 정제 단계를 위해 상기 침전된 관심 단백질은 원심분리하여 회수되고, 새로운 버퍼에 용해된다.

바람직하게는, 본 발명의 단백질은 1.5M 이상의 황산암모늄 농도에서 높은 용해도를 갖는다.

본 발명은 또한 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이다.

서열번호 2, 3, 4, 5 또는 9의 단백질은 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.

(i) 서열번호 6에서 제1코돈(ATG)이 생략된 결과에 따른 단백질은 서열번호 2,

(ii) 서열번호 6에서 제1코돈(ATG) 및 제2코돈(GCA)이 생략된 결과에 따른 단백질은 서열번호 3,

(iii) 서열번호 6에서 제1코돈(ATG), 제2코돈(GCA) 및 제3코돈(CCG)이 생략된 결과에 따른 단백질은 서열번호 4,

(iv) 서열번호 6에서 제1코돈(ATG), 제2코돈(GCA), 제3코돈(CCG) 및 제4코돈(CCG)의 생략된 결과에 따른 단백질은 서열번호 5,

(v) 아미노산 TPA의 N-으로부터 C-말단까지 암호화하는 코돈은 서열번호 6의 제1코돈(ATG)와 제2코돈(GCA) 사이에 추가되며, 아미노산 서열 MGI를 암호화 하는 코돈이 서열번호 6의 끝에서 두번째 코돈(CCG)의 3'에 추가된 결과에 따른 단백질은 서열번호 9에 개시된다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현에 의해 획득되거나 획득 가능한 단백질을 포함하는 약학 조성물 또는 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화된 단백질에 관한 것이다.

상기 용어 "조성물"은 본 명세서에 사용된 바와 같이,

(a) 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현에 의해 획득되거나 획득 가능한, 적어도 하나의 단백질을 포함하는 조성물;

(b) 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 9에 따른 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터;

(c) 또는 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화된 단백질;

(d) 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 9에 따른 댄백질을 암호화하는 염기서열에 관한 것이다.

이하에 기재되는 본 발명의 조성물은 상기 단백질의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 선택적으로, 항체 또는 림프구와 같은 다른 단백질과 결합할 수 있는 분자를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 그 중에서도, 분말, 정제, 용액, 에어로졸, 과립, 알약, 현탁액, 에멀전, 캡슐, 시럽, 액체, 엘릭시르제(elixir), 추출제, 팅크제(tincture) 또는 용액 추출물 형태 또는 특히 바람직하게 경구 또는 비경구 또는 경피(점막) 투여에 적합한 형태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier), 첨가제 또는 이들의 조합을 선택적으로 더 포함하는 약학 조성물이다. 상기 약학 조성물은 그 중에서도 본 발명의 염기서열 또는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 예를 들어, 항체 또는 혈청에 존재하는 또 다른 단백질과 같은 추가의 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.

상기 약학 조성물은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"의 의미는 관리기관 또는 동물 및 특히 인간에 사용되는 일반적인 약전에 의해 승인되는 것을 의미한다.

용어 "담체(carrier)"는 약학 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보존제 또는 부형제(vehicle)를 의미한다. 이러한 약학적 캐리어는 물 및 기름과 같은 멸균액체일 수 있다. 상기 물은 약학 조성물이 정맥으로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수, 포도당 용액 및 글리세롤 용액 또한 액체 담체로, 특히 주사 투여가 가능한 용액으로 사용될 수 있다.

적절한 약학적 첨가제로는 전분, 포도당, 젖당, 자당, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카겔, 스테아르산나트륨(sodium stearate), 글리세롤 모노스테아레이트(glycerol monostearate), 활석(talk), 나트륨 이온, 탈지분유, 글리세롤, 플로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등과 같은 물질을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 필요한 경우, 적은 양의 습윤화제, 에멀전화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방형(sustained-release) 제형 등과 같은 형태를 가질 수 있다. 상기 조성물은 일반적인 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체를 사용하여 좌약으로 만들어질 수 있다. 경구 제제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적인 담체를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E.W. Martin.의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로, 투여대상에게 투여하기 적합한 양의 담체와 함께 치료상으로 효과적인 양을 포함할 수 있다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

또 다른 바람직한 구현예에서는, 상기 조성물은 인간의 정맥투여에 적합한 약제학적 조성물로서 일반적인 방법에 따라 제조된다. 일반적으로, 정맥투여용 조성물은 멸균 등장성(isotonic) 수계 버퍼에 녹아있다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 가용화제와, 주사 부위의 고통을 완화하기 위해 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은 예를 들어, 활성화제의 양을 나타내는 약봉지 또는 앰플과 같이 밀폐 용기 내에 무수농축 또는 동결건조된 분말과 같은 단위 투여 제형으로 개별적 또는 함께 혼합되어 공급된다. 상기 조성이 주입(infusion)에 의해 투여되는 경우, 멸균된 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입병(infusion bottle)에 조제될 수 있다. 상기 조성물이 주사로 투입되는 경우, 주사를 위한 멸균수 앰플 또는 식염수가 제공될 수 있으며, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있다.

본 발명의 상기 약제학적 조성물은 중성 또는 염기성 형태로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로는 염화수소, 인, 아세틱, 옥살릭, 타르타르산 등으로부터 유도된 음이온 형태와 같은 것을 포함하며, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화3가철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 양이온의 형태를 포함한다.

생체 외 분석은 최적 투여 범위를 확인하기 위해 선택적으로 이용될 수 있다. 제형에 적용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 장애의 심각성에 따라 결정될 수 있으며, 의사 및 각각의 투여대상의 상황에 따른 판단에 의해 결정되어야 한다. 유효량은 생체 외 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 얻은 용량-반응 곡선으로부터 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 직접 또는 보조제와 함께 병용 투여된다.

상기 약학 조성물은 유전자 치료에 적용하기 위해 설계될 수 있다. 유전자 치료 기술은 본 발명의 숙주세포와 관련하여 상술한 바 있으며, 상기 약학 조성물과 관련한 사용 또한 모두 상기와 같다. 예를 들어, 상기 약학 조성물 내의 핵산분자 또는 서열번호 1의 핵산 발현에 의해 획득 또는 획득 가능한 단백질 또는 단백질, 또는 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는 단백질은 바람직하게는, 개별 치료 대상의 세포 내 도입, 발현 및/또는 안정적 통합을 허용하는 형태이다.

유전자치료에 있어서 예를 들어, 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus), 우두(vaccinia) 또는 바람직하게는, 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 RNA 바이러스와 같은 이용 가능한 다양한 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 단일 외래 유전자가 삽입된 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)에는 MoMuLV(Moloney murine leukemia virus), HaMuSV(Harvey murine sarcoma virus), MuMTV(murine mammary tumor virus) 및 RSV(Rous Sarcoma Virus)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 다수의 추가적 레트로바이러스 벡터는 다중 유전자를 포함할 수 있다. 상기 모든 벡터는 형질도입된 세포가 식별 및 생성되게 하기 위해서 선택 가능한 마커 유전자를 옮기거나(transfer) 포함(incorporate)할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 당, 당지질 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 특정한 목적(target specific)으로 만들어질 수 있다. 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 레트로바이러스를 특정대상에 전달하기 위해 레트로바이러스 유전체에 삽입될 수 있는 특정 폴리뉴클레오티드 서열은 당업자에게 잘 알려져 있거나, 과도한 실험 없이 이미 확인된 것일 수 있다.

재조합 레트로바이러스는 결함이 있을 수 있으므로, 감염성 벡터 입자를 제조하기 위해 도움을 필요로 한다. 이러한 도움은 예를 들어, LTR에서 조절서열에 의한 조절 하에, 레트로바이러스의 모든 구조 유전자를 암호화하는 플라스미드를 함유하는 보조세포주(helper cell line)를 사용하여 제공될 수 있다. 상기 플라스미드는, 캡슐화(encapsidation)하기 위한 RNA 전사를 인식하여 패키징 메커니즘(packaging mechanism)을 가능하게 하는 염기서열이 결여되어 있다. 패키징 신호가 결여된 보조세포주는 예를 들어, W2, PA317 및 PA12를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 세포주는 유전자가 패키징되지 않았기 때문에 비어있는 비리온(virions)을 생성한다. 레트로바이러스 벡터가, 패키징 세포가 온전한 세포로 도입되면 구조 유전자는 다른 관심 유전자로 대체되지만, 벡터는 패키징 되고, 벡터 비리온이 생성될 수 있다. 다른 대안으로, NIH 3T3 또는 다른 조직 배양 세포는 일반적인 인산칼슘 형질주입(transfection)에 의해 레트로바이러스 구조적 유전자 gag, pol 및 env를 암호화하는 플라스미드와 함께 직접적으로 형질주입될 수 있다. 그 후, 상기 세포는 관심 유전자를 함유하는 벡터 플라스미드로 형질전환된다. 상기에서 얻어진 세포는 레트로바이러스 벡터를 배지로 방출시킨다.

본 발명의 핵산분자를 위한 다른 표적 전달 시스템(targeted delivery system)은 콜로이드 분산 시스템(colloidal dispersion system)이다. 콜로이드 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소입자, 비드 및 수중유적형, 마이셀, 혼합된 마이셀 및 리포좀을 포함하는 지질계 시스템을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 인-비트로 및 인-비보에서 매개체 전달에 유용한 인공막 소포이다. 0.2-0.4 pm 크기 범위의 큰 단층 소포(LUV)는 거대 분자를 함유하는 상당한 비율의 수성 버퍼를 캡슐화할 수 있음을 보여주고 있다. RNA, DNA 및 빈 비리온은 수용액 내로 캡슐화될 수 있으며, 생물학적 활성 형태로 세포로 전달될 수 있다(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). 또한 포유류 세포뿐만 아니라, 리포좀은 식물, 효모 및 박테리아 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전달에 사용된다. 리포좀은 효율적인 유전자 전달 매개체로서, 다음의 특성을 가진다: (1) 생물학적 활성의 손상이 없는 고 효율의 관심 단백질 캡슐화; (2) 비표적 세포에 비해 표적 세포로의 우선적 및 단단한 결합; (3) 고효율로 목표 세포질로의 매개체 수성 내용물 전달; 및 (4) 유전자 정보의 정확하고 효과적인 발현(Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). 리포좀의 상기 구성은 인지질, 특히 고성능변화온도 인지질(high-phase-transition-temperature phospholipid)의 일반적인 조합이며, 일반적으로, 특히, 콜레스테롤과 같은 스테로이드와의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 결정된다. 리포좀 생성물에서 유용한 지질의 예로는 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 스핑고지질(sphingolipids), 세레브로시드(cerebrosides) 및 강글리오시드(gangliosides)와 같은 포스파티딜 화합물(phosphatidyl compound)을 포함한다. 특히 유용한 것은 디아실포스파티딜글리세롤(diacylphosphatidylglycerols)이다. 상기 지질의 일부분은 14-18의 탄소원자, 특히 16-18 탄소원자를 함유하고, 상기 지질의 일부분은 포화되어 있다. 예시된 인지질은 난황 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine,), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine) 및 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine)을 포함한다. 상기 리포좀의 표적화는 해부학적 및 기계적 요인에 따라 분류될 수 있다. 해부학적 분류는 예를 들어, 조직특이적, 세포특이적 및 세포기관 특이적 등과 같이 선택적인 수준에 근거한다. 기계적 표적화는 능동적인지 수동적인지 여부에 기초하여 구분될 수 있다. 수동적 표적화는, 동양모세혈관(sinusoidal capillaries)을 포함하는 조직 내에 망상내피계 시스템(RES)의 세포를 분포시키기 위한 리포좀의 자연적인 성질을 이용한다.

본 발명에 기재된 용어 "대상"은 발병에 대한 치료를 필요로 하는 개인을 의미한다. 바람직하게는, 상기 대상은 척추동물이며, 더욱 바람직하게는 포유류, 특히 바람직하게는, 인간이다. 일구현에서, 상기 인간은 환자 또는 개인으로 기재될 수 있다.

상기 용어 "투여된"은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산분자를 각 개인에게 치료적으로 또는 진단적으로 유효한 양을 투여하는 것을 의미한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, "치료적으로 유효한 양"은 장애 또는 질병을 치료 또는 개선하거나, 질병 진행의 지연 또는, 질병의 치료 또는 관리에 있어 치료적 이득을 제공하기에 충분한 치료 활성 성분 또는 작용제의 양을 의미한다.

당 업계에 공지되어있으며 전술한 바와 같이, 침투성과 국소전달, 연령, 체중, 일반건강, 성별, 식이, 투여 시기, 약물 상호작용 및 엄격한 조건이 필요하며, 당업자에 의해 통상적인 실험으로 확인할 수 있을 것이다. 상기 방법은 인간의 치료 및 수의학 응용에 적용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 목적의 치료적 활성을 갖는 화합물은 기재된 바와 같이, 환자가 생리학적으로 허용 가능한 담체로 투여될 수 있다. 투여 방법에 따라, 상기 화합물은 하기와 같이 다양한 방법으로 조제될 수 있다. 조제에 있어서 치료적 활성 화합물의 농도는 약 0.1-100wt%일 수 있다. 상기 작용제는 단독으로 또는 다른 치료제와 혼합하여 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여는 기재된 바와 같이, 다양한 방법으로 수행될 수 있으며, 경구, 피하, 정맥, 동맥, 결절, 골수, 척수, 심실, 비강, 기관지, 진피, 직장, 복막, 근육, 폐, 또는 안구 내 투여를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어 일부 경우에, 상처 및 염증의 치료에 있어서, 후보 물질을 건조 스프레이 용액으로 직접 분무하여 적용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 바람직하게는 주사로 투여된다. 상기 주사투여는 정맥 내, 피하 또는 근육 내 주입에 사용된다. 또한 상기 약학 조성물은 다른 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물, 특히 인간용 약전에 일반적으로 인정되는 것을 의미한다.

상기 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균된 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입병에 조제될 수 있다. 상기 조성물이 주사로 투입되는 경우, 주사를 위한 멸균수 또는 식염수가 제공될 수 있으며, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 스테로이드 또는 정맥 내 면역글로불린과 같은 하나 이상의 다른 치료적 작용제 또는 항체, 특히 코르티코스테로이드(corticosteroid), 글루코코르티코이드 전구체(glucocorticoid prodrug)와 조합하여 투여될 수 있으며, 예를 들어, 프리드니손(prednisone), IVIG, anti-D, 빈카알칼로이드(vinca alkaloids), 예를 들어, 빈크리스틴(vincristine) 또는 빈블라스틴(vinblastine), 다나졸(danazol), 면역억제제, 예를 들어, 아자티오프린(azathioprine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 또는 사이클로포린 A(cyclosporin A), 답손(dapsone), 트롬보포이에틱 제제(thrombopoicetic agent), 리투시맵(rituximab), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 로미플로스팀(romiplostim), 엘트롬보패그(eltrombopag)를 조합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "조합된"은 하나 이상의 예방제, 치료제 또는 이들의 조합의 사용을 의미한다. 상기 용어 "조합된"은 예방제, 치료제 또는 이들의 조합이 환자에게 투여되는 순서를 제한하지는 않는다.

상기 조성물의 용법용량은 주치의 및 임상적 요인에 따라 결정될 수 있다. 의학 분야에서 공지된 바와 같이, 어느 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 포함하는 많은 요인에 따르며, 특히 투여되는 화합물, 성별, 투여 횟수 및 경로, 일반 건강 및 동시에 투여되는 다른 약제에 의에 결정된다. 예를 들어, 일반적인 투여량은 0.001 내지 1000μg 범위일 수 있으나, 상기 기본적인 범위 이하 또는 이상은 특히, 상기 요인을 고려하여 예측된다.

상기 투여량은 바람직하게는 일주일로 주어지나, 치료 진행 중에 복용량은 더 긴 시간 간격으로 주어질 수 있으며, 필요에 따라 더 짧은 시간 간격으로 예를 들어, 하루로 주어질 수 있다. 바람직한 경우, 면역반응은 당업자에게 공지된 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 검사할 수 있으며, 예를 들어, 기간, 양 및 구성과 같은 용법용량이 최적화된다. 투여량은 변화할 수 있으나, 바람직한 DNA의 정맥내 투여 용량은 대략 DNA 분자의 10⁵ 내지 10¹² 카피(copy)일 수 있다. 연속 주입 방식의 경우에는 또한, 각각, 분 당, 체중 1kg 당 1μg 내지 10mg 단위 범위로 투여해야 한다. 이러한 진행은 주기적인 평가에 의해 검사될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물은 국소 또는 전신에 투여될 수 있다. 바람직하게는 예를 들어, 정맥 내와 같이, 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구용 투여를 위한 조제용 물질은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현택액 및 에멀전을 포함한다. 상기 비수성 용액의 예로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브기름과 같은 식물성 기름 및 에틸올레산과 같은 주입 가능한 유기에스터가 있다. 수성 담체로는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하고, 식염수 및 완충배지를 포함한다. 비경구 매개체는 나트륨 이온 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 나트륨 이온, 젖산 링거 또는 비휘발성 기름을 포함한다. 정맥 내 매개체는 유체 및 영양보충제, 전해질 보충제(덱스트로스 링거) 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등의 조제용 물질 및 다른 첨가제를 또한 포함할 수 있다.

또한, 예를 들어, 상기 약학 조성물은 메틸화된 DNA의 진단에 유용하거나, 예를 들어, 일반적으로 메틸화된 형태로 나타날 수 있는 악성종양의 진단에 유용한 다른 작용제와 공동치료법으로 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 기재된 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 또한, 당업자에게 공지된 약학 조성물은 환자의 질병, 자가면역질환, 또는 이들의 조합에 효과적인 치료 또는 예방을 위한 FcγR 투여의 유효한 양을 포함하는 다중투여키트(multiple-doage-kit)의 형태로 제공될 수 있다. 일구현예에서, 약학적 팩 또는 키트는 본 발명의 약학 조성물로 채워진 하나 이상의 컨테이너를 포함한다. 또한, 질병의 치료에 유용한 하나 이상의 추가적인 예방적 또는 치료적 작용제가 상기 약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다.

부가적으로, 본 발명의 상기 약학 조성물은 장애 또는 질병의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어 "치료" 및 그와 유사한 용어는 환자 및 질병 또는 장애에 대한 방어의 관리 및 보살핌을 의미한다. 본 명세서에 기재된 용어 "예방" 및 "방어"는 예방제 또는 치료제의 투여 결과로 투여 대상의, 질병이 하나 이상의 증상에 대한 재발 또는 발병의 예방을 의미한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "장애" 및 "질병(질환)"은 대상에 따라 혼용된다. 특히, 용어 "자가면역질환"은 용어 "자가면역장애"와 혼용되며, 그 자신의 세포, 조직, 장기 또는 이들 대상의 면역학적 반응에 의해 유발되는 세포, 조직, 장기 또는 이들의 손상에 의해 특정화된 대상의 상태를 의미한다. 용어 "염증성 질환"은 용어 "염증성 장애"와 혼용되며, 염증, 바람직하게는 만성적 염증에 의해 특정화된 상태를 의미한다. 자가면역질환은 염증과 관련될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 또한, 염증은 자가면역질환을 유발할 수도, 그렇지 않을 수도 있다. 그러므로, 특정 질환은 자가면역 및 염증질환 모두로 특정 지어질 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 염증성 질환은 일차 면역혈소판감소증(ITP), 전신홍반성루푸스(SLE), 류마티스관절염(RA) 또는 자가면역성 용혈빈혈(AIHA)이다.

본 발명은 또한 서열번호 2, 3 또는 이들의 조합에 따른 단백질을 포함하는 물질 조성물에 관한 것이다.

용어 "물질 조성물"은 화학적 조합 또는, 기계적 혼합 또는, 생물학적 제제의 둘 이상의 물질의 모든 조성물 및 모든 합성 물질을 의미한다. 상기 물질의 조성물은 둘 이상의 성분의 혼합으로 형성될 수 있다. 상기 물질의 조성물 내 성분의 혼합은 기계적 또는 화학적 방법 또는 생물학적 처리에 의해 조제될 수 있다.

상기 물질의 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 활성성분을 포함할 수 있다. 상기 "활성성분"은 치료적으로 효과적인 성분을 의미한다. 이러한 활성성분은 본 명세서에 기재된 바와 같이, IgG 항체에 결합할 수 있으며, 예를 들어, T-세포, B-세포, 자연살해세포(NK-cell)와 같이 림프구에 결합이 가능하다. 이러한 활성성분은 오직 불변부(constant region)에만 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 단백질은 상기 물질의 조성물 내에서 단독 활성성분인 것이 바람직하다.

일구현예에서, 상기 물질 조성물은 서열번호 2 및 3의 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 물질 조성물은 서열번호 2 또는 3의 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 물질 조성물은 서열번호 2의 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 물질 조성물은 서열번호 3의 단백질을 포함한다.

다른 일구현예에서, 본 발명의 상기 물질 조성물은 서열번호 4, 5 또는 이들의 조합에 따른 단백질을 더 포함한다. 구체적으로 예를 들어, 본 발명의 상기 물질 조성물은 서열번호 4 및 5의 단백질을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 상기 물질 조성물은 서열번호 4 또는 5의 단백질을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 상기 조성물은 서열번호 4의 단백질을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 상기 조성물은 서열번호 5의 단백질을 더 포함한다.

다른 일구현예에서 본 발명의 상기 물질 조성물은 서열번호 2의 단백질 양이 서열번호 3의 단백질 양을 초과하는 것을 특징으로 한다.

다른 일구현예에서 본 발명의 상기 물질 조성물은 서열번호 3의 단백질 양이 서열번호 2의 단백질 양을 초과하는 것을 특징으로 한다.

다른 일구현예에서, 본 발명의 상기 물질 조성물은 서열번호 2의 단백질 양이 서열번호 3의 단백질 양을 초과하고, 서열번호 2 및 3의 단백질 양이 서열번호 4, 5 또는 이들의 조합에 따른 단백질 양을 초과하는 것을 특징으로 한다.

일구현예에서, 상기 물질 조성물은 서열번호 9의 단백질을 포함한다.

상기 물질 조성물은 바람직한 실시예에서 약학 조성물이다.

본 발명은 또한 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 조건에서 본 발명의 숙주세포 배양을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법 및 수득된 약학 조성물의 회수에 관련된 것이다.

실시예

하기 실시예에서는 본 발명을 예시한다. 그러나 이들 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 실시예들은 예시의 목적으로 포함되며, 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.

재료 및 방법

FcR 변이체의 제조

250mL 베플삼각플라스크에 50ug/mL 카나마이신이 첨가된 75ml LB에 5μL의 글리세롤 스탁을 접종하고 37℃, 170rpm 15시간 동안 쉐이킹하였다(Multitron Standard, Infors HT). 그 후 2L 베플삼각플라스크의 1L LB에 하룻동안 배양시킨 균주 10mL을 접종시키고, 37℃, 170rpm으로 쉐이킹하였다. OD₆₀₀ 값이 1.6일때 1mM IPTG의 첨가하여 발현을 유도하였다. 170rpm, 37℃에서 3시간 동안 배양 후에, 세포를 원심분리(4℃, 5'000·g, 10분)로 수득하고, 200mL의 차가운 PBS로 한 번 세정 하여 -20℃에 보관하였다.

세포 파쇠 및 봉입체의 분리

6-8g의 냉동 E.coli 세포를 실온에서 해동한 후, 100ug/mL의 라이소자임이 첨가된 30mL의 라이시스 버퍼(lysis buffer, 50mM Tris/HCl, 25 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.0)에 테플론 유리균질기를 사용하여 재현탁하였다. 그 후 얼음에서 15분 동안 정치하고, 초음파분쇄(분발 설정 6, 충격계수 30%, 30분)로 분쇄한 후, 현탁액을 원심분리(4℃, 13'000·g, 45분)하였다. 1mL의 상등액을 취하고, 나머지 용액은 폐기하였다. 미가공 봉입체인 펠렛은 0.5wt%(v/v) 폴리솔베이트 20이 포함된 35mL 라이시스 버퍼에 테플론 유리균질기를 사용하여 재현탁시키고, 원심분리하였다(4℃, 13'000·g, 15분). 세정액으로 한번 세정한 후에, 최종 세정단계에서는 라이시스 버퍼만을 사용하여 세정하였다.

리폴딩(Refolding) 및 FcR 변이체의 정제

원심분리 튜브 안의 봉입체는 20℃, 일정한 교반조건(400 RPM)에서 2.5 시간 동안 20 mM Tris/HCI, 6M 구아니딘(guanidine), 3mM EDTA, 5mM DTT, pH8.0에 200㎎/㎖로 가용화하였다. 원심분리(20'000·g , 10분, 20℃) 후에 상등액을 기울여 따라 수집하였고, Knauer Bioselect C4의 RP-HPLC로 1:60 희석 후에 FcR 함유물을 측정하였다. 분석 결과에 기초하여, 용해된 봉입체를 20mM Tris/HCI, 6M 구아니딘, 3mM EDTA, 5mM DTT, pH8.0 용액을 사용하여 FcR 함량이 21mg/mL로 되도록 희석하고, 희석된 FcR 용액 1부를 리폴딩 버퍼(20mM Tris/HCI, 2M 우레아(urea), 0.5M 아르기닌(arginine), 2mM 시스테아민(cysteamine), pH7.7, 6℃) 20부에 800rpm로 교반하면서 적하하였다. 밀폐용기에 교반 없이 10℃에서 16시간 배양 후, 리폴딩 용액을 실온으로 가온하였다. 상기 실온의 리폴딩 용액을 교반(400 rpm) 하에 20mM NH₄H₂P0₄, pH7.0, 3.5M (NH₄)₂SO₄를 적하하여 1.1M (NH₄)₂SO₄로 조정하였다. 1시간 동안 200rpm에서 더 교반한 후 현탁액을 원심분리(20'000·g, 20분, 20℃)하고, 상등액을 여과(0.2μm, Duraporeㄾ, Millipore)하고, 상기 여과액을 1.2M (NH₄)₂SO_{4 ,} 20 mM NH₄H₂PO₄, pH 7.0 으로 평형화된 35mL 페닐 세파로스 HP 컬럼(Phenyl Sepharose HP column; h=6.6cm, d=2.6cm, GE Gealthcare) 수지에 4mL/min, ≤4mg protein/mL로 로딩하였다. 상기 컬럼을 100mL의 1.2M (NH₄)₂SO₄, 20 mM NH₄H₂P0_{4 ,,} pH 7.0으로 세정하고, 결합된 단백질을 350mL의 20mM NH₄H₂P0_{4 ,} pH 7.0 내 1.2M 내지 0M (NH₄)₂SO₄ 5mL/min으로 직선 그라디언트(linear gradient)하여 용출(elution)하였다. 상기 용출액(eluate)은 7.5ml 분획으로 수집하였다. 상기 분획물은 Phenomemex Jupiter C4의 RP-HPLC로 분석하였다. 상기 분획물은 약 2배 농도의 요구되는 FcR 변이체를 모으고, 전도도가 약 5mS/cm로 감소할 때까지 접선유동여과(tangential flow filteration; Vivaflow 50, 5kDa MVCO, 0.01m², cross-flow 200mL/min, pIN=2bar; Sartorius)를 통해 20 mM L-histidine pH 6.5에 디아필트레이션(diafiltration)하는 경우, 순도가 약 85% 이상으로 나타났다. 버퍼 교환 후, 용액은 20mM L-histidine, pH6.5 에서 평형화된 9mL의 SP 세파로스 HP 컬럼(SP Sepharose HP colume; h=4.5 cm, d=1.6 cm, GE Healthcare) 수지에 2 mL/min, ≤20mg protein/mL로 로딩하였다. 컬럼을 30mL의 20mM L-histidine, 30mM NaCl, pH6.5로 세정하고, 결합된 단백질을 90mL의 20mM L-histidine, pH6.5 내 20mM 내지 400mM에 3mL/min으로 직선 그라디언트하여 용출하였다. 분획물은 회수된 주요 피크를 포함한다. 상기 분획물은 20mM L-histidine pH 6.5를 사용하여 15.4mS/cm로 조정하고, 한외여과(ultrafiltration; 4'000·g, 5 kDa MWCO, Vivaspin 20, Sartorius)에 의해 약 20 mg/mL 농도로 농축하였고, 20mM L-histidine, 150 mM NaCl, pH6.5를 사용하여 15mg/mL로 희석하였다. 상기 희석된 FcR 용액은 여과(0.45μm, PES membrane, Puradisc™ 25mm, Whatman)하고, 분주하여 액체질소에 -80℃로 냉동 보관하였다.

침전법(Precipitation Screen)

FcR을 20mM histidine, 150mM NaCl 및 0 내지 2.8 M 황산암모늄 존재 하에 적절한 양의 ddH₂O, 10X histidine/NaCl 원액(200mM 히스티딘, 1.5M NaCl) 및 황산암모늄 원액(4M in ddH₂O)을 첨가하여 0.7mg/mL로 조정하였다. pH는 적절한 pH의 10X histidine/NaCl 및 황산암모늄 원액을 사용하여 6, 7 또는 8로 조정하였다. 각각의 조건은 이중으로 설정하였다. 상기 샘플을 25℃에서 1시간 동안 배양하고, 원심분리(20'000·g, 10분)하여, 30μL의 상등액을 384-웰 플레이트(μclear, non- binding, black, Greiner Bio-one)로 옮겼다. 흡광도는 280nm에서 측정(Spectrofluor plus, Tecan)하였고, 상기 단백질 함유물은 1.5625 mL x mg^-1x cm^-1의 질량흡광계수 및 0.24cm의 경로 길이를 사용하여 람버트 비어 법칙(Lambert Beers Law)에 따라 계산하였다. 샘플 웰의 흡광도는 버퍼만(blank buffer)을 함유하는 웰의 흡광도에 의해 수정되었다.

SDS page

이황화 교환을 억제하기 위해, 자유 티올(free thiol)을 18μL 가용성 IBs 또는 리폴딩 배지(refolding broth)와 H₂O로 새로 제조한 2μL의 250mM 요오드아세트아미드의 혼합에 의한 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 사용하여 알킬화하였다. 상기 혼합물을 암흑 조건 30℃에서 750rpm, 45분간 배양하고, NuPAGE^® Novex^® manual(Invitrogen)에 따라 SDS-PAGE 샘플 준비에 바로 사용하였다. 제조사 지시에 따라 MES 러닝버퍼(NuPAGE^® Novex^®, Invitrogen) 내 4 내지 12% Bis-Tris 겔(NuPAGE^® Novex^® Invitrogen)에서 단백질을 분획하였다. 겔을 ddH₂O로 세 번 세정하고, Simply Blue™ Safe Stain(Invitrogen)을 사용하여 상온에서 적어도 6시간 동안 염색하였다. 분자량 마커로는 10uL의 SeeBlue^® Plus2 pre-stained standard(Invitrogen)을 사용하였다.

LC-MS

미가공 발현 단백질의 분자 질량은 MPI 생화학연구소(Martinsried)와 공동작업으로 질량분석기(mass spectrometry)를 이용하여 측정하였다. 샘플은 30% 아세토니트릴(acetonitrile), 0.05% TFA로 미리 평형화된 페노메넥스 에어리스™ 와이드포어 C₄ 컬럼(Phenomenex Aeris™ Widepore C column; 100 mm x 2.1 mm, 3.6 μΜ 입자크기, 300Å 공극 크기)를 갖춘 ESI-TOF 질량분석기(ESI-TOF mass analyser; microTOF, Bruker)로 분석하였다. FcR 함유 샘플은 20℃, 0.25mL/min으로 주입하였고, 결합된 단백질은 30% 내지 80% 아세토니트릴, 0.05% TFA에 15분간 직선 그라디언트하여 용출하였다.

자외-가시광 분광법(UV/VIS spectroscopy)

필요한 경우, 단백질 용액은 각각의 버퍼를 사용하여 OD₂₈₀ 에서 0.2 및 0.8로 희석하였다. 400μL의 상기 용액은 UV-마이크로큐벳(UV-cuvette micro, Brand)에 옮겨 담았다. 280nm에서 흡광도는 320 nM로 측정되었으며(TidasE, J&M Analytik), mg/mL 단백질 농도는 다음의 식에 따라 계산하였다:

C_protein = (OD₂₈₀ - OD₃₂₀) x 0.64 mg/mL

블랭크로는 각각의 버퍼를 사용하였다. 분석은 3번 반복으로 실시하였으며, 결과는 평균값으로 나타내었다.

실시예 1: 침전법(Precipitation screen)

리폴딩 기반 공정에 의한 FcR 단백질의 제조는 일반적으로 황산암모늄 침전법 단계와 관련된다. 코스모트로픽 황산암모늄(kosmotropic ammonium sulfate)의 첨가에 의해, 언폴딩(unfolding) 및 미스폴딩(misfolding)된 종과 같은 폴딩 부산물(foding byproduct) 뿐만 아니라, 세포벽 성분과 같은 숙주세포 유래 불순물 및 단백질이 침전되었다. 침전 농도의 증가와 함께, 침전효과는 증가하므로, FcR 변이체가 높은 황산암모늄 농도에서 침전 내성을 나타낸다면, 고 순도의 FcR 침전물을 얻을 수 있다. 그러므로 1.5M 이상의 황산암모늄 농도에서 용해도가 높은 FcR 변이체인 것이 바람직하다. 불순물의 간단한 침전뿐만 아니라, 고농도 황산암모늄은 HIC 수지에 효과적인 결합을 촉진하게 할 수 있다. 높은 동적 결합능은 항상 크로마토그래프 회수 단계에서의 중요한 계발 목표이며, 높은 황산암모늄 농도에서의 용해도는 필수적이다.

FcR 변이체의 용해도를 평가하기 위해 pH 6 내지 8의 황산암모늄 농도 증가 환경에서 각각의 변이체를 배양하였다. 25℃에서 1시간 배양 후, 상등액의 FcR 농도를 UV/vis 분광계로 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 변이체 3은 2.05M 내지 2.13M의 (NH₄)₂SO₄에서 반-최고치 침전(half-maximal precipitation)을 나타내므로, 황산암모늄에 의한 침전에 대해 가장 큰 저항성을 가진다. 반면, "변이체 2"(서열번호 8) 및 " 변이체 4"(서열번호 9)는 높은 황산암모늄 농도에서 더 낮은 가용성을 나타내며, 1.70M 내지 1.76M의 (NH₄)₂SO₄ 농도에서 반-최고치 침전값을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, "변이체 4"는 높은 황산암모늄 농도에서 여전히 가용성을 나타낸다. 모든 FcR 변이체에 대한 용해도의 pH 의존성은 무시할만한 정도이다.

"변이체 1"은 충분히 재접힘되지 않아 가용성 단백질을 침전법으로 획득할 수 없으므로, 고농도의 황산암모늄에서 "변이체 1"의 용해도를 결정하여 침전법을 수행하는 것이 가능하지 않음을 주목할 수 있다.

<110> GMBH, SuppreMol <120> Novel Fc gamma receptor IIB variants <130> IPA-0123 <150> US 13/663,527 <151> 2012-10-30 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 <400> 1 Met Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn 1 5 10 15 Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser 20 25 30 Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro 35 40 45 Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser 50 55 60 Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val 65 70 75 80 His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu 85 90 95 Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys 100 105 110 Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys 115 120 125 Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His 130 135 140 Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser 165 170 175 Pro <210> 2 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 <400> 2 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys 115 120 125 Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170 175 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 <400> 3 Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu 1 5 10 15 Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu 20 25 30 Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His 35 40 45 Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu 50 55 60 Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe 85 90 95 Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys 100 105 110 Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe 115 120 125 Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His 130 135 140 Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser 145 150 155 160 Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170 175 <210> 4 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4 <400> 4 Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln 1 5 10 15 Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser 20 25 30 Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr 35 40 45 Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr 50 55 60 Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln 85 90 95 Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro 100 105 110 Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser 115 120 125 Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser 130 135 140 Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser 145 150 155 160 Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170 <210> 5 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 <400> 5 Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser 20 25 30 Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro 35 40 45 Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys 50 55 60 Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly 85 90 95 Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val 100 105 110 Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser 115 120 125 Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp 130 135 140 Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170 <210> 6 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 <400> 6 atggcaccgc cgaaagcagt tctgaaactg gaaccgcagt ggattaacgt tctgcaggaa 60 gatagcgtta ccctgacctg tcgtggcacc catagcccgg aaagcgatag cattcagtgg 120 tttcacaacg gcaatctgat tccgacccat acccagccga gctatcgttt taaagcgaac 180 aacaacgata gcggcgaata tacctgtcag accggtcaga ccagcctgag cgatccggtt 240 catctgaccg ttctgagcga atggctggtt ctgcagaccc cgcatctgga atttcaggaa 300 ggcgaaacca ttgttctgcg ttgccacagc tggaaagata aaccgctggt taaagttacc 360 ttcttccaga acggcaaaag caaaaaattc agccgtagcg atccgaattt tagcattccg 420 caggcgaatc atagccatag cggcgattat cattgtaccg gcaacattgg ctataccctg 480 tatagcagca aaccggtgac cattaccgtt caggcgccga gcagcagccc gtaa 534 <210> 7 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7 <400> 7 Met Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu 1 5 10 15 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp 20 25 30 Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln 35 40 45 Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr 50 55 60 Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val 65 70 75 80 Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu 85 90 95 Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu 100 105 110 Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg 115 120 125 Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly 130 135 140 Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Ile Thr Val 165 <210> 8 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 <400> 8 Met Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg 20 25 30 Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly 35 40 45 Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn 50 55 60 Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln 85 90 95 Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro 130 135 140 Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala 165 170 175 Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile 180 185 <210> 9 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9 <400> 9 Met Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln 1 5 10 15 Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly 20 25 30 Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn 35 40 45 Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn 50 55 60 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser 65 70 75 80 Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr 85 90 95 Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His 100 105 110 Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly 115 120 125 Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln 130 135 140 Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly 145 150 155 160 Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro 165 170 175 Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile 180

Claims (16)

1. 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 염기서열.
2. 제1항의 염기서열을 포함하는 벡터.
3. 제1항의 염기서열 또는 제2항의 벡터의 숙주세포 내 발현을 통해 수득되거나 수득 가능한 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포가 원핵숙주세포인 단백질.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 E.coli인 단백질.
6. 서열번호 6의 염기서열에 의해 암호화되는 단백질.
7. 제3항 또는 제4항의 단백질을 포함하는 약학 조성물.
8. 서열번호 2, 3 또는 이들의 조합에 따른 단백질을 포함하는 물질 조성물.
9. 서열번호 4, 5 또는 이들의 조합에 따른 단백질을 더 포함하는 물질 조성물.
10. 제8항에 있어서, 서열번호 2의 단백질 양이 서열번호 3의 단백질 양을 초과하는 물질 조성물.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 2 및 3의 단백질 양이 서열번호 4, 5 또는 이들의 조합에 따른 단백질 양을 초과하는 물질 조성물.
12. 제1항의 염기서열 또는 제2항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
13. 제12항에 있어서,
    상기 숙주세포가 원핵숙주세포 또는 진핵숙주세포인 숙주세포.
14. 제 12항에 있어서,
    상기 숙주세포가 E.coli인 원핵숙주세포.
15. 제14항에 있어서,
    상기 E.coli가 E.coli BL21인 원핵숙주세포.
16. 암호화된 단백질의 발현 및 회수된 약학 조성물의 수득 허용 조건에서 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.

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