CN104918955A

CN104918955A - Fcγ受体IIB变体

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Publication number: CN104918955A
Application number: CN201380056738.3A
Authority: CN
Inventors: P·松德尔曼; D·特米尔; T·波尔; R·温特; U·雅各布
Original assignee: Suppremol GmbH
Current assignee: Suppremol GmbH
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: PT2914624T; EA201590845A1; HUE032786T2; LT2914624T; KR102170674B1; JP6423351B2; JP2016503289A; HK1209765A1; JP2018186833A; AU2013340831B2; EP2914624A1; WO2014068012A1; BR112015008815A2; CA2887164A1; US20140120080A1; RS56075B1; CN104918955B; AU2013340831A1; HRP20170894T1; ES2628049T3

Abstract

本发明涉及编码SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列；包含所述核酸序列的载体和包含所述核酸序列或所述载体的宿主细胞。本发明还涉及通过在宿主细胞中表达所述核酸序列或所述载体而得到的或可得到的蛋白。进一步地，本发明涉及由SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。本发明还包括药物组合物及其制备方法。

Description

Fcγ受体IIB变体

发明领域

本发明涉及编码SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列；包含所述核酸序列的载体，以及包含所述核酸序列或所述载体的宿主细胞。本发明还涉及通过在宿主细胞中表达所述核酸序列或所述载体而得到的或可得到的蛋白。另外，本发明还涉及由SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。此外，本发明包含药物组合物及其制备方法。本发明还涉及包含根据SEQ ID NO:2和/或3的蛋白的物质组合物，所述组合物还包含根据SEQ ID NO:4和/或5的蛋白。

背景技术

FcγR属于Fc受体(FcR)家族，所述Fc受体在保护人生物体防御感染方面起着关键作用。一般而言，需要区分激活性FcγR和抑制性FcγR。在人的三种主要FcγR中，FcγRI能够结合单体IgG，而FcγRII和FcγRIII结合由抗体和抗原组成的多价免疫复合物(IC)(Takai,T.Nature ReviewsImmunology 2002:580-592)。取决于所表达的FcR类型及相关蛋白，由FcγR触发的效应功能包括经病原体和抗原递呈的随后中和作用的内吞作用、抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)、介质分泌或抗体产生的调节(Fridman等人，Immunol Rev，1992125:49-76，van de Winkel and Capel Immunol Today，1993：14(5)：215-21)。

WO 00/32767记载了可溶性Fc受体(FcR)，其仅由受体的细胞外部分组成并且没有被糖基化。由于这些蛋白没有跨膜结构域和信号肽，它们以可溶性形式存在并且不与细胞结合。此外，WO 00/32767记载了FcR可以被重组产生，由于它们能够与抗体Fc部分相结合而不干扰免疫系统的其它组分，因此FcR已被提议用于治疗自身免疫性疾病。WO 00/32767还记载了某些FcR的晶体结构，并记载了发现下述物质的可能性：所述物质借助于这些晶体结构而抑制IgG与FcR的相互作用。阐明所述晶体结构使得能够通过使用可得到的计算机程序筛选数据库，寻找出这种抑制剂。如WO 03/043648中所限定的发明进一步开发了WO 00/32767的发现，并提供了尤其针对疾病(例如多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA))以及用于自然杀伤细胞水平升高的疾病的治疗方法。

当所述受体在原核生物中重组生成并因此未被糖基化时，WO 03/043648的发明人意外地发现，尽管预期非糖基化蛋白的溶解度不高，但受体仍可以以高浓度的可溶形式的FcγR纯化。WO 03/043648和其它出版物证实了FcR在免疫系统的防御反应中起重要作用。

Fc受体在免疫系统中具有重要作用，在免疫系统中它们可以控制免疫反应的程度和强度。这证明了特别是可溶的(即Fcγ受体IIB的细胞外部分)Fcγ受体IIB(sFcγRIIB)(所述Fcγ受体IIB与免疫细胞上表达的FcγR竞争致病性免疫复合物)在自身免疫性疾病的治疗中是有益的。在发生于自身免疫性疾病中的免疫反应的早期进行干预，会预防导致炎症和组织破坏的级联反应的触发。具体而言，sFcγRIIB同时处于适应症原发性免疫性血小板减少症(ITP)和系统性红斑狼疮(SLE)的II期临床试验中。众所周知，对于临床试验，需要生物材料(本文为sFcγRIIB)优选具有良好的化学、制造和控制(CMC)性能，例如纯化过程中的高纯度和高稳定性。

因此，本发明的一个目的是提供具有良好CMC性能的人FcγRIIB蛋白。该目的通过权利要求中反映的、本文描述的、在实施例和附图中示例的实施方案而得到解决。

令人惊讶的是，对于例如本文所述那些的蛋白已证明，由于在超过1.5M时的硫酸铵浓度下更好的溶解度，能够达到更高的纯化程度。作为很多纯化方案中的第一个步骤，硫酸铵沉淀有用于去除大量污染蛋白。当目标是高纯度蛋白时，硫酸铵浓度越高，则结果越好，但是由于硫酸铵离子强度高，在蛋白上施加的应力越大。因此，蛋白抗应力越强，硫酸铵浓度可越高，因此蛋白纯度越高。具体来说，通过加入离液序列低的(kosmotropic)硫酸铵，副产物如未折叠或错误折叠的物质以及源自宿主细胞的杂质如细胞壁组分和蛋白被沉淀。随着沉淀浓度增大，沉淀效率将增大，因此得到高度纯化的蛋白沉淀，只要感兴趣的蛋白在如此高的硫酸铵抵抗沉淀即可。如所述，令人惊讶地证实，如本文所述的FcR蛋白在硫酸胺浓度等于或超过1.5M时，是高度可溶的。这尚未被预期得到，原因在于，如实施例所示，现有技术的FcR蛋白表现不同，而且也没有对如何改变FcR蛋白使其具有如本发明所提供的FcR蛋白的表现方式和特性的任何可得到的教导。如所述，本发明人非常惊讶的是，证实本文所述蛋白实际上抵抗高浓度硫酸铵，由此相比于现有技术中FcγRIIB蛋白，例如WO 00/3276或WO 03/043648中所述的FcγRIIB蛋白，其具有更高的纯度。

发明内容

本发明涉及编码一种根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列。本发明还提供编码示于SEQ ID NO:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。示于SEQ IDNO:6的核酸序列编码SEQ ID NO:1的蛋白。

本发明还涉及一种载体，其包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列。本发明还涉及载体，其包含编码根据SEQ ID NO:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。

进一步地，本发明还涉及一种通过在宿主细胞中表达编码根据SEQ IDNO:1的蛋白的核酸序列或表达本发明的载体而得到的或可得到的蛋白，优选地，所述宿主细胞为原核宿主细胞，更优选为大肠杆菌。

此外，本发明还涉及一种由根据SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含通过在宿主细胞中表达编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列或表达本发明的载体而得到的或可得到的蛋白，或包含由根据SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。

进一步地，本发明涉及一种包含SEQ ID NO:2和/或3的蛋白的物质组合物。优选地，所述物质组合物为药物组合物。

在一个实施方案中，本发明的物质组合物还包含根据SEQ ID NO:4和/或5的蛋白。优选地，所述物质组合物为药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明的物质组合物具有的根据SEQ ID No:2的蛋白的量超过根据SEQ ID No:3的蛋白的量。

在另一个实施方案中，本发明的物质组合物具有的根据SEQ ID No:2的蛋白的量超过根据SEQ ID No:3的蛋白的量，而且根据SEQ ID No:2和3的蛋白的量超过根据SEQ ID No:4和/或5的蛋白的量。

另外，本发明涉及一种物质组合物，其包含根据SEQ ID NO:9的蛋白。优选地，所述物质组合物为药物组合物。

本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码根据SEQ ID No:1的蛋白的核酸序列，或者所述宿主细胞包含本发明的载体，所述载体包含权利要求1的核酸序列。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码根据SEQ ID No:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列，或者所述宿主细胞包含本发明的载体，所述载体包含编码根据SEQ ID No:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为原核或真核宿主细胞。

在本发明另一个实施方案中，所述原核宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21，例如BL21(DE3)。

本发明还涉及一种制备药物组合物的方法，所述方法包括在允许表达所编码蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和回收得到的药物组合物。

附图说明

图1：a)人sFcγRIIB的晶体结构(PDB条目：2FCB)。如变体1的氨基酸序列(SEQ ID No:7)表示的不可变核心结构对于此研究中测试的所有sFcR变体均相同，显示为深灰色，认为对于IgG结合很重要的环显示为浅灰色，N-和C-端延伸显示为黑色。两个二硫键显示为球状和棒状图示。由图1b所示序列比对还明确鉴定出在所有测试变体之间的该核心结构的同一性。

b)本研究中使用的sFcR变体(缩写为“var”)1-4的序列比对。SEQ IDNo:被缩写为SEQ。

图2：FcR沉淀筛选结果。FcR变体1-4在25℃以及指示的pH值和硫酸铵浓度下孵育1小时。离心后，上清液中的FcR含量通过OD₂₈₀测量而测定，并且相对于硫酸铵浓度绘图。

序列

以下序列提供本文使用的序列的概述：

SEQ ID No:1(本文有时也被称为“变体3”)

SEQ ID No:2

SEQ ID No:3

SEQ ID No:4

SEQ ID No:5

SEQ ID No:6

SEQ ID NO:7(本文有时也被称为“变体1”，在WO 03/043648中该序列被公开为SEQ ID NO:1)

SEQ 8(本文有时也被称为“变体2”，在WO 00/32767中该序列被公开为SEQID NO:3)

SEQ ID 9(本文有时也被称为“变体4”)

具体实施方式

需要指出的是，本文使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述/该”，除非本文有其它明示，其包括复数指代。因此，例如提及“一种试剂”包括此类不同试剂中的一种或多种，提及“所述方法”包括对本领域普通技术人员已知的可修改或替换本文所述方法的等同步骤和方法的指代。

本公开内容中引用的所有出版物和专利通过引用其全文而并入。在所述材料通过引用并入与本说明书矛盾或不一致的程度，本说明书优先于任意此类材料。

除非有其它明示，在一系列元素前使用术语“至少”应被理解为是指该系列中的每一个成分。本领域技术人员将确认或使用常规试验能够确定本文所述发明的具体实施方式的许多等同物。预期此类等同物都被本发明包含。

在本说明书全文及后附的权利要求书中，除非上下文另有要求，术语“包含”以及例如“包括”和“含有”的变型应被理解为表示包含所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。本文如用到术语“含有”，其能够被替代为术语“包含”，或者被替代为本文有时用到的术语“具有”。

本文使用“由…组成”时排除了所要求保护的元素中没有表明的任何元素、步骤或成分。本文使用“基本上由…组成”时没有排除实质上不影响权利要求的基本特征和新颖性特征的材料或步骤。

本文每一个实例中，术语“包含/包括”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个可以被其它两个术语中的任一个代替。

本说明书全文中引用了若干文件。本文引用的每个文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、操作指南等)，无论是上文还是下文，都通过引用全文并入本文。本文绝不理解为承认本发明由于之前的发明而不先于此类公开。

在第一方面，本发明涉及一种编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列。

本文使用的术语“核酸”和“核苷酸序列”或“核酸序列”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、DNA和RNA分子的组合或杂合DNA/RNA分子以及DNA或RNA分子的类似物。这种类似物能够通过使用例如核苷酸类似物产生，所述核苷酸类似物包括但不限于肌苷或三苯甲基化(tritylated)碱基。这些类似物还可以包含DNA或RNA分子，所述DNA或RNA分子包含经修饰的主链，其给分子赋予有益属性，例如核酸酶抗性或增大的跨细胞膜的能力。所述核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可能包含单链和双链部分二者，并可能包含三链部分，但优选双链DNA。

可以对DNA和RNA做出各种修饰；因此，术语“核酸分子”或“核酸序列”涵盖了经化学、酶解或代谢的修饰形式。例如，本发明核酸分子或核酸序列可以通过翻译后或转录后修饰。

本发明核酸序列编码SEQ ID NO:1的蛋白。由SEQ ID NO:1编码的多肽序列可以由于翻译后或转录后修饰而被修饰，这取决于表达由SEQ ID NO:1编码的多肽的宿主细胞。

在本文使用“SEQ ID NO:X的蛋白”时，其中X为1、2、3、4、5或9，其表示具有示于SEQ ID NO:X或如SEQ ID NO:X中所描述的氨基酸序列的蛋白，其中X为1、2、3、4、5或9。

本文使用术语“多肽”或“蛋白”时表示肽、蛋白或多肽，其可以互换使用，且包含给定长度的氨基酸链，其中氨基酸残基由共价肽键连接。但是，本发明还包括所述蛋白/多肽的拟肽(其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物取代)，并且除了20种基因编码的氨基酸，还包括如硒代半胱氨酸。肽、寡肽和蛋白可以被称为多肽。如所述，术语多肽和蛋白在本文经常互换使用。术语多肽还指且不排除多肽的修饰。修饰包括糖基化、乙酰化、酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素共价连接、血红素共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物共价连接、脂质或脂质衍生物共价连接、磷脂酰肌醇连接、交联、环化、形成二硫键、脱甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、formulation、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸盐化、转移RNA介导的添加氨基酸至蛋白如精氨酰和泛素化；例如参见PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson,Ed.，Academic Press，New York(1983)，pgs.1-12；Seifter,Meth.Enzymol.182(1990)；626-646，Rattan，Ann.NY Acad.Sci.663(1992)；48-62。

本发明所述蛋白示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5或9。因此，本发明提供示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5或9的蛋白。

术语“表达”或“核酸序列表达”意为特定核酸或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“核酸表达”尤其意为核酸序列或基因构建体的转录，如包含SEQ ID NO:1的核酸的载体转录为结构RNA(rRNA，tRNA)或mRNA，具有或不具有随后将后者翻译为蛋白。优选地，所述蛋白随后被翻译。所述过程包括DNA的转录以及对产生的RNA产物的处理。所述mRNA随后被翻译为多肽链，多肽链最终被折叠为最终的多肽/蛋白。蛋白表达通常被蛋白组学研究者用来指示特定细胞或组织中一种或多种蛋白的存在和丰度的测量。可通过多种方法测量细胞的蛋白表达。例如采用免疫组织化学和蛋白印迹分析。本文所得结果可以通过用载体转染的细胞相比于模拟转染的细胞来评估，所述载体包含本发明的核酸。较高表达(宿主)细胞显示染色，其与在相同条件下的对照细胞(模拟)相比，在例如强度方面提高了。mRNA表达也可以通过例如RT-PCR衡量。本领域技术人员已知如何测定细胞的某一蛋白或mRNA表达的不同技术。同样预见到由于翻译后或转录后修饰得到的蛋白。

多肽的“变体”涵盖多肽，其中一个或多个氨基酸残基被置换，相比于所述多肽，优选保守置换，其中所述变体优选能够与抗体的Fc部分结合(参见FcγR结合)以及可能与淋巴细胞结合。此类变体包括缺失、插入、倒位、重复以及根据本领域已知一般规则选择的置换。例如Bowie,Science 247：(1990)1306-1310中提供了关于如何制成表型沉默的氨基酸置换的教导，其中该作者指明，研究氨基酸序列耐受性变化有两个主要策略。优选的FcγRIIB变体示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5或9，优选为示于SEQ ID NO:1的FcγRIIB。

这里使用的术语“Fc伽马受体”可以与“FcgR”或“Fcγ受体”或“FcγR”互换，其包括膜性FcγR和可溶的(即Fcγ受体的细胞外部分)FcγR。Fc伽马受体属于蛋白的免疫球蛋白超家族，其发现在许多造血谱系上。如它们的命名所表明，Fc受体识别和结合于抗体Fc(片段、结晶)部分，即与抗体的两个重链的两个C-端结构域相对应并且通常与效应分子和细胞相互作用的片段。

优选地，根据SEQ ID NO:1的蛋白是可溶性FcγR。同样优选地，根据SEQ ID NO:2、3、4、5或9的蛋白是可溶性FcγR。还优选地，根据SEQ IDNO:1、2、3、4、5或9的蛋白在合适液体中可溶，例如水性液体。

FcγR识别IgG抗体。人体中存在4个IgG亚类，按照它们在血清中的丰度命名(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，其中IgG1为丰度最大的IgG类型)。人体中存在的FcγR分为三类：FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIIIA(CD16)。进一步地，FcγR出现各种同工型，即功能相似的Fcγ受体，该受体具有类似但不相同的氨基酸序列。所述同工型包括FcγRIA、B1、B2、C；FcγRIIA1-2、B1-3、C以及还包括若干等位基因(FcγRIIa1-HR、-LR；FcγRIIIb-NA1、-NA2)(van de Winkel和Capel，Immunol，Today 1993，14:215-221)。FcγR的不同种类和同工型在它们对IgG的亲和力方面，尤其在对不同IgG亚类的亲和力方面，可能并不相同。通常，FcγR作为I型跨膜蛋白或者以可溶形式出现，但是还存在FcγRIII(FcγRIIIB)的糖基化磷脂酰肌醇锚定形式。

“可溶FcγR”还表示为“sFcγR”。如本文使用的术语“可溶Fcγ受体”和类似术语指的是Fcγ受体的细胞外部分。这部分能够溶解于液体。一般而言，任何Fcγ类的溶解形式、同工型或等位基因能够通过前面的“s”识别，例如，sCD32或sFcγRII是指可溶的FcγRII受体。通常，与膜性(即膜结合的)FcγR不同，可溶的FcγR不包含跨膜区或胞质尾。

优选地，本发明的FcγR具有人起源或是人的FcγR。术语“人起源”以其最广义解释。一般而言，从氨基酸序列和/或结构上看，该术语表示FcγR(或其区域或片段)效仿或类似人FcγR(例如，人体内发现的蛋白)。

或者，所述“具有人起源的”FcγR可以是重组FcγR，其通过在宿主细胞中重组核酸表达得到，例如，记载于Sondermann和Jacob(1999),Bioll，Chem,380(6),717-721。简单来说，从生物体得到感兴趣的基因，然后引入载体如质粒或病毒中，然后其用于将基因转递至表达重组基因并产生重组蛋白产物的宿主细胞中。本领域技术人员能够容易地获知选择哪个宿主细胞以获得例如适用于制备药物组合物的FcγR。例如在一些实施方案中，非糖基化的FcγR可能是所需的。而后本领域技术人员可以选择原核宿主细胞用于FcγR表达，所述原核宿主细胞中FcγR避免了蛋白质糖基化所必需的酶机制。在一个实施方案中，根据WO 00/32767所述，所述FcγR能够在原核生物中表达，随后经纯化和再折叠。

在另一个实施方案中，在真核表达系统中能够简单而廉价地生产高纯度FcγR。可以利用的系统包括拥有用于生产细胞外蛋白的专用装置的真核生物如B细胞。其它可选的真核表达系统包括并不限于CHO或HEK细胞。因此，所述可溶的FcγR为重组的、可溶的、糖基化的FcγR。

本文所述的FcγR还包括这样的FcγR，与野生型FcγR比较，所述FcγR已在氨基酸序列上被修饰或改变，包括例如添加的糖基化位点或类似情况。此外，还设想了FcγR的非糖基化形式，并作为FcγR的优选实施方案。

本发明所述Fcγ受体包括如示于SEQ ID NO:1(SM101的氨基酸序列，本文还指为变体3)中的至少一个氨基酸序列。根据SEQ ID NO:6(核酸序列编码SM101，本文还指为变体3)的核酸序列的至少一个编码本发明所述FcγR。能够在表达载体中克隆这些序列，从而通过重组表达产生相应的FcγR。

本发明还涉及包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列的载体。此类载体可以是，如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或另外例如在遗传工程中惯常使用的载体，手术载体可以包含其他基因例如标记基因，所述标识基因允许所述载体在合适条件下和合适宿主细胞中选择和/或复制。在一个优选实施方案中，所述载体为表达载体，其中本发明核酸分子被可操作地连接至表达控制序列，所述表达控制序列允许在如本文所述的原核或真核宿主细胞中表达。如本文使用的术语“可操作地连接”是指在一个或多个表达控制序列和多核苷酸中的编码区之间的连接，所述连接的方式使得在与表达控制序列相容的条件下实现表达。

因此本发明核酸分子可被插入到若干可购买得到的载体中。非限制性实例包括与哺乳动物细胞相容致的质粒载体，例如pUC、pBluescript(Stratagene)、pET(Novagen)、pREP(Invitrogen)、pCRTopo(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pUCTag、pIZD35、pLXIN和pSIR(Clontech)和plRES-EGFP(Clontech)。优选地，本发明核酸分子被插入到载体“pET”中处于IPTG诱导型T7-启动子控制下。杆状病毒载体例如pBlueBac、BacPacz杆状病毒表达系统(CLONTECH)和MaxBacTM杆状病毒表达系统、昆虫细胞和方案(Invitrogen)，能够购买得到并且也可用于高产量生产生物活性蛋白。(还参见，Miller(1993),Curr.Op.Genet.Dev.,3,9；O'Reilly,BaculovirusExpression Vectors：A Laboratory Manual,p.127)。另外，原核载体如pcDNA2；以及酵母载体如pYes2均为本发明其它适用载体的非限制性实例。

本申请优选的其它表达载体是本领域熟知的在果蝇属细胞中表达蛋白的那些，例如Invitrogen的DES2-系列。优选地，所述果蝇属细胞表达载体是pMTBiP/V5-His B(Invitrogen)。所述pMT/BiP/V5-His载体提供下述另外的特点。所述载体尺寸小(93.6kb)以促进DNA产量以及增大亚克隆效率，其具有C-端V5表位标签用于采用Anti-V5抗体快速检测，并具有C-端6xHis标签用于使用镍螯合树脂来简单纯化重组融合蛋白。

关于载体修饰技术，参见上文的Sambrook和Russel(2001)。载体可包含一个或多个用于克隆或表达的复制和遗传系统，一个或多个用于在宿主中选择的标记，例如抗生素抗性，以及包含一个或多个表达盒。

被插入载体中的编码序列能够通过标准方法合成，从天然来源中分离，或作为杂合体制备。将编码序列与转录调控元件连接(例如启动子、增强子和/或隔离子)和/或使用已有方法与其它氨基酸编码序列连接。

进一步地，除了本发明所述核酸序列，所述载体还包含表达控制元件，其允许编码区在适合的宿主中适当表达。技术人员已知此类控制元件，并且此类控制元件可以包含启动子、翻译起始密码子、翻译和插入位点或内部核糖体进入位点(IRES)(Owens,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001),1471-1476)以用于将插入片段引入载体。优选地，本发明核酸分子与所述允许在真核或原核细胞中表达的表达控制序列可操作性地连接。

本领域技术人员已知确保在真核和原核细胞中表达的控制元件。如前所述，控制元件通常包括确保转录起始的调控序列和确保转录终止、转录子稳定的任选poly-A信号。另外的调控元件可以包括转录以及翻译增强子，和/或天然结合的或异源启动子区。允许例如在哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调控元件包括CMV-HSV胸苷激酶基因启动子、SV40、RSV-启动子(劳斯肉瘤(Rous sarcome)病毒)、人延伸因子1α-启动子、CMV增强子、CaM-激酶启动子或SV40-增强子。

对于在原核细胞中表达，已记载了大量启动子，包括，例如，tac-lac-启动子、lacUV5或色氨酸启动子。除了负责转录起始的元件，此类调控元件还可包括转录终止信号，例如在多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A。本文中，本领域已知的适合表达载体例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-Vitrogene，尤其应用在附加实例中)、pSPORT1(GIBCO BRL)或pGEMHE(Promega)，或原核表达载体，例如λgt11。

根据本发明的表达载体至少能够引导本发明所述核酸和蛋白的复制，优选是表达。复制的适当起始包括例如Col E1、SV40病毒和M 13复制起始。适当的启动子包括例如巨细胞病毒(CMV)启动子、lacZ因子、gal10启动子和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)多面体启动子。适当的终止序列包含例如牛生长激素、SV40、lacZ和AcMNPV多聚腺苷酸化信号。可选择的标记的实例包括新霉素、氨比西林和潮霉素抗性以及类似物，优选卡那霉素。特殊设计的载体允许DNA穿梭于不同的宿主细胞之间，例如细菌-酵母，或动物-细菌细胞，或细菌-真菌细胞，或细菌-无脊椎动物细胞。

除了本发明核酸分子，所述载体还可进一步包含用于编码分泌信号的核酸序列。此类分泌信号序列为本领域技术人员熟知。进一步地，根据使用的表达系统，本发明所述的核酸分子的编码序列中可以添加能够引导所表达多肽到细胞腔室的前导序列，并且所述前导序列是本领域熟知的。所述前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，优选地，前导序列能够将所翻译的蛋白或其一部分的分泌物引导入尤其是胞外膜。可选地，所述异源序列能够编码融合蛋白，所述融合蛋白包括赋予预期特性的C-或N-端识别肽，所述预期特性例如稳定或简化地提纯所表达的重组产品。一旦所述载体被引入到适当宿主中，所述宿主保持在适用于核苷酸序列高表达水平的条件下，并且如期望地，随后收集和纯化本发明蛋白、抗原片段或融合蛋白。当然，所述载体还可包含来自致病生物体的调控区。

优选地，所述载体可以是诱导型表达载体，例如IPTG-诱导型载体。

进一步地，所述载体除了是表达载体外还可以是基因转移和/或基因靶向载体。基因治疗是基因转移的最重要应用之一，其基于将治疗基因(例如疫苗)通过离体或体内技术导入细胞中。文献中记载了用于体内或体外基因治疗的适当载体、载体系统和方法，这些也是本领域技术人员已知的；参见，例如，Giordano,Nature Medicine 2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science 256(1992),808-813,Isner,Lancet348(1996)，370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Wang,NatureMedicine 2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；Schaper,CurrentOpinion in Biotechnology 7(1996),635-640或Verma,Nature 389(1997),239-242以及其中引用的参考文献。

如本文上述的本发明核酸分子和载体可以被设计为用于向细胞中直接导入或用于经由脂质体或病毒载体导入(例如腺病毒或逆转录病毒载体)。另外，杆状病毒系统或基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒的系统能够用作本发明的核酸分子的真核表达系统。除了重组产生，本发明所述蛋白、融合蛋白或抗原片段的片段还可以使用固相技术通过直接的肽合成产生(参见Stewart等人,(1969)Solid Phase Peptide Synthesis；Freeman Co，San Francisco；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85(1963),2149-2154)。体外蛋白合成可以通过人工技术或自动化进行。可以实现自动化合成，例如按照制造商提供的指南，使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer,Foster City CA)。各种片段可以分别化学合成，然后使用化学方法组合，以产生全长分子。

本发明还涉及包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列的宿主细胞，或包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列的载体。

所述“宿主”可以通过向宿主细胞中引入所述载体或核苷酸序列而产生，由于其在细胞中的存在，所述宿主细胞介导本发明核苷酸序列编码的蛋白的表达，或者所述宿主细胞包含根据本发明的核苷酸序列或载体，其中核苷酸序列和/或所编码的多肽对于宿主细胞来说是外源的。本文使用术语“宿主”时包括宿主细胞。

“外源的”表示所述核苷酸序列和/或所编码的多肽相对于宿主来说是异源的，异源的意味是源自具有不同基因组背景的细胞或生物体，或者相对于宿主是同源的、但是处于与所述核苷酸序列的天然存在的对应物不同的基因组环境中。这是指，如果核苷酸序列相对于宿主是同源的，它不位于它在所述宿主基因组中的天然位置，尤其是它被不同的基因围绕。在这种情况下，所述核苷酸序列可以在其自身启动子的控制下或在异源启动子控制下。技术人员通过使用本领域技术人员熟知的方法可以确认被导入的核酸分子或载体的位置，所述方法例如DNA印迹。存在于宿主细胞中的根据本发明的载体或核苷酸序列可以被整合到宿主基因组中，或可以在染色体外以某种形式保持。在这方面还可以理解为，本发明核苷酸序列可以用于经由同源重组来修补或产生突变基因。

在一个实施方案中，包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列或包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列的载体的宿主细胞是原核或真核宿主细胞。优选地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌；更优选地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌BL21，例如BL21(DE3)。

适当的原核/细菌细胞是通常用于克隆如大肠杆菌、沙门氏菌、鼠伤寒、粘质沙雷菌或枯草芽孢杆菌的那些。所述真核宿主可以是哺乳动物细胞、两栖动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞或细菌细胞(例如，大肠杆菌菌株HB101、DH5a、XL1Blue、Y1090和JM101)。优选原核重组宿主细胞，最优选大肠杆菌。

真核宿主细胞进一步的实例包括但不限于酵母，例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母或毕赤酵母细胞，人、牛、猪、猴的细胞系和啮齿类动物起源的，以及昆虫细胞，其包括但不限于草地夜蛾的昆虫细胞和果蝇来源的昆虫细胞以及斑马鱼细胞。源自哺乳动物物种的细胞系适合使用并能够购买得到，包括但不限于L细胞、CV-1细胞、COS-1细胞(ATCC CRL1650)、COS-7细胞(ATCC CRL 1651)、HeLa细胞(ATCC CCL 2)、C1271(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。

所述源自果蝇属的细胞可以是果蝇属S2(ATCC CRL-1963)，优选用于果蝇属表达系统中异源蛋白表达，例如，果蝇属表达系统

源自哺乳动物物种的细胞系适合使用并能够购买得到，包括但不限于L细胞、CV-1细胞、COS-1细胞(ATCC CRL 1650)、COS-7细胞(ATCC CRL1651)、HeLa细胞(ATCC CCL)、C1271(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCCCCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。

在另一个更优选的实施方案中，所述两栖动物细胞是卵母细胞。在一个甚至更优选的实施方案中，所述卵母细胞是青蛙卵母细胞，特别优选为非洲爪蟾卵母细胞。

在一个更优选的实施例中，本根据发明的宿主是非人转基因生物体。所述非人生物体可以是哺乳动物、两栖动物、鱼、昆虫、真菌或植物。特别优选的非人转基因动物为果蝇属物种、秀丽隐杆线虫、非洲爪蟾的物种、斑马鱼、草地夜蛾、苜蓿银纹夜蛾、小鼠和大鼠。转基因植物包括但不限于小麦、烟草、荷兰芹和拟南芥。本领域还熟知的是转基因真菌，其尤其包括酵母如粟酒裂殖酵母或酿酒酵母，或曲霉菌、脉孢菌或黑粉菌物种或毕赤酵母物种。

本发明还涉及通过在宿主细胞中表达编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列或表达载体而得到的或可得到的蛋白，所述载体包含编码根据SEQID NO:1的蛋白的核酸序列，所述宿主细胞优选为原核宿主细胞，更优选为大肠杆菌，最优选为大肠杆菌BL21，例如大肠杆菌BL21(D3)。

本文描述一种用于制备由本发明所述核酸分子编码的多肽的方法，所述方法包括培养/培育本发明所述宿主和分离所产生的多肽。

本领域存在大量在适当宿主中产生多肽的方法。如果所述宿主为单细胞生物体或哺乳动物或昆虫细胞，本领域技术人员能够很容易地利用培养条件，所述培养条件可以进一步优化且无需过度劳动。很容易通过现有的方法从培养基中或从分离的(生物学的)包涵体收获所产生的蛋白。进一步地，可以直接从宿主细胞中分离所产生的多肽。所述宿主细胞可以是宿主生物体的一部分或源自宿主生物体的一部分，例如所述宿主细胞可以是该组织的一部分，例如动物的CNS、皮肤等或植物的可收获部分。此外，可以从源自所述宿主的液体分离所产生的多肽，所述液体如血液、奶或脑脊液。

此外，本发明涉及由编码根据本发明的SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列编码的多肽。

本发明所述多肽可以相应地通过微生物法或通过转基因哺乳动物产生。此外预见到本发明多肽还从转基因植物回收得到。或者可以合成或半合成地产生本发明多肽。

例如，化学合成，例如Houghton Proc.Natl.Acad.Sci.USA(82)(1985),5131-5135中记载的固相法。另一种方法是体外翻译mRNA。优选的方法涉及如前述宿主细胞中蛋白的重组产生。例如，能够通过PCR合成包含根据本发明核苷酸序列中任一个的全部或部分的核苷酸序列，其被插入表达载体中，然后利用所述表达载体转化宿主细胞。之后，培养宿主细胞以产生所需的多肽，将其分离和纯化。可以通过若干已知技术中任一种实现蛋白分离和纯化；所述技术例如但不限于离子交换色谱法、凝胶过滤层析和亲和层析、高压液相色谱法(HPLC)、反相HPLC、制备性凝胶圆盘电泳。另外，能够使用无细胞翻译系统来产生本发明所述多肽。根据本发明使用的合适的无细胞表达系统包括兔网织细胞溶胞产物、小麦胚芽提取物、犬胰腺微粒体膜、大肠杆菌S30提取物和耦合转录/翻译系统例如TNT-系统(Promega)。这些系统允许以下表达：加入克隆载体后的重组多肽或肽，DNA片段，或包含编码区和适当启动子元件的RNA序列。如前所述，蛋白分离/提纯技术可能需要使用常规方法来修饰本发明所述的蛋白。例如，可以将组氨酸标签加入蛋白中来实现在镍柱上进行纯化。其它修饰可引致更高或更低的活性，允许更高水平的蛋白产生或简化蛋白纯化。其它标签还包括flag-标签。标签优选用于真核宿主。

本发明所述蛋白优选具有由本发明所述核酸分子编码的氨基酸序列，或者是通过表达本文所述核酸序列而得到的或可得到的。因此，包含SEQ IDNO:1的载体如表达载体可以用于实现通过表达SEQ ID NO:1的核酸序列而得到或可得到的蛋白的表达。

例如，大肠杆菌菌株BL21(DE3)可以用于介导SEQ ID NO:1的蛋白表达或载体表达，所述载体包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列。本领域已知例如用于在IPTG诱导型T7-启动子的控制下表达的载体的构建。电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞能够用质粒DNA、例如上述表达载体转化。然后将处理后的细胞置于培养基中生长。培养后，离心收获所述细胞，或可以直接将所述细胞裂解，例如通过超声来裂解，然后悬浮液经离心或如实例中示例处理。随后，片状沉淀物即粗包涵体，可以在缓冲液例如裂解缓冲液中重悬浮。然后溶解所述湿包涵体。再一次离心后，可以获得感兴趣的蛋白，或如实例所示例，在离心处理前可以再折叠所述蛋白。如本领域已知得进行蛋白表达、细胞裂解、回收包涵体、再折叠包涵体，例如如本文实施例中所述。

纯化蛋白的一种途径包括硫酸铵沉淀，所述方法通过改变蛋白溶解度而用于纯化蛋白。它是已知为盐析的更一般技术的具体案例。通常使用硫酸铵，因为硫酸铵的溶解度高，可以获得具有高离子强度的盐溶液。蛋白的溶解度随溶液的离子强度而变化，因此随盐浓度而变化。观察到两个不同效果：盐浓度低时，蛋白的溶解度随盐浓度增大(即离子强度增大)而增大，称为盐溶效应。当盐浓度(离子强度)进一步增大，蛋白的溶解度开始下降。在离子强度足够高时，蛋白将几乎完全从溶液中沉淀出来(盐析)。

由于蛋白在离子强度高时的溶解度变化显著，盐析作为非常有用的操作步骤，帮助给定蛋白的纯化。通过添加离液序列低的(kosmotropic)硫酸铵，折叠副产品如未折叠和错误折叠的物质以及源自宿主细胞的杂质如细胞壁组分和蛋白被沉淀。随着沉淀浓度增大，沉淀效率将增大，因而得到高度纯化的FcR制备物，只要FcR变体在如此高的硫酸铵浓度下抵抗沉淀即可。因此，理想的是具有在硫酸铵浓度等于或甚至超过1.5M时仍高度可溶的FcR变体。

通过离心移除沉淀的蛋白，随后将硫酸铵浓度增大到沉淀绝大部分感兴趣的蛋白、同时将最大量的蛋白污染物仍然留在溶液中的值。通过离心回收感兴趣的所沉淀的蛋白，并将其溶解于新鲜的缓冲液中，用于纯化的下一个阶段。

优选地，本发明蛋白具有在硫酸铵浓度等于或超过1.5M时的高溶解度。

本发明进一步涉及由根据SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。

可以由根据SEQ ID NO:6的核酸序列编码根据SEQ ID NO:2、3、4、5或9的蛋白；其中

(i)第一个密码子(ATG)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:2的蛋白，

(ii)第一个密码子(ATG)和第二个密码子(GCA)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:3的蛋白，

(iii)第一个密码子(ATG)、第二个密码子(GCA)和第三个密码子(CCG)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:4的蛋白，

(iv)第一个密码子(ATG)、第二个密码子(GCA)、第三个密码子(CCG)、第四个密码子(CCG)和第五个密码子(AAA)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:5的蛋白，

(v)将编码N-端至C-端氨基酸TPA的密码子加入在SEQ ID NO:6的第一个密码子(ATG)和第二个(GCA)之间，并且将编码氨基酸序列MGI的密码子以3’加入至SEQ ID NO:6的倒数第二个密码子(CCG)，得到根据SEQ ID NO:9的蛋白。

本发明还涉及药物组合物，其包含通过表达编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列而得到的或可得到的蛋白，或通过表达载体而得到的或可得到的蛋白，所述载体包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列，或者包含由SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。

根据本发明使用的术语“组合物”涉及：

(a)包含通过表达编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列而得到得或可得到的至少一个蛋白的组合物；

(b)或者包含编码根据SEQ ID NO:1、2、3、4、5或9的蛋白的核酸的载体；

(c)或者由SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白；

(d)或者编码根据SEQ ID NO:1、2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。

预见到下文描述的本发明组合物还包含任意组合的前述蛋白。可选择地，所述组合物还可包含能够结合其它蛋白的分子例如抗体或淋巴细胞。所述组合物可以是固体、液体或气体形式，尤其可以是粉末、片剂、溶液、气溶胶、颗粒、丸剂、悬浮液、乳状液、胶囊、糖浆、液体、酏剂、提取物、酊剂或流浸膏的形式或是特别适合口服或非肠道或局部用药的形式。

本发明另一个优选组合物为药物组合物，其可选择性地包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。所述药物组合物尤其包含本发明所述核酸序列或本发明所述多肽，所述多肽可以被耦合到另外的多肽，例如抗体或血清中存在的其它蛋白。

如本文所述，所述药物组合物可以与生理上可接受的载体一起施用给患者。在一个特定实施方案中，术语“药学上可接受的”是指经监管机构或其他公认的药典批准的用于动物，更尤其是用于人。

术语“载体”是指所述药物组合物与其一起施用的稀释剂、佐剂或溶媒。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油。所述药物组合物经静脉内施用时，优选载体为水。盐水溶液、水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。

适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、钠离子、脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇以及类似物。如需要，所述组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂以及类似物。利用传统的粘结剂和载体例如甘油三脂，所述组合物能够被配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药物载体的实例记载于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”。此类组合物包含治疗有效量的上述化合物，优选为具有适量载体的纯化形态，以提供用于适当施用至受试者的形式。所述制剂应当适合给药形式。

在另一个优选实施方案中，按照常规方法配制组合物，作为适于人静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物为溶于无菌等渗水性缓冲液的溶液。必要时，所述组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。通常，所述成分被独立供应或以单位剂量形式混合在一起，例如，作为在指示活性剂的量的气密性容器如安瓿或sachette中的干冻干粉末或无水浓缩物。在组合物以输注形式给药时，可以通过包含无菌药品级水或生理盐水的输注瓶分配。在组合物通过注射给药时，可以提供注射用无菌水或生理盐水的安瓿，使得所述成分可以在给药前混合。

本发明药物组合物能够以中性或盐的形式配制。药学上可接受的盐包括用阴离子例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的那些盐，还包括用阳离子例如源自钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些形成的那些盐。

可选择地采用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。在制剂中采用的精确剂量还将取决于给药途径、疾病或障碍的严重性，另外还应根据实际操作者的判断以及每个患者的状况而决定。可以从来自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推算有效剂量。优选地，将所述药物组合物直接给药或与佐剂组合给药。

可以设计用于基因治疗中应用的药物组合物。前述已经记载了与本发明宿主细胞相关的基因治疗技术，而上述记载的所有应用同样也适用于所述药物组合物。例如，所述药物组合物中的核酸分子或包含通过表达SEQ ID NO:1的核酸而得到的或可得到的蛋白的蛋白或包含编码根据SEQ ID NO:1的蛋白的核酸的载体或由SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白，均优选以允许其导入、表达和/或稳定整合到待治疗的个体患者的细胞的形式。

对基因治疗而言，可以利用各种病毒载体，如腺病毒、疱疹病毒、牛痘或者优选RNA病毒如逆转录病毒。单个外源基因可插入其中的逆转录病毒载体的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)以及劳斯肉瘤病毒(RSV)。另外许多逆转录病毒载体还可以结合多个基因。所有这些载体均能够传递或结合用于可选择标记的基因，从而可以确认和产生被转导的细胞。通过插入例如编码糖、糖脂或蛋白的多核苷酸而使逆转录病毒载体成为靶标特异性的。本领域技术人员熟知或能够通过常规试验而容易地确定具体的多核苷酸序列，所述序列可以被插入到逆转录病毒基因组中以允许包含插入的多核苷酸序列的逆转录病毒载体的靶标特异性递送。

由于重组逆转录病毒优选是缺陷型的，因此它们需要辅助以便产生感染性载体粒子。这种辅助可以例如通过使用辅助细胞系而提供，所述辅助细胞系含有编码处于LTR内调控序列的控制下的逆转录病毒中所有结构基因的质粒。这些质粒缺失这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列使得包装机制能够识别出用于衣壳化的RNA转录体。具有包装信号缺失的辅助细胞系包括但不限于例如w2、PA317和PA12。因为没有包装的基因组，这些细胞系将产生空病毒粒子。如果将逆转录病毒载体导入这些包装信号完整、但用其它感兴趣的基因代替结构基因的细胞中，可以包装所述载体并能够产生载体病毒粒子。可以选择地，通过传统的磷酸钙转染，可以用质粒直接转染NIH 3T3或其它组织培养细胞，所述质粒编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env。然后用包含感兴趣的基因的载体质粒转染这些细胞。产生的细胞将逆转录病毒载体释放至培养基中。本发明所述核酸分子的另一个靶向递送系统为胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳状液、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体系统是脂质体。脂质体是可用作体外和体内递送载体的人工膜囊泡。已经证明，尺寸范围为0.2-4.0pm的大单层囊(LUV)能够包覆相当大百分比的含有大的大分子的水性缓冲液。RNA、DNA和完整病毒粒子可以在水性内部被包覆，然后以生物活性形式被递送至细胞(Fraley等人，Trends Biochem.Sci.,6:77,1981)。除了哺乳动物细胞以外，脂质体已被用于递送多核苷酸到植物、酵母和细菌细胞中。为了使脂质体成为有效基因转移载体，必须具备以下特点：(1)以高效率包覆感兴趣的基因同时不损害其生物活性；(2)与非靶细胞相比，其优先并显著结合靶细胞；(3)以高效率向靶细胞的细胞质递送囊泡的水性内容物；和(4)准确并高效表达遗传信息(Mannino等人，Biotechniques,6:682,1988)。脂质体的组成通常是磷脂、尤其是相转变温度高的磷脂的组合，通常与类固醇特别是胆固醇结合。也可使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。可用于生成脂质体的脂质实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节糖苷。尤其有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂质部分包含14-18个饱和碳原子，特别是16-18个饱和碳原子。示例性的磷脂包括蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。根据结构和机械因素，能够将脂质体的靶向性分类。结构分类基于选择性水平，例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。可以基于其是被动的还是主动的来区分机械靶向性。被动靶向性利用脂质体分布到器官中的网状内皮系统(RES)细胞的天然趋向，所述器官含有正弦毛细血管。

在本发明上下文中术语“受试者”的意思是需要进行情感性障碍(affectivedisorder)治疗的个体。优选地，所述受试者是脊椎动物，甚至更优选为哺乳动物，特别优选为人。在一个实施例中，人为患者或个体。

术语“给药/施用”是指给个体施用治疗或诊断有效剂量的编码本发明多肽的前述核酸分子。

如本文所用的“治疗有效量”是指治疗活性的组分或试剂的量，所述量足以治疗或改善疾病或障碍、延迟疾病的发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗益处。

如本领域已知且在本文记载，针对全身递送相对于局部递送、年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用以及病情严重程度的调整可能是必要的，这是本领域技术人员通过常规试验可以确定的。所述方法适用于人治疗和兽医应用。本文所述组合物具有理想的治疗作用，如本文所述，其可以在生理上可接受的载体中给患者给药。如以下讨论，根据导入方式，所述组合物可以通过各种方法配制。制剂中的治疗活性化合物的浓度可为约0.1-100wt％不等。所述药剂可单独给药，或结合其它治疗方式给药。

如上述讨论，所述药物组合物能够以各种方式给药，包括但不限于，经口、皮下、静脉内、动脉内、鼻内，髓内、鞘内、心室内、鼻内、支气管内、经皮、结内、直肠内、腹膜内、肌内、肺内、经阴道、经直肠或眼内。一些情况下，例如再创伤和炎症的治疗中，可以直接作为溶液干燥喷雾应用候选药剂。

所述药物组合物优选注射。所述注射使用皮下或肌肉地静脉内输注给药。进一步地，所述药物组合物还包括其它药学上可接受的载体和/或赋形剂。术语“药学上可接受的”是指药典所公认的可用于动物，尤其适用于人。

所述组合物通过输注给药时，其可采用含有无菌药品级水或盐水的输注瓶分配。所述药物组合物通过注射给药时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得所述成分可以在给药前混合。此外，所述药物组合物可以结合一种或多种其它治疗剂或抗体给药，例如类固醇或静脉内免疫球蛋白，尤其为皮质类固醇、糖皮质激素前药如泼尼松、IVIG、抗-D、长春花生物碱如长春新碱或长春碱、达那唑、免疫抑制剂如(硝基)咪唑硫嘌呤、环磷酰胺或环孢菌素A、二氨二苯砜、促血小板生成素制剂、利妥昔单抗、霉酚酸酯、罗米司亭、艾曲波帕、吗替麦考酚酯。如本文使用的术语“组合”是指使用多于一个的预防和/或治疗药剂。术语“组合”的使用并不限制预防和/或治疗药剂给患者给药的次序。

主治医师和临床因素将确定给药方案。如医疗领域熟知，对任何患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给药的具体化合物、性别、给药时间和途径、整体健康状况和同时给药的其它药物。常规剂量范围可以例如为0.001至1000μg；但是，尤其当考虑到上述因素时，预见到剂量低于或高于该示例性范围。

所述剂量优选为一周一次，然而治疗过程中剂量可以在更长的时间间隔中给予，并且根据需要可以在更短的时间间隔中给予，例如每日。优选的情况下，使用本文所述方法以及其它本领域技术人员已知的其他方法，监控免疫反应，从而来优化剂量，例如时间、量和/或组成。剂量会发生变化，但是DNA静脉内给药的优选剂量为大约106至1012拷贝的DNA分子。如果采用连续输注的方案，则该剂量应为1μg至10mg单位/公斤体重/分钟范围内。可以通过定期评估来监控过程。本发明药物组合物可以局部或全身给药。优选为非肠道给药如静脉内。用于非肠道给药的制备物包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳状液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和注射用有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道溶媒包括钠离子溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和钠离子、乳酸林格氏或非挥发油。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)及类似物。还可以存在防腐剂和其它添加剂如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体及类似物。

还预见到所述药物组合物在与其它试剂的联合治疗方法中采用，所述其它试剂例如可用于检测甲基化DNA，因此可用于例如诊断恶性肿瘤，所述恶性肿瘤可能示出典型甲基化模式。

本发明提供试剂盒，其能够用于上述方法。本领域技术人员还熟知的是，所述药物组合物能够采取多剂量试剂盒的形式，所述试剂盒包含足够量的FcγR给药剂量用以有效治疗或预防患者中的炎性疾病和/或自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述药物包装或试剂盒包括一个或多个装有本发明药物组合物的容器。此外，所述药物包装或试剂盒还可以包括一个或多个可用于治疗疾病的另外的预防或治疗药剂。

另外，本发明药物组合物可以用于疾病或障碍的治疗和预防。

如本文使用的术语“治疗”及类似术语是指管理和照顾患者和/或防治疾病或障碍。如本文使用的术语“预防”、“防治”和“阻止”是指在患者中由于施用预防或治疗药剂后，防止障碍的一种或多种症状复发或发作。

如本文使用地，可交替使用的术语“障碍”和“疾病”是指患者中的病症。特别地，术语“自身免疫性疾病”和“自身免疫性障碍”可交替使用，是指患者中特征为患者对其自身的细胞、组织和/或器官的免疫反应导致的细胞、组织或器官损伤的病症。本文可交替使用术语“炎性疾病”和术语“炎症障碍”，是指患者中特征为炎症、优选慢性炎症的病症。自身免疫性障碍可能与炎症相关，也可能不相关。而且，炎症可能由自身免疫性障碍引致，也可能不是由自身免疫性障碍引致。因此，某些障碍可能以自身免疫性和炎性障碍两者为特征。

在一个优选实施方案中，可以通过本发明所述方法治疗的炎性疾病为原发性免疫性血小板减少症(ITP)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)或自身免疫性溶血性贫血(AIHA)。

本发明还涉及包含根据SEQ ID NO:2和/或3的蛋白的物质组合物。

术语“物质组合物”意为两种或更多种物质的所有组合物和所有复合物质，无论它们是化学结合、机械混合还是生物制品所产生的。两种或更多种成分的混合可以形成物质组合物。通过机械或化学操作或通过生物过程，可以将物质组合物中的成分混合。

所述物质组合物可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的活性成分。“活性成分”意为治疗有效成分。这种活性成分能够与本文记载的IgG抗体结合，还可以与淋巴细胞如T-细胞、B-细胞和自然杀伤细胞结合。这种活性成分只能结合于恒定区。优选为，本发明蛋白在物质组合物中是如上所述的唯一活性成分。

在一个实施方案中，所述物质组合物包含根据SEQ ID NO:2和3的蛋白。在另一个实施方案中，所述物质组合物包含根据SEQ ID NO:2或3的蛋白。在另一个实施方案中，所述物质组合物包含根据SEQ ID NO:2的蛋白。在另一个实施方案中，所述物质组合物包含根据SEQ ID NO:3的蛋白。

在一个实施方案中，本发明所述物质组合物还包含根据SEQ ID NO:4和/或5的蛋白。在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物还包含根据SEQ ID NO:4和5的蛋白。在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物还包含根据SEQ ID NO:4或5的蛋白。在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物还包含根据SEQ ID NO:4的蛋白。在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物还包含根据SEQ ID NO:5的蛋白。

在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物的特征在于，根据SEQ IDNO:2的蛋白的量超过根据SEQ ID NO:3的蛋白的量。

在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物的特征在于，根据SEQ IDNO:3的蛋白的量超过根据SEQ ID NO:2的蛋白的量。

在另一个实施方案中，本发明所述物质组合物的特征在于，根据SEQ IDNO:2的蛋白的量超过根据SEQ ID NO:3的蛋白的量，而且根据SEQ ID NO:2和3的蛋白的量超过根据SEQ ID NO:4和/或5的蛋白的量。

在一个实施方案中，所述物质组合物包含根据SEQ ID NO:9的蛋白。

在一个优选实施方案中，所述物质组合物为药物组合物。

本发明还涉及制备药物组合物的方法，所述方法包括在允许表达所编码蛋白的条件下培养本发明所述宿主细胞，和回收得到的药物组合物。

具体实施方式

以下实施例示例本发明。这些实施例不应被理解为限制本发明的范围。包括实施例的目的在于说明，而本发明仅以权利要求书的限定。

材料和方法

FcR变体制备

在250mL折流板锥形烧瓶中的75ml LB(补充了50μg/mL卡那霉素)中接种5μL甘油母液，在37℃下振荡15h，转速170rpm(Multitron Standard，Infors HT)。之后在2L折流板锥形烧瓶中的1L LB中接种10ml过夜培养物，37℃下振荡，转速170rpm。OD600为1.6时，通过加入1mM IPTG诱导表达。37℃下、170rpm再培养3h之后，通过离心(5′000·g，4℃，10分钟)收获所述细胞，用200ml冰冷却的PBS清洗一次，-20℃下保存。

细胞裂解和分离包涵体

室温下融化6-8g冰冻的大肠杆菌细胞，使用聚四氟乙烯玻璃均浆器在补充了100μg/mL溶菌酶的30mL裂解缓冲液(50mM Tris/HCl，25mM NaCl，2mM EDTA，pH 8.0)中再次悬浮。于冰上孵育15分钟之后，超声破裂细胞(功率设置6，占空比30％，30分钟，配备微头的声波降解器250，Branson)，然后离心悬浮液(13′000·g，4℃，45分钟)。采样上清液1mL，去除剩余液体。使用聚四氟乙烯玻璃均浆器在补充了0.5％(v/v)聚山梨醇酯20的35mL裂解缓冲液中，再次悬浮片状沉淀物即粗包涵体，然后离心(13′000·g，4℃，15分钟)。使用洗涤剂再次清洗后，最后单独使用裂解缓冲液清洗。洗涤后的包涵体于-20℃下保存直到使用。

再折叠和纯化FcR变体

在密封离心管中，20℃、持续搅拌(400rpm)下，将湿包涵体以200mg/mL溶解于20mM Tris/HCl，6M胍，3mM EDTA，5mM DTT，pH 8.0达2.5小时。离心(20′000·g，20℃，10分钟)之后，通过倾析收集上清液，1:60稀释后通过在Knauer Bioselect C4上的RP-HPLC，测定FcR含量。根据分析结果，用20mM Tris/HC，6M胍，3mM EDTA，5mM DTT，pH 8.0稀释溶解的包涵体至FcR含量为21mg/mL，将1份经稀释的FcR溶液逐滴加入20份搅拌(800rpm)的再折叠缓冲液(20mM Tris/HCl，2M尿素,0.5M精氨酸，2mM巯基乙胺，2mM胱胺，pH 7.70，6℃)中。在10℃下于密封容器内不搅拌孵育16h之后，将再折叠溶液升至室温。在持续搅拌(400rpm)下，通过逐滴加入3.5M(NH₄)₂SO₄，20mM NH₄H₂PO₄，pH 7.0，将该升至室温的再折叠溶液调整为(NH₄)₂SO₄浓度为1.1M。在200rpm下再搅拌1h后，离心(20′000·g，20min，20℃)所述悬浮液，过滤(0.2μmMillipore)上清液，以4mL/min，≤4mg蛋白/mL树脂将滤液加载到35mLPhenyl Sepharose HP色谱柱(h＝6.6cm，d＝2.6cm，GE Healthcare)上，所述色谱柱在1.2M(NH4)2SO4，20mM NH₄H₂PO₄，pH 7.0中平衡。使用100mL1.2M(NH₄)₂SO₄，20mM NH₄H₂PO₄,，pH 7.0清洗色谱柱，然后使用20mMNH₄H₂PO₄，pH 7.0中的1.2M至0M(NH4)2SO4以5mL/min的350mL线性梯度洗脱结合的蛋白。以7.5mL的级分收集洗脱液，在Phenomenex JupiterC4上使所述级分进行RP-HPLC分析。合并其中期望的FcR变体的纯度在85％以上的级分，大致浓缩2次，然后通过切向流过滤(Vivaflow 50,5kDaMWCO,0.01m2,横向流200mL/min,pIN＝2bar；Sartorius)，相对于20mM L-组氨酸pH 6.5渗滤直至传导率降低至大约5mS/cm。更换缓冲液之后，以2mL/min、≤20mg蛋白/mL树脂将溶液加载到9mL SP Sepharose HP色谱柱(h＝4.5cm，d＝1.6cm，GE Healthcare)上，所述色谱柱在20mM L-组氨酸，pH 6.5中平衡。使用30mL 20mM L-组氨酸，30mM氯化钠，pH 6.5清洗色谱柱，然后使用20mM L-组氨酸，pH 6.5中的20mM至400mM氯化钠的90mL线性梯度以3mL/min洗脱结合的蛋白。合并含主峰的级分，使用20mML-组氨酸，pH 6.5调整至15.4mS/cm，通过超滤(4′000·g，5kDa MWCO，Vivaspin 20，Sartorius)浓缩至大约20mg/mL，然后使用20mM L-组氨酸,150mM氯化钠,pH 6.5稀释至15mg/mL。过滤(0.45μm PES膜，Puradisc^TM25mm,Whatman)经稀释的FcR溶液，分装，液态氮快速冷冻，-80℃下保存。

沉淀筛选

通过加入适量双蒸水、10X组氨酸/氯化钠储备溶液(200mM组氨酸，1.5M NaCl)和硫酸铵储备溶液(双蒸水中为4M)，在20mM组氨酸、150mM氯化钠和0-2.8M硫酸铵的存在下，调整FcR为0.7mg/mL。通过使用10X组氨酸/NaCl和合适pH的硫酸铵储备溶液，将pH设定为6、7或8。重复设置每一个条件。25℃下孵育样品1h，离心(20′000xg，10min)，然后将30μL上清液转移到384孔板(μclear，非结合，黑色，Greiner Bio-one)。测定280nm处的吸光度(Spectrofluor plus，Tecan)，然后根据兰伯特啤酒法使用质量消光系数1.5625mL x mg-1x cm-1以及路径长度为0.24cm，计算蛋白含量。通过仅包含空白缓冲液的孔的吸光度来校正样品孔的吸光度。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

为抑制后续二硫键交换，使用碘乙酰胺，通过将18μL IB溶解液或再折叠培养液与新鲜制备的2μL 250mM碘乙酰胺在水中混合，使得游离硫醇烷基化。在30℃、750rpm下，在暗处孵育混合物45分钟，然后根据手册(Invitrogen)，直接用于SDS-PAGE样品制备。在4-12％Bis-Tris凝胶上在MES电泳缓冲液(二者均为Invitrogen)中根据制造商指南分离蛋白。用双蒸水清洗凝胶3次，用Simply Blue^TM Safe Stain(Invitrogen)室温下染色至少6h。作为分子量标记物，使用10μL的Plus2预染标准物(Invitrogen)。

LC-MS

通过质谱法联合生化MPI(Martinsried)测定完整的所表达蛋白的分子量。样品在配备有Phenomenex Aeris^TM Widepore C4色谱柱(100mm x 2.1mm，3.6μM粒径，孔径)的ESI-TOF质量分析器(microTOF，Bruker)上分析，所述色谱柱预先在30％乙腈，0.05％TFA中平衡。以0.25mL/min、20℃下注射含有FcR的样品，然后采用30％至80％乙腈，0.05％TFA的15min线性梯度洗脱结合的蛋白。

UV/VIS光谱学

如有必要，使用相应的缓冲液稀释蛋白溶液，使其OD₂₈₀为0.2至0.8。将该溶液400μL转移到UV-微量吸收池(UV-cuvette micro,Brand)。记录(TidasE，J&M Analytik)280nm和320nm处的吸光度，并根据以下等式计算出以mg/mL计的蛋白浓度：

c蛋白＝(OD₂₈₀-OD₃₂₀)x 0.64mg/mL

相应的缓冲液用作空白组。一式三份进行试验，结果取平均数。

实施例1：沉淀筛选

通过基于再折叠的方法的FcR蛋白制备通常涉及硫酸铵沉淀步骤。通过加入离液序列低的(kosmotropic)硫酸铵，折叠副产品如未折叠或错误折叠的物质以及源自宿主细胞的杂质如细胞壁组分和蛋白被沉淀。随着沉淀浓度增大，沉淀效率将增大，因而得到高度纯化的FcR制备物，只要FcR变体在如此高的硫酸铵浓度下抵抗沉淀即可。因此，理想的是具有在硫酸铵浓度等于或超过1.5M时仍高度可溶的FcR变体。除了杂质直接沉淀以外，高硫酸铵浓度促进与HIC树脂的有效结合。由于高动态结合能力一直是色谱捕获步骤的关键开发目标，在高硫酸铵浓度存在下的可溶性是必须的。

为了评估FcR变体在硫酸铵存在下的溶解度，用pH 6至8下的增大浓度的硫酸铵孵育每一个变体。在25℃下1h后，通过紫外/可见光谱测定上清液中FcR浓度。如图2所示，变体3在(NH₄)₂SO₄2.05M至2.13M时具有半最大沉淀从而对硫酸铵沉淀的抗性最大。相反地，“变体2”(SEQ ID NO:8)和“变体4”(SEQ ID NO:9)在高硫酸铵浓度下的溶解度较差，从而显示在(NH₄)₂SO₄浓度为0.70M-1.7M范围时具有半最大沉淀。然而，“变体4”在高硫酸铵浓度下仍可溶。对所有FcR变体而言，可以忽略溶解度的pH依赖。

需要注意的是，不能进行沉淀筛选，因此无法测定“变体1”在高硫酸铵浓度下的溶解度，因为“变体1”不能充分再折叠，因此无法获得可溶性蛋白来进行沉淀筛选。

Claims

1.一种编码根据SEQ ID No:1的蛋白的核酸序列。

2.一种包含权利要求1所述的核酸序列的载体。

3.一种通过在宿主细胞中表达权利要求1所述的核酸序列或表达权利要求2所述的载体而得到的或可得到的蛋白。

4.根据权利要求3所述的蛋白，其中所述宿主细胞为原核宿主细胞。

5.根据权利要求3或4所述的蛋白，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。

6.一种由根据SEQ ID No:6的核酸序列编码的蛋白。

7.一种包含权利要求3或4所述的蛋白的药物组合物。

8.一种包含根据SEQ ID No:2和/或3的蛋白的物质组合物。

9.所述物质组合物还包含根据SEQ ID No:4和/或5的蛋白。

10.根据权利要求8所述的物质组合物，其中根据SEQ ID No:2的蛋白的量超过根据SEQ ID No:3的蛋白的量。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的物质组合物，其中根据SEQ IDNo:2和3的蛋白的量超过根据SEQ ID No:4和/或5的蛋白的量。

12.一种包含权利要求1所述的核酸序列或权利要求2所述的载体的宿主细胞。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其为原核宿主细胞或真核宿主细胞。

14.根据权利要求12所述的原核宿主细胞，其为大肠杆菌。

15.根据权利要求14所述的原核宿主细胞，其为大肠杆菌BL21。

16.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括在允许表达所编码蛋白的条件下培养权利要求12至15中任一项所述的宿主细胞，和回收得到的药物组合物。